Мембранотропные тканеспецифические биорегуляторы, выделенные из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат биологических наук Рыбакова, Елена Юрьевна

• Рыбакова, Елена Юрьевна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Рыбакова, Елена Юрьевна

Содержание

Стр.

Список использованных сокращений

Введение

Глава 1. Литературный обзор

Мембранотропные гомеостатические тканеспецифи- ^

ческие биорегуляторы

1.1. Экспериментальный подход, разработанный для исследования МГТБ

19

1.2. Физико-химические свойства и строение МГТБ

Глава 2. Материалы и методы

2.1. Выделение и очистка биорегуляторов из сыворотки крови КРС и экстракта костной ткани крысы

2.1.1. Высаливание сыворотки крови и экстракта костной ткани

2.1.2. Выделение белка-модулятора из сыворотки крови и его очистка

2.1.3. Изоэлектрофокусирование фракций супернатантов и сывороточного белка-модулятора

2.1.4. Аффинная хроматография сывороточного биорегулятора

2.1.5. Определение концентрации белка

2.1.6. Электрофорез белковых фракций в полиакриламидном геле

2.1.7. Обращённо-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография

2.1.8. Масс-спектрометрическое изучение биорегуляторов

2.2. Изучение физико-химических свойств биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих

2.2.1. Исследование биорегуляторов с помощью ядерного магнитного резонанса (ЯМР)

2.2.2. Исследование биорегуляторов с помощью метода кругового дихроизма

2.2.3. Определение размеров частиц методом динамического лазерного светорассеяния

2.2.4. Определение аминокислотного состава.

2.2.5. Определение фрагментов первичных структур пептида и белка-модулятора, входящих в состав биорегулятора сыворотки крови

52

53

54

55

56

57

58

59

60

60

64

65

2.2.6. Изучение липидной компоненты биорегулятора, выделенного из сыворотки крови

2.2.7. Изучение углеводной компоненты биорегулятора, выделенного из сыворотки крови

2.3. Изучение мембранотропной активности белков, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих.

2.3.1. Мембранотропная активность биорегуляторов

2.3.2. Биотестирование оросомукоида и его гликозидной

цепи

2.3.3. Изучение механизма инактивации сывороточного биорегулятора

2.4. Изучение специфической биологической активности биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих

2.4.1. Исследование влияния сывороточного биорегулятора на состояние кожи тритона при роллерном культивировании in vitro

2.4.2. Исследование влияния биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих, на состояние регенерата хвоста тритона при роллерном культивировании in vitro

2.4.3. Морфометрическая оценка гистологических срезов

2.4.4. Исследование влияния сывороточного биорегулятора на ранозаживление кожной раны у мышей in vivo

Глава 3. Результаты и их обсуждение

3.1. Выделение МГТБ из сыворотки крови и костной ^ ткани млекопитающих и их очистка

3.2. Изучение состава биорегуляторов и структуры их ^ отдельных компонентов

3.3. Белок, модулирующий активность сывороточного биорегулятора (белок-модулятор)

3.4. Изучение специфической активности биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих

3.4.1. Исследование влияния сывороточного биорегулятора на состояние кожи тритона при роллерном культивировании in vitro

3.4.2. Сравнительное исследование влияния сывороточного биорегулятора и биорегулятора, выделенного из костной ткани млекопитающих, на состояние регенерата

хвоста тритона при роллерном культивировании in vitro

3.4.3. Исследование влияния сывороточного биорегулятора на ранозаживление кожной раны у мышей in vivo

Выводы

Список литературы

Список использованных сокращений

АСМ - атомно-силовая микроскопия БР - биорегулятор

БРК - ИЭФ-фракция биорегулятора, выделенного из костной ткани, и собранная в интервале значений рН <3,0

БРС1 - ИЭФ-фракция биорегулятора, выделенного из сыворотки крови, и, собранная в интервале значений рН <3,0

БРС2 - ИЭФ-фракция биорегулятора, выделенного из сыворотки крови, и собранная в интервале значений рН 4,5 - 5,1 БСА (В S А) - бычий сывороточный альбумин ВКМ - внеклеточный матрикс

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ИПРФ (IGF) - инсулиноподобный ростовой фактор

ИФМ - интерфоторецепторный матрикс

ИЭФ - изоэлектрофокусирование

КД - круговой дихроизм

КРС - крупный рогатый скот

Ma - мембранотропная активность

МБК - морфогенетические белки кости (вопе morphogenetic proteins (BMP) МГТБ - мембранотропные гомеостатические тканеспецифические биорегуляторы

МК - межклеточные контакты мол. масса - молекулярная масса ПААГ - полиакриламидный гель ПМ - плазматическая мембрана ПЭ - пигментный эпителий РП - регуляторный пептид

СМД - сверхмалые дозы, соответствующие диапазону концентраций

вещества в растворе 10"8-10"15 мг/мл

ТФМС - трифторметансульфокислота

ТФУ - трифторуксусная кислота

ЭДТА - этилендиаминотетрауксусная кислота

ЯМР - ядерный магнитный резонанс

AGP - оросомукоид

сАМР - циклический аденозинмонофосфат cGMP - циклический гуанозинмонофосфат

ConA-сеф. 4В - конканавалин А, иммобилизованный на сефарозе 4В FGF - фактор роста фибробластов

HEPES - Ы-2-гидроксиэтилпиперазин-КГ'2-этансульфокислота man-сеф. 4В - манноза, иммобилизованная на сефарозе 4В NO - монооксид азота ОР - остеопонтин

TGF{3 - трансформирующий фактор роста

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Мембранотропные тканеспецифические биорегуляторы, выделенные из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих»

Введение

Актуальность работы. Реализация физиологических и биохимических процессов в различных тканях обусловлена действием множества регуляторных молекул. Регуляция происходит как внутри клетки с участием цитоплазматических белков, так и со стороны межклеточного пространства посредством взаимодействия различных лигандов с рецепторами клеточной поверхности. Изучению биорегуляторов в науке вообще и в биофизике и биотехнологии в частности уделяется большое внимание. Это связано с тем, что, полученные о структуре и механизме действия биорегуляторов, знания являются основой для понимания сущности процессов, происходящих в живых системах. В биотехнологии различные биорегуляторы широко используются, прежде всего, в качестве лекарственных средств.

Настоящее исследование посвящено изучению эндогенных биорегуляторов, которые на основании своеобразия их свойств и активности, выделены в отдельную группу мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов (МГТБ).

В качестве объектов исследования были выбраны МГТБ сыворотки крови и костной ткани млекопитающих. Несмотря на то, что сывороточный биорегулятор ранее был выделен, были изучены его свойства и на его основе разработаны два фармакологических препарата, однако, имеющиеся сведения о его структуре и свойствах не дают полного представления о механизме его биологического действия. Поэтому в настоящей работе продолжено исследование его свойств и, особенно, его специфической биологической активности. Биорегулятор, выделенный из костной ткани, в настоящей работе изучен впервые.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось исследование биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих.

В отдельные задачи исследования входило:

1. Выделить биорегулятор из костной ткани млекопитающих и исследовать его физико-химические свойства.

2. Выделить биорегулятор из сыворотки крови млекопитающих и исследовать его физико-химические свойства.

3. Изучить условия инактивации сывороточного биорегулятора.

4. Разработать новые экспериментальные модели для изучения действия биорегуляторов, выделенных из костной ткани и сыворотки крови млекопитающих.

Новизна работы. Впервые из костной ткани крыс был выделен МГТБ, который проявляет физико-химические свойства и активность, характерные для всех биорегуляторов данной группы. Впервые показано, что в состав МГТБ сыворотки крови входят биологически активные пептиды и белок, модулирующий их активность, который представляет собой ранее неизученную изоформу преальбумина сыворотки крови. Определены фрагменты первичных структур пептида и белка-модулятора, входящих в состав МГТБ сыворотки крови.

Для исследования активности биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих, были разработаны новые модели роллерного органотипического культивирования кожи и регенерата хвоста тритона Р1еигос1е1е8 м?аШ. Впервые показано, что оба биорегулятора оказывают протекторное действие на ткани кожи и хряща, которое выражается в поддержании жизнеспособности клеток и структуры этих тканей. Впервые было изучено биологическое действие обоих биорегуляторов в высоких дозах и показано, что оно принципиально отличается от действия этих биорегуляторов в сверхмалых дозах (СМД).

Практическая значимость. Результаты, полученные при исследовании ранозаживляющего действия биорегулятора, выделенного из сыворотки крови, указывают на перспективность разработки на его основе новых препаратов для применения в травматологии и хирургии, особенно,

челюстно-лицевой. Эти препараты следует использовать при травмах, ожогах кожи как высокоэффективные ранозаживляющие средства, которые будут способствовать восстановлению структуры кожи. Кроме того, представляется актуальной разработка препаратов на основе биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани, для применения в ортопедии и травматологии при лечении переломов, заболеваний суставов. Новые модели роллерного органотипического культивирования кожи и регенерата хвоста тритона Pleurodeles waltl, разработанные для исследования специфической биологической активности биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих, могут быть использованы для биотестирования других тканеспецифических биологически активных веществ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 157 страницах и включает следующие главы:

Введение, в котором рассмотрены актуальность, новизна, практическая значимость работы.

Литературный обзор содержит описание и систематизацию результатов исследования группы мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов (МГТБ).

Материалы и методы включает в себя описание материалов и основных методов, с помощью которых было проведено данное исследование.

Результаты и их обсуждение, глава, в которой представлены данные, полученные при выделении МГТБ из сыворотки крови и костной ткани млекопитающих, их очистке, а также при исследовании их физико-химических свойств и изучении биологической активности на новых экспериментальных моделях роллерного органотипического культивирования тканей кожи и регенератов хвоста амфибий in vitro, и заключение, содержащее анализ полученных результатов.

Выводы.

Диссертация содержит 6 таблиц, 38 рисунков, 147 литературных ссылок.

Глава 1. Литературный обзор Кровь и костная ткань являются разновидностями соединительной ткани, которые отличаются друг от друга составом и соотношением клеток, волокон и физико-химическими свойствами межклеточного вещества [.Афанасьев и др., 1999]. Соединительные ткани развиваются из мезенхимы. Их гистогенез продолжается в течение всего онтогенеза особи. В эмбриональный период мезенхима приобретает черты тканевого строения раньше закладки других тканей; для этого периода характерны высокие темпы размножения клеток и волокнообразования. Гистогенез постэмбрионального периода направлен на поддержание тканевого гомеостаза, пролиферацию малодифференцированных клеток и замену ими отмирающих клеток. Эти процессы протекают под влиянием межклеточных внутритканевых взаимодействий, различных регуляторных факторов таких как, интегрины, адгезивные молекулы, гормоны, цитокины, наличие малодифференцированных клеток и др. Например, у человека на долю соединительных тканей в организме приходится более 50% массы тела. Они участвуют в формировании стромы органов, прослоек между другими тканями, дермы кожи, скелета. Полифукциональность соединительных тканей определяется сложностью их состава и организации. Для соединительной ткани характерно значительное количественное преобладание межклеточного вещества над клеточными элементами. Межклеточное вещество является, по существу, информационной системой, которая испытывает регулирующее воздействие со стороны клеток соединительной ткани, в свою очередь, оказывает такое же воздействие на них и на клеточные системы других тканей и органов [Поликар, Колле, 1966; Серое, Шехтер, 1981; Афанасьев и др., 1999]. Подобное взаимодействие основано, вероятно, на обратной связи, оно поддерживает гомеостаз в организме, регулирующий осуществление функций соединительной ткани и приспособительные изменения, возникающие при старении и патологических

и

процессах. Межклеточное вещество, несмотря на специфическую роль каждого из своих компонентов, при осуществлении основных функций выступает как единое целое, причём играет значительную, а иногда и ведущую роль.

Кровь - жидкая соединительная ткань, осуществляющая в организме транспорт веществ (в том числе кислорода), который обеспечивает протекание биохимических процессов в клетках и межклеточных пространствах различных тканей. Кроме того, кровь выполняет защитную, регуляторную, терморегуляторную, экскреторную и гомеостатическую. [Марри и др., 1993]. Кровь представляет собой коллоидно-полимерный раствор плазмы и взвешенных в ней форменных элементов: эритроцитов, лейкоцитов и тромбоцитов. Сыворотка крови представляет собой внеклеточный матрикс (ВКМ) этой ткани, а ее белки - являются компонентами ВКМ. Основными белками сыворотки крови являются альбумины и глобулины, фибриноген, а также фибронектин - один из основных компонентов ВКМ различных тканей. Белки сыворотки крови, выполняют важные функции, а именно: они способствуют поддержанию коллоидно-осмотического, водного, кислотно-основного, а также иммунного гомеостазов в организме; они участвуют в процессах свертывания крови; связываясь с различными веществами (липидами, аминокислотами, углеводами и др.), они обеспечивают строительным материалом клетки всего организма, а также участвуют в выводе из него метаболитов; они выполняют - основную функцию крови - перенос различных веществ, в том числе тех, с помощью которых организм защищается от воздействий окружающей среды или регулирует функции отдельных органов. К таким регуляторам гомеостаза в организме относятся многочисленные сигнальные молекулы. Сигнальные молекулы, секретируемые в организме, циркулируют и переносятся кровью. Это очень большая группа веществ, которая включает в себя гормоны, нейромедиаторы, цитокины [Марри и др., 1993; Ашмарин, Стукалов и др., 1996; Хаеинсон и др., 2003; Nicola, 1994]. В организме эти

вещества опосредуют межклеточные взаимодействия. Они осуществляют контроль над основными биологическими процессами, происходящими в различных тканях, со стороны трех важнейших систем организма: нервной, иммунной и эндокринной. В качестве примера таких молекул можно рассмотреть ряд аспектов биологического действия пептидов семейства инсулиноподобных ростовых факторов \Dulak, Тетт, 1973; РауеИс, Маф'еую, Кпегеук, 2007]. На примере последних можно рассмотреть состав и строение системы этих ростовых факторов. В её состав входят во-первых, пептидные гормоны - инсулиноподобные ростовые факторы типа 1 - ИПРФ-1 и типа 2 - ИПРФ-2, а также связывающие эти гормоны белки - ИПРФ-СБ 16; во-вторых, рецепторы клеточной поверхности - инсулиновый рецептор ИР (Ж) и рецепторы инсулиноподобных ростовых факторов типа 1 - ИПРФ-Р1 и типа 2 - ИПРФ-Р2.

ИПРФ являются митогенами, т.е. изменяют статус клеточной пролиферации, дифференцировки и влияют на апоптоз. Действие ИПРФ опосредовано через их рецепторы, которые запускают сигнальные каскады, регулирующие эти биологические процессы. Оба ИПРФ-фактора были выделены в 1970-е годы \Dulak, Тетт, 1973; ШпйегкпесЫ , НитЪе1, 1978]. Они представляют собой небольшие пептиды, состоящие из 70 (ИПРФ-1) и 67 (ИПРФ-2) аминокислотных остатка, и имеющие мол. массу около 7,5 кДа, они на 70% идентичны и на 50% схожи с проинсулином. ИПРФ-1 присутствуют в крови в высокой концентрации. Основным источником ИПРФ-1 в сыворотки крови является печень, но многие другие ткани синтезируют его и чувствительны к действию ИПРФ-1, особенно, в постнатальном развитии. Биосинтез ИПРФ-1 в печени регулируется ростовыми факторами и инсулином. Синтез ИПРФ-2 не зависит от действия этих сигнальных молекул и экспрессируется в основном в эмбриогенезе, нежели в постнатальном периоде [.РоПак, Зскегпкаттег, Напктзоп, 2004; РауеНс, МаН]еУ1С, Кпегеу'ю, 2007]. Он также действует как регуляторный пептид, являясь митогеном для ряда клеточных типов. Ген ИПРФ-2 может

экспрессироваться для выработки белков различной мол. массой. Самой активной формой в отношении связывания с ИПРФ-рецептором является 7,5 кДа. Пептид с большей мол. массой не обеспечивает достаточного посттранскрипционного деления клетки и вызывает гипогликимию, которая может сопровождать развитие ряда опухолей [Kiess et al., 1994].

Биологическое действие ИПРФ-1 и ИПРФ-2 осуществляется через аутокринный, паракринный и эндокринный регуляторные механизмы за счёт связывания двумя типами рецепторов клеточной поверхности ИПРФ-Р1 и ИПРФ-Р2, а также ИР. ИПРФ-1 и ИПРФ-2 связываются со своими рецепторами по-разному: например, ИПРФ-1 взаимодействует с ИПРФ-Р1 и с меньшим сродством с ИР, а ИПРФ-2 связывается с высоким сродством с ИПРФ-Р2, но с низким сродством - с ИПРФ-Р1 и не взаимодействует с ИР. Таким образом, биологическое действие ИПРФ-факторов, в основном, опосредовано через ИПРФ-Р1 [Pollak, Schernhammer, Hankinson, 2004], который, как и ИР, относится к группе тирозин-киназных рецепторов ростовых факторов. Он является гетеротетрамером, состоящим из двух а-(лигандсвязывающих) субъединиц и двух трансмембранных ß-субъединиц, которые содержат тирозин-киназный домен, который активирует рецептор фосфорилированием. Было установлено, что при развитии некоторых опухолей ИПРФ-2 взаимодействует именно с ИПРФ-Р1 [Kiess et al., 1994]. ИПРФ-Р2 структурно и функционально отличается от ИПРФ-Rl и представляет собой мономерный мембранный короткий гликопротеин с мол. массой 250 кДа, который содержит большой внеклеточный домен, связывающий маннозу-6-фосфат, лизосомальные ферменты и ИПРФ-2 [Kornfeld, 1992].

Как показано для многих цитокинов [Nicola, 1994], ИПРФ-связывающие белки, представляют собой семейство, состоящее из 6 белков (ИПРФ-СБ 1 - 6). Они обладают свойством связывать ИПРФ-1 и ИПРФ-2, присутствующих в сыворотке крови, а также в биологических жидкостях [Ricort, 2004; Lelbach, Muzes, Feher, 2005]. Гены ИПРФ-СБ человека

локализованы в разных хромосомах. ИПРФ-СБ имеют мол. массу около 30 кДа и простую доменную структуру, состоящую из цистеинбогатых N- и С-концевых доменов, соединённых гибким линкерным участком (L-домен). ИПРФ-связывающие сайты локализованы как на N-, так и на С-концевых доменах. N-домены ИПРФ-СБ связывают только ИПРФ, а С-концевые домены ИПРФ-СБ взаимодействуют со множеством молекул, которые могут модулировать ИПРФ-зависимую и -независимую активности. L-домен ИПРФ-СБ неконсервативен и не имеет выраженного сродства с ИПРФ. Деградация протеазами ИПРФ-СБ приводит к локальному увеличению концентрации ИПРФ, что способствует активации ИПРФ-Р1 [Lelbach, Muzes, Feher, 2005]. Результаты, полученные при исследовании системы инсулиноподобного ростового фактора, могут быть использованы при диагностики и терапии онкологических заболеваний [Yu, Rohan, 2000; Pavelic, Matijevic, Knezevic, 2007].

Изменение уровня тех или иных сигнальных молекул в кровотоке вызывает запуск различных биологических процессов в организме, в некоторых случаях необратимых. Таким образом, кровь, является основным информационным руслом организма, а сыворотка крови - матрицей, на которую записывается эта информация.

Костная ткань относится к скелетным тканям - специализированному типу соединительной ткани с высокой минерализацией межклеточного вещества, содержащего до 70% неорганических соединений, в основном фосфатов кальция. Клеточные элементы костной ткани представлены костным диффероном: стволовые, полустволовые клетки (преостеобласты), остеобласты (разновидность фибробластов), остеоциты (обеспечивают обменные процессы межклеточном веществе и поддерживают его целостность) и неотносящиеся к дифферону - остеокласты (разновидность макрофагов), развивающиеся из стволовых клеток крови [например, Афанасьев и др., 1999; Некачалов, 2000].

Межклеточное вещество - внеклеточный матрикс, костной ткани состоит из плотно упакованных коллагеновых волокон, на поверхности которых располагаются кристаллы гидроксиапатита, а также липидов и неколлагеновых белков. По сравнению с хрящевой тканью в нём содержится небольшое количество воды, хондроитинсерной кислоты, но много лимонной и других кислот, образующих комплексы с кальцием, а также большое количество микроэлементов, таких как медь, стронций, магний, цинк, барий, играющих важнейшую роль в метаболических процессах в организме. Образование межклеточного вещества и его обызвествление - результат деятельности костеобразующих клеток - остеобластов, которые по мере образования костной ткани внедряются в межклеточное вещество и превращаются в остеоциты. Костная ткань служит основным депо кальция в организме и активно участвует в кальциевом обмене. Высвобождение кальция достигается путём разрушения (резорбции), а его связывание -путём новообразования костной ткани. С этим связан процесс постоянной перестройки костной ткани, продолжающийся в течение всей жизни организма [например, Афанасьев и др., 1999; Некачалов, 2000].

Костная ткань животных и человека содержит ряд фосфорилированных сиалопротеинов. К ним относятся, например, костный сиалопротеин (КСП), остеопонтин (ОП) и др. Фрагмент КСП, образовавшийся в тканевом экстракте костной ткани после воздействия протеиназ, был впервые выделен и изучен в 1972 году [Herring, Bourne, 1972]. Позже, после введения ингибитора протеиназ в экстракт ткани кости, удалось выделить и изучить свойства всей молекулы этого белка [Oegema, Hascall, Dziewiatkowski, 1975]. Последующее клонирование и определение нуклеотидной последовательности кДНК КСП [Oldbarg, Franzen, Heinegars, 1988] позволило определить полную аминокислотную последовательность данного белка [Oldbarg, Franzen, Heinegars, 1988]. Применение экспериментальных подходов, разработанных на основе результатов исследования КСП и других сиалопротеинов, позволило далее идентифицировать другие белки кости,

которые проявляли способность влиять на адгезивные и пролиферативные свойства клеток этой ткани. Одним из таких белков является ОП.

ОП впервые был идентифицирован в костной ткани человека в 1985 году [Franzen, Heinegard, 1985]. ОП является секреторным фосфорилированным сиалопротеином с мол. массой около 32 кДа, который был обнаружен во многих тканях и обладал широким спектром тканевой локализации и биологической активности. Его секретируют остеобласты. ОП практически не был обнаружен в участках костного матрикса, которые контактируют с клеточной поверхностью остеокластов, т.е. в областях, где протекают процессы резорбции. Анализ аминокислотной последовательности ОП позволил установить наличие повторов, богатых аспарагиновой кислотой (которые, вероятно, придают ОП способность связываться с гидроксиапатитом) и трипептида Арг-Гли-Асп (RGD, особенно, в средней части молекулы), ответственного за адгезию клеток. Известно, что этот трипептид присутствует в структуре всех адгезивных молекул, компонентов ВКМ [Kreis, Vale, 1993]. Предполагается, что ОП участвует как в регуляции минерализации кости, так и в резорбции уже сформированного костного матрикса.

В процессах остеогенеза исключительно важную роль играют различные эффекторные молекулы - цитокины, молекулы адгезии, гормоны и др. К ним относятся семейство морфогенетических белков кости (МБК, вопе morphogenetic proteins - BMP), представляющих собой мультифункциональные ростовые факторы, принадлежащие к суперсемейству трансформирующего фактора роста. В последние годы биологическое действие МБК активно изучают [например, Chen, Zhao, Mundy, 2004; Bragdon et al., 2011]. Свыше 20 представителей семейства МБК обнаружены в организме человека. Они принимают активное участие в различных процессах, например, таких как формирование хрящевой и костной ткани, миогенез, гематопоэз и нейрогенез, особенно в эмбриогенезе [Mishina et al., 1995; Christiansen et al., 2000]. Хотя многие функции МБК

определены, но до сих пор остаются малоизученными многие аспекты их биорегуляции.

Впервые МБК были идентифицированы в 1960-х годах [Urist, 1965]. Они синтезируются как большие предшественники, насчитывающие 400 -500 аминокислотных остатка, состоящие из N-концевого сигнального пептида, регулирующего его секрецию, продомена для специфического фолдинга, а также С-концевого готового пептида [например, Bragdon et al., 2011]. Активные МБК состоят из 50 -100 аминокислотных остатка с семью остатками цистеина, 6 из которых образуют 3 внутримолекулярных дисульфидных связи, известные как «цистеиновые узлы». 7-ой остаток цистеина используется для димеризации с другим мономером с образованием ковалентной дисульфидной связи, так формируется биологически активная сигнальная молекула. Все МБК проявляют выраженную тенденцию к агрегации, образуют или гомодимеры или гетеродимеры.

МБК связываются с рецепторами 1-го и 2-го типов, взаимодействие с которыми иннициируют каскады внутриклеточных реакций [например, Chen, Zhao, Mundy, 2004; Bragdon etal., 2011].

МБК-рецепторы представляют собой серин/треонин-киназные рецепторы, состоящие из короткого внеклеточного домена с 10 - 12 остатками цистеина, одиночного трансмембранного домена и внутриклеточного серин/треонин-киназного домена. В передаче сигнала больше значение имеет фосфорилирование белков - транскрипционных факторов Smadl, 5 и 8. Далее происходит образование комплекса с Smad4, который затем переносится в ядро остеобласта и оказывает влияние на другие транскрипционные факторы. Передача сигнала через МБК-рецептор имеет важное значение для правильного остеогенеза в организме в течение всей жизни.

Далее рассмотрим результаты, полученные при исследовании группы мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов.

Мембранотропные гомеостатические тканеспецифические

биорегуляторы

Мембранотропные гомеостатические тканеспецифические

биорегуляторы (МГТБ) были обнаружены практически во всех тканях животных, причём не только млекопитающих, но и в тканях птиц, амфибий, а также и в растениях [Ямскова и др. 19776; Ямскова, Резникова, 1991; Краснов и др., 2003]. Эти биологически активные вещества были выделены в отдельную группу на основании общности проявляемых физико-химических свойств и характера биологического действия. Было установлено, МГТБ локализованы в межклеточном пространстве тканей, в СМД влияют на важные биологические процессы (адгезию, миграцию, пролиферацию, дифференцировку клеток), стимулируют восстановительные и репаративные процессы в патологически изменённых тканях. Активность МГТБ характеризуется отсутствием видовой, но наличием тканевой специфичности [Ямскова и др., 1977а; Ямскова и др., 19776; Ямскова, Резникова, 1991; Краснов, Григорян, Ямскова, 2003а; Краснов и др., 2005а; Маргасюк, Григорян, Ямскова, 20056; Борисенко, 2005]. Их исследование оказалось возможным благодаря разработке нового экспериментального подхода, сочетающего в себе методы выделения, очистки, изучение физико-химических свойств, а также метод их биотестирования и изучения специфической биологической активности [Вошепко & а!., 2007; Кгазпоу е1 а1, 2007; Ма^азуик et а1, 2007; Ыагагоуа а1, 2007]. В настоящем обзоре будут рассмотрены результаты исследования физико-химических свойств, состава и структуры, а также специфической активности МГТБ, выделенных из различных тканей млекопитающих.

1.1. Экспериментальный подход, разработанный для исследования

МГТБ

Выделение МГТБ и их последующая очистка

Все биорегуляторы данной группы, выделенные из различных тканей животных и растений, были получены по одной методике, включающей экстракцию МГТБ и их очистку, которую проводили с применением различных биохимических методов (высаливание, изоэлектрофокусирование, хроматография различных видов, электрофорез в ПААГ белков) [Ямскова и др., 19776; Ямскова, Резникова, 1991; Краснов и др., 2003а; Краснов и др., 20036; Маргасюк и др., 20056; Назарова и др., 2005; Назарова и др., 2006; Borisenko et al., 2007; Krasnov et al., 2007; Margasyuk et ah, 2007; Nazarova et ah, 2007; Борисенко и др., 2007]. Присутствие МГТБ на каждой стадии выделения оценивали с помощью метода биотестирования, основу которого составляет определение мембранотропной активности исследуемых биорегуляторов [Ямскова, Резникова, 1991]. Для изучения специфической активности МГТБ были разработаны оригинальные экспериментальные модели как in vitro, так и in vivo [Гундорова и др., 1997; Краснов, Григорян, Ямскова, 2003; Краснов и др., 2005; Краснов и др., 2005; Борисенко, 2005; Маргасюк, Григорян, Ямскова, 2005; Маргасюк и др., 2005; Назарова и др., 2005; Краснов и др., 2006].

Для выделения МГТБ были выбраны следующие условия: экстракция мелкоизмельчённых тканей животных или растений в Са2+-содержащем растворе Рингера при 4°С [Ямскова, Туманова, Логинов, 1990]. По данной методике выделения были исключены гомогенизация и ферментативная обработка ткани. Существенным фактором, определяющим переход биорегуляторов во внешнюю среду, является температура экстрагирующего раствора (4°С), при которой предполагается возможным фазовый переход надмолекулярных структур межклеточного пространства и их экстракция [Ямскова, Ямское, 1999]. Таким способом были получены тканевые экстракты, содержащие МГТБ, из печени, лёгкого, тонкого кишечника, различных тканей глаза, предстательной и молочной желёз млекопитающих.

Важнейшим этапом очистки МГТБ является фракционированирование тканевых экстрактов высаливанием белков в насыщенном растворе

сернокислого аммония. Было установлено, что при высаливании тканевого экстракта происходит отделение основной массы белков от фракции биорегуляторов, которые остаются в растворённом состоянии в насыщенном растворе соли [Ямскова, Резникова, 1991]. На этой стадии очистки происходит разделение между МГТБ и остальными примесными белками, входящих в состав тканевых экстрактов, сыворотки крови, молока и желчи: в условиях образования насыщенного раствора соли примесные белки осаждаются, а МГТБ переходят в надосадочную жидкость (супернатант) [Ямскова, Резникова, 1991; Назарова и др., 2006; Borisenko et al., 2007; Krasnov et al., 2007; Margasyuk et al., 2007; Nazarova et al., 2007; Борисенко и др., 2007]. Исключение составляют биорегуляторы, выделенные из тканей заднего отдела глаза, которые в этих условиях переходят в осадок [Краснов и др., 2003а; Ямскова и др., 2009]. Предполагается, что это связано с более высокой степенью сродства между МГТБ и взаимодействующими с ними белками в тканевом экстракте.

По способности МГТБ оставаться в растворенном состоянии в насыщенном растворе сульфата аммония их можно сравнить с белками семейства S100 [Moore, McGregor, 1965; Moore, 1982; Donato, 1986; Fano et al., 1995; Donato, 1999], которые впервые были обнаружены в мозге быка. К названной группе относятся кислые, Са2+-связывающие белки с молекулярной массой порядка 21 кДа; в их вторичной структуре отмечено наличие 40% а-спиралей, 30% ß-спиралей и 30% статистического клубка. Аминокислотный анализ белка, относящегося к семейству белков S100, выделенного из мозга быка, показал высокое содержание остатков дикарбоновых аминокислот - глутаминовой и аспарагиновой, присутствие остатков серосодержащих, ароматических аминокислот, в том числе, триптофана. В области С-конца у белков S100 обнаружен специфический аминокислотный мотив, получивший название EF-hand, с помощью которого белки этого семейства связывают ионы кальция. Белки S100 были обнаружены практически во всех тканях животных, в том числе и в

сыворотке крови. Однако, в отличие от МГТБ, белки 8100 не были обнаружены в тканях растений. В настоящее время идентифицировано не менее 19 белков семейства 8100. Для большей части представителей определена первичная структура. Согласно полученным результатам, белки 8100 являются фосфорилированными, не содержащими остатков углеводов, липидов, нуклеиновых кислот. Они являются Са -зависимыми регуляторами внутриклеточных процессов, активно участвуют в процессах клеточного деления, дифференцировки, гомеостаза ионов Са2+, в проведении внутриклеточного регуляторного сигнала запрограммированной смерти клетки (апоптоза), обнаруживаются в сыворотке крови при различных патологических процессах. В литературе отсутствуют данные исследования дозовой зависимости биологического действия белков 8100, в том числе, данные о проявлении белками 8100 биологической активности в СМД. Следует отметить, что МГТБ тоже являются Са2+- связывающими белками, причём их константа связывания с ионами Са2+ выше, чем у кальмодулина [Краснов и др., 2003а]. Аминокислотный состав МГТБ также характеризуется большим количеством остатков дикарбоновых кислот, серина, глицина, но практически полным отсутствием остатков ароматических аминокислот. И, тем не менее, сравнивая МГТБ с белками 8100, их можно с уверенностью отнести к разным группам биорегуляторов, так как результаты исследования двух групп белков, несмотря на некоторые сходные свойства, имеют принципиальные различия. Белки 8100 являются термолабильными, негликозилированными, содержат полипептидную цепь с молекулярной массой 23-26 кДа.

Длительное время следующей стадией очистки МГТБ было разделение супернатантов тканевых экстрактов, сыворотки крови, молока и желчи методом изоэлектрофокусирования (ИЭФ) [Ямскоеа, Резникова, 1991; Маргасюк и др., 20056; Назарова и др., 2005; ВопБепко е/ а1, 2007; Кгаэпоу & а1, 2007; Margasyuket а1, 2007; Иагагоуа & а!., 2007; Борисенко и др., 2007]. МГТБ были обнаружены в нескольких ИЭФ-фракциях: кислых белков со

значением рН < 3,0; фракциях, собранных в интервалах рН 4,5-5,1 и рН 6,8 - 7,2, а также основных белков со значением рН > 9,0. В ряде случаев при разделении супернатантов тканевых экстрактов ИЭФ-фракции слабокислых, нейтральных и основных белков не были обнаружены. Наиболее подробно были изучены ИЭФ-фракции кислых белков, содержащие МГТБ, поскольку они более представлены количественно по сравнению с остальными белковыми фракциями. Исключением явилось фракционирование супернатанта молока, когда была обнаружена единственная фракция -фракция слабокислых белков со значением рН 4,5 - 5,1 [Назарова и др., 2006; N azar ova et al., 2007]. Следует отметить, что при разделении супернатанта сыворотки крови млекопитающих изначально была идентифицирована ИЭФ-фракция слабокислых белков, содержащая МГТБ, поэтому она и была наиболее подробно изучена [Ямскова, Резникова, 1991]. Несмотря на то, что все ИЭФ-фракции, содержащие МГТБ, обладали мембранотропной активностью, по специфической биологической активности данные фракции различались. Например, при исследовании биорегуляторов, выделенных из ткани нейральной сетчатки и ПЭ глаза быка, было показано, что только фракция кислых белков сетчатки оказывала выраженное протекторное действие на нейроны сетчатки и клетки Мюллера, а фракция основных белков ПЭ эффективно действовала на адгезию между нейральной сетчаткой и ПЭ и ингибировала пролиферацию пигментированных клеток сетчатки [Краснов, Григорян, Ямскова, 2003]. При исследовании фракций кислых и основных белков, выделенных из супернатанта экстракта тимуса млекопитающих, было отмечено, что эти фракции принципиально различались по действию на отдельные фракции Т-лимфоцитов: фракция кислых белков оказывала влияние на Th2 (Т-хелперы типа 2), а фракция основных белков - на Thl (Т-хелперы типа 1) [Казанский и др., 2000]. Следовательно, фракция кислых белков тимуса препятствовала процессам, идущим по аутоиммунному механизму, а фракция основных белков стимулировала процессы клеточного иммунитета, обеспечивающих

антибактериальную, противовирусную и противоопухолевую защиту организма. Подобное проявление противоположного действия наблюдали для ИЭФ-фракций кислых и основных белков, выделенных из супернатанта желчи [Борисенко и др., 2006]. Было показано, что фракция кислых белков желчи способствовала стабилизации состояния коллоидных частиц желчных кислот и уменьшению образовавшихся камней в желчном пузыре, в то время как, фракция основных белков желчи вызывала взаимодействие частиц желчи и их укрупнение. ИЭФ-фракция кислых белков, содержащая МГТБ, выделенная из поджелудочной железы, обладала протекторным действием в эксперименте острого панкреатита и диабета второго рода, в случае фракции основных белков такого эффекта не было отмечено [Гримов, Ямскова, Ямское, 2005].

В настоящее время сложно объяснить различное действие отдельных ИЭФ-фракций МГТБ: очевидно, это связано с недостатком знаний об их составе и структуре.

Полученные после ИЭФ МГТБ-фракции исследовали на предмет их гомогенности с помощью электрофореза в полиакршамидном геле (ПААГ) и обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Кроме того, с помощью этих методов удалось осуществить дополнительную очистку биорегуляторов данной группы.

Методом электрофореза в ПААГ для биорегуляторов данной группы было установлено, что биологически активной является фракция, которая характеризовалась исключительно высокой электрофоретической подвижностью (ИТ 0,9-1,0) [Маргасюк и др., 20056; Назарова и др., 2005; Вошепко ег а1, 2007; Кгазпоч et а1, 2007; Ма^аБуик а1, 2007; Ыагагоуа & а1, 2007; Борисенко и др., 2007]. Такую картину разделения наблюдали при ПААГ-электрофорезе различных ИЭФ-фракций, содержащих МГТБ. Например, значение «кажущейся» молекулярной массы, для пептида, выделенного ПААГ-электрофорезом из ИЭФ-фракции экстракта хрусталика глаза быка, составляло менее 3 к Да \Krasnov & а1, 2007], а для пептида,

полученного после обращённо-фазовой ВЭЖХ ИЭФ-фракции кислых белков сетчатки глаза быка - 6-8 кДа [Красное и др., 2003а].

Таким образом, было показано, что биологически активной компонентой МГТБ являются пептиды с молекулярной массой не более 10 кДа. Но, кроме них, в состав МГТБ входят другие белки, углеводы, липиды (см. раздел 1.2).

Наиболее эффективным способом очистки МГТБ оказался метод обращённо-фазовой ВЭЖХ в градиенте вода-ацетонитрил [Маргасюк и др., 20056; Назарова и др., 2005; Borisenko et al., 2007; Krasnov et al., 2007; Margasyuk et at, 2007; Nazarova et at, 2007; Борисенко и др., 2007].

Для наилучшего разделения пептидов были подобраны следующие условия: обращённо-фазовую ВЭЖХ проводили на жидкостном хроматографе высокого давления, используя колонки С8 или С18, а в качестве элюента применяли смесь ацетонитрила с 0,1% трифторуксусной кислотой, которую подавали на колонку в виде градиента ацетонитрила от 5% до 80%. Детекцию белковых фракций осуществляли при 210 и 280 нм. Было установлено, что пептиды, входящие в состав МГТБ, элюируются при низкой концентрации ацетонитрила [Borisenko et at, 2007; Krasnov et at, 2007; Margasyuk et at, 2007; Nazarova et al., 2007].

При выделении и на каждой стадии очистки, а также на различных этапах исследования МГТБ, проводили оценку их мембранотропной активности, используя оригинальный адгезиометрический метод [Ямскова, Резникова, 1991].

Метод биотестирования

Метод биотестирования был специально разработан для идентификации биорегуляторов данной группы [Ямскова, Туманова, Логинов, 1990; Ямскова, Резникова, 1991]. Он является ключевым звеном экспериментального подхода, поскольку с его помощью можно определить присутствие биорегуляторов во фракциях белков, полученных в процессе

очистки, а также изучить дозовую зависимость их активности \Borisenko е/ а1, 2007; Кгаточ et а1, 2007; Ма^азуик е/ а1, 2007; Ыагагоуа ег а1, 2007].

Известно, что воздействие молекул адгезии (например, их взаимодействие в качестве лигандов с рецепторами поверхности клетки) вызывает изменение пространственной организации макроструктуры клеточного микроокружения, которое выражается в соответствующем изменении вязкоупругих свойств ткани. Надмолекулярные структуры, образованные белками и полисахаридами внеклеточного матрикса, взаимодействующие через универсальные рецепторы плазматической мембраны (ПМ) - интегрины с компонентами цитоскелета, образуют в ткани единую систему, основная функция которой заключается в регуляции процессов межклеточного узнавания, клеточной дифференцировки, сигнальной трансдукции и морфогенеза \Streuli & ей., 1993; Таке'юЫ, 1995; Воис1геаи, ЫязеП, 1998; ТакежЫ, 1998].

Таким образом, с помощью оценки вязкоупругих свойств ткани можно характеризовать состояние макроструктуры клеточного микроокружения и определить вклад отдельных, входящих в его состав, белков.

Авторы данного метода объясняют механизм, который лежит в основе метода биотестирования, следующим образом. Метод основан на экспериментальной оценке параметра, характеризующего вязкоупругие свойства ткани. В условиях стандартного деформационного воздействия на ткань печени часть клеток может остаться целыми, а часть - разрушиться с выделением клеточных ядер. Очевидно, что количество выделившихся целых клеток и клеточных ядер будет определяться вязкоупругими свойствами ПМ, макромолекулярных структур межклеточного пространства, состоянием цитоплазмы и цитоскелета клетки. ПМ является структурой, вязкоупругие свойства которой постоянно изменяются за счет непрерывно протекающих лигандо-рецепторных взаимодействий. При увеличении вязкоупругих свойств ПМ, которое достигается, например, при воздействии биорегуляторов, в условиях сдвиговой деформации значительное количество

клеток, подобно упругим шарикам, может «проскользнуть» в пространстве зазора дезинтегратора без разрыва ПМ клетки. Напротив, при уменьшении вязкоупругих свойств ПМ, после дезинтеграции фрагмента ткани количество целых клеток значительно снижается из-за их разрушения как шариков с жесткими оболочками, а количество выделившихся клеточных ядер соответственно увеличивается [Маленков, Модянова, Ямскова, 1977; Ямскова, Резникова, 1991]. Результаты исследования мембранотропного действия биорегуляторов данной группы свидетельствуют об их способности в СМД изменять проницаемость ПМ клеток млекопитающих. Это было показно, например, при изучении проницаемости меченого лейцина через ПМ гепатоцитов крысы [Ямскова и др., 1994].

Для мембранотропной активности биорегуляторов данной группы характерен полимодальный тип дозовой зависимости: причем всегда отмечается присутствие экстремумов в области СМД [Ямскова, Резникова, 1991; Краснов и др., 20036].

Из-за нелинейного характера дозовой зависимости МГТБ не представляется возможным применить понятие единицы активности для оценки их активности. В данном случае представляется более удобным оценивать интервал разбавлений изучаемой фракции биорегулятора, при котором проявляется ее мембранотропная активность: чем более «сдвигается» интервал концентраций, в которых проявляется активность препарата, в область СМД, тем более она активна, тем выше концентрация в ней МГТБ. Однако, в этом аспекте, следует отметить следующее: активность биологически активных пептидов, входящих в МГТБ, по мере очистки могла увеличиваться, а в отдельных случаях, наоборот, - уменьшаться. Как показали результаты исследования МГТБ, выделенных из тканей глаза, на активность пептидов оказывают влияние другие белки, входящие в состав биорегуляторов - белки-модуляторы [Скрипникова и др., 2008; Ямскова и др., 2008] (см. раздел 1.2).

Следует отметить, что способность МГТБ влиять на ПМ клеток была продемонстрирована при исследовании, проведённом на модели демиелинизации нервного волокна лягушки Rana temporaria in vivo и in vitro [Максимов и др., 2000]. Результаты этой работы показали, что биорегуляторы, выделенные из различных тканей, проявляли мембранотропное действие в СМД на этой экспериментальной модели.

При исследованиях, проведённых с помощью метода биотестирования, было установлено, что мембранотропная активность МГТБ проявлялась только в условиях сохранения целостности структуры межклеточного пространства ткани [Ямскова, Туманова, Логинов, 1990; Ямскова и д., 1994]. Например, было показано полное отсутствие мембранотропного действия биорегуляторов на моделях суспензионных культур гепатоцитов, а также органной культуры печени млекопитающих, предварительно перфузированной физиологическим раствором [Ямскова, Туманова, Логинов, 1990; Ямскова и др., 1994]. Эти результаты исследований были использованы при разработке экспериментальных моделей для изучения активности МГТБ.

Биологическая активность МГТБ

Первые эксперименты, в которых изучали специфическую активность МГТБ, были проведены с биорегулятором, выделенным из сыворотки крови крупного рогатого скота (КРС) [Буеверова и др., 1985]. Авторы изучали влияние данного биорегулятора на рост и клонирование трансформированных клеток млекопитающих (фибробластов) при культивировании in vitro. Было показано, что биорегулятор, выделенный из сыворотки крови, в СМД стимулировал пролиферацию, адгезию, усиливал клоногенность этих клеток. Однако долгое время для остальных МГТБ не удавалось подобрать соответствующие экспериментальные модели клеточных культур. Поэтому были предприняты попытки изучить действие биорегуляторов данной группы в экспериментах in vivo. Например, биорегулятор, выделенный из сыворотки крови КРС был изучен на модели

экспериментальной травмы глаза у кролика in vivo [Гундорова и др., 1997]. В этом исследовании было продемонстрировано выраженное ранозаживляющее действие данного биорегулятора в СМД. Позже, на аналогичной модели - экспериментального разреза в роговице глаза тритона in vivo, методом авторадиографии было исследовано ранозаживляющее свойство биорегулятора, выделенного из роговицы глаза быка [Маргасюк и др., 20056; Маргасюк, Григорян, Ямскова, 2005; Маргасюк и др., 2005]. Было установлено, что исследуемый биорегулятор стимулирует пролиферацию клеток эпителия роговицы глаза тритона. Было отмечено, что при сравнительной оценке значений параметра ИМЯ, полученных в секторах роговицы, через которые проходил разрез, и которые разрез не затрагивал, между ними не было обнаружено достоверных отличий. Авторы предположили, что процессы заживления поврежденной роговицы происходят в ткани достаточно широко, формируя поле репарации вне области прямого повреждения. Это предположение согласуется с концепцией морфогенетических полей [Гилберт, Опиц, Рэф, 1997; Beloussov, 2001] и связанных с ними полей регенерации [Chiang, Robinson, Vanable, 1992; Robinson, Messerli, 2003].

В других экспериментах, проведённых в условиях in vivo, также удалось продемонстрировать специфическую активность некоторых биорегуляторов группы МГТБ [Казанский и др., 2000; Гримов, Ямскова, Ямское, 2005; Борисенко и др., 2006; Неверкович, 2000]. При использовании экспериментальных моделей in vivo были выявлены условия, при которых проявлялась специфическая активность МГТБ, а именно: сохранение в ткани адгезионных взаимодействий между клетками, а также целостности ультраструктур межклеточных контактов [Ямскова, Туманова, Логинов, 1990; Ямскова и др., 1994; Туманова, Попова, Ямскова, 1996]. Поэтому, оптимальной моделью для изучения биологического действия МГТБ в условиях in vitro является органотипическое культивирование тканей позвоночных животных.

Одной из таких экспериментальных моделей in vitro стала культура заднего отдела глаза тритона, с сохранением адгезионных взаимодействий между сетчаткой, ПЭ, хороидом и склерой [Краснов, Григорян, Ямскова, 2003]. В этой работе исследовали специфическую активность двух биорегуляторов, выделенных, соответственно, из тканей нейральной сетчатки и пигментного эпителия глаза быка. В контрольных сериях на 3-й - 4-й день культивирования наблюдали развитие деструктивных процессов, особенно, отмечалось нарушение целостности монослоя ПЭ и статуса дифференцировки эпителиальных клеток. В сетчатке наблюдалась массовая деградация нейронов различных типов, нарушение адгезии в области интерфоторецепторного матрикса (ИФМ).

Добавление в СМД в среду культивирования биорегулятора, выделенного из сетчатки глаза быка, способствовало сохранению пространственной организации этой ткани и ее адгезии с ПЭ в ИФМ, а также увеличению жизнеспособности нейронов по сравнению с контролем.

При воздействии в СМД биорегулятора, выделенного из ПЭ глаза быка, наблюдали стабилизацию адгезии и дифференцировки пигментных клеток. Биорегулятор проявлял протекторное свойство, выражающееся в достоверном увеличении жизнеспособности биполяров нейральной сетчатки in vitro.

Важно отметить, что в данном исследовании было установлено, что биорегуляторы, выделенные из тканей, имеющих общее происхождение, связанных в онтогенезе метаболитически и контактирующих между собой, оказывают влияние на жизнеспособность, адгезионные свойства клеток различных типов этих тканей, т.е. их активность характеризуется наличием тканевой специфичности.

В дальнейшем, на культурах отдельных тканей глаза, а также целого глаза позвоночных in vitro, удалось оценить специфичность действия МГТБ, выделенных из различных тканей глаза.

Например, исследование активности биорегулятора, выделенного из хрусталика глаза быка, проводили на культурах целых хрусталиков глаз различных позвоночных животных, инициируя катарактогенез веществами, оказывающими повреждающее действие на хрусталик [Краснов и др., 2005]. Были использованы растворы хлорида кальция, пероксида водорода и дистиллированная вода, так как они способствуют образованию катаракты различных видов, которые часто встречаются у человека [Копаева, 2002]. Было показано, что биорегулятор, выделеннный из хрусталика, в СМД препятствовал развитию катарактогенеза как у амфибий (лягушки Xenopus laevis), так и у млекопитающих (крысы Wistar и быка) на моделях in vitro.

Но наиболее результативными оказались исследования специфической активности биорегуляторов данной группы на моделях при роллерном способе органотипического культивирования тканей in vitro. Впервые роллерное клеточное культивирование было предпринято в 50-60-е годы XX века на клетках сетчатки глаза куриных эмбрионов [Moscona, 1961; Moscona, 1963; Moscona, 1968]. Исследование проводили на суспензии одиночных клеток. При роллерном культивировании, взаимодействуя друг с другом, клетки сетчатки образовывали ассоциаты сферической формы (сфероиды), которые, в свою очередь, образовывали более крупные агрегаты клеток [Moscona, 1961], приэтом не происходило адгезионного взаимодействия с поверхностью флакона.

Метод органотипического роллерного культивирования тканей менее распространен по сравнению с методом роллерного клеточного культивирования. Он был впервые использован при культивировании ткани эмбриональной сетчатки млекопитающих для биотестирования ряда цитокинов [Victorov, Lyjin, Aleksandrova, 2001]. Позже данный экспериментальный подход был применен при культивировании сетчатки взрослых тритонов с целью исследования ее регенераторных потенций [Григорян и др., 2005]. Было показано, что в данных условиях культивирования происходит накопление малодифференцированных клеток,

которые активно пролиферируют и могут быть отнесены к клеточным источникам регенерации в этой ткани. Таким образом, было установлено, что в условиях отсутствия адгезионного сигнала со стороны подложки в ткани развиваются процессы дедифферецировки клеток, клеточной миграции и пролиферации. Данный метод является эффективным для исследования клеточных источников регенерации в тканях у взрослых особей, по крайней мере, у низших позвоночных. В этой связи, необходимо отметить, что ткани амфибий, по сравнению с тканями млекопитающих, имеют высокие потенции к регенерации, выдерживают большие сроки культивирования, сохраняя жизнеспособность клеток в условиях in vitro. Для их культивирования не требуется введение в питательную среду различных биологически активных веществ, которые могут повлиять на активность биорегуляторов.

Поскольку активность МГТБ характеризуется отсутствием видовой, но наличием тканевой специфичности [.Ямскова, Резникова, 1991; Краснов, Григорян, Ямскова, 2003; Маргасюк, Григорян, Ямскова, 2005; Назарова и др., 2005; Борисенко, 2005], эксперименты были проведены, в основном, на органных культурах тканей хвостатых амфибий (тритон Pleurodeles waltl).

Используя роллерный способ культивирования, было изучено действие в СМД биорегуляторов данной группы, выделенных из различных тканей млекопитающих, в том числе тканей глаза, а также некоторых желез и их секретов [Краснов, Григорян, Ямскова, 2003; Назарова, 2006; Борисенко и др., 2006]. Эти исследования проводили на культурах соответствующих тканей тритона, крысы и мыши.

На модели органотипического культивирования предстательной железы мыши in vitro была изучена специфическая активность биорегулятора, выделенного из ткани предстательной железы быка [Назарова, 2006]. При вращении в роллере культивировали отдельно половинки простат мыши в течение 24 часов. В контроле в ткани железы наблюдали значительную гибель клеток секреторного эпителия и отсутствие

выработки секрета. Тем не менее, ткань оставалась жизнеспособной (особенно в краевых зонах): сохранялась структура отдельных желез и протоков. При воздействии в СМД биорегулятора, выделенного из предстательной железы, наблюдали совершенно иную картину: в ткани происходила активная выработка секрета. Отмечалась стимуляция биорегулятором секреторной функции эпителиальных клеток простаты: она оказалась настолько интенсивной, что приводила к истощению и гибели секреторных клеток в условиях органного культивирования железы in vitro. Таким образом, применение данного метода способствовало выявлению такого свойства биорегулятора, выделенного из предстательной железы, как стимуляция секреторной функции клеток простаты.

На органной культуре печени тритона было изучено специфическое действие МГТБ, выделенных из печени и желчи быка [Борисенко и др., 2006]. Было показано, что только при роллерном способе культивирования ткани биорегулятор, выделенный из печени, способствовал увеличению площади кластеров меланомакрофагов печени тритона - аналоги клеток Купфера печени млекопитающих, но в то же время угнетал пролиферативную активность клеток кроветворения в краевой зоне по сравнению с контролем. Влияние биорегулятора, выделенного из желчи, выражалось в уменьшении площади кластеров пигментированных клеток и в ингибировании пролиферативной активности кроветворных клеток в краевой зоне, по сравнению с контролем. Полученные результаты показывают, что данные биорегуляторы несмотря на то, что источником их биосинтеза является печень, представляют собой разные вещества, которые различным образом влияют на клетки печени хвостаттых амфибий.

Таким образом, в этих исследованиях было продемонстрировано тканевоспецифическое действие МГТБ.

Исследование биорегулятора, выделенного из склеры глаза быка, было проведено с применением 3-х новых экспериментальных моделей in vitro: роллерного культивирования ткани склеры, культуры заднего отдела глаза, а

также впервые проведённого роллерного культивирования целого глаза тритона [Ямскова и др., 2010].

На модели органоспецифического культивирования заднего отдела глаза тритона in vitro было показано, что на 7-е сутки в культурах контрольной группы наблюдали картину развития дегенеративных процессов: во всех тканях заднего отдела глаза отмечали нарушения адгезионных межклеточных взаимодействий между склерой и сосудистой оболочкой, а также между клетками и волокнами коллагена в ткани склеры. В сетчатке наблюдалась картина полной деградации клеток, деструкция сосудистой оболочки и ПЭ. В склере было отмечено присутствие фибробластов с нехарактерными для этих клеток ядрами неправильной округлой формы, т.е. в ткани происходило развитие процессов деградации (кариорексис). Вокруг деградирующих фибробластов наблюдали образование пустот за счет деструкции волокон коллагена.

При добавлении в среду культивирования биорегулятора, выделенного из склеры глаза быка в СМД, соответствующей концентрации 10"9 мг/мл, сохранялась пространственная организация тканей заднего отдела глаза. Имела место адгезия между сосудистой и склеральной оболочками, причем в пределах хороида отмечали отсутствие пустот, по сравнению с контролем. Адгезивные взаимодействия и статус дифференцировки в ПЭ сохранялись: пигмент был распределен в клетках равномерно. В склере наблюдали более компактное и плотное расположение волокон, с менее заметными расслоениями, чем в культурах контрольной серии. Фибробласты в склере также выглядели жизнеспособными, судя по морфологии их ядер; кроме того, их было больше приблизительно в два раза, чем в культурах контрольной группы.

При исследовании биорегулятора склеры на модели роллерного культивирования ткани склеры in vitro наблюдали ее деструкцию, как в опытных культурах, так и в контрольной серии. Происходило выселение и гибель клеточных элементов из ткани. Однако отмечали более плотное и

упорядоченное состояние коллагеновых волокон в культурах опытной группы по сравнению с контрольной.

Наиболее выраженным протекторное действие биорегулятора, выделенного из склеры глаза, было на модели роллерного культивирования целого глаза тритона in vitro. В контрольной серии наблюдали нарушение адгезионных взаимодействий между тканями заднего отдела глаза, несмотря на сохранение их пространственной организации. Наблюдали гибель основных типов клеток в сетчатке, нарушалась целостность монослоя ПЭ -можно было обнаружить только одиночные меланофаги. В ростовой зоне глаза наблюдали большое количество новообразованных дедифференцированных клеток, которые смещались в область погибающей сетчатки и замещали фоторецепторные клетки и нейроны высших порядков. В склеральной оболочке наблюдали практически полную гибель и выселение фибробластов. В культурах контрольной и опытной серий в роговице отмечали гибель клеток эпителиального пласта. В культурах опытной серии (при воздействии биорегулятора в СМД) можно отметить сохранение адгезионных взаимодействий между тканями заднего сектора. В склере наблюдали присутствие жизнеспособных фибробластов, количество которых было больше приблизительно в 5 раз, по сравнению с контролем, и более плотную, упорядоченную организацию коллагеновых волокон.

Полученные данные показывают, что модель стационарного (на фильтрах) органотипического культивирования склеры в составе заднего отдела глаза, а также модель роллерного культивирования целого глаза тритона PI. waltl оказались наиболее эффективными для изучения специфического действия биорегулятора склеры. На данных экспериментальных моделях удалось выявить протекторное действие биорегулятора, которое выражалось в увеличении жизнеспособности фибробластов склеры, поддержании пространственной организации коллагеновых волокон. Кроме того, была продемонстрирована способность биорегулятора, выделенного из склеры, поддерживать адгезию между

тканями заднего отдела глаза, стимулировать статус клеточной дифференцировки ПЭ.

Важное биологическое действие МГТБ было выявлено при разработке экспериментальных моделей для исследования специфического действия биорегулятора, выделенного из роговицы глаза быка. Культивировали роговицы животных с разной способностью к регенерации - тритона Pleurodeles waltl и крысы линии Wistar. Были разработаны две принципиально различающиеся модели культивирования целых роговиц глаз позвоночных in vitro: роллерная и стационарная (на подложке) [Маргасюк, Григорян, Ямскова, 2005; Маргасюк и др., 20056; Margasyuk et al., 2007]. Следует отметить, что роговица является уникальным объектом исследования клеточного резервного отдела в системах in vitro. Исследование лимба - области, расположенной на границе роговицы и склеры - как источника клеток, участвующих в возобновлении и регенерации слоев роговицы была показана в начале 1970-х годов [Davanger, Evenson, 1971; Cotsarelis et al., 1989]. Исследование веществ, оказывающих влияние на прогениторные клетки области лимба, является актуальным направлением современных биологических исследований. В зависимости от способа выделения роговицы из глаза (с сохранением области лимба или без данной области), роговица сохраняет либо один (только базальный слой эпителия роговицы), либо два (базальные слои эпителия лимба и роговицы) клеточных источника регенерации. В связи с этим в этом эксперименте для культивирования использовали роговицы с сохраненной областью лимба или без данной области. Таким образом, в этой работе была исследована роль основного клеточного источника регенерации роговицы - лимба.

В данном исследовании во флаконы опытных серий добавляли

биорегулятор, выделенный из роговицы глаза быка, в СМД,

12

соответствующей концентрации 10" мг белка/мл; в контроле в культуральную среду биорегулятор не добавляли. Для оценки состояния

роговицы морфометрически оценивали относительную толщину эпителия и стромы.

В результате проведенного исследования было сделано несколько важных выводов. Во-первых, было показано, что в отличие от культивирования на подложке (наличие адгезионного сигнала), роллерный тип культивирования роговицы глаза амфибий способствует активации клеток резервного отдела, но не имеет того же эффекта при действии на роговицу глаза крысы.

Во-вторых, у амфибий влияние биорегулятора выражалось в стимуляции как недифференцированных клеточных источников регенерации - клеток лимба, так и более дифференцированных тканевых прогениторных клеток - клеток базального слоя.

В-третьих, в условиях роллерного культивирования роговиц глаза крысы биорегулятор не оказывал влияния на клеточные источники регенерации ткани (клетки лимба), но действовал на клетки базального слоя роговицы, интенсифицируя их переход в дифференцированные эпителиальные клетки. Таким образом, роллерное органное культивирование роговицы глаза тритона является принципиально новой моделью, позволяющей изучать клеточный резервный отдел роговицы, а также влияние различных факторов, в том числе, биологически активных веществ, на его состояние. Эти данные полностью согласуются с выводами, сделанными авторами исследования нейральной сетчатки глаза тритона в условиях длительного роллерного культивирования [„Григорян и др., 2005].

Анализируя результаты проведенных исследований, можно заключить, что активность МГТБ проявляется в поддержании жизнеспособности клеток и цитоархитектоники ткани. Кроме того, в этих работах была продемонстрирована способность МГТБ стимулировать восстановительные и репаративные процессы в тканях, из которых были выделены изучаемые биорегуляторы. Следует также отметить, что своё специфическое действие эти биорегуляторы проявляют в СМД, что указывает на существование в

тканях позвоночных животных ранее не изученного механизма проведения регуляторного сигнала, в котором важнейшая роль отводится биологическим жидкостям, а вода является матрицей для передачи информации [Ямскова, Ямское, 1999].

Важным моментом при разработке экспериментального подхода к исследованию МГТБ явилось установление локализации данных биорегуляторов в тканях позвоночных животных, т.к. это исследование позволило бы понять механизм действия МГТБ.

Локализация МГТБ в тканях позвоночных животных

Исследование локализации МГТБ в ткани проводили с помощью методов иммуногистохимии. Поликлональные антисыворотки получали по методу Гослинга путем иммунизации кроликов фракциями биорегуляторов, очищенных после изоэлектрофокусирования [Gosling, 2000]. Молодых кроликов иммунизировали многократно и часто небольшими объемами концентрированных растворов соответствующих фракций биорегуляторов. Только при таком способе иммунизации удалось получить поликлональные сыворотки к ряду биорегуляторов данной группы. Локализацию МГТБ изучали в тканях крысы и тритона, используя иммуногистохимическую реакцию с использованием вторичных FITC-конъюгированных антител.

Например, было установлено, что биорегулятор, выделенный из роговицы глаза быка, располагается в межклеточном пространстве эндотелия и эпителия как в роговице глаза тритона, так и глаза крысы [Маргасюк и др., 2005].

В этом же исследовании было показано, что в роговицах глаз этих видов позвоночных после культивирования в течение 4 суток наблюдалось значительное увеличение интенсивности специфической

иммунофлуоресценции в межклеточном пространстве эпителия и эндотелия, по сравнению с интактной тканью. Причем усиление интенсивности иммунофлуоресценции в межклеточном пространстве эпителия существенно

превосходило таковое в межклеточном пространстве эндотелия. Эти данные указывают на увеличение содержания биорегулятора в межклеточном пространстве эпителия роговицы после культивирования, которое может быть связано с работой защитного механизма, направленного на поддержание целостности и сохранения функции ткани. Эти данные согласуются с представлениями о возможном механизме биологического действия биорегулятора, выделенного из роговицы, который был изложен выше.

Биорегулятор, выделенный из сетчатки глаза быка, был обнаружен иммуногистохимическим способом на поверхности отростков фоторецепторов сетчатки. Причем, в этом исследовании также было показано, что идентификация биорегулятора в ткани осуществлялась только после длительного культивирования сетчатки [Ямскова, Краснов, Ямское, 2009].

При исследовании локализации биорегулятора, выделенного из печени крысы, было показано, что он локализуется в области синусоида печени \Borisenko е? а1, 2007].

Для биорегулятора, выделенного из коровьего молока, было установлено, что он имел пристеночную локализацию, а также обнаруживался во внутреннем просвете протока лактирующей молочной железы крысы [Назарова, 2005]. Аналогичную пристеночную локализацию в протоках железы имел биорегулятор, выделенный из предстательной железы быка. Данные, полученные при исследовании локализации биорегуляторов, выделенных из молока коровы и из предстательной железы быка, в соответствующих тканях, позволили авторам предположить, что исследуемые биорегуляторы являются секретируемыми белками и входят в качестве возможных биологически активных факторов в состав соответствующих секретов \Nazarova & а1, 2007].

Таким образом, результаты проведенных исследований показывают, что МГТБ локализованы в межклеточном пространстве тканей, которые

являлись источником их выделения. Эти результаты согласуются с данными, свидетельствующими о проявлении биорегуляторами данной группы мембранотропной и адгезионной активности [Ямскова, Туманова, Логинов, 1990; Вопяепко а а1, 2007; Кгаэпоу et а1, 2007; Ма^аяуик et а1, 2007; Ыагагоуа & а1, 2007].

Результаты, полученные в процессе очистки МГТБ, показали, что они имеют сложное строение и обладают своеобразными физико-химическими свойствами, которые будут рассмотрены в следующем разделе.

1.2 Физико-химические свойства и строение МГТБ

Полученные на сегодняшний день результаты указывают на сложный состав МГТБ. Например, для биорегуляторов, выделенных, соответственно, из ткани предстательной железы и молока КРС, методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) было показано присутствие белковой, углеводной и липидной компонент в их составе [Ыагагоуа а а1, 2007]. В свою очередь, в состав белковой компоненты входят небольшие пептиды (мол. масса не более 5 кДа), которые оказывают биологическое действие, и белки, модулирующие их активность (белки-модуляторы) [Скрипникова и др., 2008; Ямскова и др., 2008]. Белковая компонента ответственна за проявление активности биорегуляторов данной группы [Ямскова и др., 2009].

МГТБ представляют собой вещества, устойчивые к воздействию различных физико-химических факторов: температуре (активность биорегуляторов не изменяется после нагревания до 100°С в течение 10 мин, а также после многократной процедуры «размораживание-оттаивание»), к воздействию хелатирующих агентов и органических растворителей, длительному пребыванию в деионизированной среде, изменению рН раствора в диапазоне от 3,0 до 10,0 [Ямскова, Резникова, 1991; Ямскова и др., 2008].

Методом кругового дихроизма (КД) было показано, что вторичная структура пептидно-белковой компоненты МГТБ характеризуется

российская государственная библиотека

преимущественным содержанием ß-структур и статистического клубка и малым содержанием a-спиралей. Исследование третичной структуры молекул МГТБ с помощью метода дифференциальной сканирующей калориметрии показало отсутствие на кривых эндотермических пиков, характеризующих кооперативный переход третичной структуры глобулярных белков. Следовательно, МГТБ не являются глобулярными белками, а их молекулы отличаются исключительной конформационной подвижностью. На это также указывают данные аминокислотного анализа, показывающие значительное количество остатков глицина, которые обеспечивают шарнирную подвижность полипептидной цепи [Ямскова, Краснов, Ямское, 2012]. Таким образом, третичная структура МГТБ описывается в терминах "расплавленной глобулы".

Аминокислотный анализ пептидно-белковой компоненты биорегуляторов данной группы показал, что помимо значительного количества остатков глицина, они содержат также остатки серина и дикарбоновых аминокислот, и практически не содержат остатков ароматических аминокислот [,Ямскова и др., 1977а; Ямскова и др., 19776; Ямскова, Резникова, 1991]. Подобный аминокислотный состав характерен для углеводсодержащих белков - гликопротеинов [Kreis, Vale, 1993; Степанов, 1996].

Данные углеводного анализа ИЭФ-фракций биорегуляторов показали, что в их состав входит углеводная компонента, представленная N-олигоманнозидными цепями, содержащими остатки маннозы и N-ацетилглюкозамина. Не исключено, что N-олигоманнозидная цепь принадлежит пептидам: методом аффинной хроматографии было показано, что именно пептидная компонента взаимодействовала с иммобилизованным на сефарозе 4В конканавалином А [Ямскова и др., 2009]. Тем не менее, в настоящее время углеводная компонента МГТБ остаётся не изученной.

Следует отметить, что в состав биорегуляторов данной группы входят ионы Ca 2+. С помощью метода равновесного микродиализа было показано,

что МГТБ, выделенные из тканей глаза быка, имеют высокое сродство к ионам Са2+, которое превышает таковое у других Са2+-связывающих белков [Краснов и др., 2003а].

Методами динамического лазерного светорассеяния и атомно-силовой микроскопии (АСМ) было установлено, что МГТБ в водных растворах присутствуют в виде наноразмерных частиц [Borisenko et al., 2007; Margasyuk et al., 2007; Nazarova et al., 2007].

Как известно, при высоких концентрациях в растворе все белки могут образовывать наноразмерные частицы, но обычно этот размер соответствует приблизительно 10 нм [Armstrong et al., 2004; Cui et al., 2004]. Результаты этих исследований показали также отсутствие корреляционной зависимости между значением молекулярного веса, концентрацией белка в растворе и его тенденцией к образованию межмолекулярных ассоциатов и их размерами.

В случае же биорегуляторов группы МГТБ в растворах низких концентраций (100 мкг/мл) наблюдается образование достаточно больших частиц (-50-200 нм) [Borisenko et al., 2007; Margasyuk et al., 2007; Nazarova et al., 2007]. Вероятно, как предположили авторы [Ямскова и др., 2009], наноразмерное состояние биорегуляторов данной группы определяет их свойство действовать в СМД, хотя этот вопрос в настоящее время ещё остается открытым. Из литературных данных известно, что после перевода аморфного в наноразмерное состояние вещества приобретают ряд новых свойств, например, сверхтекучести, сверхпроводимости [Глезер, 2002]. Получение «наноматериалов» с помощью соответствующих технологий является одной из актуальных задач современной науки, привлекающей вниманием специалистов из различных областей.

Наноразмерное состояние МГТБ обусловливает проявление ими другого важного свойства - влияния на структуру воды в растворах. Было установлено, что все МГТБ проявляют биологическое действие не только в СМД, но и в «мнимых» растворах, которые получали последовательным 10-тикратным разбавлением раствора биорегулятора с концентрацией 0,1 мг

белка/мл, достигая, таким образом, разбавления в Ю50 раз. Например, в состоянии «мнимого» раствора биорегулятор, выделенный из пигментного эпителия сетчатки глаза быка, проявлял активность в течение нескольких дней, а также после нагревания до 100°С в течение 20 мин, или облучения УВЧ (мощность 700 Вт, частота 2450 МГц, расстояние от излучателя до объекта облучения 6-22 см, 2 мин). Активность биорегулятора полностью исчезала после воздействия ультразвуком (100Вт, частота 20кГц, 5 мин) [Ямскова и др., 2008]. Эти данные указывают на образование под действием МГТБ определенных структур воды, которые проявляют биологическую активность, свойственную данным биорегуляторам.

Например, для МГТБ, выделенного из сыворотки крови, методом ИК-спектроскопии было изучено изменение характера водородных связей между молекулами воды в его присутствии [Ямское и др., 1999; Ямскова, Краснов, Ямское, 2012]. Измеряли ИК-спектры воды, входящей в состав растворов

9 22

данного биорегулятора в концентрациях соответствующих 10" -10" мг белка/мл, измерение проводили на фурье-спектрометре в области 4000-1200 см"1 с расширением 2 см"1. Важно отметить, что к внутренним колебаниям мономерной молекулы воды относят интенсивную несимметричную ИК-полосу в области 3400 см"1 (симметричное и антисимметричные валентные колебания ОН), а также симметричную полосу при 1645 см"1 (деформационное колебание НОН) [Юхнееич, 1973]. В рассматриваемой области спектра присутствует также довольно широкая полоса с максимумом около 2120 см"1, которая обычно интерпретируется как составной тон деформационного колебания с одним или несколькими межмолекулярными колебаниями. Широкую интенсивную полосу в спектре воды около 680 см"1 обычно относят к либрационной моде осцилляции мономера Н20 в поле соседних молекул, более слабую полосу 200 см"1 соответственно относят к затрудненному трансляционному колебанию решетки воды. Обнаружено, что структура воды в жидкой фазе представляет собой сетку сильно деформированных случайных водородных связей, слегка напоминающую

существующую в кристалле льда. Диффузия в такой системе представляет собой не прыжковый процесс, а является скорее следствием непрерывного коллективного движения. Интерпретировали полосу 200 см"1 в спектре воды как связанную со скоррелированным туннелированием протона в многоминимумном потенциале ут. Это предположение подтверждается заметным различием нормированных полуширин в спектре воды: для внутренних колебаний величина у^/у в области 3400см"1 и 1645 см"1 составляет соответственно 10% и 5%, в то время как для полосы 200 см"1 эта величина равна 60%.

Для лучшего понимания характера влияния сывороточного биорегулятора в сверхмалых дозах на структурное состояние воды были изучены ИК-спектры воды бытовой и дважды перегнанной, с добавлением сывороточного биорегулятора, 1%-го раствора БСА, насыщающих концентраций КаС1 (для оценки влияния заряда), а также смеси этанол-вода в соотношении объемов 6:4.

При добавлении ЫаС1 к дважды перегнанной воде максимум 3400 см"1 смещается к 3408 см"1. Увеличение частоты на 8 см"1 свидетельствует об усилении внутримолекулярной связи. В то же время значение максимума полосы поглощения 2100 см"1 уменьшается на 18 см"1, что позволяет предположить ослабление межмолекулярных связей. Добавление №С1 в чистый этанол не вызывает изменений в спектре. По-видимому, это связано с тем, что в силу своего химического строения молекулы этанола не способны образовывать макроструктуры, подобные существующим в воде [НОН]п.

Влияние сывороточного биорегулятора на воду нельзя объяснить электростатическим воздействием, так как если при добавлении КаС1 в воду наблюдаются сдвиги полос в области 3400 и 2100 см"1, то в случае сывороточного биорегулятора подобных спектральных изменений не обнаружено.

Для подтверждения высказанной гипотезы были измерены ИК-спектры поглощения в области трансляционных колебаний ут (600 - 50 см"1) для всех взятых образцов

Оказалось, что полоса в области 200 см"1, характеризующая наличие водородных связей в структуре воды, в спектрах растворов сывороточного

9 22

биорегулятора в малых и сверхмалых дозах (10" - 10" М) смещается по сравнению со спектром «чистой» воды (ут = 196 см"1 для дважды перегнанной воды, = 200 см"1 для бытовой воды) в область более низких частот до 186 см"1, т. е. приближается к полосе, характерной для 40%-го раствора этанола (л>т =176 см"1). Низкое значение ут для спиртового раствора объясняется отсутствием поперечных сшивок молекул воды, образованию которых препятствуют С2Н5-группы этанола. Напротив, молекулы альбумина, благодаря своей разветвленной структуре, инициируют как продольное, так и поперечное сшивание молекул воды, что выражается в закономерном повышении ут до 208 см"1.

Поскольку спектр вещества, в данном случае воды, зависит от наличия примесей, то разброс максимумов полос ут от 176 см"1 (вода - этанол) до 208 см"1 (раствор БСА) подтверждает предположение об образовании различных молекулярных структур воды в присутствии примесей.

Таким образом, в данной работе впервые было представлено доказательство изменения состояния воды под влиянием сверхмалых доз вещества - биорегулятора данной группы, выделенного из сыворотки крови.

Также для сывороточного биорегулятора методом молекулярного флуктуационного светорассеяния были измерены спектры серии разбавленных растворов [Ямское и др., 1999; Ямскоеа, Красное, Ямское, 2012]. Измерения проводили с помощью флуктуационного спектрометра АГЛС ЭДАС-1, регистрировали рассеянный свет в режиме гомодинирования (смешение пучков рассеянного на образце света от двух точек кюветы) под углом 90°, с наложением на образец постоянного магнитного поля напряженностью 280 А/м и предварительным освещением образца

когерентным ИК-излучением с длиной волны 890 нм; накопление интенсивности рассеянного света осуществляли в течение 3 мин с шагом интегрирования 5 мс. Далее по временным рядам зарегистрированных значений интенсивности рассеянного света методом фурье-преобразования вычисляли спектральные характеристики: спектральную плотность мощности и спектральную дисперсию в частотном диапазоне 0,35-5 Гц. Для полученных спектральных характеристик рассчитывали их производные и интегралы.

Было установлено, что по мере разбавления раствора сывороточного биорегулятора наблюдается увеличение отклонения интегралов обеих характеристик - плотности спектральной мощности и спектральной дисперсии - от значений интегралов для чистого растворителя (дистиллированной воды). Эти зависимости имеют три экстремума, равные или превышающие значения интегралов спектральных характеристик для чистого растворителя и соответствующие растворам сывороточного биорегулятора с концентрациями 10"8 - Ю"10 М; 10'18 М и 10"26 М. По спектральным характеристикам исследованные растворы сывороточного биорегулятора в интервале концентраций 10"4 - 10"28 М четко разделялись на две группы. В первую группу входят растворы, для которых значения интегралов превосходят или равны интегралам для чистой воды, это растворы с концентрациями 10"4, 10"6, 10"8, Ю"10, 10'18 и 10'26 М. Они имеют высокие начальные значения производной в широкой области частот, что свидетельствует о быстрой релаксации спектра с узкой областью низких частот. Для второй группы растворов сывороточного биорегулятора с концентрациями 10"12, 10"14, 10"16, 10"22, 10"24 и 10"28 М характерны низкие значения производной с узкой начальной зоной и широкой областью плавного снижения ее величины, что свидетельствует о большом наборе частот с мало различающимся уровнем плотности спектральной мощности.

Полученные результаты показывают, что процедура разбавления раствора сывороточного биорегулятора до сверхмалых концентраций

вещества вплоть до получения «мнимых растворов» приводит к существенному изменению физических свойств растворителя вследствие значительного изменения структурного состояния воды. Причем разбавление имеет нелинейную зависимость состояния параметров воды от концентрации.

Характеристики для второй группы значений концентраций растворов свидетельствуют о боле высокой по сравнению с первой группой растворов скорости процессов ассоциирования-диссоциирования оптических неоднородностей (водных ассоциатов). Эти результаты подтверждают ранее полученные данные о том, что многократное разбавление приводит к увеличению времен жизни свободных ОН-групп в воде, т.е. к росту скоростей процессов ассоциирования-диссоциирования.

Рассмотренные зоны значений концентраций с пониженным уровнем ассоциирования чередуются с зонами, характеризующимися повышенным уровнем ассоциирования (первая группа концентраций растворов). Таким образом, показано, что изменение значений интегралов параметров светорассеяния имеют колебательный характер в зависимости от концентрации сывороточного биорегулятора. Подобную картину имеет и вид дозовой зависимости при исследовании мембранотропной активности биорегуляторов группы МГТБ, по мнению авторов это связано с явлением постоянного изменения состояния молекул воды, которое описывается не только в терминах ассоциация-диссоциация. И, наверное, с этим обстоятельством связано также отсутствие прямой корреляции между величинами биологического эффекта растворов биорегуляторов и параметрами их светорассеяния.

При исследовании теплоемкости водных растворов биорегулятора, выделенного из сыворотки крови, также было установлено изменение свойств растворителя [Ямское и др., 1999; Ямскова, Краснов, Ямское, 2012].

Для понимания механизма наблюдаемых биологических эффектов, в начале изучали температурную зависимость теплоемкости растворов

сывороточного биорегулятора как важнейшую термодинамическую характеристику растворов, которая дает информацию не только о состоянии вещества в растворе, но и об изменении состояния растворителя при воздействии вещества.

Измерение температурной зависимости избыточной теплоемкости водных растворов сывороточного биорегулятора (по отношению к воде) проводили на дифференциальном сканирующем микрокалориметре в интервале температур 290 - 380 К, при скорости сканирования температуры 2 град/мин и избыточном давлении 0,49 МПа. Шкалу теплоемкостей калибровали по эффекту Джоуля-Ленца и дополнительно корректировали, используя в качестве калориметрического стандарта водный раствор метанола (измеренная парциальная молярная теплоемкость раствора метанола при 298 К составила 153,2 Дж/(моль-К)).

Удельную теплоемкость Ср растворов сывороточного биорегулятора рассчитывали по формуле:Ср = Cpi (V/Vi) - (ACp/m), где Cpi - удельная теплоемкость воды, Дж/(г-К), V и Vi - удельный объем водных растворов сывороточного биорегулятора и воды соответственно, мг/г; ДСР - измеренная разность теплоемкостей между водой и водным раствором сывороточного биорегулятора, Дж/(г-К), m - масса сывороточного биорегулятора в ячейке калориметра, г.

Парциальный удельный объем для сывороточного биорегулятора был рассчитан по аддитивной схеме, исходя из данных о его составе и значений парциальных удельных объемов аминокислотных и углеводных остатков, он составил 0,67 мл/г.

Было установлено, что термограммы водных растворов сывороточного биорегулятора не содержат эндотермических пиков, характерных для термической денатурации биополимеров, в частности белков, во всем исследуемом температурном интервале, что свидетельствует, по-видимому, о развернутом состоянии молекулы сывороточного биорегулятора. С учетом этого обстоятельства была вычислена удельная теплоемкость раствора

сывороточного биорегулятора по аддитивной схеме с использованием данных по парциальным удельным теплоемкостям аминокислотных остатков и экспериментально измеренной теплоемкости гликозидной части сывороточного биорегулятора. Это значение составило 1,8 Дж/(г-К). Экспериментальное же значение Ср (калориметрическое измерение величины АСР и вычисление по приведенной выше формуле) для раствора сывороточного биорегулятора при концентрации 120 мкг/мл оказалось равным 0,74±0,04 Дж/(г-К), что в 2,5 раза меньше теоретического значения. Более того, экспериментальное значение удельной теплоемкости сывороточного биорегулятора оказалось меньше Ср, определенной для компактных глобулярных белков, 1,3 Дж/(г-К), а также для белков с развернутой формой молекулы в растворе, 1,8-2,1 Дж/(г-К), к которым можно отнести сывороточный биорегулятор. Известно, что теплоемкость растворенного в воде вещества состоит из двух составляющих: собственной теплоемкости вещества и теплоемкости его гидратации. Первая величина имеет положительное значение, теплоемкость гидратации неполярных групп веществ также положительна, а гидрофильных - отрицательна. Это относится, в частности, к белкам и к другим биополимерам. Авторы предположили [Ямское и др., 1999], что более низкое значение экспериментальной теплоемкости Ср для сывороточного биорегулятора, по сравнению с расчетом, обусловлено необычно сильным влиянием гидрофильных групп молекул сывороточного биорегулятора на воду.

Авторы предположили [Ямское и др., 1999], что сывороточный биорегулятор в растворах присутствует преимущественно в виде молекулярных ассоциатов значительной молекулярной массы, в связи с этим, следовало ожидать, что снижение концентрации сывороточного биорегулятора в растворе должно привести к диссоциации крупных межмолекулярных агрегатов сывороточного биорегулятора на более мелкие с образованием значительных количеств мономерной формы этого белка. И как следствие, должно возрасти влияние молекул сывороточного

биорегулятора на состояние его раствора при концентрации 1,2 мкг/мл: ДСР = -3125 Дж/(г-К). Это значение далеко выходит за рамки значений удельных теплоемкостей водорастворимых веществ. Авторы считают, что единственно возможным объяснением полученных ими экспериментальных данных является представление об изменении структуры воды в результате воздействия малых доз сывороточного биорегулятора (1,2 мкг/мл соответствует 10"7 М). Если отнести измеренное при концентрации 1,2 мкг/мл значение Ср не к сывороточному биорегулятору, а к воде, находящейся в ячейке калориметра, то в таком случае разность теплоемкостей между обычной водой и водой в растворе сывороточного биорегулятора будет равна 0,071 Дж /(г-К) (при 298 К). Полученный результат показывает, что «новое» состояние воды не особенно отличается по теплоемкости от обычной воды, 75,161 Дж/(г-К), а наблюдаемая разность теплоемкостей значительно меньше, чем, например, таковая при переходе «жидкая вода-лед», где различия достигают двукратной величины. По мнению авторов, наблюдаемое снижение теплоемкости воды в присутствии сывороточного биорегулятора, по сравнению с обычной водой, связано с переходом ее межмолекулярных ассоциатов в более упорядоченное состояние.

В этих работах были впервые представлены экспериментально полученные данные, которые показали влияние эндогенных биолологически активных веществ на состояние воды. Таким образом, можно предположить участие биорегуляторов данной группы в процессах передачи регуляторного сигнала в живых системах.

Заключение по литературному обзору

Несмотря на присутствие в сыворотке крови большого количества сигнальных молекул, осуществляющих межклеточные взаимодействия, группа МГТБ имеет некоторое своеобразие в проявлении биологического действия. Представляется, что данная группа биологически активных веществ действует на повреждённые и патологически изменённые ткани, восстанавливает их за счёт влияния на клеточные источники регенерации.

Эта функция реализуется на уровне органо-тканевого гомеостаза, поскольку биологическое действие МГТБ характеризуется наличием тканевой, но отсутствием видовой специфичности.

Биорегуляторы данной группы характеризуются сложным составом. Они содержат пептиды, которые могут быть связаны с олигоманнозидной цепью, и являются биологически активной компонентой МГТБ. В составе биорегуляторов присутствуют также белки-модуляторы, углеводы, липиды и ионы Са2+. Вероятно, МГТБ в таком комплексном состоянии присутствуют в водных растворах в виде наночастиц. Исключительная резистентность данных биорегуляторов к различным физико-химическим факторам и их локализация в межклеточном пространстве обуславливает их постоянное присутствие в нём, а не выработку в ответ на какое-либо воздействие. Экспериментально полученные результаты по влиянию МГТБ на состояние воды, указывают на то, что важнейшей функцией биорегуляторов данной группы является не только поддержание адгезивных взаимодействий между клетками, но и изменение структуры воды биологических жидкостей, которая исполняет роль матрицы в процессах передачи регуляторного сигнала, распространяемого в тканях организма.

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Рыбакова, Елена Юрьевна

Выводы

1. Из костной ткани млекопитающих впервые был выделен и очищен биорегулятор, в составе которого были обнаружены пептид с мол. массой 4301±2 Да и белок с мол. массой 66000-67000 Да.

2. С помощью КД-спектроскопии показано, что вторичные структуры белковых компонент биорегуляторов, выделенных из костной ткани и сыворотки крови, в растворе сходны и характеризуются преимущественным содержанием ^-структур (57 - 61,6%) и участков статистического клубка (32 - 33%). По данным лазерного динамического светорассеяния, изучаемые МГТБ, присутствуют в растворах в виде наноразмерных частиц (55,8 - 87,7 нм).

3. Показано, что белковая компонента сывороточного биорегулятора, ответственная за проявление им биологической активности, содержит гликопептиды и ранее не изученный белок, гомологичный преальбумину быка, взаимодействие с которым приводит к образованию неактивного комплекса по механизму углевод-белкового узнавания.

4. Впервые разработана новая экспериментальная модель роллерного культивирования кожи тритона in vitro, при использовании которой было изучено биологическое действие двух фракций сывороточного биорегулятора, различающихся по составу. Обе фракции сывороточного биорегулятора способствовали сохранению структуры ткани, а также увеличению жизнеспособности соединительнотканных элементов кожи.

5. На экспериментальной модели кожной раны у мыши in vivo показано, что обе фракции сывороточного биорегулятора стимулировали репаративные процессы в ране, способствовали восстановлению структуры ткани.

6. Впервые разработана новая экспериментальная модель роллерного культивирования регенератов хвостов амфибий in vitro, при использовании которой была изучена специфичность биологического действия двух фракций сывороточного биорегулятора, а также фракции биорегулятора, выделенного из кости крыс.

7. На данной экспериментальной модели было показано, что обе фракции

11 13 сывороточного биорегулятора в СМД (соответствующей 10" - 10" мг белка) способствовали сохранению структуры всех тканей регенерата, а фракция биорегулятора, выделенного из костной ткани, в СМД (соответствующей 10"14 мг белка) оказывала протекторное действие на хрящевую ткань, т.е. проявляла тканеспецифическую активность.

8. Показано, что действие исследуемых биорегуляторов в более высоких дозах (10"4 - 10"8 мг белка) принципиально различаются, а именно: сывороточный биорегулятор, оказывал морфогенетическое действие на состояние всех тканей регенерата хвоста тритона; биорегулятор, выделенный из костной ткани, проявлял протекторное свойство в отношении тканей регенерата, но не оказывал влияния на хрящевую ткань.

Заключение

Полученные нами результаты по исследованию биорегуляторов, выделенных из сыворотки крови и костной ткани, принадлежащих к группе МГТБ, а именно: устойчивость к действию различных физико-химических факторов, тенденция к образованию межмолекулярных ассоциатов, влияние на структуру воды, межклеточная локализация, а также характер их биологического действия - стимулирование восстановительных процессов в патологически изменённых тканях, предполагают их определённую функцию в организме. Эти, имеющие сложный состав, наноразмерные структуры, собирающиеся по принципу самосборки, в начале образуются по механизму углевод-белкового взаимодействия, очевидно, определяет тканеспецифический характер биологического действия биорегулятора данной группы. Обнаруженная способность МГТБ проявлять биологическую активность в СМД и в «мнимых» растворах, на наш взгляд, подтверждает их свойство эффективно влиять на структуру воды, как это было установлено в экспериментах, выполненных с помощью физико-химических методов (см. глава 1, раздел 1.2).

Результаты по роллерному культивированию показали, что кроме тканеспецифического действия биорегулятора, выделенного из костной ткани, на развитие хрящевой ткани, отмечается протекторное действие обоих биорегуляторов на ткани регенерата в целом. Очевидно, это связано с воздействием данных биорегуляторов на клеточные источники регенерации. Особенно это было продемонстрировано на модели кожной раны, где показана дополнительная активация клеточных источников регенерации, локализованных на границе раны. Биорегулятор, выделенный из сыворотки крови, способствовал развитию репарации с восстановлением гистоструктуры кожи, приэтом происходило блокирование репарации раны с образованием соединительнотканного рубца. Очевидно, это связано с тем, что МГТБ определяют прохождение информационного сигнала к клеточным источникам регенерации со стороны организма, т.е. они определяют влияние микроокружения ниши на стволовые клетки, передавая через микроокружение команду к клеточным источникам регенерации. Таким образом, МГТБ подавляют другой механизм репарации, протекающий через образование фиброзного рубца. МГТБ как биорегуляторы гомеостаза направляют выбор механизма репарации в ткани. Именно эта функция делает группу МГТБ отличной от других регуляторов, которые осуществляют межклеточные взаимодействия, передавая сигналы от одних клеток к другим. МГТБ являются истинными настройщиками гомеостаза в живых организмах.

Важнейшими вопросами, на сегодняшний день, остаются следующие: происхождение биологически активных пептидов, входящих в состав биорегуляторов данной группы; изучение свойств белков-модуляторов; исследование механизмов, лежащих в основе самосборки наноразмерных частиц в растворах биорегуляторов, продолжительности их существования в межклеточном пространстве и их дальнейшей судьбы. Решение этих вопросов станет предметом исследований в будущем.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Рыбакова, Елена Юрьевна, 2012 год

Список литературы.

1. Афанасьев Ю.И., Юрина H.A., Котовский Е.Ф. и др. II Гистология: Учебник / Афанасьев Ю.И., Юрина H.A., Котовский Е.Ф. и др.; Под ред. Афанасьева Ю.И., Юриной H.A. - М.: Медицина, 1999. - 744 е., ил.

2. Ашмарин И.П., Стукалов П.В. и др. // Нейрохимия: Учебник для биологических и медицинских ВУЗов / Ашмарин И.П., Стукалов П.В. и др.; Под ред. акад. РАМН Ашмарина И.П. и проф. Стукалова П.В. - М.: Изд-во Института биомедицинской химии РАМН, 1996. - 470 с.

3. Бабаева А.Г.П Регенерация: факты и перспективы / Бабаева А.Г. -М.: Издательство РАМН, 2009. - 336 с.

4. Борисенко A.B. Влияние регуляторного белка, выделенного из печени крыс, на состояние ткани печени тритона Pleurodeles waltl при органном культивировании in vitro II Сборник тезисов «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты». 2005. С. 17-18

5. Борисенко A.B. Изучение тканевой специфичности биологической активности регуляторных белков // Онтогенез. 2005. Т. 36. № 3. С. 230231

6. Борисенко A.B., Благодатских И.В., Березин Б.Б., Краюхина М.А., Липницкий Е.М., Лычников Д.С., Рубашникова Е.В., Ямскова В.П., Ямское H.A. Биологически активные в сверхмалых дозах регуляторные пептиды, выделенные из печени, сыворотки крови и желчи млекопитающих // Сборник тезисов IV Международного Конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине». СПб. 2006. С. 70.

7. Борисенко A.B., Ямскова В. П., Благодатских КВ., Березин Б.Б., Краюхина М.А., Ямское H.A. Идентификация регуляторных белков, биологически активных в сверхмалых дозах, и исследование их физико-химических свойств // Биологические мембраны. 2007. Т. 24. №3. С. 227233

8. Буевероеа Э.И., Брагина Е.В., Резникова М.М., Ямскова В.П., Хрущов Н.Г. Действие адгезионного фактора сыворотки крови на пролиферацию клеток млекопитающих in vitro // ДАН СССР. 1985. Т. 281. №1. С. 158-160

9. Бурлакова Е.Б., Конрадов A.A., Худяков И.В. Воздействие химических агентов в сверхмалых дозах на биологические объекты // Изв. РАН, серия биол. 1990. № 2. С.184-193

10. Бурлакова Е.Б., Конрадов A.A., Мальцева ЕЖ. Сверхслабые взаимодействия химических соединений и физических факторов на биосистемы // Биофизика. 2004. Т. 49. №. 3. С. 551-564

11. Вашман A.A., Пронин КС. Ядерная магнитная релаксационная спектроскопия, М.:«Энергоатомиздат». 1986. С. 245

12. Воронцова М.А., Лиознер Л.Д., Маркелова КВ., Пухалъская Е.Ч.Н Тритон и аксолотль / Под общей ред. М.А. Воронцовой. - М.: Изд. «Советская наука», 1952. - 296 с.

13. Гилберт С.Ф., Опиц Д.М., Рэф P.A. Новый синтез эволюционной биологии и биологии развития // Онтогенез. 1997. Т. 28. № 5. С. 325 - 343.

14. Глезер A.M. Аморфные и нанокристаллические структуры: сходства, различия, взаимные переходы // Рос. Хим. Журн., 2002, Т. XLVI,№5, С. 57-63.

15. Григорян Э.Н., Краснов М.С., Алейникова КС., Поплинская В.А., Миташов В.И. Ротационное культивирование изолированной сетчатки тритона как способ получения малодифференцированных, пролиферирующих клеток in vitro // ДАН. 2005. Т. 405. № 4. С. 566-570.

16. Гримов Д.С., Ямскова В.П., Ямское И. А. Идентификация биологически активных в сверхмалых дозах регуляторных белков, выделенных их щитовидной и поджелудочной желез млекопитающих //В кн.: труды V ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН - ВУЗЫ. Москва. 2005. С. 77-83

17. Гундорова P.A., Хорошшова-Маслова И.П., Ченцова Е.В., Платовская Л.В., Ямскова В.П., Романова И.Ю. Применение адгелона в лечении проникающих ранений роговицы в эксперименте // Вопросы офтальмологии. 1997. Т. 113. №2. С. 12-15

18. Казанский Д.Б., Анфалова Т.В., Хромых Л.М., Силаева Ю.Ю., Ямскова В.П., Ямское И.А. Регуляция иммунитета Т-лимфоцитами: роль низкомолекулярных адгезивных гликопротеинов тимуса // Онтогенез. 2000. Т. 31. №4. С. 276-278

19. Карлсон Б.М.П Регенерация: проблемы биологии развития / Карлсон Б.М. - М.: «Наука», 1986. - 212 с.

20. Краснов М.С., Григорян Э.Н, Ямскова В.П. Модель органотипического культивирования сетчатки вместе с тканями заднего сектора глаза тритона для изучения действия адгезивных гликопротеинов // Изв. Акад. Наук. Серия биологическая. 2003а. № 1. С. 22-36

21. Краснов М.С., Григорян Э.Н., Ямскова В.П., Богуславский Д.В., Ямское И.А. Регуляторные белки тканей глаза позвоночных // Радиционная биология и радиоэкология. 2003. №3. С. 265-268

22. Краснов М.С., Маргасюк Д.В., Ямское И.А., Ямскова В.П. Действие новых регуляторных белков из растений в сверхмалых дозах // Радиционная биология и радиоэкология. 2003. № 3. С. 269 - 272

23. Краснов М.С., Гурмизов Е.П., Гундорова P.A., Ямскова В.П., Капитонов Ю.А. Модель катарактогенеза позвоночных животных in vitro // Офтальмология. 2005. Т. 2. №2. С. 43-49

24. Краснов М.С., Гурмизов Е.П., Ямскова В.П., Гундорова P.A., Ямское И.А. Исследование влияния регуляторного белка, выделенного из хрусталика глаза быка, на катарактогенез у крыс in vitro // Вестник офтальмологии. 2005а. Т. 121. № 1. С. 37-39

25. Краснов М.С., Ямскова В.П., Гурмизов Е.П., Григорян Э.Н., Маргасюк ДВ. Модели органотипического культивирования тканей глаза in vitro для тестирования регуляторных молекул // Сборник научных

трудов Ш Международной научной конференции "Факторы экспериментальной эволюции организмов". Алушта. К.: Логос. 2006. Т. 3. С. 590-595

26. Копаева В.Г.Н Глазные болезни: Учебник / Под ред. В.Г. Копаевой. - М.: Медицина, 2002. - 560 с.

27. Лахтин В.М., Ямское И.А. Лектины в исследовании рецепторов. // Успехи химии. 1991. т. 60. вып. 8. С. 1777 - 1816.

28. Максимов Г.В., Ямскова В.П., Лазарева Е.С., Ямское И.А. Действие сверхмалых доз адгезивных белков из мозга и сетчатки глаза млекопитающих на проведение возбуждения при демиелинизации нервного волокна // Онтогенез. 2000. Т. 31. №4. С. 277-278

29. Маленков А.Г., Модянова Е.А., Ямскова В.П. Тканевоспецифические адгезионные факторы - G1 кейлоны // БиофизикаЛ977. Т. 22. С. 156-157

30. Маргасюк Д.В., Краснов М.С., Ямскова В.П., Ямское И.А. Биологически активный в сверхмалых дозах регуляторный белок, выделенный из роговицы глаза быка: влияние на состояние роговицы крысы в условиях культивирования in vitro // Труды V ежегодной международной молодежной конференции ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика». Москва. 2005. С. 197-207

31. Маргасюк Д.В., Краснов М.С., Ямскова В.П., Григорян Э.Н., Ямское И.А. Исследование регуляторного белка, выделенного из роговицы глаза быка: выделение, очистка, локализация в ткани и биологическая активность // Офтальмология. 20056. Т. 2. №3. С. 81-87

32. Маргасюк Д.В., Григорян Э.Н., Ямскова В.П. Исследование влияния на клеточную пролиферацию в роговице глаза тритона адгезивного белка, выделенного из роговицы глаза быка // Изв. РАН Сер. Биол. 2005а. № 6. С. 738-743

33. Марри Р., Греннер Д., Мейес П., Родуэлл В.// Биохимия человека: В 2-х томах. Пер. с англ.: - М.: Мир, 1993. - 384 е., ил., 415 е., ил.

34. Назарова П.А. Исследование регуляторных белков, выделенных из молока крупного рогатого скота: физико-химические свойства и локализация в ткани лактирующей молочной железы крысы Тезисы докладов XIV школы «Актуальные проблемы биологии развития и биотехнологии» // Онтогенез. 2005. т. 36. № 5. С. 385-386

35. Назарова П.А., Ямскова В.П., Краснов М.С., Ямское H.A. Исследование регуляторного белка, выделенного из предстательной железы быка // ДАН. 2005. Т. 405. №5. С. 708-710

36. Назарова П.А. Изучение регуляторных белков, выделенных из тканей желез млекопитающих и их секретов (предстательная, молочная железы, молоко): физико-химические свойства и локализация в ткани. Тезисы докладов конференции молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН // Онтогенез. 2006. Т. 37. №4. С. 235-236

37. Назарова П. А., Краснов М.С., Ямскова В.П., Ямское И. А. Регуляторный белок, выделенный из молока крупного рогатого скота // Прикладная биохимия и микробиология. 2006. Т. 42. №5. С. 529-533

38. Неверкович A.C. Оценка препарата адгелона при лечении повреждений суставного хряща// Онтогенез. 2000. Т. 31. № 4. С. 282-283

39. Некачалов В.В. II Патология костей и суставов. Руководство / Некачалов В.В. - СПб.: Сотис, 2000. - 298 е., ил.

40. Остерман JI.A.// Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами / Остерман JI.A. - М.: Изд. "Наука", 1983. - 304 с.

41. Остерман JI.A.II Хроматография белков и нуклеиновых кислот / Остерман Л.А. - М.: Изд. "Наука", 1985.-536 с.

42. Поликар А., Колле А.II Физиология нормальной и патологической соединительной ткани / Поликар А., Колле А. - Новосибирск. Сибирское отделение: Изд. «Наука», 1966. - 272 е., ил.

43. Практическая химия белка: Пер. с англ. / Под ред. А. Дарбре. - М.: Мир. 1989.-623 е., ил.

44. Рамис Е. К проблеме нуклеации (образования клеток) при самоорганизации наноструктур белка in vitro и in vivo II Ж. техн. физики. 2005. Т. 75. С. 107-113.

45. Рамис Е. Неравновесное состояние наноструктур белка при его самоорганизации // Ж. техн. физики. 2006. Т. 76. С. 121 - 127.

46. Резникова М.М., Ямскова В.П. Получение и свойства неспецифического адгезионного фактора из сыворотки крови теплокровных животных и человека // Журнал общей биологии. 1985. Т.46. № 3. С. 389-400.

47. Серов В.В., Шехтер А.Б.// Соединительная ткань / Серов В.В., Шехтер А.Б. - М.: Медицина. 1981. - 300 е., ил.

48. Скрипникова B.C., Краснов М.С., Березин Б.Б., Бабушкина Т.А., Борисенко A.B., Измайлов Б.А., Ямскова В.П., Ямское И.А. Биологически активный в сверхмалых дозах низкомолекулярный белок склеры // ДАН 2007. Т. 417. № 5. С. 697-699.

49. Скрипникова B.C., Краснов М.С., Ямское H.A., Ямскова В.П. Модуляторы биологически активных регуляторных белков тканей глаза // Труды научно-практической конференции «Нанотехнологии в диагностике и лечении патологии органа зрения». - М., 2008. - С. 37-39

50. Справочник биохимика: Пер. с англ. / Доссон Р., Эллиот Д., Эллиот У., Джонс К.-М.: Мир. 1991. - 544 е., ил.

51. Степанов В.М.// Молекулярная биология. Структура и функции белков / Степанов В.М. - М.: Высшая школа, 1996. - 335 с

52. Туманова Н.Б., Попова Н.В., Ямскова В.П. Влияние макромолекулярных адгезионных факторов на пролиферацию гепатоцитов в органных культурах эмбриональной печени мышей // Известия Акад. наук серия биол. 1996. №.6. С.653-657

53. Тучкова С.Я., Ямскова В.П., Резникова М.М. Действие 6Д -полипептида из сыворотки крови млекопитающих на регенерацию

передней конечности у шпорцевых лягушек // Онтогенез . 1992. Т. 23. № 3. с. 319-320

54. Хавинсон ВХ, Кеетной И.М., Южаков В.В., Попучиев В.В., Коновалов С. С. II Пептидергическая регуляция гомеостаза / Хавинсон В.Х., Кветной И.М., Южаков В.В., Попучиев В.В., Коновалов С.С. -СПб.: «Наука». 2003. - 194 с.

55. Юхневич Г.ВЛ Инфракрасная спектроскопия воды / Юхневич Г.В. -М.: Наука, 1973.-209 с.

56. Ямское И.А., Ямскова В.П., Даннленко А.Н., Клеменкова З.С., Антипов Б.Г., Черников Ф.Р., Гусынина М.М., Рыбакова Е.Ю. Экспериментальные доказательства роли физико-химических факторов в механизме биологического действия сверхмалых доз. //Российский химический журнал (ЖРХО им. Д.И. Менделеева), 1999. т.43, №5, с.34-39.

57. Ямскова В.П. Роль ионов кальция в стабилизации адгезионного фактора печени крыс // Биофизика. 1978. Т.23. С.428-432.

58. Ямскова В.П., Краснов М.С., Скрипникова B.C., Куракина Е.А., Яжук М.В., Ямское И.А. Влияние экзогенных неионизирующих излучений на активность биорегулятора, выделенного из пигментного эпителия сетчатки глаза быка. // Сборник трудов конференции «Электромагнитные излучения в биологии БИО-ЭМИ-2008». Калуга,

2008. С. 314-319

59. Ямскова В.П., Краснов М.С., Скрипникова B.C., Ямское И.А. Экспериментальные модели культивирования тканей глаза тритона Pleurodeles waltl для исследования специфического действия активного в сверхмалых дозах биорегулятора склеры // Бюлл. экспер. биол. и мед. 2010, №4 стр. 393-395

60. Ямскова В.П., Краснов М.С., Ямское И.А.// Наноразмерные биорегуляторы тканей глаза млекопитающих как основа для фармакологических препаратов нового поколения / - М.: МАКС Пресс,

2009. - 84 с

61. Ямскова В.П., Красное М.С., Ямское И.А.// Механизм действия мембранотропных гомеостатических тканеспецифических биорегуляторов / - LAP Lambert Academic Publishing, 2012 - 120 с.

62. Ямскова В.П., Модяноеа Е.А., Лееенталъ В.И., Ланковская Т.П., Бочарова O.K., Маленков А.Г. Тканевоспецифические макромолекулярные факторы из печени и легкого: очистка и действие на механическую прочность ткани и клеток // Биофизика. 1977а. Т. 22. С. 168-174

63. Ямскова В.П., Модяноеа Е.А., Резникова М.М., Маленков А.Г. Высокоактивные тканевоспецифические адгезионные факторы печени и легкого // Молекулярная биология. 19776. Т. 11. № 5. С. 1147-1154

64. Ямскова В.П., Нечаева Н.В., Туманова Н.Б., Юровицкий Ю.Г., Новикова Т.Е., Фатеева В.И., Гвазава ИГ. Исследование влияния макромолекулярных адгезионных факторов, выделенных из сыворотки крови и печени млекопитающих на интенсивность синтеза белка и содержание АТФ в гепатоцитах in vitro // Известия Акад. наук, серия биол. 1994. №2. С. 190-196

65. Ямскова В.П., Резникова М.М. Низкомолекулярный полипептид сыворотки крови теплокровных: влияние на клеточную адгезию и пролиферацию // Журнал общей биологии. 1991. Т. 52, № 2, С. 181-191

66. Ямскова В.П., Скрипникова B.C., Краснов М.С, Битко С.А., Березин Б.Б., Ямское И.А. Модуляторы активности регуляторных белков, действующих в микродозах // Сборник научных трудов «Факторы экспериментальной эволюции организмов». - Алушта, 2008. - Т. 5. С. 473-478

67. Ямскова В.П., Скрипникова B.C., Краснов М.С., Молявка A.A., Маргасюк Д.В., Борисенко A.B., Ямское И.А. Новая функция альбуминов сыворотки крови // Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. - Новосибирск: «Арта», 2008. - С. 315

68. Ямскова В.П., Скрипникова В.С, Молявка А.А., Ильина А.П., Краснов М.С., Маргасюк Д.В., Борисенко А.В., Березин Б.Б., Кузнецова Е.С., Буряк А.К., Ямское И.А. Структурно-функциональные особенности нового биорегулятора, выделенного из ткани пигментного эпителия глаза быка // Биохимия. 2009. т. 74. № 9. С. 1195-1203

69. Ямскова В.П., Туманова Н.Б., Логинов А.С. Сравнительное исследование действия экстрактов печени мышей линии С57В1 и СВА на адгезию гепатоцитов // Бюлл. экспер. биол. и мед. 1990. №3. С. 303-306

70. Ямскова В.П., Ямское И.А. Механизм биологического действия физико-химических факторов в сверхмалых дозах // Российский химический журнал ЖРХО им. Д.И. Менделеева. 1999. Т. 43. №2. С. 7479

71. Altschul S.F. II Nucleic Acids Res. 1997. V. 25. № 17. P. 3389 - 3402

72. Andrade M.A., Chacon P., Merelo J.J., Moran F. Evaluation of secondary structure of proteins from UV circular dichroism spectra using an unsupervised learning neural network // Prot. Eng. 1993. V .6 (4). P. 383-390.

73. Armstrong J.K., Wenby R.B., Meiselman H.J., Fisher T.C. The Hydrodynamic Radii of Macromolecules and Their Effect on Red Blood Cell Aggregation 11 Biophysical Journal. 2004. V. 87. P. 4259-4270

74. Barni S., Bertone V., Croce A.C., Bottiroli G., Bernini F., Gerzeli G. Increase in liver pigmentation during natural hibernation in some amphibians // J. Anat. 1999. V. 195. P. 19-25.

75. Beloussov L.V. Morphogenetic fields: outlining the alternatives and enlarging the context // Dev. Biol. 2001. V. 94. № 2. P.219 - 235

76. Borisenko A.V., Yamskova V.P., Krasnov M.S., Blagodatskikh I.V., Vecherkin V. V., Yamskov I.A. "Regulatory proteins from the mammalian liver that display biological activity at ultra low doses" pp. 35-45 // In the book "Biochemical Physics Frontal Research", Ed. by Varfolomeev S.D., Burlakova E.B., Popov A.A. and Zaikov G.E., Hauppauge NY, Nova Science Publishers Inc. p. 160. 2007

77. Boudreau N., Bissell M.ll Extracellular matrix signaling: integration of form and function in normal and malignant cells // Curr. Opin. Cell Biol. 1998. V. 10. N5. P. 640-647

78. Bowen B., Steinberg J., Laemmli U., Weintraub H. The detection of DNA-binding proteins by protein blotting // Nucleic. Acids Res. 1980. V. 8 (1). P. 1-20.

79. Bragdon B., Moseychuk O., Saldanha S., King D., Julian J., Nohe A. Bone Morphogenetic Proteins: A critical review // Cellular Signalling 23 (2011)609-620

80. Brown J.R. Structural origins of mammalian albumin. // Fed. Proc. 1976. 35 (10):2141-2144

81. Burgoyne R.D., Duncan J.S. Secretion of milk proteins // J. Mammary Gland Biology and Neoplasia. 1998. V. 3. P. 275-286

82. Chen D., Zhao M, Mundy G.R. Bone Morphogenetic Proteins // Growth Factors, December 2004 Vol. 22 (4), pp. 233-241

83. Chiang M., Robinson K.R., Vanable J. W. Electrical fields in the vicinity of epithelial wounds in the isolated bovine eye // Exp. Eye Res. 1992. V. 54. № 6. P. 999-1003

84. Christiansen J.H., Coles E., Wilkinson D.G. Molecular control of neural crest formation, migration and differentiation // Curr. Opin. Cell. Biol. 2000. 12, 719-724.

85. Cotsarelis G., Cheng G., Dong G., Sun T.T., Lavker R.M. Existence of slow-cycling limbal epithelial basal cells can be preferential stimulated to proliferate: implication on epithelial stem cells // Cell. 1989. V. 57. P. 201 -209

86. Cui S., Arosio D., Doherty K.M., Brosh R.M., Falaschi A., Vindigni A. Analysis of the unwinding activity of the dimeric RecQl helicase in the presence of human replication protein A // Nucleic Acids Researches. 2004. V. 32. P. 2158-2170

87. Davanger M., Evenson A. Role of the pericorneal structures in renewal of corneal epithelium // Nature. 1971. V. 229. P. 560 - 561

88. Donato R. S-100 proteins // Cell Calcium. 1986. V. 7. P. 123-145

89. Donato R. Functional role of S-100 proteins, calcium-binding proteins of the EF-hand type // Biochimica et Biophysica Acta (BBA). 1999. V. 1450. P. 191-231

90. Dulak N.C., Temin H.M. A partially purified polypeptide fraction from rat liver cell conditioned medium withmultiplication-stimulating activity for embryo fibroblasts // J Cell Physiol 1973; 8 : 153-6076.

91. Elysee-Collen B., Lencki R. W. II Biotechnol. Prog. 1997 v. 13, №6. 849856

92. Eto T. A review of the biological properties and clinical implications of adrenomedullin and proadrenomedullin N-terminal 20 peptide (PAMP), hypotensive and vasodilating peptides // Peptides. 2001. 22. P. 1693-1711

93. Fano G., Biocca S., Fulle S., Mariggio M.A., Belia S., Calissano P. The S-100: A protein family in search of a function // Progress in Neurobiology. 1995. V.46. P. 71-82

94. Foster G.F. II In: Albumin. Structure, function and uses. Edited by V.M/ Rosenour, V. Jratz and A. Rothschild. Pergamon Press. Oxford. 1992. P. 53-87

95. Franzen A., Heinegard D. Isolation and characterisation of two sialoproteins present onlyin bone calcified matrix. // J. Biochem 1985. V. 232. p. 715-724.

96. Gosling J. P. Ed. In: "Immunoassaays: a practical approach". 2000. Oxford University Press, P. 19-36.

97. Greenfield N., Fasman G.D. II Biochemistry 1969. V.8. №10. P. 41084116

98. Hames B.D. One-dimensional gel electrophoresis of proteins. In Gel Electrophoresis of Proteins.A Practical Approach (B.D. Hames and D. Rickwood, eds.) 1990. Oxford University Press. New York. 106 P.

99. Herring G., Bourne G. The organic matrix of bone. Academic Press. New York. 1972. Ed. V.l. p. 127-189

100. http: //bioinformatik.biochemtech.uni-halle.de/cdnn.

101. Iten L.E., Bryant S. V./l J. Exp. Zool., 1976a, vol. 196, p. 283-292.

102. Kanzaki TV"., Uveda T.Q., Onuma K. Intermolecular interaction of actin revealed by a dynamic light scattering technique 11 J Phys Chem B Condens Matter Mater Surf Interfaces Biophys. 2006. V. 110 (6). P. 2881-7.

103. Kiess W, Yang Y, Kessler U, Hoeflich A. Insulin-like growth factor II (IGF-II) and the IGF-II/mannose-6-phosphate receptor: the myth continues // Horm Res 1994; 41\ 66-73

104. Kim Y, Fung L., Michael G., Spencer G. and Duncan M. A Comprehensive characterization of the peptide and protein constituents of human seminal fluid // The Prostate. 2004. V.61. P. 171-181

105. Kitamura K., Eto T. II Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 1997. V. 6. № 1. P. 80-87

106. Kornfeld S. Structure and function of the mannose-6-phosphate/insulin like growth factor II receptors // Annu Rev Biochem 1992; 61 : 307-30

107. Krasnov M.S., Gurmizov E.P., Yamskova V.P., Yamskov I.A. "Analysis of a Regulatory Peptide from the Bovine Eye Lens: Physicochemical Properties and Effect on Cataract Development in vitro and in vivo" pp. 21-33 // In the book "Biochemical Physics Frontal Research". Ed. by S.D. Varfolomeev, E.B. Burlakova, A.A. Popov and G.E. Zaikov. Hauppauge NY. Nova Science Publishers Inc. p. 160. 2007

108. Kreis T., Vale R. Eds. In: Guidebook to the Extracellular Matrix and Adhesion Proteins // Oxford University Press. 1993. P. 176

109. Lapillonne A., Clarke S.D., Heird W.C. Polyunsaturated fatty acids and gene expression. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 2004 Mar; 7(2): 151-6.

110. Lelbach A., Muzes G., Feher J. The insulin-like growth factor system: IGFs, IGF-binding proteins and IGFBP-proteases // Acta Physiol Hung. 2005; 92 : 97-107

111. Margasyuk D.V., Krasnov M.S., Blagodatskikh I.V., Grigoryan E.N., Yamskova V.P., Yamskov L.A. "Regulatory Protein from Bovine Cornea: Localization and Biological Activity", pp. 47-59 // In the book «Biochemical Physics Frontal Research», Ed. by Varfolomeev S.D., Burlakova E.B., Popov A.A. and Zaikov G.E., Hauppauge NY, Nova Science Publishers Inc, p. 160. 2007

112. Mishina Y, Suzuki A., Ueno N., Behringer, R.B. Bmps encodes a type I bone morphogenetic protein receptor that is essential for gastrulation during mouse embryogenesis // Genes Dev. 1995. 9, 3027-3037

113. Moore B.W., McGregor D. Chromatographic and electrophoretic fractionation of soluble proteins of brain and liver // J. Biol. Chem. 1965. V. 240. P.1647-1653

114. Moore B.W. Chemistry and biology of the S-100 proteins 11 Scand. J. Immunol. (Suppl.). 1982. V. 9. P. 53-74

115. Moscona A. Rotation - mediatrd histogenetic aggregation of dissociated cells // Exp. Cell Res. 1961. V. 22. P. 455-458

116. Moscona A. Studies of cell aggregation: demonstration of material with selective cell-binding activity // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1963. V.49. P.743-748

117. Moscona A. Cell agregation: properties of specific cell-ligands and their role in the formation of multicellular systems // Develop. Biol. 1968. V.18. P.250-277

118. Nazarova P.A., Yamskova V.P., Krasnov M.S., Filatova A.G., Yamskov l.A. "Regulatory proteins biologically active in ultralow doses from mammalian glands and their secretions" pp. 73-82 // In the book "New Trends in Biochemical Physics Research", Ed. by Varfolomeev S.D., Burlakova E.B., Popov A.A. and Zaikov G.E., Hauppauge NY, Nova Science Publishers Inc, 143 p., 2007

119. Nicholson J.K., Foxall P.J., Spraul M., Farrant R.D., Lindon J.C. 750 MHz 1H and 1H-13C NMR spectroscopy of human blood plasma // Anal Chem. 1995. V. 67(5). P. 793-811.

120. Nicola N.A. Guidebook to Cytokines and their receptors // Oxford University Press, 1994. pp. 261.

121. Nussdorfer G.G., Rossi G.P., Mazzocchi G. II Peptides. 1997. V. 18. № 7. P. 1079-1089

122. Oegema T., Hascall V. Dziewiatkowski. J. II Biol.Chem. 1975. V.250. p. 6151-6159.

123. Ogata A.M., Muramatsu T., Kobata A.ll Arch. Biochem. Biophys, 1977. V.181. P. 353-358

124. Oldbarg A., Franzen A., Heinegars D. The Primary Structure of a Cell-binding Bone Sialoprotein. // J. Biol. Chem. 1988. V. 263. p. 19430-19432.

125. Olivier J.C. Drug Transport to Brain with Targeted Nanoparticles // The Journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 2005. V. 2. P. 108-119.

126. Onuma K., Kanzaki N., Kobayashi N. Association of calcium phosphate and fibroblast growth factor-2: a dynamic light scattering study // Macromol. Biosci. 2004. V. 21. P. 39-46

127. Pavelic J., Matijevic T., Knezevic J. Biological & physiological aspects of action of insulin-like growth factor peptide family // Indian J Med Res 125, April 2007, pp 511-522

128. Pearson W.R., Lipman D.J. IIPNAS. 1988. V. 85. № 8. P. 2444 - 2448

129. Pollak M.N., Schernhammer E.S., Hankinson S.E. Insulin-like growth factors and neoplasia 11 Nat Rev Cancer 2004; 4: 505-18

130. Provencher S.W. Secondary structure of the pore-forming colicin A and its C-terminal fragment. Experimental fact and structure prediction // Makromol. Chem. 1985. V. 15. P. 632

131. Ricort J.M. Insulin-like growth factor binding protein (IGFBP) signaling // Growth Horm IGF Res. 2004. 14 /277-86

132. Rinderknecht E., Humbel R.E. The amino acid sequence of human insulinlike growth factor I and its structural homology with proinsulin // J Biol Chem 1978; 253 :2769-76

133. Robinson K.R., Messerli M.A. Left/right, up/down: the role of endogenous electrical fields as directional signals in development, repair and invasion // Bioassays. 2003. V. 25. № 8. P. 759 - 766

134. Ross C.A., Poirier M.A. Protein aggregation and neurodegenerative disease // Nat. Med. 2004, 10 Suppl. P. 10 - 17.

135. Sathyamoorthy N., Decker J.M., Sherblom A.P., Muchmore A. Evidence that specific high mannose structures directly regulate multiple cellular activities // Mol. and Cell. Biochem. 1991. № 2. 102: 139-147.

136. Stepanek P. Dynamic Light Scattering. The method and some applications // Ed. By Brown W. Oxford: Clarendron Press. 1993. P. 177.

137. Streuli C., Schmidhauser C., Kobrin M., Bissel M., Derynck R .//Extracellular matrix regulates expression of the TGF-|31 gene // J. Cell Biol. 1993. V. 120. P.253-260

138. Takeichi M.H Morphogenetic roles of classic cadherins//Current Opinion in Cell Biology. 1995. V. 7. №.5. P. 619-628

139. Takeichi M. //The cadherins: cell-cell adhesion molecules controlling animal morphogenesis // Development. 1998. V. 102. P. 639-655

140. Tarns J.W., Welinder K.G. 11 Anal. Biochem. 1995. V. 228. №1. P.48 -55.

141. Urist M.R. Bone formation by autoinduction // Science 1965. 150, p. 893-899

142. Victorov I. V., Lyjin A.A., Aleksandrova O.P. II Brain Res. Prot. 2001. V. 7. P. 30-37

143. Weigel P.H. Rat hepatocytes bind to synthetic galactoside surfaces via a patch of asialoglycoprotein receptors // J. Cell. Biol. 1980 Dec; 87(3 Pt 1): 855-61.

144. Weigel P.H., Schmell E., Lee Y.C., Roseman S. Specific adhesion of rat hepatocytes to beta-galactosides linked to Polyacrylamide gels // J. Biol. Chem. 1978. Jan. 25; 253(2): 330-3.

145. Wilson C.M. Staining of proteins on gel: comparision of dyes and procedures // Methods in Enzymol. 1983. V. 91. P. 236-247

146. www,genebee. msu. ru

147. Yu H., Rohan T. Role of insulin like growth factors familyin cancer development and progression // J Natl Cancer Inst. 2000; 92 : 1472-89