Молекулярно-генетический анализ рака яичников тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат наук Мингажева Эльвира Тагировна

• Мингажева Эльвира Тагировна
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Мингажева Эльвира Тагировна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 .ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.Эпидемиология рака яичников

1.2.Факторы риска развития рака яичников

1.3. Вклад нарушений генов, вовлеченных в общий сигнальный путь поддержания стабильности генома, в развитие рака яичников

1.4. Роль вовлеченных в иммунный ответ и воспаление генов в патогенезе рака яичников

1.5.Современные молекулярно-генетические методы исследования

механизмов возникновения и развития рака яичников

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы исследования

2.2. Молекулярно-генетические методы исследования

2.2.1. Выделение геномной ДНК методом фенол-хлороформной экстракции

2.2.2. Метод дискриминации аллелей TaqMan

2.2.3. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК

2.2.4. Аллель-специфичная ПЦР

2.2.5.Анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов

2.2.6. Метод гель-электро фореза

2.2.7. Анализ кривых плавления с высокой разрешающей способностью (ШМ)

2.2.8. Секвенирование ДНК по Сэнгеру

2.2.9. Секвенирование экзома

2.2.10. Высокопроизводительная ПЦР в режиме реального времени по технологии Fluidigm

2.3. Статистические методы

2.4. Дизайн исследования

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Скрининг мутаций c.5266dupС, c.4034delА и е.68_69ёе1АО в гене ВЯСЛ1 и c.5946delT в гене ВЯСЛ2 в группе больных раком яичников

3.2.Полноэкзомное секвенирование образцов ДНК больных наследственным раком яичников

3.3. Скрининг и анализ встречаемости полиморфных локусов 22 генов-кандидатов, вовлеченных в канцерогенез, с использованием системы для проведения высокопроизводительной полимеразной цепной реакции в режиме реального времени

3.4. Анализ ассоциации полиморфных локусов генов иммунного ответа и воспаления ЫГКВ1, 1Ь18 и 1Ь23Я с развитием рака яичников у женщин из Республики Башкортостан

3.5. Анализ ассоциации сочетания аллелей и генотипов ряда

полиморфных локусов 25 генов-кандидатов рака яичников

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение А. Характеристика пациентов и индивидов из контрольной

группы, включенные в исследование

Приложение Б. Хроматограммы, подтверждающие наличие изменений нуклеотидной последовательности в генах, отобранных в результате

экзомного секвенирования

Приложение В. Частота редких аллелей полиморфных локусов генов-кандидатов рака яичников, обнаруженных в результате экзомного

секвенирования

Приложение Г. Анализ распределения частот аллелей ряда

полиморфных локусов потенциальных генов-кандидатов рака яичников

среди пациенток и женщин из контрольной группы

Приложение Д. Частота редких аллелей 22 полиморфных локусов

потенциальных генов-кандидатов рака яичников

Приложение Е. Результат аннотации 22 полиморфных локусов генов-

кандидатов рака яичников с помощью программы ANNOVAR

Приложение З. Электрофореграмма, описывающая результаты аллель-специфичной ПЦР полиморфного локуса rs 1946518 в гене IL18

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

РЯ -Рак яичников;

НРЯ -Наследственный рак яичников;

РМЖ -Рак молочной железы;

РБ -Республика Башкортостан;

OR - Odds Ratio (соотношение шансов);

CI - Confidence interval (доверительный интервал);

ПЦР -Полимеразная цепная реакция;

ПДРФ -Полиморфизм длин рестрикционных фрагментов;

HRM - High resolution melting analysis;

NGS - Next generation sequencing, секвенирование следующего

поколения;

GWAS - Genome-wide association study;

BRCA1 - Breast cancer 1 gene (ген, ассоциированный с РМЖ 1);

BRCA2 - Breast cancer 2 gene (ген, ассоциированный с РМЖ 2);

NFKB1 -Nuclear factor kappa B subunit 1 gene (ген ядерного фактора

транскрипции NF-kB);

IL18 -Interleukin 18 gene (ген интерлейкина18);

IL23R -Interleukin 23 receptor gene (ген рецептора интерлейкина 23);

ITIH2 -Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain 2 gene;

AGBL2 -ATP/GTP binding protein-like 2 gene;

FAM83A -Family with sequence similarity 83 member A gene;

ZC3H14 -Zinc finger CCCH-type containing 14 gene;

NBEAL1 -Neurobeachin like 1gene;

STX10 -Syntaxin 10 gene;

CXCR3 -C-X-C chemokine receptor type 3 gene.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-генетический анализ рака яичников»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования

Рак яичников (РЯ) является одним из наиболее распространенных злокачественных новообразований женской репродуктивной системы и в настоящее время представляет собой актуальную проблему здравоохранения. Каждый год в мире регистрируется более 295 414 новых случаев заболевания и 184 799 смертельных исходов (Bray et al., 2018). Важной особенностью рака яичников является то, что продолжительное время он протекает без явно выраженных симптомов и, как правило, диагностируется на поздних стадиях развития (III-IV), когда общая 5-летняя выживаемость пациентов не превышает 40% (Allemani et al., 2015).

В структуре общей онкологической заболеваемости злокачественными новообразованиями женского населения России рак яичников стоит на 10 месте (4,2%). Среди опухолей женской репродуктивной системы рак яичников занимает 3-е место после рака молочной железы, тела и шейки матки. Так, в 2018 году было зарегистрировано 14318 новых случаев заболевания раком яичников и 7616 смертельных исходов (Каприн и др., 2019). Похожая ситуация складывается и в Республике Башкортостан (РБ). В структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями у женщин республики РЯ находится на 6-ом месте (6,2%). В 2018 году у 13 094 человек была зарегистрирована онкопатология, среди которых 354 случая приходится на рак яичников (Каприн и др., 2019). Стандартизованный показатель заболеваемости на 2018 год составляет 10,50 на 100 000 человек (Каприн и др., 2019).

Злокачественные опухоли яичников встречаются у женщин разных возрастов. Средний возраст манифестации заболевания составляет 59,3 года, средний возраст умерших от рака яичников - 65,1 год. Пик заболеваемости РЯ приходится на возраст 60-64 года. Кроме того, в последние годы наблюдается тенденция к омоложению данного вида рака, так чаще стали

диагностировать заболевание в группе женщин в возрасте до 30 лет (Каприн и др., 2019).

Рак яичников - это сложное гетерогенное заболевание, развитие которого обусловлено наследственной предрасположенностью, возрастом, гормональным дисбалансом, воздействием окружающей среды и образом жизни. Высокий риск данной патологии в первую очередь связан с мутациями в генах-супрессорах опухолевого роста BRCA1 и BRCA2, белковые продукты которых являются основными участниками сигнального пути клетки в ответ на воздействие ионизирующей радиации (Antoniou et al., 2003; Любченко, 2009; Шубин, Карпухин, 2011; Батенева и др., 2013; Бермишева и др., 2018; Tyulyandina et al., 2019). В развитие РЯ также вовлечены другие гены с умеренной и низкой пенетрантностью, участвующие в поддержании целостности генома, процессах пролиферации и миграции клеток, репарации (NBN, RAD50, MRE11, CHEK2, BLM, PALB2, ATM, BRIP1, BARD1, MDC1, STK11, TP53, CDK12 и другие) (Прокофьева, 2013; Батенева и др., 2013; Бермишева и др., 2018; Гордиев и др., 2018; Koczkowska et al., 2018; Bogdanova et al., 2019).

В последнее время при исследовании патогенеза злокачественных новообразований яичников большой интерес ученых во всем мире направлен на изучение роли генов иммунного ответа и воспаления в развитии РЯ. Ежедневно в организме возникает большое количество клеток, подвергшихся злокачественной трансформации. При нормальном функционировании иммунной системы иммунокомпетентные клетки способны находить и уничтожать их. При наличии ошибок в иммунологической регуляции перерожденная клетка не распознается, вследствие чего происходит накопление пула опухолевых клеток, что ведет к росту опухоли. Одним из важных механизмов, предшествующих злокачественной трансформации клеток, считается хроническое воспаление. В качестве регуляторных молекул, опосредующих функциональную связь между воспалением и канцерогенезом, выступают провоспалительные цитокины и хемокины, но до

настоящего времени нет единого мнения о степени их участия в патогенезе рака яичников (СИагЬоппеаи е1 а1., 2013; Faro1fi е1 а1., 2019).

Степень разработанности темы

Несмотря на то, что на сегодняшний день достигнуты определенные успехи в области изучения генетической предрасположенности к раку яичников, остается еще множество невыясненных аспектов. Дальнейшие исследования патогенетических механизмов возникновения и развития РЯ будут способствовать более глубокому пониманию данной проблемы.

Для всестороннего изучения РЯ на сегодняшний день созданы международные консорциумы, основной целью которых является изучение сложных патогенетических механизмов развития опухолей яичников с применением передовых технологий анализа генома. В рамках данных исследований выявлены новые генетические факторы риска и мишени для таргетного лечения пациентов с диагнозом «рак яичников» (Cancer Genome Atlas Research Network et al. 2011; Johnatty et al., 2015; Knijnenburg et al., 2018).

Благодаря стремительному развитию современных технологий, включая секвенирование экзома, стало возможным проводить масштабный скрининг различных изменений по всему геному. Исследования с применением подходов секвенирования следующего поколения (Next Generation Sequencing) позволяют вести поиск новых генов-кандидатов, вовлеченных в развитие того или иного заболевания, включая рак яичников (Susswein et al., 2015; Zhao et al., 2017; Li et al., 2019).

В последнее время для исследования общей генетической изменчивости по всему геному человека с целью определения генетических ассоциаций с заболеванием и поиска генов, вовлеченных в патогенез многофакторных патологий широкое применение получили технологии биологических микрочипов, которые позволяют за короткое время проводить одновременное тестирование тысяч образцов. Использование подобных

подходов может быть весьма востребованным для выявления маркеров риска развития и тяжести течения заболеваний, а также при создании «генетического паспорта» человека (Chan et al., 2017).

Башкортостан является многонациональной республикой со сложной историей формирования генофонда популяций, что значительно влияет на структуру заболеваемости онкопатологиями. Известно, что спектр и частота вовлеченных в патогенез РЯ мутаций и полиморфных локусов сильно отличаются между различными географическими регионами и странами. Таким образом, популяции Республики Башкортостан обладают своими генетическими особенностями. В связи с этим остро стоит необходимость проведения поиска этноспецифичных генетических маркеров риска развития рака яичников, что позволит диагностировать заболевание на ранних стадиях и повысит эффективность лечения.

На основании вышеизложенного была поставлена цель исследования: Изучение молекулярно-генетических маркеров риска развития рака яичников у женщин из Республики Башкортостан.

Для достижения цели выдвинуты следующие задачи:

1. Провести полное экзомное секвенирование образцов ДНК больных наследственным раком яичников с последующим биоинформатическим анализом полученных данных и идентификацией патогенных и вероятно патогенных вариантов нуклеотидной последовательности новых генов-кандидатов рака яичников.

2. Оценить частоту встречаемости выявленных при секвенировании экзома патогенных и вероятно патогенных вариантов новых генов-кандидатов рака яичников на расширенных выборках пациенток и контрольной группы.

3. Провести анализ ассоциации 22-х полиморфных локусов потенциальных генов-кандидатов рака яичников (USP39, EGF, SMARCAL1, BCLAF1, ANKRD36, PHKB, TP53I3, PZP, APLF, EXO5, BABAM2, HERC6,

БС1ЯЕ1Л, Б1Х1В, ЛРОВЕС1, Н4С2, Н4С12, ЛШ/Р, МУСТ1, ЫЛЫвО, ЛТР23 и ЕЛЫСЬ) с риском развития заболевания.

4. Провести анализ ассоциации 4-х полиморфных локусов генов иммунного ответа и воспаления - г^28362491/#РКВ1, га 1946518/^18, ^7517847!/Ь23Я и га10889677//Ь23Я с риском развития рака яичников.

5. Провести анализ ассоциации сочетания аллелей и генотипов ряда полиморфных локусов 25-и генов-кандидатов рака яичников с риском развития заболевания.

Научная новизна исследования

Впервые проведено полное экзомное секвенирование 8 образцов ДНК, выделенных из венозной крови больных наследственным раком яичников (НРЯ). Биоинформатический анализ данных, а также оценка функциональной значимости выявленных с помощью аналитических программ вариантов, позволили отобрать 7 новых потенциальных генов-кандидатов (ЛОВЬ2, /Т/Н2, ЕЛМ83Л, ЫВЕЛЫ, 1С3Н14, СХСЯ3 и 5ТХЮ), нарушения в которых могут привести к развитию РЯ.

Впервые получена оценка частоты гетерозиготного носительства редких аллелей вероятно патогенных вариантов с^481А/ЛСВ£2, С.С1438Т//Т/Н2, с.736Ае\С/БТХ10 и с.293_296de1ACAG/ZC3H14, сШ56Т /ГЛМ83Л, с.G3463T/NBEЛL1, с.С73Т/СХСЯ3 среди больных раком яичников и контроля из РБ. Впервые установлено, что вероятно патогенные варианты с.G481A/ЛGBL2, с.293_296de1ACAG/ZC3H14 и с.С73Т/СХСЯ3 встречаются в гетерозиготном состоянии только у больных раком яичников с частотой 0,38%, 0,38% и 0,76%, соответственно.

Вероятно патогенные варианты С.С1438Т//Т/Н2, c.G256T/FЛM83Л, с.736Ае1С/8ТХ10, с.G3463T/NBEЛL1 определены как у больных РЯ (1,5%; 1,9%; 1,14%; 0,38% соответственно), так и в контрольной группе (0,35%; 0,7%; 1,41% и 0,35% соответственно), однако при сравнительном анализе

распределения частот аллелей и генотипов изученных локусов достоверных различий между выборками не выявлено (р>0,05).

Впервые проведен анализ частоты встречаемости редких аллелей 22 полиморфных локусов новых потенциальных генов-кандидатов РЯ rs112653307/USP39, rs11569144/EGF, rs119473033/SMARCAL1,

rs138333275/BCLAF1, rs141447363/ANKRD36, ra141733590/PHKB,

га200026311/О^ШМ, rs200435542/SLX1B, rs34275479/APOBEC1, rs535221714/H4C2, rs544620282/H4C12, rs564635111/AUNIP,

rs3841162/MYCT1, rs762642172/NANOG, rs768622289/ATP23 и rs759217526/FANCL в выборках пациенток и женщин из контрольной группы. Редкие аллели 3-х полиморфных локусов rs119473033/SMARCAL1, rs200026311/DCLRE1A и rs768622289/ATP23 не выявлены в исследуемых выборках. Ассоциации 19-и полиморфных локусов генов-кандидатов с риском развития рака не установлено.

Впервые дана оценка ассоциации полиморфных локусов га28362491, rs1946518, га7517847 и га 10889677 генов иммунного ответа и воспаления ^18 и IL23R с риском развития эпителиального РЯ у женщин из РБ. Установлена ассоциация гетерозиготного генотипа га1946518*СА гена ^18 с повышенным риском развития рака яичников у женщин русской этнической принадлежности (р=0,003, OR=2,40). Генотип га10889677*СА гена IL23R является маркером повышенного риска развития рака яичников у пациенток в постменопаузе (р=0,002, ОЯ=4Д3) и женщин с заболеванием, диагностированным на поздних стадиях (р=0,004, ОЯ=4,24), татарской этнической принадлежности.

Впервые дана оценка ассоциации сочетания аллелей и генотипов ряда полиморфных локусов 25 генов-кандидатов РЯ с риском развития заболевания у женщин из РБ. Маркерами повышенного риска развития заболевания у женщин русской этнической принадлежности с

ra145078765/TP53I3, rs150018949/EXO5,

rs145240281/PZP, ra150302537/BABAM2,

ra149897324/APLF, га192005184Ж^6,

манифестацией заболевания в пременопаузе являются сочетания аллелей и генотипов rs28362491 *D гена + га762642172*! гена NANOG +

га1946518*СА гена Ш8\ га1946518*С гена Ш8 + ^564635111*11 гена AUNIP и rs 1946518*C гена Ш8 + rs762642172*II гена NANOG. Рисковыми для женщин татарской этнической принадлежности являются сочетания аллелей и генотипов га762642172 *! гена NANOG + га3841162*В гена МУСТ1 + га 141447363*! гена ANKRD36 + rs7517847*G гена IL23R (без учета менопаузального статуса), га28362491*Т гена + га 10889677*А гена

IL23R + rs7517847*G гена IL23R и га28362491*1 гена +

га10889677*СА гена IL23R (в постменопаузе).

Теоретическая и практическая значимость исследования

Данные, полученные в нашем исследовании, расширяют знания о генетической предрасположенности к возникновению РЯ. Результаты исследования могут использоваться при чтении лекций по медицинской генетике и онкогенетике на биологических факультетах университетов, медицинских ВУЗов, на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Методология и методы исследования

Методологическую основу проведенного нами исследования составил системный подход с применением комплекса молекулярно-генетического и статистического методов, анализа данных литературы по результатам исследований ведущих отечественных и зарубежных авторов, что позволяет всесторонне изучить роль выбранных генов-кандидатов в патогенезе рака яичников. Молекулярно-генетические исследования проводились в лаборатории ПЦР-анализа Башкирского государственного университета.

Положения, выносимые на защиту:

1.В результате анализа данных полного экзомного секвенирования образцов ДНК пациенток с наследственным раком яичников из Республики Башкортостан обнаружены вероятно патогенные варианты 7 новых потенциальных генов-кандидатов - ЛGBL2, /Т/Н2, БТХ10, 2С3Н14, ГЛМ83Л, NBEЛL1 и СХСЯ3.

2.Впервые идентифицированные вероятно патогенные варианты с^481А в гене ЛGBL2, с.293_296de1ACAG в гене 2С3Н14 и известный вероятно патогенный вариант с.С73Т в гене СХСЯ3 встречаются в гетерозиготном состоянии у больных раком яичников из Республики Башкортостан с низкой частотой 0,38%, 0,38% и 0,76%, соответственно.

3.Частоты встречаемости вероятно патогенного варианта С.С1438Т в гене /Т/Н2, впервые обнаруженного при секвенировании экзома, и известного вероятно патогенного варианта с^256Т в гене ЕЛМ83Л у больных раком яичников были выше, чем в контрольной группе, и составляли 1,5% и 0,35%, соответственно (с.С1438Т//Т/Н2); 1,9% и 0,7%, соответственно (c.G256T/FЛM83Л). Впервые выявленный вероятно патогенный вариант c.736delC в гене БТХ10 и вероятно патогенный вариант с^3463Т в гене NBEЛL1 с низкой частотой встречались в группах больных раком яичников и контроля - 1,14% и 1,41%, соответственно (c.736de1C/STX10) и 0,38% и 0,35%, соответственно (с.G3463T/NBEЛL1).

4.Минорные аллели полиморфных локусов rs 119473033/SMAЯCЛL1, rs200026311/DCLЯE1Л и га768622289/ЛТР23 не выявлены ни в группе больных, ни в группе контроля. Редкие аллели 19-и полиморфных локусов потенциальных генов-кандидатов рака яичников Р39, EGF, В^ЛР1, ЛШШ36, РНКВ, ТР53/3, РТР, ЛPLF, EXO5, ВЛВЛМ2, ШЯС6, SLX1B, ЛPOBEC1, Н4С2, Н4С12, ЛШ/Р, МУСТ1, NЛNOG и FЛNCL) встречались с частотой 0,24-12,44% среди пациенток и с частотой 0,24-9,38% в контрольной группе. Ассоциации изученных 19-и полиморфных локусов с риском развития рака яичников не установлено.

5. Гетерозиготный генотип rs1946518*CA гена IL18 является генетическим маркером риска развития рака яичников для женщин русской этнической принадлежности (p=0,003, OR=2,40). Генотип rs10889677*CA гена IL23R ассоциирован с повышенным риском развития рака яичников у пациенток в постменопаузе (p=0,002, OR=4,13) и женщин с заболеванием, диагностированным на поздних стадиях (p=0,004, OR=4,24), татарской этнической принадлежности.

6.Впервые выявлена ассоциация сочетания аллелей и генотипов rs28362491*D гена NFKB1 + rs762642172*I гена NANOG + rs1946518*CA гена IL18; rs1946518*C гена IL18 + rs564635111*II гена AUNIP и rs1946518*C гена IL18 + rs762642172*II гена NANOG с повышенным риском развития рака яичников у женщин русской этнической принадлежности в пременопаузе. Впервые обнаружена ассоциация сочетания аллелей и генотипов ряда генов с повышенным риском развития рака яичников у женщин татарской этнической принадлежности вне зависимости от менопаузального статуса (rs762642172 *I гена NANOG + rs3841162*D гена MYCT1+ rs 141447363*I гена ANKRD36 + rs7517847*G гена IL23R) и с манифестацией заболевания в период постменопаузы (rs28362491 *I гена NFKB1 + rs10889677*A гена IL23R + rs7517847*G гена IL23R, rs28362491 *I гена NFKB1 + rs10889677*CA гена IL23R).

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность полученных результатов подтверждается применением современных молекулярно-генетических и статистических методов. Результаты исследования согласуются с данными, представленными в отечественной и зарубежной литературе. Материалы исследования были представлены на международных и российских конференциях: «European Human Genetics Conference» (Glasgow, Scotland, United Kingdom, 2015), «Трансляционная биомедицина: современные методы междисциплинарных исследований в аспекте внедрения в практическую медицину» (Санкт-

Петербург, 2015), «Актуальные проблемы современной генетики» (Казань, 2016), VII Международной школе молодых учёных по молекулярной генетике «Геномика и биология живых систем» (Звенигород, 2016), «Молекулярная Диагностика 2017» (Москва, 2017), XI научной конференции «Генетика человека и патология» (Томск, 2017), IX Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная Диагностика 2018» (Минск, 2018), Всероссийской конференции «Биология будущего» (Уфа,

2018), VI Студенческой научной конференции «Биология будущего» (Уфа,

2019), Международном Конгрессе «VII Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров» (г. Санкт-Петербург, 2019), «V Российский Конгресс лабораторной медицины» (г. Москва, 2019), «XIII Международный конгресс по репродуктивной медицине» (г.Москва, 2019), «V Всероссийская конференция по молекулярной онкологии» (г.Москва, 2019), научно-практическом журнале «Прикладные информационные аспекты медицины».

Личный вклад автора в проведенные исследования

Определение направления диссертационной работы, цели и задачи исследования проводились автором совместно с научным руководителем д.б.н., проф., Хуснутдиновой Э.К. Автором самостоятельно изучена зарубежная и отечественная литература по теме диссертации и лично написана рукопись данной работы. Автор непосредственно участвовал в подготовке материалов к публикациям и их написании. Основная часть экспериментальной работы: выделение ДНК, амплификация, рестрикционный анализ, анализ кривых плавления с высокой разрешающей способностью (НЯМ), секвенирование ДНК по Сэнгеру, высокопроизводительная ПЦР в режиме реального времени по технологии F1uidigm выполнены автором самостоятельно. Соискатель самостоятельно обрабатывал, анализировал и обобщал полученные данные.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 28 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК РФ.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Диссертационная работа «Молекулярно-генетический анализ рака яичников» соответствует формуле специальности 03.02.07 - «Генетика». В диссертационной работе исследована возможность использования генетических факторов риска, как маркеров риска развития РЯ у женщин из Республики Башкортостан.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, библиографического списка и приложений. Список литературы включает 503 работы зарубежных и отечественных авторов. Работа изложена на 246 страницах машинописного текста, содержит 32 рисунка, 20 таблиц и 7 приложений.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Эпидемиология рака яичников

Рак яичников является одним из наиболее частых злокачественных опухолей женских половых органов и в мировой статистике занимает третье место после рака тела и шейки матки (Жорданиа и др., 2017). Высокая смертность в первую очередь вызвана диагностированием данной патологии на поздних стадиях развития (Ш-1У). Как правило, на первом году после установления диагноза погибает каждая третья пациентка. Выявление заболевания на поздних стадиях развития и низкая выживаемость больных связаны с бессимптомным течением болезни, широким возрастным диапазоном, разнообразием гистологических типов, ограниченной чувствительностью и специфичностью диагностических методов исследования, несовершенством методов терапии, врачебными ошибками, а также низкой онкологической настороженностью врачей амбулаторно-поликлинического звена (Воробьева и др., 2013; Жорданиа и др., 2017).

В России в 2018 году было зарегистрировано 14318 новых случаев заболевания раком яичников и 7616 смертельных исходов (рис. 1, 2) (Каприн и др., 2019). Всего на учете в 2018 году в нашей стране стояло 81707 пациенток с данной патологией и 52668 женщин умерли (ЬАр:/^1оЬосаплагс.1г). По данным Каприна и Старинского (2019) заболеваемость РЯ в России возросла с 59,1 на 100 000 женщин в 2008 г. до 76,2 на 100 000 женщин в 2018 г. Удельный вес больных, выявленных на I стадии заболевания в 2018 г. составил 27,8% больных, II - 12,5%, на III стадии - 38%, на IV стадии - 20,0%. Летальность на первом году с момента установления диагноза составила 21,3%. С 2008 г. данный показатель снизился на 4,9% (Каприн и др., 2019).

14800 14600 14400 14200 14000 13800 13600 13400 13200 13000 12800

12600 -1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-1-

т^ ^ ^ **

Рисунок 1. Динамика заболеваемости раком яичников в России за период 2008-2018 гг.

7850

7800 —-к-ж-

7750 —г-А—/Х—А-

7700 —/—\ / X / \ ^—

7650 —г-V/-—

7600 -Л-у-±-^

7550 --

7500

7450

7400

/> ^ ^ ^ /

Рисунок 2. Динамика смертности от рака яичников в России за период

2008-2018 гг.

Похожая ситуация складывается и в Республике Башкортостан (РБ). В 2018 году у 13 094 человек была зарегистрирована онкопатология, среди которых 354 случая приходится на рак яичников (Каприн и др., 2019). В структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями у женщин республики РЯ находится на 6-ом месте (6,2%). Стандартизованный показатель заболеваемости на 2018 год составляет 10,50 на 100 000 человек. Из них 22,2% имели I стадию болезни, 13,4% - II, 48,1% - III, 16,2% - IV стадию. К концу года всего на учете состояло 2707 больных. Летальность на

первом году жизни после установления диагноза составила 22,7% (Каприн и др., 2019).

Злокачественные опухоли яичников встречаются у женщин разных возрастов. В России в 2018 году доля рака яичников среди злокачественных новообразований у женщин колебалась от 3,53% (в 55-84 года) до 6,63% (в 40-54 года) и 7,35% (в 15-39 лет). Показатель заболеваемости достигал наибольшего значения (39,61 на 100 000) в возрастной группе 65-69 лет. Средний возраст манифестации - 59,3 года, средний возраст умерших от рака яичников - 65,1 года. Пик заболеваемости РЯ приходится на возраст 60-64 года (Каприн и др., 2019).

1.2. Факторы риска развития рака яичников

Генетическая предрасположенность. Генетическая

предрасположенность является одним из основных факторов риска развития РЯ (Lynch etal., 2012). В 10-17% случаев РЯ наследуется по аутосомно-доминантному типу с неполной пенетрантностью. Установлено, что характерными особенностями для постановки диагноза семейного РЯ служат ранний возраст манифестации заболевания, отягощенный семейный анамнез и наличие синхронных или метахронных первично-множественных новообразований. Молекулярные изменения в таких случаях затрагивают высокопенетрантные гены BRCA1 и BRCA2, терминальные мутации которых увеличивают риск развития РЯ (Lalwani et al, 2011; Zhang et al, 2011; Kuchenbaecker et al., 2017). Выделяют три формы наследственного рака яичников.

Семейный рак яичников. Встречается в 10-15% случаев наследственного РЯ. Риск развития заболевания зависит от числа ближайших родственников, заболевших ранее раком яичников, особенно в семьях, где заболевание зарегистрировано у родственников первой степени родства (Jervis et al., 2014; Frank et al., 2017; Zheng et al., 2018).

Семейный рак молочной железы /яичников. На долю данной формы заболевания приходится 65-75% всех случаев наследственного РЯ. В таких семьях наблюдаются случаи заболевания раком молочной железы (РМЖ) и раком яичников у ближайших родственниц (Урманчева и др., 2012).

Основная доля наследственного рака яичников и рака молочной железы обусловлена мутациями в высокопенентрантных генах-супрессорах опухолевого роста - BRCA1 (Breast cancer gene 1) и BRCA2 (Breast cancer gene 2) (Lalwani et al, 2011). Белковые продукты данных генов вовлечены в процессы регуляции пролиферации клеток, геномной стабильности и репарации двунитевых разрывов ДНК путем гомологичной рекомбинации. У носительниц мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 риск развития рака яичников к 8О годам составляет 35-53% и 11-25%, соответственно (Kuchenbaecker et al., 2017).

Наследственный неполипозный рак толстой кишки (HNPCC, Hereditary Non Polyposis Colorectal Cancer), синдром Линча. В семьях, отягощенных синдромом Линча, у ближайших родственников с высокой частотой наблюдаются аденокарциномы различной локализации, преимущественно в толстой кишке, молочной железе, эндометрии и яичниках (Урманчеева и др., 2012). К настоящему времени выявлены основные гены, мутации в которых обуславливают синдром Линча; MLH1, MSH2, MSH6, PMS2, MLH3 и EPCAM. Нарушения функции данных генов приводят к дефектам системы репарации неспаренных оснований (MMR, mismatch repair) и выражаются высоким уровнем микросателлитной нестабильности в опухоли (Vasen et al., 2ОО7). Синдром Линча составляет 0,4%-1% случаев в структуре заболеваемости раком яичников (Norquista et al, 201б). Риск развития РЯ в течение жизни у женщин с синдромом Линча колеблется от 4% до 2О%. Средний возраст больных, у которых развивается РЯ при синдроме Линча, составляет 42.5 года, однако около 3О% случаев заболевания диагностируются до 35 лет (Watson et al., 2008). РЯ,

ассоциированный с синдромом Линча, обычно представлен эндометриоидными или светлоклеточными опухолями (Ketabi et al., 2011).

Изменение гормонального фона. Рак яичников является гормонозависимой опухолью. Гормональные нарушения, проявляющиеся в виде изменения метаболизма эстрогенов, создают условия для возникновения мутаций и высокой клеточной пролиферации, что в свою очередь предрасполагает к развитию злокачественного новообразования. Генетические нарушения в генах, продукты которых участвуют в метаболизме эстрогенов, могут увеличивать риск новообразований репродуктивной системы, в том числе рака яичников (Chen et al., 2020).

С риском развития РЯ также связаны ранний возраст менархе (до 11 лет) и позднее вступление в период менопаузы (после 55 лет), поскольку происходит увеличение количества овуляторных циклов (Gong et al., 2013; Li et al., 2015; Wentzensen et al., 2016). Уменьшение количества овуляторных циклов в течение жизни вследствие беременностей, периода кормления грудью и приема оральных контрацептивов выступает в качестве протективного фактора в развитии РЯ (Wentzensen et al., 2016). Так, в работе Wentzensen с соавторами было установлена обратная ассоциация позднего возраста менархе и светлоклеточных опухолей яичников. Наступление менопаузы после 55 лет было ассоциировано с эндометриоидным и светлоклеточными опухолями, по сравнению с серозными и муцинозными гистологическими типами РЯ (Gates et al., 2010; Wentzensen et al., 2016). Установлено, что такие характеристики менструального цикла как длительность и регулярность/нерегулярность могут оказывать различное влияние на развитие РЯ в зависимости от гистологического типа опухоли. Так, у женщин с нерегулярными менструациями и продолжительностью цикла больше 35 дней отмечено достоверное снижение риска инвазивного рака по сравнению с женщинами с регулярным циклом меньше 35 дней. Однако для женщин с нерегулярным циклом возрастает риск возникновения пограничных серозных и муцинозных опухолей (Harris et al., 2018).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Мингажева Эльвира Тагировна, 2020 год

= 200 - -

100 --

О -■

-1С

Allelic Diacnmination

T]

□ д

о

10 20 30

RFU for Allele 1 FAM

JO

50

| □ Allele? с none A Hetereaaote |

Allelic Di9Cri[ftin«iDf>

700 600 ^ 500 „ 400 4 300

о

= 200 s

100 0

Г п Л ;

Г о

□ Allele 2

20 40 SO 80

RFU for Allele 1 - FAM

О None д Helerozygote [

Рисунок 16. Скрининг мутаций с.5266ёирС (а), с.4034ёе1А (б) и с.68_69ёе1ЛО (в) гена BRCA1 методом дискриминации аллелей TagMan. I I -гомозигота по нормальному аллелю; - гетерозигота.

Скрининг мутации c.4034delA (4153delA) в гене БЯСЛ1 Мутация c.4034delA, локализованная в 11 экзоне гена БЯСЛ1, приводит к сдвигу рамки считывания, в результате чего появляется преждевременный стоп кодон. В нашей работе носительниц мутации c.4034delA гена БЯСЛ1 не выявлено.

Скрининг мутации c.68_69delAG (185 del AG) в гене BRCA1 Мутация c.68_69delAG, локализованная во 2 экзоне гена BRCA1, приводит к сдвигу рамки считывания. Данное нарушение с высокой частотой обнаружено у евреев ашкенази, в Северной Америке, Южной Африке, Азии, Англии, Франции, Венгрии, Польше и России (Rebbeck et al., 2018). Однако в нашем исследовании носителей данной мутации не найдено.

Скрининг мутации c.5946delT в гене BRCA2 Мутация c.5946delT (6174 delT) расположена в регионе OCCR (ovarian cancer cluster region) гена BRCA2. В проведенном нами исследовании носительниц данного изменения не обнаружено.

Allelic Oi-sCsifrisri-aliOn

еоо soo доо +

«ч

я гоо

и.

СИ

100 0

: # д

Ф

■Ю

10 20 RFU for Allele 1 - РАМ

30

40

□ Aiiflfc г

A Htttfoiyggti")

Рисунок 17. Генотипирование мутации c.5946delТ в гене БЯСЛ2 методом дискриминации TagMan: - гомозигота по нормальному аллелю; -гетерозигота.

Дополнительно был проведен скрининг мутаций c.5266dupC, c.4034delA и c.68_69delAG в гене BRCA1 и c.5946delT в гене BRCA2 с целью определения частоты встречаемости данных изменений у женщин из РБ

(n=284). Носительниц данных мутаций не обнаружено.

***

Наличие терминальных мутаций в генах BRCA1 и BRCA2 является одной из основных причин злокачественной трансформации клеток яичников и молочной железы. По данным BIC (Breast Cancer Information Core) самой частой мутацией в гене BRCA1 является c.5266dupC. Данная мутация с разной частотой встречается у больных раком молочной железы и/или рака яичников из Польши, Сербии, Словении, Германии, Франции, России и некоторых других стран (Батенева и др., 2013; Бермишева и др., 2018; Meisel et al., 2017; Kowalik et al., 2018; Rebbeck et al., 2018; Laitman et al., 2019). В нашем исследовании частота встречаемости мутации c.5266dupC составила 3.4%, что согласуется с данными, полученными рядом ученых при изучении спектра мутации в гене BRCA1 в российских популяциях (Любченко, 2009; Батенева и др., 2013; Прокофьева,2013; Бровкина и др., 2017; Бермишева и др., 2018).

Делеция аденина в позиции 4034 кДНК гена BRCA1 также с разной частотой встречается в различных популяциях Европы, наиболее высокая частота распространения данной мутации обнаружена у больных РЯ из Республики Белоруссия и Литвы (Bogdanova et al., 2010; Rebbeck et al., 2018). В России делеция выявлена с низкой частотой. В нашей работе носители мутации c.4034delA гена BRCA1 не идентифицированы.

Мутация c.68_69delAG гена BRCA1 была выявлена в семьях c раком молочной железы и/или яичников из Франции, Польши, Росиии, Испании, Египта, Турции и ряде других стран (Rebbeck et al., 2018; Laitman et al., 2019). В нашей работе данное изменение не выявлено.

Делеция тимина в положении 5946 кДНК гена BRCA2 характерна для больных РЯ и РМЖ из Северной Америки, Южной Африки, Австралии,

Израиля, Англии, Нидерландов, Германии, Венгрии, Польши и России. Мутация c.5946delT в гене BRCA2 является мутацией с эффектом основателя для евреев Ашкенази (Rebbeck et al., 2018; Laitman et al., 2019).

3.2. Полное экзомное секвенирование образцов ДНК больных наследственным раком яичников

Нами было проведено полное экзомное секвенирование 8 образцов ДНК, выделенных из венозной крови больных наследственным раком яичников из Республики Башкортостан, что позволило определить новые потенциальные гены-кандидаты рака яичников.

Ввиду очень большого массива сырых данных для обработки результатов экзомного секвенирования использовалась уникальная научная установка Центра коллективного пользования научным оборудованием ФГБОУ ВО «Башкирский государственный университет» (ЦКП БашГУ) -гетерогенный вычислительный кластер для высокопроизводительных параллельных вычислений, а также высокопроизводительный компьютер с пакетом программ для обработки большего объема геномных данных лаборатории генетики рака отделения акушерства и гинекологии медицинской школы Ганновера (Германия).

Обработка данных полного экзомного секвенирования включала три

этапа:

- базовая биоинформатическая обработка, основанная на удалении плохих ридов, выравнивании последовательности относительно референсного генома и определении качества секвенирования;

- дополнительная программная обработка, которая заключалась в определении кодирующих последовательностей и выравнивании ридов по парам;

- исследовательский анализ, целью которого было определение типа изменения нуклеотдной последовательности ДНК, их отбор и выявление функциональной значимости обнаруженных вариантов.

В рамках базовой биоинформатической обработки данных также проводили определение качества секвенирования экзома для каждого образца по программе FastQS High Throughput Sequence QS Report ver.0.11.2 (http: //www.bioinformatics. babraham.ac. uk/proj ects/fastqc/).

Следующий этап - дополнительный биоинформатический анализ данных экзомного секвенирования проводили с помощью программного обеспечения NextGENe-2.2-UG001 (Bioke), позволяющего отображать сегменты точек разрывов, биологическую информацию для каждой точки разрыва, а также информацию о покрытии, данные о мутациях, расположение кодирующих последовательностей (CDS) и мРНК и текущую позицию ридов в выравнивании. После завершения выравнивания по парным ридам либо по одиночным последовательностям данные о вариантах, расположение кодирующих последовательностей (CDS) и мРНК и текущую позицию ридов в выравнивании. После завершения выравнивания по парным ридам либо по одиночным последовательностям данные об изменениях были автоматически сгенерированы. Для их отображения пользовались опцией mutation report, которая представляет собой полные данные о каждом варианте, а именно нить ДНК, на которой расположен ген, образец РНК для гена из NCBI, референсный нуклеотид, количество выровненных ридов на месте SNP (покрытие), количество ридов, отражающих позицию изменения в прямом и обратном направлениях.

При непосредственной исследовательской работе по анализу данных полного экзомного секвенирования проводился поиск наболее значимых вариантов, которые могут быть вовлечены в канцерогенез опухолей яичников. При отборе изменений были использованы следующие критерии:

1. Локализация варианта. В приоритете рассматривались изменения, расположенные в экзонах и сайтах сплайсинга.

2. Функциональная значимость. В первую очередь отбирались изменения, приводящие к сдвигу рамки считывания или к образованию стоп кодона;

3. Новизна. В приоритете были впервые выявленные варианты. Для известных вариантов оценивалась частота встречаемости в различных популяциях;

4. Для генов, отобранных по предыдущим критериям, проводили анализ сигнальных путей, в которые они вовлечены. В первую очередь рассматривались сигнальные пути, вовлеченные в возникновение онкопатологий, а именно репарация, апоптоз, контроль клеточного цикла; воспаление и иммунный ответ, а также проводилось изучение партнеров, с которыми взаимодействует ген-кандидат.

5. Оценка влияния обнаруженных генетических вариантов на функциональное состояние белка.

Обнаруженные изменения в последовательности ДНК были аннотированы с помощью программы ANNOVAR (Wang et al., 2010), а также проведено сравнение с рядом специализированных баз данных:

dbSNP - база данных, содержащая описание однонуклеотидных полиморфизмов, коротких вставок и делеций, коротких тандемных повторов;

Reference Sequence (RefSeq) - аннотация замен по этой базе данных позволяет понять, как в кодирующую или некодирующую часть генома попала замена. Если в кодирующую, то в какой ген попала замена, в какой экзон этого гена, и привела ли замена к смене аминокислоты или к сдвигу рамки считывания;

Sift - база данных, позволяющая прогнозировать вред несинонимичных мутаций для последовательности белка, кодированной геном, содержащим замену;

PolyPhen-2, LTR, MutationTaster annotation, MutationAssessor annotation, FATHMM annotation - базы данных, позволяющая прогнозировать силу вреда замены;

CADD - представляет собой инструмент для оценки вредности единичных нуклеотидных вариантов, а также вариантов вставки / делеции в геноме человека;

ClinVar - база данных, содержащая информацию о клинически значимых полиморфизмах и об их ассоциации с заболеваниями;

1000 Genomes, esp6500, ExAC - базы данных, содержащая информацию о частотах минорных аллелей, составленных на основании результатов секвенирования геномов и экзомов в рамках проектов «1000 genomes» и «NHLBI Grand Opportunity Exome Sequencing Project».

В результате полного экзомного секвенирования образцов ДНК, выделенных из крови больных наследственным раком яичников в среднем в одном образце обнаружено 53057 изменений нуклеотидной последовательности. При этом более половины данных изменений были аннотированны, как расположенные в интронных областях. При анализе функциональной значимости идентифицированных генетических вариантов установлено, что 0,14% изменений являются нонсенс-мутациями, 18,61% -сайлент-мутациями, 18,40 % - миссенс-мутациями, 0,4% - инсерциями и делециями, 0,3% - инсерциями и делециями, не приводящими к сдвигу рамки считывания; и для 62,14% вариантов не ясно влияние на структуру и функцию белка (табл.3)

Таблица 3. Данные по всем изменениям, обнаруженным в результате проведенного полного экзомного

секвенирования образцов ДНК больных наследственным раком яичников (п=8).

1 2 3 4 5 6 7 8

Всего 53 645 67 467 54 464 53 874 52 468 58 161 56 647 64 486

- Экзонные изменения 21 112 27 326 21 630 21 490 20 033 24 163 23 006 26 633

- Интронные изменения 32 415 40 012 32 727 32 261 32 321 33 884 33 543 37 732

- Изменения сайта сплайсинга 118 129 107 123 114 114 98 121

Тип изменений

-Известные варианты 50 694 64 167 51 418 50 848 49 438 54911 53751 61045

-Неизвестные варианты 2 951 3 300 3 046 3 026 3 030 3250 2896 3441

- Делеции 115 134 113 116 122 123 111 103

- Инсерции 101 139 113 110 132 107 109 111

- Фреймшифт делеции 100 119 98 98 105 87 96 101

- Фреймшифт инсерции 78 100 76 68 62 69 66 71

- Нонсенс-мутации 78 99 72 85 75 87 78 61

- Миссенс-мутации 9 010 11 683 9 252 9 173 10 012 11 242 12 502 12 002

- Сайлент-мутации 9 952 13 014 10 212 10 231 9 258 12 235 11 917 9 031

- КЛ (неопределенные) 34 211 42 179 34 528 33 993 32 702 34 211 31 768 43 006

На следующем шаге исследования нами были отобраны генетические маркеры, расположенные в экзонных областях и сайтах сплайсинга. Подавляющее большинство отобранных мутаций (85%) составили изменения, приводящие к сдвигу рамки считывания или появлению преждевременного стоп-кодона. Также приоритетом стали новые мутации, обнаруженные впервые в результате данного исследования. Учитывая роль рассматриваемых генов в жизнедеятельности клетки, участие в канцерогенезе и функциональную значимость локализованных в них вариантов, были отобраны 7 новых генов-кандидатов (ЛОБЬ2, 1ТШ2, 2С3И14, 8ТХ10, СХСЯ3, ЫБЕЛЫ и ЕЛЫ83Л). Выбранные гены участвуют в контроле клеточного цикла, репарации ДНК, апоптозе, регуляции процессов клеточной инвазии, пролиферации и роста, транскрипции, а также в иммунном ответе и могут быть вовлечены в развитие рака яичников. Все выявленные варианты были подтверждены прямым секвенированием по Сэнгеру (прил. Б) (Прокофьева и др., 2016).

Результаты аннотации с помощью программы ANNOVAR отобранных для дальнейшего изучения вариантов представлены в таблице 4.

Таблица 4. Результат аннотации отобранных вероятно патогенных вариантов с помощью программы ANNOVAR.

Ген (вариант) Известный /новый Гетеро/го мозигот ность SIFT Poly Phen2 Mut Taster Mut Assessor FATHMM Raw Score CADD 6

AGBL2 (p.R161X) новый het 1 - * 1,1,A - - 9.549743 35

ITIH2 (p.Q480X) новый het 0.16 - * 1,1,A - - 12.498538 39

ZC3H14 (p.98 99del ACAG) новый het - - 18.67

STX10 (c.589delC) новый het - - - - - 3.894640 23.5

NBEAL1 (p.E1155X) rs200689887 het 0.7 L.(0,88) 1,1,A - - - 51

CXCR3 (p.Q25X) rs 188959001 het 0.15 1,0.0,N - - - 25.3

FAM83A (p.G86X) rs148011353 het 0.26 - * 1,1,A - - 5.480825 26.2

Примечания: Sift: D-disease causing; PolyPhen2: D-Probably damaging (>=0.957); P-possibly damaging (0.447<=pp2_hdiv<=0.909); MutationTaster: A-disease causing automatic; D-disease causing; MutationAssessor: H-high; M-medium; L-low; CADD: чем выше значение, тем более патогенен вариант.

Анализ варианта с.G481A гена AGBL2 в группе больных РЯ и контроле Один из генов, который был отобран в качестве потенциального гена-кандидата развития PЯ, является ген AGBL2 (ATP/GTP binding protein-like 2 gene). Протеин AGBL2 взаимодействует с белком р53, который играет важную роль в патогенезе рака яичников. Кроме того, белковый продукт данного гена вовлечен в регуляцию эпителиально-мезенхимального перехода опухолевой клетки (Zhang et al., 2014). В некоторых исследованиях показана определенная роль белка AGBL2 в клеточной пролиферации и устойчивости к химиотерапии при раке желудка, а также ассоциация высокого уровня экспрессии данного протеина с риском развития рака молочной железы (Zhang et al., 2014; Zhu et al., 2014).

В результате полного экзомного секвенирования был обнаружен ранее неизвестный вероятно патогенный нонсенс-вариант aG481A(p.R161X) в 7 экзоне гена AGBL2. По результатам анализа данного варианта с помощью алгоритмов, предсказывающих влияние изменений на структуру и функцию белка (SIFT, Mut Taster, Raw Score, CADD), была установлена его функциональная значимость и патогенность.

Нами был проведен скрининг варианта aG481A гена AGBL2 в группе больных PЯ (n=263) и контроле (n=284). В результате исследования была обнаружена лишь 1 (0,38%) носительница изучаемого варианта в гетерозиготном состоянии в группе больных раком яичников. Других носителей данного изменения не обнаружено. Носительница варианта aG481A гена AGBL2 по национальности русская. У пациентки с данным изменением установлен диагноз «двусторонняя цистаденокарцинома» III стадии с метастазами в сальник. Заболевание было диагностировано в постменопаузе.

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о низкой частоте встречаемости (0,38%) варианта с.G481A, среди больных PЯ из Pеспублики Башкортостан.

Анализ варианта c.C1438Tгена ITIH2у больных РЯ и в контрольной группе К одним из потенциальных генов-кандидатов РЯ относят ген ITIH2 (Inter-alpha-trypsin inhibitor heavy chain 2). Белковый продукт данного гена участвует в процессах воспаления и иммунного ответа, а также препятствует метастазированию опухоли и взаимодействует с такими белками как EGFR и FN1. Согласно литературным данным, при раке молочной железы наблюдается потеря экспрессии гена ITIH2 (Hamm et al., 2008). Ген ITIH2 расположен на коротком плече десятой хромосомы (10p15).

В результате полного экзомного секвенирования образцов ДНК больных НРЯ нами был впервые обнаружен вероятно патогенный нонсенс-вариант c.C1438T(p.Q480X) в 12 экзоне гена ITIH2. В результате анализа данного варианта с помощью алгоритмов, предсказывающих влияние изменений на структуру и функцию белка (SIFT, Mut Taster, Raw Score, CADD), был сделан вывод о его функциональной значимости и патогенности.

Нами установлено, что частота встречаемости данного изменения в гетерозиготном состоянии выше среди больных РЯ (1,52%) по сравнению с женщинами из контрольной группы (0,35%) Больные РЯ с вероятно патогенным вариантом C.C1438T имели разную этническую принадлежность: 2 татарки, 1 русская и 1 происходила из межэтнического брака (рис.18). У пациенток с данным изменением в постменопаузе были диагностированы опухоли гранулезоклеточного, серозного или муцинозного гистологических типов. У трех больных РЯ заболевание выявлено на III стадии, у одной - на I стадии. В группе контроля обнаружена лишь одна носительница данного изменения русского этнического происхождения.

русские

метисы

Рисунок 18. Частота варианта С.С1438Т гена 1ТШ2 у женщин разной этнической принадлежности с диагнозом рак яичников.

Впервые обнаруженный патогенный вариант С.С1438Т в гене с несколько более высокой частотой встречается среди больных раком яичников, чем в выборке здоровых доноров, однако статистически значимых различий между исследованными группами не обнаружено (р>0.05). (рис.

Рисунок 19. Частота варианта c.C1438T гена ITIH2 у больных РЯ и в контрольной группе.

Таким образом, полученные нами данные об отсутствии ассоциации варианта c.C1438T гена ITIH2 с риском развития РЯ.

Анализ варианта с.293_2960в1ЛСЛО гена ZC3H14 у больных РЯ и здоровых

индивидов

Одним из потенциальных генов-кандидатов рака яичников выступает ген ZC3H14 (Zinc finger CCCH-type containing 14/ Данный ген локализован

19).

1,5%

Больные РЯ Контроль

на длинном плече 14 хромосомы и состоит из 20 экзонов. Белок, кодируемый указанным геном, контролирует длину поли (А) хвоста, который оказывает влияние на экспрессию гена путем регуляции полиаденилирования (Kelly et al., 2014; Rha et al., 2017). Также данный белок влияет на стабильность мРНК, ядерный экспорт и трансляцию (Wigington et al., 2016). Кроме того, белок ZC3H14 задействован в процессах ацетилирования, альтернативного сплайсинга, а также имеет сайт для связывания с ионами металла. В недавнем исследовании Zhang с соавторами (2019), было показано, что снижение уровня экспрессии протеина ZC3H14 ассоциировано с неблагоприятным клиническим исходом для больных гепатоцеллюлярной карциномой. Гиперэкспрессия белка ZC3H14 в клеточных линиях гепатоцеллюлярной карциномы подавляла пролиферацию и миграцию опухолевых клеток in vitro и in vivo, что позволяет определять его в качестве нового опухолевого супрессора (Zhang et al., 2019).

В результате полного экзомного секвенирования образцов ДНК больных НРЯ нами был впервые обнаружен вероятно патогенный нонсенс-вариант a293_296delACAG (p.98_99delACAG) / ZC3H14 в гетерозиготном состоянии. Скрининг варианта a293_296delACAG в гене ZC3H14 был проведен с помощью анализа кривых плавления с высокой разрешающей способностью (HRM) у 263 больных РЯ и 284 здоровых женщин (рис. 20).

Рисунок 20. Анализ кривых плавления с высокой разрешающей способностью (HRM): а) нормированный график кривых HRM образцов без

варианта и с вариантом p.98_99delACAG гена ZC3H14. б) кривые плавления образцов в норме и с вариантом p.98_99delACAG гена ZC3H14.

В ходе исследования вариант a293_296delACAG в гене ZC3H14 был обнаружен только у одной пациентки (0,38%) в гетерозиготном состоянии, который был идентифицирован по результатам биоинформатического анализа данных. Носительница изучаемого варианта по этнической принадлежности является русской. Как показали клинические данные, пациентка имеет один из самых агрессивных типов РЯ - серозный высокой степени злокачественности с метастазами в сальник. Опухоль была обнаружена на III стадии развития в период пременопаузы. В ходе исследования дополнительных носительниц вероятно патогенного варианта a293_296delACAG в гене ZC3H14 ни в одной из изученных выборок обнаружено не было.

Анализ варианта c.589delC гена STX10 среди больных РЯ и здоровых

индивидов

Ген STX10 (Syntaxin 10), расположенный на коротком плече девятнадцатой хромосомы (19p13) считается одним из онкогенов. Данный ген относится к семейству синтаксинов и кодирует белок SNARE (soluble N-ethylmaleimide sensitive factor attachment protein receptor) (Tang et al.,1998). Белок STX10 содержит в своем составе три домена: N-концевой регуляторный домен (Habc), комплексообразующий SNARE-домен и C-концевой трансмембранный домен. Установлено, что белок STX10 способствует слиянию везикул, обеспечивая внутриклеточный транспорт белков и других компонентов клетки. В частности, будучи ассоциированным с эндосомой аппарата Гольджи, белок STX10 вовлечен в доставку рецептора маннозо 6-фосфата и транспортера глюкозы 4типа (GLUT4) (Esk et al., 2010; Ganley et al., 2008). Белковый продукт гена STX10 также взаимодействует с протеинами UBC и RAD21, которые являются важными участниками репарации ДНК. Согласно базе данных The Human Protein Atlas, в

опухолевых образцах рака яичников отмечается значительное повышение экспрессии данного гена (Yebra et al., 2018).

В результате экзомного секвенирования нами была впервые выявлена делеция c.589delC, локализованная в 7 экзоне гена STX10 и приводящая к сдвигу рамки считывания- p.L197fs. Анализ данного варианта с помощью алгоритмов, предсказывающих влияние изменений на структуру и функцию белка (Raw Score, CADD), показал его функциональную значимость и патогенность.

Скрининг варианта p.L197fs в гене STX10 выполнен с помощью анализа кривых плавления с высокой разрешающей способностью (HRM) у 263 больных РЯ и 284 здоровых женщин (рис. 21).

Рисунок 21. Анализ кривых плавления с высокой разрешающей способностью (НКМ): а) нормированный график кривых НЯМ образцов без варианта и с вариантом p.L197fs в гене БТХ10; б) кривые плавления образцов в норме и с вариантом p.L197fs в гене БТХ10.

В проведенном нами исследовании среди больных РЯ (п=263) и здоровых доноров (п=284) патогенный вариант c.589delC гена БТХ10 в гетерозиготном состоянии был идентифицирован у 3 (1,14%) пациенток и 4 (1,41%) женщин из контрольной группы. По этнической принадлежности больные РЯ с изучаемым вариантом являются русскими. Согласно клиническим данным у них в пременопаузе диагностирован серозный РЯ.

Три здоровые носительницы варианта c.589delC гена STX10 по этнической принадлежности являются русскими, одна - татаркой. У одной пациентки с изучаемым изменением также выявлен патогенный вариант с.293_296delACAG в гене ZC3H14.

Патогенный вариант c.589delC/STX10 чаще встречается в группе здоровых индивидов по сравнению с группой больных РЯ (рис. 22). Однако статистически значимых различий между исследуемыми выборками не обнаружено ф>0.05).

Больные РЯ Контроль

Рисунок 22. Частота варианта c.589delC гена STX10 у больных РЯ и в контрольной группе.

Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о низкой частоте встречаемости варианта c.589delC в гене STX10 среди женщин из Республики Башкортостан.

Анализ варианта с.G3463Tгена NBEAL1 у женщин из Республики

Башкортостан

Одним из потенциальных генов-кандидатов рака яичников выступает ген NBEAL1 (Neurobeachin like 1). Данный ген локализован на 2 хромосоме, в области q33.2 и состоит из 61 экзона. Белковый продукт гена NBEAL1 вовлечен в ряд жизненно важных процессов клетки: апоптоз, процессинг пре-мРНК и сборку цитоскелета (Chen et al., 2004; Jian et al., 2018).

В результате экзомного секвенирования образцов ДНК у одной пациентки в 24 экзоне гена NBEAL1 была обнаружена известная однонуклеотидная замена C.G3463T (rs200689887), приводящая к образованию преждевременного стоп-кодона- p.E1155X. По результатам анализа данного варианта с помощью алгоритмов, предсказывающих влияние изменений на структуру и функцию белка (SIFT, PolyPhen, Mut Taster, Raw Score, CADD), была установлена его функциональная значимость и патогенность. Данный вариант был также выявлен в недавнем исследовании у 2 больных наследственным РМЖ Glentis с соавт. (Glentis et al., 2019).

Скрининг варианта р.Е1155Х гена NBEAL1 был проведен с помощью анализа кривых плавления с высокой разрешающей способностью (HRM) у 263 больных РЯ и 284 здоровых женщин (рис. 23).

Рисунок 23. Анализ кривых плавления с высокой разрешающей способностью (НИМ): а) кривые плавления образцов в норме и с вариантом р.Е1155Х б) нормированный график кривых НИМ образцов без варианта и с вариантом р.Е1155Х;

В результате исследования вариант с^3463Т был обнаружен только у одной пациентки (0,38%) в гетерозиготном состоянии, который был идентифицирован по результатам экзомного секвенирования. Носительница исследуемого варианта русской этнической принадлежности. У пациентки с данным патогенным вариантом диагностирован серозный рак яичников

высокой степени злокачественности с метастазами в сальник. Заболевание было диагностировано на III стадии развития в пременопаузальном периоде. У пациентки с вариантом aG3463T в гене гена NBEAL1 также выявлены изменения с.293_296delACAGIZC3H14, c.589delCISTXlO и c.C73TICXCR3.

В результате исследования была обнаружена дополнительная носительница (0,35%) вероятно патогенного варианта aG3463T гена NBEAL1 в гетерозиготном состоянии среди контроля. Пациентка и женщина из контрольной группы с данным нонсенс-вариантом по этнической принадлежности русские. У больной РЯ с изменением aG3463T гена NBEAL1 также выявлены другие вероятно патогенные варианты с.293_296delACAGIZC3H14, c.589delCISTXlO и c.C73TICXCR3.

Полученные в нашей работе данные по частоте встречаемости минорного аллеля варианта с.G3463T согласуются с мировыми данными (прил. В)

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о низкой частоте встречаемости (G,38% и 0,35% среди больных РЯ и здоровых доноров) однонуклеотидной замены aG3463T гена NBEAL1, приводящей к сдвигу рамки считывания, среди больных РЯ из Республики Башкортостан.

Анализ варианта c.С73Tгена CXCR3 у больных РЯ и в контрольной группе

В результате экзомного секвенирования герминальных образцов ДНК у одной пациентки во 2 экзоне гена CXCR3 (C-X-C motif chemokine receptor 3) нами была обнаружена известная однонуклеотидная замена c.C73T (rs 188959001), приводящая к образованию преждевременного стоп-кодона -p.Q25X. По результатам анализа данного варианта с помощью алгоритмов, предсказывающих влияние изменений на структуру и функцию белка (SIFT, Mut Taster, CADD), был сделан вывод о его функциональной значимости и патогенности.

Ген CXCR3 локализован на длинном плече Х хромосомы (Xq13.1) (Loetscher et al., 1998). Белковый продукт данного гена является интерферон-

индуцибельным хемокиновым рецептором, который экспрессируется на поверхности различных типов клеток иммунной системы, и иногда опухолевыми клетками (Groom, Luster, 2011). Рецептор CXCR3 способен избирательно связываться с тремя хемокинами: CXCL9/Mig, CXCL10/IP10 и CXCL11/I-TAC, участвующими в активации интегринов, хемотаксисе и являющиеся важными регуляторами ангиогенеза, апоптоза и клеточной пролиферации (Billottet et al., 2013; Metzemaekero et al., 2017). Сверхэкспрессия данных рецепторов считается важным маркером низкой выживаемости пациентов с серозным раком яичников высокой степени злокачественности (Windmüller et al., 2017).

Скрининг варианта c.C73T в гене CXCR3 был проведен с помощью анализа кривых плавления с высокой разрешающей способностью (HRM) у 263 больных РЯ и 284 здоровых женщин (рис.24).

Рисунок 24. Анализ кривых плавления с высокой разрешающей способностью (HRM): а) нормированный график кривых HRM образцов в норме и с вариантом p.Q25X. в гене СХСЯЗ; б) кривые плавления образцов в норме и с вариантом p.Q25X в гене СХСЯЗ.

В проведенном нами исследовании среди больных РЯ (п=263) и здоровых доноров (п=284) вариант c.C73T был идентифицирован у двух пациенток (0,76%), у одной из которых изменение было выявлено в результате экзомного секвенирования. Для пациентки, у которой обнаружено изменение нуклеотидной последовательности, похожее на изучаемый нами

вариант по результатам HRM-анализа, было проведено секвенирование по Сэгеру. По результатам прямого секвенирования было установлено, что данная носительница является носителем варианта c.C73T гена CXCR3 в гетерозиготном состоянии.

По этнической принадлежности обе пациентки с изучаемым вариантом являются русскими. У больных с вариантом c.C73T/CXCR3 диагностирован серозный РЯ высокой степени злокачественности. У одной носительницы данного изменения также выявлены варианты с.293_296delACAG/ZC3H14, c.589delC/STX10 и aG3463T гена NBEAL1.

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют о низкой частоте встречаемости (0,76%) варианта c.C73T гена CXCR3 среди больных РЯ из Республики Башкортостан и согласуются с мировыми данными о распространенности минорного аллеля исследуемого варианта (прил.В).

Анализ варианта c.G256Tгена FAM83A у больных РЯ и здоровых индивидов

Ген FAM83A (Family with sequence similarity 83 member A gene) картирован на коротком плече восьмой хромосомы (8q24.13), охватывает 27 566 пар оснований и является протоонкогеном (Li et al., 2005). Белковый продукт гена FAM83A участвует в сигнальном пути рецептора эпидермального фактора роста/EGFR. Кроме того, данный протеин способствует активации сигнальных путей RAS/MAPK и PI3K/AKT/TOR (Lee et al., 2012; Cipriano et al., 2014). Согласно литературным данным, высокая экспрессия гена FAM83A отмечена при раке различной локализации, включая рак молочной железы, яичников, поджелудочной железы, печени, мочевого пузыря, толстой кишки, яичек и легких (Lee et al., 2012; Cipriano et al., 2014; Chen et al., 2017; Tomar et al., 2017; Zhang et al., 2019; Zhou et al., 2019). Установлено, что ингибирование функции протеина FAM83A в опухоли подавляет рост и выживаемость раковых клеток (Bart el et al., 2017; Zhang et al., 2019; Zhou et al., 2019).

В результате экзомного секвенирования образцов ДНК больных НРЯ у одной пациентки в первом экзоне гена FAM83A нами была обнаружена известная однонуклеотидная замена C.G256T (га148011353), приводящая к образованию преждевременного стоп кодона- p.G86X, в гетерозиготном состоянии.

В результате скрининга варианта C.G256T на расширенной выборке больных РЯ и контрольной группе нами было выявлено 5 (1,9 %) носительниц данного варианта в гетерозиготном состоянии среди пациенток и 2 (0,7%) носительницы среди здоровых индивидов. По этнической принадлежности женщины с вариантом C.G256T в гене FAM83A относятся к разным группам: русские - 50%, татары - 25%, украинцы -25% (рис. 25). У 3 пациенток манифестация заболевания произошла в постменопаузе. У данных больных диагностирован двусторонний рак яичников III стадии. У одной пациентки с изменением C.G256T в гене FAM83A, с отягощенным семейным анамнезом, также имеется мутация c.5266dupC в гене BRCA1. Случай заболевания в семье раком молочной железы и/или раком яичников установлен также у здоровой носительницы изучаемого варианта.

Рисунок 25. Частота варианта 0.О256Т гена FAM83A у женщин разной этнической принадлежности с диагнозом рак яичников.

Исследуемый вариант с несколько более высокой частотой встречается среди больных раком яичников, чем в выборке здоровых доноров (рис. 26). Однако статистически значимых различий по частоте варианта 0.О256Т /FAM83A среди исследуемых групп не обнаружено (р>0.05).

русские

1,9%

2,0%

1,0%

0,0%

Больные РЯ Контроль

Рисунок 26. Частота варианта c.G256T гена ЕЛЫ83Л у больных РЯ и в контрольной группе.

Таким образом, полученные нами результаты свидетельствуют об ассоциации варианта c.G256T в гене ЕЛЫ83Л с риском развития РЯ у женщин из Республики Башкортостан, а также согласуются с мировыми данными о распространенности минорного аллеля исследуемого варианта (прил.В).

3.3. Анализ ассоциации 22 вариантов новых генов-кандидатов с риском

Нами был проведен скрининг и анализ ассоциации 22 полиморфных локусов новых генов-кандидатов РЯ. Рассматриваемые варианты были выбраны в результате биоинформатического анализа данных экзомного секвенирования образцов ДНК больных наследственным РМЖ и РЯ, проведенного ранее коллегами из Германии (Медицинская школа, Ганновер). Продукты выбранных генов вовлечены в сигнальные пути, регулирующие жизненно-важные функции клетки: клеточный цикл, апоптоз, репарацию и иммунный ответ.

С использованием технологии Fluidigm ВюМагк™ НО нами было проведено генотипирование 24 полиморфных локусов на выборке больных РЯ из 212 человек и здоровых индивидов- 212 человек (таб.5, рис.27) .

развития рака яичников

SNP09 : rs71 71 3548, Call Rate: 99.47%, Auto Confidence: 99.90

0.9 0.8 s 0.7 < е о.б а: ■ц 0.4 ■и 0.3 0.2 0.1 О.О 0

'A

w

Ф

A &

0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 Allel® X : Allelel (SNPtype-HEX)

Рисунок 27. Графическое изображение результатов генотипирования полиморфных локусов с использованием системы Fluidigm BioMarkHD. Ось X указывает на интенсивность флуоресценции красителя HEX, ось Y - FAM. Наблюдаются четыре различных цветовых кода, 3 генотипа плюс отрицательные контроли (NTC, черные точки). В данном случае изображено распределение генотипов полиморфного локуса rs3841162 (rs71713548) гена MYCT1 в выборке больных РЯ и контроля.

Таблица 5. Представленные в исследовании полиморфные локусы ряда генов-кандидатов рака яичников

№ п/ п SNP ID Ген Полиморф ный вариант Ал лель 1 (HEX) Ал лель 2 (FAM)

1. rs112653307 USP39 c.*208G>C G C

2. rs11569144 EGF c.3406dupC, p.Gln1136fs dupC CCCCC C CCCC

3. rs119473033 SMARCAL1 c.2542G>T, p.Glu848Ter T G

4. rs138333275 BCLAF1 c.892C>T, p.Arg298Ter G A

5. rs141447363 ANKRD36 c.12delC, p.Lys5fs delC C

6. rs141733590 PHKB c.39G>A, p.Trp13Ter G A

7. rs145078765 TP53I3 c.755C>G, p.Ser252Ter G C

8. га145240281 РТР ^203801; p.Arg680Ter G A

9. ™749897324 ЛРЬР c.1528delA,p.Arg510f s delA A

10. ю150018949 ЕХ05 ^1029^30^, p.Arg344fs insG (I) D

11. ™150302537 ВЛВЛМ2 ^1088+11589 A>C C A

12. ™192005184 НЕЯС6 p.Tyr302Ter T A

13. га200026311 ВСЬЯЕ1Л c.638G>A, p.Trp213Ter T C

14. ™200435542 БЬХ1В G C

15. ™201755391 РЛРР14 &122404166 G>A G A

16. ™34275479 ЛР0ВЕС1 c.62G>A, p.Trp21Ter C T

17. ™535221714 Н4С2 c.24dupA, p.Lys9Ter dupA Л

18. ™544620282 Н4С12 c.143_144insT, p.Gly49fs insA (I) D

19. ™564635111 ЛЦМР c.780_789delTTCAC TGATT, p.Glu260fs D I

20. га3841162 МУСТ1 c.66_69delTAGA, p.Asp22fs D I

21. ™762642172 ЫЛЫОО c.914_915delT, p.Ter306Lysext Ter D I

22. ™763189487 Т8Я1 c.568C>T, p.Gln190Ter G A

23. ™768622289 ЛТР23 c.2T>A, p.Met1Lys Л Т

24. ™759217526 РЛЫСЬ c.1111_1114dupAAT T, p.Thr372fs dup AATT ЛЛТТ

После определения генотипов полиморфных локусов ^112653307,

^11569144, ^119473033, ^138333275, ^141447363, ^141733590,

г£145078765, ^145240287, ^149897324, ^150018949, ^150302537,

га192005184, ^200026311, ^200435542, ™201755397, ^34275479,

г^535221714, ^544620282, ^564635111, ^3841162, ^762642172,

га763189487, га768622289, га759217526 рассчитаны частоты аллелей в группах больных и контроля и проведен сравнительный анализ частот аллелей и генотипов между данными выборками (табл. 6, прил. Г). Полученные в нашем исследовании частоты встречаемости аллелей в целом соответствуют общемировым данным (прил. Д). Важно отметить, что подобные исследования в нашем регионе проводятся впервые.

В результате анализа контроля качества из исследования исключили полиморфные локусы га201755391 (£.122404166 о>Л) и га763189487 (%.2238179о>Л). При генотипировании данных полиморфных локусов наблюдался слабый сигнал флуоресценции в панели чипа, что в дальнейшем помешало получить достоверные результаты.

Таблица 6. Распределение частот аллелей и генотипов 22 полиморфных локусов генов-кандидатов рака яичников у больных РЯ и женщин из контрольной группы

Хро мо со ма ГО Ал лель 1 (А1) Ал лель 2 (А2) Генотипы, аллели Больные, п, (%) Кон троль, п, (%)

2 га112653307 С а оо/ос/сс 207/0/0 206/3/0

100 98,56/1,44

о/с 207 415/3

100 99,28/0,72

4 ю11569144 ёирС (ССС С) С (СССС ) СС; C/dupC; dupC/dupC 209/3/0 202/9/0

98,58/1,42 95,73/4,27

C/dupC 421/3 413/9

99,29/0,71 97,87/2,13

2 ^119473033 т а оо/от/тт 212/0/0 207/0/0

100 100

о/т 212 207

100 100

6 к138333275 А а оо/оЛ/АА 208/0/0 201/5/0

100 97,57/2,43

О/Л 208 407/5

100 98,79/1,21

2 ю141447363 delC (О) С (I) 11/1В/ВВ 162/42/5 173/31/4

77,51/20,10 / 2,39 83,17/ 14,90/1,92

1/В 366/52 377/39

87,56/12,44 90,63/9,38

16 ™141733590 A а ОО/ОЛ/АА 204/0/0 203/4/0

100 98,07/1,93

О/Л 408 410/4

100 98,10/1,90

2 к145078765 С а ОО/ОС/СС 208/0/0 203/7/0

100 96,67/3,33

О/С 208 413/7

100 98,33/1,67

12 ™145240281 А а ОО/ОЛ/АА 210/1/0 210/2/0

99,53/0,47 99,06/0,94

О/Л 421/1 422/2

99,76/0,24 99,53/0,47

2 ™149897324 delA (О) А (I) 11/1В/ВВ 205/7/0 205/3/0

96,70/3,30 98,56/1,44

1/В 417/7 413/3

98,35/1,65 99,28/0,72

1 ™150018949 1ша (I) О ВВ/В1/11 204/7/0 206/3/0

96,68/3,32 98,56/1,44

В/1 415/7 415/3

98,34/1,66 99,28/0,72

2 ™150302537 С А ЛЛ/ЛС/СС 208/4/0 205/5/0

98,11/1,89 97,62/2,38

Л/С 420/4 415/5

99,06/0,94 98,81/1,19

4 ™192005184 А Т ТТ/ТЛ/ЛЛ 203/0/0 203/6/0

100 97,13/2,87

Т/Л 203/0 412/6

100 98,56/1,44

10 га200026311 Т С СС/СТ/ТТ 211/0/0 210/0/0

100 100

С/Т 211/0 210

100 100

16 ™200435542 С а ОО/ОС/СС 207/3/0 207/4/0

98,57/1,43 98,10/1,90

О/С 417/3 418/4

99,29/0,71 99,05/0,95

12 га34275479 Т С СС/СТ/ТТ 204/1/0 207/2/0

99,51/0,49 99,04/0,96

С/Т 409/1 416/2

99,76/0,24 99,52/0,48

6 ™535221714 ёирЛ( I) А(В) ВБ/Ы/И 209/2/0 208/1/0

99,05/0,95 99,52/0,48

Э/1 420/2 417/1

99,53/0,47 99,76/0,24

6 ™544620282 шбл (I) В ВВ/В1/11 200/4/0 186/3/0

98,04/1,96 98,41/1,59

В/1 404/4 375/3

99,02/0,98 99,21/0,79

1 ю564635111 В I 11/1В/ВВ 200/1/1 191/7/0

99,00/0,50/ 0,50 96,46/3,54

1/В 401/2 389/7

99,50/0,50 98,23/1,77

6 га3841162 В I 11/1В/ВВ 191/21/0 194/11/1

90,09/9,91 94,17/5,34/0,4 9

1/В 403/21 399/13

95,05/4,95 96,85/3,15

12 ю762642172 В I 11/1В/ВВ 197/13/0 190/20/0

93,81/6,19 90,48/9,52

1/В 407/13 400/20

96,90/3,10 95,24/4,76

12 ™768622289 А т ТТ/ТА/АА 192/0/0 169/0/0

100 100

Т/А 192/0 169

100 100

2 ™759217526 ёирЛ ЛТТ ААТТ ААТТ/ ААТТ; ААТТШр ААТТ; dup ААТТ/ dup ААТТ 209/2/0 206/2/0

99,05/0,95 99,04/0,96

ААТТ/ dup ААТТ 420/2 414/2

99,53/0,47 99,42/0,48

Аллель 1 (А1)-редкий аллель; аллель 2 (А2)-частый аллель

Скрининг полиморфного локуса rs112653307 гена USP39 у больных РЯ и

здоровых индивидов Ген USP39 (Ubiquitin Specific Peptidase 39) кодирует убиквитин-специфическую пептидазу, которая является одним из членов цистеиновых протеаз семейства USP. Белок USP39 является важным фактором сплайсинга, а также вовлечен в контроль клеточного цикла и цитокинеза. Предыдущие исследования показали, что USP39 сверхэкспрессируется при различных типах рака, включая гепатоцеллюлярную карциному, рак желудка, молочной железы, яичников и индуцирует апоптоз в опухолевых клетках (Wang et al., 2013; Xing et al., 2018; Xu et al., 2018; Yan et al., 2019).

Недавно было выяснено, что деубиквитиназа USP39 может служить регулятором белка CHEK2, который играет важную роль в восприимчивости к раку молочной железы и раку яичников. Нокдаун USP39 приводит к нарушению регуляции гена CHEK2 и индуцирует остановку фазы G2 / M клеточного цикла, вследствие чего происходит угнетение апоптоза и приобретение опухолевыми клетками устойчивости к химиотерапии (Wu et al., 2019). Аналогичные результаты были получены Yan с соавторами (2019) при изучении роли деубиквитиназы USP39 в канцерогенезе яичников. Авторами исследования был сделан вывод о том, что остановка клеточного цикла, вызванная нокдауном USP39, может быть вовлечена в сигнальный путь p53/p21. Кроме того, было установлено, что истощение USP39 ингибирует миграцию клеток рака яичников посредством блокирования эпителиально-мезенхимального перехода (Yan et al., 2019).

Полиморфный локус rs112653307 (c.*208G>C) гена USP39 ведет к нарушению сплайсинга мРНК в 3'-нетранслируемой области (3'-UTR) данного гена, которая содержит ряд регуляторных элементов (Cui et al., 2013; Wang et al., 2014; Fujiwara et al., 2014). В недавнем исследовании Kuligina с соавторами (2020) была выявлена ассоциация данного варианта с риском развития рака молочной железы (Kuligina et al., 2020).

В проведенном нами исследовании среди больных РЯ и контрольной группы полиморфный локус rs112653307 гена USP39 был идентифицирован у трех здоровых индивидов (1,44 %) в гетерозиготном состоянии (табл. 6). По этническому происхождению 2 носительницы исследуемого варианта являются русскими, одна татаркой.

Скрининг полиморфного локуса rs11569144 гена EGFу больных РЯ и

здоровых индивидов

Ген EGF (Epidermal Growth Factor) кодирует белок из суперсемейства эпидермального фактора роста. Эпидермальный фактор роста был первым ростовым фактором, обнаруженным еще в 1962г. и до сих пор рассматривается как классический представитель данных биологически активных веществ. Он состоит из 53 аминокислот, соединенных тремя дисульфидными связями, имеет молекулярный вес 6 кДа. Данный белок действует как мощный митогенный фактор, который играет важную роль в росте, пролиферации и дифференцировке многочисленных типов клеток (Herbst, 2004). Нарушение регуляции гена EGF ассоциировано с ростом и прогрессированием некоторых видов рака (Li et al., 2019). Эпидермальный фактор роста является одним из лигандов, участвующих в сигнальном пути ErbB, который изучается для использования в таргетной терапии рака яичников (Miyata et al., 2017).

Полиморфный локус rs11569144 гена EGF, расположенный в позиции c.3406 кДНК, приводит к сдвигу рамки считывания-p.Gln1136fs.

В результате скрининга варианта rs11569144 гена EGF в группе больных РЯ и здоровых женщин нами было выявлено 3 (1,42%) носительницы данного варианта в гетерозиготном состоянии среди пациенток и 9 (4,27%) носительниц среди здоровых доноров. Исследуемый вариант с несколько более высокой частотой встречается среди больных раком яичников, чем в выборке здоровых доноров (рис. 28). Однако

статистически значимых различий по частоте варианта ^11569144/ЕОЕ среди исследуемых групп не обнаружено (р>0.05).

4,27%

Больные РЯ Контроль

Рисунок 28. Частота варианта rs11569144 гена EGF у больных РЯ и в контрольной группе.

По этнической принадлежности женщины с вариантом rs11569144 относятся к разным группам: татары - 40%, башкиры - 30%, русские-20% и узбечки -10%.

Скрининг полиморфного локуса rs119473033 гена SMARCAL1 у больных РЯ и

здоровых доноров

Ген SMARCAL1 (SWI/SNF Related, Matrix Associated, Actin Dependent Regulator Of Chromatin, Subfamily A Like 1) кодирует ATP-зависимую геликазу из подсемейства А актин-зависимых регуляторов хроматина SWI/SNF, который активно взаимодействует с генами, кодирующими комплекс RAP и комплекс протеинкиназ ATR-ATRIP. Данный комплекс участвует в репликации, репарации, рекомбинации, поддержании длины теломер и координации клеточного ответа на повреждения ДНК и таким образом играет важную роль в метаболизме ДНК (Bansbach et al., 2010; Liaw et al., 2011; Daniels et al., 2012).

Белок SMARCAL1 состоит из 954 аминокислот, и содержит на своем N-конце домен, необходимый для взаимодействия с репликационным белком A (RPA), за которым следуют два домена HARP (HepA-related protein). Две части разделенного АТФ-азного домена находятся на С-конце белка (рис. 29). SMARCAL1 функционирует как ДНК-зависимая АТФаза, которая транслоцируется на ДНК (Coleman et al., 2000; Yusufzai and Kadonaga, 2008).

RBD

SMARCAL1 I

HARP1 HARP2

1 |ATPase_N ATPase_C

■ ATPase H Substrate Recoqnition Ш Protein Interaction Рисунок 29. Доменные структуры белка SMARCAL1(Poole et al., 2017).

Однонуклеотидная замена гуанина на тимин в позиции 2542 кДНК в 17 экзоне гена SMARCAL1 (rs119473033) приводит к формированию преждевременного стоп-кодона- p.Glu848Ter. По данным ClinVar, вариант считается патогенным. Согласно литературным данным, данная замена ассоциирована с иммунокостной дисплазией (синдром Шимке) (Santangelo et al., 2014).

В результате поиска варианта p.Glu848Ter гена SMARCAL1 в выборках больных РЯ и здоровых доноров из Республики Башкортостан нами не обнаружено носителей данного изменения.

Скрининг полиморфного локуса rs138333275 гена BCLAF1 у больных РЯ и

здоровых индивидов Ген BCLAF1 (BCL2 associated transcription factor 1) локализованный на длинном плече 6 хромосомы (6q23.3), кодирует транскрипционный репрессор, который взаимодействует с несколькими членами семейства белков BCL2 (B-cell lymphoma 2) (Kasof et al., 1998; Cuconati, White, 2002). Установлено, что белковый продукт данного гена участвует в различных биологических процессах, включая активацию Т-клеток, развитие легких,

повреждение и восстановление ДНК, а также в сплайсинге пре-мРНК и процессинге мРНК (McPherson et al., 2009; Sarras et al., 2010; Varia et al., 2013; Savage et al., 2014; Shao et al., 2016; Vohhodina et al., 2017). Характерными особенностями структуры белка BCLAF1 являются ДНК-связывающие домены bZIP и Myb, которые необходимы для его функционирования при регуляции транскрипции (Sarras et al., 2010). Хотя большинство исследований показывают, что BCLAF1 является опухолевым супрессором, в ряде недавних работ было установлено, что белок BCLAF1 регулирует ангиогенез и онкогенный потенциал опухолевых клеток (Kasof et al., 1998; Zhou et al., 2014; Wen et al., 2019).

Однонуклеотидная замена цитозина на тимин в положении 892 кДНК гена BCLAF1 (rs138333275) приводит к замене аргинина на стоп-кодон -p.Arg298Ter. В проведенном нами исследовании среди больных РЯ и контрольной группы полиморфный локус rs138333275 гена BCLAF1 был идентифицирован у 5 здоровых индивидов (2,43%) в гетерозиготном состоянии. Две из них русской, три-татарской этнической принадлежности.

Скрининг полиморфного локуса rs141447363 гена ANKRD36 в группе больных

раком яичников и здоровых доноров Ген ANKRD36 (Ankyrin repeat domain 36) локализован на длинном плече 2 хромосомы (2q11.2) и кодирует белок, состоящий из 1941 аминокислоты (www.genecards.org). Белковый продукт данного гена может взаимодействовать с геном GAPDH fGlyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase), который участвует в регуляции углеводного обмена. Так, в работе Fang с соавторами (2018) было установлено повышение уровня циркулирующей микроРНК ANKRD36 в лейкоцитах периферической крови, которая коррелировала с хроническим воспалением при сахарном диабете 2 типа (Fang et al., 2018).

Делеция цитозина в позиции 12 кДНК гена ANKRD36 (rs141447363) приводит к свдигу рамки считывания- p.Lys5fs. В результате сравнительного

анализа распределения частот аллелей и генотипов полиморфного локуса га141447363 гена ЛЫККОЗб в выборке больных РЯ и здоровых индивидов было выявлено, что гетерозиготный генотип т8141447363*С/йв\С встречается чаще среди больных РЯ (20,10%), по сравнению с женщинами из контрольной группы (14,90%). Частота встречаемости гомозиготного генотипа по минорному аллелю т8141447363*йеЮйе1С в группе пациентов и здоровых индивидов отличалась незначительно, 2,39% и 1,92% соответственно (рис.30). Однако выявленные различия между исследуемыми группами не достигли уровня статистической значимости (р>0,05).

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

Рисунок 30. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного локуса rs141447363 гена ANKRD36 в группе больных раком яичников и контрольной группе

Скрининг полиморфного локуса rs141733590 гена PHKB в группе больных РЯ

и контрольной группе Ген PHKB (Glycogen phosphorylase kinase P-subunit) локализованный на длинном плече 16 хромосомы (16q12.1), кодирует бета-субъединицу фосфорилазной киназы, участвующей в активации гликогенфосфорилазы и регуляции распада гликогена. Фосфорилазная киназа (PHK) представляет собой гексадекамерный комплекс, состоящий из субъединиц а, в, у и 5. Среди них а, в и 5 являются регуляторными субъединицами, а у -

каталитической субъединицей, которая отвечает за ферментативную активацию (Nadeau et al., 2012). Установлено, что фосфорилирование PHKB активирует PHKG (Phosphorylase kinase catalytic subunit gamma), что приводит к активации комплексов PHK и дальнейшей стимуляции функции гликогенфосфорилазы (Terashima et al., 2014).

Согласно последним литературным данным, киназа PHKB также может играть роль в развитии опухоли. Так, в работе Yang с соавторами (2019) было показано, что экспрессия белка PHKB значительно снижается в тканях гепатоцеллюлярной карциномы, что может служить независимым индикатором плохого прогноза при данном типе опухоли. При этом, нокдаун гена PHKB значительно стимулировал пролиферацию опухолевых клеток как in vitro, так и in vivo, тогда как его избыточная экспрессия приводила к противоположным эффектам. ^оме того, in vitro анализы показали, что чрезмерная экспрессия протеина PHKB сильно затрудняет инвазию опухолевых клеток и увеличивает скорость апоптоза, а также эффективно подавляет эпителиально-мезенхимальный переход (Yang et al., 2019).

Установлено, что замена гуанина на аденин в позиции 39 ^HK гена PHKB (rs141733590) приводит к преждевременной остановке трансляции и синтезу укороченного белка- p.Trp13Ter.

В результате скрининга полиморфного локуса rs141733590 гена PHKB среди больных РЯ и контрольной группы были обнаружены 4 (1,93%) носительницы данного варианта в контрольной группе в гетерозиготном состоянии. Женщины с вариантом rs141733590 гена PHKB русской и татарской этнической принадлежности (по 50%).

Скрининг полиморфного локуса rs145078765 гена TP53I3 в группе больных РЯ и контрольной группе Ген TP53I3 (Tumor protein p53 inducible protein 3) локализован на коротком плече 2 хромосомы (2p23.3). Продукт, кодируемый данным геном, является оксидоредуктазоподобным белком, вовлеченным в клеточный ответ

на оксидативный стресс (Contente et al., 2002). Ген TP53I3 транскрипционно индуцируется опухолевым супрессором p53 и вовлечен в p53-опосредованную клеточную гибель (Voltan et al., 2014). Он содержит консенсусный сайт связывания р53 в своей промоторной области и пентануклеотидную микросателлитную последовательность. Было показано, что р53 транскрипционно активирует ген TP53I3, взаимодействуя с пентануклеотидной микросателлитной последовательностью.

Предполагается, что микросателлитный полиморфизм может быть связан с дифференциальной предрасположенностью к раку.

В недавнем исследовании Lopes с соатворами (2019) было показано, что потеря функции TP53I3 приводит к умеренному снижению эффективности репарации путем гомологичной рекомбинации, а также повышению чувствительности клеток к цисплатину, что дает возможность предположить, что данный ген может действовать как супрессор опухолей, подобно генам BRCA1/2 (Lopes et al., 2019).

Замена гуанина на цитозин в положении 755 кДНК гена TP53I3 (rs 145078765) приводит к появлению преждевременного стоп-кодона и синтезу укороченного белка- p.Ser252Ter.

В проведенном нами исследовании среди больных РЯ и контрольной группы полиморфный локус rs145078765 гена TP53I3 был идентифицирован у 7 здоровых индивидов (3,33%) в гетерозиготном состоянии. При этом, 5 из них татарской, 2 русской этнической принадлежности.

Скрининг полиморфного локуса rs145240281 гена PZP в группе больных РЯ и контроле PZP (Pregnancy zone protein) представляет собой высокомолекулярный гликопротеин, повышение уровня которого впервые было отмечено в сыворотке крови женщин во время беременности (Smithies, 1959). Протеин PZP является иммунодепрессантом широкого спектра действия с антипротеиназной активностью (Wyatt et al., 2016). Считается, что его роль в

беременности заключается в подавлении клеточной иммунореактивности для предотвращения отторжения плода (Stimson et al, 1976; Skornicka et al., 2004). Установлено, что PZP подавляет иммунореактивность Т-лимфоцитов, рекрутирование Т-клеток, миграцию, пролиферацию и продукцию IL-2 (Wyatt et al., 2016). Недавно белок PZP был описан в качестве нового биомаркера гепатоцеллюлярной карциномы (Zheng et al., 2018).

Вариант rs145240281 (p.Arg680Ter) в гене PZP, приводящий к потере его функции, ранее был идентифицирован по результатам полноэкзомного секвенирования у женщин больных РМЖ с отягощенным семейным анамнезом из Бразилии (Thompson et al., 2012; Torrezan et al., 2018). Однако при проведении репликативного исследования Kuligina с соавторами у российских пациентов с раком молочной железы значимой ассоциации данного варианта с заболеванием не выявлено (Kuligina et al., 2020).

В результате скрининга полиморфного локуса rs 145240281 гена PZP среди больных РЯ и контрольной группы была обнаружена 1 (0,47%) носительница данного варианта в группе пациенток и 2 (0,94%) носительницы в контрольной группе в гетерозиготном состоянии. Однако выявленные различия между исследуемыми группами не достигли уровня статистической значимости (p>0,05). Носительница исследуемого варианта больная РЯ русской этнической принадлежности. Заболевание было диагностировано на III стадии развития в посатменопаузальном возрасте. Женщины из контрольной группы с вариантом rs 145240281 гена PZP русской и татарской энтической принадлежности.

Скрининг полиморфного локуса rs149897324 гена APLF в группе больных РЯ

и в контрольной группе Ген APLF (Aprataxin PNK-like factor), локализованный на коротком плече 2 хромосомы (2p13.3), кодирует нуклеазу, которая взаимодействует с белками XRCC1 и XRCC4 (X-ray repair cross-complementing protein 1, 4) и таким образом, участвует в восстановлении однонитевых и двунитевых

разрывов ДНК. Iles с соавторами было показано, что FHA-домен APLF взаимодействует с XRCC1 и оба белка колокализуются в клетке в местах индуцированного УФ-повреждения (Iles et al., 2007). В исследовании Syed с соавторами было показано, что подавление экспресии белка APLF может усиливать мезенхимально-эпителиальный переход (МЭП), связанный с перепрограммированием клеток эмбриональных фибробластов мыши. Таким образом, APLF может вызвать явление, обратное эпителиально-мезенхимальному переходу (ЭМП) (Syed et al., 2016). Установлено, что снижение уровня экспрессии APLF препятствует инвазивному, миграционному, онкогенному и метастатическому потенциалу клеток тройного негативного рака молочной железы с потерей экспрессии генов, связанных с ЭМП, при усилении регуляции МЭП-специфического гена Е-кадгерина (CDH1) (Majumder et al., 2018).

Делеция аденина в позиции 1528 кДНК гена APLF (rs149897324) приводит к сдвигу рамки считывания, и, следовательно, к синтезу дефектного белка- p.Arg510fs.

В проведенном нами исследовании среди больных РЯ и контрольной группы вариант c.1528delA гена APLF был обнаружен у 7 (3,30%) пациенток и 3 здоровых индивидов (1,44%) в гетерозиготном состоянии. Однако статистически значимых различий по частоте варианта rs 149897324/APLF среди исследуемых групп не обнаружено (p>0.05). Носительницы данного варианта являются представительницами разных этнических групп.

Скрининг полиморфного локуса rs150018949 гена EXO5 у больных раком

яичников и в контрольной группе Ген EXO5 (Exonuclease 5) картирован на коротком плече 1 хромосомы (1p34.2) и кодирует экзонуклеазу, обладающей 3'-5'-дезоксирибонуклеазной активностью. Согласно данным литературы, белковый продукт данного гена участвует в репарации ДНК после ультрафиолетового облучения и повреждения поперечных связей (Sparks et al., 2012).

Вариант c.1029_1030insG в гене EXO5 (rs 150018949), приводящий к сдвигу рамки считывания и синтезу дефектного белка - p.Arg344fs, был идентифицирован по результатам полного экзомного секвенирования у испанцев, больных раком яичек с отягощенным семейным анамнезом. С использованием алгоритмов, предсказывающих влияние данного генетического варианта на структуру и функцию белка, авторами исследования был сделан вывод о его высокой патогенности (P hred = 28,3). В дальнейшем был проведен поиск данного варианта на расширенной выборке пациентов и здоровых индивидов, по результатам которой была выявлена ассоциация полиморфного локуса rs 150018949 с умеренным риском развития рака яичек (Paumard-Hernandez et al., 2018).

Поиск варианта rs150018949/EX05 у женщин нашего региона выявил 7 (3,32%) носительниц среди пациенток и 3 (1,44%) среди здоровых индивидов. Однако статистически значимых различий по частоте встречаемости данного варианта между исследуемыми группами не обнаружено (p>0,05).

Скрининг полиморфного локуса rs150302537 в гене BABAM2 у женщин из

Республики Башкортостан

Ген BABAM2 (BRISC and BRCA1 A complex member 2, BRE), картированный на коротком плече 2 хромосомы (2p23.2), кодирует антиапоптотический белок, ассоциированный с Fas-рецептором, который взаимодействует с рецептором-1 фактора некроза опухоли. Белок BABAM2 являетя участником ряда протеиновых комплексов, включая BRCA1-A и BRISC. Комплекс BRCA1-A обладает убиквитиназной активностью и нацеливается на сайты двунитевых разрывов ДНК, тогда как мультипротеиновый BRISC-комплекс (изопептидазный комплекс BRCC36) проявляет деубиквитиназную активность и участвует в сборке митотического веретена деления (Dong et al., 2003; Cooper et al., 2009). Взаимодействие белка BABAM2 с MERIT40 необходимо для поддержания целостности

комплекса BRCA1-A (Feng et al., 2009). Взаимодействие BABAM2 и BRCC36 также важно для лигазной активности гетеродимера E3BRCA1 - BARD1 и деубиквитиназной активности BRCC36 (Dong et al., 2003; Sobhian et al., 2007). Нокдаун BABAM2 нарушает формирование очагов гена BRCA1 в местах повреждения ДНК и, таким образом, играет важную роль в восстановлении ДНК (Dong et al., 2009). В то же время выявлено, что сверхэкспрессия BABAM2 снижает внутренний апоптический ответ, вызванный стрессовыми и генотоксическими стимулами (Engels et al., 2000). Таким образом, благодаря своей антиапоптотической активности, гиперэкспрессия BABAM2 может способствовать выживаемости опухолевых клеток.

Замена аденина на цитозин в позиции c.1088+11589 согласно кДНК гена BABAM2 (rs150302537) является вариантом сплайсинга, который изменяет вторую базовую область на 3'-конце интрона. При поиске данного варианта у женщин нашего региона было выявлено 4 (1,89%) носительниц среди больных РЯ и 5(2,38%) среди здоровых доноров в гетерозиготном состоянии. Однако выявленные различия между исследуемыми группами не достигли уровня статистической значимости (p>0,05).

Скрининг полиморфного локуса rs192005184 гена HERC6 в группе больных

РЯ и в контрольной группе Ген HERC6 (HECT and RLD domain containing E3 ubiquitin protein ligase family member 6) картирован на длинном плече 4 хромосомы и кодирует одноименный белок, принадлежащий к семейству убиквитинлигаз HERC. Данное семейство белков характеризуется наличием домена HECT и одного или нескольких RCC1-подобных доменов. Предполагается, что 350-аминокислотный домен HECT катализирует образование тиоэфира с убиквитином перед переносом его на субстрат, а RLD действует как фактор обмена гуаниновых нуклеотидов для малых G-белков. Убиквитинирование белков вовлечено во многие клеточные процессы, включая деградацию

белка, интернализацию и транспорт рецепторов, передачу сигнала, клеточный цикл, апоптоз и репарацию ДНК (Hochrainer et al., 2005).

Однонуклетидная замена тимина на аденин в позиции 906 кДНК гена HERC6 (rs 192005184) приводит к формированию преждевременного стоп-кодона и синтезу укороченного белка- p.Tyr302Ter. В проведенном нами исследовании данный вариант был выявлен у 6 (2,87%) здоровых доноров.

Скрининг полиморфного локуса rs200026311 гена DCLRE1A в группе больных

РЯ и здоровых индивидов Ген DCLRE1A (DNA cross-link repair 1A), локализованный на длинном плече 10 хромосомы (10q25.3), кодирует консервативный белок, который участвует в восстановлении межцепочечных поперечных связей ДНК (Dronkert et al., 2000). Перекрестные связи между нитями ДНК предотвращают разделение цепей, тем самым физически блокируя транскрипцию, репликацию и сегрегацию ДНК. Восстановление сшивки ДНК необходимо для поддержания стабильности генома и позволяет клеткам пережить повреждение ДНК, снижая риск злокачественной трансформации клеток (Ahkter et al., 2005). Однако высокая эффективность репарации поперечных связей ДНК также может способствовать чрезмерной пролиферации клеток, стимулируя инициацию и прогрессирование опухоли (van Gent, Kanaar, 2016). В ряде работ сообщалось о связи гена DCLRE1A с риском развития различных форм онкопатологий (Frias et al., 2008; Zhang et al., 2014; Shahi et al., 2019).

Однонуклеотидная замена c.638G>A на трансляционном уровне приводит к замене триптофана на стоп-кодон, что влечет за собой формирование укороченного белкового продукта-p.Trp213Ter.

В результате проведенных нами исследований носительницы варианта c.638G>A гена DCLRE1A не обнаружены как среди больных РЯ, так и среди женщин из контрольной группы.

Скрининг полиморфного локуса rs200435542 гена SLX1B у женщин из Республики Башкортостан Ген SLX1B (Structure-specific endonuclease subunit homolog B) картированный на коротком плече 16 хромосомы, кодирует белок, который является важным регулятором стабильности генома. Белковый продукт данного гена представляет собой каталитическую субъединицу структурно-специфической эндонуклеазы SLX1-SLX4, которая может разделять вторичные структуры ДНК, образующиеся в процессе репарации и рекомбинации. Альтернативный сплайсинг приводит к нескольким вариантам транскрипции. Комплекс SLX1-SLX4, по-видимому, является альтернативным путем поддержания стабильности генома (Bastin-Shanower et al., 2003).

Замена гуанина на цитозин в позиции 711-1 согласно кДНК гена гена SLX1B (rs200435542) приводит к изменению сайта сплайсинга.

В результате поиска варианта rs200435542 гена SLX1B в выборке больных РЯ и контрольной группе нами было выявлено 3 (1,43%) носительницы данного варианта в гетерозиготном состоянии среди пациенток и 4 (1,90%) носительницы среди здоровых доноров. Однако выявленные различия между исследуемыми группами не достигли уровня статистической значимости (p>0,05).

Скрининг полиморфного локуса rs34275479 гена APOBEC1 в группе больных РЯ и здоровых доноров Ген APOBEC1(Apolipoprotein B mRNA editing enzyme catalytic subunit 1), локализованный на коротком плече 12 хромосомы (12p13.31), кодирует белок из семейства цитозин-деаминаз APOBEC. Белковый продукт данного гена состоит из 236 аминокислот и вместе A1CF (Apobec1 complementation coefficient) образует мультиплексный холофермент для редактирования РНК путем дезаминирования цитидина в уридин (C-to-U), которое впервые было описано как молекулярный механизм, лежащий в основе тканеспецифичной