Разработка аналитических подходов к оценке качества глутатиона восстановленного и модельных лекарственных форм на его основе тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.04.02, кандидат наук Алексеева Ксения Александровна
Алексеева Ксения Александровна
кандидат наук
2019
- Специальность ВАК РФ14.04.02
- Количество страниц 155
Оглавление диссертации кандидат наук Алексеева Ксения Александровна
СОКРАЩЕНИЯ, ПРИНЯТЫЕ В ТЕКСТЕ
ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Обзор исследований в области фармакологических свойств и методов анализа аминокислот и пептидов
1.2. История открытия 08И
1.3 . Биохимические функции, биосинтез и медицинское применение GSИ
1.4. Методы анализа 08И
ВЫВОДЫ ПО ОБЗОРУ ЛИТЕРАТУРЫ
ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Характеристика объектов исследования
2.2. Дериватизаторы для GSИ, их характеристика
2.3. Вспомогательные вещества, использованные в диссертационных исследованиях
2.3.1. Вспомогательные вещества, использованные в технологических исследованиях
2.3.2. Вспомогательные вещества, использованные в химических исследованиях
2.4. Пробоподготовка объектов природного происхождения
2.5. Физические методы анализа
2.5.1. Температура плавления
2.5.2. Растворимость
2.5.3. Ионометрия
2.5.4. Прозрачность и степень мутности жидкостей
2.5.5. Потеря в массе при высушивании
2.6. Химические методы анализа
2.6.1. Использование титриметрических методов в анализе 08И
2.7. Физико-химические методы анализа
2.7.1. Использование поляриметрии в анализе 08И
2.7.2. Использование ОФ ВЭЖХ в анализе 08И
2.7.3. Использование масс-спектрометрии в анализе 08И
2.7.4. Использование ИК-спектроскопии в анализе 08И
2.8. Валидационная оценка аналитических методик
2.9. Фармакологические испытания
ГЛАВА 3. РАЗРАБОТКА МЕТОДИК АНАЛИЗА вБИ
3.1. Изучение спектральных характеристик 08И
3.1.1. Спектроскопия 08И в инфракрасной области спектра
3.1.2. Масс-спектрометрия 08И
3.2. Разработка хроматографических методов для анализа 08И
3.2.1. Разработка методики анализа 08И методом ОФ ВЭЖХ
3.2.2. Разработка методик анализа ОБИ методом ОФ ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией
3.2.1.1. Разработка методики дериватизации ОБИ дансилхлоридом
3.2.1.2. Разработка методики дериватизации ОБИ ордао-фталевым альдегидом
3.2.1.3. Разработка методики дериватизации ОБИ 4-метокси-2-нитрофенил-изотиоцианатом
3.2.1.4. Разработка методики дериватизация ОБИ 1-бром-2,4-динитробензолом ....72 3.2.1.5 Сравнительный анализ реакций дериватизации ОБИ
3.2.2. Использование ОФ ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией для обнаружения примесей в ОБИ
3.2.3. Использование ОФ ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией для определения ОБИ в образцах природного происхождения
3.3. Изучение хроматографического поведения ОБИ втонких слоях сорбента
3.4. Разработка титриметрических методов анализа субстанции ОБИ
3.5. Определение влаги в исследуемой субстанции ОБИ
3.6. Изучение растворимости ОБИ в основных растворителях
3.7. Разработка проекта фармакопейной статьи предприятия на субстанцию ОБИ
ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ
ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА НОРМ КАЧЕСТВА ОБРАЗЦОВ МОДЕЛЬНЫХ СОСТАВОВ ГРАНУЛИРОВАННОЙ И КАПСУЛИРОВАННОЙ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ С ОБИ
4.1. Определение технологических характеристик субстанции ОБИ и выбор вспомогательных веществ
4.2. Разработка технологии получения гранулированной лекарственной формы на основе ОБИ
4.3. Валидационная оценка методики идентификации и количественного определения глутатиона в гранулах и капсулах методом ОФ ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией
4.4. Определение норм качества гранул на основе ОБИ
4.5. Определение норм качества капсул на основе ОБИ
ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ
ГЛАВА5. НЕКОТОРЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИЗУЧЕНИЯ АНТИОКСИДАНТНОЙ И АНТИГИПОКСИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ОБИ
5.1. Изучение антиоксидантного потенциала ОБИ в сравнении с известными антиоксидантами
5.2. Изучение антигипоксической активности ОБИ
5.2.1 .Механизм антиоксидантиного действия ОБИ
5.2.2. Оценка продолжительности жизни мышей на модели острой гипоксии
5.2.3. Результаты исследования антигипоксической активности ОБИ
ВЫВОДЫ ПО ГЛАВЕ
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
Приложение
Приложение
Приложение
Приложение
Приложение
Приложение
Приложение
СОКРАЩЕНИЯ, ПРИНЯТЫЕ В ТЕКСТЕ
АФК активные формы кислорода
БАВ биологически активные вещества
БАДы биологически активные добавки
GCL у-глутамилцистеин-лигаза
GGT у-глутамилтранспептидаза
GST ОБИ-Б-трансфераза
ГОСТ государственный стандарт
ГФ государственная фармакопея
ДДВ дважды дистиллированная вода
ИК инфракрасная
МАЛДИ или активированная матрицей лазерная десорбционная
MALDI/TOF/MS ионизация или matrix-assisted laser desorption ionization
ОФ ВЭЖХ обращенно-фазная высокоэффективная жидкостная
хроматография
СО стандартный образец
ТСХ тонкослойная хроматография
УФ ультрафиолетовая
ФСП фармакопейная статья предприятия
ХЛ хемилюминесценция
НССА а-цианокоричная кислота
DNBB 1 -бром-2,4-динитробензол
DNC дансилхлорид
FMOC 9-флуоренилметоксикарбонилформиат
GSH глутатион восстановленный
GSSH глутатион окисленный
OPA орто-фталевый альдегид
PITC фенилизотиоцианат
ВВЕДЕНИЕ
Рекомендованный список диссертаций по специальности «Фармацевтическая химия, фармакогнозия», 14.04.02 шифр ВАК
Определение аминокислот и их оптических изомеров в виде o-фталевых и дансильных производных методом высокоэффективной жидкостной хроматографии2006 год, кандидат химических наук Чернобровкин, Михаил Геннадьевич
Новые аналитические реагенты для определения цистеина, гомоцистеина, метионина и глутатиона2023 год, кандидат наук Щербатых Александр Андреевич
Определение аминокислот и их моноаминовых метаболитов в физиологических жидкостях методом микроколоночной жидкостной хроматографии с флуориметрическим детектированием1998 год, кандидат химических наук Королева, Елена Михайловна
Высокочувствительное сорбционно-жидкостно-хроматографическое определение замещенных гидразинов2009 год, кандидат химических наук Чернобровкина (Затираха), Алла Валерьевна
Разработка и стандартизация лекарственного препарата на основе аминокислот (МР-33) и обоснование экономической эффективности его производства2003 год, кандидат фармацевтических наук Быканова, Светлана Николаевна
Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Разработка аналитических подходов к оценке качества глутатиона восстановленного и модельных лекарственных форм на его основе»
Актуальность темы.
Гипоксия является доминирующим фактором нарушения регуляции метаболизма и нормального функционирования клеток при большинстве патологических состояний. Появляющиеся расстройства окислительных и энергетических метаболических процессов в клетке нуждаются в коррекции за счёт привлечения средств, сдерживающих оксидативный стресс. Указанное суждение базируется на современном представлении о ведущей роли состояния антиоксидантной системы в патогенезе, течении и прогнозе морбидных состояний, обусловленных гипоксической природой.
Одной из важнейших антиоксидантных систем организма, обеспечивающих целостность клеточных и субклеточных мембран от повреждающего действия активных форм кислорода (АФК), является система глутатиона, включающая сам глутатион восстановленный (ОБИ) и ряд глутатионзависимых ферментов. Являясь одним из важнейших эндогенных антиоксидантов, эта система имеет решающее значение в поддержании нормального функционирования организма и обеспечении многоуровневой защиты тканей от повреждающего действия ксенобиотиков.
Ключевой молекулой указанной системы является глутатион восстановленный (ОБИ) (у-Ь-глутамил-Ь-цистеинилглицин) — трипептид, составляющий основу интрацеллюлярного окислительно-восстановительного статуса, и участвующий в процессе обезвреживания ксенобиотиков различного генеза. Кроме того, ОБИ является признанным потенциальным терапевтическим агентом, используемым в клинической практике многих стран при нозологиях, сопряжённых с явлением оксидативного стресса.
ОБИ в биологической среде образует редокс-пару в виде восстановленной (ОБИ) и окисленной (ОББО) форм. Соотношение ОБИ/ОББО определяет окислительно-восстановительный статус клетки и применяется в качестве маркера оксидативного стресса. Это объясняет широту
аналитических подходов для определения GSH в биологических объектах. Существующие аналитические подходы хотя и обладают высокой чувствительностью, однако весьма сложны в исполнении, занимают длительное время, и, как правило, не обеспечивают необходимой точности для целесообразности использования в целях фармацевтического анализа.
В отечественной фармакопее отсутствует нормативная документация на субстанцию GSH, а Российская фармацевтическая промышленность не производит препаратов на его основе. Расширение ассортимента конкурентоспособных отечественных терапевтических агентов и их надлежащая стандартизация является важнейшей задачей современной фармацевтической отрасли. Поэтому разработка универсальных методик оценки качества GSH в различных объектах и создание отечественных лекарственных форм на его основе является актуальной проблемой.
Степень разработанности темы.
Большинство работ, в которых представлены методики анализа GSH, касаются его определения в различных биологических объектах. Например, в работах Chwatko G. (2014 г.), Sakhi A.K. (2017 г.) изложены методики разработки анализа GSH в растительных объектах. Аналитические исследования, посвящённые определению GSH в различных образцах животного происхождения, приведены в публикациях Ellman G.L. (1959 г.), Lenton K. (1999 г.), Dalton T.P. (2000 г.), Townsend D.M. (2003 г.), Чернобровкина М.Г. (2004 г.), Safavi A. (2009 г.), BaldE. (2009 г.), Ворониной Л.Д. (2012 г.), Giustarini D. (2014 г.), Gawlik M. (2014 г.) и др. Большинство подобного рода исследований принадлежат фармакотерапевтическому или биохимическому профилю и посвящены оценке окислительно-восстановительного статуса клеток и выявлению оксидативного стресса. При этом доминирующим аналитическим подходом для определения GSH служит метод ОФ ВЭЖХ с предварительной пробоподготовкой, дериватизацией и флуориметрическим детектированием. Существующие литературные данные в области анализа GSH в объектах различного происхождения нуждаются в
дальнейшем развитии и адаптации под задачи фармацевтического анализа. Кроме того в РФ отсутствует нормативная документация, регламентирующая качество ОБИ, и препараты на его основе. Всё это определило цель и задачи настоящего исследования.
Цель и задачи исследования.
Целью настоящего исследования явилось аналитическое обеспечение оценки качества глутатиона восстановленного в субстанции и модельных лекарственных формах на его основе.
В соответствии с обозначенной целью необходимо было решить ряд
задач:
1. Разработать ряд методик идентификации ОБИ с помощью классических и современных методов анализа;
2. Разработать и валидировать комплекс методик идентификации и количественного определения ОБИ в субстанции и природных источниках методом ОФ ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией различными дериватизаторами. Провести их сравнительную оценку. Определить аналитическую пригодность методик для определения примесей в субстанции ОБИ;
3. Предложить критерии оценки доброкачественности субстанции ОБИ. На основании проведённых исследований, подготовить нормативную документацию на субстанцию ОБИ с учётом полученных результатов химических тестов;
4. Создать ряд модельных лекарственных форм, содержащих ОБИ, разработать и валидировать методику контроля их качества;
5. Дать оценку антиоксидантного потенциала ОБИ в сравнении c таковым известных антирадикальных агентов;
6. Провести сравнительную характеристику антигипоксической активности ОБИ относительно известных антигипоксантов.
Научная новизна исследований.
Предложен ряд методик идентификации ОБИ в субстанции с помощью методов ИК -, масс-спектрометрии и ОФ ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией.
Разработан перечень норм качества субстанции ОБИ в соответствии с современным уровнем развития фармакопейного анализа и международными требованиями к качеству субстанций.
Впервые проведена сравнительная оценка дериватизаторов для идентификации и количественного определения ОБИ в субстанции и образцах природного происхождения по критериям экспрессность, чувствительность, воспроизводимость, безопасность, экономическая доступность дериватизатора, стабильность деривата. Показано, что оптимальными дериватизаторами являются дансилхлорид и о-фталевый альдегид.
Разработана методика определения специфических примесей в субстанции ОБИ методами ОФ ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией дансилхлоридом и ТСХ. Выявлены преимущества первого метода по сравнению с ТСХ. Установлено, что основной специфической примесью в ОБИ является глутатион окисленный (ОББО). Предложен способ его количественной оценки в исследуемой субстанции.
Разработан ряд модельных лекарственных форм, содержащих ОБИ и методы контроля их качества.
Впервые определена антигипоксическая активность ОБИ. Установлена выраженная дозозависимая антигипоксическая активность исследуемого объекта, сопоставимая с референс-препаратом триметазидином.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Методики идентификации, обнаружения примесей и количественного определения глутатиона восстановленного внедрены в учебный процесс кафедры общей химии ФГАОУ ВО НИУ «БелГУ», научную работу испытательного центра «Центр коллективного пользования» Российского университета дружбы народов.
По результатам проведённых исследований разработан проект ФСП на фармацевтическую субстанцию «Глутатион восстановленный» (АО «Верофарм» г. Белгород).
Методология и методы исследования.
Методологическую базу настоящего исследования составили исследования зарубежных и отечественных учёных по определению ОБИ в объектах животного и растительного происхождения.
Для идентификации, оценки чистоты и количественного определения ОБИ в субстанции, лекарственных формах и объектах природного происхождения использованы физико-химические методы: ИК-спектроскопия, масс-спектрометрия в варианте MALDI/TOF/MБ, ионометрия, поляриметрия, ТСХ, ОФ ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией. Для разработки лекарственных форм применялись технологические методы, а именно гранулирование, капсулирование.
Положения, выносимые на защиту:
-результаты разработки методик качественного, количественного определения и чистоты ОБИ химическими и физико-химическими методами анализа;
-результаты валидационной оценки методик определения ОБИ методом ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией;
-результаты определения норм качества субстанции ОБИ восстановленного;
-результаты разработки норм качества гранул и капсул с ОБИ;
-результаты исследования антиоксидантной и антигипоксической активности ОБИ.
Степень достоверности и апробация результатов.
Фрагменты проведённых диссертационных исследований доложены на конференциях: XIV международной научной конференции «Научный диалог: молодой учёный» (г. Санкт-Петербург, 22 февраля 2018 г.), 7-й международной научно-практической телеконференции «Фармацевтический
кластер как интеграция науки, образования и производства» (г. Белгород,17 октября 2018 г.), международной научно-практической конференции «Гармонизация подходов к фармацевтической разработке» (г. Москва, РУДН, 28 ноября 2018 г.), XIV Международной научно-практической конференции «Наука России: Цели и задачи» (г. Екатеринбург, 10 апреля 2019 г.).
Публикации по работе.
По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, из них 3 в изданиях, рекомендованных перечнем ВАК РФ, 2 статьи опубликованы в журналах, входящих в реферативную базу Scopus.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности.
Результаты диссертационных исследований отвечают пунктам 2 и 3 области исследований паспорта научной специальности 14.04.02 -«Фармацевтическая химия, фармакогнозия».
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук.
Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ НИУ «БелГУ» в рамках научного направления «Разработка методологических подходов к анализу природных и синтетических биологически активных соединений в объектах различного происхождения. Изучение фармакологических аспектов использования данных биологически активных соединений».
Личный вклад автора.
Автором лично обозначены цель и задачи исследования, проведён патентно-информационный поиск отечественных и зарубежных источников по выбранной теме. Выполнен полный комплекс аналитических и технологических исследований экспериментальных образцов глутатиона восстановленного и модельных лекарственных форм на его основе. Диссертантом самостоятельно выполнялись анализ и интерпретация результатов, составление таблиц и графиков, нормативной документации,
написание диссертации и автореферата, сопоставление с литературными данными.
Объем и структура диссертации.
Диссертационная работа изложена на 155 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных исследований, заключения, списка литературы, включающего 166 источников, из них 122 зарубежных, 7 приложений. Работа включает 41 таблицу, 55 рисунков.
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Обзор исследований в области фармакологических свойств и методов анализа аминокислот и пептидов
Аминокислоты и пептиды являются активными терапевтическими агентами, находящими широкое применение в современной медицине. Это объясняется многообразием выполняемых ими биохимических функций в организме [2,15].
А-аминокислоты являются предшественниками синтеза ферментов, антител и некоторых гормонов. Они участвуют в поддержании оптимального метаболизма углеводов, оказывают влияние на уровень холестерина в крови, например метионин, лизин, аргинин, триптофан. Некоторые из них, в частности цистеин, элиминируют тяжёлые металлы из организма. а-аминокислоты также являются предшественниками компонентов цикла Кребса, поэтому являются источниками энергии.
В последние годы в терапии сердечно-сосудистых заболеваний нашёл применение Ь-аргинин, как агент с гипотензивной, антиагрегантной и иммунотропной активностью. Данная аминокислота является в организме инициатором синтеза азота (II) оксида, выступающего в роли эндогенного релаксирующего фактора, а также, активного участника целого ряда биохимических и патологических процессов [11, 123].
Аминокислоты, содержащие в своём составе меркапто- и тиометильную группы, а именно цистеин (€¡8), метионин, принимают участие в образовании коллагена. За счёт тиольного фрагмента, перечисленные аминокислоты вносят вклад в создание дисульфидных мостиков, тем самым являясь ключевыми факторами в формировании вторичной структуры белков [54].
Лекарственные препараты, содержащие метионин и его производные (Б-аденозилметионин) обладают липотропной и гепатопротекторной активностью [23]. Существуют сведения о гепатотропной активности Ь-
аланина [156]. Цистеин в своё время применяли для улучшения метаболизма тканей глаза при катаракте [34].
Синтез коллагена - ключевого белка соединительной ткани регулируется гидроксипроизводными аминокислот (гидроксипролин). При нарушении синтеза коллагена, отмечается снижение числа отдельных а-аминокислот в сыворотке крови [22].
а-Аминокислоты и их производные являются регуляторами функции ЦНС. В частности, кислота глютаминовая является возбуждающим нейромедиатором и служит источником других нейромедиаторов в первую очередь ГАМК. ГАМК является основным тормозным медиатором высших отделов мозга и обусловливает регуляцию метаболических процессов в нейронах мозговой ткани. В свою очередь ГАМК предшественник возбуждающих (глутамат, кислота 2,4-диаминомасляная) и тормозных (кислота у- амино-Р-оксимасляная) нейромедиаторов [31,49,101].
Триптофан - аминокислота, лежащая в основе биосинтеза нейромедиатора серотонина и гормона мелатонин [32].
Гистидин обладает способностью связывать токсический метаболит этанола - ацетальдегид, образуя с ним основание Шиффа, тем самым способствуя купированию алкогольного отравления [27]. Также препараты на основе этой аминокислоты используются в терапии язвенных болезней желудочно-кишечного тракта [5].
Аминокислоты - достаточно сложный объект для химического анализа. Это связано с присутствием в их структуре неполярных углеводородных фрагментов и полярных функциональных групп: карбоксильной, гидроксильной, меркапто и аминогруппы. А также амфотерным характером аминокислот, приводящим к возникновению в нейтральных растворах аминокислот цвиттер-иона. При низких значениях рН, аминокислоты представляют собой катионы, из-за чего для их разделения использовался метод катионообменной хроматографии [26].
Аминокислоты и родственные им соединения относятся к веществам, не способным поглощать свет, или обладающих очень слабой способностью к поглощению света. Исключением являются триптофан, фенилаланин и тирозин, поглощающие в диапазоне 240-300 нм. Поэтому сложность регистрации аминокислот в ходе УФ-спектрофотометрического анализа обуславливается тем, что они (как правило) не имеют хромофоров. Следовательно, метод УФ-спектрофотометрии может использоваться только для трёх вышеуказанных аминокислот [41,113,13 6].
Однако, некоторые аминокислоты, например Cis, определяют по реакции окисления солями железа (III) в присутствии 1,10 - фенантролина. Полученный продукт окисления регистрируют спектрофотометрически. Поскольку реакция является чувствительной и даёт точные результаты, её используют для количественной характеристики Cis в биофармацевтическом анализе [146].
Для определения Cis используются и другие спектрофотометрические методы: с фосфорномолибденовой гетерополикислотой, проточно-инжекционное спектрофотометрическое определение в биологически активных добавках, основанное на образовании аналитом восстановленного молибденофосфорного комплекса. Также используется аналитический метод, в котором происходит одновременное спектрофотометрическое определение аскорбиновой кислоты и Cys в лекарственных препаратах [30,81].
Метод ОФ ВЭЖХ с диодно-матричным или флуориметрическим детекторами в настоящее время является наиболее распространенным в анализе аминокислот и родственных им соединений. Однако, указанные детекторы для их анализа в нативном виде малопригодны. Поэтому доминирующим подходом является получение производных аминокислот.
Одним из наиболее известных способов получения химических производных является введение хромофорной метки. Используемый для этой цели реактив должен образовывать такое производное, которое бы обладало
оптимальными свойствами избирательности и чувствительности. Совокупность именно данных свойств нивелирует воздействие матрицы [13].
Как было сказано выше, подавляющее количество аминокислот не имеет в своей структуре хромофорных фрагментов, поэтому проанализировать их методом ОФ ВЭЖХ без модификации молекулы сложно. Для этого предложена дериватизация аминокислот. Дериватизацию проводят множеством различных агентов [33, 132,25].
Осуществить дериватизацию можно двумя способами. При получении производных уже после разделения на колонке, образец сначала разделяют, а в жидкость, выходящую из колонки, вводят (насосом) реактив, обеспечивающий необходимую реакцию. При получении производных до разделения на колонке, образец сначала обрабатывают реактивом, после чего в жидкостной хроматограф вводят реакционную смесь. Такая процедура изменяет вид анализируемого вещества, но такое изменение часто оказывается выгодным (из-за повышения гидрофобности интересующих веществ, что улучшает условия хроматографического разделения).
В традиционных аминокислотных анализаторах использовалась реакция с нингидрином, добавлявшимся уже после разделения на колонке (при рН 5,5 и нагревании). В ходе такой реакции образуется продукт малинового цвета [104]; благодаря такой окраске, все аминокислоты с первичными аминогруппами удается обнаруживать при длине волны 570 нм.
Аминокислоты с вторичными аминогруппами (такие, как пролин) приобретают желтый цвет и их можно регистрировать на длине волны 440 нм [19,21].
Нингидрин обладает селективностью по отношению к первичной алифатической аминогруппе. Другие аминопроизводные либо не реагируют с данным агентом, либо дают малопригодные для идентификации продукты [40].
Трудность обеспечения такой реакции привела к тому, что в последнее время отдается предпочтение другим способам получения производных (с образованием хромофоров или электрофоров, или флуорофоров).
Популярным реактивом, способствующим получению хромофоров, является фенилизотиоцианат [27].
Ещё одной известной реакцией, применяемой в анализе аминокислот, служит введение динитрофенильного остатка в аминогруппу с помощью 2,4-динитро-1-фторбензола (реакция Sanger).
Данная реакция происходит по типу нуклеофильного замещения в ароматическом ядре, которое возможно благодаря наличию сильных электроноакцепторных заместителей [24, 42].
В качестве аналогичных реактивов, придающих способность к флуоресценции, можно назвать орто-фталевый альдегид с тиолом, 9-флуоренилметоксикарбонилформиат (FMOC), нафталин-2,3-дикарбоксиаль-дегид [166].
Аминокислоты, содержащие первичные аминогруппы с орто-фталевым альдегидом и нуклеофильными агентами дают продукты, поглощающие при 340 нм. Реакция для а-аминокислот идёт количественно, характеризуется высокой чувствительностью, однако с её помощью нельзя определить цистин, пролин и оксипролин [6,4].
Такие дериватизаторы как 7-хлор- или 7-фтор-4-нитробензоксадиазол, с аминокислотами образуют достаточно устойчивые флуоресцирующие производные [44].
Распространённым дериватизатором для аминокислот является 5-диметиламинонафталин-1-сульфонилхлорид (дансилхлорид). Полученные дериваты отличаются устойчивостью и хорошо разделяются в ходе хроматографирования с необходимой эффективностью и селективностью. Сформировавшиеся производные хорошо поглощают в УФ-свете и способны к флуоресценции. Поэтому их определяют с помощью диодно-матричного и флуориметрического детектора [18, 43].
Опубликованы многие варианты других используемых реакций. Все такие реактивы образуют уникальные продукты реакции с каждой из аминокислот. Степень гидрофобности таких продуктов попадает в широкий диапазон, из-за чего требуется градиентное элюирование (чтобы все продукты реакции оказались разделенными за одну хроматографическую разгонку).
Получение флуоресцирующих производных до разделения на колонке дает возможность достижения чувствительности, в 1000 раз превышающую типичную для традиционных аминокислотных анализаторов и в 100 раз превышающую, обеспечиваемую при реакции с фенилизотиоцианатом (PITC). Однако не все аминокислоты способны вступать в реакцию одинаково. Например, как правило, аминокислоты с вторичными аминогруппами не вступают в реакцию с орто-фталевым альдегидом (OPA) [165].
1.2. История открытия GSH
GSH впервые был обнаружен J. de Rey-Paihade в 1888 г. в экстракте дрожжей, тканях животных (мышцы и печень коров, мясо рыбы, тонкая кишка ягнят, мозг овец) и в свежем яичном белке. J. de Rey-Paihade назвал это вещество филотион. В 1921 г. Hopkins предположил, что филотион, изолированный из печени, мышц и дрожжей, является дипептидом, состоящим из цистеина и глютаминовой кислоты. Используя названия этих двух аминокислот, Hopkins назвал данное вещество «Glutatione» (Glutamat -глютаминовая кислота и thion - сера). Однако учёным не было учтено присутствия глицина в филотионе, по-видимому, из-за неправильной интерпретации данных, полученных методом Van Slyke по содержанию аминного азота.
Опираясь на данные по содержанию азота и серы в GSH, выделенном из дрожжей, крови и печени Hunter и Eagles в 1927 г. установили, что GSH дипептидом не является, а имеет структуру трипептида, состоящего из
глютаминовой кислоты, цистеина и третьей низкомолекулярной аминокислоты (возможно, серина). Используя кислотный гидролиз GSH, Hopkins в 1929 г. установил, что исследуемая молекула представляет собой трипептид, состоящий из цистеина, глицина и глютаминовой кислоты. Это было подтверждено в 1929 - 1930 гг. независимыми исследованиями Kendall с сотрудниками. Используя данные титрования GSH в воде, в присутствии формальдегида, а также значение pK, Pirie и Pinhey в 1929 г. определили состав глутатина - глутамат-цистеин-глицин. Структура GSH была подтверждена Harington и Mead в 1935 г. химическим синтезом из N-карбобензоксицистеина и этилового эфира глицина. Год спустя, du Vigneaud'и Miller был предложен еще один химический синтез GSH с использованием метилового эфира S-бензилцистеина и хлорангидрида альфа-метилового эфира N-карбобензоксиглутаминовой кислоты.
Несколько позже GSH был обнаружен во всех животных и растительных клетках, в том числе в связанном виде со спермидином в E. coli и гамма-(глутамат-цистеин)п -глицин в растениях [12, 20].
1.3. Биохимические функции, биосинтез и медицинское применение GSH
АФК в физиологических условиях вырабатываются всеми аэробными клетками [71], однако их продукция увеличивается в условиях клеточной альтерации [78]. Физиологический уровень АФК имеет значение для выживаемости клеток, однако их избыток вызывает повреждение и гибель клеток. Чтобы предотвратить необратимое повреждение клеток, увеличение АФК вызывает адаптивный ответ, заключающийся в компенсационном усилении ферментных антиоксидантных систем, направленных на восстановление редокс-гомеостаза [45]. Ферментативные процессы восстановления редокс-гомеостаза могут проходить в разных областях клетки, вовлекая различные редокс-пары, такие как GSH/GSSG или НАДН (Н+)/НАД+ [89].
Среди ферментативных систем, участвующих в поддержании внутриклеточного редокс-баланса, главную роль играет система ОБИ [115], включающая глутатионредуктазу, глутатионпероксидазу, пероксидредуктазу, глиоксалазы 1 и 2, глутатионтрансферазу. Эта система участвует не только в антиоксидантной защите, но и во многих метаболических процессах [63, 90, 120, 86, 147].
Ключевой агент ОБИ (у-Ь-глутамил-Ь-цистеинилглицин) является важнейшим низкомолекулярным внутриклеточным тиольным трипептидом, синтезируемым практически всеми животными клетками. Небольшой размер молекулы и присутствие сульфгидрильной группы делает ОБИ универсальным участником большого числа биохимических реакций. Концентрация ОБИ в клетках составляет - 1-10 ммоль/л [16,150]. Наибольшие концентрации наблюдаются в печени (до 10 мМ), селезенке, почках, эритроцитах и лейкоцитах.
Подавляющее количество ОБИ присутствует в цитозоле, однако некоторое его количество транспортируется в органеллы (митохондрии, ядро, пероксисомы, эндоплазматический ретикулум) [130, 51, 61, 79, 109].
Отмечается накопление ОБИ в ядре в процессе деления клетки, что свидетельствует о поддержании редокс-статуса ядра [108, 125].
ОБИ присутствует в плазме крови, причём его концентрация контролируется синтезом в печени. Следствием нарушения продукции ОБИ является срыв его системного межорганного гомеостаза.
Внеклеточный ОБИ может подвергаться деградации, а высвобождающиеся при этом аминокислоты, проникают внутрь клетки, где способны включаться в синтез молекулы ОБИ [127, 1, 118].
Синтез ОБИ из его составных аминокислот включает в себя две АТФ-зависимые ферментативные стадии: первая стадия является ограничивающей скорость и катализируемой GCL, которая состоит из двух субъединиц: одного каталитического ^^С) и одного модификатора ^^М) (рисунок 1) [98, 100 ,110].
Вторая стадия катализируется GSH-синтетазой (GS) [ 80, 87].
Похожие диссертационные работы по специальности «Фармацевтическая химия, фармакогнозия», 14.04.02 шифр ВАК
Исследование транспортных форм гомоцистеина при различных состояниях организма2007 год, кандидат биологических наук Блашко, Эдуард Львович
Комплексное решение проблем пробоподготовки при разработке методик ВЭЖХ анализа объектов со сложной матрицей2013 год, кандидат наук Захарова, Анна Михайловна
Совершенствование методов анализа производных бензодиазепина и фенилалкиламина2017 год, кандидат наук Лазицкая Анна Марковна
Одновременное определение гидразинов методом реакционной жидкостной хроматографии со спектрофотометрическим и тандемным масс-спектрометрическим детектированием2021 год, кандидат наук Тимченко Юрий Валерьевич
Обоснование норм качества нового биологически активного соединения кардиопротекторного действия2022 год, кандидат наук Луценко Дарья Николаевна
Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Алексеева Ксения Александровна, 2019 год
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Активная защита при окислительном стрессе. Антиоксидант-респонсивный элемент [Текст] / В. В. Ляхович, В. А. Вавилин, Н. К. Зенков [и др.] // Биохимия. - 2006. - Т. 71, № 9. - С. 1183-1197.
2. Аминокислоты глазами химиков, фармацевтов, биологов [Текст] : в 2-х т. / А. О. Сыровая, Л. Г. Шаповал, В. Н. Петюнина [и др.]. - Харьков : Щедра садиба плюс, 2014 - Т. 1. - 228 с.
3. Баласубраманиам, Д. Влияние дезинтегрантов быстрого действия на скорость растворения твердых лекарственных форм перорального применения [Текст] / Д. Баласубраманиам, Би Т. // Фармацевтическая отрасль. - 2010. - № 4 (21). - С. 92-99.
4. Бекетов, В. И. Флуориметрическое определение аминокислот и фотохимическая устойчивость продуктов их реакции с оршо-фталевым альдегидом под воздействием мощного импульсного лазерного излучения [Текст] / В. И. Бекетов, Р. Д. Воронина, Н. Б. Зоров // Вестник Московского университета. Сер. 2. Химия. - 2012. - Т. 53, № 4. - С. 228233.
5. Болдырев, А. А. Карнозин. Биологическое значение и возможности применения в медицине [Текст] / А. А. Болдырев. - Москва :Изд-во МГУ, 1998. - 320 с.
6. Великанова, О. Ф. Спектрофотометрический метод определения суммарного количества аминокислот в сыворотке крови [Текст] / О. Ф. Великанова, Ю. В. Галаев // Лабораторное дело. - 1981. - № 11. - С. 701702.
7. Воронина, Р. Д. Флуориметрическое определение аминокислот по реакции с ортофталевым альдегидом с возбуждением импульсным лазерным излучением [Электронный ресурс] / Р. Д. Воронина, В. И. Бекетов, Н. Б. Зоров // Аналитика Сибири и Дальнего Востока : материалы IX науч. конф., Красноярск, 8-13 окт. 2012 г. / РАН, М-во
образования и науки Рос. Федерации, Сиб. федер. ун-т. - Красноярск, 2012. - С. 32
8. Государственная фармакопея Российской Федерации [Текст] : в 4 ч. / М-во здравоохранения Рос. Федерации. - 14-е изд. - Москва : Науч. центр экспертизы средств мед.применения, 2018. - Ч. 1.
9. Государственная фармакопея Российской Федерации [Текст] : в 4 ч. / М-во здравоохранения Рос. Федерации. - 14-е изд. - Москва : Науч. центр экспертизы средств мед.применения, 2018. - Ч. 2..
10. Государственная фармакопея Российской Федерации [Текст] : в 4 ч. / М-во здравоохранения Рос. Федерации. - 14-е изд. - Москва : Науч. центр экспертизы средств мед. применения, 2018. - Ч. 3.
11. Граник, В. Г. Метаболизм L-аргинина [Текст] : обзор / В. Г. Граник // Химико-фармацевтический журнал. - 2003. - Т. 37, № 3. - С. 3-20.
12. Грин, Н. Биология [Текст] : в 3 т. : пер. с англ. / Н. Грин, У. Стаут, Д. Тейлор ; под ред. Р. Сопера, Б. М. Медникова, А. А. Нейфаха. - 2-е изд., стер. - Москва : Мир, 1996. - Т. 1. - 368 с.
13. Другов, Ю. С. Пробоподготовка в экологическом анализе [Текст] :практ. руководство / Ю. С. Другов, А. А. Родин. - 4-е изд. - Москва : БИНОМ. Лаборатория знаний, 2013. - 855 с. : ил. - (Методы в химии).
14. Душкин, А.В. Механохимическая технология для повышения растворимости лекарственных веществ [Текст] / А.В. Душкин, Л.П. Сунцова, С.С. Халиков // Фундаментальные исследования. - 2013. - № 1-2. - С. 448-457.
15. Защечная (трансбуккальная) фармацевтическая композиция, включающая аминоуксусную кислоту [Текст] : пат. 2253442 Рос. Федерация : МПК А61К 31/198, А61К 9/20, А61З 25/00 / заявитель и патентообладатель ЗАО «Канонфармапродакшн».- № 2003133180/15;заявл. 14.11.2003 ; опубл. 10.06.2005, Бюл. № 16. - 5 с.
16. Калинина, Е. В. Роль глутатиона, глутатионтрансферазы и глутаредоксина в регуляции редокс-зависимых процессов [Текст] / Е. В.
Калинина, Н. Н. Чернов, М. Д. Новичкова // Успехи биологической химии. - 2014. - Т. 54. - С. 299-348.
17. Каркищенко, Н. Н. Фармакологические основы терапии / Н.Н. Каркищенко. - М.: IMP-Медицина, 2015. - 560 c.
18. Клименко, Л. Ю. Дансилхлорид як дериватизуючий реагент в аналiзi бюлопчно активних речовин [Текст] / Л. Ю. Клименко, В. В. Болотов, I. М. Ьанчук // Вюник фармацп. - 2010. - № 3. - С. 42-46.
19. Копытько, Я. Ф. Аминокислоты и жирные кислоты настоек Парнасия (Белозора болотного) гомеопатических матричных [Текст] / Я. Ф. Копытько // Химико-фармацевтический журнал. - 2003. - Т. 37, № 7. -С. 12-14.
20. Кирова Ю.И- Роль системы глутатиона в регуляции окислительно, восстановительного статуса коры головного мозга крыс при гипоксии.. Патол- физиол-и эксп—терапия. - 2014. -№ 4. - С. 40-47.
21. Лазарян, Д. С. Сравнительное изучение аминокислотного состава расплода пчел [Текст] / Д. С. Лазарян // Химико-фармацевтический журнал. - 2002. - Т. 36, № 12. - С. 42-44.
22. Мансурова, И. Д. Определение количества оксилизина и лизина в сыворотке крови [Текст] / И. Д. Мансурова, Е. Н. Набиджанова // Лабораторное дело. - 1982. - № 8. - С. 459-461.
23. Машковский, М. Д. Лекарственные средства [Текст] : пособие для врачей : [в 2-х т.] / М. Д. Машковский. - 14-е изд., перераб., испр. и доп. - Москва : Новая волна, 2000. - Т. 1-2.
24. Методы анализа органических соединений [Текст] : сб. / пер. с англ. Л. Н. Петровой ; под ред. А. П. Терентьева. - Москва : Изд-во иностр. лит., 1951. - 240 с.
25. Окунев, Р. В. Определение свободных протеиногенных аминокислот почвенного раствора методом ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией фенилизотиоцианатом [Текст] / Р. В. Окунев, Б. Р. Григорьян, А. И.
Шарипова // Журнал Сибирского федерального университета. Сер. Химия. - 2014. - Т. 7, № 4. - С. 480-486.
26. Определение аминокислот в лекарственном растительном сырье методом ТСХ: на примере листьев крапивы двудомной и плодов облепихи крушиновидной [Текст] / О. В. Тринеева Е. Ф. Сафонова, А. В. Синкевич [и др.] // Химико-фармацевтический журнал. - 2015. - Т. 49, № 5. - С. 37-41.
27. Определение аминокислот в тканях и органах свиней методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии [Текст] / Н. Н. Дудкина, Е. Н. Беспамятных, А. В. Лысов [и др.] // Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. - 2017. -№ 3. - С. 171-173.
28. Опыт использования метода MALDI/TOF/MS в фармацевтическом анализе [Текст] / Д. И. Писарев, О. О. Новиков, Г. В. Васильев [и др.] // Научные ведомости БелГУ. Сер. Медицина. Фармация. - 2012. - № 10, вып. 18/2. - С. 76-85.
29. Островский, С. Ю. Изучение роли гистидина в неферментативной инактивации ацетальдегида [Текст] / С. Ю. Островский, В. И. Кондаков // Химико-фармацевтический журнал. - 1987. - Т. 21, № 9. - С. 10341037.
30. Проточно-инжекционное спектрофотометрическое определение цистеина в биологически активных добавках [Текст] / А. В. Петрова, Р. Ишимацу, К. Накано [и др.] // Журнал аналитической химии. - 2016. - Т. 71, № 2. - С. 178-184.
31. Раевский, К. С. Медиаторные аминокислоты: нейрофармакологические и нейрохимические аспекты [Текст] / К. С. Раевский, В. П. Георгиев. -Москва : Медицина ; София : Медицина и физкультура, 1986. - 240 с.
32. Разводовский, Ю. В. Влияние L-триптофана на содержание свободных аминокислот и биогенных аминов в головном мозге крыс при субхронической интоксикации фенобарбиталом [Текст] / Ю. В.
Разводовский, Е. М. Дорошенко // Химико-фармацевтический журнал. -2003. - Т. 37, № 1. - С. 6-7.
33. Руденко, А. О. Определение важнейших аминокислот в сложных объектах биологического происхождения методом обращённо-фазовой ВЭЖХ с получением фенилтиогидантоинов аминокислот [Текст] / А. О. Руденко, Л. А. Карцова, С. И. Снарский // Сорбционные и хроматографические процессы. - 2010. - Т. 10, № 2. - С. 223-230.
34. Рудницкий, Л. В. Глаукома и катаракта: лечение и профилактика [Текст] / Л. В. Рудницкий. - Санкт-Петербург : Питер, 2012. - 160 с.
35. Руководство для предприятий фармацевтической промышленности [Текст] : метод. рекомендации : утв. и введено в действие 10.08.07, протокол № 55 / Ассоц. Рос. фармац. производителей. - Москва : Спорт и культура, 2007. - Ч. 1-3. - 190 с. - (Фарм. пром-сть).
36. Руководство по валидации методик анализа лекарственных средств [Текст] : метод. рекомендации / под ред. Н. В. Юргеля, А. Л. Младенцева, А. В. Бурдейна [и др.] // Руководство для предприятий фармацевтической промышленности : метод. рекомендации : утв. и введено в действие 10.08.07, протокол № 55 / Ассоц. Рос.фармац. производителей. - Москва, 2007. - Ч. 1. - С. 5-92.
37. Руководство по проведению клинических исследований лекарственных средств [Текст] : метод. рекомендации / под ред. А.Н. Миронова, В.Г. Кукеса [и др.]. - Москва: Грифф и К, 2012. -27 с.
38. Руководство по экпериментальному изучению новых фармакологических веществ [Текст] : метод. рекомендации / под ред. Р.У. Хабиева. // 2-изд., перераб. и доп. - Москва: Медицина, 2005. - 209 с.
39. Справочник биохимика [Текст] / Р. Досон, Д. Эллиот, У. Эллиот [и др.] ; пер. с англ. В. Л. Друцы, О. Н. Королевой. - Москва : Мир, 1991. - 543 с. : ил.
40. Стандартизация рогов и пантов северного оленя. 1. Количественное определение нингидринактивных веществ в порошке рогов северного оленя [Текст] / В. П. Пахомов, Т. В. Максимова, И. Н. Никулина [и др.] // Химико-фармацевтический журнал. - 1997. - Т. 31, № 4. - С. 53-54.
41. УФ-спектрофотометрическое определение ароматических аминокислот [Текст] / Е. Р. Рошаль, В. Н. Сенаторова, А. Ф. Шолин [и др.] // Химико-фармацевтический журнал. - 1991. - Т. 25, № 4. - С. 80-83.
42. Чернобровкин, М. Г. Определение аминокислот в препарате «Элтацин» [Текст] / М. Г. Чернобровкин, Н. В. Кольцова, Б. Н. Шепелев // Фармация. - 2004. - Т. 53, № 5. - С. 18-20.
43. Чернобровкин, М. Г. Определение аминокислот и их оптических изомеров в виде о-фталевых и дансильных производных методом высокоэффективной жидкостной хроматографии [Текст] :автореф. дис. ... канд. хим. наук : 02.00.02 / М. Г. Чернобровкин. - Москва, 2006. - 25 с.
44. Якубке, Х. Д. Аминокислоты, пептиды, белки [Текст] / Х. Д. Якубке, Х. Ешкайт ; пер. с нем. Н. П. Запеваловой, Е. Е. Максимова ; под ред. Ю. В. Митина. - Москва : Мир, 1985. - 456 с. : ил.
45. Adaptation to oxidative stress, chemoresistance, and cell survival [Text] / M. Landriscina, F. Maddalena, G. Laudiero [et al.] // Antioxid. Redox. Signal. -2009. - Vol. 11, № 11. - P. 2701-2716.
46. Analysis of GSH and GSSG after derivatization with N-ethylmaleimide[Text] / D. Giustarini, I. Dalle-Donne, A. Milzani [et al.] // Nat. Protoc. - 2013. -Vol. 8, № 9. - P. 1660-1669.
47. Aoyama, K. Modulation of neuronal glutathione synthesis by EAAC1 and its interacting protein GTRAP3-18 [Text] / K. Aoyama, M.Watabe, T. Nakaki// Amino Acids. - 2012. - Vol. 42, № 1. - P. 163-169.
48. Arner, E. S. Physiological functions of thioredoxin and thioredoxin reductase [Text] / E. S. Arner, A. Holmgren // Eur. J. Biochem. - 2000. - Vol. 267, № 20. - P. 6102-6109.
49. Balazs, R. Glutamate and glutamate receptors in neurological diseases [Text] / R. Balazs, R. J. Bridges, C. W. Cotman // Excitatory amino acid transmission in health and disease / R. Balazs, R. J. Bridges, C. W. Cotman [et al.]. - New York, 2006. - P. 269-307.
50. Bald, E. Analysis of saliva for glutathione and metabolically related thiols by liquid chromatography with ultraviolet detection [Text] / E. Bald, R. Glowacki // Amino Acids. - 2005. - Vol. 28, № 4. - P. 431-433.
51. Bidirectional membrane transport of intact glutathione in Hep G2 cells [Text] / G. Sze, N. Kaplowitz, M. Ookhtens [et al.] // Am. J. Physiol. - 1993. - Vol. 265, № 6, pt. 1. - P. G1128-G1134.
52. Boyland, E. The role of glutathione and glutathione S-transferases in mercapturic acid biosynthesis [Text] / E. Boyland, L. F. Chasseaud // Adv. Enzymol. Relat. Areas Mol. Biol. - 1969. - Vol. 32. - P. 173-219.
53. British pharmacopoeia [Text]/ British Pharmacopoeia Commission. -London, UK : Her Majetys stationary office, 2005. - 3500 p.
54. Brosnan, J. T. The sulfur-containing amino acids: an overview [Text] / J. T.Brosnan, M. E. Brosnan// J. Nutr. - 2006. - Vol. 136, № 6, suppl. - P. 1636S-1640S.
55. Cabello, C. M. Experimental therapeutics: targeting the redox Achilles heel of cancer [Text] / C. M. Cabello, W. B. Bair 3rd, G. T. Wondrak // Curr.Opin.Investig. Drugs. - 2007. -Vol. 8, №12. - P. 1022-1037.
56. Calabrese, G. Mitochondrial glutathione: regulation and functions [Text] / G. Calabrese, B. Morgan, J. Riemer// Antioxid. Redox. Signal. - 2017. - Vol. 27, № 15. - P. 1162-1177.
57. Camera, E. Analytical methods to investigate glutathione and related compounds in biological and pathological processes [Text] / E. Camera, M. Picardo // J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. - 2002. -Vol. 781, № 1-2. - P. 181-206.
58. Changes in polyamine and glutathione contents of a green alga, Chlorogonium elongatum (Dang) France exposed to mercury [Text] / S. B.
Agrawal, M. Agrawal, E. H. Lee [et al.] // Environ. Exp. Bot. - 1992. - Vol. 32, № 2. - P. 145-151.
59. Chromatographic and mass spectrometric analysis of glutathione in biological samples [Text] / Y. Iwasaki, Y. Saito, Y. Nakano [et al.] // J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. - 2009. - Vol. 877, № 28. - P. 33093317.
60. Clinical studies of reversal of drug resistance based on glutathione [Text] / P. Calvert, K. S. Yao, T. C. Hamilton [et al.] // Chem. Biol. Interact. - 1998. -Vol. 111-112. - P. 213-224.
61. Critical role of mitochondrial glutathione in the survival of hepatocytes during hypoxia [Text] / J. M. Lluis, A. Morales, C. Blasco [et al.] // J. Biol. Chem. -2005. - Vol. 280, № 5. - P. 3224-3232.
62. DeLeve, L. D. Importance and regulation of hepatic glutathione [Text] / L. D. DeLeve, N. Kaplowitz // Semin. Liver. Dis. - 1990. - Vol. 10, № 4. - P. 251266.
63. Deponte, M. Glutathione catalysis and the reaction mechanisms of glutathione-dependent enzymes [Text] / M. Deponte// Biochim. Biophys. Acta. - 2013. - Vol. 1830, № 5. - P. 3217-3266.
64. Determination of cysteine and glutathione in cucumber leaves by HPLC with UV detection [Text] / G. Chwatko, E. Kuzniak, P. Kubalczyk [et al.] // Anal. Methods. - 2014. - Vol. 6. - P. 8039-8044.
65. Determination of oxidized and reduced glutathione, by capillary zone electrophoresis, in Brassica juncea plants treated with copper and cadmium [Text] / J. Mendoza, P. Soto, I. Ahumada [et al.] // Electrophoresis. - 2004. -Vol. 25, №6. - P. 890-896.
66. Determination of S-nitrosoglutathione in human and rat plasma by highperformance liquid chromatography with fluorescence and ultraviolet absorbance detection after precolumn derivatization with o-phthalaldehyde [Text] / D. Tsikas, J. Sandmann, D. Holzberg [et al.] // Anal. Biochem. -1999. - Vol. 273, № 1. - P. 32-40.
67. Determination of total glutathione in yeasts by high-performance liquid chromatography with dansylation [Text] / Y. Ma, F. Xiang, W. Jin [et al.] // Z. Naturforsch. C. - 2010. - Vol. 65, № 5-6. - P. 391-394.
68. Determining glutathione levels in plants [Text] / S. Sahoo, J. P. Awasthi, R. Sunkar [et al.] // Methods Mol. Biol. - 2017. - Vol. 1631. - P. 273-277.
69. Dickinson, D. A. Cellular glutathione and thiols metabolism [Text] / D. A.Dickinson, H. J. Forman //Biochem.Pharmacol. - 2002. - Vol. 64, № 56. - P. 1019-1026.
70. Direct glutathione quantification in human blood by LC-MS/MS: comparison with HPLC with electrochemical detection [Text] / I. Squellerio, D. Caruso, B. Porro [et al.] // J. Pharm. Biomed. Anal. - 2012. - Vol. 71. - P. 111-118.
71. Dröge, W. Free radicals in the physiological control of cell function [Text] / W. Dröge // Physiol. Rev. - 2002. -Vol. 82, №1. - P. 47-95.
72. Ellman, G. L. Tissue sulfhydryl groups [Text] / G. L. Ellman // Arch. Biochem. Biophys. - 1959. - Vol. 82, № 1. - P. 70-77.
73. European pharmacopoeia [Text] : 2 vol. / Council of Europe, European Directorate for the Quality of Medicines & HealthCare (EDQM). - 8th ed. -Strasbourg : Council of Europe, 2014. - Vol. 1-2, suppl.
74. Filomeni, G. Cell signalling and the glutathione redox system [Text] / G. Filomeni, G. Rotilio, M. R. Ciriolo // Biochem. Pharmacol. - 2002. - Vol. 64, № 5-6. - P. 1057-1064.
75. Forman, H. J. Glutathione: overview of its protective roles, measurement, and biosynthesis [Text] / H. J. Forman, H. Zhang, A. Rinna // Mol. Aspects Med. - 2009. - Vol. 30, № 1-2. - P. 1-12.
76. Forman, H. J.Oxidative signaling and glutathione synthesis [Text] / H. J. Forman, D. A. Dickinson //Biofactors. - 2003. - Vol. 17, № 1-4. - P. 1-12.
77. Franco, R. Apoptosis and glutathione: beyond an antioxidant [Text] / R.Franco, J. A.Cidlowski// Cell. Death. Differ. - 2009. -Vol. 16, №10. - P. 1303-1314.
78. Free radicals and antioxidants in normal physiological functions and human disease [Text] / M. Valko, D. Leibfritz, J. Moncol [et al.] // Int. J. Biochem. Cell. Biol. - 2007. - P. 39, № 1. - P. 44-84.
79. Galano, A. Glutathione: mechanism and kinetics of its non-enzymatic defense action against free radicals[Text] / A.Galano, J. R. Alvarez-Idaboy //RSC Advances. - 2011. - Vol. 1, № 9. - P. 1763-1771.
80. Genetically altered mice to evaluate glutathione homeostasis in health and disease [Text] / T. P. Dalton, Y. Chen, S. N. Schneider [et al.] // Free Radic. Biol. Med. -Vol. 37, № 11. - P. 1511-1526.
81. Ghasemi, J. Application and comparison of two-rate and differential kinetic methods in simultaneous spectrophotometric determination of ascorbic acid and L-cysteine in pharmaceutical samples [Text] / J. Ghasemi, S. Nayebi // Pharmaceutical Chemistry Journal. - 2006. - Vol. 40, № 1. - P. 44-51.
82. Glutathione binding to the Bcl-2 homology-3 domain groove: a molecular basis for Bcl-2 antioxidant function at mitochondria [Text] / A. K. Zimmermann, F. A. Loucks, E. K. Schroeder [et al.] // J. Biol. Chem. - 2007.
- Vol. 282, № 40. - P. 29296-29304.
83. Glutathione is recruited into the nucleus in early phases of cell proliferation [Text] / J. Markovic, C. Borras, A. Ortega [et al.] // J. Biol. Chem. - 2007. -Vol. 282, № 28. - P. 20416-20424.
84. Glutathione measurement in human plasma. Evaluation of sample collection, storage and derivatization conditions for analysis of dansyl derivatives by HPLC [Text] / D. P.Jones, J. L. Carlson, P. S. Samiec [et al.] // Clin. Chim. Acta. - 1998. - Vol. 275, №2. - P. 175-184.
85. Glutathione metabolism during aging and in Alzheimer disease [Text] / H. Liu, H. Wang, S. Shenvi [et al.] // Ann. N. Y. Acad. Sci. - 2004. -Vol. 1019.
- P. 346-349.
86. Glutathione redox potential in the mitochondrial intermembrane space is linked to the cytosol and impacts the Mia40 redox state[Text] / K. Kojer, M. Bien, H. Gangel [et al.] // EMBO J. - 2012. -Vol. 31, №14. - P. 3169-3182.
87. Glutathione synthetase. Purification from rat kidney and mapping of the substrate binding sites [Text] / L. Oppenheimer, V. P. Wellner, O. W. Griffith [et al.] // J. Biol. Chem. - 1979. -Vol. 254, №12. - P. 5184-5190.
88. Glutathione: methods of sample preparation for chromatography and capillary electrophoresis [Text] / E.Blonska-Sikora, J. Oszczudlowski, Z. Witkiewicz[et al.]. -Chemik. - 2012. - Vol. 66, №9. - P. 929-942.
89. Go, Y. M. Redox compartmentalization in eukaryotic cells [Text] / Y. M. Go, D. P. Jones //Biochim. Biophys. Acta. - 2008. - Vol. 1780, № 11. - P. 12731290.
90. Hayes, J. D. Glutathione transferases [Text] / J. D. Hayes, J. U. Flanagan, I. R. Jowsey // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. - 2005. - Vol. 45. - P. 51-88.
91. Hepatocyte-specific Gclc deletion leads to rapid onset of steatosis with mitochondrial injury and liver failure [Text] / Y. Chen,Y. Yang, M. L. Miller [et al.] // Hepatology. - 2007. - Vol. 45, № 5. - P. 1118-1128.
92. High hepatic glutathione stores alleviate Fas-induced apoptosis in mice [Text] / S. Cazanave, A. Berson, D. Haouzi [et al.] // J. Hepatol. - 2007. -Vol. 46, № 5. - P. 858-868.
93. Hissin, P. J. A fluorometric method for determination of oxidized and reduced glutathione in tissues [Text] / P. J. Hissin, R. Hilf // Anal. Biochem. - 1976. -Vol. 74, № 1. - P. 214-226.
94. Hogg, N. The biochemistry and physiology of S-nitrosothiols [Text] / N. Hogg // Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. - 2002. - Vol. 42. - P. 585-600.
95. HPLC analysis of human erythrocytic glutathione forms using OPA and N-acetyl-cysteine ethyl ester: evidence for nitrite-induced GSH oxidation to GSSG [Text] / J. T. Michaelsen, S. Dehnert, D. Giustarini [et al.] // J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. - 2009. - Vol. 877, № 28. - P. 3405-3417.
96. HPLC determination of glutathione and L-cysteine in pharmaceuticals after derivatization with ethacrynic acid [Text] / A. M. Di Pietra, R. Gotti, D.
Bonazzi [et al.] // J. Pharm. Biomed. Anal. - 1994. - Vol. 12, № 1. - P. 9198.
97. HPLC method for determination of glutathione in human plasma [Text] / DU Xiao-li, ZHU Zhu, FU Qiang [et al.] // Chinese Pharmaceutical Journal. -2005. - Vol. 40, №6. - P. 454-457.
98. Human glutamate cysteine ligase gene regulation through the electrophile response element [Text] / D. A. Dickinson, A. L. Levonen, D. R. Moellering [et al.] // Free Radic. Biol. Med. - 2004. - Vol. 37, № 8. - P. 1152-1159.
99. Hussain, S. P. Radical causes of cancer [Text] / S. P. Hussain, L. J. Hofseth, C. C. Harris // Nat. Rev. Cancer. - 2003. - Vol. 3, № 4. - P. 276-285.
100. Iles, K. E. Mechanisms of glutamate cysteine ligase (GCL) induction by 4-hydroxynonenal[Text] / K. E. Iles, R. M. Liu // Free Radic. Biol. Med. -2004. - Vol. 38, № 5. - P. 547-556.
101. Inhibitory role for GABA in autoimmune inflammation [Text] / R. Bhat, R. Axtell, A. Mitra [et al.] // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2010. - Vol. 107, № 6. - P. 2580-2585.
102. Jones, D. P. Redefining oxidative stress [Text] / D. P. Jones // Antioxid. Redox. Signal. - 2006. - Vol. 8, № 9-10. - P. 1865-1879.
103. Jones, D. P. Redox potential of GSH/GSSG couple: assay and biological significance[Text] / D. P. Jones // Methods Enzymol. - 2002. - Vol. 348. - P. 93-112.
104. Khan, Z. Studies on the kinetics and mechanism of interaction of alpha-amino-acids with ninhydrin[Text] / Z. Khan, A.A. Khan // J. Indian Chem. Soc. - 1989. - Vol. 66, № 7. - P. 454-456.
105. Klatt, P. Regulation of protein function by S-glutathiolation in response to oxidative and nitrosative stress [Text] / P. Klatt, S. Lamas // Eur. J. Biochem. - 2000. - Vol. 267, № 16. - P. 4928-4944.
106. Lenton, K. Analysis of glutathione and glutathione disulfide in whole cells and mitochondria by postcolumnderivatization high-performance liquid
chromatography with ortho-phthalaldehyde[Text] /K. J. Lenton, H.Therriault, J. R.Wagner // Anal. Biochem. - 1999. - Vol. 274, № 1. - P. 125-130.
107. Lörincz, T. The determination of hepatic glutathione at tissue and subcellular level [Text] / T. Lörincz, A. Szarka // J. Pharmacol. Toxicol. Methods. -2017. - Vol. 88, pt. 1. - P. 32-39.
108. Lu, S. C. Glutathione synthesis [Text] / S. C. Lu // Biochim. Biophys. Acta. -2013. - Vol. 1830, № 5. - P. 3143-3153.
109. Lu, S. C. Regulation of glutathione synthesis [Text] / S. C. Lu // Mol. Aspects Med. - 2009. - Vol. 30, № 1-2. - P. 42-59.
110. Lu, S. C. Regulation of hepatic glutathione synthesis: current concepts and controversies[Text] / S. C. Lu // FASEB J. - 1999. - Vol. 13, № 1. - P. 11691183.
111. Maclver, F. H. Identification of a Saccharomyces cerevisiae mitochondrial-DNA which can act as a promoter tightly regulated by carbon source when placed in the nucleus[Text] / F. H. MacIver, I. W. Dawes, C. M. Grant // Curr. Genet. - 1997. - Vol. 31, № 2. - P. 119-121.
112. Mammalian cysteine metabolism: new insights into regulation of cysteine metabolism[Text] / M. H. Stipanuk, J. E. Dominy Jr., J. I. Lee [et al.] // J.Nutr. - 2006. - Vol. 136, №6, suppl. - P. 1652S-1659S.
113. Maurer, H. R. Disk-Elektrophorese.theorie und praxis der diskontinuier lichen polyacrylamidgel-elektrophorese [Text] / H. R. Maurer. - Berlin : De Gruyter, 1968. - XVI, 221 s. :82 abb., 15 tabb.
114. Meister, A. Glutathione [Text] / A. Meister, M. E. Anderson // Annu. Rev. Biochem. - 1983. - Vol. 52. - P. 711-760.
115. Meister, A. Glutathione metabolism [Text] / A.Meister // Methods Enzymol. - 1995. - Vol. 251. -P. 3-7.
116. Meister, A. On the discovery of glutathione [Text] / A. Meister // Trends Biochem. Sci. - 1988. - Vol. 13, № 5. - P. 185-188.
117. Micro-method for the determination of glutathione in human blood [Text] / D. Giustarini, P. Fanti, E. Matteucci [et al.] // J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. - 2014. - Vol. 964. - P. 191-194.
118. Misra, I. Expression and purification of human gamma-glutamylcysteinesynthetase[Text] / I. Misra, O.W. Grifith// Protein Expr.Purif. - 1998. -Vol. 13, № 2. - P. 268-276.
119. Modulation of glutamate receptor functions by glutathione [Text] / S. S. Oja, R. Janáky, V. Varga [et al.] // Neurochem. Int. - 2000. - Vol. 37, № 2-3. - P. 299-306.
120. Molecular mechanisms and clinical implications of reversible protein S-glutathionylation [Text] / J. J.Mieyal, M. M. Gallogly, S. Qanungo [et al.] // Antioxid. Redox. Signal. - 2008. -Vol. 10, №11. - P. 1941-1988.
121. Morel, Y. Repression of gene expression by oxidative stress [Text] / Y. Morel, R. Barouki // Biochem. J. - 1999. - Vol. 342, pt. 3. - P. 481-496.
122. Motexafin gadolinium and zinc induce oxidative stress responses and apoptosis in B-cell lymphoma lines [Text] / P. S. Lecane, M. W. Karaman, M.Sirisawad [et al.] // Cancer Res. - 2005. -Vol. 65, №24. - P. 11676-11688.
123. Natural cominventors: position for the treatment of conditions [Text] : pat. 6,340,480 B1 United States : Int. Cl.7 A61K 35/78 / inventors: M. J. Duckett, K. Moore. - № 09/473, 105 ; declared 28.12.1999 ; published 22.01.2002.
124. Nikitovic, D. Inhibition of AP-1 DNA binding by nitric oxide involving conserved cysteine residues in Jun and Fos[Text] / D. Nikitovic, A. Holmgren, G. Spyrou // Biochem.Biophys. Res.Commun. - 1998. -Vol. 242, №1. - P. 109-112.
125. Nuclear glutathione [Text] / J. L. García-Giménez, J.Markovic, F.Dasí [et al.] // Biochim.Biophys.Acta. - 2013. - Vol. 1830, № 5. - P. 3304-3316.
126. O'Brien, M. L. Glutathione and related enzymes in multidrug resistance [Text] / M. L. O'Brien, K. D. Tew // Eur. J. Cancer. - 1996. - Vol. 32A, № 6. - P. 967-978.
127. Ookhtens, M. Role of the liver in interorgan homeostasis of glutathione and cyst(e)ine[Text] / M. Ookhtens, N.Kaplowitz// Semin. Liver Dis. - 1998. -Vol. 18, № 4. - P. 313-329.
128. Optimization of dansyl derivatization and chromatographic conditions in the determination of neuroactive amino acids of biological samples [Text] / X. Kang, J. Xiao, X. Huang [et al.] // Clin.Chim.Acta. - 2006. -Vol. 366, № 1-2. - P. 352-356.
129. Optimization of determination of reduced and oxidized glutathione in rat striatum by HPLC method with fluorescence detection and pre-column derivatization [Text] / M. Gawlik, W. Krzyzanowska, M. B. Gawlik [et al.] // Acta Chromatographics - 2014. - Vol. 26, № 2. - P. 335-345.
130. Orlowski, M. The gamma-glutamyl cycle: a possible transport system for amino acids [Text] / M. Orlowski, A. Meister // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1970. - Vol. 67, № 3. - P. 1248-1255.
131. Ortega, A. L. Glutathione in cancer cell death [Text] / A. L. Ortega, S. Mena, J. M. Estrela // Cancers (Basel). - 2011. - Vol. 3, № 1. - P. 1285-1310.
132. Pobozy, E. Determination of amino acids in saliva using capillary electrophoresis with fluorimetric detection [Text] / E. Pobozy, W. Czarkowska, M. Trojanowicz // J. Biochem. Biophys. Meth. - 2006. - Vol. 67. - P. 37-47.
133. Quantification of glutathione in plasma samples by HPLC using 4-fluoro-7-nitrobenzofurazan as a fluorescent labeling reagent [Text] / X. Wang, D. Chi, D. Song [et al.] // J. Chromatogr. Sci. - 2012. - Vol. 50, № 2. - P. 119-122.
134. Quantification ofreduced and oxidized glutathione in whole blood samples by capillary electrophoresis[Text] / V.Serru, B.Baudin, F. Ziegler[et al.] // Clin. Chem. - 2001. - Vol. 47, № 7. - P. 1321-1324.
135. Quantification of reduced glutathione by HPLC-UV in erythrocytes of hemodialysis patients [Text] / S. C. Garcia, K. Schott, M. Charao [et al.] // Biomed. Chromatogr. - 2008. - Vol. 22, № 5. - P. 460-468.
136. Radola, B. J. Isoelectric focusing in layers of granulated gels. I. Thin-layer isoelectric focusing of proteins [Text] / B. J. Radola // Biochim. Biophys. Acta. - 1973. - Vol. 295, № 2. - P. 412-428.
137. Radola, B. J. Isoelectric focusing in layers of granulated gels. II. Preparative isoelectric focusing [Text] / B. J. Radola // Biochim.Biophys.Acta. - 1975. -Vol. 386, № 1. - P. 181-195.
138. Raoof, J. B. Electrocatalytic oxidation of glutathione at carbon paste electrode modified with 2,7-bis (ferrocenyl ethyl) fluoren-9-one: application as a voltammetric sensor [Text] / J. B. Raoof, R. Ojani, H. Karimi-Maleh // J. Appl. Electrochem. - 2009. - Vol. 39, № 8. - P. 1169-1175.
139. Role of cysteine residues in regulation of p53 function [Text] / R. Rainwater, D. Parks, M. E. Anderson [at al.] // Mol. Cell. Biol. - 1995. -Vol. 15, №7. -P. 3892-3903.
140. Role of glutathione in cancer progression and chemoresistance[Electronic resource] / N. Traverso, R. Ricciarelli, B. Marengo [et ai.] // Oxidative Medicine and Cellular Longevity. - 2013. - Vol. 2013. - Art. 972913. -Mode of access: https://www.hindawi.com/journals/omcl/2013/972913/.
141. Sakhi, A. K. Simultaneous and trace determination of reduced and oxidized glutathione in minute plasma samples using dual mode fluorescence detection and column switching high performance liquid chromatography[Text] / A. K.Sakhi, R.Blomhoff, T. E.Gundersen// J.Chromatogr. A. - 2007. - Vol. 1142, № 2. - P. 178-184.
142. Santa, T. Recent advances in analysis of glutathione in biological samples by high-performance liquid chromatography: a brief overview [Text] / T. Santa // Drug Discov. Ther. - 2013. - Vol. 7, № 5. - P. 172-177.
143. Schafer, F. Q. Redox environment of the cell as viewed through the redox state of the glutathione disulfide/glutathione couple [Text] / F. Q. Schafer, G. R. Buettner // Free Radic. Biol. Med. - 2001. - Vol. 30, № 11. - P. 11911212.
144. Sen, C. K. Antioxidant and redox regulation of gene transcription [Text] /
C. K. Sen, L. Packer // FASEB J. - 1996. -Vol. 10, №7. - P. 709-720.
145. Senft, A. P. Determining glutathione and glutathione disulfide using the fluorescence probe o-phthalaldehyde[Text] / A. P.Senft, T. P. Dalton, H. G. Shertzer// Anal. Biochem. - 2000. - Vol. 280, №1. - P. 80-86.
146. Sequential injection analysis system for on-line monitoring of l-cysteine concentration in biological processes [Text] / S. H. Lee, O. J. Sohn, Y. S. Yim [et al.] // Talanta. - 2005. - Vol. 65, № 2. - P. 187-192.
147. Sies, H. Glutathione and its role in cellular functions [Text] / H. Sies // Free Radic. Biol. Med. - 1999. - Vol. 27, № 9-10. - P. 916-921.
148. Simultaneous electrochemical determination of glutathione and glutathione disulfide at a nanoscale copper hydroxide composite carbon ionic liquid electrode [Text] / A. Safavi, N. Maleki, E. Farjami [et al.] // Anal. Chem. -2009. - Vol. 81, № 18. - P. 7538-7543.
149. Simultaneous femtomole determination of cysteine, reduced and oxidized glutathione, and phytochelatin in maize (Zea mays L.) kernels using highperformance liquid chromatography with electrochemical detection [Text] /
D. Potesil, J. Petrlova, V. Ada [et al.] // J. Chromatogr. A. - 2005. - Vol. 1084, № 1-2. - P. 134-144.
150. Subcellular compartmentalization of glutathione: correlations with parameters of oxidative stress related to genotoxicity [Text] / R. M. Green, M. Graham, M. R. O'Donovan [et al.] // Mutagenesis. - 2006. - Vol. 21, № 6. - P. 383390.
151. Sutariya, V. Development and validation of a novel RP-HPLC method for the analysis of reduced glutathione [Text] / V. Sutariya, D. Wehrung, W. J. Geldenhuys // J. Chromatogr. Sci. - 2012. - Vol. 50, № 3. - P. 271-276.
152. Tahernejad-Javazmi, F. Analysis of glutathione in the presence of acetaminophen and tyrosine via an amplified electrode with MgO/SWCNTs as a sensor in the hemolyzed erythrocyte [Text] / F. Tahernejad-Javazmi, M.
Shabani-Nooshabadi, H. Karimi-Maleh // Talanta. - 2018. - Vol. 176. - P. 208-213.
153. The changing faces of glutathione, a cellular protagonist [Text] / A.Pompella, A.Visvikis, A.Paolicchi [et al.] // Biochem.Pharmacol. - 2003. -Vol. 66, № 8.
- P. 1499-1503.
154. The Japanese pharmacopoeia [Text]: official from April 1, 2016 / The ministry of health, labour and welfare. - Seventeenth ed. - Tokyo :Jihö, 2016.
- 2602, 175 p.
155. The problem of glutathione determination: a comparative study on the measurement of glutathione from plant cells [Electronic resource]/ P. Hajdinak, A. Czobor, T. Lörincz [et al.] // Periodic apolytechnica chemical engineering. - 2018. - Art. 11785. - Modeof access: https://pp.bme.hu/ch/article/view/11785/7973.
156. Therapeutic agent for primary biliary cirrhosis [Text] : pat. 6,339,104 B1
n
United States : Int. Cl.7 A61K 31/195 / inventors: S. Nishiguchi, I. Sounaka. -№ 09/688,339 ;declared16.10.2000 ; published 15.01.2002.
157. Thompson, J. A. Enhanced glutathione biosynthetic capacity promotes resistance to As3+-induced apoptosis [Text] / J. A. Thompson, C. C. Franklin // Toxicol. Lett. - 2010. - Vol. 193, № 1. - P. 33-40.
158. Townsend, D. M. The importance of glutathione in human disease [Text] / D. M. Townsend, K. D. Tew, H. Tapiero // Biomed. Pharmacother. - 2003. -Vol. 57, № 3-4. - P. 145-155.
159. Use of 2,3-naphthalenedicarboxaldehyde derivatization for single-cell analysis of glutathione by capillary electrophoresis and histochemical localization by fluorescence microscopy [Text] / O. Orwar, H. A. Fishman, N. E. Ziv [et al.] // Anal. Chem. - 1995. - Vol. 67, № 23. - P. 4261-4268.
160. Validation of a liquid chromatography tandem mass spectrometry method to measure oxidized and reduced forms of glutathione in whole blood and verification in a mouse model as an indicator of oxidative stress [Text] / S. G.
Lee, J. Yim, Y. Lim [et al.] // J. Chromatogr. B. Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. - 2016. - Vol. 1019. - P. 45-50.
161. Voltammetric determination of reduced glutathione using poly(thionine) as a mediator in the presence of Fenton-type reaction [Text] / B. Liu, C. Ma, Y. Li [et al.] // Talanta. - 2017. - Vol. 170. - P. 399-405.
162. Wang, J. Cancer cell killing via ROS: to increase or decrease, that is the question [Text] / J. Wang, J. Yi // Cancer Biol.Ther. - 2008. -Vol. 7, № 12. -P. 1875-1884.
163. Winterbourn, C. C. Superoxide as an intracellular radical sink [Text] / C. C.Winterbourn // Free Radic. Biol. Med. - 1993. - Vol. 14, № 1. - P. 8590.
164. Wu, H. H. Pyrrolidinedithiocarbamate prevents p53 activation and promotes p53 cysteine residue oxidation [Text] / H. H. Wu, J. Momand // J. Biol. Chem. - 1998. - Vol. 273, № 30. - P. 18898-18905.
165. Yu, B. P. Adaptive mechanisms to oxidative stress during aging [Text] / B. P. Yu, H. Y. Chung // Mech. Ageing Dev. - 2006. - Vol. 127, № 5. - P. 436443.
166. Zuman, P. Reactions of ortho-phthalaldehyde with nucleophiles [Text] / P. Zuman // Chem. Rev. - 2004. - Vol. 104, № 7. - P. 3217-3238.
Материалы внедрения и акты внедрения
ФЕДЕРАЛЫ ЮЕ ГОСУДАРСТВЕН!ЮЕ АВТОНОМ1 ЮЕ ОБРАЗОВ АТЕЛЬЕ ЮЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «БЕЛГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕ IIIIЫЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ» (НИУ «БелГУ»)
УТВЕРЖДАЮ:
эректор по науке ФГА0У ВО ^дайкшскнй государственный л'« - нсследовательскии
«БелГУ»)
^«'лЛтор^вдВДрских наук, профессор * Константинов
-Ж Ш|РЩ?Р го,
хШэ
о внедрении резулИ научно-исследовательской работы в учебный процесс
примесеи ОФ ВЭЖХ
К.А.
Алексеевой модельных
Предмет внедрения: методика идентификации, обнаружения количественного определения глутатиона восстановленного методом помощью предколоночной дериватизации дансилхлоридом.
Авторы (разработчики): Профессор кафедры общей химии, доктор фармацевтических наук Д.И. Писарев; аспирант кафедры общей химии К.А. Алексеева Источник информации. Результаты диссертационной работы «Разработка аналитических подходов к оценке качества глутатиона лекарственных форм па его основе»
Где внедрено. ФГАОУ ВО ПИУ «БелГУ», кафедра общей химии (г. Белгород, ул. Победы, д.85.)
Цель внедрения. Расширение материалов учебного процесса (курс лекции и лабораторных занятий) и НИР кафедры общей химии ФГАОУ ВО НИУ «БелГУ». Результаты внедрения. I [риобретсние студентами и аспирантами кафедры общей химии знаний и практических навыков по современным методам анализа лекарственных форм с пептидами, использованию метода высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Эффективность и значимость внедрения. Представленная информация используется при изложении студентами тематического раздела «Методы анализа лекарственных средств, производных аминокислот» по дисциплине «Фармацевтическая химия».
Заведующий кафедрой общей химии Института фармации, химии и биологии ФГАОУ ВО ПИУ «БелГУ», кандидат химических наук
Директор Института фармации, химии и биологии ФГАОУ ВО ПИУ «БелГУ» доктор фармацевтических наук, профессор
Ю.Н. Козырева
И.В. Спичак
ФЕДЕРАЛЫ ЮЕ ГОСУДАРСТВЕ! IIЮЕ АВТ01ЮМ1 ЮЕ ОБРАЗОВАТЕЛЫ ЮЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ОБРАЗОВАНИЯ «БЕЛГОРОДСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НАЦИОНАЛЬНЫЙ ИССЛ ЕДО ВАТЕЛЬС КИ Й УНИВЕРСИТЕТ» (НИУ «БелГУ»)
V м
ш
ЯВ
Я
УТВЕРЖДАЮ:
г„ по науке ФГАОУ ВО (й^Ро^&кий государственный ' исследовательский
НИУ «БелГУ») * &ЮЙР.|Ш!ССКИХ наук, профессор -■И.С.Константинов 201 г.
Акт
о внедрении результатов научно-исследовательской работы в учебный процесс
Предмет внедрения: методика количественного определения глутатиона восстановленного в составе гранул методом ОФ ВЭЖХ с использованием предколоночной дериватизации о/;шо-фталевым альдегидом.
Авторы (разработчики): Профессор кафедры общей химии, доктор фармацевтических наук Д И Писарев; аспирант кафедры общей химии К.А. Алексеева
Источник информации. Результаты диссертационной работы К.А. Алексеевой «Разработка аналитических подходов к оценке качества глутатиона и модельных лекарственных форм на его основе»
Где внедрено. ФГАОУ ВО НИУ «БелГУ», кафедра общей химии (г. Белгород, ул. 11обеды, д.85.)
Цель внедрения. Расширение материалов учебного процесса (курс лекции, практических и лабораторных занятий) и НИР кафедры общей химии ФГАОУ ВО НИУ «БелГУ». Результаты внедрения. Приобретение студентами и аспирантами кафедры общей химии знаний и практических навыков по современным методам анализа лекарственных форм с пептидами, использованию методов высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ).
Эффективность и значимость внедрения. Представленная информация используется при изложении студентами тематического раздела «Методы анализа лекарственных средств, производных аминокислот» по дисциплине «Фармацевтическая химия».
Заведующий кафедрой общей химии Института фармации, химии и биологии ФГАОУ ВО НИУ «БелГУ», кандидат химических наук
Ю.11. Козырева
Директор института фармации, химии и биологии ФГАОУ ВО НИУ «БелГУ» доктор фармацевтических наук, профессор
И.В. Спичак
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования российский университет дружбы народов испытательный центр «центр коллективного пользования (Научно-образовательный центр)» Аттестат аккредитации № РОСС 1111.0001.21ФЛ05 от 17 сентября 2012 г. Юридический адрес: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6 Фактический адрес: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8/2
http://ccp.rudn.ru
Тел./факс +7 (495) 787 38 03, доб. 2116 ^^ аЬгат0У;сЬ_га@гш1п.ишуег8ку
АКТ О ВНЕДРЕНИИ
Наименование предложения для внедрения: методики идентификации и количественного определения глутатиона восстановленного в объектах природного происхождения с использованием дериватизации дансилхлоридом и 1-бром-2,4-динитробензолом, методом обращенно-фазной высокоэффективной жидкостной хроматографии.
Кем предложено, адрес, исполнители: ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» (НИУ «БелГУ»), кафедра общей химии; 308015, Белгородская область, г. Белгород, ул. Победы, 85; аспирант кафедры общей химии Алексеева К.А. Цель внедрения: обнаружение и количественное определение глутатиона в объектах природного, используя разработанные методики анализа и соответствующую инструментальную базу. Где и кем выдано: г. Москва, ФГАОУ ВО РУДН ИЦЦКП (НОЦ) Результаты внедрения: разработанные методики используются в научной работе центра коллективного пользования ФГАОУ ВО РУД11И11ЦК11 Эффективность внедрения: предложенная методика позволяет получать достоверные результаты об идентификации и количественном содержании глутатиона восстановленного в некоторых объектах природного происхождения. Это свидетельствует о целесообразности применения данной методики.
Руководитель ИЦ ЦКП (НОЦ), д.фарм.н. Директор ЦККЛС, д.фарм.н., профессор
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образовании российский университет дружбы народов испытательный центр «центр коллективного пользования (Научно-образовательный центр)» Аттестат аккредитации № РОСС Яи.ООО 1.21 ФЛ05 от 17 сентября 2012 г. Юридический адрес: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6 Фактический адрес: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8/2
http://ccp.rudn.ru
Тел./факс +7 (495) 787 38 03, доб. 2116 ^^ аЬгат0укЬ_га@шс1п.итуег5ку
Наименование предложения для внедрения: методика идентификации, чистоты и количественного определения глутатиона восстановленного в субстанции, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с предколоночной дериватизацией дансилхлоридом.
Кем предложено, адрес, исполнители: ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» (НИУ «БелГУ»), кафедра общей химии; 308015, Белгородская область, г. Белгород, ул. Победы, 85; аспирант кафедры общей химии Алексеева К.А. в соавторстве.
Цель внедрения: осуществление эффективного контроля качества субстанции глутатиона восстановленного, используя разработанную методику анализа и соответствующую инструментальную базу. Где и кем выдано: г. Москва, ФГАОУ ВО РУДЫ ИЦ ЦКП (НОЦ) Результаты внедрения: разработанная методика используются в научной работе центра коллективного пользования ФГАОУ ВО РУДЕ ! ИЦ ЦК11 для идентификации, контроля чистоты и количественного содержания глутатиона восстановленного в субстанции.
Эффективность внедрения: предложенная методика позволяет получать достоверные результаты о качестве субстанции глутатиона восстановленного, с учётом всех критериев фармацевтического анализа
АКТ О ВНЕДРЕНИИ
Директор ЦККЛС, д.фарм.н., профессо
Руководитель ИЦ ЦКП (НОЦ), д.фарм.
Абрамович Р.А.
Новиков О.О.
Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования РОССИЙСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ ДРУЖБЫ НАРОДОВ ИСПЫТАТЕЛЬНЫЙ ЦЕНТР «ЦЕНТР КОЛЛЕКТИВНОГО ПОЛЬЗОВАНИЯ (Научно-образовательный центр)» Аттестат аккредитации № РОСС 1111.ООО 1.21 ФЛ05 от 17 сентября 2012 г. Юридический адрес: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 6 Фактический адрес: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д. 8/2
http://ccp.rudn.ru
Тел./факс +7 (495) 787 38 03, доб. 2116 ^^ аЬгатоу1сН_га@гайп.ишуег5ку
АКТ О ВНЕДРЕНИИ
Наименование предложения для внедрения: методика идентификации и количественного определения глутатиона восстановленного в гранулах с использованием предколоночной дериватизации орто-фталевым альдегидом, методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Кем предложено, адрес, исполнители: ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» (НИУ «БелГУ»), кафедра общей химии; 308015, Белгородская область, г. Белгород, ул. Победы, 85; аспирант кафедры общей химии Алексеева К.А. Цель внедрения: осуществление эффективного контроля качества гранул, содержащих глутатион восстановленный, используя разработанные методики анализа и соответствующую инструментальную базу. Где и кем выдано: г. Москва, ФГАОУ ВО РУД!I ИЦ ЦК11 (НОЦ) Результаты внедрения: разработанные методики используются в научной и учебной работе центра коллективного пользования ФГАОУ ВО РУДН И1 (IЩI для идентификации, и количественного определения глутатиона
восстановленного.
Эффективность внедрения: предложенные методики позволяют получать достоверные результаты о качестве глутатиона восстановленного с учётом всех критериев фармацевтического анализа. Это свидетельствует о целесообразности применения данной методики.
Руководитель ИЦ ЦКП (НОЦ), д.фарм.н/ .,-•>
Директор ЦККЛС, д.фарм.н., профессору
V'
Абрамович Р.А.
Новиков О.О.
veropharm
Акт апробации спецификации
Мы, ниже подписавшиеся, директор по технологиям и разработкам АО «ВЕРОФАРМ» Хушпульян Д.М. и начальник отдела развития АО «ВЕРОФАРМ» Агарина A.B. удостоверяем, что провели на базе АО «ВЕРОФАРМ» в г. Белгороде апробацию методик оценки качества субстанции «Глутатион восстановленный», включенных в спецификацию, разработанную совместно с ФГАОУ ВО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» (профессор кафедры общей химии, доктор фармацевтических наук Д.И. Писарев; аспирант кафедры общей химии К.А. Алексеева).
Проведенные работы показали воспроизводимость данных методик, включенных спецификацию, в лабораторных условиях АО «ВЕРОФАРМ».
Д.М. Хушпульян
A.B. Агарина
Страница 1 из 8
Контролируемые параметры (критерии качества)
Показатели Методы Нормы
Описание Органолептический Мелкокристаллический порошок белого цвета, без запаха
Растворимость ГФ XIII, ОФС. 1.2.1.0005.15 Легко растворим в воде, очень мало растворим в спирте этиловом, хлороформе.
Подлинность А. ИК-спектр ИК спектр субстанции, снятой в диске с калия бромидом (3 мг субстанции в 150 мг) в области от 4000 см"1 до 500 см"1, по положению полос должен соответствовать ИК-спектру СО глутатиона восстановленного.
Б. ВЭЖХ На хроматограмме, полученной при количественном определении, время удерживания основного пика испытуемого раствора дансильногодеривата глутатиона восстановленного должно соответствовать времени удерживания основного пика стандартного образца на хроматограмме раствора СО дансильногодеривата глутатиона восстановленного
Удельное вращение ГФ XIII, ОФС. 1.2.1.0018.15 От - 15,5 до - 17,5° в пересчёте на сухое вещество (4%-ный раствор)
рН ГФ XIII, потенциометрически ОФС. 1.2.1.0004.15 От 3,0 до 3,2 (1,0%-ный водный раствор)
Прозрачность раствора ГФ XIII, ОФС. 1.2.1.0007.15 Раствор препарата в воде должен быть прозрачным (10%-ный раствор)
Цветность раствора ГФ XIII, ОФС. 1.2.1.0006.15 Раствор препарата в воде должен быть бесцветным (10%-ный раствор)
Температура плавления ГФ XIII, капиллярный метод №1, ОФС 1.2.1.0011.15 От 182 - 185 °С с разложением
Родственные примеси ВЭЖХ На хроматограмме, полученной при количественном определении содержание глутатиона окисленного, должно быть не более 1,5%. Содержание других примесей должно быть не более 0,5%. Суммарное содержание примесей должно быть не более 2,5%
Страница 2 из 8
Потеря в массе при высушивании ГФ XIII, метод высушивания ОФС. 1.2.1.0010.15 Не более 0,5% при температуре 105 °С в течение 3 часов
Сульфатная зола ГФ XIII, ОФС. 1.2.2.2.0014.15 Не более 0,1 %
Хлориды ГФ XIII, ОФС.1.2.2.2.0009.15 Не более 0,02%
Сульфаты ГФ XIII, ОФС.1.2.2.2.0007.15 Не более 0,03%
Тяжелые металлы ГФ XIII, ОФС. 1.2.2.2.0012.15 Не более 0,001%
Железо ГФ XIII, ОФС. 1.2.2.2.0011.15 Не более 0,001%
Микробиологическая чистота ГФ XIII, ОФС. 1.2.4.0002.1 Категория 3 Б
Количественное определение Метод ВЭЖХ с предколоночной дериватизации дансилхлоридом От 98,0 до 102,0 % в пересчёте на сухое вещество
Упаковка По 100 г, 250 г, 500 г или 1,0 кг в банки из оранжевого стекла с навинчиваемыми пластмассовыми крышками. Банки упаковывают в ящики из картона или деревянные ящики
Маркировка В соответствии с НД
Условия хранения В плотно укупоренной упаковке, в сухом защищенном от света месте при температуре от 2 до 5 °С
Срок годности 3 года
Страница 4 из 8
Методики контроля
Описание. Мелкокристаллический порошок белого цвета, без запаха.
Растворимость. Легко растворим в воде, очень мало растворим в спирте этиловом, хлороформе.
Подлинность. ИК спектр субстанции, снятой в диске с калия бромидом (3 мг субстанции в 150 мг) в области от 4000 см"1 до 500 см"1, по положению полос должен соответствовать ИК-спектру СО глутатиона восстановленного.
На хроматограмме, полученной при количественном определении, время удерживания основного пика испытуемого раствора дансильного деривата глутатиона должно соответствовать времени удерживания основного пика стандартного образца на хроматограмме раствора СО дансильного деривата глутатиона.
Удельное вращение. От - 15,5 до - 17,5° в пересчёте на сухое вещество (4%-ный раствор) (ГФХШ, ОФС. 1.2.1.0018.15).
рН. От 3,0 до 3,2 (1,0%-ный водный раствор) (ГФХШ, ОФС. 1.2.1.0004.15).
Прозрачность раствора. Раствор 2,5 г субстанции в 25 мл воды должен быть прозрачным (ГФ XIII, ОФС. 1.2.1.0007.15).
Цветность раствора. Раствор 2,5 г субстанции в 25 мл воды должен быть бесцветным (ГФ XIII, ОФС. 1.2.1.0006.15).
Температура плавления. От 182 - 185 °С с разложением (ГФ XIII, ОФС 1.2.1.0011.15, капиллярный метод).
Сульфатная зола. В соответствии с требованиями ГФ XIII, ОФС.1.2.2.2.0014.15. Содержание сульфатной золы должно быть не более 0,1%.
Микробиологическая чистота. В соответствии с требованиями ОФС. 1.2.4.0002.15 «Микробиологическая чистота».
Потеря в массе при высушивании. Не более 0,5% (ГФ XIII, ОФС. 1.2.1.0010.15 «Потеря в массе при высушивании» метод высушивания, способ 1). Для определения используют около 0,5 г субстанции.
Хлориды. 2,5 г субстанции помещают в коническую колбу вместимостью 25 мл, растворяют в 10 мл воды и доводят тем же растворителем до метки (раствор А). 2,5 мл раствора А растворяют в 15 мл воды (раствор Б). Раствор Б должен выдерживать испытания на хлориды (ГФ XIII, ОФС. 1.2.2.2.0009.15). Содержание хлоридов должно быть не более
Название: Спецификация на фармацевтическую субстанцию Глутатион восстановленный
0,02%.
Сульфаты. 5,0 мл раствора А растворяют в 15 мл воды (раствор Б). Раствор Б должен выдерживать испытания на сульфаты (ГФ XIII, ОФС. 1.2.2.2.0007.15). Содержание сульфатов должно быть не более 0,03%.
Железо. 1,0 мл раствора А растворяют в 10 мл воды (раствор Б). Раствор Б должен выдерживать испытания на железо (ГФ XIII, ОФС. 1.2.2.2.0011.15, метод 1). Содержание железа должно быть не более 0,001%.
Тяжёлые металлы. 10,0 мл раствора А должны выдерживать испытания на тяжёлые металлы (ГФ XIII, ОФС.1.2.2.2.0012.15, метод 1). Содержание тяжёлых металлов должно быть не более 0,001%.
Родственные примеси. Определение примесей проводят методом ВЭЖХ в условиях методики количественного определения глутатиона восстановленного. На хроматограмме, полученной при количественном определении, содержание глутатиона окисленного должно быть не более 1,5%). Содержание других примесей должно быть не более 0,5%. Суммарное содержание примесей должно быть не более 2,5%.
Количественное определение. Определение проводят методом ВЭЖХ после предварительной дериватизации глутатиона восстановленного дансилхлоридом.
Приготовление испытуемого раствора глутатиона.
0,1 глутатиона восстановленного (точная навеска) помещают в мерную колбу, вместимостью 100 мл, приливают 20 мл 0,05 н. раствора натрия тетрабората, взбалтывают до полного растворения вещества и раствор доводят до метки тем же растворителем, перемешивают.
Приготовление 0,05 Мраствора натрия тетрабората.
19,02 г натрия тетрабората помещают в мерную колбу вместимостью 1000 мл, приливают 800 мл воды и перемешивают до полного растворения вещества. Смесь доводят водой до метки и перемешивают.
Приготовление 0,1%-ного раствора дансилхлорида.
0,025 г вещества (точная навеска) помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, добавляют 10 мл метанола, перемешивают до полного растворения вещества и доводят объём раствора до метки тем же растворителем и перемешивают.
Приготовление дансильного деривата глутатиона восстановленного.
2 мл приготовленного раствора глутатиона восстановленного в 0,05 М растворе натрия тетрабората помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 2 мл 0,1%-ного раствора дансилхлорида, взбалтывают.
Название: Спецификация на фармацевтическую субстанцию Глутатион восстановленный
Полученный раствор доводят до метки 0,05 н. раствором натрия тетрабората, перемешивают и хроматографируют в приведённых выше условиях.
Приготовление раствора для проверки пригодности хроматографической системы
0,025 г цистеина (примесь в глутатионе) и 0,025 г субстанции глутатиона восстановленного помещают в мерную колбу вместимостью 25,0 мл, растворяют в 10 мл 0,05 М раствора натрия тетрабората, доводят объём раствора до метки тем же растворителем и перемешивают.
По 1,0 мкл испытуемого раствора, раствора сравнения (для подлинности и количественного определения) или 5 мкл испытуемого раствора (для определения примесей) хроматографируют на жидкостном хроматографе в следующих условиях:
- колонка стальная АзсепИзехргезя С\&2,7¡им х 100 мм х 4,6 мм или аналогичная
- подвижная фаза(А) - 1%-ный водный раствор кислоты муравьиной, (Б) - спирт этиловый. Элюирование проводят в следующих условиях:
Скорость потока подвижной фазы: 0,5 мл/мин
Температура колонки: 35 °С
Детектирование диодно-матричное, длина волны детектирования при количественном определении - 284 нм, при определении примесей - 288 нм
Объём вводимой пробы: 1 мкл (подлинность, количественное определение), 5 мкл (примеси)
Подлинность, чистоту и количественное определение глутатиона восстановленного в субстанции проводят в градиентном режиме элюирования. Условия градиентного элюирования приведены в таблице.
Условия градиентного элюирования дансильного деривата глутатиона
Время, мин А,% в,%
0 100 0
60 0 100
Расчет количественного определения глутатиона восстановленного проводят по площади полученного пика, которая должна соответствовать площади пика его стандарта.
Расчёт содержания глутатиона восстановленного в 1,0 г субстанции в процентах в пересчёте на сухое вещество проводят по формуле:
х =
Sx х тохР х 100
Scm хтхх (100 - W) где:
Sx - среднее значение площадей пиков глутатиона восстановленного, вычисленное из хроматограмм испытуемого раствора;
Sct. — среднее значение площадей пиков глутатиона восстановленного, вычисленное из хроматограмм раствора сравнения;
Название: Спецификации на фармацевтическую субстанцию Глутатион восстановленный
Scr. - среднее значение площадей пиков глутатиона восстановленного, вычисленное из хроматограмм раствора сравнения; т0 — масса навески СО глутатиона восстановленного, в граммах; шх - масса навески субстанции глутатиона восстановленного, в граммах;
Р - содержание основного вещества в СО глутатиона восстановленного, %;
W - потеря в массе при высушивании.
Проверка пригодности хроматографической системы для дансильного деривата глутатиона восстановленного.
Хроматографическая система считается пригодной, если хроматограммах раствора сравнения выполняются следующие условия:
на
- эффективность хроматографической колонки, рассчитанная по пику дансильного деривата глутатиона восстановленного должна быть не менее 56000 теоретических тарелок;
- коэффициент разделения пиков дансильного деривата глутатиона и цистеина должен быть не менее 15;
- относительное стандартное отклонение площади пика дансильного деривата глутатиона восстановленного должно быть не более 2,0 %.
- коэффициент симметрии пика дансильного производного глутатиона восстановленного на хроматограммах испытуемого раствора и раствора сравнения глутатиона восстановленного должен быть от 0,6 до 1,0.
Содержание СшН^ЫзО^ в субстанции должно быть не менее 98,0% и не более 102,0 % в пересчёте на сухое вещество.
Разработал:
Проф. кафедры общей химии НИУ «БелГУ», д. фармацевтических наук
Аспирант кафедры общей химии НИУ «БелГУ»
Согласовал:
Директор по технологиям и разработкам АО «Верофарм»
C2i
(подпись) (ПОДПИСЬ)
Д.И. Писарев (Рас и I ифроп ка iтодпиен)
«/У» 2018 г
К.А. Алексеева (Расшифровка подписи)
«/9» Уч^ 2018 г
Д.М. Хупшульян
(Расшифровка подписи)
«/>» /¿С 2018 г
Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.