Методические основы высокоэффективных технологий разделения и очистки белков посредством лигандного обмена и использования частиц детонационных наноалмазов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.23, доктор биологических наук Бондарь, Владимир Станиславович

• Бондарь, Владимир Станиславович
• доктор биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации доктор биологических наук Бондарь, Владимир Станиславович

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЕЛКОВ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

1.1. Способы получения исходных белковых препаратов.

1.2. Методы разделения белков с помощью осаждения, общие представления.

1.3. Фракционирование белков посредством их распределения между жидкими фазами, общие принципы метода.

1.4. Разделение биомолекул с помощью ультрафильтрации, общий принцип метода.

1.5. Методы разделения белков посредством адсорбции, общие положения и типы хроматографий.

1.5.1. Адсорбенты, применяемые в хроматографии белков.

1.5.2. Методы элюции белков, адсорбированных на носителе, общие принципы.

1.6. Аффинная хроматография, общие принципы метода.

1.7. Гель-фильтрационная хроматография белков, общие принципы метода.

1.8. Электрофоретическое разделение белков, общие положения и основные методы.

1.9. Лигандообменная хроматография, общие принципы метода.

1.9.1. Применение лигандообменной хроматографии для разделения белковых молекул.

1.10. О возможности применения наноалмазов детонационного синтеза как новых сорбентов в технологиях выделения и очистки белков.

1.11. Резюме обзора литературы.

ГЛАВА 2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ГЛАВА 3. ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ МЕТОДА ЛОРБ, ПРОВЕРКА ЕГО ПРИМЕНИМОСТИ В МОДЕЛЬНЫХ ЭКСПЕРИМЕНТАХ.

3.1 Предпосылки создания метода ЛОРБ - обнаружение феномена преципитации белков под действием низких концентраций ионов двухвалентных металлов.

3.2 Сравнительный анализ действия ионов кальция и кадмия на белки в экстрактах из бактериальных клеток Е. coli.

3.3 Рассмотрение феномена преципитации белков в растворе под действием ионов двухвалентных металлов с позиций координационной и белковой химии.

3.4 Обоснование и основные положения метода ЛОРБ.

3.5 Проверка метода ЛОРБ в модельных экспериментах по разделению смеси маркерных белков.

ГЛАВА 4. МЕТОД ЛОРБ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ РЕКОМБИНАНТНЫХ СВЕТОИЗЛУЧАЮЩИХ БЕЖОВ.

4.1. Метод ЛОРБ при выделении рекомбинантного апообелина.

4.2. Выделение апоакворина и мутантов апофотопротеинов.

4.3. Применение технологии ЛОРБ для очистки рекомбинантной бактериальной люциферазы.

4.4. Обобщающая технологическая схема выделения белков, основанная на применении метода ЛОРБ.

ГЛАВА 5. ОБОСНОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ЧАСТИЦ ДЕТОНАЦИОННЫХ НАНОАЛМАЗОВ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЕЖОВ.

5.1. Физико-химические свойства наноалмазов детонационного синтеза как базовая основа возможности использования данного материала для сепарации белковых молекул.

5.2. Модельные исследования с маркерными белками: проверка адсорбции-десорбции белковых молекул на поверхности наноалмазов, определение сорбционной емкости наночастиц к белку.

ГЛАВА 6. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ДЕТОНАЦИОННЫХ НАНОАЛМАЗОВ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И ОЧИСТКИ БЕЖОВ.

6.1. Выделение рекомбинантного апообелина с помощью наноалмазов.

6.2. Применение детонационных наноалмазов для выделения рекомбинантной люциферазы.

6.3. Выделение глутатионредуктазы с использованием наноалмазов.

6.4. Применение наноалмазов для выделения лизоцима.

6.5. Механизмы взаимодействия белковых молекул с поверхностью частиц наноалмаза.

6.6. Детонационные наноалмазы - новый сорбент для колоночной хроматографии.

ГЛАВА 7. БИОТЕХНОЛОГИИ, ОСНОВАННЫЕ НА ВЗАИМОДЕЙСТВИИ БЕЛКОВЫХ МОЛЕКУЛ С ЧАСТИЦАМИ НАНОАЛМАЗОВ.

7.1 Получение композиционных материалов из наночастиц разной физической природы с применением белков как «сшивающих» агентов.

7.2. Создание систем индикации (биочипов) на основе комплекса наноалмаз-маркерный белок.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Методические основы высокоэффективных технологий разделения и очистки белков посредством лигандного обмена и использования частиц детонационных наноалмазов»

Актуальность проблемы. Значительный прогресс, достигнутый за минувшее столетие в понимании механизмов функционирования сложно организованных биологических систем, включая организм человека, был во многом предопределен успехами биологической химии. Прежде всего, этому способствовало выделение многих биологических макромолекул (белков и нуклеиновых кислот) в чистом виде, что позволило перейти к изучению их структурно-функциональной организации и свойств. Нет надобности говорить о том, насколько основательно были проработаны теоретические основы фракционирования биомолекул и как огромен арсенал технологических приемов и методов, применяемых в современной белковой химии, например, для разделения и очистки белков. Накопленные знания суммированы и подробно изложены в большом количестве монографических изданий, учебников, методических руководств, пособий и рекомендаций (например, Киркленд Д. (ред.), 1974; Нидервайзер А. и Патаки Г. (ред.), 1974; Дейл 3., Мацек К., Янак Я. (ред.), 1978; Туркова Я., 1980; Кочетов Г.А., 1980; Скоупс Р., 1985, Остерман Л.А., 1981, 1983, 1985; Даванков В.А. и соавт., 1989; Дарбре А., 1989; Руденко Б.А. (отв. ред.), 2003).

Наиболее значимые успехи в сепарации и очистке биологических макромолекул связаны с появлением хроматографии. В более широком смысле хроматографию рассматривают как один из самых распространенных и совершенных методов разделения смесей атомов, изотопов, молекул, всех типов изомерных молекул, включая и оптические изомеры, макромолекул (синтетических полимеров и биополимеров), ионов, устойчивых свободных радикалов, комплексов, ассоциатов, микрочастиц (Даванков В.А., Яшин Я.И., 2003). При этом вполне обоснованно утверждается, что по универсальности применения и эффективности с хроматографическими методами разделения сложных многокомпонентных смесей не может конкурировать ни один из известных аналитических методов. Этим объясняется столь широкое применение данного метода в самых разных сферах деятельности человека (Руденко (отв. ред.), 2003; Даванков В.А., Яшин Я.И., 2003).

В настоящее время хроматографические методы анализа используются в различных промышленных технологиях (например, химической, газовой, нефтехимической, пищевой, целлюлозно-бумажной отраслях) для поддержания оптимальных условий производства и контроля качества исходного сырья и готовой продукции. В экологии хроматография применяется для оценки и контроля загрязнений окружающей среды различными соединениями биологической и небиологической природы. Метод хроматографии применяется в геологоразведке, археологии, энергетике, криминалистике, судебной и медицинской экспертизе. С помощью хроматографических методов проводят оценку качества продуктов питания, устанавливают их пищевую ценность и допустимые сроки хранения, выявляют наличие порчи, загрязняющих и токсических веществ. В медицинской практике хроматография является мощным диагностическим методом. Скрининг биохимических маркеров (низко- и высокомолекулярных биомолекул), осуществляемый данным методом в биологических жидкостях и образцах биопсийного материала, позволяет своевременно выявлять наличие заболеваний, контролировать эффективность применяемой терапии, предсказывать прогноз в ходе выбранного лечения и своевременно устанавливать появление противопоказаний, определять возможность рецидивов заболевания. Хроматографические методы самым активным образом используются ведущими фармацевтическими фирмами. С их помощью получают важную информацию, как на этапах производства новых лекарственных препаратов, так и при изучении фармакодинамики, эффективности и селективности действия нового лечебного средства, его перераспределении между органами и тканями после введения в организм.

Широкое использование методов хроматографии в различных областях (промышленность, экология, биология, медицина, фармакология и т.д.) послужило мощным стимулом для развития хроматографического приборостроения. В этой отрасли применяются передовые достижения микроэлектроники, пневматики, теплотехники, оптики, высокоточной механики, автоматики, микропроцессорного управления и компьютерной обработки данных.

На вооружении исследователей, работающих в области биологической химии, имеется приборный парк, позволяющий решать практические задачи, связанные с выделением и очисткой биомолекул. Например, для совокупности различных методов жидкостной колоночной хроматографии, занимающих центральное место среди технологий разделения и очистки белков, разработан и производится ведущими фирмами («Bio-Rad», США; «Toyo-Soda», Япония; «Sigma», США; «Мегск» и «Serva», Германия; раньше «ЬКВ» и «Pharmacia», Швеция; в настоящее время «Amersham» и другие) широкий ассортимент соответствующего аппаратурного оснащения и сорбентов. В этих целях крупными мировыми лидерами, производящими хроматографическое и вспомогательное оборудование и сорбенты, ежегодно затрачиваются значительные финансовые ресурсы, которые исчисляются миллиардами долларов (Даванков В.А., Яшин Я.И., 2003). В последние годы отмечается успешная тенденция к миниатюризации аппаратуры, применяемой для хроматографических технологий. Портативное оборудование при сохранении эффективности более экономично в эксплуатации и становится все более популярным в исследовательских и диагностических лабораториях.

Однако, несмотря на высокий уровень технической оснащенности и обилие технологий сепарации биологических макромолекул, применяемых в современной биохимии, научный поиск новых путей и методических приемов их выделения и очистки по-прежнему продолжается. Более того, в последнее время активизировались исследования, направленные на разработку и создание новых высокоэффективных технологий выделения и очистки биомолекул для решения прикладных задач в области биологии, белковой химии, биофизики, молекулярной биологии, экологии и т.д. Об этом свидетельствует факт проведения в 2002-2003 годах 1-го и Н-го Международных Конгрессов «Биотехнология - состояние и перспективы развития» с участием специалистов из многих стран Мира.

Активизации этих процессов, во многом, способствовали успехи, достигнутые за последние 10-15 лет, в молекулярной биологии и генной инженерии. Пожалуй, с биотехнологической точки зрения, следует выделить три главных достижения. Во-первых, развитие рекомбинантных технологий, включающих клонирование и экспрессию генов в клетках-реципиентах, привело к тому, что в настоящее время можно получить штамм-продуцент практически любого белка (Ferguson Н.А., Goodrich J.A., 2001). Во-вторых, стало возможным получение не только рекомбинантных аналогов природных белков, но и белков с самыми разными заданными свойствами - мутантов (Kidokoro S., 1998). В-третьих, создание штаммов-продуцентов позволило решить серьезную проблему надежных и стабильных источников исходного сырья для наработки больших количеств изучаемых белков (Глик Б., Пастернак Д., 2002). В значительной мере решение этих вопросов с одной стороны открыло новые возможности и перспективы получения множества белков в препаративных количествах, с другой - способствовало возникновению и развитию новой ветви молекулярной биологии - протеомики.

В связи с этим, очевидно, что разработка и создание новых (адекватных разнообразию решаемых задач) высокоэффективных технологий получения чистых белков приобретает в настоящее время большую актуальность и значимость. Понятно, что при этом основные усилия исследователей направлены, прежде всего, на сокращение, упрощение и удешевление процедур выделения и очистки белковых молекул (Галаев И.Ю., 1999). Технологии, позволяющие решать задачи быстрой наработки чистых белков с минимальными затратами, не только позволят расширить арсенал известных методов белковой химии. Решение проблемы быстрого получения больших количеств чистых белков в целом будет способствовать развитию фундаментальных исследований их структурно-функциональных особенностей, а белков, обладающих маркерными свойствами, - поиску путей и возможностей расширения спектра их практического применения, например, в иммунологии, медицине и экологии (Jackson R.J. et al., 1996).

Особую значимость и ценность создание и внедрение новых экспрессных и дешевых технологий сепарации и выделения чистых бежов могут представлять для России. К сожалению, нельзя не согласиться с мнением ведущих специалистов в области хроматографии (Даванков В.А., Яшин Я.И., 2003) о том, что в настоящее время положение России в этой сфере науки и техники по сравнению с мировым уровнем не отличается от положения третьестепенной развивающейся страны. Очевидно, что с таким положением трудно мириться, поскольку неоспоримый приоритет открытия метода хроматографии принадлежит российскому ученому М.С.Цвету, а вклад отечественных ученых в теорию и техническое оснащение данного метода весьма весом. Вероятно, при дефиците финансирования и слабой развитости отечественного хроматографического приборостроения одним из рациональных путей выхода из сложившейся ситуации может являться создание новых и высокоэффективных технологий сепарации веществ, в частности, разделения и очистки биомолекул.

Представляемая диссертационная работа, выполненная на базе Института биофизики СО РАН, обобщает результаты многолетних исследований автора по созданию новых экспрессных технологий выделения высокоочищенных белковых препаратов из сложных белковых смесей. В работе формулируются и теоретически обосновываются основные положения новых разработанных технологий, основанных на принципах лигандообменных взаимодействий и применении частиц детонационных наноалмазов, существенно упрощающих, ускоряющих и удешевляющих процедуры очистки белков. Приводятся примеры их практического использования в решении конкретных биохимических задач.

Решаемая фундаментальная проблема.

Фундаментальной проблемой, которая решается в рамках предлагаемой работы, является теоретическое обоснование и последующая разработка высокоэффективных технологий разделения и очистки белковых макромолекул, позволяющих исключить из процесса специализированное хроматографическое оборудование и сорбенты и значительно упрощающих процедуры получения белков как из рекомбинантных штаммов-продуцентов, так и из природных источников.

Цель и задачи исследования.

Основная цель предлагаемого исследования формулируется как «Создание новых высокоэффективных технологий разделения и очистки белков, основанных на лигандном обмене и применении частиц детонационных наноалмазов».

Указанная цель достигается выполнением следующих задач:

1. Обосновать и сформулировать общие принципиальные положения нового метода «лигандообменное разделение белков» (ЛОРБ), основываясь на обнаруженном эффекте преципитации белковых молекул в растворе под действием ионов двухвалентных металлов, с использованием данных о физико-химических свойствах двухвалентных ионов в растворе.

2. Провести экспериментальную оценку возможности практического использования метода ЛОРБ в модельных экспериментах по разделению смеси коммерческих белковых препаратов.

3. Исследовать применимость метода ЛОРБ для выделения и очистки из биомассы бактериальных клеток Е. coli различных рекомбинантных светоизлучающих белков: a i а). Са -активируемых фотопротеинов (апообелин, апоакворин, различные мутанты этих белков), б), люциферазы морских светящихся бактерий.

4. Основываясь на результатах исследований очистки белков технологией ЛОРБ, предложить общую схему их выделения данным методом.

5. Обосновать возможность применения детонационных наноалмазов для разделения и очистки белковых молекул, основываясь на данных о физико-химических свойствах этих частиц, и провести экспериментальную проверку адсорбционных свойств данного материала на модельных белках.

6. Показать возможность применения частиц наноалмаза для экспресс выделения и очистки из сложных белковых смесей: а), биолюминесцентных белков (апообелин, люцифераза) из рекомбинантных штаммов-продуцентов Е. coli, б), ферментов из природных источников (глутатионредуктаза из печени быка, лизоцим из куриного яйца).

7. Исследовать возможные механизмы взаимодействия белковых молекул с поверхностью частиц наноалмазов, исходя из экспериментальных данных.

8. Провести проверку возможности создания индикаторных систем, основным элементом которых являются частицы наноалмаза, несущие на своей поверхности маркерные люминесцентные белки (обелин, люциферазу).

9. Показать применимость частиц наноалмаза как сорбента для колоночной хроматонграфии обычного давления.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Новая высокоэффективная технология разделения и очистки белковых молекул, получившая название «лигандообменное разделение белков» (ЛОРБ) и позволяющая исключить из процесса выделения искомого белка оборудование для колоночной хроматографии и сорбенты, что значительно упрощает сам процесс и минимизирует временные затраты на его проведение. Технология основывается на обнаруженном эффекте преципитации белков в растворе под действием ионов двухвалентных металлов за счет образования нерастворимых координационных (хелатных, межмолекулярных) комплексов металл-белок.

2. Разработанные на основе метода ЛОРБ схемы экспресс-очистки рекомбинантных мономерных белков фотопротеиновой группы (апообелин, апоакворин, различные мутанты этих белков) и рекомбинантного гетеродимерного белка люциферазы из биомассы штаммов-продуцентов бактериальных клеток Е. coli, позволяющие за 1.5-3 часа получать препараты данных белков в высокоочищенном и гомогенном состоянии с выходом 3540 % и 50-60 % соответственно.

3. Обобщающая принципиальная схема применения технологии ЛОРБ для выделения и очистки белков, основанная на анализе полученных экспериментальных данных и позволяющая определить стратегию поиска оптимальных вариантов использования данного метода с учетом индивидуальных особенностей и свойств выделяемого белка (белков).

4. Разработанные на основе применения частиц наноалмазов высокоэффективные технологии выделения и очистки рекомбинантных светоизлучающих белков (апообелин, люцифераза) из биомассы бактериальных клеток Е. coli и ферментов из природных источников (лизоцим из куриного яйца и глутатионредуктаза из печени быка). Данные технологии являются экспрессными и позволяют при наличии исходных экстрактов за 30-60 минут получать указанные белки в высокоочищенном и гомогенном состоянии с выходом от 35 до 60% без применения специализированного хроматографического оборудования.

5. Обоснования возможности применения частиц детонационных наноалмазов, как нового универсального материала, для сепарации белковых молекул, позволяющего проводить на нем разные типы хроматографического разделения. Выводы делаются на основании экспериментальных результатов выделения и очистки с помощью наноалмазов белков, принадлежащих к разным классам ферментов, и анализа возможных механизмов связывания их с поверхностью частиц наноалмаза.

6. Решение физической проблемы, связанной с невозможностью применения наноалмазов, как частиц крайне малого размера (4-6 нм), в качестве сорбента для колоночной хроматографии обычного давления. Полученный на основе только частиц наноалмаза новый материал, может использоваться как сорбент в колоночной хроматографии обычного давления, что подтверждается экспериментами по адсорбции-десорбции на данном носителе маркерного белка (цитохром С).

Научная новизна и теоретическая значимость работы.

Обнаружен эффект преципитации белковых молекул в растворе под' действием низких концентраций ионов двухвалентных металлов. Изучение данного эффекта позволило теоретически обосновать, разработать и предложить новую высокоэффективную технологию разделения и очистки белков. Предложенная технология пополняет арсенал известных методов, применяемых в биохимии для сепарации белковых молекул, и позволяет без использования хроматографического оборудования и сорбентов получать высокоочищенные и гомогенные белковые препараты при минимальных временных затратах. Полученные новые знания дополняют и расширяют представления о координационных и лигандообменных взаимодействиях ионов двухвалентных металлов с белковыми молекулами в растворе, что имеет общебиологическое значение.

Анализ имеющихся данных о физико-химических свойствах частиц детонационных наноалмазов и проведенные в работе исследования позволили обосновать, сформулировать и развить новое научное направление по изучению механизмов взаимодействия частиц наноалмазов с белковыми молекулами. Полученные новые знания не только расширяют представления о свойствах этого материала, традиционно используемого объекта в физических, физико-химических исследованиях и технических приложениях, но и открывают новую возможность его изучения и использования в различных областях биологии. Открываются перспективы применения наноалмазов в качестве сорбента при разработке новых высокоэффективных технологий выделения и очистки белков и создании сенсорных систем. Исходя из результатов исследований механизмов взаимодействия белковых молекул с поверхностью частиц наноалмаза, делается вывод о возможности применения этого материала как универсального сорбента, позволяющего проводить разные типы хроматографических процессов.

Практическая значимость работы.

С помощью метода ЛОРБ разработаны экпресс-технологии выделения и очистки мономерных и полимерных рекомбинантных светоизлучающих белков (Са -активируемые фотопротеины апообелин, апоакворин и их мутанты, а также люцифераза морских светящихся бактерий) из биомассы штаммов-продуцентов Е. coli.

Предложенная принципиальная схема выделения белков технологией ЛОРБ, позволяет выбрать стратегию поиска оптимальных вариантов применения данного метода для выделения искомого белка с сохранением его структурно-функциональной организации и свойств.

На основе применения частиц детонационных наноалмазов разработаны экспресс-технологии выделения рекомбинантных белков (апообелин, люцифераза) из штаммов-продуцентов Е. coli и ферментов (лизоцим, глутатионредуктаза) из природных источников (куриное яйцо, печень быка).

На твердой подложке получены прототипы люминесцентных сенсорных систем (биочипов), основным элементом которых являются частицы наноалмаза, несущие на своей поверхности светоизлучающие белки (обелин, люцифераза), и показана принципиальная возможность их применения в биолюминесцентном анализе.

Технологии выделения и очистки белков методом ЛОРБ и с применением частиц наноалмазов реализованы и используются на базе Института биофизики СО РАН (Красноярск).

Предложения по практическому использованию результатов работы.

Разработанные технологии разделения и очистки белковых молекул, основанные на применении метода ЛОРБ и частиц наноалмаза, отличаются от известных технологий простотой исполнения, минимумом оборудования, задействованного в технологическом процессе, и малыми временными затратами. Это позволяет предполагать возможность их широкого применения для решения прикладных задач белковой химии и протеомики, связанных с выделением и очисткой биомолекул.

Методы исследования.

Биофизические методы, основанные на регистрации биолюминесценции; спектрофотометрические методы оценки спектральных характеристик изучаемых белков и определения активности ферментов класса дегидрогеназ; биохимические методы выделения и очистки белков и изучения особенностей их структурно-функциональной организации и свойств; микробиологические методы культивирования бактериальных клеток Е. coli.

Достоверность представленных в диссертации результатов.

Достоверность результатов работы подтверждается их воспроизводимостью в серии экспериментов выделения и очистки разработанными технологиями рекомбинантных белков из клеток штаммов-продуцентов Е. coli, отличающихся разными конструкциями плазмид и обладающих разным уровнем продукции искомого белка. Технология экспресс-выделения рекомбинантного апообелина из биомассы Е. coli с помощью частиц наноалмаза и технология получения плоскостного люминесцентного биочипа с использованием обелина и наноалмазов были полностью воспроизведены и прошли экспертную оценку в независимых условиях лаборатории «Биологических и медицинских исследований» университета города Дарема (Англия). Критериями оценки воспроизводимости результатов являются данные SDS-электрофореза о качестве получаемых конечных белковых препаратов и проценты выхода искомых белков, определяемые из измерений их специфической активности. Эффективность технологии ЛОРБ и технологий, основанных на использовании частиц наноалмаза, подтверждается примерами выделения и очистки с их помощью белков, принадлежащих к разным классам ферментов, как из рекомбинантных (штаммы-продуценты бактериальных клеток Е. coli), так и природных (например, печень быка, белок куриных яиц) источников.

Апробация работы и публикации.

Основные материалы, изложенные в диссертационной работе, были представлены на Пятом Всесоюзном симпозиуме «Химия и физика белков и пептидов» (Баку, 1980); I Всесоюзной конференции «Аффинная хроматография» (Вильнюс, 1982); III Всесоюзной межуниверситетской конференции «Физико-химическая биология» (Тбилиси, 1982); III Всесоюзном симпозиуме «Молекулярная жидкостная хроматография» (Рига,

1984); V Всесоюзном симпозиуме «Инженерная энзимология» (Кобулети,

1985); 14th International Congress of Biochemistry (Prague, 1988.

Czechoslovakia); First International School on Biological Luminescence

Wroclaw, 1989. Poland); Седьмом Всесоюзном симпозиуме «Инженерная энзимология» (Москва, 1991); VII International Symposium on

Bioluminescence and Chemiluminescence (Banff, Alberta, 1993. Canada);

Bioluminescence Symposium (Westin Maui, Hawaii, 1993. USA); III

Всероссийской конференции по направлению «Генная и клеточная th инженерия» (Москва, 1993); 8 International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence: Fundamentals and Applied Aspects (Cambridge, 1994. England); 31st European Marine Biology Symposium (Saint Petersburg, 1996. Russia); 9th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence: Molecular Reporting with Photons (Woods Hole, 1996. USA); 10th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence: Perspectives for the 21st Century (Bologna, 1998. Italy); II Съезде биофизиков России (Москва, 1999); IV Съезде Белорусского Общественного Объединения Фотобиологов и Биофизиков «Молекулярно-клеточные основы функционирования биосистем» (Минск, 2000); 3-й Международной конференции «Химия высокоорганизованных веществ и научные основы нанотехнологии» (Санкт-Петербург, 2001); 12th International Symposium «Thin Films in Electronics» (Kharkov, 2001. Ukraine); HIGH-TECH-2001 (Krasnoyarsk, 2001. Russia); 11th International Symposium on Bioluminescence and Chemiluminescence (Cambridge, 2001. England); I Международном Конгрессе «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002); VI Всероссийской (международной) конференции «Физикохимия ультрадисперсных (нано-) систем» (Томск, 2002); I

Международном симпозиуме «Детонационные наноалмазы: получение, свойства и применение» (Санкт-Петербург, 2003); Всероссийской научно-технической конференции «Ультрадисперсные порошки, наноструктуры, материалы: получение, свойства, применение (третьи ставеровские чтения)» (Красноярск, 2003); International Conference on Biophotons and Biophotonics (Beijing, 2003. China); NATO advanced research workshop «Synthesis, properties and applications of ultrananocrystalline diamond» (St. Petersburg, 2004); The 9th International Conference on New Diamonds Science and Technology ICNDST-9 (Tokyo, Japan 2004); NATO advanced research workshop «Innovative superhard materials and sustainable coating» (Kyiv, Ukraine, 2004); The XII Symposium of the Russia-Japan Medical Exchange (Krasnoyarsk, 2005); The 6th Pacific Rim Conference on Ceramic and Glass Technology (Kapalua, Maui Hawaii, 2005 USA); The IV-th Moscow International Conference «Theory and Practice of Technologies of Manufacturing Composite Materials and New Metal Alloys Products» (TMCMM) (Moscow, 2005).

По материалам диссертации опубликовано 49 работ.

Проекты и гранты, в которых автор принимал участие.

Отечественные гранты: Российский Фонд Фундаментальных Исследований (№93-04-21308, №96-0448489, №99-04-48452, №05-04-48422); Красноярский Краевой Фонд Науки (№ 9F37, № 10F026C, 1F0099, 5F0029).

Международные проекты: INTAS № 97-1754; Bayer AG (Germany); Federal Ministry of Investigation and Technology (Germany) and the Russian Ministry of Science and Technology (Russia); Department of Trade and Industry (DTI, UK); National Institutes of Health (NIH, USA) (HL12186); National Institutes of Health (NIH, USA) (TW00412); Grant NA76RG0119, Project R/B-32 from the National Oceanic and Atmospheric Administration to Washington Sea Grant Program, University of

Washington (USA); EC grant ERB IC15-CT96-0103 (The Netherlands); EU contract CHGE-CT94-0061 (The Netherlands); NWO Grant 047.007.021 for Dutch-Russian research cooperation (The Netherlands).

Личный вклад автора.

Автор принимал личное участие в планировании и проведении основного комплекса исследований, результаты которых представлены в диссертационной работе. Им обнаружен эффект преципитации белковых молекул в растворе под действием низких концентраций ионов двухвалентных металлов. При его основном участии проводились эксперименты по изучению механизмов адсорбции-десорбции белковых молекул на поверхности частиц детонационных наноалмазов. С его непосредственным участием проводилось теоретическое обоснование и формулирование основных положений новых технологий выделения и очистки белков, основанных на лигандообменных взаимодействиях и применении наноалмазов. Им лично, или под его непосредственным научным и техническим руководством разрабатывались технологии выделения рекомбинантных светоизлучающих белков и белков из природных источников с помощью ионов металлов и частиц наноалмазов. Автор принимал личное участие в обработке, систематизации, анализе и интерпретации полученных результатов.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, семи глав, заключения, выводов и списка литературы. Работа изложена на 259 страницах машинописного текста, содержит 52 рисунка и 6 таблиц. Список цитируемой литературы включает 261 источник, из них 176 зарубежных.

Заключение диссертации по теме «Биотехнология», Бондарь, Владимир Станиславович

ОСНОВНЫЕ ВЫВОДЫ

1. Теоретически обоснованы и сформулированы принципиальные положения нового метода «лигандообменного разделения белков» (ЛОРБ), основанные на обнаруженном эффекте преципитации белков в растворе под действием низких (милимолярные, микромолярные) концентраций ионов двухвалентных металлов.

2. В модельных экспериментах показана принципиальная возможность применения метода ЛОРБ для разделения белковых молекул на примере разделения смеси коммерческих белков, включающих: фосфорилазу Б - 94 кДа; бычий сывороточный альбумин - 67 кДа; яичный альбумин - 43 кДа; карбоангидразу - 30 кДа; соевый ингибитор трипсина - 20,1 кДа; лактальбумин -14,4 кДа,.

3. Разработаны схемы выделения и очистки методом ЛОРБ рекомбинантных белков, различающихся структурно-функциональной организацией и физико-химическими свойствами, из биомассы бактериальных клеток Е. coli: а) - апообелина и его мутантов с заменами в молекуле белка консервативного Cysl58 на аланин и серин, а также мутанта с делецией 14 N-концевых аминокислот; б) - апоакворина и его мутантов с делецией 7, 11 и 15 N-концевых аминокислот в молекуле белка; в) - бактериальной люциферазы.

Показано, что время выделения белков данной технологией составляет не более 1,5-3 часов и из процесса очистки исключаются хроматографическое оборудование и сорбенты. Все белки получены в высокоочищенном и гомогенном виде с выходом 35-45% для апофотопротеинов и 50-60% для бактериальной люциферазы.

4. Предложена общая схема выделения и очистки белков методом ЛОРБ. Для каждого этапа схемы предложены рекомендации, позволяющие осуществить выбор стратегии и оптимальных вариантов выделения и очистки конкретного белка с учетом его структурно-функциональных особенностей.

5. Теоретически обоснована возможность применения детонационных наноалмазов для разделения и очистки белковых молекул, исходя из имеющихся данных о физико-химических характеристиках и свойствах частиц. В модельных экспериментах определена емкость данного материала, составляющая 0,3-0,5 мг белка на 1 мг веса частиц. Показана принципиальная возможность разделения белковых молекул в процессе их адсорбции-десорбции на поверхности частиц.

6. Разработаны технологии экспресс выделения и очистки с помощью частиц наноалмаза светоизлучающих рекомбинантных белков (апообелин, люцифераза) из штаммов-продуцентов Е. coli и ферментов из природных источников (грутатионредуктаза из печени быка, лизоцим из куриного яйца). Время выделения белков данной технологией составляет не более 30-60 минут, из процесса очистки исключается хроматографическое оборудование. Все белки получены в высокоочищенном и гомогенном виде с выходом от 35-40% до 45-60%.

7. Показано, что связывание белковых молекул с поверхностью частиц наноалмаза может осуществляться посредством образования ковалентных (например, -S-S-) и координационных связей, ионообменных и гидрофобных взаимодействий. Это позволяет рассматривать частицы наноалмаза как универсальный сорбент, на котором можно выполнять разные типы хроматографий.

8. Из частиц наноалмазов получен сорбент, который можно использовать в колоночной хроматографии обычного давления. Показано, что емкость сорбента по отношению к маркерному белку (цитохром С) составляет 0,2 - 0,4 мг на 1 мг носителя.

9. Созданы прототипы люминесцентных индикаторных тест-систем (биочипов), в которых основным элементом являются частицы наноалмаза, несущие на своей поверхности светоизлучающие белки (обелин, люцифераза). Показана принципиальная возможность их применения в биолюминесцентном анализе.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Работа посвящена решению проблем создания высокоэффективных технологий разделения и очистки белков, основанных на принципах координационных и лигандообменных взаимодействий ионов двухвалентных металлов с белковыми макромолекулами, а также на применении частиц детонационных наноалмазов в нетрадиционной области использования этого материала - белковой химии, основанном на способности наночастиц адсорбировать белковые макромолекулы. При этом основные усилия в экспериментальных исследованиях фокусировались на создании таких методических подходов, которые позволили бы значительно упростить и удешевить процедуры выделения искомых белков как из рекомбинантных штаммов-продуцентов, так и из природных источников. Предполагалось, что новые технологии позволят минимизировать аппаратурное оснащение, применяемое для процедур разделения и очистки белков, за счет исключения из процесса дорогостоящего специализированного хроматографического оборудования и сорбентов, а также приведут к сокращению временных затрат, необходимых для получения целевых продуктов. Несомненно, что реализация заявляемых в работе новых методов требовала как их предварительного теоретического обоснования, так и последующего изучения возможности применения в практических целях.

При обосновании целесообразности выбора такой темы диссертационной работы, оправданности основной цели научного исследования и постановки экспериментальных задач, при выполнении которых она достигалась, учитывались известные факты и обстоятельства, которые рассматриваются ниже.

Совершенно очевидно, что за минувшее столетие накоплен колоссальный опыт и знания в области разделения самых разных веществ и, в том числе, макромолекул биологического происхождения (белки, нуклеиновые кислоты) (например, Даванков В.А., Яшин Я.И., 2003; Руденко

Б.А. (отв. ред.), 2003). В свою очередь, это предопределило развитие и значительный прогресс в понимании тонких механизмов функционирования сложно организованных биологических систем, включая организм человека, поскольку этому способствовало выделение многих биологических макромолекул (белков и нуклеиновых кислот) в чистом виде, что позволило перейти к последующему изучению их структурно-функциональной организации и свойств.

Теоретические основы различных методов выделения и фракционирования биополимеров (в частности, белков) основательным образом проработаны и подробно излагаются в большом количестве монографических изданий, учебников, методических руководств, пособий и рекомендаций. И хотя арсенал технологических приемов, применяемых в современной белковой химии в этих целях, весьма широк, тем не менее, наиболее значимые успехи в сепарации и очистке биологических макромолекул, как самостоятельной области биохимии, обоснованно связывают с появлением хроматографии.

Активное внедрение этого метода в разные сферы деятельности человека объясняется тем, что по универсальности и эффективности разделения сложных многокомпонентных смесей с хроматографией не может конкурировать ни один из известных методов (Руденко Б.А. (отв. ред.), 2003; Даванков В.А., Яшин Я.И., 2003). В свою очередь, широкое применение методов хроматографии для решения практических задач в таких отраслях как промышленность, экология, биология, медицина, фармакология и т.д. стимулировало развитие приборостроения, в котором используются передовые достижения микроэлектроники, пневматики, теплотехники, оптики, высокоточной механики, автоматики, микропроцессорного управления и компьютерной обработки данных.

Известные фирмы, которые являются мировыми лидерами в этой сфере («Bio-Rad», «Sigma» и «Aldrich» (США); «Toyo-Soda» (Япония); «Мегск» и

Serva» (Германия); ранее «ЬКВ» и «Pharmacia» (Швеция), а в настоящее время «Amersham» и другие), разрабатывают и производят широкий ассортимент соответствующего аппаратурного оснащения и сорбентов, которые применяются в жидкостной колоночной хроматографии, занимающей центральное место среди технологий разделения и очистки белков (Остерман JI.A., 1985; Скоупс Р, 1985). Причем в последние годы отмечается тенденция к миниатюризации аппаратуры, применяемой для хроматографических технологий. Портативное оборудование при сохранении эффективности более экономично в эксплуатации и становится все более популярным для использования в исследовательских и диагностических лабораториях (Даванков В.А., Яшин Я.И., 2003; Руденко Б.А. (отв. ред.), 2003). Благодаря этому, на вооружении исследователей, работающих, например, в области биологической химии, имеется приборный парк, позволяющий решать практические задачи, связанные с выделением и очисткой биомолекул.

В тоже время нельзя не заметить, что, несмотря на высокий уровень технической оснащенности и обилие технологий сепарации биологических макромолекул, применяемых в современной биохимии, научный поиск новых путей и методических приемов их выделения и очистки по-прежнему продолжается и остается актуальным. Более того, в последнее время наблюдается заметная активность в этом направлении. Причем основные усилия экспериментаторов направлены на разработку и создание высокоэффективных технологий, которые позволяют упростить, удешевить и убыстрить процессы выделения и очистки биомолекул. Вполне вероятно, что такая тенденция объясняется успехами, которые были достигнуты за последние 10-15 лет в области молекулярной биотехнологии. К основным достижениям в области молекулярной биологии и генной инженерии, которые способствовали развитию биотехнологии в целом можно отнести следующие:

1. Благодаря развитию рекомбинантных технологий, включающих клонирование и экспрессию генов в клетках-реципиентах, в настоящее время стало возможным получение штаммов-продуцентов практически любого белка (Ferguson Н.А., Goodrich J.A., 2001).

2. Открылись возможности получения не только рекомбинантных аналогов природных белков, но и белков с самыми разными заданными свойствами - мутантов (Kidokoro S., 1998).

3. Разработка и создание рекомбинантных штаммов-продуцентов позволяет решать серьезные проблемы, связанные с наличием надежных и стабильных источников исходного сырья для наработки изучаемых белков в больших количествах (Глик Б., Пастернак Д., 2002).

В значительной мере решение этих вопросов с одной стороны открыло новые возможности и перспективы получения множества белков в препаративных количествах, с другой - способствовало возникновению и развитию новой ветви молекулярной биологии - протеомики. До недавнего времени такого рода работы либо сдерживались, либо были серьезно затруднены в силу того, что природные источники не могли обеспечить значительных количеств изучаемых и используемых белков.

Исходя из этого, очевидно, что разработка и создание новых (адекватных разнообразию решаемых задач) высокоэффективных технологий получения чистых белков приобретает в настоящее время большую актуальность и значимость. В тоже время, такой подход вполне оправдан еще и с экономической точки зрения, поскольку при дефиците финансирования российской науки и слабой развитости отечественного хроматографического приборостроения он является в настоящий момент одним из рациональных путей выхода из сложившейся ситуации.

Технологии, позволяющие решать задачи быстрой наработки чистых белков с минимальными затратами, не только позволят расширить арсенал известных методов белковой химии. Решение проблемы быстрого получения больших количеств чистых белков в целом будет способствовать развитию фундаментальных исследований их структурно-функциональных особенностей, а белков, обладающих маркерными свойствами, - поиску путей и возможностей расширения спектра их практического применения, например, в иммунологии, медицине и экологии (Jackson RJ. et al., 1996).

В результате исследований, проведенных при выполнении работы, были разработаны две новые экспресс-технологии, позволяющие проводить выделение и очистку целевого белка из сложных белковых смесей и пригодные для применения в области прикладной биохимии.

Создание нового метода (технологии), получившего название «лигандообменное разделение белков» (ЛОРБ), основывалось на экспериментальных данных и, прежде всего, установлении феномена преципитации белковых молекул при добавлении малых (микромолярные, милимолярные) концентраций ионов двухвалентных металлов к белковым растворам. Установленные экспериментальные факты и анализ известных данных из таких областей знаний как физическая химия ионов двухвалентных металлов в растворе, координационная химия, молекулярная биология и химия белка, позволили высказать и обосновать идею создания новой технологии разделения и очистки белковых макромолекул, основанной на принципах координационных и лигандообменных взаимодействий белок - ион двухвалентного металла в растворе.

В самом общем виде идеология нового метода может быть представлена следующим образом. Вначале искомый белок переводится в осадок за счет образования нерастворимых координационных (хелатных или межмолекулярных) комплексов с ионами двухвалентных металлов, добавляемых в исходный образец (экстракт). После этого целевой продукт селективно извлекается из преципитата посредством его лигадообменного замещения в координационном комплексе свободным лигандом.

Оба этапа (и вся технология в целом) предполагают возможность их оптимизации и модификации с учетом физико-химических особенностей строения и свойств выделяемого белка. В зависимости от решаемой задачи (выделение индивидуального белка или группы белков) осуществляется подбор экспериментальных условий (нативные или денатурирующие условия, буферная система, рН и температура среды, и т.д.). При этом используемый ион двухвалентного металла и его концентрация являются индивидуальными и в каждом конкретном случае могут быть подобраны эмпирически. Селективность экстракции и, как следствие, качество получаемого технологией ЛОРБ конечного продукта определяется выбором используемого свободного лиганда (или комбинацией нескольких лигандов), его концентрацией, рН применяемого элюента или сочетанием этих факторов.

Идея о возможности применения детонационных наноалмазов в нетрадиционной области использования этого материала, а именно, при создании новых технологий сепарации и очистки белковых макромолекул основывалась на анализе известных данных о физико-химических свойствах этих наночастиц. В этой связи следует отметить, прежде всего, размерный фактор (4-6 нм) частиц наноалмаза (первичных нанокристаллитов), обеспечивающий высокоразвитую поверхность материала (до 300 - 420 м /г), и, что особенно важно, выраженный химический полиморфизм их поверхности. Известно, что на поверхности детонационных наноалмазов обнаруживается значительное количество различных, высокоактивных с химической точки зрения, функциональных групп (гидроксильные, карбоксильные, карбонильные, эфирные и др.), присутствуют различные углеводородные фрагменты взрывчатых веществ и микропримеси металлов (Чиганова Г.А, 1994; Чиганова Г.А. и Чиганов А.С., 1999; Долматов В.Ю., 2001). Такой набор физико-химических характеристик и свойств частицы наноалмаза приобретают в процессе технологического цикла их получения, включающего синтез с использованием энергии взрыва и последующую химическую очистку от сопутствующих примесей.

Перечисленные выше свойства наноалмазов позволили рассматривать их как материал, который должен обладать превосходными адсорбционными свойствами по отношению к различным соединениям биологической (в частности, белковым макромолекулам) и небиологической природы и, следовательно, имеющий перспективы практического применения как новый адсорбент. Более того, с химической точки зрения, наличие выраженного химического полиморфизма поверхности наночастиц, содержащей широкий спектр функциональных групп, углеводородных фрагментов и микропримесей металлов, позволяло предполагать возможность разных механизмов взаимодействия с ней белковых молекул, например, координационных, ковалентных, ионообменных и гидрофобных, одновременного вовлечением в процесс связывания белка нескольких механизмов.

В свою очередь, высказанные предположения о различных механизмах связывания белков с наночастицами алмаза дали основание полагать, что данный материал может являться универсальным сорбентом, позволяющим осуществлять разные типы хроматографий, например, лигандообменную (или металл-хелатную), ковалентную, ионообменную и гидрофобную. Причем, в ходе одной процедуры разделения и очистки белков с применением наноалмазов появляется возможность проведения разных типов хроматографий. Надо заметить, что такой универсальностью не обладает ни один из известных сорбентов, применяемых в настоящее время в белковой химии и производимых ведущими зарубежными фирмами (например, Pharmacia, Amersham, Sigma и др.).

Обоснованность и правильность теоретических предпосылок, высказанных относительно возможности создания новых технологий, были подтверждены результатами предварительных исследований. В ходе выполнения модельных экспериментов с использованием коммерческих препаратов маркерных белков была продемонстрирована принципиальная возможность сепарации белковых макромолекул как с помощью метода ЛОРБ, так и с помощью наноалмазов взрывного синтеза.

Одним из основных моментов всей диссертационной работы являлось экспериментальное подтверждение применимости и эффективности разработанных методов (технологий) для решения с их помощью прикладных задач в области белковой химии, связанных с выделением и очисткой белков. Исходя из этого, практическое применение новых технологий было проиллюстрировано в работе примерами выделения разных белков как из рекомбинантных штаммов-продуцентов (бактериальные клетки Е. coli) так и из природных источников (печень быка, белок куриных яиц). Причем, при проверке выделения искомых белков новыми технологиями решались задачи максимальной сложности, а именно, получить высокоочищенные препараты целевых продуктов из сложных белковых смесей (грубых экстрактов), содержащих полный набор белков после разрушения исходной биомассы, и не подвергавшихся предварительным способам фракционирования. Такой подход представлялся вполне оправданным, поскольку давал информацию о возможностях новых методов и позволял оценить их надежность, воспроизводимость и эффективность.

Проведенные исследования показали возможность применения новых технологий в практических целях. С помощью метода ЛОРБ и технологий, основанных на использовании частиц наноалмаза, были выделены рекомбинантные светоизлучающие белки группы

Са - активируемых фотопротеинов (апообелин, апоакворин, их различные мутанты) и бактериальная люцифераза из бактериальных клеток Е. coli, а также ферменты из природных источников - глутатионредуктаза из печени быка и лизоцим из белка куриных яиц. Следует подчеркнуть, что перечисленные белки принадлежат к разным классам ферментов, имеют существенные отличия в структуре и физико-химических свойствах. Несмотря на это, применение новых технологий позволило успешно провести их очистку из сложных белковых смесей и получить целевые продукты высокого качества и с высоким выходом.

Анализ полученных в работе результатов позволяет выделить наиболее общие и важные преимущества практического применения разработанных новых технологий для выделения и очистки белков:

1. Простота и экономичность технологий. Выделение искомого белка с применением как метода ЛОРБ, так и детонационных наноалмазов проводится при минимальном аппаратурном оснащении, что существенно облегчает задачу исследователя. В обоих вариантах из процесса очистки исключается дорогостоящее специализированное хроматографическое оборудование, применяемое в колоночной хроматографии, а при использования метода ЛОРБ еще и сорбенты. Надо заметить, что в случае использования метода ЛОРБ это является принципиальным положительным отличием от общеизвестных технологий «лигандообменной хроматографии» (Helfferich F., 1961; Даванков В.А. и др., 1989) и «металло-хелат-аффинной» хроматографии (Porath J. et al., 1975),

2. Быстрота процедуры выделения. Схемы выделения и очистки белков с помощью разработанных технологий характеризуются минимумом промежуточных и подготовительных этапов, что существенно сокращает затраты времени на получение целевого продукта. Так, выделение белков технологии ЛОРБ составляет не более 1.5 - 3.0 часов, а применение наноалмазов около 30 - 60 минут. Для сравнения отметим, что выделение перечисленных выше ферментов стандартными технологиями, включающими значительное число промежуточных (подготовительных) этапов и несколько стадий колоночной хроматографии, занимает не менее 23 суток (Бондарь B.C. и соавт., 1988; Бондарь B.C. и соавт., 1992; Bondar V.S. et al., 1995; Illarionov В.А. et al., 2000).

3. Эффективность технологического процесса. Выход искомых белков, полученных как с помощью технологии ЛОРБ, так и с применением наночастиц алмаза высок и составляет от 35-45% (апообелин, апоакворин, мутанты апофотопротеинов, глутатионредуктаза) до 50-60% (люцифераза). При этом все целевые продукты по данным SDS-электрофореза были получены в высокоочищенном и гомогенном виде.

4. В случае применения для очистки частиц наноалмазов, возможность в процессе технологического цикла параллельно с выделением проводить концентрирование белка, что весьма затруднительно сделать в условиях обычной колоночной хроматографии.

В дополнение нельзя не отметить также, что анализ результатов, полученных при использовании технологии ЛОРБ в практических целях, позволил обосновать и предложить общую схему выделения и очистки белков этим методом. Предложенная схема позволяет экспериментатору осуществить выбор стратегии и поиск оптимальных вариантов технологии, исходя из особенностей строения и физико-химических свойств выделяемого белка.

В тоже время, анализ данных, полученных при исследованиях механизмов взаимодействия белковых макромолекул с поверхностью частиц наноалмазов, позволяет прогнозировать возможность применения этого материала как универсального сорбента для проведения разных типов хроматографического разделения белков.

Подводя итог исследованиям, выполненным в представленной диссертационной работе в целом, и суммируя полученные при этом экспериментальные результаты можно сделать заключение общего характера. С большой долей уверенности можно говорить о том, что созданы новые высокоэффективные технологии сепарации белков, основанные на принципах координационных и лигандообменных взаимодействий и применении наноалмазов детонационного синтеза, расширяющие арсенал известных методов, применяемых в белковой химии, и позволяющие в значительной степени интенсифицировать процессы разделения и очистки белковых макромолекул. Разработанные технологии позволяют без применения оборудования, используемого в колоночной хроматографии, и сорбентов, с минимальными затратами времени осуществлять эффективное выделение белков, имеющих существенные различия в структурно-функциональной организации и физико-химических свойствах, и получать их в высокоочищенном и гомогенном виде. Исходя из этого, есть все основания полагать возможность их широкого применения в биологической химии. Данные методы хорошо зарекомендовали себя и используются в практических целях в Институте биофизики СО РАН. Кроме того следует отметить, что технология очистки белков с помощью частиц наноалмаза в целом и, в частности, эффективное выделение с их помощью рекомбинантного апообелина из биомассы Е. coli, была полностью воспроизведена, прошла независимую экспертизу в университете города Дарема (School of Biological & Biomedical Sciences, University of Durcham) (Англия) и получила положительную высокую оценку.

Изложенные выше факты отражают практический аспект выполненной работы. В тоже время, вполне очевидно, что полученные данные могут представлять и фундаментальное значение. Например, установленный в ходе исследований феномен преципитации белков в растворе под действием низких концентраций ионов двухвалентных металлов дополняет и расширяет представления о координационных и лигандообменных взаимодействиях ион металла - белковая макромолекула, что имеет общебиологическое значение. В настоящий момент нельзя исключить, что полученные новые знания позволят взглянуть с несколько иных позиций на регуляторные механизмы функционирования сложноорганизованных биологических систем, в которых участвуют ионы двухвалентных металлов.

В тоже время, анализ имеющихся данных о физико-химических свойствах частиц детонационных наноалмазов и проведенные в работе исследования позволили обосновать, сформулировать и развить новое научное направление по изучению механизмов взаимодействия наночастиц с белковыми молекулами. При этом полученная новая информация не только расширяет представления о свойствах этого материала, традиционно используемого в физических, физико-химических исследованиях и технических приложениях, но и открывает новую возможность его изучения и использования в различных областях биологии. Обоснованность высказанного предположения уже подтверждается результатами представленной работы. В ходе ее выполнения была показана принципиальная возможность создания нового класса индикаторных тест-систем (биочипов) с использованием детонационных наноалмазов, несущих на своей поверхности маркерные, например, светоизлучающие (обелин, бактериальная люцифераза) белки. Продемонстрирована также возможность применения таких индикаторов в биолюминесцентном анализе.

В заключении целесообразно выделить и рассмотреть те перспективные направления дальнейших исследований, которые основываются на результатах выполненной работы и являются ее логическим продолжением.

Интерес представляют исследования применимости разработанных методов для последовательного выделения с их помощью нескольких целевых продуктов (белков) в ходе одного технологического цикла, что могло бы еще больше повысить их эффективность и экономичность. Как правило, в биохимических исследованиях усилия экспериментатора оправданно фокусируются на выделении и очистке одного искомого белка и под решение этой задачи разрабатывается конкретная технологическая схема. При этом остальные белковые молекулы, естественно, рассматриваются как нежелательные балластные примеси и по этой причине отбрасываются. В тоже время, с практической точки зрения это не всегда оправдано и экономично при промышленном производстве белковых препаратов. В связи с этим, разработка методических приемов, позволяющих получать за один технологический цикл несколько целевых продуктов высокого качества, представляется весьма перспективной. Анализ результатов, полученных в работе, свидетельствует в пользу потенциальной возможности адаптации метода ЛОРБ и технологий с применением наноалмазов под решение таких задач. Более того, надо заметить, что такие исследования уже начаты, а предварительные результаты модельных экспериментов вселяют надежду в перспективность данного направления.

Актуальным направлением является изучение возможностей внедрения и адаптации новых технологий в промышленное производство белковых препаратов, что также потребует дополнительных исследований. Из практической биохимии хорошо известно, что переход от аналитических и полупрепаративных вариантов выделения и очистки белка по отработанной технологической схеме к препаративному или крупномасштабному получению целевого продукта может сопровождаться снижением его качества. Как правило, это сопряжено с дополнительными исследованиями, направленными на коррекцию и адаптацию имеющейся технологии.

Нельзя не отметить, что наряду с эффективным использованием наноалмазов для очистки белков в объеме, не менее перспективным представляется применение наночастиц и как нового материала для колоночной хроматографии. Причем для задач белковой химии наиболее ценным, вероятно, будет являться создание нового класса сорбентов для хроматографии обычного давления. Принципиальная возможность этого уже показана в данной работе. Мы полагаем, что проведение в рамках данного направления исследований по модификации поверхности наночастиц различными методами (физические, химические, биологические), позволит еще больше расширить спектр возможностей этого материала в практической биохимии, например, при создании класса сорбентов селективного действия.

Не менее многообещающим направлением применения наноалмазов в биологии является разработка на их основе новых индикаторных систем регистрации (биочипов), в которых сенсорным элементом является комплекс наночастица-маркерный белок. Во многом, этому будет способствовать и продолжение исследований, направленных на развитие представлений о механизмах взаимодействия наноалмазов и белковых молекул, включая теоретический анализ и построение теоретических моделей, отражающих общие процессы физико-химических взаимодействий биомакромолекул с поверхностью наночастиц. Надо отметить, что перспективность этого направления очевидна и с позиции развивающейся в настоящее время биотехнологии в целом, и с позиции отдельной ее отрасли -нанобиотехнологии. За последние годы отмечается заметный рост интереса к поиску новых методических подходов в разработке и создании миниатюрных полифункциональных систем регистрации, пригодных для использования различных сферах биологии и медицины (например, MacBeath G., 2002; Templin M.F. et al., 2002; Warren E.N. et al., 2004; Stoll D. et al., 2005; Poetz O. et al., 2005). Изучается также возможность применения для этих целей нанометровых частиц разной физической природы и химических свойств.

В тоже время, эффект взаимодействия белков с наночастицами детонационного синтеза может быть использован и при создании сложных надмолекулярных структур (комплексов) и новых композиционных материалов, в которых белковые молекулы выполняют роль «сшивающих» агентов. Результаты исследований в этом направлении могут, вероятно, представлять не только академический интерес, но быть востребованными, например, в области физики, микроэлектроники и техники.

И, наконец, весьма интересным, многообещающим и перспективным является направление, связанное с использованием наноалмазов как нового материала медицинского назначения. Полученные в работе данные позволяют прогнозировать возможность применения наноалмазов в области медицины, например:

1) как энтеросорбента для выведения из организма или как адсорбента для удаления с поверхности, например, открытых посттравматических и ожоговых ран нежелательных и токсичных соединений белковой и небелковой природы (продукты метаболизма, токсины, тяжелые металлы, радионуклиды, ксенобиотики и т.п.);

2) в качестве носителя препаратов, применяемых в лечебных целях (например, различные лекарства, ферменты, изотопы и т.д.), и транспортера биомакромолекул и веществ, адсорбированных на частицы, через мембраны к биологическим мишеням;

3) для разработки новых аналитических тест-систем, расширяющих арсенал диагностических методов, и создания новых методических приемов, пригодных для применения в лечебной практике.

Совершенно очевидно, что более обоснованная и объективная оценка возможности (или невозможности) применения любого нового материала в медицинской практике требует предварительной и всесторонней экспериментальной проверки его воздействия на сложноорганизованные биологические системы (например, организм животных). Такого рода исследования до недавнего времени были существенно затруднены (или невозможны), поскольку наноалмазы, выпускаемые в России и за рубежом, из-за малой коллоидной стабильности в гидрозолях (водных коллоидах) быстро образуют осадки. Это не позволяет получать золи с точной концентрацией частиц, проводить их стерилизацию, хранить в замороженном виде и применять в длительных медико-биологических экспериментах. Однако недавно в ИБФ СО РАН получены модифицированные наноалмазы, которые лишены перечисленных недостатков и адаптированы для медико-биологических исследований (Бондарь B.C., Пузырь А.П., 2004).

Модифицированные наночастицы обладают рядом уникальных свойств (Puzyr А.Р. et al., 2005) и пока не имеют аналогов в мировой практике, а технологии их получения подтверждены патентами (Пузырь А.П., Бондарь B.C., 2005а, б). Благодаря появлению модифицированных наноалмазов открываются реальные возможности и перспективы проведения комплексных исследований медико-биологического характера.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Бондарь, Владимир Станиславович, 2006 год

1. Альбертсон Пер-Оке. Разделение клеточных частиц и макромолекул. М.: Мир.- 1974.-381с.

2. Арутчева А.А., Петраков А.А., Нуждин В.И., Попова Т.П. Ранняя диагностика послеоперационных нагноений при эндопротезировании тазобедренного сустава // Вестн. хирургии. 1994. - Т. 152. - С.79-82.

3. Безвершенко И.А. Аффинная хроматография. Киев: Наукова думка. -1978.- 127с.

4. Беленький Б.Г., Виленчик JI.3. Хроматография полимеров. М.: Химия.- 1978.-343с.

5. Белошапко А.Г., Букаемский А.А., Ставер A.M. Образование ультрадисперсных соединений при ударно-волновом нагружении пористого алюминия. Исследование полученных частиц // Физика горения и взрыва. -1990. Т.26. - С.93-98.9+

6. Бондарь B.C. Са -активируемый фотопротеин обелин из гидроидных полипов Obelia longissima // Дисс. канд. биол. наук. -Красноярск. 1992. - 131с.

7. Бондарь B.C. О возможной биологической функции кадмия как аналога кальция // Доклады РАН. 1997. - Т.352. С.693-694.

8. Бондарь B.C., Лихачева Л.А. Способ разделения ферментов тиол-дисульфидного обмена из печени крыс на ДЭАЭ-сефадексе. // В сб.: Вклад молодых ученых Красноярья в программу «Здоровье», Красноярск, 1982. -С.15-16.

9. Бондарь B.C., Пузырь А.П. Наноалмазы для биологических исследований // Физика твердого тела. 2004. -Т.46. - С.698-701.

10. Бондарь B.C., Высоцкий Е.С., Летунов В.Н. Получение высокоочищенной глутатионредуктазы из гидроидных полипов Obelialongissima и изучение некоторых ее физико-химических свойств // Препринт №123Б Института биофизики СО АН СССР, Красноярск. 1990. - 32с.

11. Бондарь B.C., Кузнецов П.В., Межевикин В.В. Синтез, скрининг и использование новых аффинных адсорбентов для получения высокоочищенных НАДФ(Н)-зависимых ферментов. // Препринт №63Б Института физики СО АН СССР, Красноярскю 1987. - 35с.

12. Бондарь B.C., Кузнецов П.В., Межевикин В.В. Получение высокоочищенных НАДФ(Н)-зависимых ферментов из печени крыс с использованием НАДФ-гидразидоадипоилоксипропил сефарозы // Прикладная биохимия и микробиология. 1988. - Т.24. - С.361-367.

13. Бондарь B.C., Трофимов К.П., Высоцкий Е.С. Физико-химические свойства фотопротеина из гидроидного полипа Obelia longissima // Биохимия. 1992. - Т.57. - С.1481-1490.

14. Бондарь B.C., Высоцкий Е.С., Гамалей И.А., Каулин А.Б. Использование фотопротеина из гидроида Obelia longissima для измерения внутриклеточного Са в макрофагах // Препринт №137Б Института биофизики СО АН СССР, Красноярск. 1990. - 45с.

15. Бондарь B.C., Высоцкий Е.С., Гамалей И.А., Каулин А.Б. Получение, свойства и применение кальций-чувствительного фотопротеина из гидроида Obelia longissima // Цитология. 1991а. - Т.ЗЗ. - С.57-66.

16. Бондарь B.C., Высоцкий Е.С., Заворуев В.В., Межевикин В.В., Райбекас А.А. Получение препарата бактериальной люциферазы для биолюминесцентного анализа // Прикладная биохимия и микробиология. -1988.-Т.24.-С.745-753.

17. Бондарь B.C., Высоцкий Е.С., Рожманова О.М, Воронина С.Г. Са2+-активируемый фотопротеин обелин как индикатор кальциевого транспорта в протеолипосомах, включающих мембраны Т-системы скелетных мышц // Биохимия. 19916. - Т.56. - С.806-811.

18. Бондарь B.C., Пуртов К.В., Маликова Н.П., Франк JI.A., Илларионов Б.А. О роли консервативного Cysl58 при образовании активного фотопротеинового комплекса обелина // Биохимия. 2001. - Т.66. - С. 12451251.

19. Бухарин О.В., Васильев Н.В. Лизоцим и его роль в биологии и медицине. Томск: Изд-во Томского университета. - 1974. - 208с.

20. Варламов В. П., Лопатин С. А., Рогожин С. В. Лигандообменная хроматография ферментов. I. Синтез хелатирующих сорбентов и очистка экзонуклеазы А5 от актиномицинов // Биоорг. Химия. 1984. - Т. 10. - С.927-934.

21. Галаев И.Ю. Новые методы очистки белков. Аффинная ультрафильтрация. // Биохимия. -1999. Т.64. - С.1013-1021.

22. Гительзон И.И., Родичева Э.К., Медведева С.Е. и др. Светящиеся бактерии (Кондратьева Е.Н. ред.). Новосибирск: Наука. 1984. - 277с.

23. Глик Б., Пастернак Д. Молекулярная биотехнология. М.: Мир. -2002. 590с.

24. Горшков А.И., Евреинов В.В. Критическая хроматография макромолекул / В кн.: 100 лет хроматографии (Б.А.Руденко ред.). 2003. -С.136-184.

25. Даванков В.А. Лигандообменная хроматография прорыв в области энантиоселективных технологий / В кн.: ЮОлет хроматографии (Руденко Б.А. ред.).-2003.-С.212-232.

26. Даванков В.А., Рогожин С.В. Хроматография лигандов новый метод изучения смешанных комплексов. Стереоселективные эффекты вкомплексах меди(Н) с а-аминокислотами // ДАН СССР. 1970. - Т.193. -С.94-96.

27. Даванков В. А., Яшин Я. И. Сто лет хроматографии // Вестник Российской академии наук. 2003. - Т. 73, N 7. - С. 637-646.

28. Даванков В.А., Навратил Д., Уолтон X. Лигандообменная хроматография. М.: Мир. 1989. - 294с.

29. Дарбре А. Практическая химия белка. М.: Мир. 1989. - 621с.

30. Дейл 3., Мацек К., Янак Я. Жидкостная колоночная хроматография. М.: Мир. 1978.-Т.1.-554с.

31. Дин Щред.) Аффинная хроматография: Методы. М.: Мир. 1988.278с.

32. Долматов В.Ю. Ультрадисперсные алмазы детонационного синтеза: свойства и применение // Успехи химии. 2001. - Т.70. - С.687-708.

33. Долматов В.Ю. Биологически активные ультрадисперсные алмазы детонационного синтеза // Патент Р.Ф. 2203068 МПК А61КЗЗ/44. Опубл. 04.27. 2003.

34. Дорофейчук В.Г. Определение активности лизоцима нефелометрическим методом // Лабораторное дело. 1968. - №1. - С.28-30.

35. Жуховицкий А.А., Туркельтауб Н.М. Газовая хроматография. М.: Гостоптехиздат. 1962. - 240с.

36. Илларионов Б.А., Тюлькова Н.А. Штамм бактерий Escherichia coli -продуцент бактериальной люциферазы // Патент Р.Ф. №2073714, С12 N1/21 Опубл. 02. 20.1997.

37. Илларионов Б.А., Маркова С.В., Бондарь B.C., Высоцкий Е.С., Гительзон И.И. Клонирование и экспрессия в Escherichia coli Са(++)-активируемого фотопротеина из гидроида Obelia longissima // Доклады АН СССР. 1992. - Т.326. - С.911-913.

38. Истратов В. Г., Карелин А. А., Кубышкин В. А., Мозгалин А. Г., Титова М., Значение определения хитинолитической активности лизоцима вдиагностике инфицирования перитонеального экссудата // Вестник новых медицинских технологий. 1997.- Т.4. - С.58-60.

39. Каграманова К.А., Ермольева З.В. Сравнительная характеристика методов определения активности лизоцима // Антибиотики. 1966. - №10. -С.317-319.

40. Каргер Б. Связь теории и практики в высокоскоростной жидкостной хроматографии / В кн.: Современное состояние жидкостной хроматографии (Киркленд Д. ред.). М.: Мир. 1974. - С.9-45.

41. Карелин А.А., Короткина Р.Н. Некоторые современные аспекты диагностической энзимологии с помощью органоспецифических ферментов // Вестник АМН СССР. 1984. - № 8. - С.89-94.

42. Киселев А.В., Пошкус Д.П., Яшин Я.И. Молекулярные основы адсорбционной хроматографии. М.: Химия. 1986. - 272с.

43. Киркленд Д. Современное состояние жидкостной хроматографии. М.: Мир, 1974.-325с.

44. Коликов В.М., Мчедлишвилли Б.В. Хроматография биополимеров на макропористы кремнеземах. JL: Наука. 1986. - 192с.

45. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. М.: Высшая школа. 1981. -272с.

46. Кратасюк В.А., Гительзон И.И. Использование светящихся бактерий в биолюминесцентном анализе // Успехи микробиологии. 1987. -Т.21. -С.3-30.

47. Кузнецов П.В., Бондарь B.C. Новые НАДФН-содержащие аффинные сорбенты для очистки дисульфидредуктазных ферментов. // В сб.: Пятый Всесоюзный симпозиум по химии и физике белков и пептидов. -Баку.- 1980.-С.82.

48. Лебедев Ю.Я. Теория хроматографии медленно диффундирующих веществ. Типы режимов // Журнал физической химии. 1995. - Т.69. -С.1080-1084.

49. Лебедев Ю.Я. Теория хроматографии медленно диффундирующих веществ. Хроматограммы убывающего типа // Журнал физической химии. -1997. — Т.71. — С.1877-1881.

50. Ленинджер А. Биохимия. М.: Мир. 1974. - 957с.

51. Лещенко И.Г. Активность лизоцима сыворотки крови при ранениях и тяжелой политравме // Военно-медицинский журнал. 1981. - №9. - С.61-62.

52. Майстренко В.Н., Круглов Э.А. Эколого-аналитический мониторинг диоксинов: состояние проблемы и пути решения // Экологические проблемы регионов России. № 4. М.: ВИНИТИ, 1997. С. 6176.

53. Малер Г., Кордес Ю. Основы биологической химии. М.: Мир. -1970.-567с.

54. Межевикин В.В., Заворуев В.В., Высоцкий Е.С., Родичева Э.К. Способ получения препарата бактериальной люциферазы // А.с. СССР №1035062. Опубл. в БИ №30 1983.

55. Мецлер Д.Е. Биохимия. М.: Наука. 1980. - Т1. - 407с.

56. Нидервайзер А. и Патаки Г. Новые методы анализа аминокислот, пептидов и белков. М.: Мир. 1974. - 462с.

57. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. М.: Просвещение. -1987.-815с.

58. Онучак Л. А., Даванков В.А., Кудряшов С.Ю. Расчет стандартных термодинамических функций сорбции в газожидкостной хроматографии // Журнал физической химии. 2003. - Т.77. - С. 1677-1682.

59. Остерман JI.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультрацентрифугирование. М.: Наука. 1981. -288с.

60. Остерман Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами. М.: Наука. 1983. - 304с.

61. Остерман Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот. М.: Наука. 1985.-536с.

62. Пермяков Е.А. Парвальбумин и родственные кальцийсвязывающие белки. М.: Наука. 1985. - 191с.

63. Полякова А.А., Ревельский И.А., Токарев М.И., Коган Л.О., Тальрозе В.А. Масс-спектральный анализ смесей с применением ионно-молекулярных реакций. М.: Химия. 1989. - 240с.

64. Пузырь А.П., Бондарь B.C. Способ получения наноалмазов взрывного синтеза с повышенной коллоидной устойчивостью // Патент РФ №2252192 С2, С01 В31/06, Опубл. 20.05.2005а Бюл. №14.

65. Пузырь А.П., Бондарь B.C. Способ обработки наноалмазов // Патент РФ №2258671 С2, С01 В31/06, Опубл. 20.08.20056 Бюл. №23.

66. Пузырь А.П., Бондарь B.C., Белобров П.И., Букаемский А.А. Получение комплекса наноалмаз белок - 8-оксид алюминия. // Доклады РАН. - 2000. - Т.373. - С.408-410.

67. Рогинский С.З., Яновский М.И., Берман А.Д. Основы применения хроматографии в катализе. М.: Наука. 1972. - 376с.

68. Родичева Э.К., Выдрякова Г.А., Медведева С.Е. Каталог культур светящихся бактерий. Новосибирск: Наука. 1997. - 125с.

69. Руденко Б.А. (отв. ред.). 100 лет хроматографии. М.: Наука. 2003. - 739с.

70. Самсонов Г. В., Меленевский А. Т. Сорбционные и хроматографические методы физико-химической биотехнологии. Л.: Наука. -1986.- 229с.

71. Скороход О. Р., Варрава А. Г. Комплексы тиомочевины с кадмием в сульфокатионитахКУ-2//ЖФХ.- 1972.-V.46.-P. 1708-1715.

72. Скоупс Р. Методы очистки белков. М.: Мир. 1985. - 358 с.

73. Ставер A.M., Губарева Н.В., Лямкин А.И., Петров Е.А. Ультрадисперсные алмазные порошки, полученные с использованием энергии взрыва // Физика горения и взрыва. 1984. - Т.20. - С. 100-104.

74. Степанов В.М. Молекулярная биология (Структура и функция белков). М.: Высшая школа. 1996. - 335с.

75. Тихонов А.Н., Жуховицкий А.А., Забежинский Я.Л. Поглощение газа из потока воздуха слоем зернистого материала // Журнал физической химии. 1946. - Т.20. - С.1113-1121.

76. Торчинский Ю.М. Сера в белках. М.: Наука. 1977. - 302с.

77. Тривен М. Иммобилизованные ферменты. М.: Мир. 1983. - 213с.

78. Туркова Я. Аффинная хроматография. М.: Мир. 1978. - 471с.

79. Цвет М.С. О новой категории адсорбционных явлений и о применении их к биохимическому анализу // Труды и протоколы заседаний общества естествоиспытателей Варшавского университета. Отд. биол. -1903. Т.14. С.1-20.

80. Чиганова Г.А. Исследование поверхностных свойств ультрадисперсных алмазов // Коллоидный журнал. 1994. - Т.56. - С.266-268.

81. Чиганова Г. А., Чиганов С. А. Структура и свойства ультрадисперсных алмазов детонационного синтеза // Неорганические материалы. 1999. - Т.35. - С.581-586.

82. Шпигун О. А., Золотов Ю. А. Ионная хроматография и ее применение в анализе вод. М.: Изд-во МГУ. 1991. 200с.

83. Энтелис С.Г., Евреинов В.В., Кузаев А.И. Реакционноспособные олигомеры. М.: Химия. 1985. - 304с.

84. Aigner R., Spitzy H., Frei R. W. Separation of drug substances by modern liquid chromatography on silver impregnated silica gels // J. Chromatogr. Sci. 1976. - N8. - P.381-385.

85. Affinity chromatography: Principles and methods. Pharmacia Fine Chemicals AB publications. Uppsala. - 1979. - 218p.

86. Askonas B.A. The use of organic solvents at low temperature for the separation of enzymes: Application to aqueous rabbit muscle extract // Biochem. J. 1951. V.48. - P.42-48.

87. Andrews P. The gel filtration behaviour of proteins related to their molecular weight over a wide range // Biochem. J. 1965. - V. 96. - P. 595-606.

88. Anselstetter V., Weidemann G. Separation of glutathione reductase in human serum by gradient gel electrophoresis // J. Clin. Chem. Clin. Biochem. -1979. V. 17. - P.767-769.

89. Baumann G., Chrambach A. Gram-preparative protein fractionation by isotachophoresis: Isolation of human growth hormone isohormones // Proc. Nat. Acad. Sci. 1976. - V.73. - P.732-736.

90. Bellinger J.F., Buist N.R.M. The separation of peptides from amino acids by ligand-exchange chromatography //J. Chromatogr. 1973. - V.87. - P.513-522.

91. Biveau D., Daussant J. Immunoaffinity chromatography of proteins: A gentle ant simple desorption procedure // J. Immunol. Meth. 1981. - V.41. -P. 187-392.

92. Black W. S., van Tol A., Fernando S., Horecker B. L. Isolation of a highly active fructose diphosphatase from rabbit muscle: its subunit structure and activation by monovalent cations // Arch. Biochem. Biophys. 1972. -V.151. -P.576-590.

93. Blinks J.R., Prendergast F.G., Allen D.G. Photoproteins as biological calcium indicators // Pharmacol. Rev. 1976. - V.28. - P. 1-93.

94. Blinks J.R., Wier W.G., Hess P., Prendergast F.G. Measurement of Ca2+ concentration in living cells // Prog. Biophys. Molec. Biol. 1982. - V.40. - P.l-114.

95. Bog-Hansen Т. C. Crossed immuno-affinoelectrophoresis: An analytical method to predict the result of affinity Chromatography // Anal. Biochem. 1973. -V.56.-P.480-488.

96. Bondar V.S., Sergeev A.G., Illarionov B.A., Vervoort J., Hagen W.R. Cadmium-induced luminescence of recombinant photoprotein obelin // Biochim. Biophys. Acta. 1995. - V.1231. - P.29-32.

97. Bucher D., Thomsen J., Nexo E. Amino terminal sequence of hog intrinsic factor//Сотр. Biochem. Physiol. В. 1979. -V62.-P. 175-177.

98. BuistN.R.M., O'Brien D. The separation of peptides from amino acids in urine by ligand exchange chromatography // J. Chromatogr. 1967. - V.29. -P.398-402.

99. Burgess J. Metal ions in solution. Chichester: Ellis Horwood; New York: Halsted Press. 1978. - 48 lp.

100. Burgess P., Appel S.H., Wuson C.A., Polk H.C. Detection of intraabdominal abscess by serum lysozyme estimation // Surgery. 1996. - V.l 15.- P.16-21.

101. Carlberg I., Mannervik B. Inhibition glutathione reductase by interaction of 2,4,6-trinitrobenzenesulfonate with the active-site ditiol // FEBS Lett. 1979. - V.98. - P.263-266.

102. Chaabouni A., Dellacherie E. Affinity partition of proteins in aqueous two phase systems containing polyoxyethylene glycol bound ligand and charged dextrans// J. Chromatogr.- 1979.- V. 171.-P. 135-143.

103. Chang R. Physical chemistry with application to biological systems / New York: Macmillan Publ. Co. -1981. 659p.

104. Chen Da-Ren, Wendt C.H., Pui D.Y.H. A novel approach for introducing bio-materials into cells // Journal of Nanoparticles Research. 2000. -V.2. - P.133-139.

105. Cooke N. H. C., Viavattene R. L., Ekstein R., Wong W. S., Davies G., Karger B. L. Use of metal ions for selective separations in high-performance liquid chromatography // J. Chromatogr. 1978. - V.149. - P.391-398.

106. Curling J. M. Methods of plasma protein fractionation / New York: Academic Press. 1980. -326p.

107. Davankov V. A. Review of ligand exchange chromatography / Handbook of HPLC for the Separation of Amino Acids, Peptides, and Proteins. -V. 1, Hancock W. S. (ed.). CRC Press, Boca Raton, Fla. -1984. - P.393.

108. Davankov V.A. Enantioselective ligand exchange in modern separation techniques // J. Chromatogr. A. 2003. - V.1000. -P.891-915.

109. Digman J.D., Deutscher M.P. Aminoacyl-tRNA synthetase stimulatory factors and inorganic pyrophosphatase // Biochemistry. 1979. - V.18. - P.3165-3170.

110. Dobry A., Boyer-Kawenoki F. Phase separation in polymer solution // J. Polym. Sci. 1947. - V. 2. - P. 90-100.

111. Dolmatov V.Yu., Fujimura T. Physical and chemical problems of modification of detonation nanodiamond surface properties. In: Synthesis, properties and applications of ultrananocrystalline diamond (Gruen D.M.,

112. Shenderova O.A., Vul' A.Ya. eds.) / NATO Science Series. II. Mathematics, Physics and Chemistry. 2005. - V.192. - P.217-230.

113. Dong Y.S., Liang F., Yu X.Y., Guo L.A., Chang J.H. Preparation of novel magnetic dextran affinity adsorbents and their application to purify urokinase // Se pu (Chinese journal of chromatography). 2001. - V.19. - P.21-24. Chinese.

114. Eisenbarth G. S. Review: application of monoclonal antibody techniques to biochemical research // Anal. Biochem. 1981. - V.l 11. - P. 1-16.

115. Escott G.M., Adams D.J. Chitinase activity in human serum and leukocytes // Infect. Immun. 1995. - V.63. - P.4770-4773.

116. Fagan T.F., Ohmiya Y., Blinks J.R., Inouye S., Tsuji F.I. Cloning,iexpression and sequence analysis of cDNA for the Ca -binding photoprotein, mitrocomin // FEBS Lett. 1993. - V.333. - P.301-305.

117. Fanou-Ayi L., Vijayalakshmi M. Metal-chelate affinity chromatography as a separation tool // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1983. - V. 413. - P. 300-306.

118. Fazakerley S., Best D.R. Separation of amino acids, as copper chelates, from amino acid, protein, and peptide mixtures // Anal. Biochem. 1965. - V.l2. -P.290-295.

119. Ferguson H.A., Goodrich J.A. Expression and purification of recombinant human c-Fos/c-Jun that is highly active in DNA binding and transcriptional activation in vitro. // Nucleic Acids Res. 2001. - V. 29. P. 98-105.

120. Fernandez-Lahore H.M., Geilenkirchen S., Boldt K., Nagel A., Kula M.R., Thommes J. The influence of cell adsorbent interactions on protein adsorption in expanded beds // J. Chromatogr. A. 2000 - V.873. - P. 195-208.

121. Fleming A. On a remarkable bacteriolytic element found in tissues and secretions // Proc. Roy. Soc. Ser. B. 1922. - V.93. - P.306-17.

122. Frausto da Silva J.J.R., Williams R.J.P. The biological chemistry of the elements / Oxford: Clarendon Press. 1991. - 561 p.

123. Frei R. W., Beall K., Cassidy R. M. Determination of aromatic nitrogen heterocycles in air samples by high-speed liquid chromatography // Mikrochim. Acta.-1974.-N5.-P.859-869.

124. Fujimura К., Коуата Т., Tanigawa Т., Funasaka W. Studies in ligand-exchange chromatography. IV. Separation of hydroxybenzoic and hydroxy-naphthoic acid isomers //J. Chromatogr. 1973. - V. 85. - P. 101-106.

125. Funasaka W., Fujimura K., Kuriyama S. Ligand exchange chromatography. I. Separation of phenylaminediamine isomers // Bunseki Kagaku.- 1969.-V. 18.-P. 19-24.

126. Funasaka W., Hanai Т., Fujimura K., Ando T. Nonaqueous solvent chromatography // J. Chromatogr. 1973. - V.78. - P.424-428.

127. Gaberc-Porekar V., Menart V. Perspectives of immobilized-metal affinity chromatography // J. Biochem. Biophys. Methods. 2001. - V.49. - P.335-360.

128. Ganizal G., Ascencio J.A., Gardea-Torresday J., Jose Yacaman M. Multiple twinned gold nanorods grown by bio-reduction techniques // Journal of Nanoparticles Research. 2001. - V.3. - P.475-481.

129. Gardea-Torresdey J.L., Tiemann K.J., Gamez G., Dokken K., Tehuacanero S., Jose-Yacaman M. Gold nanoparticles obtained by bio-precipitation from gold (III) solutions // Journal of Nanoparticles Research. 1999.- V.l. -P.397-404.

130. Goodman W.F., Baptist J.N. Isoelectric point electrophoresis: A new technique for protein purification // J. Chromatogr. 1979. - V.179. - P.330-332.

131. Gordon A.H. Electrophoresis and chromatography of amino acids and proteins // Ann. N. Y. Acad. Sci. 1979. - V.325. - P.94-105.

132. Gubitz G, Jellenz W, Santi W. Separation of the optical isomers of amino acids by ligand-exchange chromatography using chemically bonded phases //J. Chromatogr.- 1981.-V.203.-P.377-384.

133. Guha О. K., Janak J. Charge transfer complexes of metals in the chromatographic separation of organic compounds // J. Chromatogr. 1972. -V.68. -P.325-343.

134. Gutwein L.G., Webster T.J. Osteoblast and chondrocyte proliferation in the presence of alumina and titania nanoparticles // Journal of Nanoparticles Research. 2002. - V.4. - P.231-238.

135. Hartman A., Johansson G., Albertsson P.-A. Partition of proteins in a three-phase system // Eur. J. Biochem. 1974. - V. 46. - P. 75-81.

136. Hastings J.W., Baldwin Т.О. Nicoli M.Z. Bacterial luciferase: assay, purification and properties // Meth. Enzymol. 1978. - V.57. -P.135-153.

137. Hefti M.H., Van Vugt-Van der Toorn C.J., Vervoort J. A novel purification method for histidine-tagged proteins containing a thrombin cleavage site // Anal. Biochem. 2001. - V.295. - P. 180-185.

138. Hefti M.H., Milder F.J., Boeren S., Vervoort J., van Berkel W.J. A His-tag based immobilization method for the preparation and reconstitution of apoflavoproteins // Biochim. Biophys. Acta. 2003. - V. 1619. - P. 139-143.

139. Helfferich F. Ligand exchange. A novel separation technique // Nature. 1961.-V. 189.-P. 1001-1002.

140. Helfferich F. Ligand exchange. I. Equilibria // J. Am. Chem. Soc. -1962a.-V.84.-P.3237-3241.

141. Helfferich F. Ligand exchange. II. Separation of ligands having different coordinative valencies // J. Am. Chem. Soc. 19626. - V.84. - P.3242-3246.

142. Hemdan E.S., Zhao Y.J., Sulkowski E. Porath J. Surface topography of histidine residues: a facile probe by immobilized metal ion affinity chromatography //Proc. Natl. Acad. Sci. USA.- 1989. V.86. -P.l811-1815.

143. Hemmasi В. Ligand-exchange chromatography of amino acids on nickel-Chelex 1001 IJ Chromatogr. 1975. - V.104. - P.367-372.

144. Hemmasi В., Bayer E. Ligand exchange chromatography of amino acids on copper-, cobalt-, and zinc-Chelex 100 // J. Chromatogr. 1975. - V.109. -P.43-48.

145. Hockney R.C. Recent developments in heterologous protein production in Escherichia coli // TIBTECH. 1994. - V.12. - P.456-463.

146. Holmgren A. Pyridine-nucleotide-disulfide oxidoreductases // Experientia Suppl. 1980. -V.36. - P. 149-180.

147. Holzman T.F., Baldwin Т.О. Isolation of bacterial luciferases by affinity chromatography on 2,2-Diphenylpropylamine-Sepharose // Biochemistry. 1982. - V.21. -P.6194-6201.

148. Horejsi V. Review: Affinity electrophoresis // Anal. Biochem. 1981. -V.112.-P.1-8.

149. Horejsi V., Kocourek J. Affinity electrophoresis: Separation of phytohemagglutinins on O-glycosyl polyacrylamide gels // Meth. Enzymol. -1974. -V.34. -P.178-181.

150. Houx N. W. H., Voerman S., Jongen W. M. F. Purification and analysis of synthetic insect sex attractants by liquid chromatography on a silver-loaded resin // J. Chromatogr. 1974. - V. 96. - P. 25-32.

151. Illarionov B.A., Bondar V.S., Illarionova V.A., Vysotski E.S. Sequenceч iof the cDNA encoding the Ca -activated photoprotein obelin from the hydroid polyp Obelia longissima // Gene. 1995. - V.l53. - P.273-274.

152. Illarionov B.A., Frank L.A., Illarionova V.A., Bondar V.S., Vysotski E.S., Blinks J.R. Recombinant obelin: cloning and expression of cDNA, purification and characterization as a calcium indicator // Meth. Enzymol. 2000. -V.305. - P.223-249.

153. Inouye S., Tsuji F.I. Cloning and sequence analysis of cDNA for the Ca2+-activated photoprotein, clytin // FEBS Lett. 1993. - V.315. - P.343-346.

154. Jackson R.J., Fujihashi К., Kiyono H., McGhee J.R. Luminometry: a novel bioluminescent immunoassay enhances the quantitation of mucosal and systemic antibody responses. // J. Immunol. Methods. 1996. - V.190. - P. 189197.

155. Jacobsen D. W., Montejano Y. D., Huennekens F. M. Rapid purification of cobalamin-binding proteins using immobilized aminopropylcobalamin // Anal. Biochem. 1981. - V.113. - P. 164-171.

156. Jolles P. and Jolles J. What's new in lysozyme research? Always a model system, today as yesterday // Mol. Cell. Biochem. 1984. - V.63. - P.165-189.

157. Kidokoro S. Design of protein function by physical perturbation method // Adv. Biophys. 1998. - V. 35. -P. 121-143.

158. Kossovsky N., Gelman A., Hnatyszyn H.J., Sponsler E., Chow G.M. Conformationally stabilizing self-assembling nanostructured delivery vehicles for biochemically reactive pair // Nanostructured Materials. 1995a. - V.5. - P. 233247.

159. Kossovsky N., Gelman A., Hnatyszyn H.J., Rajguru S., Garrell R.L., Torbati S., Freitas S.S., Chow G.M. Surface-modified diamond nanoparticles as antigen delivery vehicles //Bioconjug. Chem. -19956. V.6. -P.507-511.

160. Kothari R. M. Some aspects of the fractionation of DNA on an IR-120 A13+ column. V. The effect of RNA contamination on the chromatographic profiles of DNA // J. Chromatogr. 1971. - V.57. - P.83-88.

161. Kula M. R. Extraction and purification of enzymes using aqueous 2-phase systems. In: Applied biochemistry and bioengineering (Wingard L.B.,

162. Katchalski-Katzir E. and Goldstein L., eds.) / New York: Academic Press. -1979.-V. 2.-P. 71-96.

163. Kunzru D., Frei R. W. Separation of aromatic amine isomers by high-pressure liquid chromatography on cadmium-impregnated silica gel columns // J. Chromatogr. Sci. 1974.-V. 12.-P. 191-196.

164. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 // Nature. 1970. - V.227. - P.680-685.

165. LePage J. N., Lindner W., Davies G., Seitz D. E., Karger B. L. Resolution of the optical isomers of dansyl amino acids by reversed-phase liquid chromatography with optically active metal chelae additives // Anal. Chem. 1979. - V.51. -P.433-438.

166. Levine L.D. and Ward W.W. Isolation and characterization of a photoprotein, "phialidin", and spectrally unique green-fluorescent protein from the bioluminescent jellyfish Phyalidium gregarium // Сотр. Biochem. Physiol. -1982. V.72B. - P.77-85.

167. Lindner W., LePage J. N., Davies G., Seitz D. E., Karger B. L. Reversed-phase separation of optical isomers of Dns-amino acids and peptides using chiral metal chelate additives // J. Chromatogr. 1979. - V.185. -P.323-329.

168. Liu Z.J., Vysotski E.S., Chen C.J., Rose J.P., Lee J., Wang B.C. Structure of the Ca2+-regulated photoprotein obelin at 1.7 A resolution determined directly from its sulfur substructure // Prot. Sci. 2000. - V.9. - P.2085-2093.

169. Livingstone D.M. Immunoaffmity chromatography of proteins // Meth. Enzymol. 1974.-V.34.-P.723-731.

170. Lonnerdal В., Keen C. L. Metal chelate affinity chromatography of proteins // J. Appl. Biochem. 1982. - V. 4. - P. 203-208.

171. Lopatin S.A., Varlamov P.V. A new trend toward using metal chelates in affinity chromatography of proteins (review) // Prikl. Biokhim. Mikrobiol. -1995. V.31. - P.259-266.

172. Lopatin S.A., Varlamov V.P., Davankov V.A. Ligand-exchange chromatography of proteins and enzymes // Bioorg. Khim. 1990. - V.16. -P.725-750.

173. MacBeath G. Protein microarrays and proteomics // Nat. Genet. 2002. - V.32.-P.526-532.

174. Maeda M., Tsuji A., Ganno S., Onishi Y. Fluorophotometric assay of amino acids by using automated ligand-exchange chromatography and pyridoxal-zinc(II) reagent // J. Chromatogr. 1973. - V.77. - P.434-438.

175. Maslowska J., Pietek W. The use of ligand exchange for the separation of aromatic acids on synthetic cation exchangers // Chromatographia. 1985. -V.20. -P.46-51.

176. Melander W., Horvath C. Salt effects on hydrophobic interactions in precipitation and chromatography of proteins: An interpretation of the lyotropic series // Arch. Biochem. Biophys. 1977. - V.183. - P.200-215.

177. Morin J.G. Coelenterate bioluminescence. In: Coelenterate biology. Reviews and new perspectives (Muscatine L., Lenhoff H.M. eds.) / New York: Academic Press. 1974. - P. 397-438.

178. Moroux Y., Boschetti E., Egly J. M. Preparation of metal-chelating trisacryl gels for chromatographic applications // Sci. Tools. 1985. - V. 32. - P. 1-9.

179. Morris C.J.O.R., Morris P. Molecular-sieve chromatography and electrophoresis in polyacrylamide gels //Bochem. J. 1971. - V. 124. -P.517-528.

180. Muller K.M., Arndt K.M., Bauer K., Pluckthun A. Tandem immobilized metal-ion affinity chromatography/immunoaffinity purification of His-tagged proteins evaluation of two anti-His-tag monoclonal antibodies // Anal. Biochem. - 1998.- V.259.-P.54-61.

181. Muramatsu Т., Iwanaga S.-i., Kan S. Isolation and characterization of glutathione reductase from the dark muscle of Pacific Mackerel // Bull. Jap. Soc. Sci. Fisch. 1980. - V.46. - P.757-762.

182. Nexo E. A new principle in biospecific affinity chromatography used for purification of cobalamin-binding proteins // Biochim. Biophys. Acta. 1975. - V.379. -P.189-192.

183. Nexo E. Purification of rabbit transcobalamin II by labile ligand affinity chromatography // Can. J. Physiol. Pharmacol. 1977. - V.55. - P. 923924.

184. Nexo E., Olesen H. Purification and characterization of rabbit haptocorrin // Biochim. Biophys. Acta. 1981. - V.667. - P.370-376.

185. Nikolova-Damyanova В., Momchilova S. Silver ion thin-layer chromatography of fatty acids. A survey // Journal of Liquid Chromatography & Related Technologies. 2001. - V.24. - P. 1447 - 1466.

186. Ornstein L. Disc electrophoresis. I. Background and theory // Ann. N. Y. Acad. Sci.- 1964,-V.121.-P.321-349.

187. Otto J., de Hernandez С. M., Walton H. F. Chromatography of aromatic acids on La-loaded ion-exchange resins // J. Chromatogr. 1982. - V. 247. - P. 9196.

188. Ouyang Q., Okada K. Friction properties of aluminium-based composites containing cluster diamond // J. Vac. Sci. Technol. A. 1994. - V.12. -P.2577-2580.

189. Peterson E. A., Sober H. A. Chromatography of proteins. I. Cellulose ion exchange adsorbents // J. Amer. Chem. Soc. 1956. - V.78. -P.751-755.

190. Petronio В. M., DeCaris E., Iannuzzi L. Some applications of ligand-exchange // Talanta. 1982. - V.29. - P.691-705.

191. Poetz O., Ostendorp R., Brocks В., Schwenk J.M., Stoll D., Joos Т.О., Templin M.F. Protein microarrays for antibody profiling: specificity and affinity determination on a chip // Proteomics. 2005. - V.5. - P.2402-2411.

192. Pogell B. N. Enzyme purification by selective elution with substrate from substituted cellulose columns // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1962. - V.7.-P.225-230.

193. Poison A., Potgieter G.M., Largier J.F., Mears G.E.F., Joubert F.J. The fractionation of protein mixtures by linear polymers of high molecular weight // Biochim. Biophys. Acta. 1964. - V.82. - P.463-475.

194. Porath J. Immobilized metal ion affinity chromatography // Protein Expr. Purif. 1992. - V.3. -P.263-281.

195. Porath J., Flodin P. Gel filtration: A method for desalting and group separation //Nature. 1959. - V.83. - P. 1657-1659.

196. Porath J., Carlsson J., Olsson I., Belfrage G. Metal chelate affinity chromatography a new approach to protein fractionation // Nature (London). -1975. - V.258. - P.598-599.

197. Puzyr A.P., Bondar V.S., Bukayemsky A.A., Selyutin G.E., Kargin V.F. Physical and chemical properties of modified nanodiamonds // NATO

198. Science Series. II. Mathematics, Physics and Chemistry (Gruen D.M., Shenderova O.A., Vul' A.Ya. Eds.), Springer. - 2005. - Vol. 192. - P.261-270.

199. Rabilloud T. (Ed). Proteome Research: Two Dimensional Electrophoresis and Identification Methods (Principles and Practice) / Springer. -1999.-248p.

200. Racker E. Glutathione reductase from baker's yeast and beef liver // J. Biol. Chem. 1955. - V.217. - P.855-866.

201. Robertson J. Deposition of diamond-like carbon // Phil. Trans. Roy. Soc. A. 1993a. -V.342. -P.277-286.

202. Robertson J. Deposition mechanisms for promoting sp3 bonding in diamond like carbon // Diam. Rel. Mat. 19936. - V.2. - P.984-989.

203. Scopes R. K. Purification of clycolytic enzymes by using affinity elution chromatography // Biochem. J. 1977a. - V. 161. - P.253-263.

204. Scopes R. K. Multiple enzyme purifications from muscle extracts by using affinity elution chromatographic procedures // Biochem. J. 19776. -V.161. -P.265-277.

205. Scopes R. K. Techniques for protein purification. In: Techniques in the life sciences // Elsevier North-Holland, Amsterdam. 1978. - V.B101. - P. 142.

206. Scopes R. K. Quantitative studies of ion-exchange and affinity elution chromatography of enzymes // Anal. Biochem. 1981. - V. 114. - P.8-18.

207. Schwinghamer E.A. A method for improved lysis of some gram-negative bacteria//FEMS Microbiol. Lett. 1980. - V.7. - P. 157-162.

208. Service R.F. Nanomaterials show sins of toxity // Science. 2003. -V.300. - P.243.

209. Shahwan G. J., Jezorek J. R. Liquid chromatography of phenols on an 8-quinolinol silica gel-iron(III) stationary phase // J. Chromatogr. 1983. - V.256. -P. 9-44.

210. Sharma S., Agarwal G.P. Interactions of proteins with immobilized metal ions: a comparative analysis using various isotherm models // Anal. Biochem. 2001. - V.288. - P. 126-140.

211. Shimomura K., Walton H. F. Thin-layer chromatography of amines by ligand exchange // Sep. Sci. 1968. - V. 3. - P. 493-496.

212. Shimomura 0., Johnson F.H. Structure of the light-emitting moiety of aequorin // Biochemistry. 1972. - V.l 1. - P. 1602-1608.

213. Shimomura O., Johnson F.H., Saiga Y. Extraction, purification and properties of aequorin, a bioluminescent protein from the luminous hydromedusan, Aequorea // J. Cell. Сотр. Physiol. 1962. - V.59. - P.223-240.

214. Shimomura O., Johnson F.H., Saiga Y. Extraction and properties of halistaurin, a bioluminescent protein from the hydromedusan, Halistaura // J. Cell. Сотр. Physiol. 1963. - V.62. - P.9-15.

215. Sluyterman L. A. A., Elgersma O. Chromatofocusing: Isoelectric focusingon ion-exchange columns. I. General principles // J. Chromatogr. -1978a. -V. 150. -P. 17-30.

216. Sluyterman L. A. A., Elgersma O. Chromatofocusing: Isoelectric focusing on ion-exchange columns. II. Experimental verification // J. Chromatogr. 19786. -V. 150.-P. 31-44.

217. Sluyterman L. A. A., Wijdenes J. Chromatofocusing: III. The properties of a DEAE-agarose anion exchanger and its suitability for protein separations // J. Chromatogr. 1981a. - V. 206. - P.429-440.

218. Sluyterman L. A. A., Wijdenes J. Chromatofocusing: IV. Properties of an agarose polyethyleneimine ion-exchanger and its suitability for protein separations // J. Chromatogr. 19816. - V. 206. - P.441-447.

219. Smithies O. Zone electrophoresis in starch gels: Group variations in the serum proteins of normal human adults // Biochem. J. 1955. - V. 61. - P. 629-641.

220. Snyder R.V., Angelichi R.J., Meek R.B. Partial resolution of amino acids by column chromatography on a polystyrene resin containing an optically active copper(II) complex // J. Am. Chem. Soc. 1972. - V.94. - P.2660-2663.

221. Stoll D., Templin M.F., Bachmann J., Joos Т.О. Protein microarrays: applications and future challenges // Curr. Opin. Drug. Discov. Devel. 2005. -V.8. -P.239-252.

222. Strynadka N.C.J., James M.N.G. Crystal structures of the helix-loop-helix calcium-binding proteins // Annu. Rev. Biochem. 1989. - V.58. - P.951-998.

223. Sulkowski E. Purification of Proteins by IMAC // Trends Biotechnol. -1985.-V.3. -P.l-10.

224. Sulkowski E. The saga of IMAC and MIT // Bioessays. 1989. - V.10. -P.170-175.

225. Sulkowski E. Immobilized metal-ion affinity chromatography: imidazole proton pump and chromatographic sequelae. I. Proton pump //J. Mol. Recognit. 1996a. - V.9. - P.389-393.

226. Sulkowski E. Immobilized metal-ion affinity chromatography: imidazole proton pump and chromatographic sequelae. II. Chromatographic sequelae // J. Mol. Recognit. 19966. - V.9. - P.494-498.

227. Swain A. Restrained least-squares refinement of native (Ca) and Cd-substituted carp parvalbumin using X-ray data to 1.6A resolution // Ph. D. Tesis. Univ. S. Carolina. 1988.196p.

228. Swain A.L., Kretsinger R.H., Amma E.L. Restrained least squares refinement of native (calcium) and cadmium-substituted carp parvalbumin using

229. X-ray crystallographic data at 1.6-A resolution // J. Biol. Chem. 1989. - V.264. -P.16620-16628.

230. Tanford C. The hydrophobic effect: Formation of micelles and biological membranes / New York: Wiley-Interscience. 1980. - 233p.

231. Templin M.F., Stoll D., Schrenk M., Traub P.C., Vohringer C.F., Joos Т.О. Protein microarray technology // Trends Biotechnol. 2002. - V.20. - P. 160166.

232. Ticha M., Horejsi V., Barthova J. Affinity electrophoresis of proteins interacting with blue dextran // Biochim. Biophys. Acta. 1978. - V.534. -P.58-63.

233. Todd R.J., Johnson R.D., Arnold F.H. Multiple-site binding interactions in metal-affinity chromatography. I. Equilibrium binding of engineered histidine-containing cytochromes с // J. Chromatogr. A. 1994. - V.662. - P. 13-26.

234. Tsuji A., Sekiguchi K. Adsorption of nicotine acid hydrazide on cation exchanger of various metal forms // Nippon Kagaku Zasshi. 1960. - V.81. -P.847-852.

235. Tsuji F.I., Ohmiya Y., Fagan T.F., Toh H., Inouye S. Molecular evolution of the Ca -binding photoproteins of the hydrozoa // Photochem. Photobiol. 1995. - V.62. -P.657-661.

236. Tswett M.S. Physikalisch-chemische Studien uber das Chlorophyll. Die Adsorbtionen // Berichte der Deutschen botanischen Geselschaft. 1906a -Bd.24.-S. 316-323.

237. Tswett M.S. Adsorbtionanalyse und chromatographische Methode. Anwendung auf die Chemie des Chlorophylls // Berichte der Deutschen botanischen Geselschaft. 1906b - Bd.24. - S. 384-393.

238. Ueda E.K., Gout P.W., Morganti L. Current and prospective applications of metal ion-protein binding // J. Chromatogr. A. 2003. - V.988. P. 1-23.

239. Vogt C. R., Ryan T. R., Baxter J. S. High-speed liquid chromatography on cadmium-modified silica gel // J. Chromatogr. 1977. - V.136. - P. 221-227.

240. Von der Haar F. Affinity elution principles and applications to purification of aminoacyl-tRNA synthetases // Meth. Enzymol. 1974. - V.34. -P.163-171.

241. Wagner F.W., Shepherd S.L. Ligand exchange amino acid analysis: resolution of some amino sugars and cysteine derivatives. // Anal. Biochem. -1971. V.41. - P.314-322.

242. Walters J.A.L.I., Bont W.S. An improved method for the separation of proteins by zonal electrophoresis on density gradients // Anal. Biochem. 1979. - V.93. -P.41-45.

243. Ward W.W., Seliger H.H. Extraction and purification of calcium-activated photoproteins from the ctenophores Mnemiopsis sp. and Beroe ovata // Biochemistry. 1974. - V. 13. - P. 1491 -1499.

244. Warren E.N., Elms P.J., Parker S.E., Borchers C.H. Development of a protein chip: a MS-based method for quantitation of protein expression and modification levels using an immunoaffinity approach // Anal. Chem. 2004. -V.76. - P.4082-4092.

245. Webster P. V., Wilson J. N., Franks M. C. Macroreticular ion-exchange resins: some analytical applications to petroleum products // Anal. Chim. Acta. -1967.-V.38.-P. 193-200.

246. Whitaker J. R. Determination of molecular weights of proteins by gel filtration on Sephadex // Anal. Chem. 1963. - V.35. - P.1950-1953.

247. Xiao S., Liu F., Rosen A.E., Hainfeld J.F., Seeman N.C., Musier-Forsyth K., Kiehl R.A. Selfassembly of metallic nanoparticle arrays by DNA scaffolding // Journal of Nanoparticles Research. 2002. - V.4. - P.313-317.

248. Yasuda K. Thin-layer chromatography of aromatic amines on cadmium sulphate-impregnated silica gel thin layers // J. Chromatogr. 1971. - V. 60. - P. 144-149.

249. Yoshikawa Y., Yamasaki K. Complete chromatographic resolution of cobalt(III) complexes on ion exchange Sephadex // Inorg. Nucl. Chem. Lett. -1970. V.6. - P.523-527.

250. Yoshikawa Y., Yamasaki K. Chromatographic resolution of metal complexes on Sephadex ion exchangers // Coord. Chem. Rev. 1979. - V.28. -P.205-211.

251. Zhao Y.J., Sulkowski E. Porath J. Surface topography of histidine residues in lysozymes // Eur. J. Biochem. 1991. - V.202. -P.l 115-1119.

252. Zhao Y.Q., Lin L., Li J.R., Tang J.A., Duan M.X., Jiang L. DNA biosensor with high sensitivity amplified by gold nanoparticles // Journal of Nanoparticles Research. -2001. V.3. - P.321-323.