Метаболические аспекты биосинтеза полигидроксибутирата/валерата аэробными метилобактериями тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, кандидат биологических наук Короткова, Наталья Анатольевна

• Короткова, Наталья Анатольевна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Короткова, Наталья Анатольевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Биосинтез бактериальных полигидроксиалканоатов

1.1. История вопроса

1.2. Внутриклеточная локализация ПГА

1.3. Пути биосинтеза ПГА у микроорганизмов

1.4. Деградация ПГБ

1.5. Биосинтез ПГА при культивировании бактерий на различных субстратах

1.6. Регуляция биосинтеза ПГБ 22 Глава 2. Биотехнологические аспекты синтеза биополимера

2.1. Методы анализа ПГА

2.2. Физико-химические свойства и сферы применения ПГА

2.3. Факторы, определяющие экономику производства ПГА

2.4. Способы культивирования различных бактерий - продуцентов ПГА

2.5. Перспективы производства ПГА

2.6. Метилотрофные бактерии как продуценты ПГБ/В 34 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3. Объекты и методы исследования

3.1. Объекты исследования и условия культивирования

3 2. Изучение влияния различных компонентов среды на биосинтез ПГБ

3.3. Биосинтез ПГБВ

3.4. Культивирование в ферментере

3.5. Анализ распределения 14С в ССЬ, ПГБ/В и клеточных компонентах

3.6. Динамика включения радиоуглерода

3.7. Ингибиторный анализ

3.8. Экстракция и измерение внутриклеточного содержания НАД(Ф)Н

3.9. Методы определение активности ферментов

3.10. Нативный электрофорез

3.11. Гель-хроматография

3.12. Методы количественного анализа ПГБ/В

3.13. Определение метаболитов в культуральной жидкости

3.14. Методы анализа физико-химических свойств ПГБ/В

3.15. Аналитические методы 50 РЕЗУЛЬТАТЫ

Глава 4. Новый метод анализа ПГБ/В с использованием ВЭЖХ 52 Глава 5. Биосинтез ПГБ/В метилобактериями

5.1. Отбор штаммов-продуцентов ТТГБ

5.2. Влияние компонентов минеральной среды на синтез ПГБ у метилобактерий

5.3. Биосинтез ПГБВ M.extorquens, M.helvetica и P.methylutens при культивировании

на различных соединениях

5.4. Подбор оптимальных концентраций пропанола и пентанола для биосинтеза ПГБВ

5.5. Свойства ПГБ/В: температура плавления и молекулярный вес

5.6. Ферменты биосинтеза и деградации ПГБ у M.extorquens и M.helvetica

5.7. Ферменты метаболизма пропанола и пентанола у M.extorquens, M.helvetica 67 Глава 6. Физиолого-биохимические особенности биосинтеза ПГБ/В у M.extorquens

6.1 Биосинтез ПГБ/В M.extorquens при периодическом культивировании в ферментере

6.2. Метаболические изменения при культивировании M.extorquens на метаноле и

на смеси метанола/пентанола

6.3.Уровни внеклеточных метаболитов при культивировании M.extorquens на метаноле

Глава 7. Анализ углеродных потоков в С02, ПГБ/В и биомассу при

росте метилобактерий на различных субстратах

7*1. Анализ углеродных потоков при росте на метаноле, ацетате и бутирате

7.2. Математическая модель метаболизма метанола и ацетата

7.3. Влияние ингибиторов на биосинтез ПГБ и внутриклеточное содержание НАД(Ф)Н

7.4. Включение 14С из пропанола, пентанола, пропионата и валерата в СО2, ПГБВ и биомассу 90 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 93 ВЫВОДЫ юо СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Метаболические аспекты биосинтеза полигидроксибутирата/валерата аэробными метилобактериями»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы: Многие прокариоты синтезируют и запасают поли-3-гидроксибутират (ПГБ) при несбалансированных условиях роста (дефицит азота, фосфатов, кислорода или магния) в виде цитоплазматических гранул. Биополимер обладает полезными свойствами - биоразлагаемостью, биосовместимостью, термопластичностью - и поэтому имеет очевидное практическое значение для биотехнологии, сельского хозяйства и медицины. Введение 3-гидроксивалерата (ЗГВ) в ПГБ существенно улучшает физико-химические свойства полимера. Сополимер 3-гидроксибутирата/З-гидроксивалерата (ГТГБВ) обладает большей прочностью и эластичностью (уменьшается модуль Юнга с увеличением фракции ЗГВ в ПГБВ), чем ПГБ, и поэтому более перспективен как биоразлагаемый заменитель персистентных химических полимеров (Anderson and'Dawes, 1990).

До сих пор себестоимость ГГГБ/В служит основным препятствием широкому использованию в промышленном масштабе. Одной из причин является высокая цена субстратов для культивирования микроорганизмов, которая достигает треть стоимости биополимера (Вугош, 1987). Как известно, метилотрофные бактерии с сериновым путем Ci метаболизма накапливают значительное количество ПГБ (Trotsenko et al., 1992). Метанол является одним из потенциальных субстратов для производства биополимера, так как имеет низкую цену, высокую чистоту, небольшую плотность и хорошую растворимость в воде. Однако физиолого-биохимические основы биосинтеза ПГБ/В у аэробных метилобактерий до сих пор не ясны, что существенно ограничивает возможности реализации этого перспективного процесса в биотехнологии.

Создание промышленных производств на основе микробиологического синтеза биополимера требует детального и всестороннего изучения штаммов-продуцентов, в том числе исследования метаболизма субстратов. Это позволит оценить потенциальные возможности штаммов и разработать подходы к улучшению их производственных характеристик, снизить себестоимость биополимера.

Цель и задачи исследования. В связи с вышеизложенным понимание принципов метаболической организации метилотрофных продуцентов ПГБ/В было предпосылкой и целью данного исследования.

Для достижения указанной цели в работе решались следующие основные задачи:

1. Разработать быстрый и чувствительный метод определения ПГБ/В в микробной биомассе.

2. Подобрать метилотрофные продуценты и оптимальные условия их культивирования для биосинтеза ПГБ/В. Оценить физико-химические свойства биополимера.

3. Установить пути биосинтеза и деградации ПГБ/В и пути метаболизма косубстратов у метилотрофных продуцентов.

4. Определить источник НАД(Ф)Н для биосинтеза ПГБ/В у сериновых мепгилобактерий.

Научная новизна работы.' Разработан простой чувствительный метод количественного определения ПГБ/В в микробной биомассе с помощью ВЭЖХ на колонке с обращенной фазой Ci8 в изократическом режиме элюции.

В результате скрининга отобраны 3 продуцента ПГБ - Methylobacterium extorquens, Methylopila helvetica и Paracoccus methylutens. Обнаружено, что метилобактерии накапливают ПГБВ в присутствии пропанола, пентанола, пропионата и валерата, при этом добавление С5-субстратов приводит к более высокому содержанию ЗГВ в составе сополимера, нежели внесение Сз-соединений. P.methylutens синтезирует ГГГБВ также в присутствии глицерина и гептана.

Впервые установлены пути метаболизма пропанола и пентанола у M.extorquens и M.helvetica. Радиоизотопным методом показано у M.extorquens существование нового альтернативного пути окисления пропионил-КоА и валерил-КоА, связанного с декарбоксилированием первого углеродного атома.

У M.extorquens и M.helvetica определены ферменты биосинтеза и деградации ПГБ, Обнаружено, что только НАДФН-зависимая ацетоацетил-КоА редуктаза участвует в биосинтезе полимера. Выявлены различия в путях деградации ПГБ.

Впервые определены скорости образования С02, ПГБ/В и биомассы при росте на С! и Cn-субстратах. Разработана математическая модель, описывающая метаболизм этих субстратов у сериновых метилобактерии. Показано, что при росте бактерий на метаноле скорость образования НАДФН в цикле Кребса не обеспечивает скорость биосинтеза ПГБ и биомассы.

У M.extorquens и M.helvetica выявлены активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ метилентетрагидрометаноптерина и метилентетрагидрофолата. Результаты радиоуглеродного, энзимологического, ингибиторного анализа и математического моделирования метаболических потоков у сериновых метилобактерий свидетельствуют об участии тетрагидрофолатного и/или тетрагидрометаноптеринового/метанофуранового путей

переноса одноуглеродных фрагментов в генерировании НАДФН для биосинтеза ПГБ при метилотрофном росте.

Практическое значение работы. Разработанный нами метод анализа ПГБ/В достаточно прост и чувствителен, что позволяет оперативно проводить серийные анализы микробной биомассы и контролировать кинетику накопления биополимера в процессе ферментации.

Отобраны метилотрофные штаммы, активно синтезирующие ПГБ/В. Установлен спектр косубстратов, культивирование на которых приводит к биосинтезу ПГБВ, подобраны их оптимальные ростовые концентрации. В связи с этим результаты работы могут представлять практическую ценность при разработке способов получения ПГБВ.

Полученные данные по метаболической организации у штаммов-продуцентов ПГБ/В могут служить основой для их направленного культивирования с целью повышения эффективности биотехнологического процесса.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на конференциях "Биосинтез и деградация микробных полимеров. Фундаментальные и прикладные аспекты" (Пущино, 1995 г.) и "Автотрофные микроорганизмы" (Москва, 1996 г.), на международных симпозиумах "Bacterial Polyhydroxyalcanoates" (Davos, 1996 г.) и "Biochemical principles and mechanisms of biosynthesis and biodégradation of polymers" (Munster, 1998 г.), a также на стендовых сессиях научных работ ИБФМ РАН (Пущино, 1995, 1997, 1998 гг.). В целом работа обсуждена на совместном семинаре отдела биохимии микроорганизмов и лаборатории радиоактивных изотоповю

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 114 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (2 главы), описания методов исследования, изложения результатов (4 главы), обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа включает 27 таблиц, 16 рисунков. Список литературы содержит 146 источников литературы.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Биосинтез бактериальных полигидроксиалканоатов 1.1. История вопроса

Многие микроорганизмы обладают способностью накапливать различные внутриклеточные материалы, а именно - полисахариды, полифосфаты, липиды. Такие соединения чаще всего синтезируются организмом при несбалансированных ростовых условиях, при недостатке какого-либо элемента питания (за исключением углерода), и деградируются во время голодания, для поддержания жизнеспособности.

Полиэфиры 3-гидроксиалканоатов (ПГА) могут накапливаться в цитоплазма-тических гранулах многих прокариот и служат резервными источниками углерода и энергии, а также способствуют образованию спор и цист. Они имеют общую формулу:

[ — О — СН — СН2 — С — ]п 7

I II

R О

где R - СНз для поли-3-гидроксибутирата (ПГБ), R - СН3СН2 для поли-3-гидроксивалерата (ПГВ), R - СНз(СН2)2 для поли-3-гидроксигексаноата (ПГТ), R - СН3(СН2)4 для поли-3-гидроксиоктаноата (ПГО).

Поли-З-гидроксибутират - линейный эфир /?-оксимасляной кислоты - был впервые обнаружен Lemoigne (1926) в бактериях Bacillus megaterium. Много поздее было показано, что полимер накапливается во внутриклеточных гранулах большого количества грам-положительные и грам-отрицательные бактерий. При этом максимальные концентрации ПГБ зарегистрированы в клетках Alcaligenes eutrophus, до 76% к весу сухого вещества (Kim et al, 1994), Azotobacler vinelandii, до 80% (Page and Cornish, 1993) и рекомбинанта Escherichia coli, до 80% (Lee et al., 1994).

Развитие различных методов анализа внутриклеточных метаболитов - ИК-спектроскопии, ЯМР и ЭПР - позволило установить, что, помимо ПГБ микроорганизмы способны синтезировать и другие полигидроксиалканоаты. Wallen и Rohwedder (1974)

впервые определили, что полимер, открытый Lemoigne, может содержать также некоторое количество других 3-гидроксикислот. Они экстрагировали из активного ила полимер, состоящий из 3-гидроксибутирата (3ГБ) и 3-гидроксивалерата (ЗГВ) как главных компонентов, а также Сб и С? 3-гидроксикислот в незначительном количестве. Позднее в клетках Bacillus sp (Findlay and White, 1983) и A.eutrophus (Holmes et al., 1981) были обнаружен полимер, содержащий ЗГВ и 3-гидроксигексаноат (ЗГГ), а в клетках Pseudomonas oleovorans (De Smet et al., 1983) - 3-гидроксиоктаноат (ЗГО) и 3-гидроксидеканоат (ЗГД).

В последнее десятилетие использование необычных ростовых субстратов для культивирования бактерий позволило совершить настоящий прорыв в обнаружении новых строительных блоков биополимера - найдено около 100 различных мономеров. Среди них насыщенные 3-гидроксиалканоаты (ЗГА) с длиной цепи от 5 до 15 углеродных атомов, ненасыщенные ЗГА с длиной цепи от 5 до 13 углеродных атомов с одной или двумя двойными связями. У бактерий выявлена также способность накапливать изоцепные, ароматические, галогензамещенные ПГА, содержащие различные функциональные группы: карбокси-, циано-, ацетокси-, эпокси-, циклогексил-. Кроме ЗГА, в составе мономеров установлены 4-, 5- и 6-гидроксиалканоаты (Steinbüchel and Valentin, 1995). Единственный водорастворимый ПГА - поли-^-Ь-малат - синтезируют грибы Pénicillium cyclopium (Shimada et al., 1969), Physarum polycephalum (Fischer et al., 1989) и Aureobasidium pullutans (Lie and Steinbüchel, 1996). Необходимо отметить, что все найденные ПГА, имеющие хиральный атом, находятся в Щ-)-конфигурации. Можно ожидать, что в будущем будут обнаружены новые мономеры благодаря использованию разнообразных субстратов и успешному скринингу бактерий.

Несмотря на то, что в литературе описано огромное количество ПГА, только несколько из них было получено в количествах, достаточных для исследования их физических, химических и биологических свойств, и выявления области их потенциального применения. Это ПГБ, сополимер З-гидроксибутирата/З-гидроксивалерата (ПГБВ) (Lee and Chang, 1995), поли-3-гидроксивалерат (Steinbüchel and Schmack, 1995), поли-4-гидроксибутират (П4ГБ) (Steinbüchel et al., 1994) и сополимер 3-гидроксигексаноата/3-гидроксиоктаноата (ЗГГ/ЗГО) (Preusting et al., 1993а). Остальные ПГА получены в небольших количествах, поскольку субстраты (чаще всего аналоги

мономеров) являются дорогими, или токсичными для бактерий, или их содержание в клетках очень низкое.

1.2. Внутриклеточная локализация ПГА

У большинства микроорганизмов ПГА находятся в клетках в виде гранул, подобно накоплению крахмала в растениях. Гранулы ПГА окрашиваются черным Суданом и хорошо видны в фазовом контрасте светового микроскопа. Размеры гранул различны, их диаметр составляет от 0.2 до 0.8 мкм. Исследования ультраструктуры клеток показало, что количество гранул может колебаться от 6 до 8, и все они локализованы в цитоплазме (Ellar et а!., 1968).

Нативная структура гранул и физическое состояние ПГА в них пока не полностью определены. В гранулах помимо полимерных цепей ПГА, которые составляют 93.8-94.9% от веса сухих гранул, обнаружено 1.87% белков, 0.46% липидов и фосфолипидов (Lundgren et al., 1964; Griebel et al., 1968). Гранулы остаются в мобильном состоянии при выделении, только если окружены белками и липидными компонентами. При удалении фосфолипидов и денатурации белков полимер кристаллизуется (Stuart et al, 1995). На основании всех этих данных была предложена гипотетическая модель гранулы ПГА (Fuller et al., 1992; Hocking and Marchessault, 1994). Считалось, что плотность и высокая гидрофобность полимера в гранулах связана с наличием ограничивающих фосфолипидных оболочек, которые расположены монолинейно и укреплены белками. Таким образом, фосфолипиды должны играть важную роль в компартментации полимера и поддержании его в жидком, аморфном состоянии в живых клетках. Однако в предложенной модели гранулы по математическим расчетам фосфолипиды должны составлять 5.1-6.2% от веса сухой гранулы, что не совпадает с экспериментальными данными.

В мембранном слое гранул всегда присутствуют белковые включения. Их можно разделить на 4 класса. Первый класс белков представляют ПГА-синтазы - ферменты, катализирующие образование эфирных связей между мономерами ПГА. Второй класс белков - это деполимеразы, участвующие во внутриклеточной деградации ПГА. Третий класс белков состоит из небольших амфифильных белков - фазинов. Они обнаружены во всех бактериях, синтезирующих биополимер. Установлено, что фазины играют важную

роль в накоплении ПГА, контролируя размер, форму, количество гранул в клетках, а также скорость биосинтеза полиэфиров. Steinbüchel предположил, что именно фазины составляют главную основу мембранного слоя гранул, создавая монопленку между гидрофобными цепями ПГА и гидрофильной цитоплазмой. (Steinbüchel et al., 1995), К четвертому классу белков относятся белковые включения, функция которых еще не изучена.

Reusch и Sadoff (1983) обнаружили в клетках A.vinelandii и Bacillus subtitis высокомолекулярный ПГБ в виде цитоплазматических гранул, а низкомолекулярный - в цитоплазматической мембране. Напротив, Haemophilus influenzae и E.coli вообще не способны накапливать ПГБ в виде гранул. У этих бактерий низкомолекулярный ПГБ находится только в цитоплазматической мембране, при чем содержание биополимера корелирует с их компетентностью.

Из цитоплазматической мембраны E.coli были выделены квазикристаллические комплексы ПГБ, ионов кальция и полифосфатов в молярном соотношении 1/0.5/1 (Reusch and Sadoff, 1988). Цепь ПГБ состояла из 120-200 субъединиц, а полифосфатная цепь насчитывала 130-170 мономеров. Согласно компьютерной модели, в этих комплексах ПГБ свернут в спираль (14 субъедениц в каждом витке), образуя полый цилиндр с дипофильными метильными и метиленовыми группами на внешней стороне. Карбоксильные атомы кислорода и эфирные связи расположены внутри цилиндра и комплексно связаны через ионы Са2+ с полифосфатной цепью, которая также имеет спиральную конфигурацию.

Так как высокая концентрация данных комплексов обнаружена в генетических составляющих клеток, при этом внутренний диаметр цилиндра имеет достаточно места для одноцепочечной ДНК, то предполагается, что трансмембранные комплексы служат не только как резервы кальция, но и для транспорта кальция, фосфата и ДНК (Reusch and Sadoff, 1988).

Позже комплексы ПГБ/Са27полифосфат были также обнаружены и выделены из различных растительных и животных тканей (Reusch, 1989). Это единственное сообщение о нахождении ПГБ в эукариотических клетках. Но до сих пор неизвестно, как ПГБ синтезируется в этих организмах, включая E.coli.

ПГА найдены также в клетках бактерий в мономерном и димерном состоянии вместе с другими биомолекулами. Рамнолипиды, например, состоят из рамнозы и 3-

гидроксиалкановой кислоты. Рамнолипид R-1 (2-Оа-Ь-рамнопиранозил-«-Г-рамнопиранозил-З-гидроксидеканоил-З-гидроксидеканоат) и рамнолипид R-2 (a-L-рамнозил-/?-гидроксидеканоил-/?-гидроксидеканоат) синтезируют Pseudomonas aeruginosa и Pseudomonas fluorescens и выделяют их в среду (Syldatk et al., 1985). Кроме того, ПГБ был идентифицирован как компонент внутриклеточных полисахаридов в некоторых штаммах Rhizobium trifolii (Hollingsworth et al., 1984).

1.3. Пути биосинтеза ПГА у микроорганизмов

В зависимости от набора углеродных атомов мономеры ПГА классифицируются на короткоцепочные (3-5 углеродных атомов) и среднецепочные (6-16 углеродных атомов). Наиболее распространенным среди ПГА внутриклеточным биополимером является ПГБ, который синтезируется из ацетил-КоА. Существуют два различные пути биосинтеза ПГБ. У A.eutrophus (Haywood et al., 1988), Zoogloea ramigera (Fukui et al., 1987) и Azolobacter heijerinckii (Ritchie et al., 1971) в синтезе полимера участвуют 3-кетотиолаза, НАДФН-зависимая ацетоацетил-КоА редуктаза и ПГБ-синтаза. При этом происходит конденсация двух ацетил-КоА с образованием ацетоацетил-КоА, восстановление последнего субстрата до 0(-)-3-гидроксибутирил-КоА с участием НАДФН, и полимеризация в ПГБ (рис. 1).

Ацетил-КоА + Ацетил-КоА

3-кетотиолаза

КоА

Ацетоацетил-КоА

НАДФН НАДФ+

ацетоацетил-КоА редуктаза

1)(-)-Гидроксибутирил-КоА

ПГА сиптаза

КоА

ПГБ

Рис. 1. Биосинтез ПГБ у A.eutrophus.

У Rhodospirillum rubrum (Moskowitz and Merrick, 1969) биосинтез ПГБ происходит при участии пяти ферментов: 3-кетотиолазы, НАДН-зависимой ацетоацетил-КоА редуктазы, L(+)- и Б(-)-специфичных кротонил-КоА гидратаз (L- и D-кротоназы) и ПГБ-синтазы. Ацетоацетил-КоА восстанавливается до Ц+)-3-гидроксибутирил-КоА в результате активности НАДН-зависимой редуктазы. L- и D-кротоназы далее конвертируют Ц+)-3-гидроксибутирил-КоА в 0(-)-изомер, который полимеризуется с участием ПГБ-синтазы (рис.2). Ферменты второго пути также обнаружены у факультативного метилотрофа Methylobacterium rhodesianum с сериновым путем Ci метаболизма (Mothes and Babel, 1994).

A.eutrophus (Haywood et al., 1988), Z.ramigera (Saito et al., 1977) также имеют НАДН-зависимую ацетоацетил-КоА и L-кротоназу, но в биосинтезе ПГБ они не участвуют, а вовлечены в ^окисление жирных кислот.

Специфичность ферментов биосинтеза ПГБ не ограничивается выше перечисленными субстратами. З-Кетотиолаза, выделенная из A.beijerinckii (Senior and Dawes, 1973), A.eutrophus (Oeding and Schlegel, 1973) и Z.ramigera (Nishimura et al., 1978), проявляла активность не только с С4, но и с С5 КоА-производными кетокислот. У A.eutrophus присутствует также вторая 3-кетотиолаза с более широкой субстратной специфичностью к 3-кетоацил-КоА: от С4 до Сю (Oeding and Schlegel, 1973). Данный фермент, возможно, участвует в деградации жирных кислот.

Ацетил-КоА + Ацетил-КоА

КоА

3-кетотиолаза

D-кротон

Ацетоацетил-КоА

НАДН —^sj ацетоацетил-КоА редуктаза

!)(-)-Гид роксибугирил-КоА

ПГА синтаза

КоА

ПГБ

Рис. 2. Биосинтез ПГБ у R.rubrum.

НАДФН-зависимые редуктазы, выделенные из A.eutrophus (Haywood et al., 1988) и Z.ramigera (Fukui et al., 1987) проявляли активность только с Г)(-)-субстратами от С^ до С5, а у A.eutrophus еще и с Сб 3-гидроксиацил-КоА.

У A.eutrophus (Haywood et al., 1989a) и Z.ramigera (Tomita et al, 1983) ПГБ-синтаза может находиться в двух формах, растворимой и связанной с гранулой, и представляет один и тот же белок. Фермент, выделенный из разных бактерий, активен только с D(-)-изомерами (Steinbüchel and Valentin, 1995). ПГБ-синтаза из A.eutrophus имеет очень высокую субстратную специфичность,' катализируя включение в ПГА, по крайней мере, шести различных гидроксиалканоатов: 3-гидроксипропионата, 3-гидроксибутирата, 3-гидроксивалерата, 4-гидроксибутирата и 5-гидроксибутирата (Steinbüchel and Valentin, 1995).

Большинство псевдомонад, объединённые в первую группу на основе гомологии 16S рРНК, при культивировании на таких субстратах, как алканы, алкановые спирты и кислоты накапливают полимер, состоящий из 3-гидроксиалкановых кислот со средней длиной цепи (6-14 углеродных атомов). Этот путь синтеза был впервые обнаружен у P.oleovorans. Установлено, что в биосинтезе ПГА, состоящих из мономеров с п или п-2 углеродными атомами, при культивировании на n-алканах участвуют ферменты ß-окисления жирных кислот: L- и D-кротоназы, эпимераза и 3-кетоацил-КоА редуктаза (Lageveen et al., 1988). Например, при выращивании P.oleovorans на октане накапливается полимер, содержащий до 90% 3-гидроксиоктаноата. При этом октаноил-КоА, или Ц+)-гидроксиоктаноил-КоА, или 3-кетооктаноил-КоА покидают /^-окислительный цикл и превращаются под действием ферментов в 0(-)-гидроксиоктаноил-КоА - субстрат ПГА-синтазы.

Биосинтез полимера, содержащего пропорцию Сп+2 3-гидроксикислот, происходит в результате конденсации ацетил-КоА с ацил-КоА при участии 3-кетотиолазы. Наиболее трудно объяснить присутствие в ПГА следовых количеств C„+i и C„-i 3-гидроксикислот при росте бактерий на некоторых n-алкановых кислотах, но, по-видимому, в этих биосинтетических реакциях также участвуют ферменты общего метаболизма жирных кислот.

ПГА-синтаза P.oleovorans и других псевдомонад обладает необычно высокой субстратной специфичностью, катализируя включение 60 различных мономеров в ПГА. У P.oleovorans присутствуют две различные ПГА-синтазы, которые полимеризуют

алифатические, ненасыщенные или замещенные ЗГА с 6-14 углеродными атомами (Steinbüchel and Valentin, 1995).

Все псевдомонады, объединённые в 1 группу на основе гомологии 16S рРНК, за исключением P.oíeovorans, способны из ацетил-КоА синтезировать ПГА, состоящие из ЗГА со средней длиной цепи. Так, при росте на сахарах, а также на различных монокарбоновых кислотах P.aeruginosa, P.aureofaciens, P.ciíronellolis, P.mendocina, P.chlororaphis, P.marginalis, P.puiida, накапливают 3-гидроксидеканоат в значительном количестве (Timm et al., 1990; Yoon et al., 1994). Основываясь на результатах детального исследования структуры ПГА с помощью 'Н и 13С ЯМР, предполагается, что у данных бактерий 3-гидроксиацил-АГГБ (промежуточный продукт, ковалентно связанный с ацилпереносящим белком) является интермедиатом биосинтеза жирных кислот de novo и синтеза ПГА. Однако пока неизвестно, какие производные являются субстратами для ПГА-синтазы у этих бактерий (Eggink et al., 1992).

1.4. Деградация ПГБ

У большинства бактерий гранулы ПГА при недостатке углерода деградируются внутриклеточно и используются в качестве источника углерода и энергии.

Наиболее исследованы ферменты деградации биополимера у A.beijerinckii, A.euírophus, R.rubrum и Z.ramigera. Продуктами первой стадии деполимеризации ПГБ могут являться как три- и димеры, так и мономеры 3ГБ (Dawes and Senior, 1973). У A.euírophus обнаружена полная деполимеризация до 3ГБ, которая катализируется ПГБ-деполимеразой - ферментом, связанным с гранулой (Hippe and Schlegel, 1967). Tomita et al. (1983) предположил, что у Z.ramigera, также как и у R.rubrum, на начальной стадии деполимеризации ПГБ принимают участие три фермента: ПГБ-деполимераза, олигомер-тиолаза и димер-гидролаза.

З-Гидроксибутират затем окисляется НАД-зависимой 0(-)-3-гидроксибутират-дегидрогеназой до ацетоацетата. Далее ацетоацетат под действием ацетоацетат-сукцинат КоА-трансферазы превращается в ацетоацетил-КоА - предшественник ПГБ биосинтеза, и продукт его биодеградации (рис.3).

В то время как A.beijerinckii (Senior and Dawes, 1973) и A.euírophus (Oeding and Schlegel, 1973) обладают ацетоацетат-сукцинат КоА-трансферазой, у Z.ramigera (Fukui et

al., 1982) и облигатного метанотрофа Methylosinus trichosporium ОВЗЬ (Anderson and Dawes, 1990) ацетоацетат по реакции этерификации связывается с Ко А, образуя ацетоацетил-КоА, при участии ацетоацетил-КоА синтетазы (рис.3).

Среди ферментов катаболизма ПГБ изучен механизм регуляции только у 3-гидроксибутират дегидрогеназы. У A.beijerinckii и A.eulrophus (Senior and Dawes, 1973; Oeding and Schlegel, 1973) данный фермент ингибируется НАДН, пируватом, а-кетоглутаратом, предоотвращая деградацию полимера в присутствии экзогенного источника углерода. У A.eutrophus ГТГБ-деполимераза и 3-гидроксибутират дегидрогеназа находятся под контролем системы транспорта Сахаров, что приводит к ингибированию ферментов при избытке углерода или активирует их при недостатке углеродного питания (Steinbüchel et al., 1990).

ПГБ

П1 Ъ-деполимераза

0(-)-3-Гидроксибутират

НАД" НАДН

З-гидроксибутират-дегидрогеназа

сщетоацетат-сущииат

КоА-трансфераза Ацетоацетат

сукцинил-КоА | коА Тг л

; ~ ацетоацетия-КоА

сукцинат

рс0д ^ синтетаза

Ацетил-КоА Ацетоацетил-КоА

3-кетотиолаза

Рис.3. Внутриклеточная деградация ПГБ у бактерий. Пунктирной линией показано участие ацетоацетил-КоА синтетазы вместо ацетоацетат-сукцинат КоА-трансферазы у Z.ramigera и МлпсНохрог 'шт

Таким образом, ферменты ПГБ-цикла обладают эффективным регуляторным механизмом, позволяющим клеткам переносить неблагоприятные условия роста. Время сохранения жизнеспособности бактерий, содержащих высокие концентрации полимера, при несбалансированных условиях роста в 2-3 раза выше по сравнению с клетками, не синтезирующими ПГБ (Anderson and Dawes, 1990).

Некоторые бактерии и грибы, такие как P.lemoignei, P.pickettii, P.fluorescens, P.oleolvorans, P.putida, Z.ramigera, B.megaterium, Alcaligenes faecalis, Aspergillus fumigatus, Aspergillus penicilloides, Paecilomyces marquandii, Penicillium chermisinum способны деградировать ПГА внеклеточными деполимеразами (Tomasi et al., 1996). Кроме того, описана биодеградация нитей и лекарственных форм из ПГБ in vivo при имплантации в животные ткани (Holland et al., 1987).

Внеклеточные деполимеразы гидролизуют только "денатурированные" кристалличекие ПГА, тогда как внутриклеточные деполимеразы расщепляют нативные гранулы полимера. Обнаружено, что ПГА-деполимеразы, выделенные из P.lemoignei. P.pickettii, A.faecalis, деградируют только ПГБ, ПГБВ, ПГВ и сополимер (ЗГБ/4ГБ). У P.lemoignei выявлены, по крайней мере, пять деполимераз с различной субстратной специфичностью (Jendrossek et al., 1995). Деполимераза из P.fluorescens наиболее специфична к поли-3-гидроксиоктаноату и к полиэфирам, содержащим мономеры со средней длиной цепи, но может также гидролизовать ПГБ и ПГВ (Schirmer et al., 1993). Все изученные полимеразы расщепляют биополимеры до водо-растворимых продуктов: мономеров, димеров и тримеров.

В связи с экологическими проблемами свойство микроорганизмов деградировать и ассимилировать ПГА имеет большое практическое значение, поскольку полимерные изделия не накапливаются в окружающей среде. Скорость деградации изделий из ПГА зависит от физико-химические свойств полимера (состава, кристалличности, площади контакта) и от условий окружающей среды (температуры, рН, влажности). Полная деградация бутылок из ПГА происходит за несколько месяцев, а пленок - от нескольких часов до недель, в зависимости от толщины пленки. Молекулярный вес полимера остаётся неизменным в процессе биодеградации.

1.5. Биосинтез ПГА при культивировании бактерий на различных субстратах

Биосинтез ПГА у бактерий состоит из трех метаболических фаз. Первая стадия - это транспорт углеродного источника специфической транспортной системой, расположенной в цитоплазматической мембране или в результате диффузии. Вторая стадия - это превращение субстрата в соответствующий гидроксиацил-КоА - субстрат

ПГА-синтазы. На этой стадии участвуют как анаболические, так и катаболические ферменты. На третьей стадии происходит полимеризация гидроксиацил-КоА благодаря активности ПГА-синтазы (Steinbüchel and Valentin, 1995).

Большинство изученных бактерий синтезируют ПГА (кроме ГТГБ) при росте на гомологичных субстратах, чей углеродный скелет подобен структуре составляющего мономера. Наиболее простое превращение субстрата в ПГА происходит при культивировании на соответствующем гидроксиалканоате, который включается в полимер при участии тиокиназы или Ко А -тран сфераз ы и синтазы.

Кроме гидроксильной группы, субстрат может иметь дополнительные функциональные группы или двойную связь, хотя не обязательно, что в образованном полимере они сохранятся. Например, A.eutrophus синтезирует сополимер 3-гидроксибутирата/4-гидроксибутирата (ЗГБ/4ГБ) при росте на у-бутанлактоне, 4-хлорбутановой кислоте или 1,4-бутандиоле (Doi et al., 1990). При росте бактерии на 5-хлорвалерате происходит включение в сополимер 5-гидроксивалерата (Doi et al., 1987а).

Ацетил-КоА

I I i

*

0(-)-Гидроксибутирил-КоА

Ацетил-КоА + Пропионил-КоА

З-кетотиолаза

КоА

4

3-Кетовалерил-КоА

НАДФН г—ацетоацетил-КоА НАДФ+<3^ редуктаза

В(-)-Гидроксивалерил-КоА

ПГА синтеза

КоА

> ПГБВ

ПГА сиптаза

Рисунок 4. Биосинтез ПГБВ у А.еЫгорЪт при росте на ацетате и пропионате.

Обычно для биосинтеза ПГБВ необходимо добавление в ростовую среду пропионата, валерата, н-пропанола и н-пентанола (далее везде пропанол и пентанол), которые метаболизируются до пропионил-КоА и валерил-КоА. Кроме того, при синтезе

ПГБВ используют аминокислоты с нечетным количеством углеродных атомов - валин, изолейцин, или метионин, - которые окисляются до пропионил-КоА и валерил-КоА (Steinbüchel and Valentin, 1995).

У A.eutrophus, A.beijerinckii и Z.ramigera пропионил-КоА включается в ПГБВ в результате активности 3-кетотиолазы, НАДФН-зависимой ацетоацетил-КоА редуктазы и ПГБ-синтазы (рис.4). Благодаря отсутствию специфичности начального фермента, 3-кетотиолазы, происходит конденсация пропионил-КоА с ацетил-КоА и образование 3-кетовалерил-КоА, который далее восстанавливается до 0(-)-гидроксивалерил-КоА под действием ацетоацетил-КоА редуктазы. Последний затем ковалентно связывается в полиэфир при помощи синтазы.

Валерил-КоА встраивается в ПГБВ при участии ацил-КоА дегидрогеназы, L-кротоназы, НАДН- и НАДФН-зависимых ацетоацетил-КоА редуктазы и ПГБ-синтазы (рис. 5) (Haywood et al., 1988; Fukui et al., 1987; Shuto et al., 1981).

Валери.п-КоА

ацил-КоА дегидрогеназа

Метилкротонил-КоА

Н20

L-кротоназа

Ц+)-Гидроксивалерил-КоА

3-Кетовалерил-КоА

НАДФН1_____I allemoallemuJl'^°A

редуктаза

НАДФ+

Ацетил-КоА

0(-)-Гидроксивалерил-КоА

ПГА синтаза

ПГБВ

ПГА синтаза

Рисунок 5. Биосинтез ПГБВ у A.eutrophus при росте на ацетате и валерате.

У R.rubrum в образовании ЗГВ из пропионил-КоА также участвуют ферменты биосинтеза ГТГБ: 3-кетотиолаза, НАДН-зависимая ацетоацетил-КоА редуктаза, L- и D-кротоназы и ПГБ-синтаза, а валерил-КоА включается в сополимер посредством ацил-КоА дегидрогеназы, L- и D-кротоназ и ПГБ-синтазы (Anderson and Dawes, 1990; Moskowitz and Merrick, 1969).

Таким образом, широкий спектр различных гомологичных источников углерода может быть добавлен в качестве ростового субстрата и в результате получен сополимер с дополнительной гидроксикислотой.

Некоторые бактерии синтезируют ПГА при росте на негомологичных субстратах (табл.1). Такой способностью обладают некоторые Грамположительные коринеформные бактерии, такие как Rhodococcus, Corynebacterium и Nocardia (Anderson et al., 1990; Valentin and Dennis, 1996), псевдомонады (Haywood et al., 1990), пурпурные несерные бактерии, такие как Rhodobacter, Rhodocyclus, Rhodopseudomonas, Rhodospirillum (Liebergesell et al., 1991).Этот альтернативный способ получения различных сополимеров представляет большой интерес, так как позволяет синтезировать ПГА из сравнительно дешевых и нетоксичных субстратов.

У данных бактерий промежуточные продукты центральных метаболических путей, которые используются для получения энергии, или анаболических целей, могут быть направлены на биосинтез ПГА. Детальное изучение биосинтеза ПГБВ у R.ruber NC1MB 40126 с использованием 13С-ЯМР выявило возможный путь образования 3-гидрокси-валерата. Промежуточный продукт цикла трикарбоновых кислот (ЦТК), сукцинил-КоА, изомеризуется в метилмалонил-КоА при участии метилмалонил-КоА рацемазы и мутазы. Далее метилмалонил-КоА декарбоксилируется до пропионил-КоА под действием карбоксилтрансферазы и включается в биосинтезе ПГБВ (Anderson et al., 1992).

Steinbüchel and Pieper (1991) получили мутантный штамм A.eutrophus R3, имеющий дефекты по ферментам анаболизма аминокислот - треонина, лейцина и изолейцина. Мутант синтезировал ПГБВ при культивировании на фруктозе, глюконате, ацетате и лактате. Штамм обладал увеличенной активностью ацетолактатсинтазы и дефективной треониндегидратазой, и сверхпродуцировал изоцепные 2-кетоалканоаты - интермедиаты анаболизма аминокислот - при дефиците аммония в среде выращивания. 2-Кетоалка-ноаты деградировали при участии ферментов катаболизма аминокислот до пропионил-К"оА - предшественника 3-гидроксивалерата. Таким образом, получение подобных

мутантов может стать полезным инструментом для продукции ПГБВ из доступных субстратов.

Таблица. 1. Синтез микроорганизмами различных сополимеров при росте на негомологичных субстратах.

Штамм Источник углерода Полимер Источник литературы

A.eutrophus R3 Фруктоза, глюконат, ацетат, сукцинат, лактат ПГБВ Steinbüchel, 1991

Corynebacterium hydrocarboxydans Фруктоза, глюкоза, сукцинат, ацетат, лактат ПГБВ Anderson et al., 1990

Haloferax mediterranei Крахмал, ацетат ПГБВ Rodríguez-Valera and Lillo, 1992

Rhodococcus sp. ATCC 19070 Фруктоза, глюкоза, сахароза, ацетат, лактат ПГБВ Anderson et al., 1990

Rhodococcus sp. NCIMB 40126 Фруктоза, глюкоза, меласса, сукцинат, ацетат, лактат ПГБВ Anderson et al., 1990

Nocardia corallina Глюкоза, сукцинат ПГБВ Valentín and Dennis, 1996

Nocardia lucida Фруктоза, глюкоза, ацетат, сукцинат ПГБВ Anderson et al., 1990

Rhodobacíer sphaeroides Ацетат ПГБВ Liebergesell et al., 1991

Burkholderia sp Глюконат, сахароза Сополимер ЗГБ/З-гидрокси-4-пентената Rodrigues et al., 1995

P.cieruginosa Глюконат, фруктоза, глюкоза, этанол Сополимер ЗГО/ЗГД Haywood et al., 1990

Необходимо отметить, что, несмотря на большое разнообразие мономеров ПГА, среди них обнаружено лишь несколько гомополимеров. Это ПГБ, ПГВ, поли-3-гидрокси-5-фенилвалерат, поли-3-гидроксигексаноат, поли-3-гидроксигептаноат, поли-3-

гидроксиоктаноат, поли-3-гидроксинонаноат и поли-4-гидроксибутират (Steinbüchel and Valentin, 1995), но только ПГБ и 111 В синтезируются бактериями в больших количествах. ПГБ накапливают огромное количество микроорганизмов, а ПГВ выявлен только в клетках Cromobacterium violaceum при культивировании на валерате (Steinbüchel and Schmack, 1995).

Несмотря на то, что многие КоА-тиоэфиры гидроксиалкановых кислот являются эффективными субстратами для ПГА-синтаз, они подвергаются дальнейшей деградации до ацетил-КоА катаболическими ферментами. Следовательно, конкуренция между ПГА синтазами и катаболическими ферментами, также как и отсутствие специфичности всех изученных синтаз, препятствует синтезу гомополимеров.

1.6. Регуляция биосинтеза ПГБ

Бактерии, синтезирующие ПГБ, можно разделить на две группы. Первая группа бактерий, как, например, A.eutrophus, A.beijerinckii, Methylobacterium exlorquens, M.rhodesianum, накапливает ПГБ при несбалансированных условиях роста - дефиците азота, фосфатов, кислорода, сульфата, калия или магния и одновременном избытке источника углерода. Вторая группа бактерий, к которой относятся Alcaligenes latus, мутантный штамм Azotobacter vinelandii, имеющий дефект в дыхательной цепи окисления НАДН, и рекомбинант coli, накапливает ПГБ при сбалансированных условиях роста.

Очевидно, что у бактерий, относящихся к первой группе, биосинтез ПГБ должен контролироваться соотношением количества углерода к лимитирующему компоненту. Такая регуляция происходит как на уровне индукции или репрессии соответствующих ферментов, так и вследствие регуляции активностей ферментов внутриклеточными концентрациями метаболитов.

Регуляторный механизм биосинтеза ПГБ у A.beijerinckii был впервые предложен Senior and Dawes (1973). Штамм накапливал значительное содержание ПГБ в условиях дефицита кислорода. Установлено, что недостаток кислорода приводил к немедленному увеличению соотношения НАДН/НАД\ Поскольку цитратсинтаза и изоцитратдегидро-геназа ингибируются НАДН, ацетил-КоА в этих условиях не поступает в ЦТК, а направляется на биосинтез ПГБ. З-Кетотиолаза - первый фермент биосинтеза ПГБ -ингибируется свободным КоА. Поэтому, как только цитратсинтаза выключается, в

клетках уменьшается концентрация КоА, что активирует 3-кетотиолазу. Следовательно, у A.beijerinckii, 1IIЪ служит не только резервом углерода и энергии, но и для утилизации восстановительных эквивалентов при отсутствии акцептора - кислорода.

Система регуляции синтеза ПГБ у A.beijerinckii возможно не является универсальной моделью для изучения регуляторных механизмов накопления биополимера. Недостаток кислорода стимулирует биосинтез ПГБ лишь у некоторых бактерий. Однако дефицит таких компонентов среды, как азот и фосфор, приводит к прекращению белкового синтеза, • что, в свою очередь, резко увеличивает внутриклеточную концентрацию НАД(Ф)Н - ингибитора цитратсинтазы и изоцитратдегидрогеназы. Поэтому данный механизм подходит для изучения регуляции биосинтеза ПГБ у A.eutrophus и других бактерий (Lee et al., 1995).

Рекомбинант E.coli содержит высококопийную плазмиду, кодирующую гены ферментов биосинтеза ПГА из A.eutrophus, и накапливает полимер при сбалансированных условиях роста (Lee et al., 1994). Добавление в ростовую среду аминокислот или олеиновой кислоты приводит к увеличению скорости биосинтеза ПГБ у рекомбинанта. Установлено, что накопление биополимера стимулируется высоким внутриклеточным содержанием НАДФН, что активирует второй фермент биосинтеза ПГБ - ацетоацетил-КоА редуктазу (Lee et al., 1996). Рекомбинант также имеет низкую активность цитратсинтазы при культивировании в этих условиях, что обеспечивает доступность ацетил-КоА для ферментов биосинтеза ПГБ.

Таким образом, благоприятными условиями для биосинтеза ПГБ у бактерий обеих групп являются высокий уровень ацетил-КоА и восстановленных пиридиннуклеотидов при низкой концентрации КоА.

У A.eutrophus (Park and Lee, 1996) и A.beijerinckii (Dawes, 1988) при росте на углеводных субстратах глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа является основным источником НАДФН для биосинтеза ПГБ. Цикл Кребса выполняет анаболическую функцию и конкурирует за ацетил-КоА с ферментами биосинтеза ПГБ. Так, например, содержание биополимера у мутантного штамма A.eutrophus RM-1, имеющего дефектную изоцитратдегидрогеназу, было значительно выше, чем у штамма дикого типа и биосинтез ПГБ происходил даже при сбалансированных условиях роста (Park and Lee, 1996).

Однако у метилотрофных бактерий вопрос об источнике восстановительных эквивалентов для биосинтеза ПГБ остается открытым. Бактерии с сериновым путем Ci ассимиляции окисляют метанол через формальдегид и формиат до С02 посредством

соответствующих дегидрогеназ (Quayle, 1990). Формальдегид включается в сериновый цикл, приводя к образованию ацетил-КоА, который может идти на биосинтез ПГБ, либо окисляться в ЦТК.

Как считают Babel and Mothes (1978), ферменты прямого окисления метанола играют главную энергетическую роль в метаболизме метилотрофов. Считается, что на участке прямого окисления метанола не образуется НАДФН, а только НАДН (Mothes and Babel, 1994). Фермент ЦТК - НАДФ-зависимая изоцитратдгидрогеназа - единственный выявленный источник НАДФН у метилотрофов (Yamane, 1993; Mothes and Babel, 1995; Belova et al., 1997).

Метилотроф M.rhodesianum имеет НАДН- и НАДФН-зависимую ацетоацетил-КоА редуктазу, а также D- и L-кротоназы (Mothes and Babel, 1995). Поскольку, ферменты прямого окисления метанола образуют только НАДН, то в метаболизме ПГБ у метилотрофа должна участвовать НАДН-зависимая ацетоацетил-КоА редуктаза как у R.rubrum, при этом НАД-зависимая формиатдегидрогеназа является основным поставщиком восстановительных эквивалентов для биосинтеза полимера (Mothes and Babel, 1994). В этом случае регуляция биосинтеза ПГБ у M.rhodesianum подобна механизму, описанному у A.eutrophus и A.beijerinckii, где выключение ЦТК стимулирует накопление полимера.

Однако D-кротоназа у M.rhodesianum проявляла высокое значение Км, что ставит под сомнение участие этого фермента и НАДН-зависимой ацетоацетил-КоА редуктазы в биосинтезе ПГБ. Yamane (1993) и Belova et al. (1997) предполагают, что НАДФН-зависимая ацетоацетил-КоА редуктаза участвует в метаболизме ПГБ у метилотрофов, при этом НАДФ-зависимая изоцитратдегидрогеназа является энергетическим источником для биосинтеза полимера. В этом случае модель регуляции биосинтеза ПГБ у метилобактерий М. rhodesianum и M.extorquens должна сильно отличаться от регуляторных механизмов, обнаруженных у других бактерий.

Понимание принципов регуляции биосинтеза ПГА у бактерий необходимо для разработки различных подходов к улучшению штаммов-продуцентов и условий их культивирования.

Глава 2. Биотехнологические аспекты синтеза биополимера 2.1. Методы анализа ПГА

Разработано несколько методов определения содержания ПГА в микробной биомассе, а также состава мономеров и их распределения в биополимере.

Для количественного определения ПГБ в бактериальных клетках широко используют спектрофотометрический метод Law and Slepecky (1961). Метод основан на поглощении при 235 нм кротоновой кислоты, получаемой в результате химической деполимеризации ПГБ под действием концентрированной серной кислоты, и последующего элиминирования молекулы воды. В последствии на основе данной процедуры было разработано определение ПГБ с помощью ионообменной (Aminex) высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (Karr et al., 1983). Данный метод имеет преимущества перед спектрофотометрическим определением ПГБ. Это -предварительное фракционирование материала до детекции кротоновой кислоты, высокая чувствительность и точность определения, быстрота анализа.

Поскольку метод Karr не позволял анализировать мономеры ПГА с более длинными цепями, чем 3-гидроксибутират, Brandl (1992) предложил использовать для анализа ПГБВ гидролиз биомассы 2 N NaOH с последующим анализом продуктов ионообменной (НРХ-87) ВЭЖХ.

Для анализа ПГБ в биомассе бактерий Jüttner et al. (1975) использовал ИК-спектрофотометрический метод, который основан на интенсивном поглощении при 5.75 нм связи V - С = О в ПГБ, растворенном в хлороформе.

Разработаны также методики анализа ПГБ с помощью газовой хроматографии (ГХ). Первый подобный метод был предложен Braunegg et al. (1978). Клетки с ПГБ подвергали мягкому щелочному или кислотному метанолизу. Полученный метиловый эфир 3ГБ анализировали ГХ, при этом вся процедура занимала 4 ч. Riss и Mai (1988) улучшили данный метод, используя пропанол и HCl для образования пропилового эфира 3ГБ, который более устойчив к окислению и легче фракционируется, чем метиловый эфир. Этот метод позволяет кроме 3ГБ анализировать довольно широкий спектр ЗГА с более длинной углеродной цепью.

Кроме того, существуют также другие модифицированные методы определения ПГА с помощью ГХ. Grassie et al. (1984) подвергал лиофильно высушенную биомассу

пиролизу с последующим анализом продуктов с помощью капиллярной ГХ. ПГБ расщеплялся до кротоновой и изокротоновой кислот, тогда как из ГТГБВ получали также /и/хшс-2-пентеновую кислоту с примесью z/wc-изомера. Поскольку данным методом можно идентифицировать дегидратированные ди- и тримеры, это позволяет проводить структурный анализ ПГА - определение мономерной последовательности.

Для исследования различных изоцепных, ненасыщенных и замещенных мономеров ПГА был успешно применен ЯМР. Анализ спектра ]Н ЯМР позволяет установить состав полимера, а 13С ЯМР-анализ - распределение мономерных единиц в ПГА (Doi et al., 1986).

Для конформационного анализа ПГБ в хлороформе использовали вискозиметрию, светорассеяние, оптическую дисперсию вращения, а также 'Н ЯМР (Akita et al., 1976; Cornibert et al., 1970; Doi et al., 1986; Marchessault et al., 1970), которые выявили спиральную структуру полимера в растворителях.

2.2. Физико-химические свойства и сферы применения ПГА

Физические, химические и механические свойства ПГА, такие как температура плавления, кристалличность, жесткость, хрупкость, устойчивость к органическим растворителям, сильно зависят от мономерного состава и молекулярного веса полимера. В литературе были описаны свойства ПГБ, ГТГБВ, 111 В, сополимера ЗГБ/4ГБ и сополимера ЗГТ/ЗГО. Другие биополимеры были получены лишь в небольших количествах, что не позволило детально исследовать их свойства.

Проведен конформационный анализ ПГБ и ПГВ и предложена структура цепи, обладающая низкой потенциальной энергией. Данная молекулярная модель состоит из правосторонней спирали с шагом 0.556 для ПГВ и 0.596 для ПГБ (Anderson and Dawes, 1990). Спиральная конформация полимера стабилизируется взаимодействиями карбонил/метил и не зависит от образования водородных связей.

ПГБ имеет плотность между 1.171 и 1.269 г/см3. Нижнее значение соответствует аморфному состоянию, а верхнее - кристаллическому. Температура плавления ПГБ, как правило, варьирует между 157 и 188° С (Bluhm et al., 1986). ПГБ - термопластичный полимер. При нагревании полимера цепи его молекул легко сдвигаются относительно друг друга, в результате чего полимер размягчается, и приобретает текучесть. Данное свойство позволяет ПГБ прессоваться в различные формы, нити, волокна, пленки и т.п.

Однако при температуре 190° С происходит быстрое разложение биопластика. Поэтому, ПГБ можно прессовать только в узком температурном интервале.

Некоторые из физико-химических свойств ПГБ подобны свойствам химического полимера - полипропилена (табл.2). ПГБ и полипропилен имеют близкие температуры плавления и степени прозрачности. Однако по своим механическим свойствам ПГБ более жесткий и хрупкий, чем пропилен, поэтому возникает необходимость добавления пластификаторов для понижения его модуля Юнга (Holmes, 1985).

ПГБ является пьезоэлектрическим биополимером, так как давление, используемое при изготовлении пленки ПГБ, приводит к пьезоэлектрическому эффекту, который обусловлен внутримолекулярными взаимодействиями между полярными атомами в кристаллической решетке. Пьезоэлектрическая константа для ПГБ составляет приблизительно 0.1 pC/N.

Растворимость ПГБ в органических растворителях может быть использована для экстракции полимера из микробной биомассы. ПГБ растворяется в хлороформе, трихлорэтилене, этилацетате, диметилформамиде, 0.5 М феноле, ледяной уксусной кислоте и 1 N NaOH. Не растворяется в метаноле, этаноле, ацетоне, гексане, воде и разбавленных минеральных кислотах.

Таблица 2. Сравнительная характеристика физико-химических свойств различных ПГА* и

полипропилена

Свойства ПГБ ПГБВ ПГО Полипропилен

Температура плавления, °С 175 145 61 176

Кристалличность, % 80 40 30 70

Молекулярный вес, кДа -500 -500 -500 -200

Температура затвердевания, °С 15 -1 -35 -10

Предел прочности на разрыв, МПа 40 32 10 38

Растяжение на разрыв, % 6 - 300 400

Устойчивость к УФ излучению хорошая хорошая хорошая плохая

Устойчивость к растворителям плохая плохая плохая хорошая

*- охарактеризован ПГБВ, содержащий 80% С4 и 20% С5; ПГО, содержащий 10% С<„ 86% С8и4%С10 (King, 1982)*

Введение 3-гидроксивалерата в ПГБ существенно улучшает физические и механические свойства сополимера. Увеличение фракции ЗГВ в ПГБ приводит к уменьшению кристалличности, увеличению механической прочности и гибкости, возрастанию сопротивления на разрыв, уменьшению температуры плавления (табл.2). Например, 111ЬВ, содержащий 30-40% ЗГВ, имеет на 75° С меньше температуру плавления, чем гомополимер, но такую же температуру деградации (Wallen and Rohwedder, 1974; Bluhm et al., 1986). Это свойство позволяет использовать термические процессы при изготовлении различных форм из сополимера. Кроме того, пленки из сополимера, содержащего более 9% ЗГВ, деградируются быстрее почвенными микроорганизмами, чем пленки из гомополимера (Kunioka et al., 1989).

Doi et al. (1990) исследовал физико-химические свойства сополимера ЗГБ/4ГБ и отметил уменьшение кристалличности и температуры плавления сополимера по сравнению с гомополимером. Механические свойства данного биопластика подобны свойствам эластичной резины. Необходимо также отметить, что биодеградабельность сополимера ЗГБ/4ГБ выше, чем у ПГБ или ПГБВ (Kunioka et al., 1989).

Почти все ПГА, содержащие мономеры со средней длиной цепи (6-14 углеродных атомов), представляют собой эластичные полимеры с невысокой степенью кристалличности (табл.2). Они имеют низкую температуру плавления (39-61° С), поэтому размягчаются и приобретают текучесть уже при комнатной температуре (Gross et al., 1989). Кроме того, полимеры обладают низкой скоростью кристаллизации, что сильно ограничивает их применение во многих технологиях изготовления материалов. Однако получение ПГА, содержащих ненасыщенные мономеры, и их последующая сшивка химическими агентами позволяет увеличить температуру плавления и уменьшить скорость полимеризации (De Koning et al., 1994). Показано, что подобные модификации полимеров не нарушают их биодеградабельности.

Таким образом, используя различные микроорганизмы, и варьируя условия их выращивания, можно направленно изменять свойства получаемых биопластиков (от жесткого и твердого до эластичного).

Сферы применения биополимеров достаточно обширны, учитывая их вышеперечисленные свойства. ПГБ и ПГБВ уже используют в качестве различных упаковочных материалов, тары, пленки, заменителя латексов. Эти предметы, в отличие от изделий, сделанных на основе пропилена и полиэтилена, деградируют естественной

почвенной микрофлорой до мономеров, которые далее включаются в микробный обмен, не накапливаясь в среде.

Изделия из ПГА также разрушаются деполимеризующими ферментами плазмы животных тканей. Биодеградируемость и биосовместимость ПГА с животными тканями и газобарьерные свойства делают их прекрасными материалами для медицины, хирургии, фармакологии. Биополимеры используются для изготовления одноразовых сосудов для крови, хирургических ниток, перевязочного материала, имплантируемых средств доставки лекарств с контролируемым временем рассасывания оболочки и высвобождения препарата, как заменитель имплантируемых металлических спиц в ортопедической хирургии.

Активно проводятся исследования модифицированных пленок из ПГА с целью получения полунепроницаемых мембран. Пьезоэлектрические свойства ПГБ определяют перспективность применения его в радиоэлектронике.

2.3. Факторы, определяющие экономику производства ПГА

Несмотря на большие ожидания, биополимеры пока не получили широкого промышленного внедрения в связи с высокими ценами на эти материалы: цена за килограмм ПГБВ составляет 16$, а за килограмм полипропилена - 1 $ (Lee, 1996).

Экономикой процесса получения ПГА управляют различные факторы - цена источников углерода для культивирования микроорганизмов, сложность технологии, продолжительность культивирования, продуктивность процесса, стоимость растворителей для выделения полимера из биомассы.

Среди более 300 различных микроорганизмов, способных синтезировать ПГА, только несколько бактерий были использованы для получения биополимеров. При анализе различных штаммов обнаружено, что некоторые организмы имеют низкую скорость роста (Rhizohium sp., Ferrobacillus sp.), требуют для роста солнечную энергию (Chromatium sp.), накапливают небольшое содержание ПГА, или синтезируют существенные количества полисахаридов наряду с накопление ПГА (Byrom, 1987).

После рассмотрения этих и других факторов оказалось, что наиболее вероятные продуценты ПГА - это A.eulrophus, A Ja tus, A.vinelandii, несколько метилотрофных штаммов, P.oleovorans, рекомбинант A.eutrophus, рекомбинант K.coli и рекомбинант

Klebsiella aerogenes (Lee, 1996). Культивирование этих бактерий можно проводить до высокой плотности клеток с высоким содержанием полимера за сравнительно короткий период ферментации, что приводит к высокой продуктивности ПГА (определяется как г-л^-час"1).

Цена субстрата - один из основных факторов, влияющих на себестоимость ПГА. Микроорганизмы используют различные субстраты для роста и накопления биополимера - углеводы, масла, спирты, кислоты, углеводороды. Кроме того, выход ПГА по отношению к потребленному углеродному источнику также должен быть достаточно высоким, чтобы избежать расхода субстрата на образование побочных продуктов (полисахаридов, аминокислот и т.д.). Такой выход может быть теоретически предсказан, исходя из стехиометрических уравнений, описывающих биосинтез ПГА (Yamane, 1993). В таблице 3 представлен вклад различных углеродных источников в себестоимость ПГБ, определенный на основании теоретического выхода ПГБ.

Таблица 3. Влияние цены субстрата и выхода ПГБ на стоимость ПГБ

Субстрат Цена, Выход ПГБ, Цена ПГБ,

1$/кг субстрата г(ПГБ)/г(субстрата) * 1$/кг ПГБ

Глюкоза 0.493 0.38 1.30

Глюкоза, полученная при 0.220 0.38 0.58

гидролизе кукурузы

Сахароза 0.290 0.40 0.72

Метанол 0.180 0.43 0.42

Ацетат 0.595 0.38 1.56

Этанол 0.502 0.50 1.00

Меласса 0.220 0.42 0.52

Сырная сыворотка 0.071 0.33 0.22

Гидролизат гемицеллюлозы 0.069 0.20 0.34

*- определен, путем умножения теоретического выхода (Уатапе, 1993) на 0.8 (предполагая 80% ПГБ от веса сухой биомассы)

Анализируя выше перечисленные данные, можно сделать вывод, что на сегодня самыми экономичными субстратами для производства ПГБ являются сырная сыворотка,

гидролизат гемицеллюлозы, меласса, метанол. Однако пока только при культивировании бактерий на глюкозе можно получить высокие выходы полимера - до 80% от веса сухой биомассы.

Полимер может быть выделен из биомассы несколькими способами:

1. Прямой экстракцией органическими растворителями.

2. Механическим разрушением клеток.

3. В результате лизиса клеток химическим или энзиматическим способом Самым дешевым способом выделения ПГА, на сегодня, является экстракция органическими растворителями - метанолом, хлороформом и метиленхлоридом. Для разрушения клеточных оболочек может быть использована деструкция клеток недорогими ферментами: пепсином, трипсином, папаином и другими протеолитическими ферментами.

2.4. Способы культивирования различных бактерий - продуцентов ПГА

Способ культивирования бактерий зависит от условий, стимулирующих накопление биополимера. Если штамм относится к первой группе бактерий, синтезирующих ПГА при несбалансированных условиях роста, то для получения биополимера обычно используют двухстадийный периодический режим культивирования. На первой стадии клетки выращивают до необходимой плотности при сбалансированных условиях. На второй стадии в ростовой среде создают дефицит какого-либо компонента (азота, фосфатов, кислорода, сульфата, калия или магния), стимулируя биосинтез ПГА, при этом прирост биомассы происходит только за счет накопления ПГА.

Такой способ культивирования A.eutrophus применен ZENECA Bio Products для коммерческого производства ПГБ и ПГБВ (Lee, 1996). Для получения ПГБ культуру непрерывно выращивают в реакторе переточного типа на минеральной среде с глюкозой в качестве источника углерода. Содержание фосфата в среде рассчитывают только на основное количество клеточного роста, все остальные элементы питания добавлены в избытке. По мере роста культуры количество фосфатов уменьшается, и клетки начинают синтезировать преимущественно ПГБ. Начальная ростовая фаза длится приблизительно 60 час. Вторая фаза, в начале которой вносят дополнительно глюкозу, длится около 48 час. Выход ПГБ составляет до 80% от веса сухой биомассы (Kim et al., 1994).

Для получения 111 ЬВ процесс проводится таким же образом, за исключением того, что на второй стадии культивирования глюкозу добавляют вместе с пропионовой кислотой. Содержание ЗГВ в сополимере зависит от соотношения глюкозы к пропионату.

Однако большинство бактерий, относящихся к первой группе, как, например, M.extorquens и P.oleovorans, синтезируют ПГА наиболее эффективно, если лимитирующий компонент не полностью исчерпан из ростовой среды (Suzuki et al., 1986а; Preusting et al., 1993a). В этом случае, во второй стадии культивирования субстрат и лимитирующий компонент вносят в определенном соотношении и поддерживают в течение всего периода биосинтеза полимера.

Если штамм относится ко второй группе бактерий, синтезирующих ПГА при сбалансированных условиях роста, то для получения биополимера обычно применяют одностадийный периодический режим культивирования. В качестве источников азота, как правило, используют дрожжевой экстракт или пептон. Рост клеток и биосинтез ПГА должны быть тщательно сбалансированы для того, чтобы не допустить получение высокого урожая биомассы с низким содержанием ПГА, или преждевременной остановки ферментации при еще низкой плотности клеток. Лучший результат получается при высокой клеточной концентрации с высоким содержанием биополимера.

По всем расчетам, применение непрерывного культивирования для получения биополимеров должно повысить продуктивность ПГА. Культивирование бактерий первой группы в этом режиме необходимо проводить в двухстадийном хемостате, а бактерий второй группы - в одностадийном хемостате (Lee, 1996). Только А.latus и P.oleovorans выращивали в непрерывном режиме для получения ПГА (Preusting et al., 1991; Preusting et al., 1993b). Однако по сравнению с периодическим культивированием, в непрерывном режиме получен более низкий выход биополимера. Поэтому при использовании непрерывного режима культивирования необходим точный экономический анализ продуктивности и выхода ПГА.

2.5. Перспективы производства ПГА

Культивирование A.eutrophus на углеводном сырье в лимите по азоту или фосфатам оценивается как наиболее удобная технология получения ПГБ/В с учетом простоты технологии выращивания бактерий, высокого выхода продукта, а также доступности и

относительной дешевизны сырья. Продуктивность ПГБ составляет 2.42 r-л''-час"1, а ПГБВ - 2.55 г-л^-час"1 (Kim et al., 1994). Lee and Chang (1995) также использовали для культивирования A.eutrophus такие субстраты как этанол, олеиновая кислоту, смесь водорода и СО2.

A.latus является хорошим кандидатом для производства ПГБ, поскольку имеет высокую скорость роста, накапливая в сбалансированных условиях полимер с высокой продуктивностью - 3.97 г-л^-час"1. Данный штамм использует сахарозу эффективнее, чем A.eutrophus, поэтому для получения ПГБ может быть использована меласса. Однако A.latus синтезирует лишь около 50% ПГБ от веса сухой биомассы (Yamane et al., 1996а).

Мутант A.vinelandii накапливает ПГБ с высоким выходом - 80% от веса сухой биомассы - во время сбалансированного роста на глюкозе. Периодическое культивирование продуцента занимает 47 час. Но продуктивность ПГБ была довольно низкой - 0.34 г-л'1-час"1, что требует доработки ферментационной стратегии (Page and Cornish, 1993),

P.oleovorans является пока единственным микроорганизмом, который используется для получения среднецепочечных ТТГА (Сб-Сн). При двухфазном периодическом культивировании на октане штамм синтезирует около 33% сополимера ЗГГ/ЗГО с невысокой продуктивностью - 0.32 г-л^-час"1 (Preusting et al., 1993а).

Для увеличения выхода ПГА, расширения спектра используемых субстратов, а также для производства новых биополимеров в последние годы применены методы рекомбинантной ДНК. Рекомбинантный штамм E.coli, имеющий высококопийную плазмиду с генами ферментов биосинтеза ПГА A.eutrophus, синтезировал до 80% ПГБ при одностадийном периодическом культивировании на глюкозе. Продуктивность ПГБ составляла - 2.08 г-л~'-час ' (Lee et al., 1994). Поскольку E.coli растет также на сахарозе, лактозе и ксилозе, для получения ПГБ могут быть использованы такие субстраты, как меласса, гидролизат гемицеллюлозы и молочная сыворотка (Lee and Chang, 1995; Lee et al., 1997). Необходимо отметить, что E.coli плохо использует в качестве источника углерода пропионат. Это затрудняет получение с помощью рекомбинанта ПГБВ, однако мутантные штаммы могут решить эту проблему.

Получен также рекомбинантный штамм Klebsiella aerogenes, который содержит плазмиду, кодирующую гены биосинтеза ПГБ из A.eutrophus (Zhang et al., 1994). Рекомбинант при одностадийном культивировании на мелассе за 32 час синтезировал около 65% ПГБ от веса сухой биомассы с продуктивностью 0.75 r-л''-час'1.

Рекомбинанты E.coli и K.aerogenes получены из штаммов, не синтезирующих вообще ПГА. Введение в A.eutrophus плазмиды, содержащей ген, кодирующий ПГА-синтазу из этого же штамма, приводило к увеличению скорости биосинтеза ПГВ в 1.24 раза (Lee et al., 1994). Подобная стратегия может быть успешно применена для улучшения способности к биосинтезу ПГА у других бактерий.

Недавно начаты исследования по получению трансгенных растений, способных синтезировать биополимеры. В Arabidopsis thaliana введены гены ферментов биосинтеза ПГА из A.eutrophus и получено около 14% ПГБ от веса сухой биомассы (Poirier et al., 1995). По-видимому, дальнейшее развитие биохимии и генетики растений приведет к увеличению продуктивности и выхода ПГА из растительной биомассы.

2.6. Метилотрофные бактерии как продуценты ПГБ/В

Метанол является одним из наиболее перспективных субстратов для производства ПГБ, так как имеет низкую цену (табл.3), высокую чистоту, небольшую плотность и хорошую растворимость в воде. В связи с этим, метилотрофные бактерии как продуценты ПГБ/В привлекают большое внимание.

Для ассимиляции Ci-соединений метилобактерии используют различные пути метаболизма - сериновый, рибулозомонофосфатный (РМФ) и рибулозобисфосфатный (РБФ). Метилотрофы с сериновым путем окисления метанола, как, например, M.extorquens, M.rhodesianum, Methylobacterium organophilum и Methylosinus trichosporium являются наиболее эффективными продуцентами биополимера, накапливая до 80% ПГБ от веса сухой биомассы. Бактерии с РБФ путем ассимиляции Ci-соединений накапливают менее 20% ПГБ, а с РМФ путем - менее 1% ПГБ при культивировании на метаноле (Trotsenko et al., 1992).

Разработано несколько технологий производства ПГБ с использованием метилотрофных продуцентов (Suzuki et al., 1986а; Bourque et al., 1995; Kim et al., 1996). Однако низкий выход и невысокая продуктивность ПГБ требуют дальнейшей оптимизации процесса культивирования (табл.4). M.extorquens при периодическом культивировании на метаноле синтезировал до 64% ПГБ от веса сухой биомассы. Штамм выращивали на минеральной среде в ферментере с автоматической подачей метанола до концентрации 0.5+0.2 г/л. На первой стадии культивирования рН в ферментере

поддерживали N Fit ОН На этой стадии культуру выращивали до концентрации - 70 г/л, после чего заменяли метанол на смесь метанола и NH4OH (33%) в молярном соотношении 10/1. Культивирование длилось примерно 170 час, при этом продуктивность ПГБ составляла 0.88 г-л'^час"1 (Suzuki et al., 1986а).

Таблица 4. Биосинтез ПГБ при культивировании различных штаммов

Микроорганизм Субстрат Выход ПГБ, ПГБ, Время Продуктив-

биомас- г/л % культивиро- ность,

сы, г/л вания, час г/'л-час

M.extorquens Метанол 233 149 64 170 0.88

(Suzuki et al., 1986a)

M. organophilum Метанол 250 130 52 70 1.86

(Kim et al., 1996)

A.eutrophus Глюкоза 164 121 76 50 2.42

(Kim et al., 1994)

E.coli Глюкоза 102 89 80 39 2.08

(Lee et al., 1994)

При культивировании M.organophilum получен ПГБ с более высокой продуктивностью - 1.86 г-л"'-час' благодаря сокращению времени ферментации до 70 час. Биосинтез полимера стимулировали дефицитом калия в ростовой среде. На первой стадии культивирования рН в ферментере поддерживали КОН и выращивали штамм до концентрации 81 г/л. На второй стадии КОН заменяли на NaOH, при этом в процессе роста биомассы концентрация калия снижалась до 25 мг/л. Выход ПГБ составлял 52% от веса сухой биомассы (Kim et al., 1996). В этих условиях метаболическая активность клеток поддерживалась на высоком уровне, в отличие от культивирования в условиях дефицита аммония (Suzuki et al., 1986b).

Биосинтез ПГБВ у бактерий с сериновым путем Q метаболизма мало исследован. Показано, что M.extorquens накапливает ПГБВ при росте на метаноле и добавлении в ростовую среду на стадии биосинтеза полимера пропионата, валерата и пентанола (табл.5). Сообщалось также о биосинтезе ПГБВ у M.rhodesianum при культивировании на различных субстратных смесях - метанол/валерат, метанол/пропионат, фруктоза/валерат

(Babel, 1992). Однако биосинтез ПГБВ у сериновых метилобактерий в условиях культивирования в ферментере не был изучен.

Таблица 5. Биосинтез ПГБВ метилобактериями с сериновым путем метаболизма метанола

Микроорганизм Субстраты, в соот- ПГБ, Мономеры, Источник

ношении 10/1 (г/л) % % литературы

с4 с5

Methylobacterium sp. метанол/вал ерат 25 68 32 Haywood et al., 1989b

ICI 11484Х

M.extorquens MP4 метанол/валерат 26 95 5 Haywood et al., 1989b

M.extorquens MP4 метанол/пропионат 5 46 54 Haywood et al., 1989b

M.extorquens К метанол/пентанол 33 62 38 Ueda et al., 1992

Исследован биосинтез сополимера в условиях периодического культивирования у Рагасосст (¡етМ/гсат, метилотрофного штамма с РБФ путем С) метаболизма. На первой стадии культуру выращивали на метаноле (0.5% об/об). Содержание аммония в среде рассчитывали только на основное количество клеточного роста, все остальные элементы питания были добавлены в избытке. В течение начальной фазы, которая длилась 80 час, аммоний полностью использовался. Во второй стадии метанол добавляли вместе с пентанолом в соотношении 5/1 (об/об) и культивировали еще 58 час для биосинтеза сополимера. Выход ПГБВ составлял 26% от веса сухой биомассы, при этом содержание ЗГВ в сополимере достигало 60% (ГЫа й а1., 1992). Увеличение концентрации пентанола приводило к большему содержанию ЗГВ в составе ПГБВ.

При культивировании на одном пентаноле в тех же условиях Р\denitrificans накапливал до 24% гомополимера 3-гидроксивалерата (Уатапе е1 а1., 1996Ь). Метилотроф также синтезировал ПГБВ при росте на различных субстратных смесях -этанол/пропанол, этанол/пентанол, пропанол/пентанол, бутанол/пентанол (Уатапе е1 а1., 1996с).

Таким образом, цель нашего исследования заключалась в изучении биосинтеза ПГБВ метилобактериями с сериновым путем С1 метаболизма при культивировании на метаноле и косубстрате. Знание особенностей организации и регуляции метаболизма метилобактерий позволит контролировать биосинтез ПГБ/В, увеличить продуктивность и выход биополимера.

Экспериментальная часть

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Короткова, Наталья Анатольевна

выводы

1. Разработан быстрый и чувствительный метод анализа полигидроксибутирата (ПГБ) и его сополимера с 3-гидроксивалератом (ГТГБВ) посредством высокоэффективной жидкостной хроматографии на обращенной фазе Cig. Метод использовался для количественного определения содержания ГТГБВ в образцах биомассы метилобактерий и скрининга активных продуцентов.

2. Обнаружено, что сериновые метилобактерии Methylobaclerium extorquens и Methylopila helvetica активно синтезируют ПГБВ на смесях метанола с пропанолом, пропионатом, пентанолом или валератом, включая в сополимер Cs-косубстраты эффективнее, чем Сз-соединения. С увеличением количества 3-гидроксивалерата в составе ПГБВ температура плавления полимера снижалась, а кристалличность уменьшалась. Молекулярный вес ПГБВ в среднем составлял 50 кДа и не зависел от соотношения мономеров.

3. Определены пути биосинтеза и деградации ПГБ у М. extorquens и М.helvetica. Отсутствие у них D-кротоназы свидетельствует о функционировании классического трех стадийного пути биосинтеза ПГБ с участием 3-кетотиолазы, НАДФН-зависимой ацетоацетил-КоА редуктазы и ПГБ-синтазы. Выявлены различия в путях деградации ПГБ: у M.extorquens присутствуют 3-гидроксибутиратдегидрогеназа и ацетоацетат-сукцинат КоА-трансфераза, а у М.helvetica функцию ацетоацетат-сукцинат КоА-трансферазы выполняет ацетоацетил-КоА синтетаза.

4. Показано, что в первичном метаболизме пропанола и пентанола у M.extorquens и М.helvetica участвуют ФМС-связанные алкоголь- и альдегиддегидрогеназы, а также ацил-КоА синтетаза. Найдено, что М.extorquens обладает новым путем декарбоксилирования пропионил-КоА и валерил-КоА, причем метанол стимулирует их декарбоксилирование и включение в ПГБВ.

5. Результаты радиоизотопного, энзимологического, ингибиторного анализов и математического моделирования метаболических потоков у сериновых метилобактерий свидетельствуют, что основным донором НАДФН для биосинтеза ПГБ/В является не цикл Кребса, а прямое окисление метанола с участием тетрагидрометаноптериново-го/метанофуранового пути.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Короткова, Наталья Анатольевна, 1999 год

Список литературы

1. Белова JI.JL, Соколов А.Р., Моргунов И.Г., Троценко Ю.А. 1997. Очистка и характеристика цитратсинтазы из Methylobacterium extorquens — метилотрофного продуцента полигидроксибутирата. Биохимия. Т. 62. С. 85-90.

2. Быстрых Л.В., Троценко Ю.А. 1983. Очистка и некоторые свойства диоксиацетонкиназы метилотрофных дрожжей Candida boidinii. Биохимия. Т. 48. С. 16111616.

3. Логинова Н.В., Троценко Ю.А. 1979. Карбосилазы пирувата и фосфоенолпирувата у метилотрофов. Микробиология Т. 48. С. 202-206.

4. Akita S., Einaga Y, Miyaki Y,, Fujita H. 1976. Solution properties of poly(D-/?-hydroxybutyrate). 1. Biosynthesis and characterization. Macromolecules. V. 9. P. 774-780,

5. Anderson A.J., Dawes E.A. 1990. Occurrence, metabolism, metabolic role, and industrial uses of bacterial polyhydroxyalkanoates. Microbiol. Rev. V. 54. P. 450-472,

6. Anderson A.J., Haywood G.W., Williams DR., Dawes E.A. 1990. The production of polyhydroxyalkanoates from unrelated carbon sources. P. 119-129. In Dawes E.A. (ed.) Novel biodegradable microbial polymers. Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, The Netherlands.

7. Anderson A,J., Williams D R., Taidi В., Dawes E.A., Ewing D.E. 1992. Studies on copolyester synthesis by Rhodococcus ruber and factors influencing the molecular mass of polyhydroxybutyrate accumulated by Methylobacterium extorquens and Alcaligenes eutrophus. Internat.Symp. on Bacterial. Polyhydroxyalkanoates. 1SBP - 92. FEMS Microbiol. Rev. Schlegel H.G., Steinbüchel A. (ed.) Göttingen: Goltze-Drück. V. 103, P. 93-102,

8. Anthony С., Zatman L.J. 1964. The microbial oxidation of methanol. The methanol-oxidizing enzyme of Pseudomonas sp. M 27. Biochem. J. V. 92. P. 614-621.

9. Attwood MM., Harder W. 1978. Formate assimilation of Hyphomicrobium X. FEMS Microbiol. Lett. V. 3. P. 111-114.

10. Babel W., Mothes G. 1978. Dissimilatorische Sequenzen in methylotrophen bakterien. Z. Allg. Mikrobiol. V. 18. P. 17-26.

11. Babel W. 1992. Pecularities of methylotrophs concerning overflow metabolism, especially the synthesis of polyhydroxyalkanoates. Internat.Symp, on Bacterial, Polyhydroxyalkanoates. ISBP - 92. FEMS Microbiol. Rev. Schlegel H.G., Steinbüchel A. (ed.) Göttingen: Goltze-Drück. V. 103. P. 141-148.

12. Belova L.L., Sokolov A.P., Sidorov I.A., Trotsenko Y.A. 1997. Purification and characterization of NADPH-dependent acetoacetyl-CoA reductase from Methylobacterium exlorquens. FEMS Microbiol. Lett. V. 156. P. 275-279.

13. Blackmore M.A., Quayle J.R. 1970. Microbial growth on oxalate by a route not involving glyoxylate carboligase. Biochem. J. V. 118. P. 53-59.

14. Bluhm T L., Hamer G.K., Marchessault R H., Fyfe C A., Veregin R.P. 1986. Isodimorphism in bacterial poly(/?-hydroxybutyrate-co-/?-hydroxyvalerate). Macromolecules. V. 19. P, 28712876.

15. Bourque D., Pomerleau Y., Groleau D. 1995. High-cell-density production of po1y-,#-hydroxybutyrate (PHB) from methanol by Methylobacterium exlorquens production of high-molecular-mass PHB. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 44. P. 367-376.

16. Brandl H. 1992. A sensivite HPLC method for the detection of short-side-chain poly(3-hydroxyalkanoates). Internat.Symp. on Bacterial. Polyhydroxyalkanoates. ISBP - 92. FEMS Microbiol. Rev. Schlegel H.G., Steinbüchel A. (ed.) Göttingen: Goltze-Drück. V. 103. P. 441442.

17. Braunegg G., Sonnleither B., Lalferty R.M. 1978. A rapid method for the determination poly-/?-hydroxybutyric acid in microbial biomass. Eur. J. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 6. P. 2937.

18. Byrom D. 1987. Polymer synthesis by microorganisms: technology and economics. Trends Biotechnol. V. 5. P. 246-250.

19. Chistoserdova L., Lidstrom M.E. 1994. Genetics of the serine cycle in Methylobacterium exlorquens AMI: identification of sgaA and rnldA and sequences of sgaA, hprA, and in Id A. J. Bacteriol. V. 176. P. 1957-1968.

20. Chistoserdova L., Vorholt J.A., Thauer R.K., Lidstrom M.E. 1998. Ci transfer enzymes and coenzymes linking methylotrophic bacteria and methanogenic archaea. Science. V. 281. P. 99102.

21. Comeau Y., Hall K.J., Oldham W.K. 1988. Determination of poly-/?-hydroxybutyrate and poly-^-hydroxyvalerate in activated sludge by gas-liquid chromatography. Appl. Environ. Microbiol. V. 54. P. 2325-2327.

22. Copeland L., Quinnell R.G., Day D.A. 1989. Malic enzyme activity in bacteroids from soybean nodules. J. Gen. Microbiol. V. 135. P. 2005-2011.

23. Cornibert J., Marchessault R H., Benoit H., Weill G. 1970. Physical properties of po]y(ß-hydroxybutyrate). TTT. Folding of helical segments in 2,2,2-trifluoroethanol. Macromolecules V. 3. P. 741-746.

24. Davis B.J. 1964. Disk electrophoresis-11. Method and application to human serum proteins. Ann. N. Y. Acad. Sei. V. 121. P. 404-427.

25. Dawes E.A., Senior P.J. 1973. The role and regulation of energy reserve polymers in microorganisms. Adv. Microbiol. Physiol. V. 10. P. 135-266.

26. Dawes E.A. 1988. Polyhydroxybutyrate: an intriguing biopolymer. Bioscience Reports. V. 8. P. 537-547.

27. De Koning G.J.M., Van Bilsen H.H.M., Lemstra P.J., Hazenberg W., Witholt B., Preusting H., Van der Galien J G., Schirmer A., Jendrossek D. 1994. A biodegradable rubber by crosslinking poly(hydroxyalkanoate) from Pseudomonas oleovorans. Polymer. V. 35. P. 20902097.

28. De Smet M.J., Eggink G., Witholt B., Kingma J., Wynberg H. 1983. Characterization of intracellular inclusions formed by Pseudomonas oleovorans during growth on octane. J. Bacteriol. V. 154. P. 870-878.

29. Doi Y., Kunioka M., Nakamura Y., Soga K. 1986. Nuclear magnetic resonance studies on poly(/?-hydroxybutyrate) and a copolyester of /^-hydroxybutyrate and /3-hydroxyvalerate isolated from Alcaligenes eutrophus H 16. Macromolecules. V. 19. P. 2860-2864.

30. Doi Y., Tanaki A., Kunioka M., Soga K. 1987a. Biosynthesis of terpolyesters of 3-hydroxybutyrate, 3-hydroxyvalerate and 5-hydroxyvalerate from 5-chloropentanoic and pentanoic acids. Makrom. Chem. Rapid. Commun, V. 8. P. 631-635.

31. Doi Y., Kunioka M., Nakamura Y., Soga K. 1987b. Biosynthesis of copolyesters in Alcaligenes eutrophus H 16 from 13C-labeled acetate and propionate. Macromolecules. V. 20. P. 2988-2991.

32. Doi Y,, Segawa A., Kunioka M. 1990. Biosynthesis and characterization of po1y(3-hydroxybutyrate-co-4-hydroxybutyrate) in Alcaligenes eutrophus. Int. J. Biol. Macromol. V. 12. P. 106-111.

33. Eggink G., de Waard P., Huijberts G.N.M. 1992. The role of fatty acid biosynthesis and degradation on the supply of substrates for poly(3-hydroxya1kanoate) formation in Pseudomonas putida. Internat.Symp. on Bacterial. Polyhydroxyalkanoates. ISBP - 92. FEMS Microbiol. Rev. Schlegel H.G., Steinbüchel A. (ed.) Göttingen: Goltze-Drück. V. 103. P. 159-164.

34. Ellar D , Lundgren DG, Okamura K., Marchessault R.H. 1968. Morphology of poly-/?-hydroxybutyrate granules. J. Mol. Biol. V. 35. P. 489-502.

35. Findlay R.H., White D.C. 1983. Polymerie beta-hydroxyalkanoates from environmental samples and Bacillus megaterium. Appl. Environ. Microbiol. V. 45. P 71-78.

36. Fischer H., Erdmann S., Holler E. 1989. An unusual polyanion from Physarum polycephalum that inhibits homologous DNA polymerase in vitro. Biochemistry. V. 28. P. 52195226.

37. Fukui T., Ito M., Tomita K. 1982. Purification and characterization of acetoacetyl-CoA synthetase from Zoogloea ramigera I-16-M. Eur. J. Biochem. V. 127 P. 423-428.

38. Fukui T., Ito M., Saito T., Kenkichi T. 1987. Purification and characterization NADP-linked acetoacetyl-CoA reductase from Zoogloea ramigera I-16-M. Biochem. Biophys. Acta. V. 917. P. 365-371.

39 Fuller R.C., O'Donell J.P., Saulnier J., Redlinger T.E., Foster J., Lenz R.W. 1992. The supramolecular architecture of the polyhydroxyalkanoate inclusions in Pseudomonas oleovorans. FEMS Microbiol. Rev. V. 103. P. 279-288.

40. Garrigues C., Loubiere P., Lindley N.D., Cocaign-Bousquet M. 1997. Control of the shift from homolactic acid to mixed-acid fermentation in Lactococcus lactis\ predominant role of the NADH/NAD+ ratio. J. Bacteriol. V. 179. P. 5282-5287.

41.Grassie N., Murray E.J., Holmes P.A. 1984. The thermal degradation of poIy-(D)-/?-hydroxybutyric acid. 1. Identification and quantitative analysis of products. Polym. Degrad. Stabil. V. 6. P. 47-61.

42. Green D.E., Mii S., Mahler HR., Bock R.M. 1954. Studies on the fatty acid oxidizing system of animal tissues. Ill Butyryl coenzyme A dehydrohenase. J. Biol. Chem. V. 206. P. 1-12.

43. Griebel R., Smith Z., Merrick J.M. 1968. Metabolism of poly-/?-hydroxybutyrate, and properties of native poly-/?-hydroxybutyrate granules fron Bacillus megaterium. Biochemistry. V. 7. P. 3676-3681.

44. Gross RA., DeMello C., Lenz R.W., Brandl H., Fuller R.C. 1989. Biosynthesis and characerization of poly(/i-hydroxyalkanoates) produced by Pseudomonas oleovorans. Macromolecules. V. 22. P. 1106-1115.

45. Haywood G.W., Anderson A.J., Chu L, Dawes F. A. 1988. The role of NADH and NADPH-linked acetoacetyl-CoA reductase in the poly-3-hydroxybutyrate synthesizing organism Alcaligenes eutrophus. FEMS Microbiol. Lett. V. 52. P. 259-264.

46. Haywood G.W., Anderson A.J., Dawes E.A. 1989a. The importance of PHB-syntase substrate specificity in polyhydroxyalkanoate synthesis by Alcaligenes eutrophus. FEMS Microbiol. Lett. V. 57. P. 1-6.

47. Haywood G.W., Anderson A. J., Dawes E.A. 1989b. A survey of the accumulation of novel polyhydroxyalkanoates by bacteria. Biotechnol. Lett. V. 11. P. 471-476.

48. Haywood G.W., Anderson A.J., Ewing D.F., Dawes E.A. 1990. Accumulation of a polyhydroxyalkanoate containing primarily 3-hydroxydecanoate form simple carbohydrate substrates by Pseudomonas sp. strain NCI MB 40135. Appl. Environ. Microbiol. V. 56 P. 33543359.

49. Henderson R.A., Jones C.W. 1997. Poly-3-hydroxybutyrate production by washed cells Alcaligenes eutrophus; purification, characterization and potential regulatory role of citrate synthase. Arch. Microbiol. V. 168. P. 486-492.

50. Hippe H., Schlegel H.G. 1967. Hydrolyse von PHBS durch intracellulare depolymerase von Hydrogenomonas HI 6. Arch. Mikrobiol. V. 56. P. 278-299.

51. Hocking P.J., Marchessault R.H. 1994. Biopolyesters. In Chemistry and technology of biodegradable polymers. Griffin G.J.L. (ed ). Chapman and Hall. London. P. 48-96.

52. Holland S., Jolly A., Yasin M., Tighe B. 1987. Polymers for biodegradable medical devices. II. Hydroxybutyrate-hydroxyvalerate copolymers. Hydrolytic degradation studies. Biomaterials. V. 8. P. 289-296.

53. Hollingsworth R.I., Abe M., Sherwood J.E., Dazzo F.B. 1984. Bacteriophage-induced acidic heteropolysaccharide lyases that convert the acidic heteropolysaccharides of Rhizobium trifolli into oligosaccharide units. J. Bacteriol. V. 160. P. 510-516.

54. Hollinshead J.A. 1966. Microbial growth on Cl compounds. The role of folate in the metabolism of Pseudomonas AMI. Biochem. J. V. 99. P. 389-395.

55. Holmes P.A., Wright L.F., Collins S.H. 1981. Beta-hydroxybutyrate polymers. Eur.Patent Appl. 0052459.

56. Holmes P A. 1985. Applications of PHB - a microbially produced biodegradable thermoplastic. Phys. Technol. V, 16. P. 32-36,

57. Horton A.A., Kornberg H.L. 1964. Oxaloacetate 4-carboxy-lyase from Pseudomonas ovalis Chester. Biochim. Biophys. Acta. V. 89. P. 318-381.

58. Jackson F A., Dawes E.A. 1976, Regulation of the tricarboxylic acid cycle and poly-/?-hydroxybutyrate metabolism in Azotobacter beijerinckii grown under nitrogen or oxygen limitation. J. Gen. Microbiol. V. 97. P. 303-312.

59. Jendrossek D., Frisse A., Behrends A., Andermann M., Kratzin H D., Stanislawski T., Schlegel H.G. 1995. Biochemical and molecular characterization of the Pseudomonas lemoignei polyhydroxyalkanoate depolymerase system. J. Bacteriol. V. 177. P. 596-607.

60. Johnson P.A., Quayle J.R. 1964. Microbial growth on Crcompounds. Oxidation of methanol, formaldehyde and formate of methanol-grown of Pseudomonas AMI. Biochem. J. V. 93. P. 281-290.

61. Jüttner R.R., Lafferty R.M., Knackmuss H.J. 1975. A simple method for the determination of poly-y9-hydroxybutyric acid in microbial biomass. Eur. J. Appl. Micrbiol. V. 1. P. 233-237.

62. Karr D.B., Waters J.K., Emerich D.W. 1983. Analysis of poly-/¿-hydroxybutyrate in Rhizobium japonicum bacteroids by ion-exchange high-pressure liquid chromatography and UV detection. Appl. Environ. Microbiol. V. 46. P. 1339-1344.

63. Kim B.S., Lee SC., Lee S.Y., Chang H.N., Chang Y.K., Woo S.L. 1994. Production of poly(3-hydroxybutyric acid) by fed-batch culture of Alcaligenes eulrophus with glucose concentration control. Biotechnol. Bioeng. V. 43. P. 892-898.

64. Kim S.W., Kim P., Lee H.S., Kim J.H. 1996. High production of poly-/^-hydroxybutyrate (PHB) from Methylobacterium organophilum under potassium limitation. Biotechnol. Lett. V. 18. P. 25-30.

65. King P.P. 1982. Biotechnology. An industrial view. J. Chem. Tech. Biotechnol. V. 32. P. 28.

66. KuniokaM.Y., Kawaguchi Y., Doi Y. 1989. Production of biodegradable copolyesters of 3-hydroxybutyrate and 4-hydroxybutyrate by Alcaligenes eulrophus. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 30. P. 569-573.

67. Lageveen R.G., Huisman G.W., Presusting H., Ketelaar P., Eggink G, Witholt B. 1988. Formation of polyesters by Pseudomonas oleovorans: effect of substrates on formation and composition of poly-(R)-3-hydroxyalkanoates and poly-(R)-3-hydroxyalkenoates. Appl. Environ. Microbiol. V. 54. P. 2924-2932.

68. Large P.J., Peel D., Quayle J R. 1961. Microbial growth on Ci compounds. 2. Synthesis of cell constituents by methanol- and formate-grown Pseudomonas AMI, and methanol-grown Hyphomicrobium \nlgare. Biochem. J. V. 81. P. 470-479.

69. Law J.H., Slepecky R A. 1961. Assay of poly-/?-hydroxybutyric acid. J. Bacteriol. V. 82. P.

JJ-JO.

70. Lee S.Y., Yim K.S., Chang H.N., Chang Y.K. 1994. Constaiction of plasmids, estimation of plasmid stability, and use of stable plasmids for the production of poly(3-hydroxybutyric acid) by recombinant Escherichia coli. J. Biotechnol. V. 32. P. 203-211.

71. Lee S.Y., Chang H.N. 1995. Production of poly(hydroxyalkanoic acid). Adv Biochem. Eng. Biotechnol. V. 52. P. 27-58.

72. Lee Y., Kim M.K., Chang H.N., Park Y.H. 1995. Regulation of poly-/?-hydroxybutyrate biosynthesis by nicotinamide nucleotide in Alcaligenes eutrophus. FEMS. Microbil. Lett. V. 131. P. 35-39.

73. Lee S.Y. 1996. Plastic bacteria? Progress and prospects for polyhydroxyalkanoate production in bacteria. Tibtech. V. 14. P. 431-438.

74. Lee Y., Kim M.K., Park Y.H., Lee S.Y. 1996. Regulator}' effects of cellular nicotinamide nucleotides and enzyme activities on poly(3-hydroxybutyrate) synthesis in recombinant Escherichia coli. Biotechnol. Bioeng. V. 52. P. 707-712.

75. Lee S.Y., Middeiberg A.P.J, Lee Y.K. 1997. Poly(3-hydroxybutyrate) production from whey using recombinant Escherichia coli. Biotechnol. Lett. V. 19. P. 1033-1035.

76. Lefebvre G., Rocher M., Braunegg G. 1997. Effects of low dissolved-oxyden concentrations on poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) production by Alcaligenes eutrophus. Appl. Environ. Microbiol. V. 63. P. 827-833.

77. Lemoigne M. 1926. Products of dehydration and of polymerization of /?-hydroxybutyric acid. Bull. Soc. Chem. Biol. V. 8. P. 33-36.

78. Lie S., Steinbüchel A. 1996. Investigation of poly(/?-L-malic acid) production by strains of Aureobasidiumpullulans. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 46. P. 273-278,

79. Liebergesell M., Hustede E., Timm A., Steinbüchel A., Fuller R.C., Lenz R.W., Schlegel G. 1991. Formation of poly(3-hydroxya1kanoates) by phototrophic and chemolithotrophic bacteria. Arch. Microbiol. V. 155. P. 415-421.

80 Lowry O H , Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. 1951. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. V. 193. P. 265-275.

81. Lundgren D.G., Pfister R.M., Merrick J.M. 1964. Structure of poly(/*-hydroxybutyric acid) granules. J. Gen. Microbiol. V. 34. P. 441-446.

82. Marchessault R.H., Okamura K., Su C.J. 1970. Physical properties of po1y(/?-hydroxybutyrate). II. Conformation aspects in solution. Macromolecules, V. 3. P. 735-740.

83. Marison I.W., Attwood M.M. 1982. A possible alternative mechanism for the oxidation of formaldehyde to formate. J. Gen. Microbiol. V. 128, P. 1441-1446.

84. Maruyama K. 1982. Short-chain acyl-coenzyme A synthetases in Rhodopseudomonas sphaeroides. J. Biochem. V. 91. P. 725-730.

, 85. Moskowitz G.J., Merrick J.M. 1969. Metabolism of poly-/^-hydroxybutyrate. II. Enzymatic synthesis of D(-)-/?-hydroxybutyry! coenzyme A by enoyl hydratase from Rhodospirillum rubrum. Biochemistry. V. 8. P. 2748-2755.

86. Mothes G , Babel W. 1994. Methylobacterium rhodesianum MB 126 possesses two acetoacetyl-CoA reductases. Arch. Microbiol. V. 161. P. 1441-1446.

87. Mothes G., Babel W. 1995. Methylobacterium rhodesianum MB 126 possesses two stereospecific crotonyl-CoA hydratases. Can. J. Microbiol. V. 41. P. 68-72.

88. Nishimura T., Saito T., Tomita K. 1978. Purification and properties of P-ketothiolase from Zoogloeaa ramigera. Arch. Microbiol. V. 116. P. 21-27.

89. O'Brien WE., Brewer J.M., Ljungdahl LG 1973. Purification and characterisation of thermostable 5,10-methylenetetrahydrofolate dehydrogenase from Clostridium thermoaceticum. J. Biol. Chem. V. 2-18. P. 403-408.

90. Oeding V., Schlegel H.G. 1973. /WKetothiolase from Hydrogenomonas eutropha H16 and its significance in the regulation of poly-/^-hydroxybutyrate metabolism. Biochem. J. V. 134. P. 239-248.

91. Olsen I., Merrick J.M. 1968. Identification of propionate as an endogenous CO2 acceptor in Rhodospirillum rubrum and properties of purified propionyl-coenzyme A carboxylase. J Bacteriol. V. 95. P. 1774-1778.

92. Page W.J., Cornish A. 1993. Growth of Azotobacter vinelandii UWD in fish peptone medium and simplified extraction of poly-/?-hydorxybutyrate. Appl. Environ Microbiol. V. 59. P. 4236-4244.

93. Park J.S., Lee Y.H. 1996. Metabolic characteristics of isocitrate dehydrogenase leaky mutant of Alcaligenes eutrophus and its utilization of poly-/?-hydroxybutyrate production. J. Ferment. Bioeng. V. 81. P. 197-205.

94. Poirier Y., Nawrath C., Somerville C. 1995. Production of polyhydroxyalkanoates, a family of biodegradable plastics and elastomers, in bacteria and plants. Biotechnology. V. 13. P. 142150.

95. Preusting H., Kingma J., Witholt B. 1991. Physiology and polyester formation of Pseudomonas oleovorans in continuous two-liquid-phase cultures. Enzyme. Microb. Technol. V. 13. P. 770-780.

96. Preusting H., van Houten R, Hoefs A., van Langenberghe E.K., Favre-Bulle O., Witholt B. 1993a. High cell density cultivation of Pseudomonas oleovorans: growth and production of poly(3-hydroxyalkanoates) in two-liquid phase batch and fed-batch systems. Biotechnol. Bioeng. V. 41. P. 550-556.

97. Preusting H., Hazenberg W., Witholt B. 1993b. Continuous production of poly(3-hydroxyalkanoates) by Pseudomonas oleovorans in a high-cell-density, two-liquid-phase chemostat. Enzyme. Microb. Technol. V. 15. P. 311-316.

98. Pronk J.T., Linder-Beuman A., Verduyn C , Schefifers W.A., Dijken J.P. 1994 Propionate metabolism in Sacchoromyces cerevisial: implications for the metabolon hypothesis. Microbiol. V. 140. P. 717-722,

99. Quayle J.R. 1980. Aspects of regulation of methylotrophic metabolism. FEBS Lett. V. 117. P. 16-27.

100. Raemakers-Franken P.C., Korstee A.J., van der Drift C., Vogels G.D 1990. Methanogenesis involving a novel carrier of Ci compounds in Methanogenium talionis. J. Bacteriol. V. 172. P. 1157-1159.

101. Reeves H.C., Rabin R., Wegener W.S., Aje S.L. Assays of enzymes of the tricarboxilic acid and glioxylate cycles. Methods in microbiology, Norris J.R. and Ribbons W.W. (ed.) Acad. Press. V. GA.

102. Reusch R.N., SadoflfH.L. 1983. D(-)-Po1y-/?-hydroxybutyrate in membranes of genetically competent bacteria. J. Bacteriol. V. 156. P. 778-788.

103. Reusch R.N., Sadoflf H.L. 1988. Putative structure and functions of a poly-,/2-hydroxybutyrate/calcium polyphosphate channel in bacterial plasma membranes. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. V. 85. P. 4176-4180.

104. Reusch R.N. 1989. Poly-/Ahydroxybutyrate/calcium polyphosphate complexes in eukarvotic membranes. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. V. 191. P. 377-381.

105. Riis V., Mai W. 1988. Gas chromatographic determination of poly-/î-hydroxybutyric acid in microbial biomass after hydrochloric acid propanolysis. J. Chrornatogr. V. 445, P. 285-289.

106. Ritchie G.A.R., Senior P.J., Dawes E.A. 1971. The purification and characterization NADP-linked acetoacetyl-CoA reductase from Azotobacler beijerinckii. Biochem. J. V. 121. P.309-316.

107. Rodriguez-Valera F., Lillo J.A.G. 1992. Halobacteria as producers of poly-ß-hydroxyalkanoates. Internat. Symp. on Bacterial. Polyhydroxyalkanoates. ISBP - 92. FEMS Microbiol. Rev. Schlegel H.G., Steinbüchel A. (ed.) Göttingen: Goltze-Drück. V. 103. P. 181186.

108. Rodrigues M.F.A., da Silva L.F., Gomez J.G.C., Valentin H.E., Steinbüchel A. 1995. Biosynthesis of poly(3-hydroxybutyric acid co-3-hydroxy-4-pentenoic acid) from unrelated substrates by Bnrkholderia sp. Appl. Microbial. Biotechnol. V. 43. P. 880-886.

109. Saito T., Fukui T., Ikeda F., Tanaka Y., Tomita K. 1977. An NADP-linked acetoacetyl-CoA reductase from Zoogloea ramigera. Arch. Microbiol. V. 114. P. 211-217.

110. Schirmer A., Jendrossek D., Schlegel H.G. 1993. Degradation of poly(3-hydroxyoctanoic acid) [P(3HO)] by bacteria: purification and properties of a P(3HO) depolymerase from Pseudomonas fluorescens GK13 and its gene product. J.Bacteriol. V. 59. P. 1220-1227.

111. Schwörer B., Thauer R.K. 1991. Activities of formylmethanofuran dehydrogenase, methylenetetrahydromethanopterin dehydrogenase, methylenetetrahydromethanopterin reductase, and heterodisulfide reductase in methanogenic bacteria. Arch. Microbiol. V. 155. P. 459-465.

112. Senior P.J., Dawes E.A. 1973. The regulation of poly-3-hydroxybutyrate metabolism in Azotobacler beijerinckii. Biochem. J. V. 134. P. 225-238.

113. Shimada K., Matsushina K., Fukumoto J., Yamato T. 1969. Poly-L-malic acid, a new protease inhibitor from Pénicillium cyclopium. Biochem. Biophy. Res. Commun V. 35. P. 619624.

114. Shuto H., Fukui T., Saito T., Shirakura Y., Tomita K. 1981. An NAD-linked acetoacetyl-CoA reductase from Zoogloeaa ramigera I-16-M. Eur. J Biochem. V. 118. P. 53-59.

115. Steinbüchel A., Schubert P., Timm A., Pries A. 1990. Genetic analysis of the Alcaligenes eutrophus poly(hydroxyalkanoate) synthetic genes and accumulation of PHA in recombinant bacterial strains. P. 143-159. In Dawes F..A. (ed.), Novel Biodegradable Microbial Polymers. Kluwer, Dordrecht.

116. Steinbüchel A. 1991. Polyhydroxyalkanoic acids. In Biomaterials. Byrom D. (ed.) P. 123213. MacMillan Publishers. Basingstoke.

117. Steinbüchel A., Pieper U. 1991. Production of a copolyester of 3-hydroxybutyric acid and 3-hydroxyvaleric acid from single unrelated carbon sources by a mutant of Alcaligenes eutrophus. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 37. P. 1-6.

118. Steinbüchel A., Valentin HE., Schonebaum A. 1994. Application of recombinant gene technology for production of polyhydroxyalkanoic acids: biosynthesis of poly(4-hydroxybutyric acid) homopolyester. J. Environ. Polymer Degrad. V. 2. P. 67-74.

119. Steinbüchel A., Schmack G. 1995. Large-scale production of poly(3-hydroxyvaleric acid) by fermentation of Chromohacteriwn violaceum, processing, and characterization of the homopolyester. J. Environ. Polymer Degrad. V. 3. P. 243-258.

120. Steinbüchel A., Valentin H.E. 1995. Diversity of bacterial polyhydroxyalkanoic acids. FEMS Microbiol. Lett. V. 128. P. 219-228.

121. Steinbüchel A., Aerts K., Babe! W., Föllner C., Liebergesell M., Madkour M.H., Mayer F., Pieper-Fürst U., Pries A., Valentin H.E., Wieczorek R. 1995. Considerations on the structure and biochemistry of bacterial polyhydroxyalkanoic acid inclusions. Can. J. Microbiol. V. 41. P. 94-105.

122. Stuart E.S., Lenz R.W., Fuller R.C. 1995. The ordered macromolecular surface of polyester inclusion bodies in Pseudomonas oleovoram. Can. J. Microbiol. V. 41. P. 84-93.

123. Suzuki T., Yamane T., Schimizu S. 1986a. Mass production of poly-/^-hydroxybutyric acid by fed-batch culture with controlled carbon/nitrogen feeding. Appl. Microbiol. Biotechnoi. V. 24. P. 370-374.

124. Suzuki T., Yamane T., Schimizu S. 1986b. Mass production of poly-/?-hydroxybutyric acid by folly automatic fed-batch culture of methylotroph. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 23. P. 322-329.

125. Syldatk C., Lang S., Wagner R., Wray V., Witfe L. 1985. Chemical and physical characterization of four interfacial-active rhamnolipids from Pseudomonas spec. DSM 2874 grown on n-alkanes. Z. Naturforch V. 40. P. 61-67.

126. Taylor I. J., Anthony C. 1976. Acetyl-CoA production and utilixation during growth of the facultative methylotroph Pseudomonas AM! on methanol, malonate and 3-hydroxybutyrate. J. Gen. Microbiol. V. 95. P. 134-143.

127. Textor S„ Wendisch V.F., De Graaf A.A., Muller U„ Linder M I, Linder D , Buckel W. 1997. Propionate oxidation in Escherichia coli, evidence for operation of methvlcitrate cycle in bacteria. Arch. Microbiol. V. 168. P. 428-436.

128. Timm A., Byrom D., Steinbüchel A. 1990. Formation of blends of various poly(3-hydroxyalkanoic acids) by a recombinant strain of Pseudomonas oleovorans. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 33. P. 296-301.

129. Tomasi G., Scandola M., Briese B.H., Jendrossek D. 1996. Enzymatic degradation of bacterial poly(3-hydroxybutyrate) by a depolymerase from Pseudomonas iemoignei. Macromolecules. V. 29. P. 507-513.

130. Tomita L., Saito T., Fukui T. 1983. Bacterial metabolism of poly-/i-hydroxybutyrate. P. 353-366. In Lennon D.L.F., Statman F.W., and Zahlten R.N. (ed.) Biochemistry of metabolic process. Elsevier Science Publishing. Inc. New York.

131. Trotsenko Y.A., Doronina N.V., Ostafin M. 1992. PHB synthesis by methane- and methanol-utiiizing bacteria. Internat. Svmp. on Bacterial. Polyhydroxyalkanoates. fSBP - 92. FEMS Microbiol. Rev. Schlegel H.G., Steinbüchel A. (ed.) Göttingen: Goltze-Drück. V. 103. P. 393-394.

132. Ueda S., Sato K., Shimizu S. 1978. Role of vitamin Bi2 and enzymes related to methylmalonyl-CoA mytase in a methanol-utiiizing bacterium Proiaminobacier ruber. J. Nutr. Sei. Vitaminol. V. 24. P. 477-489.

133. Ueda S., Sato K., Shimizu S. 1981. Glyoxylate formation from mesaconyl-CoA and its related reactions in methanol-utiiizing bacterium, Proiaminobacier ruber. Agric. Biol. Chem. V. 45. P. 823-830.

134. Ueda S., Matsumoto S., Takagi A., Yamane T. 1992. Synthesis of poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) from methanol and n-amyi alcohol by the methyiotrophic bacteria Paracoccus denitrificans and Melhylobaclerium extorquens. Appl. Environ Microbiol. V. 58. P. 3574-3579.

135. Valentin H.E., Steinbüchel A.. 1994. Application of enzymatically synthesized short-chain-length hydroxy fatty acid coenzyme A thioesters assay of polyhydroxyalkanoic acid synthases. Appl. Microbiol. Biotechnol. V. 40. P. 699-709.

136. Valentin H E., Dennis D. 1996. Metabolic pathway for poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) formation in Nocardia corallina: inactivation of mulB by chromosomal integration of a kanamycin resistance gene. Appl. Environ Microbiol. V. 62. P. 372-379.

137. Vorholt J.A., Chistoserdova L., Lidstrom M.E., Thauer R. 1998. The NADP-dependent methylene tetrahydromethanopterin dehydrogenase in Methylokacterium extorque m AMI. J. Bacteriol. V. 180. P. 5351-5356.

138. Wallen L.L., Rohwedder W.K. 1974. Poly-/^-hydroxyalkanoate from activated siudge. Environ. Sci. Technol. V. 8. P. 576-579.

139. Wegener W.S., Reeves H.C., Rabin R., Ajl S.J. 1968. Alternate pathways of metabolism of short-chain fatty acids. Bacteriol. Rev. V. 32. P. 1-26.

140. Whiteley H.R., Huennekens F.M.' 1962. Mechanism of reaction catalyzed by the formate-activating enzyme from Micrococcus aerogenes. J. Biol. Chem. V. 237. P. 1290-1297.

141. Yamane T. 1993. Yield of poly-D(-)-3-hydroxybutyrate from various carbon sources: a theoretical study. Biotechnol. Bioeng. V. 41. P. 165-170.

142. Yamane T., Fukunaga M., Lee Y.W. 1996a. Increased PHB productivity by high-cell-density fed-batch culture of Alcaligenes latus, a growth-associated PHB producer. Biotechnol. Bioeng. V. 50. P. 197-202.

143. Yamane T., Chen X., Ueda S. 1996b. Growth-associated production of poly(3-hydroxyvalerate) from n-pentanol by a methylotrophic bacterium, Paracoccus denitnficans, Appl Environ. Microbiol. V. 62. P. 380-384.

144. Yamane T , Chen X., Ueda S. 1996c. Polyhydroxyalkanoate synthesis from alcohols during the growth of Paracoccus denitrificans. FEMS Microbiol. Lett. V. 135. P. 207-211.

145. Yoon S.C., Song J.J., Kim T.U. 1994. Isolation and characterization of Pseudomonas putida BM01 accumulating high amount of PHA,ul;!. Biodegradable plastics and polymers. In Doi Y , Fukuda K. (ed.) Elsevier Science B.V P. 400-409.

146. Zhang H., Obias V., Gonyer K., Dennis D. 1994. Production of polyhydroxyalkanoates in sucrose-utilizing recombinant Escherichia coli and Klebsiella strains. Appl. Environ. Microbiol. V. 60. P. 1198-1205.

Автор выражает искреннюю благодарность научным руководителям Троценко Ю.А. и Дорониной Н.В. за плодотворное руководство при выполнении работы.

Благодарю сотрудников лаборатории радиоактивных изотопов за постоянную товарищескую поддержку и помощь в работе.