Повышение уровня секреции внеклеточного полисахарида и выхода биомассы облигатной метилотрофной бактерии Methylophilus quaylei в присутствии экзогенных жирных кислот и их сложных эфиров тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат химических наук Отман Садек Ахмед Мукред

• Отман Садек Ахмед Мукред
• кандидат химических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат химических наук Отман Садек Ахмед Мукред

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Метаболизм жирных кислот у бактерий

1.1.1. Биосинтез жирных кислот у Escherichia coli

1.1.2. Деградация жирных кислот

1.1.3. Регуляция экспрессии бактериальных десатураз

1.2. Изменения состава мембранных липидов в процессе адаптации бактерий

к стрессовым условиям

1.2.1. Влияние температуры на состав мембранных липидов

1.2.2. Влияние осмотического стресса на состав мембранных липидов

1.2.3. Влияние давления на состав мембранных липидов

1.2.4. Влияние добавления спиртов

1.3. Влияние экзогенных свободных жирных кислот и их производных

на рост и жизнедеятельность бактерий

1.3.1. Ингибирование роста в присутствии свободных жирных кислот

1.3.2. Ингибирование роста бактерий в присутствии экзогенных производных жирных кислот

1.3.3. Усиление роста бактерий в присутствии свободных жирных кислот

1.4. Транспорт жирных кислот через мембрану грамотрицательных бактерий

1.4.1. Транспорт жирных кислот через мембрану без участия белков

1.4.2. Транспорт жирных кислот через мембрану с участием белков

1.4.3. Энергетика процесса транспорта жирных кислот через мембрану 28 1.5. Регуляция липидного состава путем введения экзогенных ЖК

1.6. Жирные кислоты как разобщители окислительного фосфорилирования

1.6.1 .Хемиосмотическая гипотеза Митчелла 3

1.6.2. Окислительное фосфорилирование у бактерий

1.6.3. Разобщители биоэнергетической работы

1.6.4. Жирные кислоты как разобщители окислительного

фосфорилирования

1.7. Жирные кислоты как ауторегуляторные метаболиты, необходимые

для межклеточной коммуникации

1.7.1. Восприятие кворума («Quorum sensing») 3

1.7.2. Жирные кислоты как ауторегуляторные метаболиты

1.8. Морфогенетические изменения бактерий под действием экзогенных

жирных кислот

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

2.1. Влияние экзогенных жирных кислот и их сложных эфиров на рост

и продукцию внеклеточного полисахарида Methylophilus quaylei

2.1.1. Изучение кинетики ростаМ quaylei и секреции внеклеточного полисахарида в присутствии жирных кислот и их метиловых эфиров

2.1.2. Влияние олеиновой кислоты на продукцию внеклеточного полисахаридам quaylei

2.1.3. Влияние олеата натрия на рост М. quaylei и секрецию полисахарида

2.1.4. Фракционирование и анализ липидного состава бактерий М. quaylei методом ТСХ на силикагеле

2.1.5. Анализ жирнокислотного состава фракций липидов методом хромато-масс-спектрометрии

2.1.6. Влияние экзогенного метилстеарата на жирнокислотный состав

М quaylei

2.1.7. Изучение физико-химических свойств поверхности клеток

М. quaylei и свойств липидного бислоя

2.2. Получение, очистка и изучение углеводного и фракционного состава полисахарида М. quaylei

2.2.1. Оптимизация состава питательной среды методом

математического планирования эксперимента

2.2.2. Разработка методов выделения внеклеточных полисахаридов

М. quaylei

2.2.3. Анализ состава внеклеточного полисахаридам quaylei

2.2.4. Исследование фракционного состава внеклеточного полисахарида

М quaylei методом гель-хроматографии

2.3. Изучение эмульгирующих и реологических свойств растворов,

содержащих внеклеточные полисахариды М quaylei

3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 82 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 94 ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АОБ - алкилоксибензолы

АСР - ацилпереносящий белок

БКЖ - бесклеточная культуральная жидкость

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВБ - высушенная биомасса

СоА - кофермент А

ДЦЖК - длинноцепочечные жирные кислоты

ДФГ - 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриен

ЖК - жирные кислоты;

КОЕ - колониеобразующие единицы

КЖ - культуральная жидкость

ККМ - критическая концентрация мицеллообразования

МЭЖК - метиловые эфиры жирных кислот

НЛ - нейтральные липиды

ОК - олеиновая кислота

ОБ - оптическая плотность

СК - стеариновая кислота

ТСХ - тонкослойная хроматография

ТФУ - трифторуксусная кислота

цАМФ - циклический аденозинмонофосфат

ФГ - фосфатидилглицерин

ФК - фосфатидная кислота

ФЛ - фосфолипиды

ФХ - фосфатидилхолин

ФЭ - фосфатидилэтаноламин

ЦТАБ - цетилтриметиламмоний бромид

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭПС - экзополисахарид

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Повышение уровня секреции внеклеточного полисахарида и выхода биомассы облигатной метилотрофной бактерии Methylophilus quaylei в присутствии экзогенных жирных кислот и их сложных эфиров»

ВВЕДЕНИЕ

Поиск компонентов питательных сред, ускоряющих рост бактерий - продуцентов биомассы и внеклеточных метаболитов - актуальная задача биотехнологии. Перспективными для управления метаболическими процессами у бактерий являются ауторегуляторные вещества, относящиеся по химической природе к свободным жирным кислотам (СЖК) [1-3]. Участие этих соединений в биохимических процессах в клетке отражается на свойствах мембраны, играющей ключевую роль, как в структурной организации, так и в функционировании клеток. Жирные кислоты (ЖК) с длиной цепи от С и до С20 представляют собой уникальные природные вещества, которые в виде производных - липидов - являются структурными компонентами клеточных мембран, выполняют энергетические и регуляторные функции. Кроме этого свободные жирные кислоты обладают разнообразной биологической активностью и прежде всего -антимикробной (активны против вирусов, бактерий, грибов, водорослей, простейших) и цитотоксической [4,5]. Бактерицидное действие свободных жирных кислот наблюдали по отношению как к грамположительным бактериям (родов Streptococcus [6-8], Staphylococcus [9-12], Bacillus [12-15], Lactobacillus [16], Mycobacterium [17,18] и других [4,19]), так и грамотрицательным (родов Escherichia [12,14,20], Pseudomonas [15], Neisseria [15], Salmonella [14,15], Helicobacter [21,22] и других [4,19]).

Несмотря на большой научный интерес к биологическим функциям свободных жирных кислот, механизм их бактерицидной активности изучен не достаточно. Известно, что основной мишенью является клеточная мембрана и процессы в ней протекающие -функционирование электронтранспортной цепи, окислительное фосфорилирование, ферментативные процессы, транспорт питательных веществ, перекисное окисление липидов [5].

Свободные жирные кислоты являются компонентами врожденного иммунитета и присутствуют на коже, в грудном молоке и кровотоке человека и животных [23], где выполняют защитные функции. Наиболее детально изучена активность жирных кислот, особенно олеиновой, по отношению к бактериям родов Staphylococcus и Streptococcus -наиболее распространенных возбудителей инфекций кожи и других органов человека [611]. В концентрациях, не вызывающих цитотоксического действия, олеиновая кислота разрушает клеточные стенки и приводит к гибели популяции Staphylococcus aureus [10]. По мнению авторов [10-11] в качестве антимикробных веществ жирные кислоты являются альтернативой традиционным антибиотикам, применение которых часто приводит к формированию лекарственной устойчивости у патогенных бактерий. Использование жирных кислот предлагается авторами [10-11] в качестве элемента новой антимикробной

стратегии, основанной на свойствах врожденного неспецифического иммунитета. Бактерицидная активность олеиновой кислоты против S. aureus возрастает в составе липосом [11].

Экзогенно добавленные в среду культивирования бактерий жирные кислоты в определенных концентрациях ускоряют рост, повышают выживаемость некоторых бактерий в неблагоприятных условиях, например лактобацилл [1,24,25]. Более того, жирные кислоты являются необходимыми ростовыми факторами для таких бактерий, как бактерии родов Lactobacillus, Corynebacterium, Clostridium [26,27].

Бактерицидный или ростостимулирующий эффект жирных кислот определяется их строением (особенно важно количество, а иногда и положение двойных связей), видом бактерии, концентрацией жирной кислоты и условиями культивирования [4,26]. Недавно было показано, что наличие свободных жирных кислот в составе модельных мембран способствует образованию участков небислойной обращенной гексагональной структуры наряду с ламеллярной в широком интервале температур. Молекула жирной кислоты встраивается в мембрану, образует водородные связи с молекулами воды и соседними аминогруппами молекул фосфатидилэтаноламина и влияет на свойства бислоя [28]. Способность свободных жирных кислот влиять на структуру биологических мембран используется в новом направлении фармакологии - мембрано-липидной терапии [29]. Так, олеиновая кислота (ОК), увеличивая отрицательную кривизну мембраны, активирует ряд важных белков, способных ингибировать клеточную пролиферацию и индуцировать апоптоз: G-белков, протеинкиназы С, белков теплового шока. Возможно, этот механизм объясняет ускорение роста бактерий - лактобацилл, коринебактерий [24-26], а также индукцию реактивации покоящихся форм микобактерий в присутствии олеиновой кислоты [30]. Однако, несмотря на большой научный интерес к функциям свободных ЖК в последнее время, механизм их биологической активности изучен не достаточно.

Перспективной моделью для такого рода исследований являются метилотрофные бактерии, не использующие ЖК в качестве субстрата. Работа с такими моделями исключает вероятность стимулирования роста за счет возможности метаболизировать ЖК. Многие облигатные метилотрофные бактерии, использующие в качестве единственного источника углерода доступный метанол, характеризуются способностью секретировать внеклеточные полисахариды или экзополисахариды (ЭПС) и являются перспективными продуцентами биомассы и ЭПС [31,32]. Бактериальные ЭПС - биополимеры, обладающие уникальными реологическими свойствами, эмульгирующей активностью и способностью формировать гели. Сферы применения микробных экзополисахаридов чрезвычайно разнообразны: нефте- и горнодобывающая, текстильная, пищевая, фармацевтическая,

химическая промышленности и медицина. Потребность в этих полимерах постоянно растет, однако спрос на них удовлетворяется не полностью.

Цели и задачи исследования:

Целью настоящей работы явилось изучение влияния экзогенных жирных кислот на выход биомассы и повышение уровня секреции внеклеточного полисахарида облигатной метилотрофной бактерии Methylophilus quaylei, а также оптимизация условий его получения и выделения.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

- исследование влияния экзогенных ЖК и их метиловых эфиров на рост и продукцию внеклеточного полисахарида М. quaylei;

- фракционирование клеточных липидов из биомассы, полученной в присутствии олеиновой кислоты и стеариновой кислоты (СК), а также определение жирнокислотного состава фракций свободных ЖК и фосфолипидов;

- исследование физико-химических свойств интактных клеток М. quaylei, выращенных в стандартных условиях и в присутствии экзогенной ОК - величины С,-потенциала (методом электрофоретического рассеяния) и текучести мембран (по величинам анизотропии флуоресценции с использованием в качестве гидрофобного зонда 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриена (ДФГ);

- оптимизация условий биосинтеза, методы выделения и очистки ЭПС, изучение углеводного и фракционного состава ЭПС М. quaylei;

- изучение реологических и эмульгирующих свойств растворов, содержащих ЭПС.

Список литературы диссертационного исследования кандидат химических наук Отман Садек Ахмед Мукред, 2012 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Бабусенко Е.С., Эль-Регистан Г.И., ГрадоваН.Б., Козлова А.Н., Осипов Г.А. Исследование мембранотропных ауторегуляторных факторов метанокисляющих бактерий. Успехи химии. 1991. Т. 60. №11. С.2362-2372.

2. Светличный В.А., Эль-Регистан Г.И., Романова А.К., Дуда В.И. Характеристика ауторегуляторного фактора d2, вызывающего автолиз клеток Pseudomonas carboxydoflava и Bacillus cereus. Микробиология. 1983. Т. 52. С. 33-38.

3. Светличный В.А., Романова А.К., Эль-Регистан Г.И. Изучение количественного содержания мембраноактивных ауторегуляторов при литоавтотрофном росте Pseudomonas carboxydoflava. Микробиология, 1986, т.55, №.1. С.55-59.

4. Nieman С. Influence of trace amounts of fatty acids of the growth of microorganisms. Bacterid. Rev., 1954. V.18. P.147-163.

5. Desbois A.P., Smith V.J. Antibacterial free fatty acids: activities, mechanisms of action and biotechnological potential. Appl Microbiol Biotechnol. 2010. V.85. №6. P. 1629-1642.

6. Norman P.W., Guy E.M. Long-chain fatty acid inhibition of growth of Streptococcus agalactiae in a chemically defined medium. J. Bacteriology, 1966. V.91, №6. P. 2245-2250.

7. Speert D.P., Wannamaker L.W., Gray E.D., Clawson C.C. Bactericidal effect of oleic acid on group A Streptococci: mechanism of action. Infection and immunity. 1979. V.26. №3. P. 12021210.

8. Carson D.D., Daneo-Moore L. Effects of fatty acids on lysis of Streptococcus faecalis. J. Bacterid. 1980. P.l 122-1126.

9. Kenny J.G., Ward D., Josefsson E., Jonsson I.-M., Hinds J., Rees H.H., Lindsay J.A., Tarkowski A., Horsburgh M.J.. The Staphylococcus aureus response to unsaturated long chain free fatty acids: survival mechanisms and virulence implications. PLoS One, 2009.V.4 №2. e4344.

10. Chen C.-H., Wang Y., Nakatsujil Т., Liu Y.-T., Zouboulis C.C., Gallol R.L., Zhang L., Hsieh M.-F., Huang C.-M.. An Innate Bactericidal Oleic Acid Effective Against Skin Infection of Methicillin-Resistant Staphylococcus aureus: A Therapy Concordant with Evolutionary Medicine. J. Microbiol. Biotechnol. 2011. V.21. №4. P.391-399.

11. Huang, С. M., С. H. Chen, D. Pornpattananangkul, L. Zhang, M. Chan, M. F. Hsieh, L. F. Zhang. Eradication of drug resistant Staphylococcus aureus by liposomal oleic acids. 2011. Biomaterials. V.32. P.214-221.

12. Raychowdhury M.K., Goswami R. Effect of unsaturated fatty acids in growth inhibition of some penicillin-resistant and sensitive bacteria. J. Appl. Microbiol. 1985. V.59. №2. P.183-188.

13. Sheu C.W., Freese E. Effects of fatty acids on growth and envelope proteins of Bacillus subtilis. J. Bacterid., 1972. V.lll. №2. P.516-524.

14. Sheu C.W., Freese E.. Lipopolysaccharide Layer Protection of Gram-Negative Bacteria Against Inhibition by Long-Chain Fatty Acids. J. Bacteriology, 1973. V.l 1 5. №3. P. 869-875.

15. Miller R.D., Brown K.E., Morse S.A. Inhibitory action of fatty acids on the growth of Neisseria gonorrhoeae. Infection and immunity, 1979. V.17. №2. P. 303-312.

16. Jenkins J.K., Courtney P.D. Lactobacillus growth and membrane composition in the presence of linoleic or conjugated linoleic acid Can. J. Microbiol. 2003. V.49. P. 51-57.

17. Saito H., Tomioka H., Yoneyama T. Growth of Group IV Mycobacteria on Medium Containing Various Saturated and Unsaturated Fatty Acids. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1984. V.26. №2. P. 164-169.

18. Kondo E, Kanai K. The relationship between the chemical structure of fatty acids and their mycobactericidal activity. Jpn.J.Med.Sci.Biol. 1977. V.30. №4. P. 171-178.

19. Kabara J.J., Swieczkowski D.M., Conley A.J., Truant L.P.. Fatty Acids and Derivatives as Antimicrobial Agents. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1972. V.2. №1. P.23-28.

20. Fay J.P., Farias R.N. The Inhibitory Action of Fatty Acids on the Growth of Escherichia coli. J. General Microbiol. 1975. V.91. P.233-240.

21. Khulusi S., Ahmed H.A., Patel P., Mendall M.A., Northfield T.C.. The effects of unsaturated fatty acids on Helicobacter pylori in vitro. J. Med. Microbiol., 1995. V.42. P. 276-282.

22. Petschow B.W., Batema R.P., Ford L.L. Susceptibility of Helicobacter pylori to Bactericidal Properties of Medium-Chain Monoglycerides and Free Fatty Acids. Antimicrobial agents and chemotherapy, 1996. V.40. №2. P. 302-306.

23. Nicolaides N. Skin lipids: their biochemical uniqueness. Science. 1974. V.186. №4158. P.19-26.

24. Corcoran B.M., Stanton C., Fitzgerald G.F., Rossi R.P. Growth of probiotic lactobacilli in the presence of oleic acid enhances subsequent survival in gastric juice. Microbiology. 2007. V.153. P.291-299.

25. Guerrini S, Bastianini A, Granchi L, Vincenzini M. Effect of oleic acid on Oenococcus oeni strains and Malolactic fermentation in wine. Curr Microbiol. 2002. V.44. №1. P.5-9.

26. Hassinen, J. B., Durbin, G. T., Bernhard, F. W. Hexadecenoic acid as a growth factor for lactic acid bacteria. Arch. Biochem. 1950. V.25. P.91-96.

27. Boughton B. W., Pollock M. R. // Long-chain unsaturated fatty acids as essential bacterial growth factors: further studies with Corynebacterium "Q". Biochem.i, 1953. v.53.p. 261-265.

28. Cordomi A., Prades J., Frau J., Vogler O., Funari S.S., Perez J.J., Escriba P.V., Barcelo F. Interactions of fatty acids with phosphatidylethanolamine membranes: X-ray diffraction and molecular dynamics studies! Lipid Res 2010. V.51. P.l 113-1124.

29. Escriba P.V. Membrane-lipid therapy: a new approach in molecular medicine. Trends Mol Med 2006. V.12.P.34-43.

30. Назарова E.B., Шлеева M.O., Морозова H.C., Кудыкина Ю.К., Вострокнутова Т.Н., Ружицкий А.О., Селищева А.А., Сорокоумова Г.М., Швец В.И., Капрельянц А.С. Роль липидных компонентов в процессах образования и реактивации «некультивируемых» форм Mycobacterium smegmatis. Биохимия. 2011. Т. 76. № 6, С. 781-791.

31. Ю.А.Троценко, Н.В.Доронина, М.Л.Торгонская. Аэробные метилобактерии. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 2010. 325 с.

32. Schrader J, Schilling М, Holtmann D, Sell D, Filho MV, Marx A, Vorholt JA. Methanol-based industrial biotechnology: current status and future perspectives of methylotrophic bacteria. Trends in Biotechnology. 2009. V.27. №.2. P. 107-115.

33. White S.W., Zheng J., Zhang Y.-M., Rock C.O. The structural biology of type II fatty acid biosynthesis Annu. Rev. Biochem. 2005. V.74. P.791-831.

34. Magnuson K., Jackowski S., Rock C., Cronan J.E. Regulation of Fatty Acid Biosynthesis in Escherichia coli. Microbiol. Reviews. 1993. V.57. №3. P.522-542.

35. Tubbs P.K., Garland P.B. Membranes and fatty acid metabolism. Br Med Bull. 1968. V.24. №2. P. 158-164.

36. Nelson D.L., Cox M.M. Lehninger Principles of Biochemistry, 4th Edition. New York: W. H. Freeman and Company. 2005. P.648-649.

37. Курс лекций, T.D. Paustian, University of Wisconsin-Madison, ©2000 fhttp://lecturer.ukdw.ac.id/dhira/Metabolism/RespFats.html)

38. Los D.A., Murata N. Structure and expression of fatty acid desaturases. Biochim. Biophys. Acta. 1998. V.1394. P.3-15.

39. Los D.A., Murata N. Membrane fluidity and its roles in the perception of environmental signals. Biochim. Biophys. Acta. 2004. V.1666. P.142-157.

40. Aguilar P.S., de Mendoza D. Control of fatty acid desaturation: a mechanism conserved from bacteria to humans. MicroReview. Molecular Microbiology. 2006. V.62. №6. P. 1507-1514.

41. Cybulski L.E., Albanesi D., Mansilla M.C., Altabe S., Aguilar P.S., de Mendoza D. Mechanism of membrane fluidity optimization: isothermal control of the Bacillus subtilis acyl-lipid desaturase. Molecular Microbiology. 2002. V.45 №5. P.1379-1388.

42. Albanesi D., Mansilla M.C., de Mendoza D. The Membrane Fluidity Sensor DesK of Bacillus subtilis Controls the Signal Decay of Its Cognate Response Regulator. Journal of Bacteriology. 2004. P.2655-2663.

43. Hazel LR, Williams EE. The role of alterations in membrane lipid composition in enabling physiological adaptation of organisms to their physical environment. Prog Lipid Res. 1990. V.29. №3. P.167-227.

44. McElhaney R.N., Souza K.A. The relationship between environmental temperature, cell growth and the fluidity and physical state of the membrane lipids in Bacillus stearothermophilus. Biochim Biophys Acta. 1976. V.443. №3. P.348-359.

45. Suutari M., Laakso S. Microbial fatty acids and thermal adaptation. Crit. Rev. Microbiol. 1994. V.20. №4. P.285-328.

46. Rilfors L., Wieslander A., Stahl S. Lipid and protein composition of membranes of Bacillus megaterium variants in the temperature range 5 to 70°C. J. Bacteriol. 1978. P.1043-1052.

47. Suutari M., Laakso S. Unsaturated and branched chain-fatty acids in temperature adaptation of Bacillus subtilis and Bacillus megaterium. Biochim Biophys Acta. 1992. V.l 126. №2. P.l 19124.

48. Yano Y., Nakayama A., Yoshida K. Distribution of polyunsaturated fatty acids in bacteria present in intestines of deep-sea fish and shallow-sea poikilothermic animals. Appl environ microbial. 1997. P.2572-2577.

49. Allakherdiev S.I., Kinoshita M. Unsaturated Fatty Acids in Membrane Lipids Protect the Photosynthetic Machinery against Salt-Induced Damage in Synechococcus./Plant Physiology. 2001. V.125.pp. 1842-1853.

50. S. Allakhverdiev, I. Suzuki, Y. Tasaka. Genetic engineering of the unsaturation of fatty acids in membrane lipids alters the tolerance of Synechocystis to salt stress. / Plant Biology.

1999. V.96. pp. 5862-5867.

51. D. Nichols, J. Olley, R. R. Brenner. Effect of Temperature and Salinity Stress on Growth and Lipid Composition of Shewanella gelidimarina. Applied and Environmental Microbiology.

2000. V.66, N.6. pp. 2422-2429.

52. L. Catucci, N. Depalo, A. Agostiano. Neosynthesis of cardiolipin in Rhodobacter sphaeroides under osmotic stress. Biochemistry. 2004. V. 43, N. 47. pp. 15066-72.

53. Danevcic T., Rilfors L., Strancar J., Lindblom G., Stopar D. Effects of lipid composition on the membrane activity and lipid phase behaviour of Vibrio sp. DSM 14379 cells grown at various NaCl concentrations. Biochim Biophys Acta. 2005. V.1712. №1. P.l-8.

54. Adams R.L., Russell N.J. Interactive effects of salt concentrations and temperature on growth and lipid composition in the moderately halophilic bacterium Vibrio costicola. Can J microbiol. 1992. V.38. №8. P.823-827.

55. Guerzoni M.E., Lanciotti R., Cocconcelli P.S. Alteration in cellular fatty acid composition as a response to salt, acid, oxidative and thermal stresses in Lactobacillus helveticus. Microbiology. 2001. V. 147, P.2255-2264.

56. Yutaka Yano, Akihiko Nakayama, Kenji Ishihara, Hiroaki Saito. Adaptive changes in membrane lipids of Barophilic Bacteria in response to changes in growth pressure. Appl environ microbial. 1998. P.479-485.

57. Kamimura K., Fuse H., Takimura O., Yamaoka Y. Effects of growth pressure and temperature on fatty acid composition of a barotolerant deep-sea bacterium. Appl Environ Microbiol. 1993. V.59. №3. P.924-926.

58. Ingram L.O. Adaptation of membrane lipids to alcohols. J. Bacteriology. 1976. P.670-678.

59. Ferdinandus J., Clark J.B.. Selective inhibition of bacterial enzymes by free fatty acids. J. Bacterid. 1969. P.l 109-1113.

60. Baldassare J.J., Rhinehart K.B., Silbert D.F. Modification of membrane lipid: physical properties in regulation to fatty acid structure. Biochemistry. 1976. V.15. №14. P.2986-2994.

61. Lai J., Okuda S.S., Takanashi H. Lipid A, various fatty acids, and their derivatives as proton conductors in membrane vesicles from Escherichia coli. II J. Gen. Appl. Microbiol. (Tokyo) 1977. V.23.P. 137-146.

62. Levin B.C., Freese E. Comparison of the effects of two lipophilic acids, hexachlorophene and deca-noate, on Bacillus subtilis. Antimicrob. Agents Chemother. 1977. V. 12. P. 357-367.

63. Lai J.S., Okuda S., Abe H., Takahashi H. Effect of lipid A and fatty acids on transport activities of membrane vesicles from Escherichia coli. II J. Gen. Appl. Microbiol. (Tokyo) 1976. V.22. P. 85-96.

64. Kondo E., Kanai K. Further studies on the lethal ettect of long-chain tatty acids in mycobacteria. // Jpn. J. Med. Sci. Biol. 1976. V.29. P. 25-37.

65. Fay J.P., Farias R.N. Inhibitory action of a nonmetabolizable fatty acid on the growth of Escherichia coli: Role of metabolism and outer membrane integrity. J. Bacterid. 1977. V. 132. P. 790-795.

66. Galbrailh H., Miller T.B. Physicochemical effects of long chain fatly acids on bacterial cells and their proloplasls. J. Appl. Bacterid. 1973. V.36. P. 647-658.

67. Tsuchido T., Hiraoka T., Takano M., Shibasak I. Involvement of autolysin in cellular lysis of Bacillus subtilis induced by short- and medium-chain fatty acids. J. Bactenol. 1985. V.162. P. 42-46.

68. Lau С., Greenway L.A., Freter E., Neungton N., Wattenberg В., Silbert D.F. Conditions influencing formation of 16:0/16:0 molecular species in membrane phospholipids of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 1983. V. 258. P. 13027-13033.

69. Lo K.W., Chua H., Lawford H., Lo W.H., Peter H.F.Y. Effects of Fatty Acids on Growth and Poly-3-hydroxybutyrate Production in Bacteria. Appl. Biochem. Biotechnol. 2005. V.122. №1-3. P. 575-580.

70. Dekio I., Hayashi H., Sakamoto M., Kitahara M., Nishikawa Т., Suematsu M., Benno Y. Detection of potentially novel bacterial components of the human skin microbiota using culture-independent molecular profiling. J.Med. Microbiol. 2005. V.54. P. 1231-1238.

71. Терехова E.A., Степичева H.A., Пшеничникова А.Б., Швец В.И. Метиловый эфир стеариновой кислоты - новый внеклеточный метаболит облигатной метилотрофной бактерии Methylophilus quaylei. Прикл. биохимия и микробиология. 2010. Т. 46. № 2. С. 180-186.

72. Esfahani М., Barnes Е., Wakil J., Wakil S. Control of fatty acid composition in phospholipids of Escherichia coli: response to fatty acid supplements in fatty acid auxotroph. Communic be Francois Jacob. 1969. V.64. P.1057-1064.

73. DiRusso C.C., Black P.N. Long-chain fatty acid transport in bacteria and yeast. Paradigms for defining the mechanism underlying this protein-mediated process. Molecular and Cellular Biochemistry. 1999. V.192. P.41-52.

74. Schaffer J.E. Fatty acid transport: the roads taken. Rewiev. Am J Physiol Endocrinol Metab. 2002. V.282. E239-E246.

75. Cronan J.E. Evidence that incorporation of exogenous fatty acids into the phospholipids of Escherichia coli does not require acyl carrier protein. J.Bacteriol. 1984. V. 159. P. 773-775.

76. Hamilton J.A. Fatty acid transport: difficult or easy? Rewiev. Journal of Lipid Research 1998. V.39. 467-481.

77. DiRusso C.C., Black P.N. Bacterial Long Chain Fatty Acid Transport: Gateway to a Fatty Acid-responsive Signaling System. Minireview. J. Biol. Chem. 2004. V.279. №48. P.49563-49566.

78. Hamilton J.A., Kamp F. How Are Free Fatty Acids Transported in Membranes? Is It by Proteins or by Free Diffusion Through the Lipids? Diabetes. V.48. 1999. P2255-2269.

79. Black P.N., DiRusso C.C. Transmembrane movement of Exogenous Long-Chain Fatty Acids: Proteins, Enzymes, and Vectorial Esterification. Microb. Mol. Biol. Rev. 2003. V.67. №3. P. 454-472.

80. Azizan A., Sherin D., DiRusso C.C., Black P.N. Energetics Underlying the Process of Long-Chain Fatty Acid Transport. Arch. Biochem. Biophys. 1999. V.365. №2. P.299-306.

81. Rock С.О., Jackowski S. Pathways for the incorporation of exogenous fatty acids into phosphatidylethanolamine in Escherichia coli. J. Biol. Chem. 1985. V. 260. P. 12700-12724.

82. Aloia R.C. Physiological regulation of membrane fluidity. V.3. New York: Liss, Cop. 1988.

83. Johnston N.C., Goldfine H. Replacement of the aliphatic chains of Clostridium acetobutylicum by exogenous fatty acids: regulation of phospholipids and glycolipid composition. J. Bacterial. 1992. P. 1848-1853.

84. Krulwich T.A., Clejan S., Falk L.H., Guffanti A.A. Incorporation of specific exogenous fatty acids into membrane lipids modulates protonophore resistance in Bacillus subtilus. J. Bacteriol. 1987. P.4479-4485.

85. Mitchell P. Aspects of the chemiosmotic hypothesis. Biochem J. 1970. V.116. №4. P.5P-6P.

86. Krulwich T.A., Quirk P.G., Guffanti A.A. Uncoupler-resistant mutants of bacteria. Microbiol Rev. 1990. V.54. №1. P.52-65.

87. Скулачев В. П. Энергетика биологических мембран.М. 1989. С.6-51.

88. Caplan S.R., Essig A. Oxidative phosphorylation: thermodynamic criteria for the chemical and chemiosmotic hypotheses. Proc Natl Acad Sci USA. 1969. V.64№1. P.211-218.

89. Николе Д., Биоэнергетика. Введение в хемиосмотическую теорию, пер. с англ., М., 1985. С.96-99.

90. Fillingame R.H. Coupling Н+ transport and ATP synthesis in FIFO-ATP synthases: glimpses of interacting parts in a dynamic molecular machine. J Exp Biol. 1997. V.200 №2. P.217-224.

91. Senior A.E., Langman L., Cox G.B., Gibson F. Oxidative phosphorylation in Escherichia coli. Characterization of mutant strains in which Fl-ATPase contains abnormal beta-subunits. Biochem J. 1983. V.210. №2. P.395-403.

92. Mitchell P. Chemiosmotic coupling in oxidative and photosynthetic phosphorylation. Biol Rev Camb Philos Soc. 1966. V.41. №3. P.445-502.

93. Hopfer U., Lehninger A.L., Thompson Т.Е. Protonic conductance across phospholipid bilayer membranes induced by uncoupling agents for oxidative phosphorylation. Proc Natl Acad Sci USA. 1968. V.59. №2. P.484-490.

94. Scholes P., Mitchell P. Acid-base titration across the plasma membrane of Micrococcus denitrificans: factors affecting the effective proton conductance and the respiratory rate. J.Bioenerg. 1970. V.l. №1. P.61-72.

95. Brummett T.B., Ordal G.W. Inhibition of amino acid transport in Bacillus subtilis by uncouplers of oxidative phosphorylation. Arch Biochem Biophys. 1977. V.l 78. №2. P.368-372.

96. Nicholas R.A., Ordal G.W. Inhibition of bacterial transport by uncouplers of oxidative phosphorylation. Effects of pentachlorophenol and analogues in Bacillus subtilis. Biochem J. 1978. V.176. №3. P.639-647.

97. Lardy H.A., Pressman B.C. Effect of surface active agents on the latent ATPase of mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1956. V.21. №3. P.458-466.

98. Hermesh O., Kalderon B., Bar-Tana J. Mitochondria uncoupling by a long chain fatty acyl analogue. J Biol Chem. 1998. V.273. №7. P.3937-3942.

99. K. van Dam K., Slater E.C. A suggested mechanism of uncoupling of respiratory-chain phosphorylation. Proc Natl Acad Sci USA. 1967. V.58 №.5. P.2015-2019.

100. Hird F.J., Weidemann M.J. Oxidative phosphorylation accompanying oxidation of short-chain fatty acids by rat-liver mitochondria. Biochem J. 1966. V.98. №2. P.378-388.

101. Wojtczak L., Schonfeld P. Effect of fatty acids on energy coupling processes in mitochondria. Biochim Biophys Acta. 1993. V.l 183. №1. P.41-57.

102. Brunaldi K., Miranda M.A., Abdulkader F., Curi R., Procopio J. Fatty acid flip-flop and proton transport determined by short-circuit current in planar bilayers. J. Lipid Res. V.46. 2005. P.245-251.

103. Hunter D.R., Haworth R.A., Southard J.H. Relationship between configuration, function, and permeability in calcium-treated mitochondria. J Biol Chem. 1976. V.251. №1. P.5069-5077.

104. Labonia N., Muller M., Azzi A. The effect of non-esterified fatty acids on the proton-pumping cytochrome c oxidase reconstituted into liposomes. Biochem J. 1988. V.254. №1. P.139-145.

105. Reed N., Fain J.N. Potassium-dependent stimulation of respiration in brown fat cells by fatty acids and lipolytic agents. J Biol Chem. 1968. V.243. №2. P.6077-6083.

106. Garlid KD, Orosz DE, Modriansky M, Vassanelli S, Jezek P. On the mechanism of fatty acid-induced proton transport by mitochondrial uncoupling protein. J Biol Chem. 1996. V.271. №5. P.2615-2620.

107. Decker S.J., Lang D.R. Mutants of Bacillus megaterium resistant to uncouplers of oxidative phosphorylation. J Biol Chem. 1977. V.252. №1. P.5936-5938.

108. Guffanti AA, Fuchs RT, Krulwich TA. Oxidative phosphorylation by isolated membrane vesicles from Bacillus megaterium and its uncoupler-resistant mutant derivative. J Biol Chem. 1983. V.258. №1. P.35-37.

109. Guffanti A.A., Blumenfeld H., Krulwich T.A. ATP synthesis by an uncoupler-resistant mutant of Bacillus megaterium. J Biol Chem. 1981. V.256. №16. P.8416-8421.

110. Williams P. Quorum sensing, communication and cross-kingdom signaling in the bacterial world. Microbiology. 2007. V.153. P.3923-3938.

111. Aaronson S. Chemical communication at the microbiological level. Florida: CRC Press. Inc. Boca Raton. 1981. V.l. P. 189; V.2. P.203.

112. Бухарин О.В., Гинцбург A.JL, Романова Ю.М., Эль-Регистан Г.И. Механизмы выживаемости бактерий. М.: Медицина. 2005. С.96-107.

113. Redfield R.J. Is quorum sensing a side effect of diffusion sensing? Trends Microbiol. V.10. 2002. P.365-370.

114. Lazazzera B.A. The intracellular function of extracellular signaling peptides. Peptides. Y.22. 2001. P.1519-1527.

115. Осипов Г.А., Эль-Регистан Г.И., Светличный В.А., Козлова А.Н., Дуда В.И., Капрелянц А.С., Помазанов В.В. О химической природе ауторегуляторного фактора d Pseudomonas carboxydoflava. Микробиология. 1985. Т.54. №2. С. 186-190.

116. Капрельянц А.С., Сулейменова М.И., Сорокина А.Д., Деборин Г.А., Эль-Регистан Г.И., Стоянович Ф.М., Лилле Ю.Э. Островский Д.Н. Структурно-функциональные изменения в бактериальных и модельных мембранах под действием фенольных липидов. Биологические мембраны. 1987. Т.4. С.254-261.

117. Eze М.О., McElhaney R.N. The effect of alterations in the fluidity and phase state of the membrane lipids on the passive permeation and facilitated diffusion of glycerol in Escherichia coli. J Gen Microbiol. 1981. V.124. №.2. P.299-307.

118. Kuruki Y.J. Effects of unsaturated fatty acids on the morphogenesis of an unsaturated fatty acid auxotroph of Escherichia coli. J. Bacteriol. 1981. V. 147. P. 1121-1124.

119. Cronan J.E. Jr., Vagelos P.R. Metabolism and function of the membrane phospholipids of Escherichia coli. Biochim. Biophys. Acta. 1972. V. 265. P. 25-60.

120. Zaritsky A., Parola A.H., Abdah M., Masalha H. Homeoviscous adaptation, growth rate, and morphogenesis in bacteria. J. Biophys. 1985. V. 48. P. 337-339.

121. ZaritskyA. Membrane micro viscosity might be involved in bacterial morphogenesis. Specul. Sci. Technol. 1983. V6. P. 465-470.

122. Yatvin M.B. Evidence that survival of irradiated Escherichia coli is influenced by membrane fluidity. Int. J. Radiat. Biol. 1976. V.30 P. 571-575.

123. George A.M., Cramp W.A., Yalvin M.B. The influence of membrane fluidily on radiation induced changes in the DNA of E. coli K1060. Int. J. Radial. Biol. 1980. V. 38. P. 427-438.

124. Alper Т., Cramp W.A., George A., Lunec J., Yatvin M.B. Membrane fluidity and the radio sensitivity of E. coli K1060. Int. J. Radiat. Biol. 1981. V.40. P. 211-215.

125. Suzuki S., Akamatsu Y. Increasing of radiation damage to potassium-ion permeability in E. coli cells with decrease in membrane fluidity. Int. J. Radiat. Biol. 1980. V.37. P. 475-482.

126. Suzuki S., Akamatsu Y. Involvement of membrane lipid in radiation damage to potassium-ion permeability of Escherichia coli. Int. J. Radiat. Biol. 1978. V.33. P. 185.

127. Bresler S.E., Rozenberg O.A., Noskin L.A., Stepanova I.M., Beketova A.G., Loshakoya L.V., Kovaleva I.G. Change in the radiosensitivity of Escherichia coli cells when cholesterol is introduced into their membrane. Dokl. Biochem. 1984. V. 274. P. 26-28.

128. Redpath J.L., Patterson L.K. Effect of membrane fatty-acid composition on radiosensitivity of Escherichia coli K1060. Radial. Res. 1978. V.75. P. 443-447.

129. Yatvin M.B., Gipp J.J., Dennis W.H. Influence of unsaturated fatty acids, membrane fluidity and oxygenation on the survival of an E.coli fatty acidauxotroph following y-irradiation. Int. J. Radiat Biol. 1979. V.35. P. 539-548.

130. Dennis W.H., Yatvin M.B. Correlation of hyperthermic sensitivity and membrane microviscosity in E. coli K1060. Int. J. Radial. Biol. 1981. V.39. P. 265-271.

131. Klamen D.L., Tuveson R.W. The effect of membrane fatty acid composition on the near-UV (300-400 nm) sensitivity of Escherichia coli K1060. Photochem. Photobiol. 1982. V. 35. P. 167-173.

132. Todo Т., Yonei S., Kato M. The modulating influence of the fluidity of cell membrane on excision repair of DNA in UV-irradiated Escherichia coli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1983. V. 110. P.609-615.

133. Doronina N., Ivanova E., Trotsenko Y., Pshenichnikova A., Kalinina E., Shvets V. Methylophilus quaylei sp. nov., a new aerobic obligately methylotrophic bacterium. Syst Appl Microbiol. 2005. V.28. №4. P.303-309.

134. Kankaanpaa P, Yang B, Kallio H, Isolauri E, Salminen S. Effects of polyunsaturated fatty acids in growth medium on lipid composition and on physicochemical surface properties of lactobacilli. Appl Environ Microbiol. 2004. V.70. №1. P.129-136.

135. Демкина E.B., Соина B.C., Эль-Регистан Г.И. Образование покоящихся форм Arthrobacter globiformis в автолизирующихся суспензиях. Микробиология. 2000. Т.69. №3. С. 383-388.

136. Mukerjee P., Mysels K.J. Critical Micelle Concentrations of Aqueous Surfactant Systems. National Standard Reference Data Series, National Bureau of Standards. Washington, D.C.: Government Printing Office. 1971. P. 136, 170.

137. Murakami K, Routtenberg A. Direct activation of purified protein kinase С by unsaturated fatty acids (oleate and arachidonate) in the absence of phospholipids and Ca . FEBS Lett. 1985. V.192. №.2. P.189-193.

138. Kanicky J.R., Shah D.O., Effect of degree, type and position of unsaturation on the pKa of long-chain fatty acids. Journal of Colloid and Interface Science, vol 256, Issue 1, 1 Dec, 2002, p 201-207

139. Wojtczak L., Mariusz R.W., Schonfeld P. Protonophoric Activity of Fatty Acid Analogs and Derivatives in the Inner Mitochondrial Membrane: A Further Argument for the Fatty Acid Cycling Model. Arch. Biochem. Biophys. 1998. V. 357, № 1, P. 76-84.

140. Skulachev V.P. Fatty acid circuit as a physiological, mechanism of uncoupling of oxidative phosphorylation. FEBS Lett. 1991. V.294. P.158-162.

141. Dubois M., Gilles K.A., Hamilton J.K., Rebers P.A., Smith F. Colorimetric method for determination of shugars and related substances. Anal. Chem. 1956. V.28. №3. P. 350-356.

142. Bligh E., Dyer W.A. A rapid method of total lipid extraction and purification. Can.J.Biochem. 1959. №8. P.911-917

143. Пшеничникова А.Б., Гаврилова E.C., Швец В.И.. Влияние физико-химических свойств клеточной поверхности грамотрицательных бактерий на резистентность к стрептомицину. Вестник МИТХТ. 2011. Т.6. №2. С.43-50.

144. Нево А.Н.С., Пшеничникова А.Б., Складнев Д.А., Швец В.И. Влияние дейтерометанола и оксида дейтерия на ростовые характеристики и биосинтез экзополисахарида облигатными метилотрофными бактериями Methylophilus sp В-7741. Биотехнология. 2003. №6. С.38-46.

145. Jonathan S.G., Fasidi I.O. Effect of carbon, nitrogen and mineral sources on growth of Psathyerella atroumbonata (Pegler), a Nigerian edible mushroom. Food Chem. 2001. V.22. P.479-483.

146. Delavechia C., Hampp E., Fabra A., Castro S.. Influence of pH and calcium on the growth, polysaccharide production and symbiotic association of Sinorhizobium meliloti SEMIA with alfalfa roots. Biol. Fertil. Soils. 2003. V.38. P.110-114.

147. Dilworth M.J., Rynne F.G., Castelli J.M., Vivas-Marfisi A.I., Glenn A.R. Survival and exopolysaccharide production in Sinorhizobium meliloti WSM419 are affected by calcium and low pH. Microbiology. 1999. V.145 №7. P.1585-1593.

148. Дерффель К. Статистика в аналитической химии. М.: Мир, 1994, 272с.

149. Вознесенский В.А.. Статистические методы планирования эксперимента в технико-экономических исследованиях. М.: Статистика, 1981, 215 с.

150. И. Вучков, Л. Бояджиева, Е. Солаков. Прикладной линейный регрессионный анализ. М.: Статистика. 1987. 346 с.

151. Е.З. Демиденко. Оптимизация и регрессия. М.: Наука. 1989. 187 с.

152. Gorkovenko A., Zhang J., Gross R.A., Allen A.L., Kaplan D.L. Bioengineering of Surfactant Structure: Emulsan Analogs. Can.J. Microbiol. 1997. V.43. P.384-390.

153. Pearson W.A., Spessard G.O. a- and p-D-glucose pentaacetate. An experiment in structure assignment using NMR. J. Chem. Educ. 1975. V.52. №12. P.814.

154. Слонекер Дж. Газожидкостная хроматография ацетатов альдитов. В кн. Методы исследования углеводов. / Пер. с англ под ред. А.Я. Хорлина. - М.: Мир. 1975. С. 22-25.

155. Blakeney А.В., Harris P.J., Henry R.J., Stone B.A. A simple and rapid preparation of alditol acetates for monosaccharide analysis. Carbohydr. Res. 1983. V.113. P.291-299.

156. Blumenkrantz N., Asboe-Hansen G. New method for quantitative determination of uronic acids. Anal. Biochem. 1973. V.54. №2. P.484-489.

157. Filisetti-Cozzi T.M., Carpita N.C. Measurement of uronic acids without interference from neutral sugars. Anal. Biochem. 1991. V.197. №1. P. 157-162.

158. Sloneker J.H., Orentas D.G. Quantitative determination of pyruvic acid. Nature. 1962. V.194. P.478.

159. Polysaccharides: structural diversity and functional versatility / Second ed. by S. Dumitriu. New York : Marcel Dekker. 2005. 1224 p.

160. Cooper D.G., Goldenberg B.G. Surfaceactive agents from two Bacillus species. Appl. Env. Microbiol. 1987. V.53. P.224-229.

161. Llamas I., Mata J.A., Tallon R., Bressollier P., Urdaci M.C., Quesada E., V. Bejar. Characterization of the Exopolysaccharide Produced by Salipiger mucosus A3T, a Halophilic Species Belonging to the Alphaproteobacteria, Isolated on the Spanish Mediterranean Seaboard Mar. Drugs. 2010. V.8. P.2240-2251.

162. M. Ю. Плетнев. Некоторые реологические и коллоидно-химические свойства водных растворов ксантана. Украинский химический журнал. 1985. Т.51. №9. С. 915-919.

163. R.Winwood. Xanthan gum a microbial polysaccharide with unique properties // SOFW -Journal. 3/2002.p 22-24.

164. Поверхностно-активные вещества и композиции. Справочник. Под ред. М. Ю. Плетнева. М.: «Фирма КЛАВЕЛЬ». 2002. С. 17-25.

165. Шталь Э. Хроматография в тонких слоях. М.: Мир, 1965. С. 151, 295, 482. 166Физер Л., Физер М. Реагенты для органического синтеза. М.:Мир, 1970. Т. II. С.320.

выводы

1. Показано, что ЖК и их метиловые эфиры ускоряют рост и продукцию ЭПС М. quaylei. По способности стимулировать рост бактерии М. quaylei гидрофобные добавки в концентрации 50 мМ располагаются в ряду: Ci8:i>Ci8;o>C 16:о>метилолеат>метилстеарат>без добавок>С14:0>С i г:о •

2. По данным о составе фракции свободных жирных кислот в клетках, величин потенциала и анизотропии флуоресценции целых клеток установлено, что эффект ускорения роста метилотрофной бактерии М. quaylei экзогенными жирных кислот обусловлен включением их в состав наружной мембраны и изменением физико-химических свойств поверхности клетки, а также свойств липидного бислоя.

3. Оптимизированы условия получения (концентрация экзогенного олеата натрия, отношение источников углерода и азота C/N, концентрации фосфатов и хлорида кальция), выделения и очистки ЭПС М. quaylei.

4. Определен углеводный состав ЭПС М. quaylei: остатки D-глюкозы, L-рамнозы и D-галактозы в соотношении 5:2:1, а также фракционный состав: основная фракция (70%) ЭПС имеет молекулярную массу от 6.8-105 до 7.9-107 г/моль, а высокомолекулярная (13%) - 2,6-108. ЭПС М. quaylei аналогично бактериальному полисахариду ксантану содержит кислотные пирувилиденовые остатки (8,73%).

5. Установлено, что ЭПС М. quaylei образует вязкие псевдопластичные растворы с тиксотропными свойствами и обладает эмульгирующей активностью, стабилизирует эмульсии типа «масло в воде». ЭПС М. quaylei может быть использован для создания препаратов стабильных косметических и лекарственных эмульсий, а также в составе буровых растворов.