Молекулярные характеристики геропротекторных пептидов, выделенных из тимуса и мозга животных тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.01.30, кандидат биологических наук Жилинский, Дмитрий Владимирович

• Жилинский, Дмитрий Владимирович
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Жилинский, Дмитрий Владимирович

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Феномен старения

1.2. Регуляторные пептиды

1.3. Пептиды иммунной системы

1.4. Пептидные препараты мозга

1.4.1. Церебролизин

1.4.2. Кортексин

1.5. Существующие подходы к выделению и очистке природных ^

пептидных препаратов

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Биохимические препараты

2.1.1. Дезоксирибонуклеиновая кислота

2.1.2

2.1.2.1 Тималин

2.1.2.2. Церебролизин

2.1.2.3

2.1.3. Синтетические пептиды

2.1.3.1. Глутатион

2.1.3.2. Вилон

2.1.3.3. Эпиталон

2.1.3.4. Вазопрессин

2.1.4. Препараты аминокислот

2.1.5. Сывороточный альбумин

2.1.6. Нейраминидаза

2.2.Материалы для хроматографии пептидов

2.2.1. Сефадекс

2.2.2. Сульфокатионит КУ-2Х8

2.2.3. Сульфокатионит Бошех5(ЖХ8

2.2.4. Пластины для высокоэффективной тонкослойной 40 хроматографии

2.2.5.Приготовление раствора ДНК

2.2.6. Приготовление буферных растворов

2.3. Оборудование для препаративного выделения низкомолекулярных

пептидов

2.3.1. Плазмофильтр ПФМ-800

2.3.2. Колонки для гель-хроматографии

2.3.3. Колонки для твердофазной экстракции

2.3.4. Колонки для ионообменной хроматографии

2.4.Методы исследования

2.4.1. Экстракция пептидов

2.4.2. Тангенциальная микрофильтрация

2.4.3. Твердофазная экстракция

2.4.4. Ионообменная хроматография пептидных препаратов

2.4.5. Определение концентрации а-аминного азота по реакции с ^ нингидрином

2.4.6. Гель-хроматография

2.4.7. Спектральные характеристики пептидных растворов

2.4.8. Высокоэффективная тонкослойная хроматография

2.4.9. Определение биологической активности пептидов при ^ органотипическом культивировании тканей

2.4.10. Вискозиметрия

2.4.11. Лиофильная сушка пептидных растворов

2.4.12. Статистическая обработка результатов исследования

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Выделение пептидов из тимуса

3.1.1. Экстракция пептидов из тимуса

3.1 ^.Фракционирование экстракта тимуса методом

ж

тангенциальной микрофильтрации

3.1.3. Твердофазная экстракция и хроматография пептидов

3.1.4. Сравнительная характеристика пептидных препаратов,

74

полученных из тимуса разными методами

3.1.5. Ионообменная хроматография пептидов, выделенных из тимуса на сульфокатионите КУ-2Х8

3.1.6. Ионообменная хроматография пептидов, выделенных из тимуса на сульфокатионите Бо\уех 50\¥Х8

3.2.Выделение и очистка пептидов коры головного мозга

3.2.1. Основные свойства пептидов мозга

3.2.2. Ионообменная хроматография пептидов мозга

3.3. Тканеспецифическая активность индивидуальных пептидов и пептидных препаратов тимуса и мозга

3.3.1. Тканеспецифические активность индивидуального пептида и пептидного препарата тимуса по сравнению с препаратом Тималин в органотипической культуре крыс

3.3.2.Тканеспецифические свойства индивидуального пептида и пептидного препарата мозга по сравнению с препаратами Церебролизин и Кортексин в органотипической культуре

103

крыс

3.3.3. Геропротекторная активность индивидуальных пептидов, выделенных из пептидных препаратов тимуса и мозга в органотипической культуре молодых и старых крыс

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВЭТСХ - высокоэффективная тонкослойная хроматография

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИП - индекс площади

ОП - оптическая плотность

РПИ - роторно-пленочный испаритель

ТФЭ - твердофазная экстракция

УФ - ультрафиолетовый

ФТ - факторы транскрипции

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярные характеристики геропротекторных пептидов, выделенных из тимуса и мозга животных»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

Демографические данные последних лет указывают на постоянное увеличение количества пожилых и старых людей среди населения разных стран. Эта тенденция беспокоит финансово-экономические институты большинства государств, так как пожилые и старые люди в большинстве представляют собой нетрудоспособное население, для которого характерны многочисленные заболевания и инвалидность.

Решение этих задач напрямую связано с развитием новых направлений фармакогнозии и фармации. Одним из этих направлений является развитие и внедрение нового класса органопрепаратов, представляющих собой низкомолекулярные природные пептиды, регулирующие физиологические функции конкретных органов и тканей. Эти пептиды проявляют отчётливые геропротекторные свойства, которые определяются, в частности, повышением клеточного и гуморального иммунитета и укреплением нейро-иммунной координации в стареющем организме [Коркушко О.В. и соавт., 2002].

Ведущими направлениями исследований в области современной геронтологии являются: изучение иммунологических механизмов старения, разработка новых схем получения природных лекарственных препаратов на основе пептидов, необходимость препаративного получения индивидуальных природных олигопептидов, экспериментальное изучение геропротекторного действия пептидов, внедрение методов биорегулирующей терапии в медицинскую практику [Морозов В.Г. и соавт., 1985]. Пептидные биорегуляторы участвуют в регуляции параметров старения и содержатся в различных клетках и тканях организма. Они образуются в ходе ограниченного протеолиза белков, обладают широким спектром биологического действия и координируют процессы развития и функции многоклеточных систем [Климов П.К. и соавт., 1993].

Имеющиеся в литературе данные о строении и биохимических свойствах регуляторных пептидов разрознены, а иногда и противоречивы. Это касается как экспериментальных данных, так и теоретических представлений о механизмах молекулярных взаимодействий пептидных препаратов с клеточными рецепторами и внутриядерным содержимым клетки.

В тоже время, для препаратов низкомолекулярных пептидов известны данные об их составе: все они представляют смесь (композицию) из нескольких низкомолекулярных пептидов с примесью аминокислот в отдельных случаях. По-видимому, именно сложность выделения и препаративного получения этих пептидных препаратов не позволяет провести фармакокинетический анализ этих компонентов. Однако попытки выделить индивидуальные природные низкомолекулярные пептиды в препаративных количествах - немногочисленны.

Цель и задачи исследования

С помощью современных методов фракционирования многокомпонентных пептидных препаратов получить индивидуальные высокоочищенные пептиды из тимуса и коры головного мозга крупного рогатого скота, установить их аминокислотный состав, молекулярные характеристики и оценить их биологическую, в частности, тканеспецифическую и геропротекторную активности.

Для достижения указанной цели в работе были сформулированы и решены следующие задачи:

1. Адаптированы способы выделения и очистки геропротекторных олигопептидов из животных тканей, исключая использование органических растворителей.

2. Разработан способ ионообменной хроматографии для получения индивидуальных геропротекторных олигопептидов в препаративных количествах.

3. Определен молекулярные характеристики (молекулярная масса, изоэлектрическая точка) и аминокислотный состав пептидов, выделенных из тимуса и мозга животных; провести сравнение их аминокислотных составов.

4. Установлены тканеспецифические свойства и геропротекторное действие выделенных пептидов в экспериментальной модели органотипических культур тканей молодых и старых крыс.

Научная новизна исследования

Впервые разработан метод выделения индивидуальных пептидов из пептидных препаратов тимуса и мозга крупного рогатого скота без использования органических растворителей, заключающийся в тангенциальной микрофильтрации экстракта ткани на трековых мембранах, твердофазной экстракции пептидов с использованием катионообменного сорбента и ионообменной изократической хроматографии низкого давления.

Проведено сравнение молекулярных характеристик (аминокислотный состав, молекулярная масса, изоэлектрическая точка, биологическая активность) геропротекторных индивидуальных пептидов, выделенных из пептидных препаратов тимуса и мозга предложенным методом. Установлено, что индивидуальный пептид тимуса имеет следующий аминокислотный состав: Glu, Lys, Asp, Gly, Val, Ala, Leu , а индивидуальный пептид мозга -Glu, Lys, Ala, Ile. Молекулярная масса пептидов, выделенных из тимуса -730,8 Да, а из мозга - 459,5 Да. Изоэлектрические точки пептидов, выделенных из тимуса и мозга оцениваются как pl=4,04 и 6,6, соответственно.

Доказано, что пептиды, выделенные методом тангенциальной микрофильтрации и твердофазной экстракции, обладают тканеспецифическими свойствами: пептиды, выделенные из тимуса, обладают пролиферативной активностью в отношении органотипических

культур тимуса и не влияют на индекс площади зоны роста эксплантатов других тканей. Пептиды, выделенные из коры головного мозга, увеличивают зону роста эксплантатов в органотипической культуре мозга, но не влияют на рост эксплантатов других тканей.

Впервые показаны геропротекторные свойства индивидуальных пептидов тимуса и мозга, выделенных методом тангенциальной микрофильтрации и твердофазной экстракции, и ионообменной хроматографией. Пептиды проявляли пролиферативную активность в отношении эксплантатов тимуса и мозга в органотипических культурах тканей от старых крыс.

Проведено сравнение пептидов, выделенных предложенным методом, со стандартными лекарственными пептидными препаратами, обладающими геропротекторным действием: Тималином, Кортексином и Церебролизином. Установлено, что компонентные составы пептидных препаратов, полученных разработанным методом и методом с использованием органических растворителей, идентичны.

Научно-практическая значимость

Разработана схема выделения индивидуальных коротких пептидов из тканей животных с использованием современных инновационных методов фракционирования сложных смесей на основе использования трековых мембран и полимерных сорбентов. Данная схема пригодна для технологического масштабирования, так как исключает использование органических растворителей с соответствующим повышением экологической безопасности производства.

Предложенная схема выделения пептидов может быть использована для внедрения в производство геропротекторных препаратов на основе экстрактов из животного сырья.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработана схема выделения высокоочищенных пептидных

фракций из животного сырья, основанная на методах

ю

тангенциальной микрофильтрации и твердофазной экстракции, что позволило полностью исключить использование органических растворителей.

2. Компонентный состав пептидных препаратов, полученных разработанным методом и методом с использованием органических растворителей, идентичен.

3. Пептиды, выделенные из тимуса и коры головного мозга крупного рогатого скота, обладают тканеспецифическими свойствами, способствуя увеличению зоны роста эксплантатов соответствующих тканей, и не влияют на рост эксплантатов других тканей в органотипической культуре тканей.

4. Пептиды, выделенные из тимуса и мозга крупного рогатого скота разработанным методом, обладают геропротекторным действием, способствуя увеличению зоны роста эксплантатов соответствующих тканей, полученных от старых крыс.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 13 печатных работ, из них 5 статей, 4 из которых - в журналах, включенных в Перечень ВАК Минобрнауки РФ, 7 - в виде тезисов докладов. Все результаты и положения диссертационного исследования полностью отражены в публикациях. Работа выполнена при поддержке программы ФСР МФП НТС «Участник молодежного научно-инновационного конкурса 2010» («У.М.Н.И.К.») № 8945р/14029.

Апробация

Основные результаты диссертационного исследования были представлены

на 6-м международном симпозиуме"Мо1еси1аг Order and Mobility in Polymer

Systems" (Санкт-Петербург, 2008), научном семинаре "Хроматография,

ионный обмен, альтернативные методы" (Санкт-Петербург, 2009), 5-ой

11

международной конференции молодых ученых "Modern problems of polymer science" (Санкт-Петербург, 2009), 4-ом Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Казань, 2009), 6-ой международной конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, 2010), 7-м международном симпозиуме "Molecular Order and Mobility in Polymer Systems" (Санкт-Петербург, 2011), 7-ой международной конференции молодых ученых «Современные проблемы науки о полимерах» (Санкт-Петербург, 2011), 5-ой юбилейной международной научно-практической конференции «Геронтологические чтения -2012» (Белгород, 2012).

Связь с планом НИР

Диссертация является составной частью научно-исследовательской работы Института биорегуляции и геронтологии СЗО РАМН в области создания и исследования пептидных препаратов, обладающих геропротекторными свойствами, а также разработки современных способов выделения индивидуальных тканеспецифических пептидов из природного сырья.

Структура и объем диссертационной работы

Диссертационная работа состоит из введения, 3-х глав (обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов), выводов и списка литературы. Объем работы составляет 125 страниц. Список литературы содержит 123 источника, в том числе 77 отечественных и 46 зарубежных. Диссертация иллюстрирована 15 таблицами и 33 рисунками.

Заключение диссертации по теме «Геронтология и гериатрия», Жилинский, Дмитрий Владимирович

выводы

1. Разработан способ выделения высокоочищенных пептидных препаратов из животного сырья без использования органических растворителей, включающий следующие стадии: тангенциальную микрофильтрацию экстракта ткани на трековых мембранах, твердофазную экстракцию пептидов с использованием катионообменного сорбента.

2. Выделение индивидуального пептида из тимуса проводили методом препаративной ионообменной хроматографии низкого давления на катионите КУ-2Х8. Градиент рН для фракционирования пептидов тимуса занимал диапазон от 4,25 до 12,0 при ионной силе 0,2 моль»л"

Высокоочищенные пептидные композиции, выделенные из тимуса экстракцией органическими растворителями (Тималин) и методом тангенциальной микрофильтрации и твердофазной экстракции (пептидный препарат тимуса), содержат одно и то же количество пептидов. При этом в Тималине содержится большее количество олигонуклеотидов, чем в препарате, полученном из тимуса.

3. Выделение индивидуального пептида из мозга проводили методом препаративной ионообменной хроматографии низкого давления на катионите БОХУЕХ 50\¥Х8. Градиент рН для выделения гомогенного пептида мозга располагался в диапазоне от 4,25 до 12,0 при ионной силе 0,2 моль«л"'. Высокоочищенные пептидные композиции, выделенные из мозга экстракцией органическими растворителями (Кортексин) и методом тангенциальной микрофильтрации и твердофазной экстракции (пептиды мозга), содержат одно и то же количество пептидов.

4. В состав индивидуального пептида, выделенного из тимуса, входят 7 аминокислот: Glu, Lys, Asp, Gly, Val, Ala, Leu, а в состав пептида мозга - 4 аминокислоты Glu, Lys, Ala, Ile. Молекулярная масса пептида, выделенного из тимуса, составляет 730,8 Да, а пептида, выделенного из мозга - 459,5 Да. Изоэлектрическая точка для пептида, выделенного из тимуса составляет 4,04, из коры головного мозга - 6,6.

5. Пептиды, выделенные предлагаемым методом, проявляют тканеспецифическое действие в органотипических культурах: индекс зоны роста эксплантатов тимуса и головного мозга крыс увеличивался на 26% и 29%, соответственно. Пептиды не оказывали стимулирующего действия на эксплантаты других тканей крыс.

6. Пептиды тимуса и коры головного мозга крупного рогатого скота, оказывали геропротекторное действие в органотипических культурах тимуса и головного мозга молодых и старых крыс. Индексы площади зоны роста эксплантатов тимуса и мозга молодых животных увеличивались на 26%) и 29%, а эксплантатов тимуса и головного мозга старых животных - на 21% и 24 %, соответственно.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Разработанный способ выделения высокоочищенных индивидуальных пептидов из животного сырья без использования органических растворителей подходит для технологического масштабирования в производстве пептидных препаратов.

2. Выявленное тканеспецифическое и геропротекторное действие пептидов, выделенных из тимуса и коры головного мозга, при действии на эксплантаты тимуса и мозга, является основой для дальнейшего изучения пептидных препаратов в качестве лекарственных средств, предназначенных для профилактики и лечения патологических состояний, в том числе при болезнях, ассоциированных с возрастом.

3. Полученные результаты могут быть рекомендованы к использованию в качестве учебных материалов при подготовке врачей-гериатров при составлении методических инструкций и указаний.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Жилинский, Дмитрий Владимирович, 2012 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Акоев Г. Н., Чалисова Н. И. Нейротрофические факторы, выделяемые из центральной нервной системы. // Успехи физиол. наук. -1990.- Т. 21, №4,- С. 138-142.

2. Анисимов В.Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения: В 2 т. — 2-е изд., перераб. и доп. -СПб.: Наука, 2008.-Т.1. -481 с.

3. Анисимов В. Н., Соловьев М. В. Эволюция концепций в геронтологии. //СПб.: Эскулап, 1999. - 130 с.

4. Арион В.Я., Зимина И.В., Москвина С.Н. Иммунобиологические свойства и клиническое применение тимозинов и других препаратов тимуса.// Иммунопатолог. Аллерголог. Инфектолог. 2008, № 1, С. 26 - 40.

5. Ашмарин И.П. Гормоны и регуляторные пептиды: различия и сходство понятий и функций. Место гормонов среди других межклеточных сигнализаторов. // Рос. Хим. Ж. (Ж. Рос. хим.об-ва им. Д.И.Менделеева), 2005.- Т.49.№1.- С.4 - 7.

6. Ашмарин И.П., Каразеева Е.П. Нейропептиды. //в кн. Биохимия мозга. С. 232 - 266. СПб.: Изд-во С.-Петербургского университета, 1999. - 326 с.

7. Ашмарин И.П. Лелекова Т.В. Санжиева Л.Ц. Об эффективности ультрамалых доз и концентраций биологически активных соединений // Изв. АН СССР. Сер.биол. 1992. №4. С. 531-536.

8. Барабанова C.B., Артюхина З.Е., Казакова Т.Б., Хавинсон В.Х., Малинин В.В., Корнева Е.А. Изменение содержания интерлейкина-2 в структурах гипоталамуса крыс при введении пептидов на фоне слабого стресса. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2006.- Т. 141, № 4.- С. 371-374.

9. Бреслер С. Е. Введение в молекулярную биологию. М.-Л.: Наука, 1966.-514с.

10. Вегнер Р.Э., Ритума И.Р., Чипенс Г.И. - Структура и биологические свойства тимопоетина П, тимозина аь их фрагментов и аналогов // Изв. АНЛатв. ССР. 1984. № 12. С. 63-76.

11. Гаврилов JI.A., Гаврилова Н.С. Биология продолжительности жизни. М.:Наука, 1986, 168 с.

12. Гланц. С. Медико-биологическая статистика. Пер. с англ., М: Практика 1999, 459 с.

13. Григорьев С.Г., Юнкеров В.И. Математико-статистическая обработка данных медицинских исследований. Спб.: ВМедА, 2002. - 266 с.

14. Гранстрем O.K., Сорокина Е.Г., Салыкина М.А., Сторожевых Т.П., Сурин A.M., Штучная Г.В., Реутов В.П., Крушинский A.JL, КузенковВ.С., Пинелис В.Г., Дьяконов М.М. Кортексин: нейропротекция на молекулярном уровне // Нейроиммунология, 2010 - Т. VIII. - №1-2. - С. 34-40.

15. Гомазков O.A. Нейротрофические и ростовые факторы мозга: регуляторная специфика и терапевтический потенциал. // Успехи физиологических наук. 2005.- Т.36. №2.- С. 1-25.

16. Громова O.A. Основа терапевтического действия препарата 4epe6poflH3HH//18.06.2009.http:www.apteka.uz./print/publish/djc/text56777.

17. Громова O.A., Катаев A.C., Третьяков В.Е. и др. Олигопептидная мембранная фракция Церебролизина // Международный неврологический журнал. -2006. .-№ 2. www.neurology.mif-ua.com.

18. Дёмин A.A., Чернова И.А.,Шатаева JI.K. Ионообменная сорбция биологически активных веществ. // СПб.: Изд-во С.-Петерб. Ун-та, 2008. -154 с.

19. Детерман Г. Гель-хроматография. Гель-фильтрация. Гель-проникающая хроматография. М.: Мир, 1974. 325 С.

20. Дильман В.М. Большие биологические часы: Введение в интегральную медицину. М.: Знание, 1981. 207 С.

21. Дьяконов М.М., Шабанов П.Д. К вопросу о нейропротекторном действии пептидных препаратов.// Вестн. Рос.Воен.-мед. Академии. 2011, Т.33.№1 С. 255 -228.

22. Доссон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К. Справочник биохимика: Пер. с англ.- М.: Мир, 1991.-544 С.

23. Зарубина И. В., Шабанов П.Д. Кортексин и кортаген как корректоры функционально-метаболических нарушений головного мозга при хронической ишемии. // Экспериментальная и клиническая фармакология. , 2011, Т. 74. №2. С. 8-15.

24. Закуцкий А. Н., Чалисова Н. И., Рыжак Г. А., Анискина А.И., Филиппов C.B., Зезюлин П.Н. Тканеспецифическое влияние синтетических биорегуляторных пептидов в органотипической культуре тканей молодых и старых крыс.// Успехи геронтологии, 2006.- вып. 19.- С. 93-96.

25. Зеликсон Б. М; Мембранный модуль для разделения крови и способ его изготовления: патент РФ № 2046647: опубл. 27.10.95, БИ № 30.

26. Зенгер В. Принципы структурной организации нуклеиновых кислот. М.: Мир. 1987.-584 С.

27. Клименко В.М., Зубарева О.Е., Краснова И.Н. Роль внутримозговых рецепторов интерлейкина-1 в модуляции гомеостатических реакций организма. Нейрохимия, 1995, т. 12, вып. 2, стр. 16-22.

28. Климов П.К., Барашкова Г. М.Эндогенные пептиды как единая система регуляторных веществ // Физиол. Журн. СССР им. И.М. Сеченова. 1993. Т.79, №3. С. 80-87.

29. Кокряков В.Н., Ковальчук JT.B., Алешина Г.М., Шамова О.В. Катионные противомикробные пептиды как молекулярные факторы иммунитета: мультифункциональность. // Журн. Микробиол. 2006. № 2. С. 98-105.

30. Коркушко О.В., Хавинсон В.Х., Бутенко Г.М., Шатило В.Б. Пептидные препараты тимуса и эпифиза в профилактике ускоренного старения. Санкт-Петербург. «Наука» 2002. 202 с.

31. Корнева Е.А., Казакова Т.Б. Современные подходы к анализу влияния стресса на процессы метаболизма в клетках нервной и иммунной систем. // Медицинская иммунология, 1999, Т. 1, № 1-2, С. 17-22

32. Корнева Е.А., Шанин С.Н., Рыбакина Е.Г. Интерлейкин 1 в реализации стресс-индуцированных изменений функций иммунной системы. // Российский физиол. журнал им.И.М.Сеченова. 2000. Т.86, № 3. С.292-302.

33. Корнева Е.А. Основные этапы становления иммунофизиологии. // Нейроиммунология. 2005. Т. 3, №1. С. 4-10.

34. Кричевская А. А., Лукаш А. И., Шугалей В. С., Бондаренко Т. И. Аминокислоты, их производные и регуляция метаболизма. - Ростов н/ Д: Изд-во Рост. Ун-та, 1983. 112 с.

35. Кузник Б.И., Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., Цитомедины: 25-летний опыт экспериментальных и клинических исследований. СПб.; Наука, 1998. 310с.

36. . Кульчиков А.Е. Применение Церебролизина при заболеваниях периферической нервной системы // Неврологический вестник. — 2008. — Т. XV, вып. 4. —С. 110-115.

37. Ласкорин Б.Н., Фёдорова Л.А., Ступин Н.П. Определение плотности сшивки дивинилбензолом сополимеров стирола. // Пластмассы. 1971, № 12, С. 46-48.

38. Машковский М.Д. Лекарственные средства. 15-е изд. М.: Новая Волна. 2005 - 1206 С.

39. Мархолл. М. Ионообменники в аналитической химии. 4.1,2. М.:"МИР" - 1985 .

40. Морозов В.Г., Рыжак Г.А., Малинин В.В. Цитамины (биорегуляторы клеточного метаболизма). СПб.: Фолиант, 2000. 119 С.

41. Морозов В. Г., Хавинсон В.Х. Новый класс биологических регуляторов многоклеточных систем - цитомедины // Успехи соврем, биологии. 1983. Т.96, вып. 3 (6), С.339-352.

42. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Роль клеточных медиаторов (цитомединов) в регуляции генетической активности // Изв. АН СССР. Сер.биол. 1985. № 4. С. 581-587.

43. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х. Пептидные биорегуляторы (25-летний опыт экспериментального и клинического изучения). СПб.: Наука, 1996. 74 С.

44. Морозов В.Г., Хавинсон В. X. Способ получения белковой пищевой добавки. Пат. 2075944 РФ от 27.03.1997. БИ. 1997, №9.

45. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., Малинин В.В. Пептидные тимомиметики. СПб.: Наука, 20006. 158 С.

46. Морозов В.Г., Хавинсон В.Х., Чайка О.В., Семёнова В.И. Способ получения из животного сырья комплекса биологически активных полипептидов, нормализующих функции головного мозга, фармакологическая композиция и её применение. Патент РФ № 2104702. Опубл. Бюлл. Изобрет. № 13.от 02.20.1998.

47. Остерман JI. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот.-М.: Наука, 1985.-536 С.

48. Рыбакина Е.Г., Корнева Е.А. Трансдукция сигнала интерлейкина-1 в процессах взаимодействия нервной и иммунной систем организма. // Вестник РАМН. 2005. №7. С. 3-8.

49. Рыжак Г.А., Малинин В.В., Платонова Т.Н. Кортексин и регуляция функций головного мозга. — СПб: Фоли ант, 2003 — 208 с.

50. Селеменев В.Ф., Котова Д.Л., Орос Г.Ю., Загородний A.A. Хроматография низкого давления физиологически активных веществ. С.546 - 569 в книге «100 лет хроматографии», М.: Наука, 2003. - 740 с.

51. Соловьёв А.Ю., Жилинский Д.В., Чернова И.А., Басин Б.Я., Шатаева Л.К. Фракционирование жесткоцепных полимеров при микрофильтрации.//Мембраны, 2009. №44, С.22-26.

52. Соловьёва Д.В., Хавинсон В.Х. Применение тималина и эпиталамина для коррекции возрастных нарушений гомеостаза у женщин.//Клинич. Геронтология // 2000, Т.6. № 7 - 8, С. 106.

53. Сотникова Н.Ю., Громова O.A., Новикова Е.А. Нейроиммуномодулирующие свойства Церебролизина // Цитокины и воспаление - 2004. Т. 3, № 2. С. 34-39.

54. Сычев К.С. Методы высокоэффективной жидкостной хроматографии и твердофазной экстракции. М.: «Аналитика - Мир Профессионалов» ЗАО «Хайтек Инструменте», 2006, 167 с.

55. Сьяксте Н.И., Будылин A.B. Структурные изменения хроматина на различных уровнях его организации при старении // Онтогенез. 1992. Т. 23, №3. С 242-253.

56. Фролькис В .В. Синдромы старения // Вест. АМН СССР. 1990. №1. С. 812.

57. Фролькис.В.В. Старение и увеличение продолжительности жизни. Л.Наука, 1988, 239 с.

58. Хавинсон В.Х. Пептидная регуляция старения // Вестник РАМН. 2001а. Т. 12.

59. Хавинсон В.Х. Тканеспецифическое действие пептидов // Бюл. эксперим. биологии.и медицины. 20016. Т. 132, № 8. С. 228-229.

60. Хавинсон В.Х., Способ получения пептидов, обладающих тканеспецифической активностью, и фармацевтические композиции на их основе. Патент РФ №216501 (2001 в). (Кортаген).

61. Хавинсон В.Х., Анисимов В.Н. Синтетический дипептид вилон (L-Lys-L-Glu) увеличивает продолжительность жизни и угнетает развитие спонтанных опухолей у мышей // Докл. АН. 2000а. Т. 372, № 3. С. 421-423.

62. Хавинсон В.Х., Анисимов В.Н. Пептидные биорегуляторы и старение. Санкт-Петербург. «Наука», 2003. - 224 С.

63. Хавинсон В.Х., Ашмарин И.П., Малинин В.В. Возрастная динамика регуляторных пептидов // Наука долголетия. 2001 в. № 1. С. 18-22.

64. Хавинсон В.Х., Голубев А.Г. Старение эпифиза // Успехи геронтологии. 2002. Вып. 9. С. 67-72.

65. Хавинсон В.Х., Егорова В.В., Тимофеева Н.М. и др. Влияние пептидов вилона и эпиталона на всасывание глюкозы и глицина в различных отделах тонкой кишки у крыс // Бюл. эксперим. биологии и медицины. 2002. Т. 133, № 5. С. 570-573.

66. Хавинсон В.Х., Малинин В.В. Пептидная регуляция иммунобиологических механизмов старения.//Аллергология Иммунология, 2008.Т.9.№ 4, С.443 -444.

67. Хавинсон В.Х., Морозов В.Г. Результаты и перспективы примененияпептидных биорегуляторов в геронтологии. // Клинич. Медицина. 2000. №8, С.81 -84

68. Хавинсон В. X., Рыбакина Е. Г., Малинин В., и др. Влияние коротких пептидов на реакцию бласттрансформации тимоцитов и процесс сигнальной трансдукции по сфингомелиновому пути // Бюл. эксперим. Биологии и медицины. 2002. Т.133, №5. С. 574-577.

69. Хавинсон В.Х., Соловьёв А.Ю., Шатаева Л.К. Молекулярный механизм взаимодействия олигопептидов и двойной спирали ДНК. // Бюл. экспер. биол. 2006. Т.141, № 4. С.443 - 447.

70. Хавинсон В.Х., Шатаева Л.К., Соловьёв А.Ю., Рыжак Г.А., Козлов Л.В. Способ получения средства, обладающего тканеспецифической активностью, и средство, полученное данным способом (варианты). Патент РФ № 241676 //опубл. 10.04.2011.,Бюл.№ 10.

71. Хавинсон В.Х., Малинин В.В., Чалисова Н.И., Григорьев Е.И. Тканеспецифическое действие пептидов в культуре тканей крыс разного возраста. // Успехи геронтологии, 2002, том 3, №9, с.41-49.

72. Цветков В.Н. Жесткоцепные полимерные молекулы. Л.: Наука, 1986.380 с.

73. Чалисова Н.И., Хавинсон В.Х., Ноздрачёв А.Д. Модулирующий и протекторный эффект пептидов тимуса в культуре лимфоидной ткани. // Доклады академии наук, 2001, том 379, №3. с. 411-413.

74. Чанг Р. Физическая химия с приложениями к биологическим системам. М.: Мир, 1980.-662 с.

75. Шабанов П.Д. Фармакология лекарственных препаратов пептидной структуры.// Психофармаколог. Биолог. Наркология, 2008, Т.8. вып.З - 4, С. 2399-24325.

76. Шатаева Л.К., Кузнецова Н.Н., Елькин Г.Э. Карбоксильные катиониты в биологии. Ленинград, «Наука» ЛО, 1979. 286 с.

77. Ягодин Г. А., Каган С. 3., Тарасов В. В. Основы жидкостной экстракции.: -М.: Химия, 1981. — 400 с.

78. Aita М., Romano N. Effects of partial decerebration and hypophyseal allograft in the thymus of chicken embryos :thymostimulin localization and enzymatic activities. Eur. J.Histochem. 2006; 50(1): 69-78.

79. Amici D., Gianfranceschi G.L. Control of RNA and protein synthesis in phytohemagglutinin-stimulated human lymphocytes by chromatin peptides from calf thymus.// Molec. Biol. Rep. 1980, V. 6., P. 225 - 228.

80. Angiolillo A., Bramucci M., Marsili V., et al. Phosphorylation of synthetic acidic peptides by casein kinase II: evidence for competition with phosphorylation of protein involved in transcription.//Molec. Cellul. Biochemistry. 1993, V. 125, P. 65 - 72.

81. Angiolillo A., Desgro A., Marsili V., et al. Synthetic octapeptide pyroGlu-Asp-Asp-Ser- Asp- Glu-Glu- Asn controls DNA transcription in vitro by RNA polymerase II.// Experientia 1993, V. 49,P. 902 - 905.

82. Anisimov V.N., Khavinson V. Kh. Peptides bioregulation of aging: results and prospects // Biogerontology, 2010. V.l 1, P. 139 - 149.

83. Audhya Т., Schlesinger D.H., Goldstein G. Complete amino acid sequences of bovine thymopoietins I, II, and III: closely homologous polypeptides. Biochemistry. 1981; 20 (21): P. 6195-6200.

84. Audhya T., Scheid M. P., Goldstein G. Contrasting biological activities of thymopoietin and splenin, two clously related polypeptide products of thymus and spleen // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81, N. 9. P. 2847-2849.

85. Bach J.F., Dardenne M. Thymulin, a zinc-dependenthormone. Med. Oncol. Tumor Pharmacother. 1989; 6(l):25-29.

86. Basso A., Rossolini G., Amici D., et al. Aging reversibility : from thymus graft to vegetable extract treatment - application to cure an age-associated pathology.// Biogerontology. 2005, V.6, P.245 - 253.

87. Blalock JE. The immune system as a sensory organ. J Immunol 1984; 132: 1067-70.

88. Bramucci M., Miano A., Quassinti L., et al. Degradation of thymic humoral factor gamma2 by human plasma: involvement of angiotensin converting enzyme. Regul. Pept. 2003; 111 (1-3): 199-205.

89. ChengA.C.,ChenW.W.,FuhramannC.N.,FrankelA.D.Recognition of nucleic acid bases and base-pairs by hydrogen bonding to amino acid side-chains // J. Mol. Biol. 2003,V. 327. P. 781-796.

90. Dardenne M, Saade N, Safieh-Garabedian B. Role ofthymulin or its analogue as a new analgesic molecule. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2006; 1088:153-63.

91. Felici F., Cardellini E., Miano A., et al. Small acidic peptides are Bound to E.coli DNA.//Molec. Biology Rep., 1991, V.15, P. 0 - 18.

92. Gianfranceschi et al. Inhibition of exogenous mRNA-translation in a cell-free system by chromatine peptides from calf thymus // Molec. Biol. Rep. 1980, V. 6, P. 169-174.

93. Gianfranceschi G.L., Amici D., Guglielmi L. Stabilisation of doublt-stranded DNA molecule by non-histon peptidic effector from calf thymus. // Molec.Biol. Rep., 1976. V.3,P. 55 -54.

94. Goldstein A.L., Badamchian M. Thymosins: chemistry and biological properties in health and disease.// Expert Opin. Biol.Ther. 2004; 4(4): 559-573.

95. Goldstein A.L., Low T.L.K., McAdoo M., et al. Thymosin alpha 1: Isolation and sequence analysis of and immunologically active thymic peptide. Proc. Natl. Acad. Sei. 1977; 74(2): 725-729.

96. Hannappel E., Davoust S., Horecker B.L. Isolation of peptides from calf thymus // Biochem.Biophys. Res. Commn. 1982. V. 104, N 1. P. 266-271.

97. Hentze, H.-P., Antonietti M. Porous polymers and resins for biotechnological and biomedical applications // Reviews in Molecular Biotechnology. - 2002. - V. 90.-P. 27-53

98. Hunt L.T., Dayhoff M.O. Amino-terminal sequence identity of ubiquitin and the nonhistone component of nuclear protein A-24. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1977; 74: 650.

99. Hutter-Paier B., Grygar e., Fruhwirth M. et al. Further evidence that Cerebrolysin protects cjrtrical neurons from neurodegeneration in vitro // J. Neural Transm.Suppl. 1998. V.53, P.363 - 372.

100. Janin Y. L. Peptides with anticancer use or potential. Amino Acids. 2003 Jul; 25(1): 1 -40.

101. Khavinson V., Shataeva L., Chernova A. DNA double-helix binds regulatory peptides similarly to transcription factors // Neuroendocrinology Lett. - 2005. - V. 26. N. 3.-P. 237-241.

102. Kvetnoy I. M., Rüssel J. Reiter, V. Kh. Khavinson. Claude Bernard was right: hormones may be produced by "non-endocrine" cells. Neuroendocrinology Letters 2000;21:173-174.

103. Levesley, J. A., Bellhouse B. J. Particulate separation using inertial lift forces // Chem. Eng. Sei. - 1993. - V. 48. - P. 3657-3669.

104. Low T.L., McClure J.E., Naylor P.H., et al. Isolation of thymosin alpha 1 from thymosin fraction 5 of different species by high-performance liquid chromatography. J. Chromatogr.1983; 266: 533-544.

105. Low T.L.K., Thurman G.B., Chincarini C., et al. Current status of thymosin research: evidence of a family of thymic factors that control T-cell maturation. Ann. N.Y. Acad Sei. 1979; 332: 33-48.

106. Martin G.M. Biology of aging. In: Goldman L, Ausiello D, eds. Cecil Medicine. 23rd ed. Philadelphia, Pa: Saunders Elsevier; 2007:chap 22.

107. Miric M., Miskovic A., Brkic S., et al. Long-term followup of patients with myocarditis and idiopathic dilated cardiomyopathy after immunomodulatory therapy. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1994;10(1): 65-74.

108. Moore S., Spackman D.H., Stein W.H. Cromatography of amino acids on sulfonated polystyrene resins.- "Anal. Chem." 1958, v. 30, p. 1185-1189.

109. Moore S., Stein W. H. Photometric ninhydrin method for use in the chromatography of amino acids // J. Biol. Chem. - 1948. - V. 176. - P. 367-388.

110. Morozov V.G., Khavinson V. Kh. 1991, US Patent N 5,070,076 Thymus-Gland preparation and method for producing same. 03 Dec 1991

111. Morozov V.G., Khavinson V. Kh. Natural and synthetic thymic peptides as therapeutics for immune dysfunction. // J. Int. Immunopharmocol.1997, V. 19. P.501 - 505.

112. Pellegrini-Calace M., Thornton! M. Detecting DNA-binding helix-turn-helix structural motifs using sequence and structure information// J. Mol. Biol.2005. V.33(7).P. 781-796. Plosker G.L., Gauthier S.Cerebrolysin: a review of its use in dementia // Drugs Aging. 2009. V. 26, № 11, P. 893-915.

113. Riley C, Hutter-Paier B, Windisch M., et al.,A peptide preparation protects cells in organotypic brain slices against cell death after glutamate intoxication. //J. Neural Transm. 2006 Jan;113(l):103-10.

114. Riley C, Hutter-Paier B, Windisch M., et al.,A peptide preparation protects cells in organotypic brain slices against cell death after glutamate intoxication. //J. Neural Transm. 2006 Jan;113(l):103-10.

115. Rockenstein E., Torrance M., Mante M. et al. Cerebrolysin decreases amyloid-beta productionby regulating amyloid protein precursor maturation in a transgenic model of Alzheimer's disease //J.Neurosci. Res., 2006,V.15. N 7.P.1252 - 1261.

116. Seomkowski M. A trial of treatment with thymus factor (TFX) for chronic autoimmune hemolytic anemias. Pol. Merkur. Lekarski. 1996; 1(5): 327-328.

117. Shauly, A., Wasch A., Nir A. Shear induced particle migration in a polydisperse concentrated suspension, // J. Reology, 1998. - V. 42. - P. 1329.

118. Skotnicki A.B. Therapeutic application of calf thymus extract (TFX). Mol. Oncol. Tumor Pharmacother. 1989; 6(1): 31-43.

119. Thurman E. M., Mills M. S., Solid-Phase Extraction: Principles and Practice, Wiley-Interscience, 1998, 372 p.

120. Tinoco I. Hypochromism in polynucleotides. J. Amer. Chem. Soc., 1960, V. 82, № 18, pp. 4785-4790.

121. Wang J, Lu WL, Liang GW, et al. Pharmacokinetics, toxicity of nasal cilia and immunomodulating effects in Sprague-Dawley rats following intranasal delivery of thymopentin with or without absorption enhancers. Peptides. 2006; 27(4): 826-835.

122. White A., Goldstein A.L. The endocrine role of the thymus and its hormone, thymosin, in the regulation of the growth and maturation of host immunological competence. //Adv. Metab. Disord. 1975; 8: 359-374.

123. Wong T.W., Merrifield R.B. Solid-phase synthesis of thymosin alpha 1 using tert-butyloxycarbonylaminoacy l-4-(oxymethyl)phenylacetamidomethyl-resin. Biochemistry. 1980;19 (14): 3233-3238.