Молекулярные эффекты ингибирования конститутивной активности рецептора c-KIT в саркомах мягких тканей: изменение передачи сигнала и профиля экспрессии генов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Фролов, Андрей Евгеньевич

• Фролов, Андрей Евгеньевич
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Фролов, Андрей Евгеньевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

I. ВВЕДЕНИЕ

II. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ПЕРЕАЧА СИГНАЛА РЕЦЕПТОРОМ KIT И ЕГО БЛОКАДА СЕЛЕКТИВНЫМ ИНГИБИТОРОМ ТИРОЗИНОВЫХ КИНАЗ, ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМ ПРЕПАРАТОМ ГЛИВЕК.

1.1. Структура рецептора KIT

1.2. Лиганд рецептора KIT - стволовой фактор роста

1.3. Функции системы KIT/SCF

1.4. Молекулярные каскады, вовлеченные в передачу сигнала рецептором KIT

1.4.1. Каскад Фосфотидилинозитол 3'- Киназы

1.4.2. Каскад JAK/STAT

1.4.3. Src киназы

1.4.4. Каскад Ras/MAP киназы

1.4.5. МАРК каскад и транскрипционные факторы

1.4.6. Каскад фосфолипазы Су

1.4.7. Каскад с вовлечением адаптерных белков

1.5. Отрицательная регуляция прохождения сигнала KIT

1.5.1. Отрицательная возвратная петля протеинкиназы С (РКС)

1.5.2. Тирозиновая фосфатаза, содержащая Src~ гомологичный домен 2 (8Н2-домен)

1.6 Эффекты активирующих мутаций c-KIT на трансдукцию сигнала от рецептора внутрь клетки

1.6.1. Активирующие мутации гена c-KIT

1.6.2. Последствия активирующих мутаций гена c-KIT

1.7. Гливек - селективный ингибитор рецепторных тирозиновых киназ

Глава 2. АНАЛИЗ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ НА ДНК-МИКРОЧИПАХ И ЕГО ПРИМЕНЕНИЕ В МОЛЕКУЛЯРНОЙ ОНКОЛОГИИ

2.1. Эволюция методов анализа дифференциальной экспрессии генов

2.1.1. Метод дифференциального дисплея мРНК (DD)

2.1.2. Методы вычитающей гибридизации

2.1.3. Серийный анализ экспрессии генов (SAGE)

2.2. Метод гибридизации на ДНК-микрочипах

2.2.1. Производство ДНК-чипов

2.2.2. Аспекты экспериментального дизайна

2.2.3. Получение кДНК и гибридизация на ДНК-микрочипах

2.2.4. Детекция гибридизационного сигнала и количественная оценка изображений

2.2.5. Обработка и вскрытие полученных данных

2.3. Применение ДНК-микрочипов в молекулярной онкологии.

2.4. Ближайшие перспективы применения и развития технологии ДНК-чипов

III. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Культура клеток СОЖКТ.

2. Обработка культуры клеток СОЖКТ Гливеком и оценка пролиферации и апоптоза.

3. Анализ состояния клеточного цикла.

4. Выделение суммарной фракции РНК.

5. Производство ДНК-чипов. в. Приготовление и гибридизация зондовой кДНК смеси.

7. Расчет интенсивности сигнала и математическая обработка данных.

8. Аннотация и секвенирование кДНК клонов.

9. Нозерн блоттинг анализ.

10. Обратная транскрипция РНК.

11. Полимеразная цепная реакция.

12. Обработка клеток СОЖКТ ингибитором МЕК и ингибитором PI3K.

13. Получение полноразмерной кДНК гена MAFbx, присоединение мус-эпитопа и клонирование в экспрессирующий лентивирусный вектор.

14. Экспрессия трансгена MAFbx с использованием лентивирусной системы экспрессии.

15. Дизайн и производство поликлональных антител к белку SPRY4.

16. Приготовление клеточных лизатов, белковый электрофорез и Вестерн блоттинг.

17. Клинические образцы и биоптаты СОЖКТ.

IV. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Создание модели стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта in vitro.

2. Выявление маркеров эффективности лечения Гливеком стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта (СОЖКТ) и молекулярные механизмы его фармокодинамики.

2.1. Эффект лекарственного воздействия Гливека на рост и пролиферацию клеток СОЖКТ в системе in vitro.

2.2. Профилирование экспрессии генов в культуре клеток СОЖКТ, обработанных Гливеком, с использованием кДНК чипов.

3. Ингибирование рецептора c-KIT Гливеком в клетках GIST882.

4. Регуляция экспрессии Гливек-зависимых генов SPRY4A, MAFbx и ARHGEF2 осуществляется ERKI/2-зависимым путем.

5. Определение значимости генов SPRY4A и MAFbx как непрямых маркеров ответа на Гливек в клинических образцах СОЖКТ.

6. Анализ экспрессии с-KIT, АКТ и ERK1/2 в СОЖКТ резистентной к Гливеку.

7. Экспрессия трансгена MAFbx вызывает нарушение пролиферации клеток СОЖКТ.

8. Только ген SPRY4A из семейства генов Sprouty подвергается репрессии в клетках GIST882, обработанных Гливеком.

9. Получение поликлональных антител к SPRY4 позволило выявить снижение уровня этого белка после обработки клеток GIST882 Гливеком.

V. ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярные эффекты ингибирования конститутивной активности рецептора c-KIT в саркомах мягких тканей: изменение передачи сигнала и профиля экспрессии генов»

Передача сигнала рецепторными тирозинкиназами является важнейшем звеном регуляции биологических процессов клеточного роста, дифференцировки и смерти. Нерегулируемая активация этих рецепторов является ведущим и порой единственным механизмом канцерогенеза ряда опухолей и патологий развития. Протоонкоген c-kit кодирует трансмембранную рецепторную тирозинкиназу типа III для колониестимулирующего фактора роста. Активирующие мутации в этом гене приводят к конститутивному фосфорилированию рецептора даже в отсутствие колониестимулирующего фактора роста и как следствие к туморогенезу некоторых мезенхимальных и эпителиальных новообразований. Множество фактов свидетельствует о том, что блокирование активности различных рецепторов и белков, участвующих в канцерогенезе, приводит к уменьшению размеров опухоли и продлению жизни больных. Использование новых химических соединений направленного действия, селективно воздействующих на рецепторные белки в опухолевых клетках, реально обеспечивает ббльшую эффективность лечения и меньшую токсичность по сравнению с традиционной неспецифичной химиотерапией.

Для большой группы сарком мягких тканей, самыми распространенными среди которых являются мезенхимапьные новообразования желудочно-кишечного тракта, характерна экспрессия и конститутивная активация рецептора c-KIT. В США ежегодно выявляется около 5000 новых случаев стромальных опухолей желудочно-кишечного тракта (СОЖКТ). В большинстве случаев заболевание заканчивается летальным исходом в течение нескольких лет после постановки диагноза вследствие низкой эффективности традиционной химио- и радиотерапии, причины которой остаются неясными. Прогнозирование успеха лечения конкретного онкологического больного до сих пор остается нерешенной задачей. Одним из подходов к прогнозированию чувствительности к терапевтическому воздействию является поиск маркеров индивидуального ответа и изучения молекулярных эффектов воздействия лекарственного средства, однако большинство предпринятых в этом направлении попыток не обеспечило желаемого эффекта. В частности, это касается лечения СОЖКТ противоопухолевым препаратом фениламинопиримидином (Гливеком). Гливек принадлежит к новейшему классу селективных ингибиторов рецепторных тирозинкиназ, к которым относятся рецепторы c-KIT, PDGFR и Всг-АЫ. Молекулярный механизм действия фениламинопиримидина был изучен в случае ингибирования рецептора Всг-АЫ при хроническом миелолейкозе. Что касается c-KIT, обладающего структурной аналогией с Всг-АЫ, то механизм его ингибирования Гливеком, а также последующий молекулярный ответ на действие этого препарата изучены лишь поверхностно. Впервые Гливек использовали для лечения сарком мягких тканей в рамках клинических испытаний №CSTI571-В2222, проведенных в США. Фаза II этих испытаний выявила большое количество положительных ответов, однако 13% пациентов не ответили на терапию, а у ряда больных наблюдали рецидив заболевания в течение нескольких месяцев после условно-положительного ответа. Вопрос о молекулярных механизмах первичной и приобретенной резистентности к Гливеку остается открытым.

Анализ дифференциальной экспрессии генов с помощью ДНК-микрочипов является оптимальным подходом для решения этого вопроса, а также для определения возможных маркеров устойчивости к Гливеку. Мы приняли решение изучить влияние Гливека на дифференциальную экспрессию (профилирование) генов в клетках СОЖКТ, сравнивая «генетические портреты» обработанных и необработанных препаратом культур этих клеток. Биологическую значимость результатов профилирования проверяли на панели клинических образцов опухолей, полученных от пациентов до и во время лечения Гливеком.

Целью настоящей работы было исследование молекулярных механизмов ингибирования конститутивной активности рецептора c-KIT фениламинопиримидином (Гливеком) и изучение воздействия этого селективного ингибитора тирозинкиназ на изменение передачи сигнала в клетках СОЖКТ. Ставился также целью поиск прогностических маркеров эффективности индивидуального лечения больных СОЖКТ этим препаратом, а, возможно, и ранее неизвестных перспективных терапевтических мишеней.

В связи с этим в работе ставились следующие экспериментальные задачи:

1. Получить стабильную культуру клеток, моделирующую СОЖКТ in vitro и пригодную для изучения терапевтического воздействия Гливека. Оценить эффект Гливека на рост и пролиферацию полученной культуры клеток с использованием современных методов оценки состояния клеточного цикла, выживаемости, уровней пролиферации и апоптоза.

2. Используя технологию ДНК-микрочипов, определить биологические маркеры ответа на терапию Гливеком и вовлеченные сигнальные каскады, участвующие в генетической регуляции, исходя из изменения уровня экспрессии генов в культуре клеток под действием препарата

3. Подтвердить биологическую и клиническую значимость маркерных генов-кандидатов в условиях in vivo, используя операционный материал и биопсии больных СОЖКТ.

4. Исследовать молекулярные эффекты ингибирования конститутивной активности рецептора с-KIT фениламинопиримидином, анализируя состояние активации ключевых адаптерных белков сигнальных каскадов, начинающихся от рецептора с-К1Т.

5. Провести функциональную оценку механизмов действия белковых продуктов маркерных генов и вычленить функционально активные молекулярные каскады прохождения сигнала от рецептора с-KIT при его активации и ингибировании в контексте СОЖКТ.

Все представленные в работе результаты имеют научную новизну. Полученная в настоящей работе клеточная линия GIST882 является первой описанной стабильной культурой клеток СОЖКТ. Эта клеточная линия впервые использована нами как модель СОЖКТ для изучения биологии этого новообразования. Получив препарат Гливек с любезного разрешения компании «Новартис Онкология», мы имели возможность в рамках клинических испытаний впервые исследовать действие Гливека на культуре клеток GIST882. Впервые всесторонне оценено действие Гливека на рост, пролиферацию клеток СОЖКТ и индукцию в них апоптоза, равно как на состояние и взаимодействие каскадов прохождения сигнала от рецептора KIT и на уровни экспрессии других генов. Нами впервые проведено генетическое профилирование ответа на действие Гливека в системе СОЖКТ in vitro. В ходе этих экспериментов впервые выявлен ряд Гливек-зависимых генов, которые потенциально могут использоваться в качестве маркеров эффективности лекарственного ответа, а для семи из них изменение экспрессии при действии Гливека подтверждено двумя независимыми методами. Эффект резкого изменения экспрессии двух генов (SPRY4A и ШРЬл) под действием Гливека наблюдали также в клинических биопсийных образцах опухолей больных СОЖКТ, что является принципиально новым результатом. Впервые показано, что инсерционная соматическая мутация гена c-KIT 1530ins6 определяет резистентность к Гливеку. Молекулярные механизмы эффектов Гливека также впервые подробно исследованы на уровне белков.

Практическое значение работы определяется тем, что она является интегральной частью клинических испытаний № CSTI571-B2222 эффективности препарата Гливек в лечении СОЖКТ. В ходе этих испытаний от пациентов до и после терапии Гливеком был получен уникальный набор биопсий СОЖКТ, который использовался в данной работе. На этих клинических образцах, как в случае благоприятного ответа на терапию Гливеком, так и в случае резистентных СОЖКТ, подтверждена биологическая значимость полученных в культуре клеток результатов.

Анализ экспрессии генов, определяющих эффективность ответа на Гливек, позволил найти прогностические маркеры результативности лечения Гливеком, которые можно определять даже в тонкоигольных биоптатах СОЖКТ. Выявленные маркеры являются высоконадежными; действительно, предсказание совпадало с клинической картиной в 100% случаев. Разработанная модель СОЖКТ in vitro имеет большую практическую ценность, поскольку может быть использована для поиска потенциальных маркеров лекарственной эффективности других препаратов. Кроме того, на основании полученных в этой работе данных белковые продукты генов SPRY4A и RTP801 могут рассматриваться как потенциальные мишени при разработке новых лекарственных препаратов, особенно в случаях СОЖКТ, резистентной к Гливеку.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Фролов, Андрей Евгеньевич

выводы

1. Впервые создана модель стромальной опухоли желудочно-кишечного тракта (СОЖКТ) in vitro - стабильная клеточная линия GIST882, которую использовали для изучения механизмов ингибирования рецепторной тирозинкиназы c-KIT фениламинопиримидином (Гливеком). Проведено генотипирование этой линии и мутационный анализ c-kit. Определена чувствительность и характер ответа GIST882 (по состоянию клеточного цикла, выживаемости, уровням пролиферации и апоптоза) на обработку противоопухолевым препаратом Гливек.

2. С помощью геномного подхода, основанного на анализе экспрессии генов при помощи технологии ДНК-микрочипов (10368 фрагментов кДНК), провели поиск потенциальных генетических мишеней действия Гливека в культуре клеток СОЖКТ. При воздействии Гливека наблюдали изменения экспрессии 14 генов, для семи из которых результаты подтверждены методами ОТ-ПЦР и Нозерн-блоттинга. Наиболее выраженные эффекты Гливека состояли в репрессии гена SPRY4A и гиперэкспрессии гена MAFbx. Показано, что изменение экспрессии генов SPRY4A и MAFbx обусловлено подавлением прохождения сигнала от рецептора KIT по МАР-киназному каскаду после воздействия Гливека.

3. Эффекты подавления экспрессии SPRY4A и гиперэкспрессии MAFbx под действием Гливека наблюдали также в клинических биопсийных образцах опухолей семи пациентов, полученных до и во время терапии Гливеком. Следовательно, анализ экспрессии генов SPRY4A и MAFbx (особенно в материале тонкоигольной биопсии опухоли с малым количеством клеточного материала) можно использовать для ранней клинической оценки ответа на терапию Гливеком.

4. С помощью иммуноблоттинга показано, что Гливек в культуре клеток и в опухолях больных ингибирует активность рецептора KIT по механизму фосфорилирования, а также значительно снижает фосфорилирование МАР-киназ ERK1 и ERK2 и зависящего от фосфоинозитол-3-фосфаткиназы фермента АКТ, приводя к снижению их активности без изменения общего количества каждого из белков.

5. В одном из клинических образцов СОЖКТ обнаружена соматическая мутация гена c-kit, приводящая к резистентности при терапии Гливеком. Показано, что она представляет собой ранее описанную инсерционную мутацию с 6-тинуклеотидной вставкой в положении 1530 (1530ins6).

6. Получены поликлонапьные антитела к белку SPRY4A и с их помощью показано снижение содержания этого белка в клетках GIST882 после обработки Гливеком. Сравнение кинетики деградации транскрипта и уровня белкового продукта гена SPRY4A свидетельствует об относительной стабильности этого белка в клетке.

7. Установлено, что гиперэкспрессия трансгена MAFbx в клетках GIST882, доставленного с помощью системы лентивирусов, приводит к аресту роста и пролиферации, тем самым моделируя эффект обработки этих клеток Гливеком.

БЛАГОДАРНОСТИ

Автор выражает глубокую благодарность своим научным руководителям проф. д.б.н. Ольге Олеговне Фаворовой за внимательное руководство и критицизм и проф. Эндрю Годвину за предоставленную возможность выполнения работы в его лаборатории и консультативную помощь в осуществлении проекта.

Автор выражает глубокую благодарность проф. д.б.н. Ольге Олеговне Фаворовой и проф. Эрике Големис за организацию программы сотрудничества между Россиийским Государственным Медицинским Университетом и Фокс-Чейзовским Онкологическим Центром.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Фролов, Андрей Евгеньевич, 2003 год

1. Besmer, P., et al., A new acute transforming feline retrovirus and relationship ofits oncogene v-kit with the protein kinase gene family. Nature, 1986. 320(6061): p. 415-21.

2. Qiu, F.H., et al., Primary structure of c-kit: relationship with the CSF-1/PDGFreceptor kinase family-oncogenic activation of v-kit involves deletion of extracellular domain and С terminus. Embo J, 1988.7(4): p. 1003-11.

3. Yarden, Y., et al., Human proto-oncogene c-kit: a new cell surface receptortyrosine kinase for an unidentified ligand. EMBO J., 1987.6(11): p. 33413351.

4. Chabot, В., et al., The proto-oncogene c-kit encoding a transmembrane tyrosinekinase receptor maps to the mouse W locus. Nature, 1988. 335(6185): p. 8889.

5. Reith, A.D., et al., Signal transduction by normal isoforms and W mutantvariants of the Kit receptor tyrosine kinase. Embo J, 1991.10(9): p. 24512459.

6. Blechman, J.M., et al., Soluble c-kit proteins and antireceptor monoclonalantibodies confine the binding site of the stem cell factor. J Biol Chem, 1993. 268(6): p. 4399-4406.

7. Blechman, J.M., et al., The fourth immunoglobulin domain of the stem cell factorreceptor couples ligand binding to signal transduction. Cell, 1995. 80(1): p. 103-113.

8. Lev, S., et al., Interspecies molecular chimeras of kit help define the binding siteof the stem cell factor. Mol Cell Biol, 1993.13(4): p. 2224-2234.

9. Copeland, N.G., et al., Mast cell growth factor maps near the steel locus onmouse chromosome 10 and is deleted in a number of steel alleles. Cell, 1990.63(1): p. 175-183.

10. Williams, D.E., et al., Identification of a ligandforthe c-kit proto-oncogene. Cell,1990.63(1): p. 167-174.

11. Zsebo, K.M., et al., Stem cell factor is encoded at the SI locus of the mouse andis the ligand for the c-kit tyrosine kinase receptor. Cell, 1990. 63(1): p. 213224.

12. Besmer, P., The kit ligand encoded at the murine Steel locus: a pleiotropicgrowth and differentiation factor. Curr Opin Cell Biol, 1991. 3(6): p. 939-46.

13. Nocka, K., et al., Candidate ligand for the c-kit transmembrane kinase receptor:

14. KL, a fibroblast derived growth factor stimulates mast cells and erythroid progenitors. Embo J, 1990. 9(10): p. 3287-3294.

15. Yee, N.S., et al., Mechanism of down-regulation of c-kit receptor. Roles ofreceptor tyrosine kinase, phosphatidylinositol З'-kinase, and protein kinase C. J Biol Chem, 1994. 269(50): p. 31991-31998.

16. Dastych, J. and D.D. Metcalfe, Stem cell factor induces mast cell adhesion tofibronectin. J Immunol, 1994.152(1): p. 213-219.

17. Meininger, C.J., et al., The c-kit receptor ligand functions as a mast cellchemoattractant. Blood, 1992. 79(4): p. 958-963.

18. Blume-Jensen, P., et al., Activation of the human c-kit product by ligandinduced dimerization mediates circular actin reorganization and chemotaxis. Embo J, 1991.10(13): p. 4121-4128.

19. Besmer, P., Kit-/igand-stem cell factors, In Colony Stimulating Factors, J.

20. Garland and P. Quesenberry, Editors. 1997, Marcel Dekker: New York.

21. Pawson, Т., Protein modules and signalling networks. Nature, 1995. 373(6515):p. 573-580.

22. Rottapel, R., et al., The Steel/W transduction pathway: kit autophosphorylationand its association with a unique subset of cytoplasmic signaling proteins is induced by the Steel factor. Mol Cell Biol, 1991.11(6): p. 3043-3051.

23. Daly, R.J., The Grb7 family of signalling proteins. Cell Signal, 1998.10(9): p.613.618.

24. Tsujimura, Т., et al., Constitutive activation of c-kit in FMA3 murinemastocytoma cells caused by deletion of seven amino acids at the juxtamembrane domain. Blood, 1996. 87(1): p. 273-283.

25. Feng, G.S., et al., Grap is a novel SH3-SH2-SH3 adaptor protein that couplestyrosine kinases to the Ras pathway. J Biol Chem, 1996.271(21): p. 12129•f12132.

26. Liu, S.K. and C.J. McGlade, Gads is a novel SH2 and SH3 domain-containingadaptor protein that binds to tyrosine-phosphorylated She. Oncogene, 1998. 17(24): p. 3073-3082.

27. Cutler, R.L., et al., Multiple cytokines induce the tyrosine phosphorylation of Sheand its association with Grb2 in hemopoietic cells. J Biol Chem, 1993. 268(29): p. 21463-21465.

28. De Sepulveda, P., et al., Socsl binds to multiple signalling proteins andsuppresses steel factor-dependent proliferation. Embo J, 1999.18(4): p. 904915.

29. Carpino, N. et al., p62(dok): a constitutivelytyrosine-phosphorylated, GAPassociated protein in chronic myelogenous leukemia progenitor cells. Cell, 1997. 88(2): p. 197-204.

30. Nishida, K., etal., Gab-family adapter proteins act downstream of cytokine andgrowth factor receptors and T- and B-cell antigen receptors. Blood, 1999. 93(6): p. 1809-1816.

31. Alal, M., et al., Steel factor stimulates the tyrosine phosphorylation of the protooncogene product, p95vav, in human hemopoietic cells. J Biol Chem, 1992. 267(25): p. 18021-18025.

32. Blume-Jensen, P., et al., Modulation of Kit/stem cell factor receptor-inducedsignaling by protein kinase C. J Biol Chem, 1994. 269(34): p. 21793-21802.

33. Tang, В., et al., Tec kinase associates with c-kit and is tyrosine phosphorylatedand activated following stem cell factor binding. Mol Cell Biol, 1994.14(12): p. 8432-8437.

34. Weiler, S.R., et al., JAK2 is associated with the c-kitproto-oncogene productand is phosphorylated in response to stem cell factor. Blood, 1996. 87(9): p. 3688-3693.

35. Duronio, V., et al., p21ras activation via hemopoietin receptors and c-kitrequires tyrosine kinase activity but not tyrosine phosphorylation of p21 ras GTPase-activating protein. Proc Natl Acad Sci USA, 1992. 89(5): p. 15871591.

36. Tournier, C., et al., Mitogen-activated protein kinase kinase 7 is an activator ofthe c-Jun NH2-terminal kinase. Proc Natl Acad Sci USA, 1997. 94(14): p. 7337-7342.

37. Lopez-llasaca, M., etal., Requirement of phosphatidylinositol-3 kinase foractivation ofJNK/SAPKs by PDGF. Biochem Biophys Res Commun, 1997. 232(2): p. 273-277.

38. Fukunaga, R. and T. Hunter, MNK1, a new MAP kinase-activatedproteinkinase, isolated by a novel expression screening method for identifying protein kinase substrates. Embo J, 1997.16(8): p. 1921-33.

39. Ludwig, S., et al., 3pK, a novel mitogen-activated protein (MAP) kinaseactivated protein kinase, is targeted by three MAP kinase pathways. Mol Cell Biol, 1996.16(12): p. 6687-6697.

40. Timokhina, I., et al., Kit signaling through PI 3-kinase and Src kinase pathways:an essential role for Rac1 and JNK activation in mast cell proliferation. Embo J, 1998.17(21): p. 6250-6262.

41. Blume-Jensen, P., etal., Increased Kit/SCF receptor induced mitogenicity butabolished cell motility after inhibition of protein kinase C. Embo J, 1993. 12(11): p. 4199-4209.

42. Lorenz, U., et al., Genetic analysis reveals cell type-specific regulation ofreceptor tyrosine kinase c-Kit by the protein tyrosine phosphatase SHP1. J Exp Med, 1996.184(3): p. 1111-1126.

43. Paulson, R.F., et al.t Signalling by the W/Kit receptor tyrosine kinase isnegatively regulated in vivo by the protein tyrosine phosphatase Shp1. Nat Genet, 1996.13(3): p. 309-315.

44. Huber, M., et al., The src homology 2-containing inositol phosphatase (SHIP) isthe gatekeeper of mast cell degranulation. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(19): p. 11330-11335.

45. Lev, S., D. Givol, and Y. Yarden, Interkinase domain of kit contains the bindingsite for phosphatidylinositol 3'kinase. Proc Natl Acad Sci USA, 1992. 89(2): p. 678-682.

46. Gommerman, J.L., R. Rottapel, and S.A. Berger, Phosphatidylinositol 3-kinaseand Ca2+ influx dependence for ligand-stimulated internalization of the c-Kit receptor. J Biol Chem, 1997. 272(48): p. 30519-30525.

47. Ihle, J.N. and I.M. Kerr, Jaks and Stats in signaling by the cytokine receptorsuperfamily. Trends Genet, 1995.11(2): p. 69-74.

48. Darnell, J.E., Jr., STATs and gene regulation. Science, 1997. 277(5332): p.1630-1635.

49. O'Shea, J.J., Jaks, STATs, cytokine signal transduction, and immunoregulation:are we there yet? Immunity, 1997. 7(1): p. 1-11.

50. Shuai, K., et al., Interferon activation of the transcription factor Stat91 involvesdimerization through SH2-phosphotyrosyl peptide interactions. Cell, 1994. 76(5): p. 821-828.

51. Leaman, D.W., et al., Regulation of STAT-dependent pathways by growthfactors and cytokines. Faseb J, 1996.10(14): p. 1578-1588.

52. Deberry, C., S. Мои, and D. Linnekin, Statl associates with c-kit and isactivated in response to stem cell factor. Biochem J, 1997. 327 (Pt 1): p. 7380.

53. Linnekin, D., C.S. DeBerry, and S. Мои, Lyn associates with thejuxtamembrane region of c-Kit and is activated by stem cell factor in hematopoietic cell lines and normal progenitor cells. J Biol Chem, 1997. 272(43): p. 27450-27455.

54. Leon, J., I. Guerrero, and A. Pel I ice r, Differential expression of the ras genefamily in mice. Mol Cell Biol, 1987. 7(4): p. 1535-1540.

55. Umanoff, H., et al., The murine N-ras gene is not essential for growth anddevelopment. Proc Natl Acad Sci USA, 1995. 92(5): p. 1709-1713.

56. Johnson, L., et al., K-ras is an essential gene in the mouse with partialfunctional overlap with N-ras. Genes Dev, 1997.11(19): p. 2468-2481.

57. Ulsh, L.S. and T.Y. Shih, Metabolic turnover of human c-rasH p21 protein of EJbladder carcinoma and its normal cellular and viral homologs. Mol Cell Biol, 1984. 4(8): p. 1647-52.

58. Malumbres, M. and A. Pellicer, RAS pathways to cell cycle control and celltransformation. Front Biosci, 1998. 3: p. d887-912.

59. Krengel, U., etal., Three-dimensional structures of H-ras p21 mutants:molecular basis for their inability to function as signal switch molecules. Cell, 1990. 62(3): p. 539-48.

60. Scheffzek, К., et al., The Ras-RasGAP complex: structural basis for GTPaseactivation and its loss in oncogenic Ras mutants. Science, 1997. 277(5324): p. 333-8.

61. Scheele, J.S., J.M. Rhee, and G.R. Boss, Determination of absolute amounts of

62. GDP and GTP bound to Ras in mammalian cells: comparison of parental and Ras-overproducing NIH 3T3 fibroblasts. Proc Natl Acad Sci USA, 1995. 92(4): p. 1097-1100.

63. Hesketh, R., The Oncogene Handbook. 1994: Academic Press. 378-413.

64. Lowy, D.R. and B.M. Willumsen, Function and regulation of ras. Annu Rev

65. Biochem, 1993. 62: p. 851-891.

66. Rodriguez-Viciana, P., et al., Activation of phosphoinositide 3-kinase byinteraction with Ras and by point mutation. Embo J, 1996.15(10): p. 24422451.

67. Katz, M.E. and F. McCormick, Signal transduction from multiple Ras effectors.

68. Curr Opin Genet Dev, 1997. 7(1): p. 75-9.

69. Leevers, S.J., H.F. Paterson, and C.J. Marshall, Requirement for Ras in Rafactivation is overcome by targeting Raf to the plasma membrane. Nature, 1994. 369(6479): p. 411-414.

70. Marais, R., etal., Differential regulation ofRaf-1, A-Raf, andB-Rafbyoncogenic ras and tyrosine kinases. J Biol Chem, 1997.272(7): p. 4378-83.

71. Hamilton, M. and A. Wolfman, Oncogenic Ha-Ras-dependent mitogen-activatedprotein kinase activity requires signaling through the epidermal growth factor receptor. J Biol Chem, 1998. 273(43): p. 28155-62.

72. Reuter, C.W., et al., Biochemical analysis of MEKactivation in NIH3T3fibroblasts. Identification of B-Raf and other activators. J Biol Chem, 1995. 270(13): p. 7644-55.

73. Berra, E., et al., Evidence for a role of MEK and МАРК during signaltransduction by protein kinase С zeta. Embo J, 1995.14(24): p. 6157-6163.

74. Nakanishi, H., K.A. Brewer, and J.H. Exton, Activation of the zeta isozyme ofprotein kinase С by phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate. J Biol Chem, 1993.268(1): p. 13-16.

75. Ballester, R., M.E. Furth, and O.M. Rosen, Phorbol ester- and protein kinase Cmediated phosphorylation of the cellular Kirsten ras gene product. J Biol Chem, 1987. 262(6): p. 2688-95.

76. Diaz-Meco, M.T., et al., Evidence for the in vitro and in vivo interaction of Raswith protein kinase С zeta. J Biol Chem, 1994. 269(50): p. 31706-10.

77. Lange-Carter, C.A. and G.L. Johnson, Ras-dependent growth factor regulationof MEK kinase in PC12 cells. Science, 1994. 265(5177): p. 1458-1461.

78. Fanger, G.R., N.L. Johnson, and G.L Johnson, MEK kinases are regulated by

79. EGFand selectively interact with Rac/Cdc42. Embo J, 1997.16(16): p. 496172.

80. Albright, C.F., et al., Characterization of a guanine nucleotide dissociationstimulator for a ras-related GTPase. Embo J, 1993.12(1): p. 339-347.

81. Kikuchi, A. and L.T. Williams, Regulation of interaction of ras p21 with RalGDSand Raf-1 by cyclic AMP-dependent protein kinase. J Biol Chem, 1996. 271(1): p. 588-594.

82. Urano, Т., R. Emkey, and L.A. Feig, Ral-GTPases mediate a distinctdownstream signaling pathway from Ras that facilitates cellular transformation. Embo J, 1996.15(4): p. 810-816.

83. Jullien-Flores, V., et al., Bridging Ral GTPase to Rho pathways. RLIP76, a Raleffector with CDC42/Rac GTPase-activating protein activity. J Biol Chem, 1995. 270(38): p. 22473-22477.

84. Kapeller, R. and L.C. Cantley, Phosphatidylinositol 3-kinase. Bioessays, 1994.16(8): p. 565-576.

85. Dhand, R., et al., PI 3-kinase is a dual specificity enzyme: autoregulation by anintrinsic protein-serine kinase activity. Embo J, 1994.13(3): p. 522-33.

86. Mcllroy, J., et al., Specific activation of p85-p110 phosphatidylinositol 3'-kinasestimulates DNA synthesis by ras- and p70 S6 kinase-dependent pathways. Mol Cell Biol, 1997.17(1): p. 248-255.

87. Hu, Q., et al., Ras-dependent induction of cellular responses by constitutivelyactive phosphatidylinositol-3 kinase. Science, 1995. 268(5207): p. 100-102.

88. Klippel, A., et al., A specific product of phosphatidylinositol 3-kinase directlyactivates the protein kinase Akt through its pleckstrin homology domain. Mol Cell Biol, 1997.17(1): p. 338-344.

89. Weng, Q.P., et al., Phosphatidylinositol 3-kinase signals activation of p70 S6kinase in situ through site-specific p70 phosphorylation. Proc Natl Acad Sci U S A, 1995. 92(12): p. 5744-8.

90. Hawkins, P.T., et al., PDGFstimulates an increase in GTP-Rac via activation ofphosphoinositide 3-kinase. Curr Biol, 1995. 5(4): p. 393-403.

91. Khosravi-Far, R. and C.J. Der, The Ras signal transduction pathway. Cancer

92. Metastasis Rev, 1994.13(1): p. 67-89.

93. Bryant, S.S., et al., Two SH2 domains ofp120 Ras GTPase-activating proteinbind synergistically to tyrosine phosphorylated p190 Rho GTPase-activating protein. J Biol Chem, 1995. 270(30): p. 17947-17952.

94. McGlade, J., et al., The N-terminal region of GAP regulates cytoskeletalstructure and cell adhesion. Embo J, 1993.12(8): p. 3073-3081.

95. Han, J., et al., Role of substrates and products of PI 3-kinase in regulatingactivation of Rac-related guanosine triphosphatases by Vav. Science, 1998. 279(5350): p. 558-560.

96. Nimnual, A.S., B.A. Yatsula, and D. Bar-Sagi, Coupling of Ras and Racguanosine triphosphatases through the Ras exchanger Sos. Science, 1998. 279(5350): p. 560-563.

97. Denhardt, D.T., Signal-transducing protein phosphorylation cascades mediatedby Ras/Rho proteins in the mammalian cell: the potential for multiplex signalling. Biochem J, 1996. 318 ( Pt 3): p. 729-747.

98. Olson, M.F., A. Ashworth, and A. Hall, An essential role for Rho, Rac, and

99. Cdc42 GTPases in cell cycle progression through G1. Science, 1995. 269(5228): p. 1270-1272.

100. Horii, Y., et al., A novel oncogene, ost, encodes a guanine nucleotide exchangefactor that potentially links Rho and Rac signaling pathways. Embo J, 1994. 13(20): p. 4776-4786.

101. Marshall, C.J., MAP kinase kinase kinase, MAP kinase kinase and MAP kinase.

102. Curr Opin Genet Dev, 1994. 4(1): p. 82-89.

103. Hill, C.S., J. Wynne, and R. Treisman, The Rho family GTPases RhoA, Rac1,and CDC42Hs regulate transcriptional activation bySRF. Cell, 1995. 81(7): p. 1159-1170.

104. Pronk, G.J. and J.L. Bos, The role ofp21ras in receptor tyrosine kinasesignalling. Biochim Biophys Acta, 1994.1198(2-3): p. 131-147.

105. Madhani, H.D. and G.R. Fink, The riddle of MAP kinase signaling specificity.

106. Trends Genet, 1998.14(4): p. 151-155.

107. Xing, J., D.D. Ginty, and M.E. Greenberg, Coupling of the RAS-MAPK pathway to gene activation by RSK2, a growth factor-regulated CREB kinase. Science, 1996. 273(5277): p. 959-963.

108. Marais, R., J. Wynne, and R. Treisman, The SRF accessory protein Elk-1 contains a growth factor-regulated transcriptional activation domain. Cell, 1993. 73(2): p. 381-393.

109. Cano, E. and L.C. Mahadevan, Parallel signal processing among mammalian MAPKs. Trends Biochem Sci, 1995. 20(3): p. 117-122.

110. Minden, A., et al., Selective activation of the JNK signaling cascade and c-Jun transcriptional activity by the small GTPases Rac and Cdc42Hs. Cell, 1995. 81(7): p. 1147-1157.

111. Minden, A. and M. Karin, Regulation and function of the JNK subgroup of MAP kinases. Biochim Biophys Acta, 1997.1333(2): p. F85-104.

112. Cavigelli, M., et al., Induction ofc-fos expression through JNK-mediated TCF/Elk-1 phosphorylation. Embo J, 1995.14(23): p. 5957-5964.

113. Su, Y.C., et al., NIK is a new Ste20-related kinase that binds NCK and MEKK1 and activates the SAPK/JNK cascade via a conserved regulatory domain. Embo J, 1997.16(6): p. 1279-1290.

114. Chen, H.E., et al., Regulation of colony-stimulating factor 1 receptor signaling by the SH2 domain-containing tyrosine phosphatase SHPTP1. Mol Cell Biol, 1996.16(7): p. 3685-3697.

115. Rodrigues, G.A., M. Park, and J. Schlessinger, Activation of the JNK pathway is essential for transformation by the Met oncogene. Embo J, 1997. 16(10): p. 2634-45.

116. Clark, E.A., et al., Genomic analysis of metastasis reveals an essential role forRhoC. Nature, 2000. 406(6795): p. 532-5.

117. Medema, R.H., et al., GTPase-activating protein SH2-SH3 domains induce gene expression in a Ras-dependent fashion. Mol Cell Biol, 1992.12(8): p. 3425-3430.

118. Finco, T.S., et al., Oncogenic Ha-Ras-induced signaling activates NF-kappaB transcriptional activity, which is required for cellular transformation. J Biol Chem, 1997. 272(39): p. 24113-6.

119. Teramoto, H., et al., The small GTP-binding protein rho activates c-Jun N-terminal kinases/stress-activated protein kinases in human kidney293T cells. Evidence for a Рак-independent signaling pathway. J Biol Chem, 1996. 271 (42): p. 25731 -25734.

120. Van Aelst, L., T. Joneson, and D. Bar-Sagi, Identification of a novel Rac1-interacting protein involved in membrane ruffling. Embo J, 1996.15(15): p. 3778-86.

121. Michiels, F., et al., A role for Rac in Tiaml-induced membrane ruffling and invasion. Nature, 1995. 375(6529): p. 338-340.

122. Kimura, К., et al., Regulation of myosin phosphatase by Rho and Rho-associated kinase (Rho-kinase). Science, 1996. 273(5272): p. 245-248.

123. Westwick, J.K., et al., Rac regulation of transformation, gene expression, and actin organization by multiple, PAK-independent pathways. Mol Cell Biol, 1997.17(3): p. 1324-1335.

124. Juo, P., et al., Fas activation of the p38 mitogen-activated protein kinase signalling pathway requires ICE/CED-3 family proteases. Mol Cell Biol, 1997. 17(1): p. 24-35.

125. Raingeaud, J., et al., Pro-inflammatory cytokines and environmental stress cause p38 mitogen-activated protein kinase activation by dual phosphorylation on tyrosine and threonine. J Biol Chem, 1995. 270(13): p. 7420-7426.

126. Wang, Z. and M.F. Moran, Requirement for the adapter protein GRB2 in EGFreceptor endocytosis. Science, 1996. 272(5270): p. 1935-1939.

127. Tan, Y., et al., FGF and stress regulate CREB and A TF-1 via a pathway involving p38 MAP kinase and MAPKAP kinase-2. Embo J, 1996.15(17): p. 4629-4642.

128. Kovarik, P., et al., Stress-induced phosphorylation of STAT1 at Ser727 requires p38 mitogen-activated protein kinase whereas IFN-gamma uses a different signaling pathway. Proc Natl Acad Sci USA, 1999. 96(24): p. 13956-13961.

129. Raingeaud, J., et al., MKK3- and МККб-regulated gene expression is mediated by the p38 mitogen-activated protein kinase signal transduction pathway. Mol Cell Biol, 1996.16(3): p. 1247-1255.

130. Lin, A., et al., Identification of a dual specificity kinase that activates the Jun kinases and p38-Mpk2. Science, 1995. 268(5208): p. 286-90.

131. Brenner, В., et al., Fas- or ceramide-induced apoptosis is mediated by a Rac1 -regulated activation of Jun N-terminal kinase/p38 kinases and GADD153. J Biol Chem, 1997. 272(35): p. 22173-22181.

132. Guay, J., et al., Regulation ofactin filament dynamics byp38 map kinase-mediated phosphorylation of heat shock protein 27. J Cell Sci, 1997.110 (Pt 3): p. 357-368.

133. Kyriakis, J.M., et al., The stress-activated protein kinase subfamily ofc-Jun kinases. Nature, 1994. 369(6476): p. 156-60.

134. Han, J., et al., A MAP kinase targeted by endotoxin and hyperosmolarity in mammalian cells. Science, 1994.265(5173): p. 808-811.

135. Westwick, J.K., et al., Oncogenic Ras activates c-Jun via a separate pathway from the activation of extracellular signal-regulated kinases. Proc Natl Acad Sci U S A, 1994. 91 (13): p. 6030-4.

136. Jacobs, D., et al., Multiple docking sites on substrate proteins form a modular system that mediates recognition by ERK MAP kinase. Genes Dev, 1999. 13(2): p. 163-175.

137. Lowenstein, E.J., et al., The SH2 and SH3 domain-containing protein GRB2 links receptor tyrosine kinases to ras signaling. Cell, 1992. 70(3): p. 431-442.

138. Thommes, K., et al., Identification of Tyr-703 and Tyr-936 as the primary association sites for Grb2 and Grb7 in the c-Kit/stem cell factor receptor. Biochem J, 1999.341 ( Pt 1): p. 211-6.

139. Nishizuka, Y., Intracellular signaling by hydrolysis of phospholipids and activation of protein kinase C. Science, 1992. 258(5082): p. 607-614.

140. Dekker, L.V. and P.J. Parker, Protein kinase C~a question of specificity. Trends Biochem Sci, 1994.19(2): p. 73-77.

141. Blume-Jensen, P., et al., Identification of the major phosphorylation sites for protein kinase С in kit/stem cell factor receptor in vitro and in intact cells. J Biol Chem, 1995. 270(23): p. 14192-14200.

142. Brizzi, M.F., et al., Protein kinase C-dependent release of a functional whole extracellular domain of the mast cell growth factor (MGF) receptor by MGF-dependent human myeloid cells. Oncogene, 1994. 9(6): p. 1583-1589.

143. Klingmuller, U., et al., Specific recruitment of SH-PTP1 to the erythropoietin receptor causes inactivation of JAK2 and termination of proliferative signals. Cell, 1995. 80(5): p. 729-738.

144. Yi, Т., et al., Hematopoietic cell phosphatase associates with the interleukin-3 (IL-3) receptor beta chain and down-regulates IL-3-induced tyrosine phosphorylation and mitogenesis. Mol Cell Biol, 1993.13(12): p. 7577-7586.

145. Yi, Т., et al., Hematopoietic cell phosphatase associates with erythropoietin (Epo) receptor after Epo-induced receptor tyrosine phosphorylation: identification of potential binding sites. Blood, 1995. 85(1): p. 87-95.

146. D'Ambrosio, D., et al., Recruitment and activation of PTPICin negative regulation of antigen receptor signaling by Fc gamma RIIB1. Science, 1995. 268(5208): p. 293-297.

147. Doody, G.M., etal., A role in В cell activation for CD22 and the protein tyrosine phosphatase SHP. Science, 1995. 269(5221): p. 242-244.

148. Kon-Kozlowski, M., et al., The tyrosine phosphatase PTP1C associates with Vav, Grb2, and mSosI in hematopoietic cells. J Biol Chem, 1996. 271(7): p. 3856-3862.

149. Longley, В. J., et al., Somatic c-KIT activating mutation in urticaria pigmentosa and aggressive mastocytosis: establishment of clonality in a human mast cell neoplasm. Nat Genet, 1996.12(3): p. 312-314.

150. Longley, B. J., Jr., et al., Activating and dominant inactivating c-KIT catalytic domain mutations in distinct clinical forms of human mastocytosis. Proc Natl Acad Sci USA, 1999. 96(4): p. 1609-1614.

151. Worobec, A.S., et al., Clinical correlates of the presence of the Asp816Val c-kit mutation in the peripheral blood mononuclear cells of patients with mastocytosis. Cancer, 1998. 83(10): p. 2120-2129.

152. Moskaluk, C.A., etal., Mutations of c-kit JM domain are found in a minority of human gastrointestinal stromal tumors. Oncogene, 1999.18(10): p. 18971902.

153. Hirota, S., et al., Gain-of-function mutations of c-kit in human gastrointestinal stromal tumors. Science, 1998. 279(5350): p. 577-580.

154. Fletcher, J.A., et al., KIT gene mutations in gastrointestinal stromal tumors: more complex than previously recognized? Am J Pathol, 2002.161(2): p. 737-8; author reply 738-9.

155. Heinrich, M.C., et al., Biology and genetic aspects of gastrointestinal stromal tumors: KIT activation and cytogenetic alterations. Hum Pathol, 2002. 33(5): p. 484-95.

156. Isozaki, К., et al., Germline-activating mutation in the kinase domain of KIT gene in familial gastrointestinal stromal tumors. Am J Pathol, 2000.157(5): p. 1581-5.

157. Tian, Q., et al., Activating c-kit gene mutations in human germ cell tumors. Am J Pathol, 1999.154(6): p. 1643-1647.

158. Furitsu, Т., et al., Identification of mutations in the coding sequence of the proto-oncogene c-kit in a human mast cell leukemia cell line causing ligand-independent activation of c-kit product. J Clin Invest, 1993. 92(4): p. 17361744.

159. Kitayama, H., et al., Constitutively activating mutations of c-kit receptor tyrosine kinase confer factor-independent growth and tumorigenicity of factor-dependent hematopoietic cell lines. Blood, 1995. 85(3): p. 790-798.

160. Kitayama, H., et al., Neoplastic transformation of normal hematopoietic cells by constitutively activating mutations of c-kit receptor tyrosine kinase. Blood, 1996. 88(3): p. 995-1004.

161. Mekori, Y.A., C.K. Oh, and D.D. Metcalfe, lL-3-dependent murine mast cells undergo apoptosis on removal of IL-3. Prevention of apoptosis by c-kit ligand. J Immunol, 1993.151(7): p. 3775-3784.

162. Piao, X., et al., Expression of the Kit and KitA receptor isoforms in human acute myelogenous leukemia. Blood, 1994. 83(2): p. 476-481.

163. Kozlowski, M., et al., SHP-1 binds and negatively modulates the c-Kit receptor by interaction with tyrosine 569 in the c-Kit juxtamembrane domain. Mol Cell Biol, 1998.18(4): p. 2089-2099.

164. Ma, Y., et al., Inhibition of spontaneous receptor phosphorylation by residues in a putative alpha-helix in the KIT intracellular juxtamembrane region. J Biol Chem, 1999. 274(19): p. 13399-13402.

165. Druker, B.J., et al., Effects of a selective inhibitor of the Abl tyrosine kinase on the growth of Всг-АЫ positive cells. Nat Med, 1996. 2(5): p. 561-6.

166. Buchdunger, E., et al., Ablprotein-tyrosine kinase inhibitor STI571 inhibits in vitro signal transduction mediated by c-kit and platelet-derived growth factor receptors. J. Pharmacol. Exp. Ther., 2000. 295(1): p. 139-145.

167. Druker, B. J., STI571 (Gleevec) as a paradigm for cancer therapy: Trends Mol Med, 2002. 8(4): p. S14-8.

168. Kantarjian, H., et al., Hematologic and cytogenetic responses to imatinib mesylate in chronic myelogenous leukemia. N. Engl. J. Med., 2002. 346(9): p. 645-652.

169. Talpaz, M., et al., Gleevec (formerly ST1571): an active drug in patients with Ph+ chronic myeloid leukemia in accelerated phase updated results of a phase II study. Blood, 2001. 98: p. 845a.

170. Sawyers, C.L., et al., Imatinib induces hematologic and cytogenetic responses in patients with chronic myelogenous leukemia in myeloid blast crisis: results of a phase II study. Blood, 2002. 99(10): p. 3530-9.

171. Heinrich, M.C., et al., Inhibition of c-kit receptor tyrosine kinase activity by STI571, a selective tyrosine kinase inhibitor. Blood, 2000.96(3): p. 925-932.

172. Tuveson, D.A., et al., STI571 inactivation of the gastrointestinal stromal tumor c-KIT oncoprotein: biological and clinical implications. Oncogene, 2001. 20(36): p. 5054-5058.

173. Heldin, C.H., A. Ostman, and L. Ronnstrand, Signal transduction via platelet-derived growth factor receptors. Biochim Biophys Acta, 1998.1378(1): p. F79-113.

174. Rosell, R., et al., Determinants of response and resistance to cytotoxics. Semin. Oncol., 2002. 29(1 Suppl 4): p. 110-118.

175. Paik, S., Incorporating genomics into the cancer clinical trial process. Semin Oncol, 2001. 28(3): p. 305-9.

176. Celis, J.E., et al., Gene expression profiling: monitoring transcription and translation products using DNA microarrays and proteomics. FEBS Lett, 2000. 480(1): p. 2-16.

177. Rubina, A., et al., Protein microchips. Dokl Biochem Biophys, 2001. 381: p. 419-22.

178. Mirzabekov, A. and A. Kolchinsky, Emerging array-based technologies in proteomics. Curr Opin Chem Biol, 2002. 6(1): p. 70-5.

179. Liang, P. and A.B. Pardee, Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction. Science, 1992. 257(5072): p. 967-71.

180. Hedrick, S.M., et al., Isolation of cDNA clones encoding Tcell-specific membrane-associated proteins. Nature, 1984. 308(5955): p. 149-53.

181. Diatchenko, L., et al., Suppression subtractive hybridization: a method for generating differentially regulated or tissue-specific cDNA probes and libraries. Proc Natl Acad Sci USA, 1996. 93(12): p. 6025-30.

182. Velculescu, V.E., et al., Serial analysis of gene expression. Science, 1995. 270(5235): p. 484-7.

183. Stein, J. and P. Liang, Differential display technology: a general guide. Cell Mol Life Sci, 2002. 59(8): p. 1235-40.

184. Wang, W.L., et al., Growth inhibition and modulation of kinase pathways of small cell lung cancer cell lines by the novel tyrosine kinase inhibitor STI571. Oncogene, 2000.19(31): p. 3521-3528.

185. Luk'ianov, K.A., et al., Selective suppression of polymerase chain reaction. Bioorg Khim, 1999. 25(3): p. 163-70.

186. Section III Patterns of mRNA expression. Methods Enzymol, 1999. 303: p. 165-411.

187. Nat Genet, 1999. 21(1 Suppl).

188. Cho, Y.J., V.R. Prezioso, and P. Liang, Systematic analysis of intrinsic factors affecting differential display. Biotechniques, 2002. 32(4): p. 762-4, 766.

189. Matz, M.V. and S.A. Lukyanov, Different strategies of differential display: areas of application. Nucleic Acids Res, 1998. 26(24): p. 5537-43.

190. Bertioli, D. J., et al., An analysis of differential display shows a strong bias towards high copy number mRNAs. Nucleic Acids Res, 1995. 23(21): p. 4520-3.

191. Ito, Т. and Y. Sakaki, Fluorescent differential display. Methods Mol Biol, 1997. 85: p. 37-44.

192. Lievens, S., S. Goormachtig, and M. Holsters, A critical evaluation of differential display as a tool to identify genes involved in legume nodulation: looking back and looking forward. Nucleic Acids Res, 2001. 29(17): p. 345968.

193. Mills, J.C., et al., DNA microarrays and beyond: completing the journey from tissue to cell. Nat Cell Biol, 2001. 3(8): p. E175-8.

194. Duguid, J.R. and M.C. Dinauer, Library subtraction of in vitro cDNA libraries to identify differentially expressed genes in scrapie infection. Nucleic Acids Res, 1990.18(9): p. 2789-92.

195. Нага, E., et al., Subtractive cDNA cloning using oligo(dT)30-latex and PCR: isolation of cDNA clones specific to undifferentiated human embryonal carcinoma cells. Nucleic Acids Res, 1991.19(25): p. 7097-104.

196. Siebert, P.D., et al., An improved PCR method for walking in uncloned genomic DNA. Nucleic Acids Res, 1995. 23(6): p. 1087-8.

197. Stollberg, J., et al., A quantitative evaluation of SAGE. Genome Res, 2000. 10(8): p. 1241-8.

198. Lipshutz, R.J., et al., High density synthetic oligonucleotide arrays. Nat Genet, 1999. 21(1 Suppl): p. 20-4.

199. Frolov, A., et al., DNA array-based method for detection of large rearrangements in the BRCA1 gene. Genes Chromosomes Cancer, 2002. 35(3): p. 232-41.

200. Ivanov, I.B., et al., Diagnosis of genetic mutations using oligonucleotide microchips. Mol Biol (Mosk), 1997. 31(1): p. 159-67.

201. Sverdlov, E.D., Prospects of medicinal use of achievements in genomics: the beginning of era of complete genome medical genetics. Patol Fiziol Eksp Ter, 2001(1): p. 3-22.

202. Pollack, J. R., et al., Genome-wide analysis of DNA copy-number changes using cDNA microarrays. Nat Genet, 1999. 23(1): p. 41-6.

203. Tiilib, S.V. and A.D. Mirzabekov, Advances in the analysis of DNA sequence variations using oligonucleotide microchip technology. Curr Opin Biotechnol, 2001.12(1): p. 53-8.

204. Kolchinsky, A. and A. Mirzabekov, Analysis of SNPs and other genomic variations using gel-based chips. Hum Mutat, 2002.19(4): p. 343-60.

205. Haab, B.B., Advances in protein microarray technology for protein expression and interaction profiling. Curr Opin Drug Discov Devel, 2001. 4(1): p. 116-23.

206. Schena, M., et al., Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray. Science, 1995. 270(5235): p. 467-70.

207. Proudnikov, D., E. Timofeev, and A. Mirzabekov, Immobilization of DNA in polyacrylamide gel for the manufacture of DNA and DNA-oligonucleotide microchips. Anal Biochem, 1998. 259(1): p. 34-41.

208. Vasiliskov, A.V., et al., Fabrication of microarray of gel-immobilized compounds on a chip by copolymerization. Biotechniques, 1999. 27(3): p. 592-4, 596-8, 600 passim.

209. Chechetkin, V.R., et al., Sequencing by hybridization with the generic 6-mer oligonucleotide microarray: an advanced scheme for data processing. J Biomol Struct Dyn, 2000.18(1): p. 83-101.

210. Hoon, D.S., et al., Assessment of genetic heterogeneity in tumors using laser capture microdissection. Methods Enzymol, 2002. 356: p. 302-9.

211. Ohyama, H., et al., Use of laser capture microdissection-generated targets for hybridization of high-density oligonucleotide arrays. Methods Enzymol, 2002. 356: p. 323-33.

212. Brazma, A., et al., Minimum information about a microarray experiment (MIAME)-toward standards for microarray data. Nat Genet, 2001. 29(4): p. 365-71.

213. Eisen, M.B., et al., Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci USA, 1998. 95(25): p. 14863-8.

214. Tavazoie, S., et al., Systematic determination of genetic network architecture. Nat Genet, 1999. 22(3): p. 281-5.

215. Tamayo, P., et al., Interpreting patterns of gene expression with self-organizing maps: methods and application to hematopoietic differentiation. Proc Natl Acad Sci USA, 1999. 96(6): p. 2907-12.

216. Shannon, W., R. Culverhouse, and J. Duncan, Analyzing microarray data using cluster analysis. Pharmacogenomics, 2003. 4(1): p. 41-52.

217. Su, A.I., et al., Molecular classification of human carcinomas by use of gene expression signatures. Cancer Res, 2001.61(20): p. 7388-93.

218. Golub, T.R., et al., Molecular classification of cancer: class discovery and class prediction by gene expression monitoring. Science, 1999. 286(5439): p. 531-7.

219. Macgregor, P.F. and J.A. Squire, Application of microarrays to the analysis of gene expression in cancer. Clin Chem, 2002. 48(8): p. 1170-7.

220. Sreekumar, A. and A.M. Chinnaiyan, Using protein microarrays to study cancer. Biotechniques, 2002. Suppl: p. 46-53.

221. Rhodes, D.R. and A.M. Chinnaiyan, DNA microarrays: implications for clinical medicine. J Invest Surg, 2002.15(5): p. 275-9.

222. Mohr, S., et al., Microarrays as cancer keys: an array of possibilities. J Clin Oncol, 2002. 20(14): p. 3165-75.

223. Chung, C.H., P.S. Bernard, and C.M. Perou, Molecular portraits and the family tree of cancer. Nat Genet, 2002. 32(Suppl): p. 533-40.

224. Sorlie, Т., et al., Gene expression patterns of breast carcinomas distinguish tumor subclasses with clinical implications. Proc Natl Acad Sci USA, 2001. 98(19): p. 10869-74.

225. Bittner, M., et al., Molecular classification of cutaneous malignant melanoma by gene expression profiling. Nature, 2000. 406(6795): p. 536-40.

226. Bhattacharjee, A., et al., Classification of human lung carcinomas by mRNA expression profiling reveals distinct adenocarcinoma subclasses. Proc Natl Acad Sci USA, 2001. 98(24): p. 13790-5.

227. Kudoh, K., et al., Monitoring the expression profiles of doxorubicin-induced and doxorubicin-resistant cancer cells by cDNA microarray. Cancer Res, 2000. 60(15): p. 4161-6.

228. Bayani, J., et al., Parallel analysis of sporadic primary ovarian carcinomas by spectral karyotyping, comparative genomic hybridization, and expression microarrays. Cancer Res, 2002. 62(12): p. 3466-76.

229. Hegde, P., et al., Identification of tumor markers in models of human colorectal cancer using a 19,200-element complementary DNA microarray. Cancer Res, 2001. 61(21): p. 7792-7.

230. Luo, J., et al., Human prostate cancer and benign prostatic hyperplasia: molecular dissection by gene expression profiling. Cancer Res, 2001.61 (12): p. 4683-8.

231. Kim, J.H., et al., Osteopontin as a potential diagnostic biomarker for ovarian cancer. Jama, 2002. 287(13): p. 1671-9.

232. Godwin, A.K., et al., High resistance to cisplatin in human ovarian cancer cell lines is associated with marked increase of glutathione synthesis. Proc Natl Acad Sci USA, 1992. 89(7): p. 3070-4.

233. Kerr, M.K., et al., Statistical analysis of a gene expression microarray experiment with replication. Statistica Sinica, 2002.12(1): p. 203-218.

234. Ideker, Т., et al., Testing for differentially-expressed genes by maximum-likelihood analysis of microarray data. J Comput Biol, 2000.7(6): p. 805-17.

235. Schultz, D.C., et al., Identification of two candidate tumor suppressor genes on chromosome 17p13.3. Cancer Res, 1996. 56(9): p. 1997-2002.

236. Dull, Т., et al., A third-generation lentivirus vector with a conditional packaging system. J Virol, 1998. 72(11): p. 8463-71.

237. Burns, J.C., et al., Vesicular stomatitis virus G glycoprotein pseudotypedretroviral vectors: concentration to very high titer and efficient gene transferinto mammalian and nonmammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 1993. 90(17): p. 8033-7.

238. Emi, N., T. Friedmann, and J.K. Yee, Pseudotype formation of murine leukemia virus with the G protein of vesicular stomatitis virus. J Virol, 1991. 65(3): p. 1202-7.

239. Pan, Z.Z., et al., Gamma-synuclein promotes cancer cell survival and inhibits stress- and chemotherapy drug-induced apoptosis by modulating МАРК pathways. J Biol Chem, 2002. 277(38): p. 35050-60.

240. Jemal, A., et al., Cancer statistics, 2002. CA Cancer J Clin, 2002. 52(1): p. 23-47.

241. Russell, W.O., et al., A clinical and pathological staging system for soft tissue sarcomas. Cancer, 1977. 40(4): p. 1562-70.

242. Ruka, W., et al., Prognostic significance of lymph node metastasis and bone, major vessel, or nerve involvement in adults with high-grade soft tissue sarcomas. Cancer, 1988. 62(5): p. 999-1006.

243. Heinrich, M.C., et al., PDGFRA Activating Mutations in Gastrointestinal Stromal Tumors. Science, 2003. 299(5607): p. 708-10.

244. Miettinen, M., M. Sarlomo-Rikala, and J. Lasota, Gastrointestinal stromal tumors: recent advances in understanding of their biology. Hum. Pathol., 1999. 30(10): p. 1213-1220.

245. DeMatteo, R.P., et al., Tivo hundred gastrointestinal stromal tumors: recurrence patterns and prognostic factors for survival. Ann. Surg., 2000. 231(1): p. 51-58.

246. Graadt van Roggen, J.F., M.L. van Velthuysen, and P.C. Hogendoorn, The histopathological differential diagnosis of gastrointestinal stromal tumours. J Clin Pathol, 2001. 54(2): p. 96-102.

247. Daniel, E.E., et al., Do gap junctions couple interstitial cells of Cajal pacing and neurotransmission to gastrointestinal smooth muscle? Neurogastroenterol Motil, 2001.13(4): p. 297-307.

248. Langton, P., et al., Spontaneous electrical activity of interstitial cells of Cajal isolated from canine proximal colon. Proc Natl Acad Sci USA, 1989. 86(18): p. 7280-4.

249. Barajas-Lopez, C., et al., Pacemaker activity recorded in interstitial cells of Cajal of the gastrointestinal tract. Am J Physiol, 1989. 257(4 Pt 1): p. C830-5.

250. Altdorfer, K.t et al., Nitric oxide synthase immunoreactivity of interstitial cells of Cajal in experimental colitis. Inflamm Res, 2002. 51(12): p. 569-71.

251. Wu, J.J., T.P. Rothman, and M.D. Gershon, Development of the interstitial cell of Cajal: origin, kit dependence and neuronal and nonneuronal sources of kit ligand. J Neurosci Res, 2000. 59(3): p. 384-401.

252. Streutker, C.J., et al., Loss ofCD117 (c-kit)- and CD34-Positive ICC and Associated CD34-Positive Fibroblasts Defines a Subpopulation of Chronic Intestinal Pseudo-obstruction. Am J Surg Pathol, 2003. 27(2): p. 228-35.

253. Faussone-Pellegrini, M.S., P. Matini, and W. Stach, Differentiation of enteric plexuses and interstitial cells of Cajal in the rat gut during pre- and postnatal life. Acta Anat (Basel), 1996.155(2): p. 113-25.

254. Ozaki, K., et al., ERK pathway positively regulates the expression of Sprouty genes. Biochem Biophys Res Commun, 2001. 285(5): p. 1084-8.

255. Lux, M.L., et al., KIT extracellular and kinase domain mutations in gastrointestinal stromal tumors. Am. J. Pathol., 2000.156(3): p. 791-795.

256. Blanke, C.D., et al., High incidence of durable responses induced by imatinib mesylate (Gleevec) in patients with unresectable and metastatic gastrointestinal stromal tumors (GISTs). Prog. Proc. Am. Soc. Clin. Oncol., 2002. 21: p. 1608a.

257. Harndahl, L., et al., Important role of phosphodiesterase 3B for the stimulatory action of cAMP on pancreatic beta-cell exocytosis and release of insulin. J Biol Chem, 2002. 277(40): p. 37446-55.

258. Thompson, W.J., et al., Exisulind induction of apoptosis involves guanosine 3',5'-cyclic monophosphate phosphodiesterase inhibition, protein kinase G activation, and attenuated beta-catenin. Cancer Res, 2000. 60(13): p. 333842.

259. Ahmad, M., et al., The role of the cyclic GMP-inhibited cyclic AMP-specific phosphodiesterase (PDE3) in regulating clonal BRIN-BD11 insulin secreting cell survival. Cell Signal, 2000.12(8): p. 541-8.

260. Bodine, S.C., et al., Identification of ubiquitin ligases required for skeletal muscle atrophy. Science, 2001. 294(5547): p. 1704-8.

261. Gomes, M.D., et al., Atrogin-1, a muscle-specific F-boxprotein highly expressed during muscle atrophy. Proc Natl Acad Sci USA, 2001.98: p. 14440-14445.

262. Nielsen, Т.О., et al., Molecular characterisation of soft tissue tumours: a gene expression study. Lancet, 2002. 359(9314): p. 1301-7.

263. Lux, M.L., et al., KIT extracellular and kinase domain mutations in gastrointestinal stromal tumors. Am J Pathol, 2000.156(3): p. 791-5.

264. Manley, P.W., et al., Imatinib: a selective tyrosine kinase inhibitor. Eur J Cancer, 2002. 38 Suppl 5: p. S19-27.

265. Allander, S.V., et al., Gastrointestinal stromal tumors with KIT mutations exhibit a remarkably homogeneous gene expression profile. Cancer Res., 2001. 61 (24): p. 8624-8628.

266. Bian, J.S., et al., The role of phosphodiesterase in mediating the effect of protein kinase С on cyclic AMP accumulation upon kappa-opioid receptor stimulation in the rat heart. J Pharmacol Exp Ther, 2000. 292(3): p. 1065-70.

267. Sanders, K.M., A case for interstitial cells of Cajal as pacemakers and mediators of neurotransmission in the gastrointestinal tract. Gastroenterology, 1996.111(2): p. 492-515.

268. Glass, D. J., Signalling pathways that mediate skeletal muscle hypertrophy and atrophy. Nature Cell Biology, 2003. 5: p. 87-90.1. NH21. Ли ганд-связывающий домен1. Димеризаиионный домен1. Экстрацеллюлярный регион

269. Трансмембранный домен Юкстамембранный домен

270. Киназный домен АТФ-связывающая область Киназная вставка

271. Киназный домен Фосфотрансферазная область1. Цитоплазматический регионсоон

272. Рис. 1. Схема доменной организации рецептора KIT.

273. Цитозольные/цитоскелетные мишени: Фосфолипаза Аг1. Транскрипционные факторы1. Транскрипция генов

274. Прогрессия клеточного цикла/ Апоптоз

275. Рис. 2. Сеть каскадов трансдукции сигнала внутрь клетки от рецептора KIT.1. KITэцд17,3%тмд1. ЮМДкд

276. Соматические дупликации Ala-502 иТуг-503 в спорадических СОЖКТ

277. Различные соматические мутации между Lys-550 и Asp-579 в соматических СОЖКТ

278. Различные терминальные мутации между Lys-550 и Asp-579 в наследственых и множественных СОЖКТ

279. Соматическая точечная мутация Lys-642 в спорадических СОЖКТ

280. Герминальная точечная мутация Lys-642 в наследственых и множественных СОЖКТ

281. Соматическая точечная мутация Asp-816 в новообразованиях тучных клеток

282. Рис 3. Частота встречаемости и характеристика мутаций KIT при спорадических и наследственных формах СОЖК. ЭЦД, экстрацеллюлярный домен; ТМД, трансмембранный домен; ЮМД, юкстамембранный домен; КД, киназный домен; KB, киназная вставка1. Иматиниба мезилат

283. Молекулярный вес 589.7 Формула C30H36N7SO4

284. Рис. 4. Структурная формула и непатентованное название препарата Гливек.

285. ДНКюриоаыхттм «ДНК н нормальныхтестер) (яра йир)с«шфоааииым Адаптером 1 ваятая а избыта1. ДНК и ра«о«ы> 1ЛГГО»тестер) с пишроиниьш Адаптером 2b,c,d +Iвторой цикл гибридизации с добавлением свежей порции драйверазаполнение концевых брешей

286. Добавление праймеров М w ПЦР амплификацияa. d отсутствие амплификации

287. Ь-*Ь' отсутствие амплификациис линейная амплификация, « экспоненциальная амплификация

288. Энзиматическое фрагментирование якорной эндонуклеазой (ЯЭ) и связывание со стрптавидиновыми бусами1. GATC GATC QATC

289. Разделение реакции пополам и лигирование линкеров А и В1. ПСТАв GATC1. CTAG GATC

290. Рестрикция "тэг'-эндонуклеаздй (ТЭ)

291. ТЭ ЯЭ Тэг (микрофрагмент) ТЭ ЯЭ Тэг (микрофрагмент)

292. GATGCTAGXXXXXXXXX | | CTAGYYYYYYYYY

293. СТAGGAT СХХХХХХХХХ II GAT CYYYYYYYYY

294. Лигирование и амплификация

295. Лигирование и амплификация /с использованием якорных праймеров А и ъ /

296. Двойной микрофрагмент IGGATG CTAGXXXXXXXXXYYYYYYYYYCTAG ICCTAGGATCXXXXXXXXXYYYYYYYYYGATC

297. Рестрикция якорной эндонуклеазой, Выделение и объединение двойных микрофрагментов, Клонирование

298. CTAGXXXXXXXXXYYYYYYYYYCTACXXXXXXXXXYYYYYYYYYCTACXXXXXXXXXYYYYYYYYYCTAC GATCXXXXXXXXXYYYYYYYYYGATCXXXXXXXXXYYYYYYYYYGATCXXXXXXXXXYYYYYYYYYGATG

299. Двойной микрофрагмент Двойной микрофрагмент Двойной микрофрагмент

300. Рис. 6. Схематическое изображение метода серийного анализа экспрессии генов (SAGE).1. Выбор клонова*