Научные и практические аспекты товароведной оценки качества растительных белков с применением гель-хроматографии в тонком слое тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 05.18.15, кандидат наук Гурковская, Елена Александровна

• Гурковская, Елена Александровна
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Гурковская, Елена Александровна

Общая характеристика работы..................................................................8

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................18

1.1.0 гель-проникающей хроматографии......................................................18

1.1.1. Колоночная и тонкослойная гель-проникающая хроматография. Сущность метода..............................................................................................25

1.1.2. Объемные соотношения в слое геля. Эффективность гель-хроматографии. ........................................................................................................27

1.1.3. Сродство анализируемых веществ к гелю. Гидрофильные гели...............31

1.1.4. Определение молекулярной массы. Калибрование................................33

1.1.5. Тонкослойная гель-хроматография. Особенности метода...........................38

1.1.6. Технология метода. Значение природы структуры сорбента...................40

1.2. О структуре молекулы белка и понимании белковых реакций...................46

1.2.1. Конформационные и конфигурационные переходы макромолекул белков...............................................................................................47

1.2.2. Факторы, определяющие конформационную устойчивость белков. Значение термина «развертывание»......................................................................51

1.2.3. Связанная вода.............................................................................53

1.2.4. Функциональные свойства белков........................................................54

1.3. Белки и их функциональные свойства. Химический состав зерна злаковых культур...................................................................................................58

1.3.1. Структура и биохимические компоненты злаков..................................67

1.3.2. Белковые характеристики злаков. Влияние белковых компонентов на качество сырья...................................................................................69

1.3.3. Химический состав и технологические свойства злаков........................74

1.3.4. Высокомолекулярные белки пшеницы и ржи......................................78

1.3.5. Химический состав и белковые характеристики ячменей.......................83

1.3.6. Химические методы анализа биополимеров.......................................87

1.3.7. Физические и физико-химические методы.........................................92

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ....................................99

2.1. Объекты исследования....................................................................99

2.2. Методы исследования.....................................................................104

2.2.1. Определение молекулярных масс растительных белков методом

модифицированной ТСГХ....................................................................104

2.2.1.1. Методические вопросы.................................................................104

2.2.2. Методы выделения лейкозина, глобулина, проламина, глютелина.........................................................................................111

2.2.3. Аминокислотного состава............................................................114

2.2.4. Пенообразующей способности и стойкости пены..............................115

2.2.5. Эмульгирующей емкости.............................................................116

2.2.6. Водопоглотительной способности...................................................117

2.2.7. Изоэлектрической точки..............................................................117

2.2.8. Содержания витаминов...................................................................118

2.2.9. Минеральных веществ.................................................................119

2.2.10. Токсичных элементов................................................................119

2.2.11. Микробиологические показатели.................................................119

2.2.12. Реологические характеристики эмульсионных продуктов......................119

2.3. Метрологическая обработка результатов............................................121

2.3.1. Метрологические исследования на основе статистической обработки

данных эксперимента.............................................................................121

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ АНАЛИЗ.........................130

3.1. Разработка методологии определения молекулярной массы растительных белков как объективного показателя их качества..................................................130

3.2. Разработка модифицированной модели процесса ТСГХ. Массообмен и факторы, определяющие физико-химические закономерномти анализа белков с учетом диффузионно-сорбционной кинетики процесса................................134

3.2.1. Идеальная модель процесса ТСГХ..................................................134

3.2.2. Реальная модель процесса ТСГХ...................................................140

3.2.3. Некоторые особенности процесса ТСГХ..........................................141

3.2.4. Сравнение и анализ динамики процессов ТСГХ и механического ситового разделения.......................................................................................149

3.2.4.1. Сходство и различия механического и молекулярно-ситового разделения. ......................................................................................................149

3.2.4.2. Особенности молекулярно-ситового процесса.................................153

3.2.4.3. Факторы, определяющие поведение молекул в слое сорбента.............157

ГЛАВА 4. АНАЛИТИЧЕСКОЕ ОПИСАНИЕ ПРОЦЕССА ТСГХ..................163

4.1. Особенности диффузионно-сорбционной кинетики в ТСГХ....................164

4.1.1. Возможные частные случаи процесса.............................................167

4.2. Общие закономерности формирования хроматографической зоны в процессе ТСГХ...................................................................................................169

4.3. Влияние факторов процесса на формирование хроматографической зоны в

ТСГХ..............................................................................................172

4.3.1. Формирование хроматографических зон с учетом конвективного фактора в процессе ТСГХ................................................................................178

4.4. Исследование механизма формирования хроматографических зон на примере ПЭГ................................................................................................183

4.4.1. Экспериментальное определение коэффициента диффузии..................183

4.4.2. Зависимость коэффициентов диффузии от параметров процесса ТСГХ ......................................................................................................184

4.4.3. Зависимость отношений осей эллипса от диффузии и сорбции в хроматографической зоне.....................................................................189

Заключение к главе 4

197 201

ГЛАВА 5. МАССООБМЕН И ДИНАМИКА СКОРОСТНЫХ ПРОЦЕССОВ В ТСГХ..............................................................................................203

5.1. Факторы, определяющие оптимальные режимы разделения......................205

5.2. Динамика скоростных процессов.....................................................209

5.3. Вязкость и диссоциация молекул белка в процессе ТСГХ.......................216

5.3.1. Скорость потока как функция вязкости подвижной фазы.......................222

5.3.2. Особенности метода ТСГХ как гидравлической системы. Уравнение

Бернулли..........................................................................................224

Заключение к главе 5.........................................................................228

ГЛАВА 6. АНАЛИЗ РАСТИТЕЛЬНЫХ БЕЛКОВ В УСЛОВИЯХ ТСГХ.........229

6.1. Разработка методологии и алгоритма инструментального метода ТСГХ, адаптированного к товароведной оценке качества растительных белков.........229

6.2. Оценка модифицированного метода по показателям разрешающей способности, диапазону разделения низкомолекулярных и высокомолекулярных белков и относительной молекулярной массы. Оптимизация условий товароведной оценки растительных белков..............................................231

6.2.1. Анализ фракционных белков методом ТСГХ......................................235

6.2.1.1. Альбумины и глобулины пшеницы...............................................235

6.2.1.2. Лейкозины и эдестины ячменя....................................................238

6.2.1.3. ТСГХ пива и пивной пены..........................................................244

6.2.2. Наши результаты и проблема клейковины........................................245

6.2.2.1. Глиадины и глютенины пшеницы................................................248

6.2.2.2. Глиадины и глютенины ржи и ржаной муки....................................252

6.2.2.3. Проламины (зеин) и глютелины кукурузы.....................................253

6.2.2.4. Проламины (гордеин) и глютелины ячменя....................................256

6.3. Обоснование и разработка объективного товароведного критерия количественного анализа качества растительных белков..............................259

6.3.1. Количественная характеристика суммарных белков злаков..................259

6.3.2. Количественная характеристика фракционных белков пшеницы и ее разновидностей..................................................................................262

6.3.3. Количественная характеристика фракционных белков ячменя и его

разновидностей................................................................................264

ГЛАВА 7. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВОДОРАСТВОРИМОГО БЕЖА МУКИ ЗАРОДЫШЕЙ ПШЕНИЦЫ И ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ НА

ЕГО ОСНОВЕ..............................................................................................270

7.1. Изучение возможностей применения модифицированного метода ТСГХ в технологии получения лейкозина из муки зародышей пшеницы.....................271

7.1.1. Физико-химические свойства лейкозина. Молекулярная масса...............271

7.1.2. Аминокислотный состав...............................................................273

7.1.3. Пенообразующая способность и стойкость пены................................275

7.1.5. Изоэлектрическая точка................................................................275

7.1.5.1. Влияние рН среды элюента на хроматографический анализ белков .........................................................................................................276

7.1.6. Содержание витаминов.................................................................279

7.1.7. Минеральные вещества...................................................................281

7.1.8. Токсичные элементы.......................................................................281

7.1.9. Микробиологические показатели....................................................282

7.1.10. Показатели безопасности............................................................283

Заключение к главе 7..........................................................................284

ГЛАВА 8. РАЗРАБОТКИ В ОБЛАСТИ ПИЩЕВЫХ ТЕХНОЛОГИЙ С ПРИМЕНЕНИЕМ МЕТОДА ТСГХ В КАЧЕСТВЕ КОНТРОЛЯ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ БЕЛКОВЫХ ИНГРЕДИЕНТОВ.......................286

8.1. Обоснование целесообразности использования объективного товароведного показателя качества - молекулярной массы растительных белков в технологиях

пивоварения.....................................................................................286

8.1.1. Регулирование пенообразования пива с помощью лейкозина...............286

8.2. Возможность использования белков, полученных из растительного сырья с помощью модифицированного метода ТСГХ, в технологиях эмульсионных

продуктов..................................................................................................292

8.2.1. Соус ванильный сладкий...............................................................292

8.2.2. Майонез «Белковый»...................................................................297

8.3. Разработка нормативной документации с учетом нового товароведного показателя качества растительных белков и промышленная апробация

модифицированного метода и соответствущих технологий...........................302

Заключение к главе 8.............................................................................303

ЗАКЛЮЧИТЕЛЬНОЕ ОБСУЖДЕНИЕ ИТОГОВ РАБОТЫ.........................305

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ..............................................................................309

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ....................................................................313

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ..........................................342

ПРИЛОЖЕНИЕ А. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЙ (ТСГХ) МЕТОД ПРЕДЕЛЕНИЯ МОЛЕКУЛЯРНОЙ МАССЫ РАСТИТЕЛЬНЫХ БЕЛКОВ В ПИЩЕВОМ СЫРЬЕ

И ПРОДУКТАХ ПИТАНИЯ................................................................344

ПРИЛОЖЕНИЕ Б. ПАТЕНТЫ...............................................................356

ПРИЛОЖЕНИЕ В. ТУ и Акты выпуска промышленной партии продукта.......362

ПРИЛОЖЕНИЕ Г. Акты апробации........................................................371

ПРИЛОЖЕНИЕ Д. МОНОГРАФИИ......................................................375

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Научные и практические аспекты товароведной оценки качества растительных белков с применением гель-хроматографии в тонком слое»

1 Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Качество питания сегодня рассматривается как фактор национальной безопасности, поэтому определение химического состава, строения и надмолекулярной структуры сырья и продуктов питания является актуальной задачей. Решающим моментом в науке о биологических свойствах представителей зерновых является определение молекулярно-массового распределения (ММР) нативных полимеров и олигомеров. Особое место при этом занимает оценка содержания и комплексообразования белков, так как белки являются важнейшим фактором пищевой ценности продуктов питания.

Для установления этих характеристик необходимо обеспечить выделение из пробы характерного данного нативного белка, обеспечить белковую полноценность продукта в современном смысле этого понятия, и, одновременно, в специфическом, в связи с его физико-химической и механической структурой. И вопрос о качественном составе биополимеров злаков, о фракционном составе, которым обусловлены специфические белковообразующие структуры, отвечающие за качество продукции, о влиянии запасных белков на технологию переработки, является одним из основных вопросов современной аналитики в этой области, а соотношение структуры и функции белков является важнейшим вопросом биотехнологии.

Имеющиеся в данное время результаты рекомендуют более глубокие подходы к решению проблемы, но налицо еще явно недостаточное знание процессов именно на молекулярном уровне, происходящих в зерне при произрастании и технологии переработки в хлебобулочную, макаронную, крупяную и пивоваренную продукцию. Эмпирика здесь далеко опередила науку. Какие пищевкусовые свойства необходимы для конечного продукта - хорошо известно; понятно, как изменяется биохимическая сущность требований к пище в течение времени вплоть до нынешнего периода. Однако проблема анализа биополимеров в зерновом сырье и продуктах переработки показывает, что, несмотря на столетия использования в большинстве стран мира агротехники зерновых и технологий их переработки, ряд основных вопросов биохимической аналитики,

этой важнейшей сферы, связанной с питанием человека, остается недостаточно исследованным.

В настоящее время количество белковых веществ определяют по общему содержанию азота, допуская, что весь азот находится в форме белка, однако это не соответствует действительности. Наиболее трудоемким, при определении белков, представляется разделение суммарной смеси на индивидуальные белки -фракционирование. Для этого в химии белков предложен ряд методов: электрофорез и электрофоретические методы, диализ, светорассеяние, высаливание, хроматография на целлюлозных сорбентах, избирательное осаждение, скоростная седиментация. В то же время в самой аналитике биополимеров зерна явно недостаточно используется такой мощный метод исследования полимерного вещества и макромолекулярных реакций, как тонкослойная гель-хроматография (ТСГХ) или молекулярно-ситовая хроматография, предложенная в 1959 году.

В настоящее время гель-хроматография считается важнейшим и эффективнейшим способом разделения белков, т.к. отличается рядом полезных характеристик: независимость от рН, температуры, сохранение нативных состава и структуры. Метод предложен в двух вариантах - колоночном и тонкослойном. Более широко применяется первый вариант, но он имеет ряд недостатков: использование больших количеств анализируемого вещества, сравнительно дорогих материалов и длительность аналитического процесса. ТСГХ более чувствительна, требует минимального количества реагентов (граммы, микрограммы), аналитический процесс завершается в течение нескольких часов. Процедура анализа своеобразна, отличается и от техники колоночной гель-хроматографии и от техники обычной ТСХ.

В мировой литературе имеются ссылки на работы в области исследования белков злаков с использованием колоночной ГПХ. Сравнительно небольшой опыт применения ТСГХ для целей гистохимии и биохимии (иммунно-ферментный анализ) освещен в работах Г.Детермана, В. Иоханссона. В нашей стране известны работы Б. Беленького в области тонкослойной гель-хроматографией полимеров.

ТСГХ преимущественно занимались медики, что, вследствие игнорирования ими профессионального химико-аналитического подхода, ограничивало возможности всестороннего развития этого гибкого и многообещающего метода. В других отраслях метод, к сожалению, не получил достаточного развития и применения, и почти совсем не использовался в химическом зерноведении и физикохимии зерна, хотя с точки зрения информации, ТСГХ является чрезвычайно выгодным методом оценки, так как позволяет получать всесторонние исследования.

Настоящая работа посвящена актуальному вопросу хроматографического исследования белков злаков и их разновидностей в связи с проблемами их качества, технологии промышленной переработки и использованием в соответствующих отраслях пищевой промышленности.

Цель исследования заключалась в разработке научных и практических аспектов товароведной оценки качества растительного сырья на основе нового объективного товароведного показателя качества с применением модифицированного метода гель-хроматографии в тонком слое.

Для реализации поставленной цели решались следующие задачи:

- разработать методологию определения молекулярной массы растительных белков как объективного товароведного показателя их качества;

- разработать модель модифицированного процесса ТСГХ, изучить массообмен и факторы, определяющие физико-химические закономерности анализа белков с учетом особенностей диффузионно-сорбционной кинетики, структуры сорбента, угла наклона, скорости подвижной фазы (ПФ), времени эксперимента;

разработать методологию и алгоритм модифицированного метода ТСГХ, адаптированного к товароведной оценке качества растительных белков;

изучить особенности процесса ТСГХ, оценить достоинства модифицированного метода по показателям разрешающей способности, диапазону разделения низкомолекулярных и высокомолекулярных белков и относительной молекулярной массы (ММ), и оптимизировать условия товароведной оценки растительных белков;

обосновать и разработать объективный товароведный критерий количественного анализа качества растительных белков;

изучить возможность применения модифицированного метода ТСГХ в технологии получения лейкозина из муки зародышей пшеницы (МЗП);

обосновать целесообразность использования объективного товароведного показателя качества - ММ растительных белков в технологиях пивоварения;

оценить возможность использования белков, полученных из растительного сырья с помощью модифицированного метода ТСГХ, в технологиях эмульсионных продуктов;

разработать нормативную документацию с учетом разработанного нового объективного товароведного показателя качества растительных белков и провести промышленную апробацию модифицированного метода и соответствующих технологий;

Научная концепция исследования заключается в совершенствовании методологии системного подхода к товароведной оценке качества растительного сырья с применением нового интегрального показателя на базе модифицированного метода ТСГХ.

Научная новизна. На основании проведенного комплекса теоретических и экспериментальных исследований:

- предложен новый объективный товароведный показатель качества растительных белков - молекулярная масса и разработана методология определения этого показателя методом ТСГХ в модификации автора;

- разработана математическая модель процесса ТСГХ, изучен массообмен и факторы, определяющие физико-химические закономерности анализа белков в процессе ТСГХ.

- обоснованы закономерности формирования хроматографических зон (ХЗ) в процессе ТСГХ на примере полиэтиленгликолей (ПЭГ);

- выявлены особенности метода ТСГХ как гидравлической системы и установлен параметр оптимизации скоростных режимов для конкретной модели потока - угол наклона камеры;

- обоснованы условия формирования ХЗ для растительных белков в зависимости от диффузионно-сорбционной кинетики процесса и осуществлена их классификация;

- изучен механизм конформационных преобразований и установлено их влияние на фазовые переходы типа "глобула-клубок" в молекуле растительного белка при использовании модифицированного метода ТСГХ;

- разработан оригинальный методологический подход к определению состава растительных белков, который заключается в оптимизации условий анализа низкомолекулярных и высокомолекулярных фракций с применением модифицированного метода ТСГХ;

определена функциональная зависимость количественных соотношений белковых фракций в зависимости от значения рН подвижной фазы элюента и сортовых особенностей растительного сырья;

- установлены закономерности распределения белковых фракций (низко- и высокомолекулярных) по классификационному признаку в зависимости от вида сырья и его качества;

- изучена возможность применения метода ТСГХ в прикладных биотехнологиях для определения качества растительного сырья и продуктов на его основе, в частности, при производстве пива, майонеза и ванильного десерта.

Практическая значимость.

- разработан новый объективный товароведный показатель качества растительных белков - молекулярная масса, который внесен в качестве основного критерия в нормативную документацию - ТУ-9143-022-56529037-13 и может служить достоверным критерием при определении степени фальсификации растительного сырья и продуктов его переработки;

предложен оригинальный методологический подход, методика инструментального обеспечения для оценки качества белковых фракций растительного сырья на основе модифицированного автором метода ТСГХ, которая применяется в учебном процессе в виде методических указаний при подготовки

специалистов и магистров, а также в таможенной практике при определении возможной фальсификации зернопродуктов;

- установлена возможность аналитической оценки белкового и клейковинного комплексов пшениц, прогностической оценки качества зерна и муки по составу образующих ее белков, позволяющей контролировать качество и уровень фальсификации исходного сырья и конечного продукта на предприятиях пищевой промышленности (Акт апробации результатов диссертационного исследования от 16.02.2006 г. прилагается);

- разработанный модифицированный метод ТСГХ используется для анализа высокомолекулярных фракций гордеина и глютелина ячменя, определяющих качество пивоваренной продукции, взамен традиционно используемого электрофоретического метода в совокупности с колоночной ГПХ (Акт промышленной апробации от 23.11.2005 г.);

- по результатам исследований определена функциональная зависимость количества определяемых фракций в отношении рН и установлены сортовые различия в составах белковых комплексов пшениц и ячменей, что позволяет моделировать и адаптивно управлять технологическим процессом производства пива в зависимости от белкового состава, что повышает экономическую эффективность процесса пивоварения и улучшает органолептические показатели готовой продукции (Акт апробации на ОАО «Останкинский пивоваренный завод»);

- получен эффект устойчивого пенообразования и стабильности пивной пены при использовании смеси лейкозина ячменного зерна и лейкозина солода, полученных с помощью модифицированного метода ТСГХ (Патент РФ 2470992);

- разработаны рецептуры и технологии новых пищевых продуктов на основе лейкозина - белка муки зародышей пшеницы с оптимальным соотношением рецептурных компонентов: способ производства десерта в виде соуса ванильного сладкого (Заявка № 2012150239; положительное решение от 25.12.2012), выпущена опытная партия продукта (Акт апробации о выпуске ванильного десерта от 12.04.2013); майонез «Белковый» и способ его получения (Заявка № 2013118572; положительное решение от 14.06.2013), разработано ТУ-9143-022-56529037-13 на

майонез «Белковый». Разработана технологическая инструкция (ТИ) по выпуску данной партии майонеза. Согласно ТУ и ТИ осуществлено промышленное производство майонеза (Акт о выпуске промышленной партии майонеза «Белковый» от 28.08.2013 г. прилагается). Результаты промышленной апробации показали повышенную стойкость при хранении нового продукта по сравнению с майонезом «Провансаль», которая обусловлена снижением доли яичного порошка, являющегося питательной средой для развития микроорганизмов, отсутствием расслоения эмульсии, улучшением органолептических показателей и упрощением технологического процесса в целом.

- результаты теоретических и экспериментальных исследований были успешно апробированы в производственных условиях для оценки и контроля качества исходного сырья и готовой продукции, отслеживания динамики качественных показателей в процессе хранения и оптимизации технологических процессов в ОАО «Останкинский пивоваренный завод», ОАО «Истра-Хлебопродукт», ОАО «Вязьминский мелькомбинат», мельзавод № 2, мелькомбинат № 4, Комбинат питания МГТУ им. Баумана научно-производственная фирма НПКФ «ДекосТ», (Акты промышленных испытаний прилагаются).

Личный вклад соискателя. Личное участие автора являлось основополагающим на всех стадиях работы и состояло в формировании научных направлений, постановке задач и целей исследования, организации эксперимента, анализе и обработке результатов, подготовке материалов к опубликованию, проведению производственных испытаний. Личный вклад автора состоял в анализе международного опыта; выявлении проблемных вопросов и путей их решения; разработке структуры и схемы проведения исследований, организации, проведении и обобщении результатов теоретических исследований, анализе полученных экспериментальных результатов; автором разработана концепция совершенствования методологии системного подхода к товароведной оценке качества растительного сырья, применен функционально-логический подход к оценке взаимозависимостей множества факторов, объединенных единой целью - обеспечить качество исходного сырья и продуктов на основе его переработки, предложены критерии, позволяющие

контролировать степень фальсификации растительного сырья; при разработке патентных решений по оптимизации проблемных этапов качества пищевых продуктов автором определены направления научно-технических исследований и способы достижения положительных эффектов, разработан новый объективный показатель качества растительных белков - молекулярная масса, который внесен в качестве основного критерия в нормативную документацию.

Основные положения, выносимые на защиту:

методология товароведной оценки качества растительного сырья с применением нового интегрального показателя - молекулярной массы и объективного метода ТСГХ в модификации автора;

физико-химические закономерности анализа качества растительных белков с применением ТСГХ;

алгоритм химико-аналитического сопровождения концепции обеспечения товароведной оценки качества и безопасности пищевых продуктов в условиях современного производства;

- технологические решения, позволяющие моделировать и адаптивно управлять технологически процессом производства пищевых продуктов в зависимости от белкового состава используемого сырья.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на международных симпозиумах, всесоюзных, всероссийских и региональных конференциях, семинарах и школах: Всесоюзной конференции "Применение хроматографии в пищевой, микробиологической и медицинской промышленности" (Геленджик, 1990), Всесоюзной конференции по аналитической химии органических веществ (Москва, 1991), Российском семинаре "Аналитические методы контроля пищевых продуктов" (Москва, 1991), Международной конференции по хроматографии (С.-Петербург, 1992), Московском семинаре по аналитической химии (Москва, 1995), 2-ом Международном симпозиуме "Хроматография и спектроскопия в анализе объектов окружающей среды и токсикологии" - ]5С8Е "96 (С.-Петербург, 1996), Российском научно-производственном семинаре "Современное состояние теории и практическое применение метода ТСХ" (Москва, 1996), Международном

симпозиуме "Инструментальная аналитическая химия и компьютерные технологии", Incom"97 (Дюссельдорф, 1997), Всероссийской конференции молодых ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии" (Саратов, 1997), Международной научно-технической конференции "Приоритетные технологии в пищевой промышленности (Москва, 1998), Международной конференции "Будущее за новыми технологиями" (Мелеуз, 1999), 5-ой Международной научно-практической конференции "Современные проблемы в пищевой промышленности" (Москва, 1999), Российском научном семинаре "Современные проблемы планарной хроматографии " (Москва, 2000), на VIII Всероссийском симпозиуме по молекулярной жидкостной хроматографии и капиллярному электрофорезу (Москва, 2001), на Всероссийском симпозиуме "Современные проблемы хроматографии" (Москва, 2002), на VIII Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы в развитии пищевой промышленности и стандартизации пищевых продуктов" (Москва,2002), на IX Международной научно-практической конференции "Стратегия развития пищевой промышленности" (Москва, 2003), на Международном симпозиуме "100 лет хроматографии", "SBS '03", (Москва, 2003), на Всероссийском симпозиуме "Хроматография и хроматографические приборы" (Москва, 2004), на Всероссийской конференции "Аналитика России" (Москва, 2004), на Международной конференции «Физико-химические основы новейших технологий XXI века» (Москва,2005), на Международной конференции «Теоретические проблемы химии поверхности, адсорбции и хроматографии» (Москва,2006), на Всероссийском симпозиуме «Хроматография в химическом анализе и физико-химических исследованиях» (Москва, 2007), на Всероссийской конференции «Химический анализ» (Москва, 2008), на XIX Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Волгоград,2011), на III Всероссийском симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» с международным участием (Краснодар,2011), на Всероссийском симпозиуме «Кинетика обменных процессов», (Краснодар,2012), на 1-Ш Международных межвузовских конференциях «Современные методы аналитического контроля качества и безопасности продовольственного сырья и продуктов питания», (Москва, 2010-2013).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 130 научных работ, в том числе 3 монографии, 69 статей, в том числе 29 статей из списка, рекомендованного ВАК. По материалам диссертации получено три патента РФ.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения (литературный обзор), восьми глав, заключения, выводов, списка литературы (337 источников, в том числе 132 иностранных) и приложений. Работа изложена на 343 страницах основного текста, содержит 100 рисунков и 73 таблицы.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. О гель-проникающей (эксклюзионной) хроматографии

Эксклюзионный механизм разделения в жидкостной хроматографии известен около 50 лет, с тех пор как было показано, что фракционирование белков на пористых носителях при определенных условиях приводит к их элюированию из колонки в порядке уменьшения молекулярной массы (ММ) [1,3]. Не удивительно, что возможность подобного разделения макромолекул привлекла внимание исследователей как потенциальный способ определения молекулярно-массового распределения (ММР) различных полимерных объектов. Однако, отсуствие соответствующего оборудования, сорбентов, низкая эффективность препаративного фракционирования надолго задержали широкое внедрение гель-проникающй (эксклюзионной) хроматографии (ГПХ) в аналитическую практику.

В отличие от традиционных вариантов жидкостной хроматографии, эксклюзионный режим разделения предполагает полное отсутствие специфических взаимодействий анализируемого вещества с подвижной фазой (ПФ) и основан на различной способности молекул к проникновению в поры сорбента [3].

Гель-проникающей хроматографией является разновидность хроматографического метода, в котором роль неподвижной фазы играет макропористый сорбент, инертный по отношению к молекулам хроматографируемого вещества. Название метода сложилось исторически и недостаточно полно отражает его сущность. Это объясняется тем, что на первых порах (60-е годы) в качестве сорбента использовали только набухающие гели -декстрановые для разделения белков и полистирольные для анализа полимеров [1]. Они представляют собой трехмерные полимерные сетчатые структуры, внутрь которых с определенной вероятностью могут проникать различные макромолекулы. Эта вероятность зависит от соотношения размеров макромолекул и ячеек сетки, а скорость проникновения в гель определяется диффузионной подвижностью макромолекул.

Сорбенты для ГПХ должны обладать высокой стойкостью по отношению к химическим, температурным и механическим воздействиям, допускать возможность широкого варьирования своей проницаемости, иметь сравнительно однородную структуру и не вступать в адсорбционное взаимодействие с макромолекулями анализируемых веществ [2].

В общем случае сорбенты для ГПХ можно классифицировать по степени жесткости матрицы (жесткие, полужесткие и мягкие), по материалу (органические и силикатные), по характеру гранул (сферические и дробленые), по смачиваемости растворителем (гидрофильные, гидрофобные и универсальные). Анализ гидрофильных полимеров и биополимеров осуществляют на мягких и жестких гидрофильных сорбентах, таких как сефадексы, полиакриламидные и агарозные гели.

Сорбенты для ГПХ характеризуются объемом пор (Ур), качество их упаковки определяется отношением объема пор к объему между гранулами (Уо). Это отношение в значительной мере определяет эффективность разделения мкромолекул. Для мягких сорбентов Ур/Уо = 3. Поэтому для ГПХ высокого разрешения олигомеров, связанной с их разделением на гомологи, достаточной эффективностью обладают только мягкие сорбенты (декстрановые и полиакриамидные гели). Важной характеристикой хроматографического сорбента является коэффициент внутренней диффузии Э, в значительной степени ответственный за хроматографическое размывание.

Метод гель-проникающей хроматографи основан на разделении молекул по их размерам, т.е. по их различной способности проникать внутрь пористого сорбента (геля) и завоевал широкую популярность среди исследователей-аналитиков, так как является важнейшим методом исследования, фракционирования и очистки белков и других природных соединений, а также синтетических полимеров. Если рассматривать ГПХ белков, то, в первые годы, этот метод использовался главным образом для препаративных целей, а сейчас все большее внимание уделяется аналитическому применению ГПХ для определения чистоты белковых фракций, молекулярной массы, их стоксова

радиуса, изучения конформационных изменений при химической модификации для исследования ассоциации белков (кинетики и термодинамики) [4].

Возникновение метода ГПХ связывается с работой Пората и Флодина [5,6], которые в 1959 году синтезировали на основе природного полисахарида -декстрана и эпихлоргидрина новый тип гидрофильного геля под названием «сефадекс», и использовали его для разделения белков. Качественный скачок в развитии эксклюзионной хроматографии произошел после сообщения Дж. Мура [2,3] о синтезе органофильных жестких стирол-дивинилбензольных гелей, обладающих достаточной прочностью, что позволило изготавливать хроматографические колонки с высокой эфективностью. Вместе с тем, эффективность первых выпускаемых колонок, заполненных стирол-дивинилбензольными гелями (стирагелями) обеспечивала невысокую достоверность получаемых результатов и вынуждала прибегать к трудоемким процедурам коррекции хроматограмм [1].

С этих пор появились две параллельные линии развития метода ГПХ, связанные с использованием гидрофильных гелей для фракционирования и исследования биополимеров и гидрофобных гелей для фракционирования и определения молекулярно-массовой полидисперсности синтетических полимеров.

При гель-проникающей хроматографии сорбционная активность компонентов и, связанный с ней, межфазный массообмен определяются только диффузионной подвижностью макромолекул и соотношением их размеров с размерами пор. Это позволяет определять методом ГПХ размеры макромолекул, их молекулярные массы и некоторые структурные особенности, например, степень разветвленности полимеров, зависимость размеров макромолекул сополимеров от их состава и молекулярных масс, число изомеров, ассоциатов и комплексов в белковой или полимерной смеси, а также соответствующие равновесные константы изомеризации, ассоциации и комплексообразования [1].

Существует три способа классификации, касающихся разделения на пористых гелях: 1) по природе исследуемых веществ; 2) по применению в

отдельных областях химии и биологии; 3) по типу решаемых проблем, выделив основные принципы применения гель-хроматографии.

Прежде всего, гель-хроматография является методом отделения крупных молекул от мелких. Эту операцию можно сравнить с просеиванием или фильтрованием. Поэтому уместнее употреблять термин гель-фильтрация [2,6]. Однако когда речь идет о разделении близких по размерам молекул, то следует подбирать гель с такой рабочей областью, чтобы молекулярные массы всех компонентов находились в ее пределах. Естественно, что в этом случае необходимо тщательно подбирать условия эксперимента. Этот вид разделения называется гель-хроматографией. Поскольку скорость элюирования полимеров пропорциональна их молекулярным массам, можно решать обратную задачу - на основании объема выхода оценить молекулярную массу. Этот аналитический вариант гель-хроматографии нашел столь широкое применение, что его следует рассматривать отдельно под названием «определение молекулярных масс» [8]. Наконец, существует еще один вариант метода, в котором различия в молекулярных массах имеют гораздо меньшее значение, чем взаимодействие разделяемых веществ с гелем - это разделение веществ с одинаковыми молекулярными массами.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Гурковская, Елена Александровна, 2013 год

/ // af

В диссертационный сонет Д 002.246.03 При Институте физической химии РАН

Оценка содержания белка в зерновых культурах, продуктах их переработки на продовольственные цели, является очень важным показателем пищевой ценности готовой продукции.

В преддверии вступления России в ВТО, а также в связи с ростом экспорта зернового сырья, переход зерноперерабатывающих предприятий на оценку содержания белка становится все более актуальным.

Анализ зерна и муки хроматографическим методом, разработанным Гурковской Е.А., позволяет достаточно оперативно, надежно и детально определять качественный состав белков, выделяя за один анализ до 25-30 фракций, отличающихся по молекулярной массе. Данный метод научно обоснован, и, по сравнению с другими методами, является наиболее объективным современным методом, имеющим большие перспективы.

Полезность использования этого метода не вызывает сомнений. Наряду с насущной необходимостью и эффективностью подкупает его доступность: внедрение метода на зерноперерабатывающих предприятиях не требует капитальных затрат и может быть организовано за счег текущих расходов, необходимых на изготовление оборудования, на обучение персонала и приобретения необходимых реактивов.

Зак 1328

ОТКРЫТОЕ АКЦИОНЕРНОЕ ОБЩЕСТВО

'ОСГАНКИНСКИЙ

ПИВОВАРЕННЫЙ ЗАВОД'

127322 г. Москва, Огорсщныйпроезд, д20

Председателю Диссертационного совета Д 002.246.03

При институте физической химии РАН Профессору Ларионову С.Г.

Тел.: [phone] Факс: [phone] ИНН 7715024980, КПП774101001 Р/сч.40702810400000003291

в АКБ'Транскапиталбанк" г.Москва БИК 044583467 КорУсч. 30101810600000000304 ОКВД 15960КП0 00341273

На Ваш №_от

Ж // 2005г. №

Полимерный анализ компонентов зерновых культур, в тесной связи с проблемами их агротехники, технологии промышленной переработки и использованием в соответствующих отраслях пищевой промышленности является весьма актуальной задачей.

При конкретном анализе злаков, используемых в пивоваренной промышленности, методом тонкослойной эксклюзионной хроматографии, разработанным Гурьковской Е.А., выявлены оптимальные условия осуществления анализа низкомолекулярных и высокомолекулярных белков ячменя и подтверждены аналитико-методические достоинства метода.

В производственных условиях подтверждена функциональная зависимость количества определяемых фракций в отношении рН-среды, установлены сортовые различия в составах белковых комплексов ячменя и получена возможность рекомендации моделирования технологического процесса производства пива соответственно анализу его белкового состава, что повышает экономичность процесса пивоварения и улучшает органолептические показатели готовой продукции.

Данная методика может быть внедрена в практику хроматографического анализа для определения качества сырья и готовой продукции, так как отличается рядом необходимых характеристик: независимость от РН-среды, температуры, сохранения нативных состава и структуры, более экспрессна, чувствительна и экономична.

Аппаратура для данного хроматографического метода является недорогой, надежной и доступной для заводских лабораторий.

С уважением, Зам. технического ди

А.Б. Буц

I ОБЩЕСТВО ВЯЗЕМСКИИ МЕЛЬКОМБИНАТ

* | С ОГРАНИЧЕННОМ ОТВЕТСТВЕННОСТЬЮ

215119 Смоленская обл , г Вязьма, ул Элееатормая д 1

¡Тел [phone] Факс [phone]

Е-та11 г1ак67@та|1 ги

Исх. №56 от 11.01.2006года.

В диссертационный совет Д 002.246.03. При Инсппуте физической химии РАН

) , Практическая значимость хромотографического метода, предлатаемой Йурковской Е А позволяет на молекулярном уровне производить глубокий двухсторонний качественный анализ соиава зерновою сырья, используемою дчя промышленной переработки зернопререрабатывающих предприяшяч 1. Указанный метод может быть особенно эффективен при использовании сырья со

значительным разбросом характеристик сырья по качеивенным показаниям Ото особенно важно для предприятий, занимающихся выпускам продукции разнообразного ассортимента Например на комбинатах, имеющих в своей структуре мукомольные и комбикормовые цеха, предложенный метод, как показало его практическое использование, позволяет эффективно дифференцировать партии посещающею зернового 'сырья по качественным показателям с учетом и\ испопьзовяпл;. „иг производства муки и комбикормов

ПРИЛОЖЕНИЕ Д

МОНОГРАФИИ

1

М.В. ИВАНОВА, Е.В. ГРУЗИНОВ, Е.А. ГУРКОВСКАЯ

ТОВАРОВЕДНАЯ ОЦЕНКА БЕЛКОВ МУКИ ЗАРОДЫШЕЙ ПШЕНИЦЫ

УДК 664.6 И 21

И 21 Иванова М.Н., I рузипов Е.В., Гурковская Е.Л. Товароведная оценка белков муки зародышей пшеницы. -

М.: «Хлебпродипформ», 2012. - 76 с.

/¿Ж 978-5-93109-127-3

Изложены результаты исследований товароведной оценки белков муки зародышей пшеницы, и показан ряд возможностей использования белка лейкозина в качестве пищевой добавки в пищевой промышленности: для обогащения хлебобулочных изделий, в производстве мучных кондитерских изделий и соусов для общественного питания.

Брошюра может представлять интерес для студентов, обучающихся по специальностям «Товароведение и экспертиза товаров» и «Общеетаенное питание», слушателей курсов повышения квалификации и для технологов по указанным специальностям.

УДК 664.6

ISBN 978-5-93109-127-3 © Иванова М.В.. Грузинов Е В.

Гурковская Е.А., 2012 О Оформление

«Хлебпродннформ», 2012

• ■ I! ВЯВ11}; Ш Е.А. ГУРКОВСКАЯ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАСС РАСТИТЕЛЬНЫХ БЕЛКОВ

МЕТОДОМ ГЕЛЬ-ХРОМАТОГРАФИИ В ТОНКОМ СЛОЕ

■■■■■■■■■■■шнннннмшвааатмм

УДК 577.112 Г 95

Г'урковская Е.А. Определение молекулярных маес растительных белков методом гель-хроматографии в тонком слое / Под редакцией доктора хим. наук, проф. Грузинова Е.В. -М.: «Хлебпродинформ, 2011. - 194 с.

ISBN 978-5-93109-124-2

Изучены массообмен и факторы, определяющие физико-химические закономерности анализа белков в процессе ТСГХ Обоснованы закономерности формирования хроматофафических зон н процессе ТСГХ. Объяснен механизм формирования формы хроматографи-чееких зон для суммарных и фракционных белков в зависимости от диффузионно-сорбциопноМ кинетики процесса и осуществлена их классификации Показан механизм конформационных преобразований и установлено их влияние на фазовые переходы типа лобула-клубок" в молекуле белка при хроматографическом разделении.

Разработаны методики определения суммарного белковоком-плексного состава культур злаков и их разновидностей и оптимизированы условия анализа низкомолекулярных и высокомолекулярных белков. Определена функциональная зависимость количественных соотношений белковых фракций от значения рН подвижной фазы и сортовых особенностей, и установлены шкономерности белкового состава по классификационному признаку.

Для студентов высших учебных заведений, аспирантов, преподавателей, научных работников.

УДК 577.112

ISBN 978-5-93109-124-2

О Гурковская Е.А., 2011 О Оформление

«Хлебпродинформ», 2011

Е.А. ГУРКОВСКАЯ, Е.В. ГРУЗИНОВ, А.А. ПЕТРЕНКО

КОЛЕБАТЕЛЬНЫЕ ПРОЦЕССЫ И КОНФОРМАЦИЯ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ

В ТОНКОСЛОЙНОЙ ГЕЛЬ-ХРОМАТОГРАФИИ

УДК 577.31+577.322 Г 95

Гурковская Е.А., Грузинов Е.В., Петренко Л.А. Колебательные процессы и конфирмации белковых молекул в тонкослойной гель-хроматографии. - М.: «Хлебпродйнформ», 2012.-203 с.

ISBN 978-5-93109-125-9

Изложена концепция конформационных изменений молекул белка. Показано влияние энтропии на конформацию белков н тонкослойной гель-хромагографни.

Представлен механизм конформационных и конфигурационных переходов молекул белков п тонкослойной гель-хроматографии. Выявлены особенности колебательных процессов макромолекул.

Объяснен механизм синхронизации колебаний как фактор, влияющий на конформацию белковых молекул.

Для студентов высших учебных заведений, аспирантов, преподавателей, научных работников.

УДК 577.31+577.322

ISBN 978-5-93109-125-9

© Гурковская Е.А., Грузинов Е.В., Петренко А.А., 2012 © Оформление «Хлебпродйнформ»,2012