Новая облигатная метилотрофная бактерия Methylophilus sp. В-7741 как продуцент дейтрированной биомассы и экзополисахарида тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат химических наук Нево Суфо Ален Нарсис

• Нево Суфо Ален Нарсис
• кандидат химических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат химических наук Нево Суфо Ален Нарсис

СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

КЛЮЧЕВЫЕСЛОВА.

СОДЕРЖАНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Применение дейтерированных соединений и методы их получения.

1.1.1. Применение дейтерированных соединений.

1.1.2. Методы получения дейтерированных БАС.

1.2.Влияние оксида дейтерия на рост, биохимию и физиологию микроорганизмов.

1.2.1. Сравнительный анализ физико-химических свойств 'НгО и 2НгО.

1.2.2. Влияние НгО на рост и морфологию микроорганизмов, феномен клеточной адаптации к 2НгО.

1.2.3. Влияние НгО на скорость ферментативных реакций и метаболизм углерода.

1.2.4. Влияние 2НгО на метаболизм нуклеиновых кислот, экспрессию генов и генетический контроль.

1.2.5. Влияние Н2О на физиологию микроорганизмов.

1.3. Связь клеточного ответа на Н2О и другие стрессовые факторы.

1.3.1. Перекрестная адаптация к стрессам у микроорганизмов.

1.3.2. Участие экзометаболитов (внеклеточных факторов) в адаптации клетки к стрессам.

1.4. Метилотрофные бактерии как объекты изотопной биотехнологии.

1.4.1 Основные свойства метилотрофных бактерий.

1.4.1.1. Особенности метилотрофных бактерий.

1.4.1.2. Характеристика первого и ключевого фермента ассимиляции метанола у метилотрофных бактерии - метанолдегидрогеназы.

1.4.2. Биотехнологический потенциал метилотрофных бактерий.

1.4.2.1. Экзополисахариды метилотрофных бактерий.

1.4.4.2. Генетическое исследование метилотрофных бактерий.

1.4.3. Получение дейтерированных БАС с использованием метилотрофных бактерий.,

ГЛАВА 2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

2.1. Влияние дейтерометанола и оксида дейтерия на кинетику роста облигатных метилотрофных бактерий Methylophilus sp. В-7741.

2.1.1. Определение кинетических параметров роста Methylophilus sp. В

РЬ в средах различного изотопного состава.

2.1.2. Влияние содержания дейтерометанола в субстрате на рост Methylophilus sp. В-7741.

2.1.3. Влияние ступенчатой адаптации бактерий Methylophilus sp. В-7741 к 2Н20-содержащим средам на продолжительность лаг-фазы, цтах и Y^.

2.1.4. Определение оптимальных условий - температуры и рН (р2Н) - для роста бактерий Methylophilus sp. В-7741 в дейтерированных средах.

2.2. Оксид дейтерия как стрессовый фактор у Methylophilus sp. В-7741.

2.2.1. Влияние условий выращивания посевного материала на параметры роста в

W^ дейтерированной среде.

2.2.2. Определение активности каталазы в клетках, выращенных в обычной и дейтерированной среде.50.

2.2.3. Изучение биологического действия дейтерированной бесклеточной жидкости на рост Methylophilus sp. В-7741 в дейтерированной среде.

2.3. Влияние дейтерирования на активность МДГ Methylophilus sp. В-7741.

2.3.1. Активность МДГ в экстракте 'Н и 2Н-биомассы Methylophilus sp. В-7741.

2.3.2. Изучение изотопного эффекта субстрата в реакции, катализируемой

МДГ Methylophilus sp. В-7741.

2.3.3. Изучение изотопного эффекта растворителя в реакции, катализируемой

МДГ Methylophilus sp. В-7741.

2.3.4. Изучение влияния рН на активность МДГ в экстракте Н и Н-биомассы Methylophilus sp. В-7741.

2.4. Влияние дейтерия на биосинтез ЭПС у Methylophilus sp. В-7741.

2.4.1. Влияние питательных сред с разными уровнями содержания дейтерия на биосинтез ЭПС.

2.4.2. Влияние температуры и рН на биосинтез ЭПС в 'Н- и 2Н-среде.64.

2.5. Исследование углеводного состава ЭПС и определение степени включения дейтерия в ЭПС.

2.5.1. Выделение и очистка ЭПС Methylophilus sp. В-7741.

2.5.2. Гидролиз ЭПС Methylophilus sp. В-7741 и определение углеводного состава гидролизата хроматографическими методами.

2.5.3. Изучение углеводного состава гидролизата ЭПС

Methylophilus sp. В-7741 методом 'Н и 13С-ЯМР спектроскопии.

2.5.4. Определение степени включения дейтерия в ЭПС при выращивании Methylophilus sp. В-7741 в максимально дейтерированной среде.

ГЛАВА 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1. Материалы.

3.1.1. Микробиологический объект.

3.1.2. Реагенты.

3.1.3. Приборы.

3.1.4. Питательные среды для культивирования Methylophilus sp. В-7741.

3.2. Методы.

3.2.1. Культивирование бактерий Methylophilus sp. В-7741.

3.2.2. Ступенчатая адаптация бактерий Methylophilus sp. В-7741 к средам, приготовленным на основе 2Н20.

3.2.3. Приготовление посевного материала, адаптированного к осмотическому и окислительному стрессу.

3.2.4. Определение ростовых параметров.

3.2.5. Получение бесклеточных КЖ.

3.2.6. Определение концентрации экзополисахарида.

3.2.7. Приготовление клеточного экстракта из Н- и Н-биомассы.

3.2.8. Определение содержания белка в клеточных экстрактах по методу

Лоури.

3.2.9. Определение активности каталазы.

3.2.10. Определение активности МДГ.

3.2.11. Частичный гидролиз в 0,1 н ТФУ.

3.2.12. Полный гидролиз в 2 н ТФУ.

3.2.13. Получение 1,2,3 Дб-пента-О-ацетил-р-Б-глюкопиранозы.

3.2.14. Ацетилирование гидролизата дейтерированного ЭПС.

3.2.14. Анализ состава гидролизатов методом ТСХ, БХ, и ВЭЖХ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Новая облигатная метилотрофная бактерия Methylophilus sp. В-7741 как продуцент дейтрированной биомассы и экзополисахарида»

Широкое применение биологически активных соединений (БАС), меченных стабильными изотопами, в частности дейтерием, в структурных и фармакокинетических исследованиях обусловило необходимость поиска новых подходов к их получению. В последние годы особое внимание уделяется разработке методов биосинтетического получения стабильномеченых БАС.

Метилотрофные бактерии являются перспективным источником различных классов стабильномеченых БАС. Перспективность метилотрофов как продуцентов дейтерированной биомассы, аминокислот, жирных кислот, экзополисахаридов и других соединений обусловлена тем, что в качестве единственного источника углерода такие бактерии способны использовать Сi-соединения, например, метанол. Это делает процесс культивирования более технологичным и позволяет получить необходимые БАС с высокой степенью включения дейтерия.

Важной проблемой биосинтеза дейтерированных соединений является токсичность дейтерированной воды как одного из основных источников дейтерия. Целый ряд вопросов, которые касаются практического использования различных штаммов-продуцентов БАС для роста и биосинтеза целевых продуктов в высокодейтерированных средах, остаются до конца невыясненными из-за сложности их адаптации к оксиду дейтерия. Решение этой проблемы позволит резко увеличить возможности биосинтетического метода получения дейтерированных БАС.

Механизм и закономерности процесса адаптации и роста бактерий, в том числе метилотрофных, в высокодейтерированных средах (средах с высокими концентрациями оксида дейтерия и дейтерометанолом) не вполне понятны, хотя биологические эффекты дейтерия подробно изучались. В связи с этим, изучение биохимических и физиологических особенностей роста и биосинтеза в тяжелой воде у микроорганизмов продолжает быть актуальной задачей как для получения различных дейтерированных соединений, так и в плане изучения биологически важного феномена адаптации к оксиду дейтерия.

Многие метилотрофные бактерии характеризуются способностью секретировать внеклеточные полисахариды (ЭПС). Дейтерированные ЭПС, полученные при культивировании этих микроорганизмов в высокодейтерированной среде, являются источниками дейтерированных углеводов, используемых в настоящее время как в качестве источника углерода для выращивания гетеротрофных микроорганизмовпродуцентов дейтерированных БАС, так и прямо в различных биомедицинских исследованиях.

Цель работы

Целью настоящей работы было изучение особенностей роста метилотрофных бактерий и биосинтеза ЭПС при замене метанола на дейтерометанол и воды на оксид дейтерия в культуральной среде с использованием в качестве модели новых облигатных метилотрофных бактерий Methylophilus sp. В-7741.

Этапы исследования включали:

1 - Изучение влияния дейтерометанола и оксида дейтерия на ростовые характеристики облигатных метилотрофных бактерий Methylophilus sp. В-7741.

2 - Изучение возможности перекрестной адаптации к дейтерированной среде и другим стрессам - осмотическому и окислительному, а также изучение возможности участия внеклеточных факторов в процессе адаптации к дейтерированной среде.

3 - Изучение влияния дейтерирования на активность МДГ Methylophilus sp. В-7741.

4 - Изучение дейтерирования ростовой среды на биосинтез ЭПС у Methylophilus sp. В-7741.

5 - Выделение и изучение углеводного состава ЭПС; определение степени включения дейтерия в этот биополимер при максимальном дейтерировании ростовой среды.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Нево Суфо Ален Нарсис

ВЫВОДЫ

1 — Изучено влияние дейтерометанола и оксида дейтерия на ростовые характеристики новых облигатных метилотрофных бактерий Methylophilus sp. В-7741. Показано, что эти дейтерированные субстраты снижают константы ртах, Ks, Kt и Y^.

2 — Проведена адаптация Methylophilus sp. В-7741 к росту в высокодейтерированной среде. Показано, что в результате адаптации продолжительность лаг-фазы удалось сократить в три раза, артах и Y^ повысить в 6 и 3 раза, соответственно.

3 — Обнаружена способность к перекрестной адаптации Methylophilus sp. В-7741 к 2Н20 и к другим стрессам - осмотическому и окислительному, а также участие экзометаболитов-адаптогенов в этом процессе. На основании этих данных предложен подход к упрощению метода получения культур метилотрофных бактерий, адаптированных к высокодейтерированным средам.

4 — В бесклеточных экстрактах изучено влияние дейтерия метанола, воды и дейтерия в самом белке на активность ключевого фермента ассимиляции метанола МДГ. Показано, что активность МДГ Methylophilus sp. В-7741 снижается при полном дейтерировании этого белка. Впервые обнаружен стимулирующий эффект 2Н20 как растворителя на реакцию, катализируемой МДГ.

5 — Установлено, что культура Methylophilus sp. В-7741 способна синтезировать значительные количества внеклеточных полисахаридов. Изучено влияние ростовых факторов и условий культивирования на биосинтез ЭПС. Показано, что снижение

I "У температуры приводит к увеличению накопления ЭПС как в Н- так и в Н-среде.

6 — Изучен химический состав ЭПС, секретируемых Methylophilus sp. В-7741. Обнаружено присутствие углеводных остатков Galр, Glcр, Rhap.

7 — При использовании максимально дейтерированной ростовой среды получены препараты ЭПС, в которых включение дейтерия составляет не менее 95 ат.% дейтерия. Таким образом, культуру Methylophilus sp. В-7741 можно рассматривать как перспективную для использования в качестве продуцента тотально дейтерированных БАС.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Нево Суфо Ален Нарсис, 2003 год

1. Schwarcz Н.Р. Use of stable isotopes to determine compliance. // Control. Clin. Trials. 1984. V.5. №.4 Suppl. P.573-575.

2. Jiang G., Tang G., Wang S., Wang C., Zheng L. Studies on urinary metabolites of perlolyrine in rats. // Zhongguo Yi Xue Ke Xue Yuan Xue Bao. 2000. V.22. №.2. P.154-158.

3. Toriba A., Chetiyanukornkul Т., Kizu R., Hayakawa K. Quantification of 2-hydroxyfluorene in human urine by column-switching high performance liquid chromatography with fluorescence detection. // Analyst. 2003. V.128. №.6. P. 605-610.

4. Wegmann H., Curtius H.C., Gitzelmann R., Otten A. Nutritive value of N-acetyl-L-tryptophan in man.// Helv. Paediatr. Acta. 1979. V.43. №.5. P.497-508.

5. Wenzel M. Erhohte gehirn-affinitat von 131J-markierten N-(alkyl)-amphetaminen nach deuterierung. // J.Labelled Compd. Radiopharm. 1989. V.27. P. 1143-1155.

6. Baker M.T., Ronnenberg W.C., Jr., Ruzicka J.A., Chiang C.K., and Tinker J.H. Inhibitory effects of deuterium substitution on the metabolism of sevoflurane by the rat. Drug Metab. Dispos. 1993. V.21.P.1170-1171.

7. Foster A.B. Deuterium isotope effects in studies of drug metabolism. TIPS. 1984. V.5. P.524-527.

8. Abrahamsson S., Dinh-Nguyen N., Hellgren L.G., Vincent J.C. Patent SE 42601 IB. 1982.

9. Merck and Co., Inc. US Patent 4028405. 1977.

10. Henderson R. The structure of purple membrane from Halobacterium halobium analysis of the X-ray diffraction patterns. //J. Mol. Biol. 1975. V.93. №2. P.123-132.

11. Michel H., Oesterhelt D. Three-dimentional crystals of membrane proteins: bacteriorhodopsin.// Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1980. V.77. №. 3. P.1283-1285.

12. Campbell I.D., Sheard B. //Trends Biotechnol. 1987. V.5. P.302-306.

13. Griesinger C., Sorensen O.W., Ernst R.R. Three-dimentional Fourier spectroscopy. Application to high-resolution NMR. // J.Magn.Res. 1989. V.84. P. 14-63.

14. Griesinger C., Sorensen O.W., Ernst R.R. Novel three-dimentional NMR techniques for studies of peptides and biological macromolecules. // J.Am.Chem.Soc. 1987. V.109. P.7227-7228.

15. LeMaster D.M., Richards F.M. NMR Sequential Assignment of Escherichia coli Thioredoxin Utilizing Random Fractional Deuteriation. // Biochemistry. 1988. V.27. P.142-150.

16. Oda Y., Nakamura H., Yamazaki Т., Nagayama K., Yoshida M., Kanaya S., Ikehara M. 1H NMR studies of deuterated ribonuclease HI selectively labeled with protonated amino acids. //Journal of BiomolecularNMR. 1992. V.2. P.137-147.

17. Hsu V.L., Armitage I.M. Solution Structure of Cyclosporin A and a Nonimmunosuppressive Analog Bound to Fully Deuterated Cyclophilin. // Biochemistry. 1992. V.31. P.12778-12784.

18. Gardner K.H., Zhang X., Gehring K., Kay L.E. Solution NMR Studies of a 42 Kda Escherichia coli Maltose Binding Protein/p-CycIodextrin Complex: Chemical Shift Assignments and Analysis. //J. Am. Chem. Soc. 1998. V.120. P.l 1738-11748.

19. Nieba-Axmann S.E., Ottiger M., Wuthrich K., Pluckthun A. Multiple cycles of global unfolding of GroEL-bound cyclophilin A evidenced by NMR. // J.Mol.Biol. 1997. V.271. №.5. P.803-818.

20. Gu S., Pan S., Bradbury E.M., Chen X. Use of deuterium-labeled lysine for efficient protein identification and peptide de novo sequencing. // Anal. Chem. 2002. V.74. №.22. P.5774-5785.

21. Kyle D.J., Gladue R., Vail P. Biodeuteration: a novel method for the production of deuterated lubricants.//J. Soc. Tribologists and Lubrication Engineers 1998. V.45. P.335-359.

22. Toray Industries, Inc. Patent J.P. 7010699. 1995.

23. Mitsui Petrochem. Ind. Co., Ltd. Patent JP. 6128557. 1994.

24. Iwamoto M., Maeda M., Sakoda K., Patent EP 501515. 1992.

25. Barker C.E., Eimerl D., Velsko S.P., Roberts D. Patent U.S. 7981636. 1992.

26. Kitahara Т., Ohnori N. Tomihashi N., Ohmori A. Patent EP 128517. 1984.

27. Mitsubishi Rayon KK. Patent JP 59084203.1984.

28. Пшеничникова А.Б., Карнаухова Е.Н., Звонкова Е.Н., Швец В.И. Методы получения дейтерированных аминокислот. // Биоорганическая химия. 1995. Т.21. №.3. С.163-178.

29. Пшеничникова А.Б., Карнаухова Е.Н., Мицнер Б.И., Дубовский П.В., Швец В.И. Изотопный обмен водорода в ароматических аминокислотах. Журнал Общей Химии. // 1993. Т.63. №.5. С. 1034-1040.

30. Griffiths D., Feeney J., Roberts G., Burgen A.S.V. Preparation of selectivelely deuterated aromatic amino acids for use in 1H NMR studies of proteins.// Biochim. Biophys. Acta. 1976. V.446. P. 479-485.

31. Foster R.T., Lewanczuk R., Caille G., Enhancement of the efficacy of nifedipine by deuteration. 1998, US Patent. №. 5. V.846. P.514.

32. Blomquist A.T., Hiscock B.F., Harpp D.N.// J. Org. Chem. 1966. V.31. №.1. P.338-339.

33. Engelman H., Niclas H., Dauert A. Verfahren zur Herstellunng von Glycin-Ds mit hoher Isotopenanreicherung: Патент ГДР. 1989. №. 263191 // Р.Ж. Химия. 1989. №. 21.210155П.

34. Yamamoto D.M., Upson D.A., Linn D.K., Hruby V.J. // J.Amer. Chem. Soc. 1977. V.99. №. 5. P.1564-1570.

35. Kluender H., Huang Fu-Chih, Fritzberg A., Schnoes H., Sih C.J. // J.Amer. Chem. Soc. 1974. V.96. №. 12. P.4054-4055.

36. Wong C.H., Whitesides G.M. //J.Amer.Chem. Soc. 1983. V.105. №.15. P.5012-5014.

37. Field S.J., Young D.W.// J.Chem.Soc.Chem.Communs. 1979. V.l 163-1165.

38. Lee K.M., Ramalingam K., Son J.K., Woodard R.W. // J.Org.Chem. 1989. V.54. №. 13. P.3195-3198.

39. Mcintosh L.P., Dahlquist F.W., Biosynthetic incorporation of 15N and 13C for assignment and interpretation of nuclear magnetic resonance spectra of proteins. // Quarterly Reviews of Biophysics. 1990. V.23. P. 1-38.

40. Katz J.J., Crespi H.L. // Science. 1966. V.151. P.l 187-1191.

41. Crespi H.L. // Stable Isotopes in the Life Sciences / Ed. Freeman S.M. Vienna: Int. Atomic Energy Agency, 1977. P. 111 -121.

42. Karnaukhova E.N., Reshetova O.S., Semenov S.Y., Skladnev D.A., Tsygankov Yu.D. // Amino Acids. 1994. V.6. №1. P. 165-176.

43. Skavenkova M.I., Satterlee J.D., Erman J.E., Siems W.F., Helms G.L. Expression, Purification, Characterization, and NMR Studies of Highly Deuterated Recombinant Cytochrome С Peroxidase // Biochemistry 2001. V.40. P. 12123-12131.

44. Massou S., Puech V., Talmont F., Demange P., Lindley N.D., Tropis M., Milon A., Heterolougous expression of a deuterated membrane-integrated receptor and partial deuteration in methylotrophic yeasts.// J. Biomol. NMR. 1999. V.14. P.231-239.

45. Sosa-Peinado A., Mustafi D., Makinen M.W. Overexpression and biosynthetic deuterium enrichment of TEM-1 p-Lactamase for structural characterization by magnetic resonance methods // Protein Express. Purif. 2000. V.19. P.235-245.

46. Rosen M.K., Gardner K.H., Willis R.C., Parris W.E., Pawson Т., Kay L.E. Selective methyl group protonation of perdeuterated proteins. // J. Mol. Biol. 1996. V.263. P.627-636.

47. Rajesh S., Nietlispach D., Nakayama H., Takio K., Laue E.D., Shibata Т., Ito Y. A novel method for the biosynthesis of deuterated proteins with selective protonation at the aromatic rings of Phe, Tyr, and Тф. // J. Biomol. NMR. 2003. V.27. №1. P.81-86.

48. Haon S., Auge S., Tropis M., Milon A., Lindley N.D. // J. Label. Сотр. Radiopharm. 1993. V.33. P.1053-1063.

49. Gross R.A., Ulmer H.W., Lenz R.W., Tshudy D.J., Uden P.C., Brandt H., Fuller R.C. Biodeuteration of poly (P-hydroxybutyrate). // Int. J. Biol. Macromol. 1992. V.14. P.33-40.

50. Urey H.C., Brickwedde F.G., Murphy G.A. Hydrogen isotope of mass 2. Phys. Rev., 1932. V.39.P.164.

51. Шатенштейн А.И., Варшавский Я.М., Дыхно H.M., Звягинцева Е.Н., Израилевич Е.А., Калиначенко В.Р., Яковлева Е.А. Изотопный состав воды. 1954. Изд. АН СССР.

52. Homma Y., Murase Y. 1990. Radioactivity in deuterated compounds. J. Radioanalytical Nuclear Chem. 146. №.1. P.205-210.

53. Bigeleisen J., Lee M.W., Mandel F. Equilibrium isotope effects. Annual Rev. Phys. Chem., 1973. V.24. P.407-440.

54. Flaumenhaft E., Bose S., Crespi H.L., Katz J.J. Deuterium isotope effects in cytology. Int. Rev. Cytol. 1965. V.18. P.313-361.

55. Лобышев В.И., Калиниченко Л.П. Изотопные эффекты D20 в биологических системах. М.: Наука. 1978. С.35-42.

56. Unno. К., Busujima H., Shimba S., Narita K., Okada S., Characteristics of growth and deuterium incorporation in Chlorella ellipsoidea grown in deuterium oxide. Chem. Pharm. Bull. 1988. V.36. P.l828-1833.

57. Еремин B.A., Чекулаева JI.H. Харатьян Е.Ф., Островский Д.Н. Выращивание бактерий Micrococcus lysodeikticus на дейтерированной среде. Микробиология. 1978. T.XLVII. №.4. С.629-636.

58. Unno К., Ando I., Hagima N., Yokogaki S., Koike C., Okada S. Growth delay and intracellular changes in Chlorella ellipsoidea C-27 as a result of deuteration. Plant. Cell. Physiol. 1992. V.33. №.7. P.963-969.

59. Moses V., Holm-Hansen O., Calvin M. Response of Chlorella to a deuterium environment. // Biochim. Biophys. Acta. 1958. V.28. P.62-70.

60. Chorney W., Scully N.J., Crepsi H.L., Katz J.J. The growth of algae in deuterium oxide. // Biochim. Biophys. Acta. 1960. V.37. P.280-287.

61. Unno K., Busujima H., Shimba S., Narita K., Okada S. Characteristics of growth and deuterium incorporation in Chlorella ellipsoidea grown in deuterium oxide. // Chem. Pharm. Bull. 1988. V.36., №.5. P.1828-1833.

62. Morgan W.D., Kragt A., Freeney J. Expression of deuterium isotope-labeled in yeast Pichiapastoris for NMR studies // J. Biomol. NMR 2000. V. 17. P.337-347.

63. Hochuli M., Szyperski Т., Wuthrich K. Deuterium isotope effects on the central carbon metabolism of Escherichia coli grown on a D20-containing minimal medium. J. Biomol. NMR. 2000. V.17. P.33-42.

64. Klinman J.P. in: Isotope effects on enzyme-catalyzed reactions (Cleland, W.W.et al. Eds). 1977. P. 176-208. University Park Press, Baltimore.

65. Klinman J.P. Adv. Enzymol. 1977. V.46. P.415-494.

66. Schowen B.K., Schowen R.L. //Methods. Enzymol. 1982. V.87. P.551-606.

67. Rebholz K.L., Northrop D.B. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1991. V.176. P.65-69.

68. Whittaker M.M., Ballou D.P., Whittaker J.W. Kinetic isotope effects as probes of the mechanism of galactose oxidase. // Biochemistry. 1998. V.37. P.8426-8436.

69. Alvarez F.J., Ermer J., Hubner G., Schellenberger A., Schowen R.L. // J. Am. Chem. Soc. 1995. V.117. P.1678-1683.

70. Parsons J.F., Armstrong R.N. //J. Am. Chem. Soc. 1996. V.l 18. P.2295-2296.

71. Henseling J., Rohm K.H. Unusual solvent isotope effects on the amino acylase-catalyzed hydrolysis of acetylamino acids. // FEBS Letters. 1997. V.219. №.1. P.27-30.

72. Shimba S., Unno K., Okada S. Differential cellular isotope effect of deuterium on photosynthetic metabolism of carbon in Cholorella ellipsoidae. Plant Cell Physiol. 1990. V.31. №.1. P.159-162.

73. Shimba S., Unno K., Okada S. Characteristics of the photosynthetic metabolism of carbon in deuterated Chlorella ellipsoidea C-27. Plant Cell Physiol. 1993. V.34. N.2. P.255-262.

74. Rittenberg S.M., Borek E. A study of a completely deuteriated enzyme. Proc. N. A. S. 1961. V.47. P.l772-1775.

75. Rokop S., Gajda L., Parmerter S., Crespi H.L., Katz J.J. Purification and characterization of fully deuterated enzymes. Biochim. Biophys. Acta. 1969. V.l 91. P.707-715.

76. Strain H.H., Thomas M.R., Crespi H.L., Blanke M.I., Katz J.J. Chloroplast pigment and photosyntesis in deuterated green algae. Ann. N.Y.Acad.Sci. 1960. V.84. P.617-633.

77. Bose S., Crespi H.L., Blanke M.I., Katz J.J. Comparative studies of photosynthetic processes in ordinary and fully deuterated algae. Plant Cell Physiol. 1967. V.8. P.545-555.

78. Craig F.N., Trelease S.F. Photosynthesis of Chlorella in heavy water. Amer. J. Bot. 1937. V.24. №.4. P.232-242.

79. Dicken C., Henderson T.R., Dinning J.S. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1962. V.l 10. P.208.

80. Henderson T.R., Dinning J.S. Fed. Proc. 1962. V.21. P.267.

81. Henderson T.R., Dinning J.S. Nature. 1962. V.l94. P.498.

82. Gross P.R., Harding C.V. Science. 1961. V.l33. P.l 133.

83. Wilson J., Dinning J.S. Biochim. Biophys. Acta. 1961. V.53. P.223

84. Ambrose A.P., Czajka D.M. Exp.Cell.Res. 1962. V.26. P.43.

85. Hughes A.M., Bennett E.L., Calvin M. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S. 1959. V.45. P.581.

86. Henderson T.R. Differential inhibition of p-galactosidase induction and synthesis by deuterium oxide. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1962. V.9. №.3. P.240-245.

87. Henderson T.R., Dacus J.M. Deuterium isotope effects on p-galactosidase formation by Escherichia coli. Arch. Biochem. Biophys. 1967. V.l20. P.316-321.

88. De Giovanni R., Zamenhof S. Rec. Genet. Soc. Amer. 1959. V.28. P.65.

89. De Giovanni R. Ann. N.Y.Acad. Sci. 1960. V.84. №.16. P.644.

90. De Giovanni R. Z. VererbLehre 1961. V.92. P.389.

91. Butler L. O., Grist R. W. The effect of D20 on the growth and transforming activities of Streptococcus pneumoniae. J. Gen. Microbiol. 1984. V.130. P.483-494.

92. Laser H., Slater E.C. Effect of heavy water on respiratory-chain enzymes. Nature, 1960. V.187. P.l 115-1117.

93. Mann L.R.B., Moses V. Properties of Escherichia coli grown in deuterated media. Folia Microbiol (Praha). 1971. V. 16. N.4. P.267-284.

94. Kotyk A., Dvorakova M., Koryta J. Deuterons cannot replace protons in active transport processes in yeast. FEBS Letters. 1990. V.264. №.2. P.203-205.

95. Unno K. Okada S. Deuteration causes the decreased induction of heat-shock proteins and1. PiartCill?kus-,ol.increased sensitivity to heat denaturation of proteins in Chlorella. 1994. V.35. N.2. P. 197202.

96. Rastogi R.P., Skukla P.C., Yadava B. Membrane permeability of heavy water // Biochim. et Biophys. Acta. 1971. V.249. №.2. P.454-461.

97. Andjus P.R., Vucelic D. D20-induced cell exitation // J.Membrane Biol. 1990. V.115. P.123-127.

98. Brooks S.C. Osmotic effects of deuterium oxide (heavy water) on living cells // Science. 1937. V.86. №.2239. P.497-498.

99. Смирнова Г.В., Музыка Н.Г., Глуховченко M.H., Октябрьский О.Н. Перекись водорода модулирует внутриклеточные уровни тиолов и калия в клетках Escherichia coli И Микробиология. 1998. Т.67. №.5. С.594-600.

100. Ткаченко А.Г., Пшеничнов М.Р., Салахетдинова О .Я., Нестерова Л.Ю. Роль путресцина и энергетического состояния Escherichia coli в регуляции топологии ДНК при адаптации к окислительному стрессу // Микробиология. 1999. Т.68. №1. С.27-32.

101. Meury J., Robin A. Glutathione-gate K+ channels of Escherichia coli carry out K+ efflux controlled by the redox state of the cell // Arch. Microbiol. 1990. V.154. P.475-482.

102. Butler L.O., Grist R.W. The effect of D20 on the growth and transforming activities of Streptococcus pneumoniae Л J. Gen. Microbiol. 1984. V.130. P.483-494.

103. Матыс В.Ю., Барышникова JI.M., Головлев E.JL. Адаптации к стрессовым условиям у представителей родов Rhodococcus и Gordona. II Микробиология. 1998. Т.67. №.6. С.743-747.

104. Н.Николаев Ю.А. Участие экзометаболитов в адаптации Escherichia coli к срессам // Микробиология. 1997. Т.66. №.1. С.38-41.

105. Flahaut S., Laplace J.M., Frere J., Auffray Y. The oxidative stress response in Enterococcus faecalis: relationship between H2O2 tolerance and H2O2 stress proteins. // Letters in Applied Microbiology. 1998. V.26. P.259-264.

106. Leblanc L., Leboeuf C., Leroi F., Hartke A., Auffray Y. Comparison betwen NaCl tolerance response and acclimation to cold temperature in Shewanella putrefaciens. II Curr. Microbiol. 2003. V.46. №.3. P.157-162.

107. Koga Т., Katagiri Т., Hori H., Takumi K. Alkaline adaptation induces cross-protection against some environmental stresses and morphological change in Vibrio parahaemolyticus. II Microbiol. Res. 2002. V.157. №.4. P.249-255.

108. Николаев Ю.А. Обнаружение двух новых внеклеточных адаптогенных факторов у Escherichia coli К-12. // Микробиология. 1997. Т.66. №.6. С.785-789.

109. Николаев Ю.А. Сравнительное изучение свойств двух внеклеточных протекторов, выделяемых Escherichia coli при повышенной температуре // Микробиология. 1997. Т.66. №.6. С.790-795.

110. Николаев Ю.А., Воронина Н.А., Перекрестное действие внеклеточных факторов адаптации к стрессу у микроорганизмов. // Микробиология. 1999. Т.68. №.1. С.45-50.

111. Rowbury R.J., Goodson М. An extracellular acid stress-sensing protein needed for acid tolerance induction in Escherichia coli. IIFEMS Microbiol. 1999. V.174. №.1. P.49-55.1.

112. Rowbury R.J., Goodson М. Extracellular sensing and signaling pheromones swith-on thermotolerance and other stress responses in Escherichia coli. // Sci. Prog. 2001. V.84. P.205-233.

113. Rowbury R.J. Extracellular sensing components and extracellular induction component alarmones give early warning against stress in Escherichia coli. II Adv. Microb. Physiol. 2001. V.44. P.215-257.

114. Large P.J., Peel D., Quayle J.R. Biochem. J. 1962. V.81. P.470-480.

115. Kemp M.B., Quayle J.R., Biochem. J. 1967. V.102. P.94-102.

116. Anthony C. The biochemistry of methylotrophs. Acad. Press. London. 1982. P.167-187.

117. Zheng Y., Xia Z., Chen Z., Mathews F.S., Bruice T.C. Catalytic mechanism of quinoprotein methanol dehydrogenase: A theoretical and X-ray crystallographic investigation. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V.98. № 2. P.432-434.

118. Mincey Т., Bell J.A., Mildvan A.S., Abeles R.H. Mechanism of action of methoxatin-dependent alcohol dehydrogenase. // Biochemistry. 1981. V.20. №.26. P.7502-7509.131. Троценко Ю.А. // 1989.

119. Davis E.N., Wallen L.L. Viscous product from activated sludge by methanol fermentation //Appl. environ, microbiol.1976. V.32. №.2. P.303-305.

120. Kanamru K., Mainuru Y., Micami Y. 2-O-Methyl-D-ramnosa in an extracellular polysaccharide from Hyphomicrobium sp.// Agr. Biol. Chem. 1982. V.46. №.10. P.2419-2424.

121. Southgate G., Goodwin P.M. The regulation of exopolysaccharide production and of enzymes involved in Ci assimilation in Methylophilus methylotrophus. II Journal of General Microbiology. 1989. №.135. P.2859-2867.

122. Osman S.F., Fett W.F., Irwin P., Cescutti P., Brouillette J.N., Oconnor J.V. The structure of the exopolysaccharide of Pseudomonas fluoresceins strain H13. Carbohydrate Research. 1997. V.300. P.323-327.

123. Гринберг Т.А., Косенко JI.B., Малашенко К. Р. ОбразавЗние экзополисахаридов метилотрофными микроорганизмами//Микробиол. Журн. 1984. Т.46. №.3. С.22-26.

124. Цыганков Ю.Д., Чистосердов А.Ю., Казакова С.М. Молекул. Генетика. 1985. №.2.

125. С3"14' Pfot.rair.Aead.9ii.asA.

126. DeMaeyer Е., SkupD., Prasad K.S.etal.-' . 1982. V.79. Р.4256.1. Nature*.

127. Hennam J.F., Cunningham A.F., Sharpe G.S., Atherton K.T. 1982. V.297. P.80.

128. Чистосердов А.Ю., Емерашвили M. Р.,Машко С.В., Лапидус А.Л., Скворцова

129. М.А., Стеркин В.Э., Стронгин А.Я., Цыганков Ю.Д. Экспрессия гена человеческогоинтерферона aF в облигатном метилотрофе Methylobacillus flagellatum КТ и№

130. Pseudomonasputida. Мол. Генет. Микробиол. Вирол.^Т.8. С.36-42.

131. Мосин О.В., Карнаухова Е.Н., Складнев Д.А., Акимова О.Л., Цыганков Ю.Д. Штамм Brevibacterium methylicum — продуцент униформно меченной дейтерием аминокислоты L-фенилаланина. Заявка РФ. N.93055824 от 15.12.1993.

132. Мосин О.В., Карнаухова Е.Н., Пшеничникова А.Б., Складнев Д.А., Акимова О.Л. Биосинтетическое получение дейтерий-меченного L-фенилаланина, секретируемого метилотрофным мутантом Brevibacterium methylicum. Биотехнология. 1993. №.9. Р.16-20.

133. Мосин О.В., Складнев Д.А., Егорова Т.А., Юркевич A.M., Швец В.И. Исследование биосинтеза аминокислот штаммом Brevibacterium methylicum на средах, содержащих тяжелую воду. Биотехнология. 1996. №.3. С.3-12.

134. Mosin O.V., Skladnev D.A., Shvets V.I. Biosynthesis of D-labeled phenylalanine by a new mutant of RuMP facultative methylotroph Brevibacterium methylicum. Bioscience, biotechnology and bioengeneering. 1998. V.62. №.2. P.225-229.

135. Складнев Д.А., Мосин O.B., Егорова T.A., Еремин С.В., Швец В.И. Метилотрофные бактерии источники изотопно-меченных D- и 13С-аминокислот. Биотехнология. 1996. №.4. С.25-34.

136. Мосин О.В., Казаринова Л.А., Преображенская Е.С., Складнее Д.А., Юркевич A.M., Швец В.И. Рост бактерии Bacillus subtilis и биосинтез инозина на высокодейтерированной среде. Биотехнология. 1996. №.4. С. 19-26.

137. Мосин О.В., Складнее Д.А., Швец В.И. Биосинтез D-меченого инозина. Известия РАН, серия Биология, 1999. N.4. С.403-413. Англ. Вариант 1999. Т.26. №.4. С 331-340.

138. Мишина И.М., Пшеничникова А.Б., Швец В.И., Складнев Д.А., Цыганков Ю.Д. Использование метилотрофных бактерий Methylophilus sp В-7741 для получения дейтерированных экзогенных углеводов. // Прикл. Биохим. Микробиол. 2002. Т.38. №.4. С.393-400.

139. Складнев Д.А., Рогожкина Е.А., Кондакова Е.В., Швец В.И., Свищева Н.В., Якименко З.А., Шенкарев З.О., Овчинникова Т.В., Раап Я. Получение изотопно модифицированного ,3C+15N пептидного антибиотика зервамицина ИВ. // Биотехнология. 2002. №.5. С.32-40.

140. Складнев Д.А. Метилотрофные бактерии как основа биотехнологического получения стабильно меченых биологически активных соединений. Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук. Типогр. МИТХТ. Москва 2000.

141. Гордеева Т.Л., Нево А.Н.С., Пшеничникова А.Б., Складнев Д.А., Швец В.И. Материалы 1-ого Международного Конгресса «Биотехнология состояние и перспективы развития»: Тез. Докл. 14-18 октября 2002 г., Москва, 2002. С. 194.

142. Vanatalu К., Paalme Т., Vilu R., Burkhardt N., Junemann R., May R., Ruhl M., Wadzack J., Nierhaus H. K. // Eur. J. Biochem. 1993. V.216. P.315-321.

143. Moore P.B., Engelman D.M. //Brookhaven Symp. Biol. 1976. V.27. P.12-23.

144. Karnaukhova E.N., Reshetova O.S., Semenov S.Y., Skladnev D.A., Tsygankov Yu.D. // Biosynthesis and MS monitoring. Amino Acids, 1994, V.6. №.1. 165-176.

145. Варфоломеев С.Д., Гуревич К.Г. Биокинетика: практический курс. М.: Фаир-Пресс. 1999. С.568-575.

146. Northrop D.B. In isotope effects on enzyme-catalysed reactions (Cleland W.W., O'Leary M.H., and Northrop D.B., eds.). University Park Press, Baltimore. 1977. P.l22-152.

147. Baev M.V., Kuznetsov E.V., Skladnev D.A., Govorukhina N.I., Sterkin V.E., Tsygankov Y.D. Growth and enzymological characteristics of a pink-pigmented facultative methylotroph Methylobacterium sp. MB1. //Folia Microbiol. 1992. V.37. №.2. P.93-101.

148. Chen B.J., Hirt W., Lim H.C., Tsao G.T. Growth characteristics of a new methylomonad // Appl. Environm. Microbiol. 1977. V.33. №.2. P.269-274.

149. Harrison D.E.F. Studies on the affinity of methanol and methane-utilizing bacteria for their carbon substrates. //J. Appl. Bacteriol. 1973. V.36. P.301-308.

150. Linton J.D., Buckee J.C. Interactions in a methane-utilizing mixed bacterial culture in a chemostat. // J. Gen. Microbiol. 1977. V.l01. P.219-225

151. Thomson J.F. Fumarase activity in D20 // Arch. Biochem. Biophys. 1960. V.90. P.l-6.

152. Natarajan S.K., Sierks M.R. Identification of enzyme-substrate and enzyme-product complexes in the catalytic mechanism of glucoamylase from Aspergillus awamori. // Biochemistry. 1996. V.35.№.48. P. 15269-15279.

153. Thomas H.G., Silverman D.N. Oxidation in H20 and D20 of 6-ethyl-5H-dibenz(c,e)azepine and 1-methylnicotinamide by aldehyde oxidase from rabbit liver.// Arch. Biochem. Biophys. 1985. V. 241. №.2. P.649-655.

154. Urbauer J.L., Dorgan L.J., Schuster S.M. Effects of deuterium on the kinetics of beef heart mitochondrial ATPase. //Arch. Biochem. Biophys. 1984. V. 231. №.2. P.498-502.

155. Мосин O.B., Складнев Д.А., Швец В.И. Исследование физиологической адаптаций бактерий к тяжелой воде.//Биотехнология. 1999. №.4. С.21-31.

156. Smirnova G.V., Muzyka N.G., Oktyabrsky O.N. The role of antioxidant enzymes in response of Escherichia coli to osmotic upshift // FEMS Microbiol. Lett. 2000. V.186. P.209-213.

157. Laser H., Slater E.C. Effect of heavy water on respiratory-chain enzymes // Nature. 1960. V.187. №.4743. P.l 115-1117.

158. Калиниченко Л.П., Христова М.Л., Шноль. Влияние D2O, глицерина, алифатических спиртов и возможная роль гидрофобных взаимодействий в транспорте электронов в митохондриях Л 967. Т. 12. С.824-828.

159. Siegel B.Z., Galston A.W. Biosynthesis of deuterated isoperoxidases in rye plants grown in D20 // Biochemistry. 1966. V.56. P. 1040-1042.

160. Anthony C. Methanol dehydrogenase, a PQQ-containing quinoprotein dehydrogenase // Subcell Biochem. 2000. V.35. P.73-117.

161. Unno K., Kishido Т., Morioka M., Okada S., Oku N. Increased expression of Hsp70 for resistance to deuterium oxide in a yeast mutant cell line. // Biol. Pharm. Bull. 2003. V.26. №.6. P.799-802.

162. Lindquist S., Craig E.A. The heat-shock proteins. // Annu. Rev. Genet. 1988. V.22. P.631-677.

163. Delaney J.M. Requirement of Escherichia coli dnaK gene for thermotolerance and protection against H202. // J.Gen. Microbiol. 1990. V.136. P.2113-2118.

164. Eom C.Y., Park S.T., Kim E., Ro Y.T., Kim S.W., Kim Y.M. Cloning, molecular characterization, and transcriptional analysis of DnaK operon in a methylotrophic bacterium Methylovorus sp. strain SSI DSM 11726. // Mol. Cells. 2002. V.14. №.2. P.245-254.

165. Ильинская O.H., Колпаков А.И., Шмидт M.A., Дорошенко Е.В., Мулюкин А.Л., Эль-Регистан Г.И. Роль бактериальных ауторегуляторов роста группы алкилоксибензолов в ответе стафилококков на стрессовые воздействия // Микробиология. 2002. Т.71. №.1. С.23-29.

166. Лойко Н.Г., Козлова А.Н., Осипов Г.А., Эль-Регистан Г.Н. Низкомолекулярные ауторегуляторы развития бактерий Thialkalivibrio versutus и Thioalkalimicrobium aerophilum II Микробиология. 2002. Т.71. №.3. С.308-315.

167. Tomita K., Rich A. The effect of deuteration on the geometry of the a-helix // J. Mol. Biol. 1962. V.4. P.83-92.

168. Scheraga H. A. Helix-Random Coil Transformations in deuterated macromolecules // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1960. V.84. P.608-616.

169. Goodwin M.G., Anthony C. Characterization of a novel methanol dehydrogenase containing a Ba2+ ion at the active site // Biochem. J. 1996. V.318. P.673-679.

170. Parkes C., Abeles R. H. Studies on the mechanism of action of action of methoxatin-requiring methanol dehydrogenase reaction of enzyme with electron-acceptor dye // Biochemistry 1984. V.23. P.6355-6363.

171. Mejillano M.R., Shivanna B.D., Himes R.H. Studies on the nocodazole-induced GTPase activity of Tubulin//Arch. Biochem. Biophys. 1996. V.336. P.130-138.

172. Scheuring J., Schramm V.L. Pertussis toxin: transition state analysis for ADP-Ribosylation of G-protein peptide cci3C20 // Biochemistry 1997. V.36. P.8215-8223.

173. Long F.A. Acid-Base Studies with deuterium oxide // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1960. V.84. P.598-602.

174. Welsh K.M., Creighton D.J., Klinman J.P. Transition-state structure in yeast alcohol dehydrogenase reaction: The magnitude of solvent and a-secondary hydrogen isotope effect //Biochemistry. 1980. V. 19. №.10. P.2005-2016.

175. Cho Y., Rebholz K. L., Northrop D. B. Solvent isotope effects on the onset of inhibition of porcine pepsin by pepstatin // Biochemistry. 1994. V.33. P.9637-9642.

176. Xia Z., He Y., Dai W., White S. A., Boyd G. D., Mathews F. S. Detailed active site configuration of a new crystal form of methanol dehydrogenase from methylophilus W3A1 at 1,9 A Resolution//Biochemistry 1999. V.38. P.1214-1220.

177. Sutherland I.W. Biosynthesis of microbial exopolysaccharides. // Adv. Microbiol. Physiol. 1982. V.23. P.79-150.

178. Petry S., Furlan S., Crepeau M.J., Cerning J., Desmazeaud M. Factors affecting exocellular polysaccharide production by Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus grown in a chemically defined medium. //Appl. Environ. Microbiol. 2000. P.3427-3431.

179. Cerning J., Bouillanne C., Landon M., Desmazeaud M. Isolation and characterization of exopolysaccharides from slime-forming mesophilic lactic acid bacteria. J. Dairy Sci. 1992. V.75. P.692-699.

180. Cerning J. 1990. Exocellular polysaccharides produced by lactic acid bacteria. FEMS Microbiol. Rev. 1990. V.87. P. 113-130.

181. Kojic M.M., Vujcic M., Banina A., Cocconcelli P., Cerning J., Topisirovic L. Analysis of exopolysaccharide production by Lactobacillus casei CG11, isolated from cheese. Appl. Environ. Microbiol. 1992. V.58. P.4086-4088.

182. Troy F.A., Frerman F.E., Heath E.C. The biosynthesis of capsular polysaccharide in Aerobacter aerogenes. //J. Biol. Chem. 1970. V.246. P. 118-133.

183. Jansson P.E., Kenne L., Widmalm G. Computer-assisted structural analysis of polysaccharides with an extended version of casper using *H- and 13C-N.M.R. Data. // Carbohydrate Research. 1989. V.188. P.169-191.

184. Lipkind G.M., Shashkov A.S., Knirel Y.A., Vinogradov E.V., Kochetkov N.K. A computer-assisted structural analysis of regular polysaccharides on the basis of 13C-N.M.R. // Carbohydrate Research. 1988. V.175. P.59-75.

185. Roe J.H. The determination of sugar in blood and spinal fluid with anthrone reagent // J. Biol. Chem. 1955. V.212.№.1 P.335-337.

186. Beers I.F., Sizer W.I. A spectrophotometric assay for measuring the breakdown of hydrogen peroxide by catalase // J. Biol. Chem. 1952. V.196. P. 133-140.

187. Anthony C., Zatman L.J. // Biochem. J. 1967. V.104. №.3. P.953-959.