Новые аналитические реагенты для определения цистеина, гомоцистеина, метионина и глутатиона тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Щербатых Александр Андреевич

• Щербатых Александр Андреевич
• кандидат наук
• 2023

Оглавление диссертации кандидат наук Щербатых Александр Андреевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Биохимические функции цистеина, гомоцистеина, метионина и глутатиона

1.1.1. Общая характеристика метаболизма цистеина, гомоцистеина, метионина и глутатиона

1.1.2. Участие цистеина, гомоцистеина, метионина и глутатиона в процессах, вызванных оксидативным стрессом

1.2. Фармакологическое применение исследуемых веществ

1.3. Анализ антиоксидантной активности цистеина и глутатиона

1.4. Аналитическая химия цистеина, гомоцистеина, метионина и глутатиона

1.4.1. Методы без использования аналитических реагентов

1.4.2. Методы, основанные на использовании аналитических реагентов

Глава 2. Экспериментальная часть

2.1. Рабочие растворы, реактивы, оборудование

2.2. Объекты исследования

2.3. Использование свободного хромоген-радикала для определения цистеина, гомоцистеина и глутатиона

2.4. Использование гетероциклических дисульфидов для определения цистеина, гомоцистеина и глутатиона

2.5. Использование индолинового и бензофурановых спиропиранов для определения цистеина, гомоцистеина и глутатиона

Глава 3. Результаты и обсуждение

3.1. Использование 2,2'-дифенил-1-пикрилгидразила для определения цистеина, гомоцистеина и глутатиона

3.1.1. Исследование взаимодействия цистеина, гомоцистеина и глутатиона со свободным хромоген-радикалом

3.1.2. Использование методов спектрофотометрии и ВЭЖХ для определения цистеина, гомоцистеина и глутатиона

3.1.3. Использование кинетического метода для определения цистеина, гомоцистеина и глутатиона

3.2. Использование гетероциклических дисульфидов для определения цистеина, гомоцистеина и глутатиона

3.2.1. Концепция выбора структуры дисульфидов

3.2.2. Оптимизация условий проведения аналитической реакции на аминотиолы и выбор методов их определения

3.2.3. Определение аминотиолов методами спектрофотометрии, капиллярного электрофореза и высокоэффективной жидкостной хроматографии

3.2.4. Кинетическое определение цистеина, гомоцистеина и глутатиона с использованием 2,2'-дитиобис(бензоксазола) и 8,8'-дихинолилдисульфида

3.2.5. Определение содержания тиольных групп в белке и общего содержания тиолов в урине методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

3.3. Применение спиропиранов для определения цистеина, гомоцистеина и глутатиона

3.3.1. Индолиновый спиропиран 5,6' -дихлор-1,3,3-триметилспиро[индолин-2,2'-2Я-пирано(3,2-^)хинолин] как аналитический реагент на исследуемые аминокислоты и трипептид

3.3.1.1. Концепция выбора структуры

3.3.1.2. Фотохимические свойства 5,6'-дихлор-1,3,3-триметилспиро[индолин-2,2'-2Я-пирано(3,2-^)хинолина]

3.3.1.3. Исследование комплексообразования между 5,6'-дихлор-1,3,3-триметилспиро[индолин-2,2'-2Н-пирано(3,2-^)хинолином] и глутатионом

3.3.1.4. Количественное определение глутатиона

3.3.1.5. Определение глутатиона в реальных образцах

3.3.1.6. Применение 5,6' - дихлор-1,3,3 -триметилспиро [индолин-2,2 ' -2H-пирано(3,2-^)хинолина] в качестве "ON-OFF-ON" спектрофотометрического реагента на глутатион, цистеин, гомоцистеин и метионин

3.3.2. Использование бензофурановых спиропиранов для определения аминотиолов

3.3.2.1. Концепция выбора структуры

3.3.2.2. Фотохимические свойства бензофурановых спиропиранов в присутствии различных субстратов

3.3.2.3. Кинетический анализ цистеина и глутатиона

Глава 4. Методики определения цистеина, гомоцистеина, метионина и глутатиона

4.1. Методика спектрофотометрического определения цистеина, гомоцистеина и глутатиона с использованием 2,2'-дифенил-1-пикрилгидразила

4.2. Методика определения цистеина, гомоцистеина и глутатиона с использованием 2,2'-дифенил-1-пикрилгидразила методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

4.3. Методика кинетического определения цистеина, гомоцистеина и глутатиона со спектрофотометрическим детектированием с использованием 2,2' -дифенил-1 -пикрилгидразила

4.4. Методика спектрофотометрического определения цистеина, гомоцистеина и глутатиона с использованием 2,2'-дитиобис(бензоксазола) и 8,8'-дихинолилдисульфида

4.5. Методика определения цистеина, гомоцистеина и глутатиона с использованием 2,2'-дитиобис(5-фенил-1,3,4-оксадиазола), 2,2'-дитиобис(бензоксазола) и 8,8'-дихинолилдисульфида методом капиллярного электрофореза

4.6. Методика определения цистеина, гомоцистеина и глутатиона с использованием 2,2'-дитиобис(5-фенил-1,3,4-оксадиазола), 2,2'-дитиобис(бензоксазола) и 8,8'-дихинолилдисульфида методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

4.7. Методика кинетического определения цистеина, гомоцистеина и глутатиона с использованием 2,2'-дитиобис(бензоксазола) и 8,8'-дихинолилдисульфида

4.8. Методика спектрофотометрического определения глутатиона с использованием 5,6'-дихлор-1,3,3-триметилспиро[индолин-2,2'-2Я-пирано(3,2-^)хинолина]

4.9. Методика флуориметрического определения глутатиона с использованием 5,6'-дихлор-1,3,3-триметилспиро[индолин-2,2'-2Я-пирано(3,2-^)хинолина]

4.10. Методика спектрофотометрического определения цистеина, гомоцистеина и глутатиона с использованием 5,6'-дихлор-1,3,3-триметилспиро[индолин-2,2'-2Я-пирано(3,2-^)хинолина] в качестве "ON-OFF-ON" реагента

4.11. Методика спектрофотометрического определения цистеина с использованием спиропирана 7-гидрокси-3',3'-диметил-3'Я-спиро(хромен-2,1 '-изобензофуран)-8-карбальдегида

4.12. Методика спектрофотометрического определения глутатиона с использованием №бензил-2- [(7-гидрокси-3 ',3'-диметил-3'Я-спиро[хромен-2,1 '-изобензофуран]-8-ил)-метилиден]гидразинкарботиоамида

4.13. Методика кинетического определения цистеина с использованием спиропирана 7-гидрокси-3',3'-диметил-3'Я-спиро(хромен-2,1'-изобензофуран)-8-карбальдегида

4.14. Методика кинетического определения глутатиона с использованием N-бензил-2-[(7-гидрокси-3',3'-диметил-3'Н-спиро[хромен-2,1'-изобензофуран]-8-ил)-метилиден]гидразинкарботиоамида

ВЫВОДЫ

Список цитируемой литературы

Приложение А Расчет метрологических характеристик разработанных методик

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ БАД - биологически активная добавка

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВИЧ - вирус иммунодефицита человека

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ВЭЖХ-МС/МС - высокоэффективная жидкостная хроматография в сочетании с тандемной масс-спектрометрией

ГСО - государственный стандартный образец

ДМСО - диметилсульфоксид

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

2,2'-ДТДП - 2,2'-дитиодипиридин

4,4'-ДТДП - 4,4'-дитиодипиридин

ДТНК - 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойная кислота), реактив Эллмана

ДФПГ - 2,2'-дифенил-1-пикрилгидразил

КЭ - капиллярный электрофорез

МНК - метод наименьших квадратов

МС - масс-спектрометрия

ОВР - окислительно-восстановительная реакция

ПрО - предел обнаружения

ТНБ - 5-тио-2-нитробензойная кислота

2-ТП - 2-тиопиридон

4-ТП - 4-тиопиридон

Трис - трис(гидроксиметил)аминометан

Тролокс - 6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбокси кислота

УФ - ультрафиолетовое излучение

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭПР - электронный парамагнитный резонанс

ЭСП - электронные спектры поглощения

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

ABTS - 2,2H'-azinobis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (2,2'-азино-бис-(3-этилбензтиазолин-6-сульфокислоты) диаммониевая соль)

BSO - бутионин-^Д]-сульфоксимин

CBS - цистатионин-Р-синтаза

CPT - S-камптотецин

CS - хитозан

CSE - цистатионин-у-лиаза

CUPRAC - cupric reducing antioxidant capacity (медь-восстанавливающая антиоксидантная способность)

Cys - цистеин

DTIQ - 5,6'-dicMoro-1,3,3-trimethylspiro[mdoHne-2,2'-2#-pyrano[3,2-^]qumoHne], 5,6'-дихлор-1,3,3-триметилспиро[индолин-2,2'-2Я-пирано(3,2-^)хинолин]

ENS - enteral nervous system (энтеральная нервная система)

FRAP - ferric reducing ability of plasma (железовосстанавливающая способность плазмы)

Gly - глицин GSH - глутатион Hcy - гомоцистеин

HILIC - hydrophilic interaction liquid chromatography (жидкостная хроматография гидрофильных взаимодействий)

ICT - intramolecular charge transfer (внутримолекулярный перенос заряда)

IRMPD - infrared multiphoton dissociation (метод инфракрасной многофотонной ионизации)

Met - метионин

4-MP - 4-меркаптофенол

3MST - 3-меркаптопируватсульфотрансфераза

Nac - N-ацетилцистеин

PMPEG - полиэтиленгликольметакрилат

RS - radical scavenging (антирадикальная активность)

SSA - сульфасалазин

SERS - surface-enhanced Raman spectroscopy (поверхностно-усиленная рамановская спектроскопия)

SP3 - 7-гидрокси-3',3'-диметил-3'Я-спиро(хромен-2,1'-изобензофуран)-8-карбальдегид

SP7 - №бензил-2-[(7-гидрокси-3',3'-диметил-3'Я-спиро[хромен-2,1'-

изобензофуран]-8-ил)-метилиден]гидразинкарботиоамид

TAC - total antioxidant capacity (общая антиоксидантная активность)

TXN - тиредоксин

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Новые аналитические реагенты для определения цистеина, гомоцистеина, метионина и глутатиона»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. Аналитическая химия биологически активных веществ является одной из важнейших областей современной аналитической химии. К таким соединениям относятся природные серосодержащие аминокислоты цистеин, гомоцистеин, метионин и трипептид глутатион. Они выполняют в организме человека ряд важных функций. Во-первых, они являются антиоксидантами, нейтрализуя свободные радикалы и другие окислители, концентрация которых в клетках возрастает в условиях оксидативного стресса. Во-вторых, они принимают участие в биосинтезе аминокислот, белков и других метаболитов в организме человека и млекопитающих. В-третьих, протекание в организме различных заболеваний сопровождается возрастанием концентрации цистеина, гомоцистеина, метионина и глутатиона в клетках, что делает их индикаторами при диагностике и исследовании нежелательных физиологических процессов.

Биохимические функции цистеина, гомоцистеина, метионина и глутатиона обуславливают их широкое применение: они входят в состав лекарственных препаратов и БАДов; с их помощью моделируют биологические процессы в условиях in vitro для изучения механизмов биохимических реакций; их также определяют в физиологических жидкостях для диагностики различных заболеваний. При этом в зависимости от объекта и целей конкретного анализа, требования к трудоемкости, селективности, чувствительности применяемой методики определения могут варьироваться.

Ввиду важности серосодержащих аминокислот и олигопептидов, существует потребность в современных, доступных и эффективных методиках их определения. Поэтому поиск новых аналитических реагентов и разработка методик на основе их применения при определении цистеина, гомоцистеина, метионина и глутатиона как в условиях in vitro, так и в анализе реальных объектов, является актуальной задачей для современной аналитической химии.

Степень разработанности темы. Поскольку цистеин, гомоцистеин, метионин и глутатион характеризуются малоинтенсивным поглощением в ультрафиолетовой и видимой областях спектра, то для их анализа методами, использующими спектрофотометрическое или флуориметрическое детектирование, часто применяют аналитические реагенты. Известны методики определения исследуемых веществ в лекарственных средствах, пищевых продуктах, биологических жидкостях, живых клетках с использованием аналитических реагентов на основе малеинового ангидрида, нитробензойной кислоты, иодацетиламинопроизводных, спиропиранов, органических дисульфидов и галогенидов. Диапазон используемых методов также широк: спектроскопия, хроматография, электрофорез, вольтамперометрия и т.д.

В зависимости от объекта и целей анализа, к методам определения выдвигаются различные требования. Поэтому в научной литературе широко представлены методики, сильно различающиеся по трудоемкости, точности, чувствительности и селективности. При этом соблюдение баланса между трудоемкостью и эффективностью разрабатываемой методики является сложной аналитической задачей. Часто характеризующаяся высокой чувствительностью и селективностью методика предполагает сложный многостадийный синтез аналитического реагента и трудоемкую пробоподготовку. Примеры реагентов, позволяющих разработать методики определения серосодержащих аминокислот и олигопептидов, которые характеризовались бы одновременно высокими экспрессностью, чувствительностью, селективностью, доступностью и малой трудоемкостью, достаточно редки. Несмотря на большое количество предложенных аналитических реагентов, в аналитической химии серосодержащих аминокислот и олигопептидов продолжает сохраняться потребность в новых методиках, которые бы отвечали современным требованиям к трудоемкости и эффективности.

Цель данной работы заключалась в поиске новых аналитических реагентов для чувствительного и селективного определения серосодержащих аминокислот цистеина (Cys), гомоцистеина (Hcy), метионина (Met) и трипептида глутатиона

(GSH) в различных объектах, с использованием спектрофотометрического или флуориметрического детектирования.

Для достижения поставленной цели потребовалось решение следующих задач:

1. Определить условия применения хромоген-радикала 2,2'-дифенил-1-пикрилгидразила (ДФПГ) в качестве аналитического реагента при определении исследуемых веществ методами спектрофотометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ);

2. Разработать методики определения исследуемых веществ методами спектрофотометрии, ВЭЖХ, капиллярного электрофореза (КЭ) и кинетическим методом с использованием гетероциклических дисульфидов 2,2'-дитиобис(5-фенил-1,3,4-оксадиазола), 2,2'-дитиобис(бензоксазола) и 8,8'-дихинолилдисульфида в качестве аналитических реагентов;

3. Определить условия применения индолинового спиропирана 5,6'-дихлор-1,3,3-триметилспиро[индолин-2,2'-2Я-пирано(3,2-^)хинолина] (DTIQ) в качестве аналитического реагента при определении исследуемых веществ методами спектрофотометрии и флуориметрии;

4. Оценить возможность применения бензофурановых спиропиранов в качестве аналитических реагентов при определении исследуемых веществ спектрофотометрическим и кинетическим методами;

5. Адаптировать разработанные методики в анализе реальных объектов.

Научная новизна.

1. Впервые показано, что хромоген-радикал ДФПГ применим для определения Cys, Шу и GSH, основанного на спектрофотометрическом детектировании при 517 нм. Установлены оптимальные условия хроматографического разделения, при которых возможно ВЭЖХ определение аналитов.

2. В качестве аналитических реагентов для определения Cys, Шу и GSH предложены дисульфиды 2,2-дитиобис(5-фенил-1,3,4-оксадиазол), 2,2-дитиобис(бензоксазол) и 8,8-дихинолилдисульфид, способные применяться в

более широком диапазоне pH и обеспечивающие большую чувствительность аналитической реакции по сравнению с дисульфидами, описанными в литературе. Исследованы устойчивость предложенных реагентов по отношению к гидролизу, кинетика, контрастность и чувствительность их реакции с аналитами при различных значениях pH.

3. Для определения Cys, Hcy и GSH впервые предложен индолиновый спиропиран DTIQ. Показано, что DTIQ селективно взаимодействует с GSH в присутствии других аминокислот с образованием прочного комплекса. Изучены условия применения DTIQ в качестве спектрофотометрического "ON-OFF-ON" реагента на Cys, Hcy и GSH.

4. Впервые показана возможность использования бензофурановых спиропиранов в качестве аналитических реагентов на серосодержащие аминокислоты. Установлено, что аналитическое применение возможно для спиропиранов, содержащих гидрокси-группу в положении 7 бензопиранового фрагмента. Показано, что спиропираны с различными заместителями в положении 8 бензопиранового фрагмента обладают разной селективностью при анализе Cys и GSH.

Теоретическая и практическая значимость.

Изучены условия аналитического применения предложенных гетероциклических дисульфидов, хромоген-радикала, индолинового и бензофурановых спиропиранов; исследованы кинетические параметры их реакций с аналитами. Разработаны методики определения серосодержащих аминокислот и трипептида, апробированные в анализе реальных объектов и in vitro и характеризующиеся высокой точностью и чувствительностью, достаточной для определения аналитов в реальных объектах (пределы обнаружения находятся в диапазоне 5.9-10-8 - 5.6-10-6 М); экспрессностью и малой трудоемкостью процедуры анализа (используются доступные реагенты и методы и простая пробоподготовка); в случае использования спиропиранов - селективностью по отношению к Cys и GSH. Практическая значимость работы заключается в преимуществах исследованных аналитических реагентов по сравнению с

описанными в литературе: предложенные дисульфиды позволяют добиться высокой чувствительности и применимы в более широком диапазоне pH (например, по сравнению с распространенным в аналитической практике реактивом Эллмана), а предложенные спиропираны способны селективно взаимодействовать с Cys и GSH с образованием более прочных комплексов (константы устойчивости на 1-4 порядка выше, чем у представленных в литературе спиропиранов). Разработанные методики определения аналитов в реальных объектах могут применяться для решения конкретных задач по контролю качества фармакологических препаратов (анализ БАДа), а также в целях медицинской диагностики (анализ физиологических жидкостей).

Методология и методы исследования.

Работа выполнена с использованием комплекса современных методов аналитической химии: спектрофотометрии, флуориметрии, КЭ, ВЭЖХ и кинетического метода.

Положения, выносимые на защиту.

1. Высокая антиоксидантная активность Cys, Hcy и GSH по отношению к ДФПГ позволяет разработать спектроскопические и хроматографические методики их определения, основанные на детектировании ДФПГ при 517 нм.

2. Гетероциклические дисульфиды 2,2'-дитиобис(5-фенил-1,3,4-оксадиазол), 2,2'-дитиобис(бензоксазол) и 8,8'-дихинолилдисульфид могут быть использованы для определения общего содержания тиолсодержащих соединений в реальных образцах при использовании спектрофотометрии, КЭ и ВЭЖХ.

3. Индолиновый спиропиран DTIQ применим для селективного спектрофотометрического и флуориметрического определения GSH в присутствии Cys, Hcy, Met и ряда других аминокислот. Также DTIQ может быть использован в качестве высокочувствительного спектрофотометрического "ON-OFF-ON" реагента на Cys, Hcy и GSH.

4. Бензофурановые спиропираны, содержащие гидрокси-группу в положении 7 бензопиранового фрагмента, применимы для селективного спектрофотометрического и кинетического определения Cys и GSH.

5. Разработанные методики применимы для анализа реальных объектов (белка бычьего сывороточного альбумина (БСА), БАДа «Glutathione reduced» («Глутатион восстановленный») и биологической жидкости здорового человека).

Степень достоверности и апробация результатов работы. Работа выполнена с использованием современных физико-химических методов анализа и современного сертифицированного оборудования. Разработанные методики апробированы в анализе реальных объектов. В частных случаях полученные экспериментальные данные согласуются с данными, известными из литературы. Для разработанных методик устанавливали метрологические характеристики согласно рекомендациям по межгосударственной стандартизации РМГ 61-2003 «Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа». Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на: II и III региональных студенческих научно-практических конференциях Южного федерального округа «Химия: Достижения и перспективы» (Ростов-на-Дону, 2017 и 2018 гг.); IV-VII Всероссийских научно-практических конференциях студентов и молодых ученых «Химия: Достижения и перспективы» (Ростов-на-Дону, 2019-2022 гг.); Международной научной конференции "Technical and Natural Sciences" (Санкт-Петербург, 2022 г.).

Личный вклад соискателя состоял в анализе литературных данных по теме работы, постановке задач исследования, выполнении эксперимента, статистической обработке и математическом анализе экспериментальных данных. В обсуждении полученных результатов и подготовке их к публикации принимали участие соавторы статей и научный руководитель.

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 2 статьи в журналах, индексируемых в базе Scopus, 2 статьи в журналах, входящих в список ВАК, и 7 тезисов докладов.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 161 странице печатного текста, включает 55 рисунков, 27 таблиц. Состоит из введения, 4 глав, выводов и библиографического списка, включающего 185 ссылок на работы; 1 приложение.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Биохимические функции цистеина, гомоцистеина, метионина и

глутатиона

1.1.1. Общая характеристика метаболизма цистеина, гомоцистеина,

метионина и глутатиона

Cys, Hcy, Met и GSH присутствуют в организме в значительных

концентрациях (их нормальное содержание в клетках составляет 30-200, 5-11, 1245 и 7-10 мМ, соответственно [1-4]). Они участвуют в синтезе белков, метаболических процессах, служат индикаторами нарушения обмена веществ, поддерживают постоянство редокс-статуса клетки [5-9]. В организмах млекопитающих Cys образуется из незаменимой кислоты Met и заменимой аминокислоты серина. Met поставляет для синтеза Cys атом серы, а серин -углеродный скелет. Конечный результат сложной последовательности реакций заключается в замене OH-группы серина на SH-группу, получаемую от Met, что приводит к образованию Cys [10]. Cys, в свою очередь, участвует в биосинтезе GSH, объединяясь на первой стадии с глутаминовой кислотой в у-глутамилцистеин, который на второй стадии присоединяет фрагмент глицина [11]. Hcy также синтезируется из Met за счет удаления терминальной метильной группы Met. В свою очередь, Hcy может превращаться обратно в Met за счет метилирования с участием Cys [12].

Cys служит важным источником сульфидов в метаболизме человека [13]. Кроме этого, благодаря своей способности связываться с ионами металлов, Cys необходим для синтеза ферментов, образующих комплексы с ионами цинка, меди, железа и никеля в клетках [14].

GSH участвует в детоксикации клеток, реагируя с метилглиоксалем, формальдегидом и другими токсичными метаболитами, образующимися в клетках при нарушении обмена веществ или попадающими в организм из внешней среды [15,16]. Также GSH участвует в биосинтезе простагландинов и лейкотриенов, поддерживает метаболизм липофильных ксенобиотиков, является кофактором глутатионпероксидазы [17,18].

Hcy - непротеиногенная аминокислота, участвующая в процессах реметилирования, трансметилирования и транссульфурации метаболитов в клетках [19-21]. Hcy необходим для аллостерической регуляции с участием дофаминового Di-рецептора [22].

Met участвует в процессах трансляции белков [23,24], также он необходим для синтеза кофактора S-аденозил метионина, который служит донором метильной группы при синтезе различных метаболитов [25-27].

Cys, Hcy, Met и GSH выполняют функции по поддержанию клеточного гомеостаза, протеканию биоэнергетических процессов, передачу цитозольных редокс сигналов как при нормальных условиях, так и в состоянии оксидативного стресса. Соответственно, помехи в работе этой системы сказываются на процессах, связанных с ростом, развитием, размножением, жизнедеятельностью и гибелью клетки.

1.1.2. Участие цистеина, гомоцистеина, метионина и глутатиона в процессах,

вызванных оксидативным стрессом

Сильные антиоксидантные свойства Cys и GSH лежат в основе их важнейшей функции - работе защитной системы организма для контроля оксидативного стресса [28,29]. Они реагируют со свободно-радикальными частицами и активными формами кислорода (АФК), окисляясь до дисульфидов [30-32]. Met как синтетический предшественник Cys также является частью антиоксидантной системы организма, поскольку от него зависит синтез и внутриклеточная концентрация Cys и GSH.

От присутствующих в организме окислителей (таких как свободные радикалы) зависит протекание ряда важнейших физиологических процессов. Так, например, АФК являются сигнальными молекулами [33-35], участвуют в процессе мутагенного ответа [36], а также защищают клетки от патогенов [37]. С другой стороны, нарушение баланса генерации и удаления окислителей в клетках может привести к резкому росту концентрации оксидантов, что вызывает оксидативный стресс [38-40]. Этот процесс негативно влияет на метаболизм, так

как приводит к неконтролируемому окислению липидов, нуклеиновых кислот и протеинов, разрушению ДНК, нарушению работы защитных ферментов, увеличивая риск развития таких заболеваний, как атеросклероз, болезнь Альцгеймера, рак, катаракта, сердечнососудистые заболевания и т.д. [41-46]. Кроме того, оксидативный стресс нарушает синтез гормонов щитовидной железы и может привести к развитию в организме гипотиреоза (тиреодит Хашимото) [47], либо гипертиреоза (болезнь Грейвса) [48].

Для регулирования концентрации окислителей и контроля оксидативного стресса клетки генерируют антиоксиданты. Антиоксиданты могут отличаться друг от друга химической природой и механизмом действия. Например, в качестве антиоксидантов, непосредственно взаимодействующих со свободными радикалами и прерывающих окислительную цепь, могут выступать низкомолекулярные аминотиолы, обладающие сильными восстановительными свойствами. Такими веществами являются Cys и GSH. Высокая реакционная активность Cys и GSH по отношению к различным формам свободных радикалов [5,31] может быть обусловлена подвижностью атома водорода тиольной группы. Интересно, что это не первый пример проявления биологической активности веществами, содержащими SH-группу, и их производными, например такими как тиоамиды. Известно, что тиоамиды также проявляют антиоксидантную активность, а кроме того, и тиреостатическую активность [49]. Met, в отличие от Cys, Hcy и GSH, не относится к аминотиолам, однако проявляет антиоксидантную активность по отношению к некоторым окислителям (например, гипохлорит-аниону [50]).

Соотношение восстановленной и окисленной форм Cys и GSH определяет текущий редокс-статус клетки и играет роль окислительно-восстановительного буфера [32]. При этом окисленные формы Cys и GSH, содержащие персульфидные мостики, также выполняют регуляторную функцию, что вызывает интерес к условиям и механизмам их образования в клетках. В работе [51] исследованы механизмы образования персульфидов Cys и GSH (Cys-SSH и GSSH, соответственно). Ранее предполагалось, что их синтез из Cys и GSH производится

действием ферментов цистатионин-у-лиазы (CSE) и цистатионин^-синтазы (CBS). Однако CBS и CSE локализованы в цитоплазме, где в то же время восстановленные формы Cys и GSH всегда преобладают над окисленными. Это дало основания предполагать, что кроме CBS и CSE, в клетке присутствуют и другие энзимы, способные катализировать превращение Cys и GSH в соответствующие персульфиды. Авторы доказали, что в роли такого фермента выступает 3-меркаптопируватсульфотрансфераза (3MST). Во-первых, исследование методом ВЭЖХ лизатов анализируемых клеток показало, что в присутствии 3MST содержание восстановленных форм Cys и GSH значительно сокращается по сравнению с лизатами, не содержащими 3MST (рисунок 1).

Рисунок 1 - Хроматограмма, полученная методом ВЭЖХ, лизатов клеток, содержащих (красная линия) и не содержащих (черная линия) 3MST Во-вторых, исследования клеток мозга мышей показали, что в отличие от 3MST CBS не вызывает значительного увеличения концентрации Cys-SSH и GSSH. Было показано, что 3MST катализирует образование Cys-SSH, Cys-S(S)nH, GSSH и GS(S)nH, за счет образования молекул H2Sn, которые и переносят серу к Cys и GSH, превращая их в персульфиды (рисунок 2).

3MP-S-H Cys-SH —► Cys-SSH

\ ■ GSH _ GSSH

3MST -s- — 3MST -S-S — H2SOj — HjSSOj \ H2s — H2Sj protein -SH protein -SSH

Рисунок 2 - Предполагаемый механизм образования персульфидных форм Cys и

GSH

Данные о том, что CBS и CSE не катализируют синтез Cys-SSH, также подтверждаются авторами [52]. По результатам ЖХ-МС анализа показано, что CBS не вызывает значительных изменений в динамике образования персульфидных форм, а CSE реагирует с Cys с образованием преимущественно H2S, а не Cys-SSH. Однако в условиях оксидативного стресса, подразумевающих высокое содержание окисленных форм, в частности цистина (Cys-SS-Cys), скорость образования Cys-SSH значительно увеличивается, что проясняет механизм регуляции редокс-статуса клеточной среды.

Очевидно, что по содержанию окисленных форм Cys и GSH можно судить об эффективности регуляторной системы клетки, а также определять ее редокс-состояние и устойчивость к стрессу.

Система антиоксидантной защиты организма включает большое количество компонентов, которые находятся во взаимосвязи друг с другом. В частности, показано, что антиоксидантная активность GSH зависит от содержания такого важного микроэлемента, как селен [53]. Авторы отслеживали концентрацию GSH в тканях печени мышей. При недостатке селена наблюдалось снижение внутриклеточной концентрации GSH, что приводило к повышенной подверженности клеток оксидативному стрессу. Измерение содержания GSH производилось посредством реакции с реактивом Эллмана с образованием производного, поглощающего при 412 нм.

Помимо прямого участия в поддержании клеточного гомеостаза и антиоксидантных процессах Cys и GSH выполняют регуляторные функции путем

стабилизации некоторых радикалов. Подобный пример с нитрозил-радикалом (NO) рассмотрен в статье [54].

NO играет важную роль в физиологических процессах, отвечающих за клеточный транспорт, сократительную способность мышц, апоптоз, циркуляцию и др. Однако время его существования занимает всего несколько секунд, вследствие чего он очень быстро окисляет кислородсодержащие энзимы, с образованием опасных радикальных форм. Поэтому содержащие цистеиновый фрагмент аминотиолы служат стабилизирующими агентами для NO, образуя относительно устойчивые нитрозопроизводные, например, нитрозоцистеин и нитрозоглутатион (рисунок 3). Они непосредственно участвуют в процессах хранения, переноса и высвобождения NO. Знание структурных особенностей этих соединений необходимо для понимания механизмов сопутствующих реакций, что важно для лечения заболеваний, связанных с нарушением гомеостаза NO. Поэтому авторами была изучена структура нитрозопроизводных Cys и GSH в форме протонированных ионов в газовой фазе методом инфракрасной многофотонной ионизации (infrared multiphoton dissociation, IRMPD). Установлено, что SNO-фрагмент нитрозоглутатиона не вызывает заметного изменения геометрии молекулы GSH, из чего следует, что аминотиол и его нитрозопроизводное имеют схожую геометрическую структуру.

H2N^H-CH2^H2-C-NH-CH-C-NH-CH2-C-OH

Рисунок 3 - Формула S-нитрозоглутатиона (GSNO) Поражения печени, вызванные гипертиреозом, часто встречаются в клинической практике. Считается, что метаболизм фосфора нарушается из-за гипертиреоза, а гипертиреозное поражение печени тесно связано с аномальным уровнем GSH [55]. Авторы [56] рассматривают новый способ одновременного отслеживания содержания фосфора в крови и GSH в тканях печени с

использованием металлорганического комплекса для изучения роли GSH в протекании гипертиреоза.

В то время как Cys и GSH являются индикаторами нарушений, связанных с редокс-статусом клетки, Шу - риск-фактор процессов, связанных с атеросклерозом, деменцией и болезнью Альцгеймера. Так, нарушения обмена веществ, вызванные недостатком витаминов группы B, особенно фолиевой кислоты, приводят к избыточному содержанию Шу - гипергомоцистеинемии [5759]. Высокая концентрация Шу в плазме крови приводит к повреждениям эндотелия, вследствие чего повышается риск возникновения атеросклероза, который, в свою очередь, может стать причиной деменции. Так, 11-летнее исследование [60] с участием более 200 пациентов в возрасте старше 75 лет показало, что высокий уровень Шу в плазме крови является независимым фактором риска возникновения деменции, на который не влияют колебания внутриплазменных концентраций веществ, обмен которых также нарушается при гипергомоцистеинемии (например, антиоксидантных микронутриентов). Было установлено, что если плазменная концентрация Шу превышает 14 мкМ, риск развития болезни Альцгеймера возрастает почти в 2 раза [6]. В недавней работе [61] авторы установили, что не только гипергомоцистеинемия, но и гипогомоцистеинемия (пониженное содержание Шу в крови, менее 4 мкМ) может быть фактором развития деменции. Из этого был сделан важный вывод о необходимости пересмотра стратегии лечения деменции, включающей использование препаратов, понижающих содержание Шу в крови, поскольку его недостаток также может спровоцировать патологические процессы в головных кровеносных сосудах.

Таким образом, важная роль, которую играют серосодержащие аминокислоты в протекании физиологических процессов, обуславливает повышенный интерес исследователей к изучению механизмов конкретных реакций и определению условий, при которых функционирование данных веществ в организме является наиболее эффективным.

1.2. Фармакологическое применение исследуемых веществ

Поскольку повышенная концентрация Hcy в крови приводит к риску развития атеросклероза и деменции, наличие Hcy в лекарственных препаратах оправдано лишь при лечении гипогомоцистеинемии, которая встречается значительно реже гипергомоцистеинемии, и потому недостаточно хорошо изучена. В случае Cys, GSH и Met (которые в отличие от Hcy не вызывают подобных токсических эффектов), их биохимические свойства (например, антиоксидантная и регуляторная функции Cys и GSH) позволяют рассматривать возможность их фармакологического использования.

В статье [62] было изучено применение GSH для предотвращения энтеральной диабетической нейропатии. Энтеральная нервная система (enteral nervous system, ENS) состоит из множества нейронов, формирующих сеть на стенках желудочно-кишечного тракта. Эта нейронная сеть может функционировать независимо от центральной нервной системы. ENS, отвечающая за перистальтику, секрецию и другие функции желудочно-кишечного тракта, уязвима для различных патологий. Особо опасны для нее осложнения, вызванные диабетом. Одной из причин возникновения диабета является оксидативный стресс, поэтому в качестве соединений, тестируемых на антидиабетические свойства, были выбраны антиоксиданты L-глутамин и L-GSH.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Щербатых Александр Андреевич, 2023 год

- 346 с.

Для разработанных методик устанавливали метрологические характеристики согласно рекомендациям по межгосударственной стандартизации РМГ 61-2003 «Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного химического анализа».

Исходные растворы готовили из веществ гарантированной степени чистоты с известным содержанием основного вещества.

Расчёт погрешности приготовления исходных растворов аналитов Д1 выполняли по формуле:

где Дл - предельное значение возможного отклонения массовой доли основного вещества в реактиве от приписанного значения ¡л, %;

¡л - массовая доля основного вещества, приписанная реактиву, %;

Дm - предельная возможная погрешность взвешивания, г;

ДV - предельное значение возможного отклонения вместимости мерной колбы от номинального значения, см3.

Из исходного раствора методом разбавления готовили анализируемый раствор.

Расчет погрешности приготовления анализируемого раствора Д2 выполняли по формуле:

где Д2 - предел возможных значений погрешности приготовления анализируемого раствора, М;

Ду - предельное значение возможного отклонения объёма пипетки от

3

номинального значения, см3;

методик

Ау - предельное значение возможного отклонения вместимости мерной колбы от номинального значения, см3; V1 - объём пипетки, см3; V - объём мерной колбы, см3.

Для определения предела обнаружения (далее - ПрО) проводили анализ раствора в соответствии с разработанной методикой, выполняли 6 параллельных измерений.

Рассчитывали среднее арифметическое хср по формуле:

ХФ - ДО

где х - результат единичного анализа, М; N - число параллельных определений.

Предел обнаружения рассчитывали как утроенное произведение стандартного отклонения (/ = 5; Р = 0.99; = 4.03):

ПрО - 3 • Ч

N-1

Рассчитывали относительное стандартное отклонение по формуле:

Бг -

N

2

Й=1(хСр - 100%

N - 1 хСр

Для оценки внутрилабораторных метрологических характеристик методики анализа готовили серию растворов, которые анализировали в соответствии с разработанной методикой. Было приготовлено три анализируемых раствора с концентрацией вблизи середины градуировочной зависимости; для каждого выполнено по 2 параллельных определения.

На основе рассчитанных концентраций аналитов проводили дальнейшую оценку составляющих погрешности определения согласно рекомендациям по межгосударственной стандартизации РМГ 61-2003 «Показатели точности, правильности, прецизионности методик количественного анализа».

Для оценки показателя повторяемости методики анализа рассчитывали среднее арифметическое Хср и выборочную дисперсию S2 результатов двух параллельных определений концентрации каждого аналита в каждом анализируемом растворе по формулам:

ср N

где - результат единичного анализа, М; N - число параллельных определений;

2 _ Я=1(*ср -хд ^ N-1

На основе полученных значений выборочных дисперсий в каждом образце проверяли гипотезу о равенстве генеральных дисперсий, используя критерий Кохрена.

Значение критерия Кохрена Сшах рассчитывали по формуле:

Р _ - - - тах

и1(тах) = уь г2 ^ ¿=1

и сравнивали его с табличным значением этого критерия Стабл для числа степеней свободы V = Ы- 1, соответствующего максимальной дисперсии, и f= Ь (Х- число суммируемых дисперсий) и принятой доверительной вероятности Р = 0.95 (значение Стабл = 0.967).

При Ошах < Ста6л все значения 82 считали однородными и по ним оценивали средние квадратические отклонения (далее - СКО), характеризующие повторяемость результатов параллельных определений, полученных для соответствующих концентраций компонента в каждом образце. Значение СКО -Sxr рассчитывали по формуле:

N

Ь

Показатель повторяемости методики анализа в виде СКО - «г для соответствующих концентраций компонента в каждом образце, устанавливали, принимая равным Sxr: «г ~ Sxr

Для оценки показателя воспроизводимости методики анализа рассчитывали выборочное СКО результатов анализа каждого образца, полученных в условиях воспроизводимости ^я) по формуле:

^ = Ч

+(п ^

¿-1 Лп N хг

¿-1

N

где п - число параллельных определений, предусмотренных методикой анализа для получения результата анализа (п = 2);

Х- общее среднее значение результатов анализа, полученных в условиях воспроизводимости, М.

Величину X рассчитывали по формуле:

-ТУ _ ^¿=1 ХсрI

Х- ~~г~

Показатель воспроизводимости методики анализа в виде СКО - «я для соответствующих концентраций компонента в каждом образце, устанавливали, принимая равным SR:

«я ~ SR

Для оценки показателя правильности методики анализа рассчитывали оценку математического ожидания систематической погрешности методики анализа - 0 как разность между средним значением результатов анализа Xх и аттестованным значением каждого образца - С:

0 = X- С

Проверяли значимость вычисленных значений 0 по критерию Стьюдента. Для этого рассчитывали значение /-критерия для каждого образца по формуле:

S2 , (±А)2

3

где 52 = - -= 52- дисперсия, характеризующая разброс средних

арифметических значении результатов единичного анализа Хср относительного среднего значения результатов анализа X, (М)2;

±А - погрешность приготовления аттестованного образца, М.

Полученное значение ? сравнивали с ?табл при числе степеней свободы f = Ь- 1 и доверительной вероятности Р = 0.95 (?табл = 4.3).

При ? < ?табл оценка систематической погрешности незначима на фоне случайного разброса, и в этом случае ее принимали равной нулю (0 = 0).

При ? > ?табл оценка систематической погрешности значима на фоне случайного, вводили поправки на значение 0.

При незначимости 0 или при принятом для методики анализа решении о введении в результаты анализа поправки показатель правильности методики анализа (верхнюю (Асв) и нижнюю (Ас.н) границы, в которых неисключенная систематическая погрешность методики анализа (для содержания, соответствующего концентрации определяемого компонента в образце) находится с принятой вероятностью Р = 0.95) рассчитывали по формуле:

где ас - среднее квадратическое отклонение неисключенной систематической погрешности методики анализа - точечная оценка, М.

Для оценки показателя точности методики анализа рассчитывали верхнюю (Ав т) и нижнюю (Ан т) границы погрешности результата анализа (для концентрации, соответствующей концентрации определяемого компонента в образце) с принятой вероятностью Р = 0.95 по формуле:

де=|дн|=д = 1.96 • = 1.96а

Учёт поправки на значение 0 показателей правильности и точности для случая, когда / > /табл выполняли по формулам:

Дс = |0| + 1.96ас Л = |0| + 1.96а

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает искреннюю благодарность и признательность своему научному руководителю, заведующему кафедрой аналитической химии (химфак ЮФУ) профессору Уфлянду Игорю Ефимовичу, профессору кафедры

аналитической химии (химфак ЮФУ) \Черновьянц Маргарите Сергеевне доценту кафедры аналитической химии (химфак ЮФУ) Аскалеповой Ольге Иосифовне за консультирование и содействие при выполнении работы; а также ведущему научному сотруднику НИИФОХ ЮФУ Чернышеву Анатолию Викторовичу и сотруднику кафедры физической и коллоидной химии (химфак ЮФУ) Попову Леониду Дмитриевичу за постоянную поддержку на протяжении всего периода работы над диссертацией.