Молекулярно-генетический и клинический анализ саркогликанопатий в Российской Федерации тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат наук Булах Мария Васильевна

• Булах Мария Васильевна
• кандидат наук
• 2019

Оглавление диссертации кандидат наук Булах Мария Васильевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Общие сведения

1.1.1. Современная классификации ПКМД и место саркогликанопатий в ее структуре

1.1.2. История открытия и изучения саркогликанопатий

1.1.3. Эпидемиология

1.2. Молекулярные аспекты саркогликанопатий: гены и их белковые продукты

1.2.1. Структура и функции саркогликанов

1.2.2. Роль саркогликанов в составе дистрофин-гликопротеинового комплекса

1.2.3. Патогенетические механизмы формирования саркогликанопатий

1.2.4. Молекулярно-генетические аспекты саркогликанопатий: гены и мутации

1.3. Клиническая характеристика саркогликанопатий

1.4. Дифференциальная диагностика

1.5. Современные подходы к диагностике саркогликанопатий

1.6. Перспективы терапии

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Объекты исследования

2.2. Методы исследования

2.2.1. Забор венозной крови

2.2.2. Выделение ДНК из венозной крови

2.2.3. Определение нуклеотидной последовательности анализируемых генов методом массового параллельного секвенирования

2.2.4. Полимеразная цепная реакция

2.2.5. Электрофорез в полиакриламидном геле (ПААГ)

2.2.6. Анализ нуклеотидной последовательности исследуемых генов методом прямого секвенирования по Сенгеру

2.2.7. Мультиплексная проба-зависимая лигазная реакция (МЬРА)

2.2.8 Статистический анализ

2.2.9 Биоинформатический анализ

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Молекулярно-генетический анализ саркогликанопатий в выборках больных МДД/Б и ПКМД

3.1.1. МПС в диагностике саркогликанопатий

3.1.2. Анализ спектра мутаций генов БОСЛ, БОСБ, БОСО, БОСБ в исследуемых выборках

3.1.3. Установление клинической значимости выявленных вариантов и подтверждение молекулярно-генетического диагноза

3.2. Определение долей генетических форм саркогликанопатии в структуре ПКМД и оценка их частоты

3.3. Усовершенствование тест-системы для молекулярной диагностики наиболее распространенных в РФ типов ПКМД и введение ее в диагностическую практику

3.4. Клиническая характеристика саркогликанопатий

3.4.1. Особенности клинических проявлений ПКМД 2D

3.4.2. Анализ вариантов гена SGCA: зависимость «генотип-фенотип» для повторяющихся вариантов

3.4.3. Сравнительный анализ клинических особенностей ПКМД 2D с другими частыми в РФ типами ПКМД с псевдогипертрофиями икроножных мышц

3.4.4. Оценка различий между группами пациентов с различными типами ПКМД по значениям концентрации КФК

3.5. Алгоритм молекулярно-генетической диагностики больных с клиническими признаками саркогликанопатий

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

5. ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

АА - акриамид

АД - аугосомно-доминантный

АР - аутосомно-рецессивный

АТФ - аденозинтрифосфат

БАА - бисакриламид

ВД - внеклеточный домен

ВнД - внуктиклеточный домен

ДГК - дистрофин-гликопротеиновый комплекс

ДКМП - дилятационная кардиомиопатия

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

КТ - компьютерная томография

КФК - креатинфосфокиназа

МДД/Б - мышечная дистрофия Дюшенна/Беккера МД ЭД - мышечная дистрофия Эмери-Дрейфуса

ФГБНУ «МГНЦ» - Федеральное государственное бюджетное научное учреждение «Медико - генетический научный центр имени академика Н.П. Бочкова»

МПС - массовое параллельное секвенирование

МРТ - магнитно-резонансная томография

НКЗ - неопределенного клинического значения (вариант)

ПААГ - полиакриамидный гель

ПКМД - поясно-конечностная мышечная дистрофия

ПЦР - полимеразная цепная реакция

СГ - белок саркогликан

СГП - саркогликанопатия

TM - трансмембранный домен

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота

ЭНМГ - электронейромиография

ЭР - эндоплазматический ретикулум

ЭФР - эпидермальный фактор роста

BAM - Binary sequence Alignment Map

HGMD - The Human Gene Mutation Database

MLPA - Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification

NCBI - National Center for Biotechnology Information

NGS - Next Generation Sequencing (секвенирование следующего поколения) OMIM - Online Mendelian Inheritance in Man TBE - трис-боратный буфер VCF - Variant Call Format

ВВЕДЕНИЕ

Саркогликанопатии - группа наследственных нервно-мышечных заболеваний с аутосомно-рецессивным типом наследования, являющихся генетическими вариантами поясно-конечностной мышечной дистрофии (ПКМД). К саркогликанопатиям относятся: ПКМД 2D (R3; а-саркогликанопатия), ПКМД 2Е (R4; ß-саркогликанопатия), ПКМД 2С (R5; у-саркогликанопатия) и ПКМД 2F (R6; S-саркогликанопатия), обусловленные мутациями в генах SGCA, SGCB, SGCG и SGCD соответственно. Частота заболеваний, входящих в данную группу, в мире очень низкая: в Великобритании она составляет 1:370000 [Norwood F.L.M. et al.], в Италии - 1:180000 [Fanin M. et al., 1997], в Нидерландах - 1:253000 [Ten Dam L. et al., 2019], при этом доля саркогликанопатий от всех типов ПКМД, включая аутосомно-доминантные, варьирует от 9 до 54% [Mahmood O.A., Jiang X.M., 2014; Yu M. et al., 2017].

Группа заболеваний в целом характеризуется проксимальной мышечной слабостью с тенденцией к постепенной генерализации патологического процесса, псевдогипертрофиями икроножных мышц и кардиомиопатией, при этом клиническом уровне диагностики отличий между отдельными саркогликанопатиями практически не наблюдается. ПКМД 2C-2F чаще дебютируют в раннем детском и детском возрасте, но в целом возраст манифестации крайне вариабелен (от 1 до 30 лет в зависимости от формы заболевания) [Meena A.K. et al., 2007; Wicklund M.P., Kissel J.T., 2014]. Характерным лабораторным признаком саркогликанопатий является повышение концентрации креатинфосфокиназы (КФК) в 5-40 раз.

Ввиду высокого генетического и клинического полиморфизма группы ПКМД все перечисленные клинические и лабораторные признаки саркогликанопатий в той или иной степени характерны и для других генетических вариантов ПКМД. Следовательно, неспецифичность фенотипов данной подгруппы заболеваний создает трудности в их дифференциальной диагностике как между собой, так и с другими генетическими типами ПКМД, при которых встречаются псевдогипертрофии икроножных мышц, и, в особенности, с мышечной дистрофией Дюшенна/Беккера (МДД/Б) - одной из наиболее частых в мире форм мышечной дистрофии. Одним из подходов к решению настоящей проблемы может послужить создание молекулярной диагностики на основе метода массового параллельного секвенирования (МПС) таргетных областей генома, включающих гены, мутации в которых ответственны за формирование трудно

дифференцируемых с саркогликанопатиями генетических форм мышечной дистрофии. Такой подход эффективен не только в качестве диагностической методики для выявления молекулярно-генетических причин заболевания у индивидуальных пациентов. Он также позволяет получить эмпирические данные относительно спектров мутаций изучаемых генов и накоплении некоторых мутаций в популяции или группе больных, что, в свою очередь, дает возможность определить вклад отдельных генетических типов ПКМД в общую структуру данной гетерогенной патологии. Выявление у больных мажорных мутаций в целевых генах становится основой для создания более дешёвой, технологически простой и эффективной тест-системы с целью совершенствования молекулярной диагностики не только больных саркогликанопатиями, но и больных другими клинически схожими с ними генетическими типами ПКМД, распространенными на территории РФ. Кроме того, базовые знания относительно молекулярных и эпидемиологических аспектов рассматриваемой подгруппы ПКМД у больных в РФ могут быть использованы для разработки и оптимизации подходов к генетической терапии ПКМД.

Степень разработанности темы исследования

Саркогликанопатии распространены во всем мире, и как часть генетического разнообразия ПКМД активно изучаются зарубежным научным сообществом на протяжении последних 25 лет. Исследуются как клинические и диагностические аспекты данной группы заболеваний, так и фундаментальные молекулярно-генетические основы, включая этиопатогенез и различные подходы к генотерапии.

Наибольшее количество исследовательских работ посвящены описанию клинических особенностей сакрогликанопатий, мутационного разнообразия причинных генов в различных популяциях, выявлению мажорных мутаций, характерных для различных популяций, определению долей генетических вариантов саркогликанопатий среди всех ПКМД. Так для гена SGCA, ассоциированного с наиболее частой в мире формой саркогликанопатии - ПКМД 2D - описана мажорная мутация с. 229С>Т (p.Arg77Cys), встречающаяся практически во всех исследованных популяциях мира. Также в ряде работ установлено накопление мутаций в экзонах 3 и 5 данного гена [Carrie A. et al., 1997; Trabelsi M. et al., 2008]. Для генов SGCB и SGCG также описаны мажорные мутации, характерные для отдельных эндемичных регионов [Alavi A. et al.,

2017; Khadilkar S.V. et al., 2009; Piccolo F. et al., 1996; Todorova A. et al., 1999]. В то же время исследовательских работ относительно эпидемиологии ПКМД 2C-F очень мало. Частота саркогликанопатий известна для ограниченного количества стран (Великобритания, Италия, Нидерланды). Малым количеством больных с данными патологиями объясняется существующая в настоящее время проблема не установленных гено-фенотипических корреляций между типом мутаций ассоциированных генов и тяжестью клинических проявлений. Два патогенных варианта гена SGCA (c.739G>A (p.Val247Met) и с.850С>Т; (p.Arg284Cys)) в нескольких научных работах описаны как приводящие к более мягким клиническим проявлениям ПКМД при наличии их у больных в гомозиготном или компаунд-гетерозиготном состоянии [Carrie A. et al.; 1997, Trabelsi M. et al.; 2008, Tarnopolsky M. et al., 2015]. Некоторыми исследовательскими группами установлены статистически не доказанные тенденции к формированию более тяжелого фенотипа ПКМД при наличии в генотипе больных Loss-of-function (LoF) вариантов [Eymard B. et al., 1997].

Многочисленные зарубежные работы по исследованию саркогликанопатий внесли серьезный вклад в изучение рассматриваемой подгруппы ПКМД. Однако в России проблема исследования саркогликанопатий остается по-прежнему актуальной, поскольку до настоящего времени глубокого и всестороннего изучения данной подгруппы наследственных заболеваний как на молекулярном, так и на клиническом уровне не проводилось.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования является молекулярно-генетический анализ и характеристика клинических особенностей саркогликанопатий в выборке больных из РФ.

Для достижения цели поставлены следующие задачи:

1. Разработать диагностическую систему для поиска мутаций в генах SGCA, SGCB, SGCG и SGCD. Оценить эффективность разработанной системы.

2. Определить доли различных форм саркогликанопатий в группе ПКМД в РФ. Оценить частоту саркогликанопатий в РФ.

3. Определить особенности спектров мутаций генов ЗОСЛ, ЗОСВ, ЗОСО, БОСО у российских больных. Определить наличие «горячих» экзонов и мажорных мутаций в исследуемых генах.

4. На основе полученных данных о долях разных форм саркогликанопатий и спектрах мутаций усовершенствовать систему молекулярной диагностики частых мутаций распространенных в РФ типов ПКМД.

5. Проанализировать особенности фенотипов саркогликанопатий. Провести сравнительный анализ клинической картины саркогликанопатий с другими распространенными в РФ типами ПКМД. По возможности оценить особенности клинических проявлений внутри группы саркогликанопатий.

6. Оптимизировать алгоритм молекулярно-генетической диагностики саркогликанопатий в РФ.

Методология и методы диссертационного исследования

Методологической и теоретической основной диссертационного исследования явились научные работы отечественных и зарубежных исследователей в области изучения саркогликанопатий, молекулярно-генетических подходов к их диагностике и популяционных исследований.

В работе использованы следующие методы: выделение геномной ДНК, метод полимеразной цепной реакции, метод прямого автоматического секвенирования по Сэнгеру, массовое параллельное секвенирование панели генов, электрофорез в полиакриламидном геле, мультиплексная проба-зависимая лигазная реакция, методы статистической обработки данных и биоинформатического анализа данных МПС.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Показана низкая представленность саркогликанопатий в РФ, как и в большинстве стран, в которых проведено подобное исследование (расчетная частота саркогликанопатий в РФ - 1:1534000 (95%ДИ: 1:4202000 - 1:851000)). Доля саркогликанопатий в исследуемой выборке российских больных ПКМД составила не менее 5,7%, среди больных МДД/Б - не менее 1% от всей выборки и 2,3% среди пациентов без протяженных делеций/дупликаций в гене ОМО.

2. Превалирующей формой саркогликанопатии у российских больных является ПКМД 2Б, встречающаяся у 4,6% (13/281) больных ПКМД и 0,8% (4/480) больных с

клиническим диагнозом «МДД/Б». Общий вклад минорных саркогликанопатий (ПКМД 2С, ПКМД 2Е и ПКМД 2Б) составил 1,1% (3/281) и 0,2% (1/480) в выборках больных ПКМД и МДД/Б соответственно.

3. У российских больных в гене БОСЛ идентифицированы три мажорных варианта (с.229С>Т, е.27Ю>А и с.574С>Т) и показано наличие двух «горячих» экзонов (3 и 5).

4. Существуют статистически значимые отличия по частотам определенных клинических признаков в группах больных ПКМД 2Б и 2 А, 21, МДД/Б.

5. Повышена эффективность тест-системы диагностики частых мутаций генов БОСЛ, СЛРЫ3, ЕКЯР и ЛЫ05, ответственных за наиболее распространенные в РФ типы несиндромальных аутосомно-рецессивных ПКМД. Разработана эффективная молекулярная диагностика саркогликанопатий и некоторых других псевдогипертофических типов ПКМД методом МПС.

6. Предложен алгоритм молекулярно-генетической диагностики больных псевдогипертрофическими типами ПКМД.

Научная новизна

В ходе настоящей работы впервые в РФ проведено исследование саркогликанопатий и генов, ответственных за их развитие, установлен вклад данной группы заболеваний в общую структуру ПКМД и МДД/Б, определены особенности спектров мутаций генов БОСЛ, БОСБ, БОСО, БОСО у российских больных.

Проанализированы особенности клинических проявлений ПКМД 2Б у больных, выявлены значимые отличия по ряду клинических признаков от других частых псевдогипертрофических типов ПКМД и МДД/Б.

Впервые в РФ предложен алгоритм молекулярно-генетической диагностики саркогликанопатий. В связи с появлением новых методов ДНК-диагностики впервые разработана МПС-диагностика для определения точковых мутаций генов БОСЛ, БОСБ, БОСО, БОСО и еще 11 генов, патогенные варианты в которых приводят к сходным с саркогликанопатиями клиническим состояниям.

Теоретическая и практическая значимость

Выявление характерных для больных в РФ мажорных мутаций и «горячих» экзонов в генах БОСЛ и БОСБ, а также определение доли тестируемых генетических

вариантов саркогликанопатий в общей структуре группы ПКМД и выявление особенностей их клинических проявлений позволило оптимизировать медико-генетическое консультирование больных ПКМД. В диагностическую практику саркогликанопатий внедрен метод массового параллельного секвенирования, а разработка на основании полученных данных системы детекции частых мутаций наиболее распространенных в РФ типов ПКМД дала возможность значительно удешевить процесс установления молекулярно-генетической причины заболевания у больных с псевдогипертрофическими типами ПКМД.

Степень достоверности результатов

Работа проведена на достаточном объеме выборки больных из Российской Федерации для выявления генетических вариантов саркогликанопатий (281 больной ПКМД и 480 больных МДД/Б). Исследование выполнено при использовании современных молекулярно-генетических методов диагностики, методов обработки данных и статистического анализа. Для теоретического обоснования и сравнительного анализа привлечено большое количество источников отечественной и зарубежной литературы. Результаты, полученные автором, свидетельствуют о выполнении поставленных задач, выводы и умозаключения подкреплены убедительными экспериментальными данными и полностью отражают результаты проведенного исследования.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Диссертация соответствует паспорту специальности 03.02.07 - «Генетика» (медицинские науки) - «Генетика человека. Медицинская генетика. Наследственные болезни. Молекулярные основы наследственности. Мутационная изменчивость. Популяционная генетика». Работа включает в себя обсуждение наследственных болезней, медицинской генетики, генетики человека, проблем популяционной генетики, генетической структуры популяций.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-генетический и клинический анализ саркогликанопатий в Российской Федерации»

Апробация работы

Материалы диссертации доложены на XI научной конференции «Генетика человека и патология» в г. Томск 27-30 ноября 2017 г., Третьей международной научно-практической конференции «МОКОЗ 2018» в г. Суздаль 25-27 апреля 2018,

Международной конференции «European Human Genetics Conference» в г. Гётебург, Швеция, 15-18 июня 2019 года.

Работа одобрена этическим комитетом и прошла экспертную комиссию, рекомендована к защите на заседании Диссертационного совета ФБГНУ «МГНЦ».

Личный вклад автора в проведение исследования

Автор непосредственно участвовал в разработке схемы эксперимента, постановке целей и задач, выборе методов исследования, проведении всех этапов эксперимента. Автором настоящей работы сформированы две экспериментальные выборки образцов ДНК, проведен молекулярный анализ ДНК в общей сложности 761 пробанда со входящими клиническими диагнозами «ПКМД» и «МДД/Б», заполнены и обработаны карты фенотипов больных четырьмя различными формами мышечной дистрофии. Автором проанализировано обширное количество литературы по теме диссертации, обработаны и проанализированы полученные результаты, проведен математический анализ данных, сформулированы основные результаты и выводы и написана рукопись. Результаты настоящего исследования опубликованы в рецензируемых журналах, а также представлены на российских научных конференциях лично автором.

Публикации

Материалы диссертации представлены в 7 печатных работах соискателя, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ для соискателей ученой степени кандидата медицинских наук (2 из них WoS и SCOPUS).

Структура и объем диссертации

Диссертация имеет следующую структуру: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты и обсуждения, заключение, выводы, практические рекомендации, список литературы, приложение. Работа представлена на 152 страницах машинописного текста, содержит 22 таблицы, 20 рисунков и одно приложение. Библиографический указатель включает 133 наименования, из них 5 отечественных и 128 иностранных источников.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 . Общие сведения

1.1.1. Современная классификации ПКМД и место саркогликанопатий в ее

структуре

Поясно-конечностные мышечные дистрофии (ПКМД) - генетически наследуемые заболевания, которые в первую очередь поражают скелетные мышцы, приводя к прогрессирующей, преимущественно проксимальной мышечной слабости, вызванной дегенерацией мышечных волокон. Для ПКМД характерна значительная генетическая гетерогенность, связанная с разнообразием белков, участвующих в образовании структуры мышечного волокна и сложном, многоступенчатом процессе его сокращения и стабилизации. Фенотипически подтипы ПКМД сильно варьируют по возрасту манифестации, скорости прогрессирования заболевания и общей тяжести. Тип наследования данной группы заболеваний - преимущественно аутосомный, поскольку ранее известные как Х-сцепленные рецессивные ПКМД МДД/Б и мышечная дистрофия Эмери-Дрейфуса (МД ЭМ) 1 типа в настоящий момент выделены как отдельные нозологии. Среди аутосомных ПКМД описаны как аутосомно-доминантные, так и аутосомно рецессивные формы, на которые приходится более 85% всех известных на данный момент форм. Номенклатура ПКМД исторически сложилась в виде численно-буквенного обозначения, где каждому вновь открытому типу присваивался индекс «1» в случае аутосомно-доминантного типа наследования и индекс «2» - в случае аутосомно-рецессивного. За этим индексом в названии типа ПКМД следовала буква латинского алфавита (от A до Z), присваиваемая в соответствии с алфавитной последовательностью каждому последующему открытому типу, что в том числе позволяло проследить исторический компонент в классификации. Когда количество идентифицированных типов превысило количество букв латинского алфавита, на 229-м Интернациональном заседании научной группы экспертов по нервно-мышечным состояниям в 2017 году провели пересмотр структуры ПКМД и ее переклассификацию [Straub V. et al., 2018]. Несколько известных ранее типов, описанных как ПКМД (2R или миофибриллярная миопатия, обусловленная мутациями гена DES, а также 2V или болезнь Помпе, обусловленная мутациями гена GAA) исключены из классификации по причине поражения преимущественно дистальных отделов конечностей и отличных

гистологических особенностей соответственно. Предложенная формула именования выглядит следующим образом: «ПКМД, тип наследования (Я для аутосомно-рецессивного или Б - для аутосомно-доминантного), порядок идентификации (число), ассоциированный белок». Обновленная классификация представлена в таблице 1. Установлены критерии выделения вновь обнаруженных типов ПКМД. Чтобы считаться отдельным нозологическим типом, состояние должно быть зарегистрировано по крайней мере в двух неродственных семьях с больными людьми, достигшими периода нормального моторного развития. Больные должны иметь повышение концентрации КФК в крови, дегенеративные изменения мышц при визуализации на МРТ и дистрофические изменения в мышечной ткани при гистологическом анализе, нарастающие с течением времени. Согласно установленным критериям типы ПКМД 2W, ПКМД 2Х, ПКМД 2Y, помеченные в таблице знаком «*» нельзя выделить как самостоятельные нозологические единицы, поскольку каждая из них описана только в одной семье.

Таблица 1

Обновленная классификация аутосомно-рецессивных типов ПКМД.

Прежнее название Ген Локус Новое название и ассоциированный белок

ПКМД 2A CAPN3 15q15.1 ПКМД R1 кальпаинЗ-связанная

ПКМД 2B DYSF 2p13.2 ПКМД R2 дисферлин-связанная

ПКМД 2C SGCG 17q21.33 ПКМД R5 у-саркогликан-связанная

ПКМД 2D SGCA 4q12 ПКМД R3 а-саркогликан-связанная

ПКМД 2E SGCB 13q12.12 ПКМД R4 Р-саркогликан-связанная

ПКМД 2F SGCD 5q33.2-q33.3 ПКМД R6 S-саркогликан-связанная

ПКМД 2G TCAP 17q12 ПКМД R7 телетонин-связанная

ПКМД 2H TRIM32 9q33.1 ПКМД R 8 TRIM 32-связанная

ПКМД 2I FKRP 19q13.32 ПКМД R9 FKRP-связанная

ПКМД 2J TTN 2q31.2 ПКМД R10 titin-related

ПКМД 2K POMT1 9q34.13 ПКМД R11 POMT1 -связанная

ПКМД 2L ANO5 11p14.3 ПКМД R12 аноктамин5-связанная

ПКМД 2M FKTN 9q31.2 ПКМД R13 фукутин-связанная

ПКМД 2N POMT2 14q24.3 ПКМД R14 POMT2-связанная

ПКМД 2O POMGnT1 1p34.1 ПКМД R15 POMGnT1-связанная

ПКМД 2P DAG1 3p21.31 ПКМД R16 а-дистрогликан-связанная

Прежнее название Ген Локус Новое название и ассоциированный белок

ПКМД 2Q PLEC 8q24.3 ПКМД R17 плектин-связанная

ПКМД 2S TRAPPC11 4q35.1 ПКМД R18 TRAPPC11-связанная

ПКМД 2T GMPPB 3p21.31 ПКМД R19 GMPPB-связанная

ПКМД 2U ISPD 7p21.2-p21.1 ПКМД R20 ISPD-связанная

ПКМД 2W* PINCH2 (LMS2) 2q14.3 PINCH-2-связанная миопатия?

ПКМД 2X* BVES 6q21 BVES-связанная миопатия?

ПКМД 2Y* TOR1AIP1 1q25.2 TOR1AIP1-связанная миопатия?

ПКМД 2Z POGLUT1 3q13.33 ПКМД R21 POGLUT1 -связанная

Миопатия Бетлема COL6A1, COL6A2, COL6A3 21q22.3 21q22.3 2q37.3 ПКМД R22 коллаген 6-связанная

Ламинин связанная миопатия LAMA2 6q22.33 ПКМД R23 ламинин а2-связанная

Среди представленных аутосомно-рецессивных типов можно выделить отдельную подгруппу саркогликанопатий, объединенную на основании единого патогенетического механизма формирования клинической картины ПКМД. Указанная подгруппа ПКМД стала предметом изучения настоящей работы. Для удобства восприятия названий саркогликанопатий и других типов ПКМД и во избежание возможной путаницы, все названия нозологий приведены по старой классификации ПКМД.

1.1.2. История открытия и изучения саркогликанопатий

Эра изучения мышечных дистрофий началась около 150 лет назад, когда в 1852 году впервые детально описана клиническая картина мышечной дистрофии Дюшенна (МДД), которой болели только лица мужского пола [Duchenne G., 1868; Meryon E.]. В середине XX века стали появляться сообщения о случаях прогрессирующей мышечной дистрофии на клиническом уровне практически неотличимой от МДД, но поражающей в том числе и женщин. Эта неизвестная тогда еще форма получила название «МДД-подобной» аутосомно-рецессивной мышечной дистрофии или тяжелой детской аутосомно-рецессивной мышечной дистрофии [Kloepfer H.W., Talley C., 1958]. Позже стало известно, что МДД и ее клинически более мягкая аллельная форма - мышечная дистрофия Беккера (МДБ) - обусловлены мутациями в гене белка дистрофина (DMD)

[Hoffman E.P. et al., 1987; Koenig M. et al., 1987]. Дальнейшие исследования структуры и функций локализованного в клеточной мембране дистрофина привели к открытию других дистрофин-ассоциированных белков, формирующих единый трансмембранный дистрофин-гликопротеиновый комплекс (ДГК). В рамках данного комплекса выявлен еще один подкомплекс, состоящий из четырех субъединиц, именуемых саркогликанами (от словосочетания «сарколеммные гликопротеины») [Yoshida M. et al., 1994]. В процессе генетического картирования - основного инструмента медицинской генетики, выявляющего причинно-следственные связи между генами-кандидатами и различными наследственными заболеваниями, стала очевидной взаимосвязь мутаций в генах, кодирующих субъединицы саркогликанового комплекса (а, ß, у и 8) и четырех типов аутосомно-рецессивных поясно-конечностных мышечных дистрофий (ПКМД), или саркогликанопатий.

Первыми зарегистрированными упоминаниями саркогликанопатий явились сообщения о больных тяжелой «МДД-подобной» аутосомно-рецессивной формой ПКМД в семьях из северной Африки (Тунис) [Ben Othmane K. et al., 1992]. Используя более 100 микросаттелитных полиморфных маркеров, в трех высокоинбредных тунисских семьях установлено сцепление заболевания с локусом 13q12. В соответствии с современной классификацией ПКМД этой форме мышечной дистрофии присвоили название ПКМД 2С, поскольку к тому времени уже были открыты две аутосомно-рецессивные формы ПКМД: 2А и 2B, вызываемые мутациями в генах CAPN3 и DYSF [Bashir R. et al., 1996; Ben Othmane K. et al., 1992; Bushby K.M., Beckmann J.S.; Richard I. et al., 1995]. В образцах мышечной биопсии больных из тунисских семей обнаружено характерное снижение экспрессии белка а-саркогликана - первого идентифицированного представителя саркогликанового семейства [Roberds S.L. et al., 1993], тесно связанного с ДГК сарколеммы мышечных волокон и на тот момент времени еще не имеющего точного кодирующего локуса. Когда в 1994 стало известно, что ген, кодирующий а-саркогликан, картирован на хромосоме 17q21, все ранее встретившиеся случаи ПКМД, сцепленные с данным локусом и весьма вариабельные по тяжести клинической картины, стали обозначать как ПКМД 2D. Следующей открытой формой стала ПКМД 2E, когда в 1995 году у больных ПКМД амишей из штата Индиана (США) обнаружили сцепление заболевания с локусом 4q12 и миссенс-мутацию p.Tyr151Arg гена, кодирующего еще один компонент саркогликанового комплекса ДГК - ß-

саркогликан [Lim L.E. et al., 1995]. В том же году исследовательская группа Noguchi et al., продолжив изучение структуры и функций ДГК, наконец, идентифицировала ген на хромосоме 13q12, кодирующий у-субъединицу саркогликанового комплекса, и тем самым установила генетическую причину ПКМД 2С [Noguchi S. et al., 1995]. Чуть позднее в нескольких бразильских семьях у больных тяжелой «МДД-подобной» мышечной дистрофией выявили сцепление заболевания с хромосомой 5q33-34, а затем другая рабочая группа открыла в этом локусе ген, кодирующий S-саркогликан -четвертый член саркогликанового семейства [Nigro V. et al., 1996; Passos-Bueno M.R. et al., 1996]. Таким образом, была открыта ПКМД 2F - последняя из саркогликанопатий, фенотипически проявляющаяся мышечной дистрофией.

1.1.3. Эпидемиология

Распространенность ПКМД 2C - F варьирует в различных популяциях. Данные по частоте саркогликанопатий имеются для очень ограниченного числа стран. Так, в Великобритании она составляет 1:370000 [Norwood F.L.M. et al.], в Италии - 5,6:1000000 (ПКМД 2D - 3,02:1000000, ПКМД 2E - 0,86:1000000, ПКМД 2C - 1,72:1000000) [Fanin M. et al., 1997], в Нидерландах - 1:253000 [Ten Dam L. et al., 2019]. Для ряда других стран известна доля саркогликанопатий от всех типов ПКМД, включая аутосомно-доминантные. В США она составляет 15% [Moore S.A. et al., 2006], в Индии - 53,8% [Meena A.K. et al., 2007], в Италии - 18,1% [Guglieri M. et al., 2008], в Мексике - 14% [Gomez-Diaz B. et al., 2012], в Великобритании - 11.7% [Norwood F.L.M. et al.], а в Бразилии - 32%, причем доля этой группы заболеваний оказалась выше среди больных с тяжелыми формами (68%) [Gouveia T.L. et al., 2006; Vainzof M. et al., 1999]. В Германии, Дании и Чехии на долю саркогликанопатий приходится 23%, 22,3% и 2,3% от всех аутосомно-рецессивных типов ПКМД, соответственно, при этом в Чехии все случаи приходятся на ПКМД 2D [Ginjaar H.B. et al., 2000; Stehlikova K. et al., 2014; Sveen M.L. et al., 2006].

Процентное соотношение каждой из саркогликанопатий внутри группы в целом различается несущественно для многих популяцией, кроме изолятов, для которых весомое значение имеет эффект основателя. Самым частым из типов независимо от региона, как правило, является ПКМД 2D. ПКМД 2С и 2Е либо равновероятно представлены среди больных [Guglieri M. et al., 2008; Moreira E.S. et al.], либо

отмечается преобладание какой-либо из этих форм (чаще ПКМД 2E) в зависимости от конкретной популяции [Moore S.A. et al., 2006; Trabelsi M. et al., 2008]. В Иране 2Е -самая частая форма. Наиболее редкой формой в большинстве стран оказалась ПКМД 2F, за исключением Индии, где она является второй по частоте саркогликанопатией после ПКМД 2С, что тоже весьма необычно [Meena A.K. et al., 2007]. Известны и другие регионы, в которых ПКМД 2С встречается чаще других саркогликанопатий, например, страны северной Африки (Тунис, Алжир, Марокко) [McNally E.M. et al., 1996; Noguchi S. et al., 1995]. В Марокко частота ПКМД 2С, обусловленная единственной мутацией с.525delT, достигает 1:20492 [El Kerch F. et al., 2014].

1.2. Молекулярные аспекты саркогликанопатий: гены и их белковые

продукты

1.2.1. Структура и функции саркогликанов

Саркогликаны представляют собой трансмембранные белки, имеющие короткий внутриклеточный конец, единичный трансмембранный домен и протяженный внеклеточный гликозилированный участок. К настоящему времени известно шесть представителей данного семейства, именуемых буквами греческого алфавита: а, в, у, 8, е и Z (табл. 2).

Таблица 2

Биохимические и молекулярные характеристики саркогликанов.

Белок Ген Локус Длина белка, АА Молекулярная масса, кДа Протяженность гена, т.п.н Заболевание

а-СГ SGCA 17q21 387 42.9 (50**) 9,9 ПКМД 2D

ß-СГ SGCB 4q12 318 34.8 (43**) 17,8 ПКМД 2E

у-СГ SGCG 13q12 291 32.4 (35**) 144,2 ПКМД 2С

8-СГ SGCD 5q33 290 32.1 (35**) 432,8 ПКМД 2F

е-СГ SGCE 7q21 437 49.9 70,9 Миоклоничес-кая дистония

Z-СГ SGCZ 8p22 312 34.5 1148,5 -

Примечание: *СГ - саркогликан; **- молекулярная масса гликозилированного белка.

а- и у-Саркогликаны экспрессируются исключительно в скелетных и сердечной мышцах, в то время как ß-, 8-, е- и Z-саркогликаны встречаются и в других тканях, например в гладкомышечной ткани сосудов [Bonnemann C.G. et al., 1995; Ettinger A.J. et al., 1997; Lim L.E. et al., 1995; Nigro V. et al., 1996; Noguchi S. et al., 1995; Roberds S.L. et

al., 1994; Wheeler M.T. et al., 2002]. a- и е-Саркогликаны являются высоко гомологичными мембранными белкам I типа с внеклеточным N-концевым доменом; в-, ô-, у- и Z-саркогликаны также имеют высокую степень гомологии и относятся к мембранным белкам II типа с внеклеточным C-концевым доменом [Chen J. et al., 2006; Shiga K. et al., 2006]. На внеклеточном домене всех саркогликанов находится цистеиновый кластер, имеющий, как полагают, исключительное значение для формирования третичной структуры белка и дальнейшей сборки саркогликанового комплекса, образуемого четырьмя субъединицами: a, в, у и ô. [Chan Y.M. et al., 1998].

Анализ белковой последовательности показал, что саркогликаны, помимо взаимно противоположной ориентации N- и C-концов, между собой различаются количеством цистеиновых остатков, N-связанных сайтов гликозилирования, а также наличием характерных сайтов связывания различных функциональных групп или других белков. a-Саркогликан, ранее известный как адгалин (араб. «Adhal» - мышца), содержит N-концевую сигнальную последовательность, пять внеклеточных цистеиновых остатков и два N-связанных сайта гликозилирования, которые являются консервативными для всех видов. После расщепления сигнальной последовательности и гликозилирования формируется белок молекулярной массой около 50 кДа. В N-концевой области a-саркогликана имеется кадгерин-подобный участок и Ca2+-связывающие карманы, наличие которых также описано для a-дистрогликанов, что свидетельствует о возможной Са2+-зависимой гетеротипической адгезии между белками [Dickens N.J. et al.]. Кроме того, a-саркогликан имеет АТФ-связывающую последовательность во внеклеточном домене, с помощью которой он, как полагают, может регулировать активность некоторых рецепторов путем связывания внеклеточного АТФ [Betto R. et al., 1999].

Молекулярная масса гликозилированного в-саркогликана составляет около 43 кДа, его протяженный внеклеточный С-концевой участок содержит пять цистеиновых остатков и три N-связанных сайта гликозилирования; внутриклеточный N-конец содержит большой гидрофобный участок [Hack A. A. et al., 2000]. Масса гликозилированных y-, ô-, и Z-саркогликанов одинакова и составляет приблизительно 35 кДа. у- и Z-Саркогликаны имеют четыре цистеиновых остатка и один N-связанный сайт гликозилирования в своей внеклеточной области; ô-саркогликан содержит также четыре остатка цистеина, но N-связанных сайтов гликозилирования у него три [Hack A.A. et al.,

2000; Nigro V. et al., 1996; Wheeler M.T. et al., 2002]. Стоит отметить, что присутствие на N-конце сайта гликозилирования белка, называемого также N-гликаном, не обязательно приравнивается к реальному событию гликозилирования. Поскольку молекулярные массы негликозилированных у- и 8-саркогликанов идентичны (32 кДа), то при наличии трех N-гликанов у 8-саркогликана его масса ожидаемо должна быть больше, чем масса у-саркогликана, имеющего только один N-гликан, однако, этого не наблюдается. Следовательно, либо, в конечном счете, гликозилируется только один N-гликан 8-саркогликана, либо эти два белка по-разному модифицируются на этапе посттрансляционного процессинга. Рядом авторов проведен функциональный и структурный анализ саркогликанов на клеточной культуре COS-1, в ходе которого стала известна роль гликозилирования N-гликанов у- и 8-саркогликанов, которая заключается в запрограммированном внутриклеточном транспорте собранного саркогликанового комплекса к месту последующей локализации-клеточной мембране [Chen J. et al., 2006; Hack A. A. et al., 2000]. Авторами исследования предложена собственная структурная модель, в которой внеклеточная часть саркогликанового комплекса в целом и каждой из субъединиц в частности в определенной области, называемой протеазо-чувствительной линкерной последовательностью, условно подразделяется на проксимальную N-концевую часть и дистальную С-концевую часть (рис. 1). Установлено, что посредством своих N-концевых внеклеточных участков в-, 8-, у-субъединицы взаимодействуют друг с другом, при этом а-саркогликан взаимодействует непосредственно только с у-субъединицей. На С-концевых внеклеточных участках в-, 8-, у-субъединиц имеются несколько консервативных участков и цистеин-богатый мотив, по расположению цистеиновых остатков гомологичный цистеиновому мотиву эпидермального фактора роста (ЭФР, последовательность CxCPxG[x]5-15C [McNally E.M. et al., 1996]). Мутации в этих регионах приводят к тому, что образовавшийся комплекс не может достигнуть клеточной мембраны и закрепиться в ней.

С помощью мутационного анализа обнаружены и другие участки аминокислотной последовательности саркогликанов, критичные для формирования саркогликанового комплекса и его локализации на клеточной мембране, а именно: протеазо-чувствительные сайт и С-концевая консервативная последовательность. В тоже время мутации N-концевого внеклеточного региона, прилегающего к трансмембранному домену, нарушают взаимодействие между субъединицами и влияют на устойчивость

комплекса в целом. Также экспериментально подтверждена гипотеза о взаимодействии внутриклеточных доменов в- и 8-саркогликанов с С-концевым участком дистрофина.

Рисунок 1. Предполагаемая структура саркогликанового комплекса. Примечание: заштрихованные кружки - протеазо-чувствительные линкерные последовательности; черные кружки - потенциальные линкерные последовательности, предсказанные компьютерным анализом, но не обнаруженные протеолизом; заштрихованные квадраты - области так называемой новой консервативной последовательности. Внутримолекулярные дисульфидные мостики и N-связанные сайты гликозилирования обозначены "-S-" и "Y", соответственно [Chen J. et al., 2006].

1.2.2. Роль саркогликанов в составе дистрофин-гликопротеинового комплекса

Экспериментальные данные о том, что а-, Р-, у- и S-саркогликаны организуются на клеточной мембране в виде тетрамерного комплекса, который экспрессируется исключительно в поперечно-полосатых мышцах, согласуются с доказанным уже фактом формирования миопатического фенотипа при возникновении мутации в генах, кодирующих эти четыре белка. Исследования сборки саркогликанового комплекса на ранней стадии дифференцировки миотубулл показывают, что саркогликаны котрансляционно перемещаются в эндоплазматический ретикулум (ЭР), где они

собираются в комплекс в аппарате Гольджи и транспортируются к плазматической мембране [Chan Y.M. et al., 1998; Hegde R.S., Kang S.W., 2008]. В ЭР полипептидный фолдинг белков осуществляется посредством оксидоредуктазы семейства PDI (Protein disulfide isomerases) и пептидил-пропил цис/транс-изомеразы, которые обеспечивают формирование и изомеризацию дисульфидных связей, правильную цис-или трансизомеризацию и предотвращают образование агрегатов [Hebert D.N., Molinari M., 2007]. Этот процесс осуществляется при участии молекулярного аппарата контроля качества в целях отсева белков, имеющих неправильную конформацию. Такие белки узнаются, перенаправляются на повторный фолдинг для достижения ими нативной (биологически активной) конформации, а в случае неудачи - отправляются в цитозоль для протеосомной деградации через путь, опосредуемый белками ЭР-ассоциированной деградации (ЭРАД; ERAD - ER-associated protein degradation) (рис. 2) [Anelli T., Sitia R., 2008].

На культуре клеток СНО получены экспериментальные доказательства в пользу того, что одновременный синтез четырех саркогликанов является обязательным условием для правильной сборки саркогликанового комплекса и позиционировании его на клеточной мембране [Holt K.H., Campbell K.P., 1998]. Похожие результаты получены на культуре миогенных клеток C2C12, подтверждая, что субъединицы саркогликанов в ЭР инициируют взаимодействие друг с другом для образования комплекса сразу после синтеза [Noguchi S. et al., 2000]. Точный механизм молекулярных взаимодействий сборки саркогликанов в единый комплекс до сих пор остается невыясненным, но большинство полученных экспериментально данных указывают на следующую последовательность событий сборки саркогликанового комплекса: (1) ß-субъединица инициирует сильное взаимодействие с S-субъединицей; (2) у-субъединица присоединяется к ßS-ядру комплекса; (3) затем присоединяется а-субъединица путем взаимодействия с у-субъединицей [Chan Y.M. et al., 1998]. Помимо основной предложена альтернативная последовательность сборки, где а-субъединица непосредственно взаимодействует с ßy-саркогликановым ядром [Draviam R.A. et al., 2006; Hack A.A. et al., 2000]. Далее происходит экспорт собранного комплекса в аппарат Гольджи, где, как предполагается, к нему присоединяются дистрогликаны и саркоспан, после чего образовавшийся мультимерный комплекс транспортируется к клеточной мембране [Noguchi S. et al., 2000]. Однако, последние исследования дают основания

полагать, что саркогликаны, дистрогликаны и саркоспан могут выходить из ЭР независимо друг от друга, а затем осуществлять сборку непосредственно во время транспортировки к клеточной мембране ^Ш^п MJ., McNally E.M., 2007]. Затем в клеточной мембране происходит взаимодействие образовавшегося комплекса с другими цитоплазматическими и внеклеточными компонентами, формируя конечную структуру многомерного ДГК (рис. 3) [Ozawa E., 2010].

Рисунок 2. Процессинг правильно сформированных и мутантных саркогликанов в ЭР. Примечание: в ЭР незрелые саркогликаны подвергаются котрансляционному гликозилированию и последующему конформационному фолдингу (а). Неправильно свернутые полипептиды отправляются на повторный фолдинг, осуществляемый циклической калнексин-калретикулиновой системой (CNX) при участии фермента УДФ-глюкозо-гликопротеин-глюкозилтрансферазы (UGGT) (б). Правильно свернутый белок включается в процесс последующей сборки тетрамерного комплекса (в), который затем экспортируется из ЭР (г). Неправильно свернутые белки расщепляются посредством ЭР-ассоциированной деградации (ERAD) при участии маннозидазы I (М) (д). Субъединицы, не способные сформировать комплекс, также подвергаются деградации (пунктирная стрелка). ЭР-ассоциированная деградация заключается в сложном процессе распознавания белка, не поддающегося повторному фолдингу (R),

обратного транспорта из ЭР (RT) и окончательного расщепления белка убиквитин-протеосомной системой (е) [Sandona D., Betto R., 2009].

Рисунок 3. Схема дистрофин-гликопротеинового комплекса [Sandona D., Betto R., 2009].

Основным компонентом ДГК комплекса является дистрофин - большой актин-связывающий белок цитоскелета, который имеет важное значение для организации связанного с клеточной мембраной ДГК [Ervasti J.M., 2007]. Трансмембранная структура, образованная дистрофином, дистрогликанами и а2-ламинином напрямую соединяет актиновый цитоскелет с внеклеточным матриксом. Соответственно, ДГК обеспечивает структурную поддержку плазматической мембраны и защищает ее от механического перенапряжения вследствие сократительной активности путем передачи бокового натяжения, порождаемого сокращением мышц, на внеклеточный матрикс [Petrof B.J. et al., 1993]. Генетические дефекты, приводящие к полному или частичному отсутствию компонентов ДГК, либо возникновению поврежденных или неполноценных белков, ответственны за развитие различных форм мышечной дистрофии, таких как МДД и МДБ, врожденная мерозин-негативная мышечная дистрофия и ПКМД.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Булах Мария Васильевна, 2019 год

Тип Использованные Ссылка

варианта предикторы

Миссенс Ми1айопТа81ег ИИр://,^^^ти1а1:юп1а81ег.ог§/

Ргоуеап/81БТ ИПр^/ргоуеап^суго^/тдех.рИр

иМБ-РгеШ^ог ИПр^/итд-рге&йог.еи/

БАТИММ ИПр^ЯаЬтт.Ыосотр^е.о^.ик/

Тип Использованные Ссылка

варианта предикторы

Миссенс PolyPhen-2 http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/

MutationAssessor http://mutationassessor.org/r3/

M-CAP http://bejerano.stanford.edu/mcap/

Вариант MutationTaster http://www.mutationtaster.org/

сайта NetGene2 http://www.cbs.dtu.dk/services/NetGene2/

сплайсинга FSPLICE http://www.softberry.com/berry.phtml?topic=fsplic e&group=programs&subgroup=gfind

Human Splicing http://www.umd.be/HSF/

Finder 3.1

ASSP http://wangcomputing.com/assp/

Для вспомогательного анализа структурного эффекта точковых мутаций на аминокислотную последовательность белков применяли онлайн-сервис HOPE [http://www.cmbi.ru.nl/hope], агрегирующий информацию из различных баз данных относительно структуры и функций анализируемых белков.

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ

ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Молекулярно-генетический анализ саркогликанопатий в выборках

больных МДД/Б и ПКМД

3.1.1. МПС в диагностике саркогликанопатий

В последнее десятилетие секвенирование нового поколения (Next Generation Sequensing) или как его еще называют Массовое параллельное секвенирование стремительно и прочно вошло в исследовательскую и диагностическую практику во многих лабораториях мира. Существенным и главным достоинством метода является его техническая адаптируемость под конкретные научные задачи, позволяющая анализировать как всю последовательность генома и экзома организмов, так и отдельные локусы. Выбор таргетных областей для анализа реализуем как на этапах "пробоподготовки" образцов и создания "библиотек" необходимых фрагментов ДНК, так и на этапе обработки данных полногеномного и полноэкзомного секвенирования, когда отсечение нецелевых регионов осуществляется с помощью программного обеспечения. На данный момент при секвенировании всего генома человека для 99% из 3,3*109 составляющих его нуклеотидов неизвестен клинический эффект. На экзом приходится всего 1% от генома (3*107нуклеотидов), но в нем находятся более 85% всех клинически-значимых вариантов. На сегодняшний день в базе данных HGMD описано всего 256070, в базе ClinVar [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/clinvar] около 500000 вариантов, для которых показана клиническая значимость. При этом при секвенировании полного экзома европейца в среднем обнаруживают 25000 - 28000 отличий от референсной последовательности, что делает их анализ очень трудоемким и времязатратным процессом. Поэтому, при наличии относительно специфичной клинической картины быстрее, логичнее и эффективнее исследовать панели генов, что является предпочтительным для научных исследований, когда суммарно получают большие массивы данных для объемных выборок больных.

Для настоящей работы спроектирована панель генов «ПКМД», описанная в главе 2. Данная панель использовалась для решения одной из главных задач работы - поиска изменений в четырех генах, мутации в которых приводят к формированию мышечных форм саркогликанопатий. Настоящим методом обследованы пациенты из двух выборок

больных с направляющими диагнозами «ПКМД» и «МДД/Б». В выборке больных с направляющим диагнозом «ПКМД» МПС проведено всем пробандам (281 пациент). В результате исследования у 12 больных обнаружили по два варианта нуклеотидной последовательности гена SGCA различной клинической значимости (табл. 10). Еще в одном случае идентифицирован уникальный генотип пробанда С131, у которого выявлены ранее описанные в литературе варианты с.574С>Т (р.Аг§192Тег) и c.662G>A (р.Аг§221И18) в гомозиготном состоянии (табл. 11). Нонсенс-вариант с.574С>Т (р.Аг§192Тег), описанный в двух источниках в четырех восточных семьях, несомненно является патогенным, что подтверждается в том числе результатами иммуногистохимического исследования биоптата мышечной ткани больных. В то же время клиническая значимость варианта с.662О>А (р.Аг§221И18) весьма спорна, поскольку данный вариант описан в гетерозиготном состоянии всего у одного пациента резко сниженным уровнем а-саркогликана при умеренном снижении остальных субъединиц, выявленного при иммуногистохимическом окрашивании биоптата мышц [Воко С. е! а1., 2003]. Второй мутации у этого пациента не выявлено. При этом данный вариант зарегистрирован в контрольных выборках агрегатора ОпотАБ с максимальной частотой 0,0072 у восточных азиат, среди которых у двоих членов выборки он встретился в гомозиготном состоянии. Согласно «Руководству по интерпретации данных» столь высокая частота варианта и наличие в контрольной выборке случаев гомозиготного носительства варианта, вкупе с тем, что у пациента также выявлен вариант с.574С>Т в гомозиготном состоянии, свидетельствует в пользу его доброкачественности. Снижение количества саркогликанов в мышечной ткани при иммуногистохимическом окрашивании биоптата мышц описанного в литературе больного [Воко С. е! а1., 2003] вероятнее всего вторично и вполне может объясняться наличием мутаций в генах, кодирующих белки, образующие тесную связь с саркогликановым комплексом. Например, ранее упоминались случаи, когда мутации гена DMD приводят ко вторичному снижению количества саркогликанов в мышечной ткани. Таким образом, варианты гена SGCA в исследуемой выборке встречаются у 4,6% больных ПКМД.

Также в группе больных ПКМД выявлены трое пробандов с генотипами, содержащими по два варианта гена SGCB, что составляет 1,1% от всей выборки. У одного больного выявлены варианты гена SGCG, причем методом МПС

зарегистрирован точковый вариант c.581T>C (p.Leu194Ser) в гомозиготном состоянии. В результате анализа числа копий гена SGCG методом MLPA выявлена делеция всего гена. Следовательно, варианты гена SGCG встретились у 0,4% больных в группе ПКМД. Варианты гена SGCD в выборке больных ПКМД не обнаружены.

Выборка 480 больных с направляющим диагнозом «МДД/Б» предварительно протипирована на наличие протяженных делеций/дупликаций в гене DMD, в результате чего мутации обнаружены у 265 больных, для которых установлен молекулярно-генетический диагноз «МДД/Б». Остальные 215 образцов ДНК исследованы методом таргетного МПС. По два варианта гена SGCA выявлены у 4 больных, что составляет 0,8% от всей выборки и 1,9% выборки больных МДД/Б без протяженных делеций/дупликаций гена DMD (табл. 12 и 13).

В гене SGCB у одного больного выявлен один патогенный вариант в гетерозиготном состоянии. Выявленный вариант нуклеотидной последовательности -c.341C>T (p.Ser114Phe) - является самой частой мутацией этого гена, встречающейся с максимальной частотой 0,00063 среди северо-западных европейцев. В соответствии с выбранной диагностической стратегией больному проведен MLPA-анализ, в результате которого протяженных делеций и дупликаций гена SGCB не выявлено. В качестве последнего доступного этапа диагностического поиска всю кодирующую последовательность гена SGCB исследовали методом прямого секвенирования по Сенгеру, поскольку основным ограничением МПС на основе полупроводникового секвенирования является снижение вероятности детекции вариантов, располагающихся в области гомополимеров, пропорциональное длине самого гомополимера. При этом наличие делеций и дупликаций более 10 п.н., а также других релевантных вариантов, «отфильтрованных» программным обеспечением в процессе формирования VCF-файла из-за низкого качества несущих их ридов, исключили очным просмотром сырых данных (в формате BAM) пробанда. Второго клинически значимого варианта также не обнаружено. Следует упомянуть, что конфигурация кастомной панели «Поясно-конечностные мышечные дистрофии» предполагала гарантированное покрытие только кодирующей последовательности и прилежащих ±10 п.н. интронных областей гена SGCB, что не позволяет детектировать варианты, располагающиеся глубоко в интронах или регуляторных областях гена. Это же ограничение распространяется на метод секвенирования по Сенгеру для данного гена. Поскольку второй мутации у этого

пробанда не найдено, подтвердить диагноз молекулярными методами на основании проведенного исследования для него не представляется возможным. В то же время нельзя исключить наличие у этого пробанда второго патогенного варианта в некодирующих и регуляторных областях гена SGCB, также как и популяционное носительство пробандом варианта с.341С>Т. В гене SGCD выявлен один патогенный вариант у одного пробанда в гомозиготном состоянии, что составляет 0,2% среди всей выборки МДД/Б и 0,5% среди пациентов с МДД/Б без протяженных делеций/инсерций в гене DMD. Ни одного больного с патогенными вариантами гена SGCG в выборке больных МДД/Б не выявлено.

В генах SGCA, SGCB, SGCG и SGCD в литературных источниках описаны крупные делеции и дупликации как одного или нескольких экзонов, так и всего гена. Для поиска таких вариантов у 129 больных без мутаций в 15 генах, входящих в панель «ПКМД», или имеющих в генотипе только один вариант в гене, ответственном за аутосомно-рецессивную форму ПКМД, проведен количественный анализ числа копий исследуемых регионов методом MLPA. Получить достоверные результаты удалось для 54 больных; в остальных случаях анализ оказался неинформативен в связи с неудовлетворительным качеством биологического материала. Ни в одном из 54 случаев не выявлено протяженных делеций/дупликаций в генах SGCA, SGCB, SGCG и SGCD. Важно отметить, что у пациентов без мутаций для подтверждения молекулярного диагноза необходимо выявить два протяженных варианта в одном из перечисленных генов, при этом, для крупных делеций они должны быть неперекрывающимися, иначе область перекрывания зарегистрировалась бы при анализе методом МПС как гомозиготная делеция. Поскольку чуть больше чем в трети случаев (54/129) мутации данного типа не найдены даже в гетерозиготном состоянии, то вероятность обнаружения таких больных в оставшихся непроанализированными 75 случаев минимальна. Для всех пробандов с вариантами, выявленными в гомозиготном состоянии также проведен МЬРА-анализ для установления копийности исследуемых областей. Все больные, кроме вышеописанного пробанда с вариантом с.581Т>С в гене SGCG, имели две копии исследуемых локусов.

При исследовании выборки больных ПКМД панелью из 15 генов у 151 больного выявлены варианты нуклеотидной последовательности в 11 генах (CAPN3 - 27,6%,

Варианты нуклеотидной последовательности, выявленные у больных из выборки «ПКМД».

Экзон / интрон Вариант Кол-во хромосом Домен № в HGMD, ссылки Критерии патогенности Клиническая значимость

нуклеотид аминокислота

SGCA 1 c.20G>A p.Trp7Ter 1 ВД: СП не описан PVS1+PM1,2 Патогенный

SGCA 2 c.101G>A p.Arg34His 2 ВД: КпД CM951149, Piccolo (1995) Nat. Genet.; Soheili (2012) Hum. Mutat.; Boyden (2010) Neurogenetics.11(4):449-455. PM2,5 +PP3,5 Патогенный (многократно описан)

SGCA 2 c.153T>G p.His51Gln 1 ВД: КпД не описан PM2+PP3,4+ BP4 НКЗ

SGCA 3 c.223delT p.Trp75Gly fs*136 1 ВД: КпД не описан PVS1+PM2+ PM3 Патогенный

SGCA 3 c.229C>T p.Arg77Cys 5 ВД: КпД CM951152, Bueno (1995) Hum. Mol. Genet.; Endo (1997) Nihon Rinsho; Walter (2004) Acta. Myol.; Tetreault (2011) Can. J. Neurol. Sci. PS+PM2+ PP3,5 Патогенный (многократно описан)

SGCA 3 c.271G>A p.Gly91Ser 5 ВД: КпД CM080532, Guglieri (2008) Hum. Mutat. PM2,5+PP3,5 Вероятно патогенный

SGCA 3 c.308T>C p.Ile103Thr 1 ВД: КпД CM971338, Duggan (1997) N. Engl. J. Med. PM2,5+PP3,4 Вероятно патогенный

SGCA 5 c.402C>G p.Tyr134Ter 1 ВД CM105561, Babameto-Laku (2011) Genet. Couns. PVS1+PM2 Вероятно патогенный

SGCA 5 c.574C>T p.Arg192Ter 5 ВД CM1111101, Schara (2001 Eur J Ped.; Reddy .(2016) Muscle Nerve,54(4):690-5 PVS1+PM2+ PP1 Патогенный

SGCA 5 c.584+5G>A сплайсинг 1 ВД CS105575, Boyden (2010) Neurogenetics. PM2+PP3 НКЗ

SGCA 6 c.739G>A p.Val247Met 1 ВД CM951157, Piccolo (1995) Nat. Genet. 10; 243.;Walter (2004) Acta Myol,; Soheili (2012) Hum Mutat. PS+PM2+ PP3,5 Патогенный (многократно описан)

Ген Экзон / интрон Вариант Кол-во хромосом Домен № в HGMD, ссылки Критерии патогенности Клиническая значимость

нуклеотид аминокислота

SGCA 7 c.850C>T p.Arg284Cys 2 ВД CM971346, Duggan (1997) N Engl J Med, Mongini (2002) Neuropediatrics; Avila De Salman (2007) Acta Myol. PS+PM2+ PP3,5 Патогенный (многократно описан)

Всего 12 26

SGCB 3 c.325C>T p.Arg109Ter 1 ВД CM080535, Guglieri (2008) Hum. Mutat. PVS1+PM2+ PP5 Патогенный

SGCB 3 c.341C>T p.Ser114Phe 1 ВД CM971349, Duggan (1997) N. Engl. J. Med.; Soheili (2012) Hum. Mutat.; van Spaendonck-Zwarts (2013) Eur. J. Heart Fail PS+PM2+ PP3,5 Патогенный (многократ-нс описан)

SGCB 3 c.355A>T p.Ile119Phe 1 ВД CM983768, Duclos (1998) Neuromuscul. Disord. PM2+PP3,4 НКЗ

SGCB 3 c.424C>T p.Gln142Ter 1 ВД не описан PVS1+PM2+ PP4 Вероятно патогенный

SGCB 4 c.551A>G p.Tyr184Cys 2 ВД CM981793, dos Santos (1998) Hum. Mut. PM2+ PP3,4,5 НКЗ/Вероятн( патогенный*

Всего 5 6

SGCG 7 c.581T>C p.Leu194Ser 1 ВД CM011483, van der Kooi (1998) Neuromuscul. Disord.; Khadilkar (2009) Neurol India 57:406-10. PS+PM2+ PP3,5 Патогенный

SGCG 1-8 с.(? -42) (744 ?)del (delex1-8) 1 ВД, ТМ, ВнД CG083442, Trabelsi (2008) Eur. J. Hu Genet, Bonnemann (2002) Neuromus Disord. -PV S1+PM2,3 Патогенный

Примечание: *Реклассифицирован как вероятно-патогенный на основании совокупности критериев и дополнительных данных (см. Главу 3.3). ВД - внеклеточный домен, ТМ - трансмембранный домен, ВнД - внутриклеточный домен, АСС -АТФ-связывающий сайт, СП - сигнальная последовательность, КпД - кадгерин-подобный домен, НКЗ - вариант

неопределенного клинического значения.

Генотипы и национальный состав больных из выборки больных ПКМД.

Пациент Пол Национальность больного Генотип, нуклеотидный вариант Генотип, аминокислотный вариант Клиническая значимость аллелей Статус диагноза

F100 ж удмуртка SGCA: c.[271G>A];[.271G>A] p.[G1y91Ser];[G1y91Ser] ВП/ВП Подтвержден

C115 ж русская SGCA: c.[229C>T];[.229C>T] р.[Лгв77Су8];[Лгв77Су8] П/П Подтвержден

C70 ж русская SGCA: c.402C>G(;)850C>T р.Туг134Тег(;)Лг§284Су8 ВП/П Подтвержден

C140 ж азербайджанка SGCA: c.229C>T(;)850C>T р.Лг§77Су8(;)Лг§284Су8 П/П Подтвержден

L468 ж удмуртка SGCA: c.[271G>A];[.271G>A] p.[G1y91Ser];[G1y91Ser] ВП/ВП Подтвержден

F121 ж русская SGCA: с.[229C>T];[223delT] p.[Лrg77Cys];[Trp75G1yfs*136] П/П Подтвержден

K. ж не известна SGCA: c.271G>A(;)308T>C p.G1y91Ser(;)I1e103Thr ВП/ВП Подтвержден

L486 м русский SGCA: c.229C>T(;)574C>T p.Лrg77Cys(;)Лrg192Ter П/П Подтвержден

C95 ж русская SGCA: c.584+5G>A(;)739G>A c.584+5G>A p (;)p.Va1247Met П/НКЗ Подтвержден*

C131 ж молдаванка SGCA: c.[574C>T];[574C>T] p.[Лrg192Ter];[Лrg192Ter] П/П Подтвержден

L466 ж русская SGCA: c.101G>A(;)153T>G p.[Лrg34His];[His51G1n] П/НКЗ Подтвержден*

L470 м аварец SGCA: c.[574C>T];[574C>T] p.[Лrg192Ter];[Лrg192Ter] П/П Подтвержден

L490 м русская SGCA: c.20G>A(;)101G>A p.Trp7Ter(;)His51G1n П/П Подтвержден

L418 ж русская SGCB: c.325C>T(;)551A>G p.Лrg109Ter(;)Tyr184Cys П/ВП Подтвержден*

C38 ж русская SGCB: c.355A>T(;)551A>G p.I1e119Phe(;)Tyr184Cys НКЗ/ВП Не подтвержден

E76 ж русская SGCB: c.341C>T(;)424C>T p.Ser114Phe(;)G1n142Ter П/П Подтвержден

C291 ж русская SGCG:c.[581T>C];[(?_-42)_ (744_?)del** p.[Leu194Ser];[0] ВП/П Подтвержден

Примечание: *- подтверждены на основании совокупности клинической значимости варианта и дополнительных критериев (см. Главу 3.3); ** - делеция всего гена SGCG, обозначенная на основе расположения олигонуклеотидных МЬРЛ-проб (сайты лигирования проб в последовательности первого и последнего экзонов гена SGCG, §.(?_23755168)_(23898548_?)де1); П -патогенный вариант, ВП - вероятно патогенный вариант.

Варианты нуклеотидной последовательности, выявленные у больных из выборки больных МДД/Б.

Ген Экзон/ интрон Вариант Кол-во хромосом Домен № в HGMD, ссылки Критерии патоген ности Клиническая значимость

нуклеотид амино кислота

SGCA 3 c.229C>T p.Arg77Cys 3 ВД: КпД CM951152, Bueno (1995) Hum. Mol .Gen.; Endo (1997) Nihon Rinsho; Walter (2004) Acta Myol. PS+PM2+ PP3,5 Патогенный (многократно описан)

SGCA 3 c.271G>A p.Gly91Ser 4 ВД: КпД CM080532, Guglieri (2008) Hum Mutat. PM2,5+ PP1,3,5 Вероятно патогенный

SGCA 3 c.308T>C p.Ile103Thr 1 ВД: КпД CM971338, Duggan (1997) N. Engl. J. Med. PM2,5+ PP3,4 Вероятно патогенный

Всего 3 8

SGCB 3 c.341C>T p.Ser114Phe 1 ВД CM971349, Duggan (1997) N Engl J Med.; Soheili (2012) Hum Mutat.; van Spaen-donck-Zwarts (2013) Eur. J. Heart Fail PS+PM2+ PP3,5 Патогенный (многократно описан)

Всего 1 1

SGCD 6 c.493C>T p.Arg165Ter 2 ВД CM971352, Duggan (1997) Neurogenetics. PVS1+PM2 +PP3,5 Патогенный

Всего 1 2

Генотипы больных из выборки больных МДД/Б.

Пациент Пол Национальность больного Генотип, нуклеотидный вариант Генотип, аминокислотный вариант Клиническая значимость аллелей Статус диагноза

1330 м мордвин-мокша SGCA: c.[229C>T];[229C>T] p.[Arg77Cys];[Arg77Cys] П/П Подтвержден

2435 м не известна SGCA: c.[229C>T](;)[308T>C] p. Arg77Cys(;)Ile103Thr П/ВП Подтвержден

2080 м русский SGCA: c.[271 G>A];[271 G>A] p.[Gly91Ser];[Gly91Ser] ВП/ВП Подтвержден

2380 м не известна SGCA: c.[271G>A];[271G>A] p.[Gly91Ser];[Gly91Ser] П/П Подтвержден

2210 м не известна SGCB: c.[341C>T];[=] p.[Ser114Phe];[=] П/- Не подтвержден

4290 м не известна SGCD: c.[493C>T];[493C>T] p.[Arg165Ter]; [Arg165Ter П/П Подтвержден

ЕКЯР - 8,1%, ЬМЫА - 4,2%, ВЫВ - 4,2%, АЫ05 - 1,1%, ЕКТЫ - 0,4%, БОСА - 4,6%, БОСБ - 0,7%, БОСО - 0,4%, - Р0МТ1 - 1,4%, САК3 - 0,7%), объясняющие клинический диагноз больных. Таким образом, эффективность таргетной МПС-системы «ПКМД» составила 53,7% для выборки больных ПКМД и 45,8% для выборки больных мужского пола с МДД/Б без протяженных делеций/дупликаций в гене ВЫВ (точковые мутации в гене ВЫВ - 40,4%, ЬМЫЛ - 2,4%, БОСА - 1,9%, СЛРЫ3 - 0,9%, БОСВ - 0,2%).

3.1.2. Анализ спектра мутаций генов 80СА, 80СБ, 80С0, 80СБ в исследуемых выборках

В группе больных ПКМД выявлено 12 различных вариантов нуклеотидной последовательности гена БОСА, 9 из них описаны в литературе ранее (75%), остальные 3 варианта (25%), среди которых единожды обнаружены нонсенс-вариант с.200>Л (р.Тгр7Тег), миссенс-вариант с.153Т>О (р.Н185Ш1п) и вариант со сдвигом рамки считывания е.223де1Т (р.Тгр75О1у^*136), выявлены впервые. Большинство вариантов являются точковыми и представляют собой однонуклеотидные миссенс- и нонсенс-замены (83%). Однократно встретились в выборке вариант сайта сплайсинга и однонуклеотидная делеция, приводящая к сдвигу рамки считывания.

Таблица 14

Сравнение частот встречаемости различных типов мутаций гена БОСА у больных саркогликанопатиями в исследуемых выборках больных из РФ и общей выборке из различных популяций мира.

Тип мутации Частота в мире* (%) Частота в РФ (%) 95% ДИ, % р-уа1ие

Миссенс 60,6 58,3 27,7 - 84,8 1,0

Нонсенс 5,8 25 5,5 - 57,2 0,076

Со сдвигом рамки считывания 21,1 8,3 0,2 - 38,5 0,694

Сайта сплайсинга 9,6 8,3 0,2 - 38,5 1,0

Крупные перестройки 3,8 0 - 1,0

Примечание: * получено на основании данных базы НОМБ.

Как следует из таблицы 14 у больных саркогликанопатиями в РФ чаще встречаются нонсенс-варианты и реже мутации, приводящие к сдвигу рамки считывания. При этом в сравниваемых выборках частоты встречаемости миссенс-вариантов и мутаций сайтов сплайсинга различаются незначительно. Однако, эти

различия статистически не значимы на уровне значимости а=0,05, что может объясняться малым количеством выявленных мутаций в этом гене.

Разнообразие вариантов в выборке больных МДД/Б представлено тремя миссенс-вариантами: c.229C>T (p.Arg77Cys), c.271G>A (p.Gly91Ser) и c.308T>C (p.Ile103Thr). Все выявленные в данной выборке варианты гена SGCA не уникальны и встретились также у больных в группе ПКМД. При этом парадоксальной особенностью спектра мутаций в группе больных МДД/Б является отсутствие «тяжелых» null-мутаций (Loss-of-function) - нонсенс-вариантов и вариантов со сдвигом рамки считывания - которые, теоретически, должны приводить к развитию более злокачественной «МДД-подобной» клинической картины.

Как следует из таблицы 15 только три варианта гена SGCA у российских больных имеют аллельную частоту более 10% среди всех хромосом с мутациями: c.229C>T, c.271G>A и a574C>T. Наиболее частыми вариантами стали миссенс-варианты c.229C>T и c.271G>A, аллельная частота которых составляет 23,5 и 26,5%, соответственно. Как отмечалось ранее, вариант с.229С>Т является самой частой и повсеместно встречающейся в мире мутацией этого гена [Carrie A. et al., 1997; Moreira E.S. et al.], обуславливая в некоторых популяциях до 100% случаев ПКМД 2D [Hackman P. et al., 2005]. Среди больных ПКМД в РФ доля этой мутации относительно невысока (23,5%) и даже несколько ниже частоты варианта c.271G>A (26,5%), который по литературным источникам зарегистрирован единожды в одной итальянской семье у двоих сибсов в компаунд-гетерозиготном состоянии с другой мутацией [Guglieri M. et al., 2008]. Аллельная частота нонсенс-варианта c.574C>T составляет 14,7% среди всех хромосом с мутациями. Этот вариант зарегистрирован в двух публикациях. Первый источник сообщает о двух албанских сибсах с указанным вариантом в гомозиготном состоянии, имеющих клиническую картину ПКМД 2D и высокие показатели концентрации КФК; при иммуногистохимическом исследовании у обоих сибсов обнаружили снижение а- и S-саркогликана в образцах мышечной биопсии [26]. Во второй публикации описаны три египетские семьи, в каждой из которых встречается от двух до пяти больных с вариантом c.574C>T в гомозиготном состоянии. При ИГХ анализе у двоих пробандов из одной семьи также обнаружилось полное отсутствие а-саркогликана в биоптате мышечной ткани [Reddy H.M. et al., 2016]. Среди вариантов, встретившихся дважды, обнаружены транзиции c.101G>A (p.Arg34His), c.308T>C (p.Ile103Thr) и c.850C>T

(р.Лг§284Су8). Шесть вариантов гена SGCA встретились по одному разу (с.200>Л, с.153Т>^ с.402С^, c.584+5G>A, c.739G>A, с.223ае1Т). Следовательно, на долю уникальных вариантов приходится 17,6% всех выявленных хромосом с патологическими изменениями.

Таким образом, больные ПКМД 2Б (а-саркогликанопатией) в РФ, в отличие от больных в остальных популяциях мира, имеют три мажорные мутации гена SGCA (с.229С>Т, е.27Ю>Л и с.574С>Т), суммарная аллельная частота по обеим выборкам которых составляет 64,7%.

Таблица 15

Спектр и аллельные частоты вариантов гена SGCA, выявленных у российских больных ПКМД 2Б.

Вариант Кол-во Аллельная Аллельная частота в контрольной выборке (N=10616), %

нуклеотид аминокислота хромосом частота, %

с.200>Л р.Тгр7Тег 1 2,9 0

с.10Ю>Л р.Лг§34И18 2 5,9 0

с.153Т>О р.И185Ю1и 1 3,8 0

с.223ае1Т р.Тгр75О1уГ8*136 1 2,9 0

с.229С>Т р.Л^77Су8 8 23,5 0,0377

с.27Ю>Л р.О1у918ег 9 26,5 0,0094

с.308Т>С р.11е103ТЬг 2 5,9 0

с.402С^ р.Туг134Тег 1 2,9 0

с.574С>Т р.Лг§192Тег 5 14,7 0

с.584+5О>Л - 1 2,9 0

с.739О>Л р.Уа1247Ме! 1 2,9 0

с.850С>Т р.Лг§284Су8 2 5,9 0

Все обнаруженные варианты гена SGCA локализованы в нуклеотидной последовательности, кодирующей внеклеточный домен белка а-саркогликана (рис. 8). Согласно данным базы ИОМБ, 95% всех зарегистрированных точковых вариантов этого гена расположены во внеклеточном домене белка, в то же время сам домен занимает 75% кодирующей последовательности белка, что возможно является одной из причин локализации в нем подавляющего большинства вариантов. Наибольшее количество вариантов выявлено в экзоне 3 (36,4%), по два варианта выявлено в экзонах 2 и 5 (18,1% от всех вариантов в каждом из экзонов). По данным исследования ряда авторов, экзоны 3 и 5 гена SGCA являются «горячими», накапливая, соответственно, 50% и 32% всех обнаруженных мутаций этого гена [ТгаЪеЫ М. е! а1., 2008]. Если исходить из данных,

представленных в базе HGMD, то 30% всех описанных точковых вариантов локализованы в экзоне 3 и 24% - в экзоне 5. Таким образом, по совокупности данных множества мировых исследований суммарная доля мутаций, выявленных в этих двух экзонах (54%), сравнима с определенной в настоящем исследовании (50%). Также выявлено, что 58,8% всех выявленных хромосом с мутациями несут вариант, расположенный в экзоне 3, 17,7% - в экзоне 5, что суммарно дает 76,5% мутантных хромосом. Следовательно, не смотря на малое количество выявленных у российских больных вариантов, установлена тенденция к накоплению в экзонах 3 и 5 гена 80СЛ патогенных вариантов, что свидетельствует о функциональная значимости кодируемой ими аминокислотной последовательности, в частности кадгерин-подобного домена.

Рисунок 8. Схема экзон-интронной структуры гена SGCA с указанием всех выявленных вариантов нуклеотидной последовательности. Оранжевыми прямоугольниками в первом и последнем экзонах отмечены 5'- и 3'-некодирующие области гена; зеленые шестиугольники обозначают количество хромосом, несущих соответствующий вариант нуклеотидной последовательности; черными стрелками отмечены миссенс-вариаты, красными прерывистыми стрелками - нонсенс-варианты, серой пунктирной стрелкой -однонуклеотидной делеция тимина, зеленой стрелкой - вариант сайта сплайсинга.

В связи с малым количеством выявленных случаев, спектр мутаций гена SGCB

более ограничен, чем описанный выше для гена SGCA. Суммарно в двух выборках он представлен пятью вариантами, среди них 3 являются миссенс-вариантами (60%), остальные 2 - нонсенс-варианты (40%). Четыре варианта описаны ранее, но только один из них - с.341С>Т - зарегистрирован более чем в одной публикации. Этот вариант, является самым частым вариантом данного гена и встречается у больных в США, Великобритании, Италии, Франции, Польше [Duggan D.J. et al., 1997; Trabelsi M. et al.,

2008] [Klinge L. et al., 2008], [Guglieri M. et al., 2008; van der Kooi A.J. et al., 1998]. Среди российский больных данный вариант встретился единожды в гетерозиготном состоянии с ранее не описанным нонсенс-вариантом c.424C>T (p.Gln142Ter) у больного из выборки ПКМД и один раз в гетерозиготном состоянии у больного из выборки МДД/Б. Еще один вариант гена SGCB - c.551A>G (p.Tyr184Cys) - встретился у двух больных из выборки ПКМД в гетерозиготном состоянии с другими вариантами. В единственной публикации, где зафиксирован данный вариант, сообщается о 21-летнем пациенте португальского происхождения с прогрессирующей мышечной дистрофии средней тяжести, фенотипически идентичной МДБ [Yu M. et al., 2017]. Диагноз МДБ у пациента исключили анализом делеций/дупликаций гена DMD, при этом у пациента обнаружен миссенс-вариант c.551A>G (p.Tyr184Cys) в гомозиготном состоянии. Как полагают авторы, выявленный вариант, находящийся во внеклеточном домене гена SGCB, содержащего в аминокислотной последовательности пять консервативных цистеинов, привнесением дополнительного цистеина способен нарушить формирование внутри- и межмолекулярных дисульфидных связей. А фенотип средней тяжести у пациента может быть обусловлен сборкой вариабельных саркогликановых комплексов: как нестабильных с дефектным ß-саркогликаном, так и стабильных, образованных нормальными субъединицами. Остальные три варианта гена SGCB (c.325C>T (p.Arg109Ter), c.355A>T (p.Ile119Phe) и c.424C>T (p.Gln142Ter)) встретились в выборке больных ПКМД единожды. Интересно, что 4 из 5-ти обнаруженных вариантов (80%) располагаются в экзоне 3, в то время как последний вариант локализуется в экзоне 4. По данным базы HGMD 54% всех точковых вариантов (включая малые делеции/инсерции) гена SGCB, зарегистрированных как «приводящие к заболеванию» (disease mutation), локализованы в экзонах 3-4. Таким образом, экзоны 3-4 гена SGCB, вероятно являются «горячими» и у больных в исследуемых выборках.

Спектр мутаций гена SGCG представлен двумя вариантами: c.581T>C (p.Leu194Ser) и делецией всего гена. В результате семейного анализа подтверждена компаунд-гетерозиготное состояние выявленных вариантов у пробанда (мать - носитель варианта c.581T>C, отец - делеции всего гена). Транзиция c.581T>C (p.Leu194Ser) описана в иностранных источниках дважды. В большой датской высоко инбредной семье этот вариант обнаружен в гомозиготном состоянии у пяти больных в двух поколениях, имеющих типичную картину прогрессирующей ПКМД с

псевдогипертрофиями икроножных мышц [van der Kooi A.J. et al., 1998]. Также он зарегистрирован у двоих индийский пациентов в одном случае с отсутствием, а в другом с частичным снижением количества всех четырех саркогликановых субъединиц при ИГХ окрашивании образцов мышечной ткани больных [Khadilkar S.V. et al., 2009]. По данным базы HGMD спектр мутаций гена SGCG на треть представлен протяженными делециями; еще 3% приходится на протяженные дупликации. Единственный выявленный в исследованных выборках случай согласуется с имеющимися мировыми данными относительно распределения долей точковых и протяженных мутаций.

В гене SGCD выявлен всего один нонсенс-вариант c.493C>T (p.Arg165Ter), в гомозиготном состоянии у больного с направляющим диагнозом «МДД/Б». В литературных источниках имеются сообщения еще о двух пациентах с указанным нонсенс-вариантом в гомозиготном состоянии: в первом случае у больного с типичной клинической картиной МДД [Duggan D.J. et al., 1997], а во втором случае у больного поясно-конечностной мышечной дистрофией и отсутствием всех четырех саркогликанов по результатам исследования биоптата мышечной ткани [Khadilkar S.V. et al., 2009].

3.1.3. Установление клинической значимости выявленных вариантов и подтверждение молекулярно-генетического диагноза

Для всех ранее зарегистрированных и вновь выявленных вариантов проведено определение клинической значимости согласно существующим в РФ критериям интерпретации вариантов, представленным в «Руководстве по интерпретации данных последовательности ДНК человека, полученных методами массового параллельного секвенирования (MPS)». Результаты представлены в таблицах 11 и 13.

Выявлено 20 различных вариантов в четырех исследуемых генах: 12 классифицированы как патогенные, 5 - как вероятно патогенные и 3 - как варианты неопределенного клинического значения (НКЗ) (рис. 9).

НКЗ

15%

Вероятно Патогенные

патогенные 60%

25%

Рисунок 9. Соотношение вариантов различного клинического значения, выявленных в четырех исследуемых генах.

Из 12 вариантов гена SGCA 7 являлись патогенными (58%), 3 - вероятно патогенными (25%) и 2 - вариантами НКЗ (17%). Необходимо отметить, что при интерпретации выявленных вариантов не задействован критерий категории «средней тяжести» PM3, поскольку материал родителей пробандов с идентифицированными вариантами не был доступен и проверка цис/транс-положения для этих вариантов не проводилась. Следовательно, клиническая значимость проанализированных вариантов занижена по объективным причинам. Из всех найденных вариантов два оказались вариантами неопределенного клинического значения (c.153T>G и c.584+5G>A). Оба варианта не зарегистрированы в контрольных выборках агрегатора gnomAD. Для оценки патогенности обоих вариантов использовали онлайн-ресурсы предсказания клинической значимости. Относительно варианта c.153T>G программы-предсказатели показывают неоднозначные результаты: MutationTaster, Sift, Provean и UMD-Predictor расценивают как нейтральный, в то же время FATHMM, MutationAssessor, M-CAP, Poly-Phen2 оценивают его как вероятно патогенный. Поскольку данная трансверзия приводит к замене полярного, положительно заряженного гистидина в положении 51 аминокислотной последовательности а-саркогликана на полярный, незаряженный глутамин, можно предположить, что такая аминокислотная замена способна привести к изменению структуры и к нарушению функциональных свойств белка. Онлайн-сервис HOPE на основании анализа структуры, заряда и гидрофобных свойств дикой и мутантной аминокислот, а также расположения аминокислотной замены в кадгерин-подобном домене белка, играющем важную роль в Са++-зависимом межмолекулярном и межклеточном взаимодействиях, предсказывает нарушение этой функции а-саркогликана. Для варианта c.584+5G>A, программы предсказания последствий изменений нуклеотидной последовательности, затрагивающих области сплайсинга, прогнозируют его деструктивное влияние на сплайсинг. Так, алгоритм предсказания NetGe^2, основанный на искусственных нейронных сетях, демонстрирует довольно резкое снижение вероятности (параметр confidence) единственного донорного сайта сплайсинга на прямой цепи и некоторые изменения низковероятностных акцепторных сайтов сплайсинга на прямой и обратной цепях ДНК (рис. 10). В результате анализа онлайн-ресурса ASSP - еще одного предиктора, использующего в качестве базового алгоритма нейронные сети, - отмечено исчезновение наиболее вероятного из пяти

имеющихся донорных сайтов сплайсинга, что демонстрирует параметр Confidence (0,954) (рис. 11).

NetGene2 v, 2.4

The sequence: sequencel has the following composition: Length: 499 nucleotides.

17.2% A, 28.9% C, 33.1% G, 20.8% T, 0.0% X, 61.9% G+C Donor splice sites, direct strand

НОРМА

NetGene2 v. 2.4

The sequence: sequencel has the fallowing composition: ^ 584+5G>A Length: 499 nucleotides.

17.4* A, 28.9* C, ÏÎ.9K G, 20.3* T, 0.0* X, 61.7* G-»C

Donar splice sites, direct strand

pos 5'->3' phase strand confidence 5 350 2 + 0.94

exon intron 3' GAAAAGAAGCGTAGGTGTGC H

pos 5'->3' phase strand confidence 5 350 2 + 0.39

exon intron 3 GAAAAGAAGGAGTAGATGTGC

Donor splice sites, complement strand

pos 31 ->5 pos 5'->3' phase strand confidence 5 483 17 - - 0.00

Acceptor splice sites, direct strand

exon intron 3" GAGGAGAGTGAGTGAGGGGTG

pos 5"->3" phase strand confidence 5 123 1 + 0.17 129 1 + 0.19 150 1 + 0.95 171 1 + 0.20 175__0 +_a .19

intron CTGGGTGCAG GCAGCCTGAG GCCTTCCCAG CCATACCAAG CCAAOCCBAG'

exon 3"

■ССТЙАЖТбТ GTGTCCACCT •GCCCCCTGCT CCGAGTTCCT ■TTÇCT66TGC

1 243 1 + 0.15 T TCC T С TCAG A С CT TGGG GGG |

Acceptor splice sites, complement strand

pos 3 ' ->5" 376 pos 5'->3' 124 phase strand 2 confidence 0.33 5' intron exon 3' С С TC T T TCAG A GAAGTCC TCT

364 136 2 0.07 AGTCCTCTAGAGGTTGtACAC |

324 51 25

176 449 475

CAATGGGAACGGGGACACGG ACCC С T TCAG A GCC CC TCAAT TCCATCACAGAACCCCAACAA

Donor splice sites, complement strand

pos 3'->5' pos 5'->3' phase strand confidence

4B3 17 - - 0.00

Acceptor splice sites, direct strand

pos 5'->3' phase strand confidence

123 1 + 0.17

129 1 + 0.19

150 1 + 0.95

171 1 + 0.20

176 0 + 0.19

Acceptor splice sites, complement strand

pos 3'->5' pos 5'->3' phase strand confidence

376 124 2 - 0.33

324 176 0 - 0.19

51 449 2 - 0.00

25 475 - - 0.00

exon intron 3' GAGGAGAGTGAGTGAGGGGTG

intron exon 3'

CTGGGTGCAGACCT5AKjT0T GCAGCCTGAG''GTGTCCACCT GCCTTCCCAGAGCCCCCT6CT CCATACCAAGACCGAGTTCCT CCAAGCCGAGATTCCTGGTGC

¡' intron exon 3'

CCTCTTTCAGAGAAGTCCTCT CAATGO^AAQAGG(jGACAC№ ACCCCTTCAGAGCCCCTCAAT TCCATCACAGAACCCCAACAA

Рисунок 10. Результаты прогноза теоретических последствий варианта c.584+5G>A сервисом NetGene2, version 2.4.

НОРМА Activations*"

Position (bp) Putative splice site Sequence Score* Intron GC* Alt./Cryptic Constitutive Confidence"

58 Alt isoform/cryptic donor GCCTGAAGGGglgtgcaggg 8252 0 657 0.818 0 130 0 841

129 Alt Isoform/cryptic donor GCAGCCTGAGgtgtccacct 7 420 0 Б71 0 807 0 140 0 827

151 Constitutive acceptor gccltcccagGCCCCCTGCT 7227 0 671 0 173 0 819 0 788

182 Alt isoform/cryptic donor CGAGTTCCTGgtgcgcagcc 9 781 0 686 0 687 0 249 0 638

191 Alt isoform/cryptic acceptor tggtgcgcagCCACGATGCG 3 207 0 671 0.865 0.127 0.853

206 Alt isoform/cryptic donor TGCGGAGGAGgtgctgccct 6 282 0 671 0 634 0 287 0547

244 Alt isoform/cryptic acceptor ttcctctcagCCTTGGGGGG 6 964 0 657 0 806 0 180 0 776

306 Alt. isoform/cryptic donor GCCTTGGACCgtgggggccg 4 597 0 614 0.559 0 368 0 342

349 AH isoform/cryptic donor GAAAAGAAGGgtagglglgc 9 926 0 543 0 665 0 253 0 620

| 353 Alt isoform/cryptic donor AGAAGGGTAGgtgtgcaacc 7 253 0 557 0.934 0 043 0 954

435 Constitutive acceptor taafflccagGTGGGGCTTT 9 868 0 514 0 429 0 555 0 227

469 Alt isoform/cryptic acceptor cacctcccagCTTCACACCC 7 664 0 571 0 824 0 164 0 800

c.584+5G>A Activations**

Position (bp) Putative splice site Sequence Score* Intron GC* Alt/Cry ptic Constitutive Confide nee'*

58 AH isoform/cryptic donor GCCTGAAGGGgtgtgcaggg 8 252 0 657 0 818 0 130 0 841

129 All isoform/cryptic donor GCAGCCTGAGgtgtccacct 7 420 0.671 0.807 0 140 0 827

151 Constitutive acceptor gcctlcccagGCCCCCTGCT 7 227 0.671 0 173 0 819 0 788

182 AH isoform/cryptic donor CGAGTTCCTGgtgcgcagcc 9 781 0 686 0.687 0 249 0 638

191 AH isoform/cryptic acceptor tggtgcgcagCCACGATGCG 3207 0 671 0 865 0 127 0 853

206 AH isoform/cryptic donor TGCGGAGGAGgtgctgccct 6.282 0.671 0.634 0 287 0 547

244 AH isoform/cryptic acceptor ttcctclcagCCTTGGGGGG 6 964 0.657 0.806 0 180 0 776

306 AH isoform/cryptic donor GCCTTGGACCgtgggggccg 4 597 0.600 0.516 0 408 0 209

349 AH isoform/cryptic donor GAAAAGAAGGglagalgtgc 5 120 0 529 0.866 0 094 0 892

435 Constitutive acceptor taatttccagGTGGGGCTTT 9 868 0.514 0 429 0 555 0 227

469 AH isoform/cryptic acceptor cacclccc a gC TTC AC AC С С 7 664 0.571 0.824 0 164 0 800

Рисунок 11. Результаты прогноза теоретических последствий варианта c.584+5G>A онлайн-предиктором ASSP. Примечание: значение Score отражает «силу» сайта

сплайсинга; Activations - «выходные» значения сетей обратной связи, используемые для классификации (высокое значение одного из сайтов в совокупности с низким значением для других сайтов подразумевают более достоверную классификацию). Confidence -параметр, обозначающий различия между «выходными» активациями (вероятность ранжируется от 0 до 1).

Видовой предиктор сайтов сплайсинга FSPLICE, основанный на модели весовой матрицы, прогнозирует исчезновение одного из двух донорных сайтов сплайсинга на прямой цепи (рис. 12). Онлайн-сервис Human Splicing Finder 3.1, в основе которого лежит положение варианта в экзон-интронной структуре генов, также предсказывает повреждение донорного сайта слайсинга (рис. 13).

FSPLICE 1.0. Prediction of potential splice sit Seq name: test sequence

Length of sequence: 4S9 C.584+5G>A

Direct chain. Acceptor(AG) sites. Treshold 4.175 (90%).

1 P: 150 И: 9.25 Seq: ttcccAGgcccc

2 P: 243 W: 4.72 Seq: ctctcAGccttg

3 P: 434 W: 4.50 Seq: tttccAGgtggg Donor(GT) sites. Treshold 6.099 (90%).

1 P: 435 H: 8.48 Seq: tccagGTggggc

Reverse chain. Acceptor(AG) sites. Treshold 4.175 (90%).

FSPLICE 1.0. Prediction of potential splice sites

Seq name: test sequence

Length of sequence: 499 НОРМА

Direct chain.

Acceptor(AG) sites. Treshold 4.175 (90%).

1 P: 150 И 9.25 Seq: ttcccAGgcccc

2 P: 243 W 4 . 72 Seq: ctctcAGccttg

3 P: 434 W 4.50 Seq: tttccAGgtggg

Donor(GT) sites. Treshold 6 099 (90%).

1 P: 350 W S . 76 Sea: aaactaGTaaata

2 P: 435 W S.43 Seq: tccaqGTqqqqc

Reverse chain.

Acceptor(AG) sites. Treshold 4.175 (90%).

IP: 124 И 10.23 Seq: ctttcAGgaagt

2 P: 449 W 7.35 Seq: ccttcAGgcccc

3 P: 475 И 6.23 Seq: atcacAGacccc

Donor(GT) sites. Treshold 6 099 (90%).

IP; 17 w 7.08 Seq: gagtgGTgaggg

2 P: 54 W 6.10 Seq: gcgtgGTaaagc

3 P: 333 W 6.10 Seq: gcttgGTatggc

1 P

2 P

3 P

124 W 449 И

475 И

10.28 Seq: ctttcAGgaagt 7.35 Seq: ccttcAGgcccc 6.28 Seq: atcacAGacccc

Donor(GT) sites. Treshold

6.099 (90%).

1 P:

2 P:

3 P:

17 H 54 И

333 H

7.08 Seq: gagtgGTgaggg 6.10 Seq: gcgtgGTaaagc 6.10 Seq: gcttgGTatggc

Рисунок 12. Результаты прогноза теоретических последствий варианта c.584+5G>A сервисом БЗРЫСБ 1.0.

▼ interpreted Data

This table shows only relevant results reiated to the mutation position and context.

Predicted signal Prédiction algorithm cDNA Position Interpretation

Broken WT Donor Site 1 - HSF Matrices AGbSCCgtaggtgtij Alteration of the WT donor site, most probably affecting splicing.

2 - MaxErrt I-1-1-1-1-1-1-1 IÎ4 10« 19B 20» 202 204 206 2«

т Ftew Date T 30 les

Potential splice sites

Potential Branch Points I Enhancer motifs I Silencer motifs I Other splicing motifs

' HSF Matrices

Sequence Position cDNA Position Splice site type Motif New splice site Wild Type Mutant If cryptic site use, exon length variation Variation

292 192 Acceptor AMkGAAGGgtaggt. a aag a a ggg t agJLT 65. S6 62.72 MA

296 196 Donor JLAGGgtagg IkA Gggtaga 66.25 64.85 MA

297 197 Donor AGGgtaggt AL-L-gtagat 85 85 73 68 20E

301 +2 Donor taggtgtg:: TAGatgtg- 35. S8 69.05 MA

Рисунок 13. Результаты прогноза теоретических последствий варианта c.584+5G>A сервисом Human Splicing Finder 3.1.

В пользу патогенности данного варианта свидетельствует и Ми1а1юпТа81ег, следовательно, как минимум пять различных алгоритмов предсказания клинической значимости с высокой вероятностью прогнозируют патогенность варианта е.584+50>Л т 8Шео. Тем не менее, поскольку данный вариант располагается не непосредственно в области канонического (+1 и +2) донорного сайта сплайсинга, то убедительные данные относительно его влияния на сплайсинг возможно получить только методом функционального анализа на уровне мРНК, который в ходе выполнения настоящей работы не проводился.

До повсеместного распространения секвенирования нового поколения в научной и диагностической практике врачи-генетики осуществляли диагностику по алгоритму, заключающемся в поиске частых мутаций предположительно причинного гена или секвенировании его кодирующей последовательности методом прямого секвенирования по Сенгеру. Для подтверждения моногенного аутосомно-рецессивного заболевания достаточно наличия в генотипе больного двух молекулярных дефектов причинного гена, при их отсутствии в контрольной выборке, состоящей в среднем из 50-100 образцов ДНК, патогенность таких вариантов не вызывала сомнений.

Если для заболевания характерна локусная генетическая гетерогенность, то врачи, исходя из совокупности всех клинических и лабораторных признаков, а также эпидемиологических данных относительно частот и распространенности той или иной формы заболевания, выстраивали алгоритмы дифференциальной диагностики и останавливались на этапе, когда выявлялся 1 или 2 варианта в "подходящем" гене. В настоящее время в результате массового параллельного секвенирования ДНК исследователи получают большие массивы данных одновременно по многим генам. Вместе с тем обозначилась новая проблема в виде получения на выходе в зависимости от размера секвенируемой области генома и специфичности клинической картины больного от одного до десятка подходящих под фенотип пациента вариантов. Однако именно на плечи врача-генетика ложится сложная задача выбора варианта/-ов, предположительно являющихся причиной генетического заболевания у конкретного больного. Обилие получаемых при МПС изменений нуклеотидной последовательности закономерно ужесточает требования как к каждому отдельно взятому варианту, так и к совокупности вариантов при аутосомно-рецессивных заболеваниях. Следовательно, при аутосомно-рецессивном заболевании обоснованным является подтверждение

молекулярно-генетического диагноза на основании наличия в генотипе больного двух патогенных вариантов, либо комбинации патогенного и вероятно патогенного вариантов или же двух вероятно патогенных вариантов, в последнем случае - при наличии четко очерченной и специфической клинической картины заболевания. Таким образом, в результате определения клинической значимости выявленных вариантов, диагноз «ПКМД 2D» подтвержден у 11 из 13 (85%) пробандов из выборки больных ПКМД и у всех пробандов из выборки больных МДД/Б. Оставшиеся два пробанда из выборки больных ПКМД имеют в генотипе комбинацию из патогенного варианта и варианта НКЗ. При этом, если рассмотреть подробнее случай пациентки L466, 14 лет, с генотипом a101G>A(;)153T>G, то у больной отмечаются типичные клинические признаки ПКМД с псевдогипертрофиями икроножных мышц, кардиомиопатией, сколиозом и контрактурами крупных суставов; заболевание манифестировало в возрасте 4 лет. Результаты иммуногистохимического исследования мышечной ткани больной, выявили снижение у-саркогликана в 60% мышечных волокон образца биоптата больной. Следовательно, результат специфического лабораторного исследования также свидетельствует в пользу наличия у пациентки одной из форм саркогликанопатии. Остается открытым вопрос, почему при проведенном исследовании не выявили снижения а-саркогликана, однако, здесь стоит помнить о имеющейся неспецифичности снижения саркогликановых субъединиц при наличии мутаций в генах, их кодирующих. Поскольку у пациентки не выявлено мутаций в гене SGCG, то снижение количества у-саркогликана вероятно является вторичным. Действительно, в зарубежной литературе неоднократно описаны случаи ПКМД 2D, когда у больных с мутациями гена SGCA в биоптате мышечной ткани наблюдалось нормальное количество а-саркогликана и при этом обнаружено снижение у-саркогликана в умеренной и резкой степени [Avila De Salman S. et al., 2007; Klinge L. et al., 2008] Таким образом, выявленные замены в гене SGCA, являются наиболее вероятной причиной заболевания у этой больной.

Во втором случае у пробанда С95 44-ёх лет с генотипом c.584+5G>A(;)739G>A первые признаки заболевания манифестировали в возрасте 27 лет и проявились слабостью в ногах, затруднением подъема по лестнице. Заболевание долго явно не прогрессировало. Ухудшение состояния началось в 39 лет (невозможность без опоры подняться со стула) и особенно явно в последний год: ходит только с поддержкой сопровождающего. Слабости в руках не ощущает. По результатам ЭНМГ определена

первично мышечная патология; лабораторные методы фиксируют десятикратное повышение концентрации КФК в крови. Объективно наблюдаются умеренная псевдогипертрофия икроножных мышц, арефлексия, грубо миопатическая походка и миопатические приемы. Наблюдаемый у пациентки мягкий медленно-прогрессирующий фенотип может объясняться наличием в генотипе варианта c.584+5G>A, не являющегося мутацией канонической последовательности сайта сплайсинга, но влияющем на его активность.

Таким образом, основании использованных в «Руководстве» критериев биоиформатик и врач лабораторный-генетик подтвердить диагноз «ПКМД 2Б» молекулярно-генетическими методами для обоих пробандов не могут. Однако, так как как данное исследование является частью комплекса медико-генетической диагностики, то с учетом совокупности молекулярных данных, клинической картины и результатов иммуногистохимического анализа для обоих пробандов консультирующими врачами -генетиками установлен клинический диагноз «ПКМД, псевдогипертрофическая форма». Поскольку ни в одном из генов, отвечающих за большинство известных псевдогипертрофических типов ПКМД (САРЫ3, ЕКЯР, ВЫВ, АЫ05), у данных больных мутаций не обнаружено, то коллегиальным решением врачей сделан выбор в пользу подтверждения конкретной формы заболевания «ПКМД 2Б» для обоих больных.

В ходе определения клинической значимости найденных вариантов гена БОСБ, 2 варианта установлены как патогенные (40%), 1 вариант - как вероятно патогенный (20%) и 2 варианта - как варианты с НКЗ (40%). Следовательно, полученные на этом этапе результаты позволяют подтвердить диагноз только у одного пробанда (Е76) с генотипом с.341С>Т(;)424С>Т. Остальные два пробанда имеют в генотипе комбинации патогенного нонсенс-варианта и варианта НКЗ (c.325C>T(;)551A>G) и двух вариантов НКЗ (с.355Л>Т(;)551Л>0). В обоих случаях одним из патологических аллелей является единожды встреченный в литературных источниках миссенс-вариант c.551A>G (р.Туг184Су8). В первом случае у больной Ь418 45-ти лет с типичной картиной ПКМД (проксимальный миопатический синдром, крыловидные лопатки, гиперлордоз поясничного отдела, миопатическая походка), заболевание манифестировало в возрасте 25 лет. На ЭМГ регистрируется первично мышечный характер поражения, отмечается резкое повышение концентрации КФК в крови (5090 ед/л). Примечательно, что у пробанда не зафиксировано наличие псевдогипертрофий икроножных мышц. В то же

время известно, что при ПКМД 2E псевдогипертрофии икроножных мышц не постоянный признак и встречаются у 78% больных с данной формой ПКМД [Semplicini C. et al., 2015]. В том же исследовании соотношение больных с тяжелым и мягким фенотипом составило 1,25:1, что говорит о имеющейся вариабельности тяжести клинической картины при ПКМД 2E, это объясняет поздний возраст манифестации заболевания у L418 и относительно мягкие клинические проявления заболевания.

Во втором случае у пробанда С38, 11 лет, с генотипом c.355A>T(;)551A>G наблюдаются типичные признаки ПКМД с диффузной мышечной гипотонией, приемами Говерса, слабостью и атрофией мышц проксимальных отделов конечностей и псевдогипертрофиями икроножных мышц. Концентрация КФК в крови больной повышена до 5870 ед/л. Неоднозначным с точки зрения патогенности среди найденных у пробанда вариантов является миссенс-вариант c.355A>T (p.Ile119Phe), зарегистрированный в гетерозиготном состоянии в одной публикации у одного пациента 15-ти лет с тяжелым фенотипом проксимальной мышечной дистрофии, манифестирующей в раннем детском возрасте, прогрессирующим сколиозом и ранней инвалидицацией в 13 лет [Duelos F. et al., 1998]. То, что второй мутантный аллель у этого больного не обнаружен, заставляет усомниться в причинно-следственной связи между молекулярным дефектом и развитием заболевания для замены с.355А>Т. В то же время, как и у любого больного с одной гетерозиготной мутацией при аутосомно-рецессивном заболевании, у данного пациента нельзя исключать наличие второго мутантного аллеля в неисследованных некодирующих и регуляторных областях гена SGCB. Вариант c.355A>T зарегистрирован в контрольных выборках агрегатора gnomAD с максимальной частотой 0,00013 у южных азиат. Предикторы патогенности выдают противоречивый результат: MutationTaster, SIFT, FATHMM и UMD-Predictor расценивают его как патогенный, PolyPhen-2 - как вероятно патогенный, PROVEAN и MutationAssessor - как нейтральный. В результате транзиции c.355A>T происходит миссенс-замена неполярных изолейцина на фенилаланин, имеющий в составе ароматическую группу, в положении 119 аминокислотной последовательности в-саркогликана. При этом данный вариант располагается в так называемом N-концевом регионе внеклеточной части белка, прилегающей к трансмембранному домену. Именно этот регион является областью взаимодействия между в- и S-субъединицами в саркогликановом комплексе. Группой китайских ученых установлено, что

молекулярные дефекты нуклеотидной последовательности, кодирующей данный регион, нарушают p/S-взаимодействие, и, как следствие формирование нормального комплекса и позиционирование его в клеточной мембране [Chen J. et al., 2006]. Сопоставляя гено-фенотипические данные для обоих пробандов, наблюдается мягкий фенотип ПКМД с поздней манифестацией для комбинации вариантов «нонсенс(;)миссенс c.551A>G» и довольно тяжелый фенотип ПКМД для комбинации вариантов «миссенс(;)миссенс c.551A>G». Прослеживается отсутствие четкой закономерности между типом мутации и фенотипом пациента, что в целом подтверждает существующую для саркогликанопатий проблему установления гено-фенотипических корреляций [Semplicini C. et al., 2015].

Вариант c.551A>G (p.Tyr184Cys) в общей сложности встретился в трех неродственных, спорадических случаях: у двух пробандов с клинической картиной ПКМД в гетерозиготном состоянии с другим вариантом гена SGCB и одного пробанда с МДБ в гомозиготном состоянии из исследования авторов dos Santos, M.R. et al. Вариант не зарегистрирован в контрольных выборках базы gnomAD среди 125748 экзомов и 15708 геномов, а также не встречен среди 800 экзомов российских больных с различными генетическими заболеваниями, обследованных в ФГБНУ «МГНЦ». При этом в той же позиции белка, расположенной между двумя протеазо-чувствительными сайтами, описана еще одна замена (p.Tyr184Ala), для которой в результате функционального исследования установлено негативное влияние на конформацию белка, приводящее к неправильному фолдингу и нарушению позиционирования белка в мембране. По совокупности критериев «Руководства», особенностей локализации варианта в структуре белка и накопления гено-фенотипических данных, вариант c.551A>G переклассифицирован как вероятно-патогенный, что позволяет подтвердить диагноз для L418. Таким образом, диагноз «ПКМД 2Е» подтвержден для двух из трех пробандов с мутациями гена SGCB (табл. 16).

Таблица 16

Подтвержденные случаи саркогликанопатии в исследуемых выборках.

Ген Количество пациентов с двумя выявленными вариантами в ассоциированном гене, N Количество подтвержденных случаев, N

ПКМД 2D 17 17 (100%)

ПКМД 2E 3 2 (67%)

ПКМД 2C 1 1 (100%)

ПКМД 2F 1 1 (100%)

Пробанду С38 на данном этапе работы подтвердить диагноз не удалось. Для двух единичных случаев больных с патогенными вариантами SGCG и SGCD также подтвержден молекулярный диагноз (ПКМД 2С и ПКМД 2F соответственно).

3.2. Определение долей генетических форм саркогликанопатии в структуре

ПКМД и оценка их частоты

Оценка вклада саркогликанопатий в структуру ПКМД производилась на основании количества подтвержденных случаев каждой из форм. Таким образом, в группе больных с направляющим диагнозом ПКМД на долю ПКМД 2D приходится 4,6% всех случаев и 81,3% всех саркогликанопатий; доля ПКМД 2F и ПКМД 2С значительно ниже и составляет 0,7% и 0,4% соответственно. При этом доля ПКМД 2D от всех саркогликанопатий в этой выборке (13/16; 95%ДИ - от 0,5435 до 0,9595) статистически значимо превышает суммарную долю остальных саркогликанопатий (3/16; 95%ДИ - от 0,0405 до 0,4565). В группе больных с направляющим диагнозом МДД/Б доля больных ПКМД 2D и ПКМД 2Е составила 0,8% и 0,2% соответственно. Воспроизводимый в двух выборках результат позволяет утверждать, что ПКМД 2D является наиболее частой в РФ формой саркогликанопатии, что согласуется с мировыми данными. Так в США на долю данной формы приходится 4%, в Италии - 8,4%, Великобритании - 3%, Китае - 7% от всех аутосомных ПКМД форм, в Чехии - 2,3% в группе аутосомно-рецессивных ПКМД [Guglieri M. et al., 2008; Moore S.A. et al., 2006; Norwood F.L.M. et al.; Stehlikova K. et al., 2014]. Необходимо отметить, что критерии включения пациентов в выборку сильно различались в разных исследованиях. В выборках, для которых на подготовительном этапе проводилась предварительная селекция пробандов на основании положительного ИГХ исследования (Индия, Бразилия, Франция), доля больных с саркогликанопатиями закономерно выше, нежели в неселективных выборках больных ПКМД (Великобритания, США, Италия, Китай, Нидерланды и исследуемая в данной работе выборка больных из РФ) (табл. 17). Следовательно, сравнивать полученные в ходе настоящего исследования значения долей корректно только со значениями в странах из второй группы. Вторая по частоте форма саркогликанопатии в исследованной выборке - ПКМД 2E - встречается реже, чем ПКМД 2D.

При сравнении относительной доли ПКМД 2Б от всех саркогликанопатий в выборке российских больных (13/16) с таковым для других стран при помощи двустороннего критерия Фишера установлено, что в Бразилии, США и Италии доля ПКМД 2Б статистически значимо ниже, чем в РФ (табл. 18).

Таблица 17

Вклад саркогликанопатий в структуру ПКМД в России и других странах.

Страна [ссылка] Доля ПКМД 2D (а-СГП), % Доля ПКМД 2E (р-СГП), % Доля ПКМД 2С (у-СГП), % Доля ПКМД 2F (5-СГП), % Относительное соотношение а-,р-,у-,5-СГП

Индия [Meena A.K. et al., 2007]* 26,9 15,3 3,8 7,4 7 : 4 : 1 : 2

Бразилия [Moreira E.S. et al.]* 40 23 23 14 3 : 2 : 2 : 1

Франция [Trabelsi M. et al., 2008]* 55,3 17 25,5 0 3 : 1 : 1,5 : 1

Великобритания [Norwood F.L.M. et al.] 2,9 2,9 5,9 0 1 : 1 : 2 : -

США [Moore S.A. et al., 2006] 4 4 2 1 4 : 4 : 2 : 1

Китай [Yu M. et al., 2017] 7 1 0 1 7 : 1 : - : 1

Италия [Guglieri M. et al., 2008] 8,4 4,5 4,5 0,7 12 : 6 : 6 : 1

Великобритания [Nallamilli B. et al., 2018] 3 1 3 0 3 : 1 : 3 : -

Нидерланды [Ten Dam L. et al., 2019] 9 6 12 0 1,5 : 1 : 2 : -

Россия 4,6 0,7 0,4 13 : 2 : 1 : -

Примечание: *- проводилось предварительное ИГХ исследование.

Таблица 18

Парное сравнение относительной доли ПКМД 2Б среди всех саркогликанопатий у российских больных (13/16) и больных из других стран.

Относительное Доля ПКМД 2D

Страна соотношение от всех СГП, p-value

а-,р-,у-,5-СГП кол-во больных

США 4 : 4 : 2 : 1 12/34 0,0054

Китай 7 : 1 : - : 1 8/10 1,0

Италия 12 : 6 : 6 : 1 15/32 0,0312

Великобритания 3 : 1 : 3 : - 4/8 0,167

Индия 7 : 4 : 1 : 2 7/14 0,1216

Бразилия 3 : 2 : 2 : 1 8/35 0,0001

Франция 3 : 1 : 1,5 : 1 26/47 0,08

Согласно литературным источникам, распределение относительных долей саркогликанопатий, кроме универсального для большинства популяций превалирования ПКМД 2Б, для разных стран отличается. Зачастую, в зависимости от региона и национальности, второй по частоте формой саркогликанопатии (за редкими исключениями) являются или ПКМД 2Е или ПКМД 2С (рис. 14).

14 -

12

12

Рисунок 14. Доли саркогликанопатий в исследовательских работах для различных стран.

В ходе ранее проведенных исследований ПКМД в РФ установлен вклад других генетических форм в структуру этой гетерогенной группы заболеваний. Так на долю ПКМД 2А приходится 43% всех изолированных случаев ПКМД, на долю ПКМД 21 -9%, ПКМД 2Ь - 0,6% [Булах М.В. и др., 2016]. Тем не менее, по совокупности всех имеющихся данных нельзя утверждать, что ПКМД 2Б является третьей по частоте формой среди ПКМД с аутосомно-рецессивным типом наследования ввиду того, что на настоящий момент полномасштабные исследования остальных типов ПКМД в РФ не проводились.

Не менее важным является тот факт, что 64,7% всех мутантных аллелей у российских больных ПКМД 2Б приходится на три наиболее частых варианта гена 80СЛ - с.229С>Т, с.27Ш>А и с.574С>Т. Высокая частота этих вариантов в РФ

свидетельствует в пользу их неслучайного накопления. Исходя из суммарной аллельной частоты этих трех вариантов в выборке больных (64,7%) произведен расчет частоты ПКМД 2D в РФ, для чего проведен поиск данных вариантов в объединенной контрольной выборке (N=10616). В результате варианты с.229С>Т и с.27Ш> выявлены в гетерозиготном состоянии у восьми и двух человек соответственно; вариант с.574С>Т в контрольной выборке не обнаружен. Ни у одного человека из контрольной выборки с выявленным в гетерозиготном состоянии вариантом второго мутантного аллеля не обнаружено и не отмечено клинических признаков ПКМД. Исходя из аллельной частоты вариантов c.229C>T, c.271G>A и с.574С>Т в контрольной выборке расчетная частота ПКМД 2D в РФ, составила 1:1887000 (95%ДИ: 1:5168000 - 1:1050000). Поскольку доля ПКМД 2D в структуре саркогликанопатий составляет 81,3%, то расчетная частота всех саркогликанопатий в РФ составляет 1:1534000 (95%ДИ: 1:4202000 - 1:851000). Следовательно, частота саркогликанопатий в РФ ниже, чем установленные в Великобритании (1:370000) [Norwood F.L.M. et al.], Италии (1:180000) [Fanin M. et al., 1997] и Нидерландах (1:253000) [Ten Dam L. et al., 2019]. Для других стран и популяций подобных эпидемиологических исследований не проводилось, поэтому сравнить частоты не представляется возможным. Суммарный вклад саркогликанопатий в структуру ПКМД составляет не менее 5,7% (ПКМД 2D - 4,6% (13/281), ПКМД 2E - 0,7% (2/281), ПКМД 2С - 0,4% (1/281)). Среди больных МДД/Б мужского пола суммарный вклад саркогликанопатий составляет не менее 1% (ПКМД 2D - 0,8% (4/480) и ПКМД 2F - 0,2% (1/480)) от всей выборки и 2,3% выборки больных МДД/Б без протяженных делеций/дупликаций гена DMD.

3.3. Усовершенствование тест-системы для молекулярной диагностики наиболее

распространенных в РФ типов ПКМД и введение ее в диагностическую практику

Ранее в ФГБНУ «МГНЦ» была разработана тест-система для диагностики наиболее распространенных несиндромальных типов ПКМД у российских больных: ПКМД 2A (CAPN3:c.550delA c.598_615del15), ПКМД 2I (FKRP:c.229C>T c.826C>A) и ПКМД 2L (ANO5: c.2272C>T и c.191dupA). На основании полученных результатов представлености саркогликанопатий в РФ и распределения относительных частот отдельных форм внутри данной группы, в указанную систему добавили три

повторяющихся патогенных варианта гена SGCA: с.229С>Т (p.Arg77Cys), с.271G>A (р.01у918ег) и с.850С>Т (p.Val247Met) (рис. 15).

CAPN3:

-йе1 с.598 6Ше115

■ Т

Т -С

SGCA: с.850С>Т

ANO5: с.2272С>Т

Д НС,СА : С.2710А

<-С 1<КПР: с.826С>А

<-Т SGCA: с.229С>Т

<-т ¡'КНР: с.229С>Т

<-С

<-Ы.ЛЛШ: с.с1ир 191А

с1с

САРЫЗ: с.550с1с1А

Рисунок 15. Электрофореграмма обновленной МЬРЛ-системы для поиска частых мутаций при наиболее распространенных в РФ АР-формах ПКМД. Дорожки: 1 -вариант с.27Ш>А гена SGCA в гомозиготном состоянии; 2 - варианты с.229С>Т и с.850С>Т гена SGCA; 3 - вариант c.550delA гена CAPN3 в гетерозиготном состоянии; 4 - вариант с.27Ш>А гена SGCA в гетерозиготном состоянии; 5, 6, 9 - мутаций не выявлено; 7 -варианты с.826С>А и с.229С>Т гена FKRP в компаунд-гетерозиготном состоянии; 8 -вариант c.598_612del15 гена CAPN3 в гетерозиготном состоянии; 10 - вариант с.2272С>Т гена АЫ05 в гетерозиготном состоянии; (К-) - Отрицательный контроль.

По техническим причинам в МЬРЛ-систему не включен патогенный вариант с.574С>Т (р.Лг§192Тег). С помощью данной тест-системы среди больных саркогликанопатиями в 41,2% случаев подтверждается молекулярный диагноз, при этом хотя бы один мутантный аллель детектируется в 70,6% случаев. В сравнении с предыдущей версией, эффективность обновленной системы для выявления больных с двумя мутациями в выборке ПКМД повышена с 13,1 до 14,5%, а для выявления хотя бы одного мутантного аллеля - с 30% до 32,5%. Ввиду дешевизны и диагностической эффективности этот анализ рекомендуется как первичный этап генетической

диагностики больных с клиническими проявлениями псевдогипертрофической ПКМД, поскольку псевдогипертрофии икроножных мышц в том или ином проценте случаев встречаются при всех вышеописанных типах ПКМД, о чем подробнее будет изложено ниже.

3.4. Клиническая характеристика саркогликанопатий 3.4.1. Особенности клинических проявлений ПКМД 2Б

Ввиду широкой распространенности ПКМД 2D в мире клинические особенности этой формы саркогликанопатии довольно хорошо изучены. Заболевание манифестирует в возрасте от 3 до 10 лет в виде симптомов мышечной слабости, гипотонии, гипотрофии мышц тазового и плечевого поясов. В целом, клинические симптомы практически полностью идентичны таковым при МДД/Б. Для большинства больных характерны гиперлордоз в поясничном отделе позвоночника и псевдогипертрофии икроножных мышц. Кардиомиопатии возникают не часто. Тяжесть заболевания варьирует от умеренной до злокачественной быстропрогрессирующей с ранней инвалидизацией.

В группе пациентов с ПКМД 2D клиническое описание и минимальный анамнез удалось собрать для 12 из 13 пациентов с мутациями гена 80СЛ. В единственном семейном случае у пробанда имелся больной сибс, для которого удалось собрать клинические данные. Дополнительно проанализированы клинические данные еще трех больных с выявленными патогенными и вероятно патогенными вариантами гена 80СЛ, не вошедшие в выборку. Эти больные идентифицированы благодаря вышеописанной тест-системе для поиска частых вариантов гена 80СЛ в ходе генотипирования пациентов с диагнозами «ПКМД» (1 пробанд) и «МДД/Б» (2 пробанда), направляемых врачами-генетиками ФГБНУ «МГНЦ». Возраст дебюта заболевания у больных варьировал от 2 до 27 лет (медиана возраста дебюта - 4 года, средний возраст - 6,4±1,5 лет) (табл. 19). У большинства больных заболевание манифестировало типичными для ПКМД признаками: нарушениями походки, чаще всего проявляющимися затруднениями при подъеме по лестнице, вставании из положения сидя и на корточках, мышечной слабостью в нижних конечностях и быстрой утомляемостью. Постоянными признаками, встречающими у всех больных ПКМД 2D, стали снижение или отсутствие

Клинические проявления у больных ПКМД 2D.

Пациент Возраст дебюта, лет Первые признаки 15 16 17 18 19 22 21 29 31 32 33 Конц. КФК, Ел/л ПГ ИМ Особенности Генотип

F100 2 Утомляемость при ходьбе, жалобы на боли в ногах + + + + + + + + + + + 5072 + Передвигается с поддержкой p.[Gly91Ser]; [Gly91Ser]

F100.2 2 Слабость в ногах, утомляемость, падения + + + - + + + + + + + 11440 + p.[Gly91Ser]; [Gly91Ser]

C115 2 Трудности при подъеме по лестнице, вставании с корточек + + + + + + + + + + + 5000 + Не ходит с 11 лет p.[Arg77Cys]; [Arg77Cys]

C70 10 Трудности при выполнении обычных движений + + + - + + + + + - - 1979 + Не может самостоятельно подняться с пола p.Tyr134Ter(;) Arg284Cys

C140 12 Трудности при подъеме по лестнице, вставании с корточек + + + + + + + - + - - 2765 + Жалобы на болезненные мышечные спазмы и боли в суставах p.Arg77Cys(;) Arg284Cys

L468 3 Утомляемость при ходьбе, трудности при подъеме по лестнице + + + - + + + + + + - 6672 + Жалобы на боли в мышцах ног p.[Gly91Ser]; [Gly91Ser]

F121 3 Нарушение походки (ходьба на носочках) - + - - + + 10200 + Приемы Говерса не применяет p.[Arg77Cys]; [Trp75Glyfs*]

L486 4 Нарушения походки, трудности при беге - + + + + + + - + - - 8525 + Жалобы на боли в ногах с 4 лет, «МДД-ПФ» p.Arg77Cys(;) Arg192Ter

Пациент Возраст дебюта, лет Первые признаки 15 16 17 18 19 22 21 29 31 32 33 Конц. КФК, Ел/л ПГ ИМ Особенности Генотип

C95 27 Слабость в ногах, трудность подъема по лестнице - - + + + + + - + - - 1596 + Ходит с поддержкой 0.584+5О>Л(;) р.Уа1247Ме1

031 6 Трудности при подъеме по лестнице, вставании с корточек + + + + + + + - + - - 9354 - р.[Лг§192Тег]; [Л[Лг§192Тег]

L466 4 Трудности при вставании из положения сидя + + + + + + + + + + + 1950 + Диффузный остеопороз, иммуногистохимия р.[Лг§34И18]; [И185Ю1п]

L470 5 Нарушение походки, быстрая утомляемость + + + + + + + + + + - 11300 + Иммуногистохимия не ходит с 9 лет р.[Лг§192Тег]; [Л^192Тег]

L490 3,5 Нарушение походки (ходьба на носочках), + + + + + + + + + - - 5800 + Не ходит с 9 лет, у сибса тот же фенотип (не типирован) р.Тгр7Тег(;) Лг§34И18

Г. 7 Трудности при подъеме по лестнице, нарушение походки + + + + + + + - + + + 15200 + «МДД-ПФ» р.[С1у918ег]; [01у918ег]

Т. 4 Нарушение походки (ходьба на носочках) + + + + + + + - + - - 5200 + «МДД-ПФ» р.[Лгв77Су8]; [Туг134Тег]

И. 8 Нарушение походки, трудности в подъеме по лестнице - + + + + + + - + - - 2830 + Передвигается самостоятельно с поддержкой р.[Л^77Су8]; [Лг§77Су8]

Примечание: № признака в таблице 19 совпадает с № признака в таблице 20: 15 - гипотрофия мыщц предплечий, 16 -гипотрофия мышц плечевого пояса, 17 - гипотрофия мышц тазового пояса, 18 - отсутствие/снижение ахилловых рефлексов, 19 -отсутствие/снижение коленных рефлексов, 20 - отсутствие/снижение рефлекса двуглавой мышцы, 21 - отсутствие/снижение рефлекса карпо-радиального, 28 - контрактуры крупных уставов, 30 - гиперлордоз, 31 - сколиоз, 32 - кардиопатия, ПГ ИМ-псевдогипертрофии икроножных мышц; Конц. - концентрация; «МДД-ПФ» - «МДД-подобный» фенотип.

коленных рефлексов и рефлексов с двуглавой мышцы, а также снижение силы в проксимальных отделах нижних конечностей. В 93% случаев наблюдались миопатические знаки (приемы Говерса), «утиная» походка, невозможность ходить на пятках (в то время как ходьба на носках нарушена только у 25% больных), гипотрофия мышц плечевого и тазового поясов конечностей, снижение/отсутствие карпо-радиального рефлекса, снижение силы в проксимальных отделах верхних конечностей, поясничный гиперлордоз и наиболее характерный признак - псевдогипертрофии икроножных мышц. У 75% больных отмечаются снижение силы в дистальных отделах нижних конечностей и снижение/отсутствие ахилловых сухожилий. Также довольно частыми признаками при ПКМД 2D являются «крыловидные» лопатки (63%) и диффузная мышечная гипотония (68%). Концентрация КФК колеблется в пределах 1596-15200 ед/д (медиана - 5500 ед/д).

Три пробанда имеют активные жалобы на выраженные мышечные боли или спазмы (18,8%), у одной больной в качестве осложнения выявлен диффузный остеопороз. Трое больных (18,8%) на момент осмотра утратили возможность передвигаться самостоятельно, причем двое из них на десятом году жизни - спустя 4 и 6 лет от начала заболевания. Остальные 12 пробандов (80%) ходят самостоятельно или с поддержкой, при этом для 11 из них с момента манифестации прошло не более 10 лет, в то время как утрата способности к самостоятельному передвижению при ПКМД 2D наступает, как правило, в течение второго десятилетия от возраста дебюта. В единичном случае, пробанд с медленно прогрессирующим в течение 17 лет заболеванием, на момент осмотра способна передвигаться, однако, у нее также отмечается тенденция к инвалидизации, поскольку ходит больная только с поддержкой. Интересно, что у больных ПКМД 2D характерный для МДД/Б симптом «дряблых» надплечий выявлялся в 38% случаев, между тем как другой свойственный МДД/Б признак как «осиная» талия не наблюдался ни у одного больного.

3.4.2. Анализ вариантов гена SGCA: зависимость «генотип-фенотип» для

повторяющихся вариантов