Молекулярно-генетическое исследование рака желудка тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.07, кандидат наук Галлямова Лилия Фанилевна

• Галлямова Лилия Фанилевна
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Галлямова Лилия Фанилевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Факторы риска, патогенез и классификация рака желудка

1.2. Молекулярно-генетические исследования рака желудка

1.2.1. Наследственные формы рака желудка

1.2.2. Ассоциация генов-кандидатов, белковые продукты которых участвуют в патогенезе опухолеобразования, с риском развития рака желудка

1.2.3. Полногеномный анализ ассоциаций (GWAS) при раке желудка

1.2.4. Использование NGS в молекулярно-генетических исследованиях рака желудка

1.2.5. Эпигенетические факторы развития рака желудка

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы исследования

2.2. Методы исследования

2.2.1. Выделение геномной ДНК из периферической крови

2.2.2. Полимеразная цепная реакция синтеза ДНК

2.2.3. Рестрикционный анализ

2.2.4. Электрофорез ДНК

2.2.5. Метод дискриминации аллелей TaqMan (Gene Expression Assay)

2.2.6. Анализ конформационного полиморфизма однонитевой ДНК (SSCP)

2.2.7. Анализ кривых плавления с высокой разрешающей способностью (HRM)

2.2.8. Аллель-специфичная ПЦР

2.2.9. Секвенирование ДНК по Сэнгеру

2.2.10. Полное экзомное секвенирование

2.2.11. Статистическая обработка полученных результатов

2.2.12. Дизайн исследования

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов цитокинов и их рецепторов с раком желудка в Республике Башкортостан

3.1.1. Анализ ассоциации полиморфных вариантов rs1143634 и rs16944 гена ILlß и VNTR-полиморфизма rs2234663 гена IL1RN с раком желудка

3.1.2. Анализ ассоциации полиморфных вариантов rs4073 гена IL8 с раком желудка

3.1.3. Анализ ассоциации полиморфных вариантов rs1800872 гена IL10 с раком желудка

3.2. Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов с раком желудка в Республике Башкортостан

3.2.1. Анализ ассоциации полиморфных вариантов rs1799750 и rs494379 гена MMP1 с раком желудка

3.2.2. Анализ ассоциации полиморфных вариантов rs2285053 гена MMP2 с раком желудка

3.2.3. Анализ ассоциации полиморфных вариантов rs3025058 гена MMP3 с раком желудка

3.2.4. Анализ ассоциации полиморфных вариантов rs3918242 и rs17576 гена MMP9 с раком желудка

3.2.5. Анализ ассоциации полиморфных вариантов rs2276109 гена MMP12 с раком желудка

3.2.6. Анализ ассоциации полиморфных вариантов rs8179090 гена TIMP2 с раком желудка

3.2.7. Анализ ассоциации полиморфных вариантов rs9619311 гена TIMP3 с раком желудка

3.3. Анализ ассоциации сочетаний аллелей и генотипов исследованных полиморфных локусов генов цитокинов и их рецепторов и генов матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов с раком желудка

3.4. Анализ ассоциации инсерционно-делеционного полиморфного варианта гена PGC с раком желудка в Республике Башкортостан

3.5. Анализ ассоциации полиморфных вариантов rs!042522 гена TP53 с раком

желудка в Республике Башкортостан

3.6. Анализ ассоциации полиморфных вариантов rs16260 гена CDH1 с раком желудка в Республике Башкортостан

3.7. Поиск молекулярно-генетических изменений в гене CDH1

3.8. Полное экзомное секвенирование образцов ДНК больных раком желудка

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение А

Приложение Б

Приложение В

Приложение Г

Приложение Д

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-генетическое исследование рака желудка»

ВВЕДЕНИЕ Актуальность темы исследования

Онкологические заболевания представляют глобальную угрозу для здоровья населения. У десятков миллионов жителей нашей планеты ежегодно диагностируется рак, при этом более половины из них умирает от этой болезни (http://globocan.iarc.fr). Проблема онкологических заболеваний остается приоритетной для современного общества. Исследователи стремятся понять причины возникновения рака, найти новые способы его профилактики и лечения (Юсупова и др., 2019).

Рак желудка (РЖ) входит в число лидирующих причин смерти от онкологических заболеваний в мире (http://globocan.iarc.fr). В Российской Федерации рак данной локализации занимает шестое место среди всех злокачественных опухолей по заболеваемости и второе - по смертности. В 2018 году выявлен 36 941 новый случай РЖ. Заболеваемость составила 25,16 на 100 000 населения и заняла 6 место (5,9%) в структуре онкозаболеваний. Смертность достигла уровня 19,42 на 100 000 населения (9,5%), что соответствует 2-му месту среди мужчин (10,4%) и 3-му - среди женщин (8,4%) (Каприн и др., 2019). В Республике Башкортостан также наблюдаются высокие показатели заболеваемости и смертности от РЖ. В 2017 году в структуре смертности от злокачественных новообразований населения Республики Башкортостан опухоли желудка заняли 2-ое место (10,5% или 703 случая) (http://02.rospotrebnadzor.ru/ content/228/37374/). Поскольку смертность от рака желудка остается на очень высоком уровне, это диктует необходимость разработки новых концепций диагностики, прогноза течения и лечения болезни (Юсупова и др., 2018).

Злокачественные новообразования желудка имеют многофакторную этиологию, значительные различия в показателях заболеваемости РЖ по регионам мира свидетельствуют о влиянии на его возникновение климатогеографических и культурно-бытовых условий, характера питания населения и других факторов

окружающей среды. Кроме этого, большой вклад в патогенез злокачественных новообразований желудка вносят инфекция Helicobacter pylori (H. pylori), генетический статус и диетические факторы (Галлямова и др., 2016).

РЖ представляет собой пример новообразования, вызываемого особенностями стиля жизни. Для индивидов, имеющих генетическую предрасположенность к развитию злокачественных новообразований желудка, показано проведение профилактических мероприятий, направленных на снижение влияния средовых факторов. Мероприятия, направленные на снижение степени влияния этих факторов позволяют отсрочить время наступления заболевания или даже исключить его возникновение (Юсупова и др., 2018).

Трансформация клеток в раковые и прогрессия онкологического процесса связаны с накоплением генетических и эпигенетических изменений в геноме, возникающих в результате нарушения нормального его функционирования (Egger et al., 2004).

Существуют семьи, в которых есть очевидная наследуемость риска развития РЖ (Юсупова и др., 2018). Молекулярной причиной предрасположенности к злокачественным новообразованиям желудка с высоким риском (70-83%) являются наследуемые мутации в ряде генов, к основным из них относятся гены CDH1, TP53, MLH1, MSH2 и другие (Baniak et al., 2016). Однако лишь небольшая часть аденокарцином желудка возникает в рамках явной наследственной предрасположенности, только около 5-10% больных имеют отягощенный семейный анамнез, в большинстве же случаев встречается спорадический РЖ. В связи с этим для поиска причин возникновения и развития злокачественных новообразований рассматриваются и другие гены, молекулярные события в которых могут стать ключевым фактором в малигнизации клеток (Юсупова и др., 2019).

Степень разработанности темы исследования

Исследование генетических основ канцерогенеза желудка проводится большим количеством ученых по всему миру, но, несмотря на это, в понимании молекулярного патогенеза заболевания остается много невыясненных моментов.

Большой материал при изучении РЖ накоплен учеными разных стран благодаря применению современных технологий полногеномного анализа ассоциаций (GWAS) и секвенирования нового поколения (NGS), в ходе которых определены новые гены-кандидаты PRKAA1, MUC1, APE1, DNMT1, ERCC5, GSTT1, MDM2, PPARG, TLR4, IL-17F, CASP8, ARID1A, FAT4, PIK3CA, KMT2C, SMARCA4, CTNNB1, NUP214, APC, PRDM16, SMAD4, DBX3, MYH9, AFF3, MACF1, CDC27, HMCN1, PDZD2, ассоциированные с риском возникновения злокачественных новообразований желудка в различных популяциях мира (Wang et al., 2011; Zang et al., 2012; Hu et al., 2016; Cho еt а1, 2018; Tian et al., 2019; Lee et al., 2019; Chen et al., 2019).

Обзор литературы последних десяти лет показывает, что в механизмах патогенеза РЖ большая роль учеными отводится также генам цитокинов и их рецепторов, матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов, генам пищеварительных ферментов и т. д. (Gabay et al., 2009; Kumar et al., 2016; Raza et al., 2017; Yang et al., 2017; Hu et al., 2018; Martínez-Campos et al., 2019).

Таким образом, в настоящее время в результате изучения молекулярных механизмов развития РЖ определены локусы, значимые для развития данного заболевания в европейских и азиатских популяциях. Однако, многие полученные на сегодняшний день результаты весьма противоречивы, этиопатогенетические основы формирования заболевания в различных популяциях на данный момент изучены недостаточно, в связи с этим необходимым становится проведение репликативных исследований в различных популяционных выборках для валидации выявленных ранее генетических предикторов РЖ (Юсупова и др., 2018).

Поиск новых генов и анализ ассоциации полиморфных вариантов этих генов с развитием злокачественных новообразований желудка в различных этнических группах призваны расширить знания и углубить понимание генетической структуры изучаемой патологии. В этой связи привлекательными методами для поиска новых генов, вовлеченных в патогенез РЖ, выступают технологии секвенирования нового поколения (NGS), которые позволяют одновременно анализировать миллионы ДНК-матриц. Одной из широко применяемых технологий NGS является полное экзомное секвенирование.

Поскольку наиболее ранними в процессе канцерогенеза являются генетические и молекулярные нарушения, то полученные в ходе настоящей работы данные могут быть весьма востребованы для разработки новых подходов ранней диагностики, прогнозирования течения болезни и персонализации лечения (Юсупова и др., 2019).

На основании вышеизложенного были поставлены цель и задачи исследования.

Цель исследования. Поиск молекулярно-генетических маркеров риска развития рака желудка в Республике Башкортостан.

Задачи исследования:

1. Провести анализ ассоциаций аллелей и генотипов полиморфных локусов ряда генов цитокинов и их рецепторов (ILlft, IL1RN, IL8 и IL10), генов матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов (MMP1, MMP2, MMP3, MMP9, MMP12, TIMP2 и TIMP3), гена PGC (ins-del), TP53 и CDH1 с риском развития рака желудка с учетом этнической и гендерной принадлежности исследуемых групп, а также клинических особенностей заболевания.

2. Провести анализ ассоциаций сочетаний аллелей и генотипов исследованных полиморфных локусов генов цитокинов и их рецепторов, генов матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов с риском развития рака желудка.

3. Провести поиск изменений нуклеотидной последовательности в гене Е-кадгерина CDH1 у больных раком желудка и здоровых индивидов.

4. Провести полное экзомное секвенирование образцов ДНК опухолевой и прилежащей к ней гистологически нормальной ткани, полученных от пациентов с диагнозом «рак желудка» с последующим биоинформатическим анализом и отбором функционально-значимых патогенных вариантов.

5. Провести поиск выявленных в результате полного экзомного секвенирования патогенных вариантов в образцах геномной ДНК на репрезентативных выборках больных раком желудка и здоровых доноров.

Научная новизна исследования

В ходе выполнения работы впервые собрана коллекция ДНК больных РЖ и соответствующей контрольной группы без признаков заболеваний желудочно-кишечного тракта, проживающих в Республике Башкортостан. Дана оценка частот аллелей и генотипов полиморфных локусов гб1 143634 и гб16944 гена 1Ь1р, гб2234663 гена 1Ь1Ш, гб4073 гена 1Ь8, гб 1800872 гена 1.110, ге1799750 и Ы94379 гена ММР1, ге2285053 гена ММР2, ге3025058 гена ММР3, ге3918242 и ге17576 гена ММР9, ге2276109 гена ММР12, ге8179090 гена Т1МР2, ге9619311 гена Т1МР3, гб 1042522 гена ТР53, гб 16260 гена СБН1., а также инсерционно-делеционного полиморфного варианта гена РОС у больных РЖ и здоровых лиц из Республики Башкортостан. Впервые проведен анализ ассоциаций полиморфных локусов генов цитокинов и их рецепторов, матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов, а также полиморфных локусов генов РОС, ТР53 и СВН1 с РЖ в Республике Башкортостан. Установлено, что полиморфные локусы ^1143634 (1ЫР), гб16944 (1ЫР), гб1799750 (ММР1), гб494379 (ММР1), гб3025058 (ММР3), гб3918242 (ММР9), гб2276109 (ММР12), гб9619311 (Т1МР3), гб1042522 (ТР53) и гб16260 (СВН1) участвуют в формировании генетической структуры предрасположенности к РЖ в Республике Башкортостан. Выявлены сочетания аллелей/генотипов полиморфных локусов генов цитокинов и их рецепторов, генов матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов, ассоциированные с РЖ.

Обнаружены синонимичные замены в 11-ом (c.1680G>C (^35741240)), 12-ом (с.1896С>Т (ге33969373)) и 14-ом (с.2253С>Т (rs33964119)) экзонах гена CDH1 у больных раком желудка и у здоровых доноров.

Впервые проведено полное экзомное секвенирование 18 образцов ДНК опухолевой и прилежащей к ней гистологически нормальной ткани, полученных от пациентов с РЖ из Республики Башкортостан. Из всех выявленных нарушений в нуклеотидной последовательности ДНК отобраны 3 патогенных варианта в генах, связанных с канцерогенезом - CDH1 (c.1320+1G>A), VEGFA (c.27_28insCCCAGCCCCAGCTACCA, ^М^) и FANCA (^1874^ p.Cys625Ser). В репрезентативных выборках больных РЖ и здоровых доноров в геномной ДНК данные изменения не обнаружены.

Теоретическая и практическая значимость работы

Полученные данные расширяют знания о генетических основах предрасположенности к РЖ. Впервые получены статистические оценки частот аллелей и генотипов исследуемых ДНК-локусов у больных РЖ и выявлены генетические маркеры предрасположенности к заболеванию. Результаты работы могут быть использованы для выявления генетической предрасположенности к РЖ с целью профилактики и своевременного выявления заболевания.

Результаты исследования также могут быть использованы при чтении спецкурсов по медицинской генетике и онкогенетике на биологических факультетах университетов, медицинских ВУЗов, на курсах повышения квалификации медицинских работников.

Методология и методы исследования

Методологическую основу проведенного нами исследования составил системный подход рассмотрения генов-кандидатов, как маркеров риска развития РЖ, а также поиск новых генов, ассоциированных с развитием злокачественных опухолей желудка для жителей Республики Башкортостан. Применение комплекса молекулярно-генетических и медико-статистических методов анализа, а также

оценка результатов исследований ведущих отечественных и зарубежных ученых в области онкогенетики способствовали всестороннему изучению роли выбранных генов-кандидатов в патогенезе РЖ. Для выполнения экспериментальной части научно-квалификационной работы использовались такие молекулярно-генетические методы исследования, как выделение геномной ДНК методом фенольно-хлороформной экстракции, полимеразная цепная реакция синтеза ДНК (ПЦР), метод электрофореза, ПДРФ-анализ, SSCP-анализ, НЯМ-анализ, аллель-специфичная ПЦР, секвенирование по Сэнгеру, секвенирование нового поколения (NGS). Опытно-экспериментальной базой для молекулярно-генетических исследований стала лаборатория ПЦР-анализа Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Башкирский государственный университет».

Положения, выносимые на защиту:

1. Маркером повышенного риска развития злокачественных опухолей желудка у русских является гомозиготный генотип ^9619311^/1 гена TIMP3, у татар - генотипы ге1799750*Ш^ гена MMP1, rs2276109*A/A гена ЫЫР12 и ^16260*^ гена CDH1.

2. Аллель ге1143634*С и генотип ге1143634*С/С гена а также аллель rs494379*G гена MMP1 ассоциированы с повышенным риском развития рака желудка у мужчин.

3. Аллель 143634^ и генотип ге1143634*С/С гена а также генотип rs2276109*A/A гена MMP12 являются генетическими маркерами высоко- и умереннодифференцированного рака желудка, гомозиготный генотип ^16260^^ гена CDH1 - маркером низко- и недифференцированного рака желудка.

4. Сочетания полиморфных вариантов генов цитокинов и генов матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов ассоциированы с повышенным риском развития рака желудка у русских (ге1800872^ гена 1Ш10 + rs2276109*A гена MMP12 + rs8179090*G/G гена Т1Ш2 и Ы073^ гена 1Ш8 + ^16944^ гена

ILip + rs2276109*G гена MMP12) и татар (rs4073*T гена IL8 + rs1799750*2G гена MMP1 + rs494379*G гена MMP1 + rs3025058*5A гена MMP3, rs1800872*C гена IL10 + rs1799750*1G/2G гена MMP1 + rs3025058*6A гена MMP3 и rs1800872*C гена IL10 + rs1799750*2G гена MMP1 + rs494379*G гена MMP1).

5. У больных раком желудка и здоровых доноров обнаружены изменения нуклеотидной последовательности в 11-ом (c.1680G>C (rs35741240)), 12-ом (c.1896C>T (rs33969373)) и 14-ом (c.2253C>T (rs33964119)) экзонах гена CDH1, которые представляют собой синонимичные замены.

6. Обнаружено 3 патогенных варианта в генах, связанных с канцерогенезом - CDH1 (c.1320+1G>A), VEGFA (c.27_28insCCCAGCCC CAGCTACCA, p.Ala9fs) и FANCA (c.G1874C, p.Cys625Ser) с помощью полного экзомного секвенирования образцов ДНК опухолевой и прилежащей к ней гистологически нормальной ткани желудка.

Степень достоверности и апробация результатов

Достоверность полученных в ходе исследования результатов подтверждается применением современных молекулярно-генетических и статистических методов, а также объемом проделанной работы. Выводы полностью и в строгой логической последовательности отражают полученные результаты.

Материалы исследования были представлены на международных и российских конференциях и конгрессах: «NGS в медицинской генетике» (Суздаль, 2016), «Актуальные вопросы фундаментальной и экспериментальной биологии» (Уфа, 2016), European Human Genetics Conference (Копенгаген, 2017), «Актуальные проблемы современной генетики» (Казань, 2016), «Молекулярная диагностика 2017» (Москва, 2017), «Биология будущего» (Уфа, 2017), «Постгеномные технологии в медицине: от теории к практике» (Воронеж, 2017), «Актуальные вопросы фундаментальной и клинической медицины» (Томск, 2018), «Биология будущего» (Уфа, 2018), European Human Genetics Conference (Милан, 2018), IV Российский Конгресс лабораторной медицины (Москва, 2018), «Фундаментальная

математика и ее приложения в естествознании» (Уфа, 2018), «Молекулярная диагностика 2018» (Минск, 2018), Международный Конгресс «VII Съезд Вавиловского общества генетиков и селекционеров» (Санкт-Петербург, 2019), V Российский Конгресс лабораторной медицины (Москва, 2019), V Всероссийская конференция по молекулярной онкологии (Москва, 2019).

Личный вклад автора в проведенные исследования

Определение темы диссертационной работы, цели и задач исследования проводились автором совместно с научным руководителем - доктором биологических наук, профессором Хуснутдиновой Э.К. Соискатель самостоятельно провел анализ отечественных и зарубежных источников литературы по теме диссертации и лично подготовил рукопись данной работы. Автор непосредственно участвовал в подготовке материалов к публикациям и их написании. Соискатель лично осуществлял сбор клинического и биологического материала для исследования. Основная часть экспериментальной работы: выделение образцов ДНК, амплификация, рестрикционный анализ, SSCP-анализ, HRM-анализ, аллель-специфичная ПЦР, секвенирование по Сэнгеру были выполнены автором самостоятельно. Соискатель самостоятельно обрабатывал и анализировал полученные данные, совместно с руководителем обобщал результаты.

Публикации

Соискатель имеет 4 опубликованные работы по теме диссертации, из них в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных ВАК, 3 работы, в том числе 1 статья в журнале, индексируемом в международных базах Web of Science и Scopus. Результаты работы были представлены на 16 конференциях и конгрессах в виде тезисов, стендовых и устных докладов.

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Диссертационная работа «Молекулярно-генетическое исследование рака желудка» соответствует формуле специальности 03.02.07 - «Генетика». В диссертационной работе исследованы молекулярно-генетические аспекты развития рака желудка, а также изучена возможность их использования в качестве маркеров риска развития данной патологии у пациентов, проживающих на территории Республики Башкортостан.

Структура и объем работы

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов, библиографического списка и приложений. Список литературы включает 240 работ зарубежных и отечественных авторов. Работа изложена на 307 страницах машинописного текста, содержит 16 рисунков, 52 таблицы и 5 приложений.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Факторы риска, патогенез и классификация рака желудка

Согласно современным представлениям, рак желудка - это комплексное заболевание, к факторам риска развития которого относят наличие наследственной предрасположенности, высокое потребление соли, низкое потребление свежих овощей и фруктов, курение, инфицирование бактерией H. pylori и другие (Имянитов, 2009; Денишев и др., 2016). Мероприятия, направленные на снижение степени влияния негативных средовых факторов, позволяют отсрочить время наступления заболевания или даже исключить его возникновение (Юсупова и др., 2018).

Всесторонний молекулярный анализ РЖ раскрыл сложную гетерогенность этого заболевания. РЖ является конечным результатом целого каскада событий, которые могут происходить в организме на протяжении десятилетий (Наумова и др., 2015). В конечном счете, злокачественные новообразования желудка являются результатом накопления в организме человека множества генетических и эпигенетических изменений. Эти изменения играют ключевую роль в малигнизации опухолевых клеток и включают множество путей, участвующих в развитии злокачественной опухоли. К ним относятся механизмы клеточного цикла, репарации ДНК, межклеточных взаимодействий, апоптоза, ангиогенеза, иммунного контроля и другие (West et al., 2012; Hudler, 2012; Wang et al., 2014; Shi et al., 2014; McLean et al., 2014; Raza et al., 2017; Furuya et al., 2018; Chen et al., 2019; Guindalini et al., 2019). Лишь небольшая часть аденокарцином желудка возникает в рамках явной наследственной предрасположенности, до 10% больных имеют отягощенный семейный анамнез, в большинстве же случаев встречаются спорадические формы РЖ (Oliveira et al., 2009). Известно, что РЖ развивается в несколько этапов. Современные представления о канцерогенезе желудка указывают на ведущую роль в этом процессе длительного течения хронического воспаления в слизистой оболочке желудка (Юсупова и др., 2018). Хроническое

воспаление с замедленной пролиферацией является общепризнанным фактором риска развития РЖ (Balkwill et al., 2001; Coussens et al., 2002). Хорошо известно, что инфекция H. pylori вызывает воспаление (хронический гастрит), которое, как полагают, прогрессирует в предраковые поражения и может привести к инвазивному РЖ. Данное состояние развивается у генетически восприимчивых индивидов с дефектами в защитных механизмах слизистой оболочки желудка или нарушением регуляции иммунных реакций цитокинами (Coussens et al., 2002).

Большинство исследователей признают, что гистогенез РЖ может развиваться по двум направлениям. Первый путь схематично можно представить следующим образом. Длительное воздействие (более 20 лет) на нормальную слизистую факторов окружающей среды, питания, и прежде всего H. pylori, приводит к атрофическому гастриту. Атрофический гастрит либо через кишечную метаплазию, дисплазию/аденому, дифференцированную карциному, либо через неметапластическую атрофию слизистой и низкодифференцированную аденокарциному приводит к инвазивному раку и метастазированию. Данный тип гистогенеза чаще наблюдается у пожилых людей и не связан с наследственным фактором (рис. 1) (Юсупова и др., 2018).

Рисунок 1. Патогенез рака желудка по P. Correa (Correa, 1988).

Второй тип гистогенеза предполагает наличие мультипотентной пролиферативной клетки шеечной зоны. Мультипотентная пролиферативная клетка развивается либо в карциноид, либо через дифференцированную аденокарциному в ряд злокачественных новообразований: муцинозная (слизистая) аденокарцинома, низкодифференцированная аденокарцинома, перстневидноклеточный рак, эндокриноклеточная карцинома, альфа-фетопродуцирующий (AFP) рак. Данный тип гистогенеза чаще развивается без предшествующего гастрита у молодых пациентов (Сельчук и др., 2003).

В 1965 году Lauren P. выделил два гистологических типа РЖ - «кишечный» или «интестинальный» и «диффузный», отличающиеся по эпидемиологии, этиологии и прогнозу (Lauren, 1965). Кишечный тип представлен дифференцированными аденокарциномами, формирующими железисто-подобные комплексы. Данный тип РЖ возникает на фоне атрофического гастрита с кишечной метаплазией. Диффузный тип РЖ представлен опухолями, в которых клетки слабо связаны друг с другом. Этот тип РЖ имеет высокоинвазивные свойства и более склонен к обширному субмукозному и интрамуральному распространению, а также к раннему метастазированию (Белковец и др., 2014).

Анализ временных трендов частоты различных гистологических типов РЖ показывает, что заболеваемость РЖ уменьшается за счет снижения заболеваемости кишечным типом, а заболеваемость диффузным типом рака остается почти неизменной. В регионах с высокой частотой заболеваемости РЖ преобладает рак кишечного типа, в то время как диффузный тип относительно более часто встречается в регионах с низкой заболеваемостью (Наумова и др., 2015).

Этиология кишечного типа РЖ, безусловно связана с факторами внешней среды (питание, бытовые условия), он преобладает в старших возрастных группах и более часто встречается у мужчин. Диффузный тип РЖ поражает лиц относительно более молодого возраста, а доля заболевших женщин при этой форме рака больше, чем при кишечном РЖ. Этот тип рака может иметь наследственную составляющую, модулирующуюся экзогенными влияниями (Shiao et al., 1999).

1.2. Молекулярно-генетические исследования рака желудка

Известно, что трансформация клеток в раковые и прогрессия онкологического процесса связаны с накоплением генетических и эпигенетических изменений в геноме, возникающих в результате нарушения нормального его функционирования (Е§§ег е1 а1., 2004). На сегодняшний день для поиска генетических и эпигенетических изменений, вовлеченных в процесс канцерогенеза, используется множество подходов. Известны наследственные синдромы и гены, патогенные мутации в которых, приводят к развитию РЖ. Одним из распространенных подходов поиска генов предрасположенности к спорадическим случаям РЖ является анализ ассоциаций генов-кандидатов, белковые продукты которых участвуют в патогенезе опухолеобразования. Кроме того проводится поиск патогенных мутаций, ведущих к канцерогенезу, с применением методов секвенирования, а также поиск эпигенетических маркеров риска развития РЖ (Юсупова и др., 2018).

1.2.1. Наследственные формы рака желудка

Случаи наследования РЖ достаточно часто цитируются в медицинской литературе (Степанов и др., 2010). Как уже упоминалось, молекулярной причиной предрасположенности к РЖ с высоким риском (70-83%) являются наследуемые мутации в ряде генов и к основным из них относятся гены СВН1, ТР53, МЬН1, МБН2 и другие (Башак е1 а1., 2016).

Ген СВН1 (cadherin 1) локализован на 16-ой хромосоме, в позиции 16q22.1, включает 16 экзонов и 15 интронов, имеет протяженность приблизительно 100 000 пн геномной ДНК, которые транскрибируются в 4 500 нуклеотидов мРНК (ЛпЫаее ^ а1., 2013).

СВН1 кодирует Е-кадгерин (увоморулин), принадлежащий к семейству трансмембранных кальций-зависимых гликопротеинов. Е-кадгерин обеспечивает адгезивные межклеточные контакты эпителиальных клеток, организует межклеточные связи, имеет большое значение для установления клеточной

полярности и поддержания нормальной морфологии тканей и клеточной дифференцировки. Е-кадгерин действует как специфический рецептор межклеточного распознавания во многих тканях, сохраняя, таким образом, их эпителиальную структуру (Юсупова и др., 2018). Отсюда можно предположить, что мутации гена CDH1, ведущие к снижению экспрессии белка Е-кадгерина, дестабилизируют связи между клетками, являются одним из основных механизмов инвазии и могут играть роль в прогрессировании эпителиальных форм рака (Anbiaee et al., 2013).

Как оказалось, изменения или инактивация CDH1, а следом и утрата экспрессии Е-кадгерина, встречаются при злокачественных новообразованиях различных локализаций, в том числе и при РЖ (Юсупова и др., 2018). Пациенты с мутациями в гене CDH1 сталкиваются с 75% риском развития РЖ в течение жизни, а для женщин добавляется еще 40% риск очагового рака молочной железы (Pharoah et al., 2001; Степанов и др., 2010; Fitzgerald et al., 2010).

Впервые соматические мутации CDH1 были обнаружены в 40-83% спорадических случаев РЖ диффузного типа, при отсутствии таковых у лиц со спорадическими случаями РЖ интестинального типа (Grady et al., 2000; Pharoah et al., 2001). В опухолях смешанного типа мутации и отсутствие экспрессии Е-кадгерина отмечалось только в диффузном компоненте опухоли, что давало основания сделать вывод о том, что потеря экспрессии Е-кадгерина - это вероятное генетическое основание для разграничения диффузного типа опухоли от интестинального (Степанов и др., 2010). Т. е. выявление нарушений гена CDH1 предлагалось расценивать, как фактор риска и движущую мутацию для развития диффузного типа РЖ. В январе 2020 года вышла в свет публикация российских авторов, в которой исследуется 77 образцов опухолевой ткани при РЖ. В данной работе ученые выявили положительную корреляцию соматических мутаций гена CDH1 с отдаленными метастазами (р=0,019) и перстневидно-клеточным РЖ (р=0,043), а также подтвердили связь мутаций в гене CDH1 с диффузным типом опухоли (Nemtsova et al., 2020).

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Галлямова Лилия Фанилевна, 2020 год

использованных для аллель-специфичной ПЦР

SNP Название Последовательности праймеров 5'— Размер амплифицируемого фрагмента, пн

CDH1-

Ex11 G GCACGTGAAGAACAGCACG

Forward

CDH1- 100

rs35741240 Ex11_C Forward GCACGTGAAGAACAGCACC

CDH1-

Ex11 GAACTAGCTAGGAGGTCGAG

Reverse

CDH1-

Ex12 С CACAGCAGAACTAACACACG

Forward

CDH1- 114

rs33969373 Ex12_T Forward CACAGCAGAACTAACACATG

CDH1-

Ex12 GAAGGGAAGCATGGCAGTTGG

Reverse

CDH1-

Ex14 С GATGACACCCGGGACAACG

Forward

CDH1- 127

rs33964119 Ex14_T Forward GATGACACCCGGGACAATG

CDH1-

Ex14 CTTACTAATCATTGCTTCTTCC

Reverse

2.2.9. Секвенирование ДНК по Сэнгеру

Для подтверждения молекулярно-генетических изменений, выявленных в результате полного экзомного секвенирования, использовали метод секвенирования по Сэнгеру. В основе данного метода лежит использование четырех терминирующих синтез ДНК дидезоксинуклеозидтрифосфатов (ddNTP: ddА, ddT, ddG, ddC), меченых разными флуоресцентными маркерами.

Синтез ДНК проводят в одной пробирке, после чего продукты флуоресцентной реакции пропускают через электрофорез в тонком стеклянном капилляре. Проходя через отверстие в капилляре, под воздействием лазерного луча меченые дидезоксинуклеотиды начинают флуоресцировать. Флуоресценция регистрируется цифровой камерой, преобразуется в электрический сигнал и выводится в виде графика.

Подготовка матриц для секвенирования включала предварительную амплификацию искомых фрагментов ДНК, очистку полученных ПЦР-продуктов от избытка праймеров, димеров праймеров и дезоксирибонуклеотидов (dNTP). Этапу очищения продуктов предшествовала постановка проверочного фореза, с целью оценки полученных ДНК-матриц. Впоследствии, полученный амплификат очищали одним из двух способов: 1) с применением набора ExoSAP-IT™ Express PCR Product Cleanup (Applied Biosystems), для этого к 5 мкл полученного амплификата добавляли 2 мкл реагента ExoSAPIT™ Express и инкубировали при 37°С в течение 4 мин, чтобы разложить избыток праймеров и нуклеотидов, а затем при 80°С в течение 1 мин, чтобы инактивировать реагент ExoSAP-IT™ Express; 2) путем элюции ДНК из агарозных гелей на магнитных частицах с использованием набора реагентов компании «Силекс» по методике, описанной в инструкции.

Следующим этапом является реакция секвенирования. Реакционная смесь для секвенирования включала в себя следующие компоненты (на 1 образец): H2O - 5,6 мкл; 0,4 мкл (10цМ) праймера для секвенирования (Forvard, либо Reverse); 1 мкл BigDye; 2 мкл буфера для BigDye; 1 мкл очищенного ПЦР-продукта. Общий объем смеси - 10 мкл.

Секвенирующую ПЦР-реакцию с BigDye проводили по схеме: Предварительная денатурация - 95°С - 1 мин Денатурация - 95°С - 15 с

Отжиг праймеров - 52°С - 10 с

Элонгация - 60°С - 1 мин

Хранение - 4°С

>- 30 циклов

В дальнейшем к полученному продукту добавляли 3 мкл Dextran и 3О мкл холодного 96%-го этанола, помещали в морозильную камеру на 1О мин при -200Q Затем центрифугировали со скоростью 13 ООО об/мин в течение 1О мин. После удаления надосадочной жидкости к осадку добавляли 2ОО мкл холодного 70%-го этанола и снова центрифугировали со скоростью 13 ООО об/мин в течение 1О мин. Затем отбирали супернатант и к полученному осадку снова добавляли 2ОО мкл холодного 7О%-го этанола, центрифугировали со скоростью 13 000 об/мин в течение 5-8 мин. Максимально отбирали супернатант и полученный осадок высушивали в термостате при 37oC в течение 1О мин. Затем осадок растворяли в 15 мкл 7О%-го формамида и переносили в плашку секвенатора.

Определение нуклеотидных последовательностей проводили на автоматическом секвенаторе Genetic Analyzer 35ОО App^d Biosystеms.

Полученные хроматограммы считывали с использованием программного обеспечения - Sequencher (v. 5.О GeneCode Corp) и SnapGene Viewer (v. 2.8.3).

2.2.10. Полное экзомное секвенирование

Проведена работа по пробоподготовке и полному экзомному секвенированию образцов геномной ДНК пациентов с РЖ. Пробоподготовка образцов осуществлялась наборами Ilumina Nextera™ DNA Sample Prep Kit согласно протоколу фирмы производителя. Общая последовательность пробоподготовки представлена ниже (рис. 5).

Количество ДНК измеряли на флюориметре Qubit 2.О («Life Technologies», США). Полное экзомное секвенирование осуществлялось путем селекции специфичных фрагментов ДНК с помощью системы SureSelect с последующим параллельным секвенированием полученных библиотек по технологии Illumina. Было использовано pair-end (парно-концевая библиотека) секвенирование синтезом (1ОО:1ОО) согласно технологии Illumina, включающее следующие этапы:

- фрагментирование ДНК физическим способом с помощью ультразвука на приборе QSonica;

- лигирование сиквенсовых адаптеров;

- предварительная амплификация библиотеки;

- отбор фракции нужной длины (size-select);

- клональная амплификация селектированной библиотеки.

Рисунок 5. Общая последовательность пробоподготовки образцов.

Общая последовательность этапов полного экзомного секвенирования представлена ниже:

1) Разрушение ДНК с получением фрагментов определенной длины;

2) Присоединение синтетических олигонуклеотидных адаптеров по краям фрагментов;

3) Наработка (амплификация) каждого фрагмента ДНК в отдельном микрореакторе с микрочастицей (эмульсионная ПЦР) и/или непосредственно на поверхности предметного стекла (мостиковая ПЦР);

4) Определение последовательности фрагментов ДНК на системе Ilumina Genome Analyzer HiSeq 2000;

5) Предварительная обработка данных (коротких прочтений).

Все последовательности (риды) выровнены на референсный геном с использованием программы Burrows-Wheeler Alignment (BWA) (Li et al., 2009). В качестве референсной использовалась последовательность генома человека (Genome Reference Consortium Human Build 37 (GRCh37-hg19)). Коллинг вариантов осуществляли с помощью The Genome Analysis Tool Kit (GATK) (DePristo et al., 2011).

Для обеспечения надежности и точности последующего анализа были предприняты следующие шаги по первичной обработке данных:

- Удалены риды с высоким однообразием нуклеотидного состава (10%,

9 пн);

- Удалены риды, представляющие собой контаминацию адаптерами (не менее 15 пн совпадения, не более 3 пн несовпадения);

- Удалены дуплицированные риды (пары прочтений, которые полностью совпадают).

Все риды после первичной фильтрации были выровнены относительно референсной последовательности. Если один рид мог быть выровнен относительно нескольких позиций в геноме, лишь одна из них была учтена.

С целью поиска SNV вариаций генома было проведено выравнивание полученной последовательности и референсного генома.

В целях выявления SNV была применена следующая фильтрация:

- Исключены SNV с Q<20;

- Исключены SNV, прочтенные менее чем 10 ридами;

- Исключены SNV, расположенные на расстоянии <5 пн от края рида;

- Исключены риды в повторяющихся участках генома.

В работе был использован пакет прикладных программ обеспечения MSExcel 2010 (Microsoft). В качестве инструмента вычислений использован пакет прикладных программ MS Office Excel 2010 (Microsoft), Plink 1.9 (http://pngu.mgh.harvard.edu/~purcell/plink/index.shtml), APSampler 3.6.1 (http://code. google.com/p/apsampler/).

Оценку частоты аллелей рассчитывали по формуле:

q=(2N3+N2)/2N,

где р - частота аллеля А, q - частота аллеля а, N - общий объем выборки.

N=N1+N2+N3,

где N1, N2, N3 - численности особей с генотипами А/А, А/а и а/а, соответственно.

Статистическую ошибку оценки частот генотипов рассчитывали по формуле (Животовский, 1991):

sp=Vp(1-p)/N,

где p - частота генотипа, N - объем выборки.

Для вычисления статистической ошибки частот аллелей использовали формулу:

sp=Vp(1-p)/2N.

Поскольку в наших выборках встречались значения частот р<0,2 и р>0,8, то в таких случаях статистическое распределение ошибки будет асимметричным, поэтому доверительный интервал генерального значения частоты вычисляли по формуле (Животовский, 1991):

p'=n/(n+(N-n+1 )F) p''=(n+1 )F"/(N-n+(n+1)F"),

где F' - критическое табличное значение F-распределения с числом степеней свободы v'1=2(N-n+1) v'2=2n для уровня значимости а/2. F" -

критическое значение F-распределения с v"1=2(n+1) v"2=2(N-n) для того же уровня значимости а/2.

При попарном сравнении частот аллелей и генотипов в группах больных и

Л

здоровых лиц использовался критерий %. Для таблиц сопряженности 2*2 применяли критерий %2 с поправкой Йейтса на непрерывность, если частота хотя бы в одной ячейке таблицы была меньше или равна 5, применялся точный критерий Фишера (http://www.biometrica.tomsk.ru/). Все статистические тесты выполнялись для двустороннего уровня значимости. Статистически значимыми считали различия при р<0,05, где р - уровень значимости критерия. Поправку на множественное тестирование проводили с помощью метода оценки доли ложно -положительных результатов FDR (False Discovery Rate; Benjiamini Hochberg), предусмотренного пакетом программы Plink 1.9 и онлайн программой (http//www.sdmproj ect.com/utilinies/?show=FDR).

Степень ассоциаций оценивали в значениях показателей соотношения шансов odds ratio (OR), по формуле:

OR = (a х d)/(b х c) или относительного риска relative ratio (RR), по формуле:

RR = ((a)/(a + b))/((c)/(c + d)), где a - частота аллеля (генотипа) в выборке больных, b - частота аллеля (генотипа) в контрольной выборке, с - сумма частот остальных аллелей (генотипов) в выборке больных, d - сумма частот остальных аллелей (генотипов) в контрольной выборке.

Доверительный интервал для показателя соотношения шансов рассчитывали по следующей формуле:

OR = exp [ In -1 ^Jy^+K + Vd )

OR" = exP (In OR + + Уь + + 1d )

В случае, когда один из показателей был равен 0, показатель OR вычислялся по формуле: ((2a+1)*(2d+1))/((2b+1)*(2c+1)) (Schlesselman, 1982).

Значение OR=1 показывало отсутствие ассоциации, значение OR>1 рассматривали как положительную ассоциацию заболевания с аллелем или генотипом (фактор повышенного риска), OR<1 - как отрицательную ассоциацию (фактор пониженного риска).

Поиск сочетаний аллелей/генотипов, ассоциированных с РЖ, осуществляли с помощью программы APSampler 3.6.1 (Favorov et al., 2005). Программное обеспечение APSampler использует метод Монте-Карло Марковскими цепями и Байесовскую непараметрическую статистику, а также проводит валидацию результатов работы алгоритма на основе традиционного статистического подхода, на основе оценки значимости ассоциаций каждого найденного основным алгоритмом сочетания аллелей и генотипов с признаком по значениям точного критерия Фишера, соотношения шансов (OR) и его 95%-го доверительного интервала (CI) (Судомоина и др., 2010). В качестве поправки на множественность сравнений использовали перестановочный тест (Permutation Test), статистически значимыми считали различия при Pperm<0,05.

Изменения, обнаруженные в результате полного экзомного секвенирования, аннотировали с помощью программы ANNOVAR с использованием summarize_annovar.pl script (Wang et al., 2010), позволяющей сравнивать однонуклеотидные замены, полученные в результате секвенирования, с рядом специализированных баз данных и предсказывать функциональную значимость выявленных изменений с использованием in silico инструментов (SIFT, PolyPhen-2, LRT, Mutation Taster, Mutation Assessor, ClinVar, phyloP, GERP++ и другие) из dbNSFP v.1.3 (Liu et al., 2011). Кроме того, дополнительно использовалась программа CADD (Combined Annotation Dependent Depletion). Для поиска соматических мутаций в образцах ДНК, выделенных из опухолевой ткани, использовали базу данных по онкологическим мутациям - COSMIC (catalog of somatic mutations in cancer). Для оценки популяционных частот выявленных вариантов использовали данные из проектов «1000 геномов», ESP6500 и Exome Aggregation Consortium.

Исследование направлено на комплексное изучение молекулярно-генетических основ развития широко распространенного онкологического заболевания - рака желудка. С этой целью было сформировано несколько направлений исследования: 1) Поиск генетических маркеров риска развития РЖ на основе анализа полиморфных локусов генов цитокинов и их рецепторов, генов матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов, а также генов пищеварительных ферментов; 2) Анализ взаимосвязи полиморфных вариантов известных генов-кандидатов, вовлеченных в патогенез наследственного РЖ, с развитием заболевания для жителей Республики Башкортостан; 3) Анализ ассоциаций сочетаний аллелей и генотипов изученных ДНК-локусов генов цитокинов и их рецепторов, генов матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов с риском развития РЖ; 4) Поиск изменений нуклеотидной последовательности в гене СВИ1 у больных РЖ и здоровых доноров; 5) Полное экзомное секвенирование образцов ДНК опухолевой и гистологически нормальной ткани, полученных от пациентов с РЖ с последующим анализом и отбором функционально-значимых патогенных вариантов и ресеквенированием участка экзома, содержащего выявленные изменения, методом Сэнгера. А также поиск выявленных изменений нуклеотидной последовательности в репрезентативных выборках больных РЖ и здоровых доноров.

Исследование полиморфных вариантов генов цитокинов и их рецепторов, генов матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов, а также генов пищеварительных ферментов и генов-кандидатов, вовлеченных в патогенез наследственного РЖ, включало анализ ассоциаций 17 локусов (табл. 7).

SNP ID Ген Полиморфный вариант Позиция на хромосоме, локализация

rsl 143634 ILip g.8967C>T СЪг 2:112832813

rs16944 ILip g.4490T>C СЪг 2:112837290

rs2234663 IL1RN VNTR №2:113130529113130872

rs4073 IL8 g.4802A>T СЪг 4:73740307

rs1800872 IL10 g.4433A>C СЪг 1:206773062

rs1799750 MMP1 g.3471delG СЪг 11:102799765102799766

rs494379 MMP1 g.102798479A>G СЪг 11:102798479

rs2285053 MMP2 g.4297C>T СЪг 16:55478465

rs3025058 MMP3 g.13452_13453insA СЪг 11:102845217102845218

rs3918242 MMP9 g.3430C>T СЪг 20:46007337

rs17576 MMP9 g.7679A>G СЪг 20:46011586

rs2276109 MMP12 g.4974A>G СЪг 11:102875061

rs8179090 TIMP2 g.76921889C>G СЪг 17:78925807

rs9619311 TIMP3 g.4892T>C СЪг 22:32800707

PGC Ins-del СЪг 6:4173793141738349

rs16260 CDH1 g.4840C>A СЪг 16:68737131

rs1042522 TP53 g.16397C>G СЪг 17:7676154

Сравнение групп больных и контроля проводилось по ряду признаков. По этнической принадлежности сравнение проводили для русских и татар, другие национальности в данном исследовании не учитывались ввиду их

немногочисленности в обеих репрезентативных выборках. Также сравнение велось по гендерной принадлежности и относительно клинических особенностей заболевания, таких как стадия развития РЖ, степень дифференцировки опухоли и агрессивное течение заболевания. Разделение пациентов по стадии развития РЖ осуществлено на основе общепринятой ТЫМ-классификации. Сравнение по степени дифференцировки опухоли проводили в двух группах - высоко- и умереннодифференцированный РЖ и низко- и недифференцированный РЖ. Агрессивное течение заболевания выявляли исходя из выживаемости пациентов, больные, умершие в последующие 2-3 года после оперативного вмешательства имели более агрессивную форму опухоли, нежели остальные.

Поиск изменений нуклеотидной последовательности в гене СВИ1 проводили во всех 16 экзонах данного гена. Анализ проводили как в группе больных, так и в группе контроля, с целью выявления частоты встречаемости обнаруженных молекулярно-генетических изменений.

Полное экзомное секвенирование проводили в 18 образцах ДНК, выделенных из опухолевой и нормальной ткани больных РЖ. Выявленные изменения подвергали биоинформатической обработке, а в последующем отобранные варианты подтверждали ресеквенированием по Сэнгеру.

Схематично дизайн исследования представлен на рисунке 6 (рис. 6).

сследование распределения частот аллелей и генотипов полиморфных локусов ряда генов цитокинов и их рецепторов, генов матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов, а также генов пищеварительных ферментов и генов-кандидатов, вовлеченных в патогенез наследственного РЖ, среди больных РЖ и здоровых доноров из Республики Башкортостан

{Анализ ассоциации аллелей и генотипов исследованных полиморфных локусов с риском развития РЖ с учетом этнической и гендерной принадлежности исследуемых групп, а также клинических особенностей заболевания

Поиск изменений нуклеотидной последовательности в гене СБИ1 у больных РЖ и вых

Полное экзомное секвенирование образцов ДНК, выделенных из опухолевой и нормальной ткани больных РЖ

V_

X

частоты встречаемости обнаруженных молекулярно-генетических изменений в гене СБИ1 среди больных РЖ и здоровых

доноров

Анализ ассоциаций сочетаний аллелей и генотипов исследованных полиморфных локусов генов цитокинов и их рецепторов, генов матриксных металлопротеиназ и их тканевых ингибиторов с риском развития РЖ

Ж

А

Ж

Биоинформатический анализ и отбор функционально-значимых патогенных

вариантов

I

у

Ресеквенирование участка экзома, содержащего выявленные патогенные варианты, методом Сэнгера

П оиск выявленных патогенных вариантов в образцах геномной ДНК на репрезентативных выборках больных РЖ и здоровых доноров

Ж.

Выявление генетических маркеров риска развития рака желудка

Рисунок 6. Схема дизайна исследования.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

У больных РЖ и индивидов контрольной группы из Республики Башкортостан проведен анализ распределения частот аллелей и генотипов семнадцати полиморфных локусов: rs1143634 и rs16944 гена интерлейкин-1р (ILip), rs2234663 гена рецепторного антагониста интерлейкина-1 (IL1RN), rs4073 гена интерлейкин-8 (IL8), rs 1800872 гена интерлейкин-10 (IL10), rs1799750 и rs494379 гена матриксной металлопротеиназы-1 (MMP1), rs2285053 гена матриксной металлопротеиназы-2 (MMP2), rs3025058 гена матриксной металлопротеиназы-3 (MMP3), rs3918242 и rs17576 гена матриксной металлопротеиназы-9 (MMP9), rs2276109 гена матриксной металлопротеиназы-12 (MMP12), rs8179090 гена тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ-2 (TIMP2), rs9619311 гена тканевого ингибитора матриксных металлопротеиназ-3 (TIMP3), rs16260 гена Е-кадгерина (CDH1), rs1042522 гена опухолевого протеина p53 (TP53), а также инсерционно-делеционного полиморфного варианта гена PGC. Наблюдаемое распределение частот генотипов по всем полиморфным локусам соответствует ожидаемому из уравнения Харди-Вайнберга. Поскольку население Республики Башкортостан в этническом отношении является неоднородным, исследуемая выборка была разделена на подгруппы в зависимости от этнической принадлежности. В отдельные группы были выделены русские и татары. Другие национальности в данном исследовании не учитывались ввиду их немногочисленности в обеих репрезентативных выборках. Было проведено сравнение распределения частот аллелей и генотипов полиморфных ДНК-локусов с целью выявления маркеров повышенного и пониженного риска развития РЖ между выборками больных и здоровых доноров с учетом этнической и гендерной принадлежности анализируемых групп, а также клинических особенностей заболевания (Юсупова и др., 2019).

3.1. Анализ ассоциации полиморфных вариантов генов цитокинов и их рецепторов с раком желудка в Республике Башкортостан

3.1.1. Анализ ассоциации полиморфных вариантов ^1143634 и ге16944 гена и У^^-полиморфизма ^2234663 гена 1ЬШМ с раком желудка

Ген ^1р картирован на длинном плече хромосомы 2 в области 2ql4. Индивидуальная вариация в экспрессии гена ^1р зависит от функциональных полиморфных локусов (Юсупова и др., 2019). Описаны полиморфные варианты в 5 экзоне (ге1143634) и в промоторной области (ге16944) гена ^1в, где аллели гб1143634*Т и гб16944*Т ассоциированы с более высокой продукцией цитокина (Громова и др., 2005; Магкоуа е1 а1., 2007).

Нами проведен анализ ассоциации аллелей и генотипов указанных однонуклеотидных замен с риском развития РЖ для жителей Республики Башкортостан (Юсупова и др., 2019). Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного локуса ^1143634 гена ^1р среди больных РЖ и здоровых доноров из Республики Башкортостан представлено в таблицах 8-10 и в приложении А: табл. А1, А2 (табл. 8-10, приложение А: табл. А1, А2).

В ходе исследования полиморфного локуса ^1143634 гена ^1р получены следующие результаты: в распределении частот аллелей и генотипов среди здоровых индивидов выявлены гендерные различия. У мужчин достоверно реже (в 45,0% случаев), чем у женщин (в 62,50% случаев) обнаруживался генотип ге1143634*С/С (х2=5,80; р=0,016) и, напротив, генотип ге1143634*С/Т у мужчин встречался достоверно чаще, чем у женщин (в 46,50% против 27,78% случаев) (Х2=6,89; р=0,009) (Юсупова и др., 2019) (табл. 8).

Аллель ^1143634*С и генотип ге1143634*С/С являются для мужчин

Л

маркерами повышенного риска развития РЖ (% =7,39; р=0,007; 0Я=1,69; 95%С1 1,17-2,44 и х2=7,83; р=0,005; 0Я=1,96; 95%С1 1,24-3,09, соответственно), а маркерами пониженного риска для этой же группы испытуемых - аллель ге1143634*Т и генотип ге1143634*С/Т (х2=7,39; р=0,007; 0Я=0,59; 95%С1 0,410,86 и х2=4,75; р=0,029; 0Я=0,58; 95%С1 0,37-0,93, соответственно) (Юсупова и

др., 2019) (табл. 8). После коррекции на множественность сравнений, статистически значимые результаты сохранились (табл. 8).

Таблица 8 - Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного локуса гб1 143634 гена в выборках больных РЖ и индивидов контрольной группы в

зависимости от гендерной принадлежности

^1143634

Генотип, Мужчины Мужчины Женщины Женщины

аллель с РЖ контроль с РЖ контроль

1 2 3 4 5 6

С/С П1 77 90 53 45

Р^р 61,60±4,35 45,00±3,52 55,21±5,08 62,50±5,71

С1 % (52,48-70,16) (37,98-52,18) (44,71-65,37) (50,30-73,64)

х2 7,83 0,63

Р (Ргаг) 0,005 (0,015) 0,429 (0,644)

ОЯ (С1) 1,96 (1,24-3,09)

С/Т П1 42 93 35 20

Р1±Эр 33,60±4,22 46,50±3,53 36,46±4,91 27,78±5,28

С1 % (25,40-42,60) (39,44-53,67) (26,87-46,91) (17,86±39,59)

х2 4,75 1,04

Р (Ргаг) 0,029 (0,044) 0,308 (0,644)

ОЯ (С1) 0,58 (0,37-0,93)

Т/Т П1 6 17 8 7

Р^р 4,80±1,91 8,50±1,97 8,33±2,82 9,72±3,49

С1 % (1,78-10,15) (5,03-13,26) (3,67-15,76) (4,00±19,01)

х2 1,09 0,002

Р (Ргаг) 0,297 ;0,839) 0,969 ;0,999)

С П1 196 273 141 110

Р^р 78,40±2,60 68,25±2,33 73,44±3,19 76,39±3,54

С1 % (72,78-83,34) (63,44-72,79) (66,60-79,54) (68,60-83,06)

х2 7,39 0,24

Р (ййт) 0,007 (0,036) 0,625 (0,787)

ОЯ (С1) 1,69 (1,17-2,44)

Т П1 54 127 51 34

Р^р 21,60±2,60 31,75±2,33 26,56±3,19 23,61±3,54

С1 % (16,66-27,22) (27,21-36,56) (20,46-33,40) (16,94-31,40)

х2 7,39 0,24

Р (РгЯг) 0,007 (0,036) 0,625 (0,787)

ОЯ (С1) 0,59 (0,41-0,86)

Кроме этого, нами было проведено сравнение частоты встречаемости аллелей и генотипов полиморфного локуса ^1143634 гена между группой здоровых доноров и пациентов, имеющих различные стадии развития заболевания, а также между выборкой здоровых лиц и больных, имеющих опухоли разной степени дифференцировки (Юсупова и др., 2019). Оказалось, что у пациентов со II стадией развития РЖ достоверно чаще встречаются аллель ге1143634*С и генотип ге1143634*ОТ (^=6,17; p=0,013; OR=2,31; 95%а 1,224,39 и х2=7,40; p=0,007; OR=2,94; 95%а 1,38-6,27, соответственно) и достоверно реже встречаются аллель ге1143634*Т и генотип ге1143634*ОТ (х2 =6,17; p=0,013; OR=0,43; 95%а 0,23-0,82 и ^=5,49; p=0,019; OR=0,36; 95%а 0,16-0,82, соответственно) по сравнению с контрольной выборкой (Юсупова и др., 2019) (табл. 9). Однако, после введения поправки на множественность сравнений, статистически значимые результаты сохранились только в отношении генотипов ге1143634*ОТ и ге1143634*ОТ (табл. 9).

Таблица 9 - Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного локуса ^1143634 гена в выборках больных РЖ различной стадии и индивидов

контрольной группы

^1143634

Генотип, аллель Контроль (в целом) Контроль (в целом)

II стадия РЖ III стадия РЖ

1 2 3 4 5 6

С/С ^ 29 135 80 135

Pi±Sp 74,36±6,99 49,63±3,03 54,05±4,10 49,63±3,03

а % (57,87-86,96) (43,54-55,73) (45,68-62,27) (43,54-55,73)

х2 7,40 0,58

p (Ы 0,007 (0,020) 0,445 (0,758)

OR (С1) 2,94 (1,38-6,27)

ОТ ^ 8 113 57 113

Pi±Sp 20,51±6,47 41,54±2,99 38,51±4,00 41,54±2,99

С1 % (9,30-36,46) (35,62-47,65) (30,64-46,86) (35,62-47,65)

х2 5,49 0,25

Р (Pfdr) 0,019 (0,029) 0,617 (0,758)

OR (С1) 0,36 (0,16-0,82)

1 2 3 4 5 6

T/T П1 2 24 11 24

pi±Sp 5,13±3,53 8,82±1,72 7,43±2,16 8,82±1,72

CI % (0,63-17,32) (5,74-12,84) (3,77-12,91) (5,74-12,84)

х2 0,22 0,09

p (pfdr) 0,638 ;0,997) 0,758 0,981)

C ni 66 383 217 383

pi±Sp 84,62±4,09 70,40±1,96 73,31±2,57 70,40±1,96

CI % (74,67-91,79) (66,37-74,21) (67,89-78,26) (66,37-74,21)

х2 6,17 0,66

p (pfdr) 0,013 (0,220) 0,417 (0,718)

OR (CI) 2,31 (1,22-4,39)

T ni 12 161 79 161

pi±Sp 15,38±4,09 29,60±1,96 26,69±2,57 29,60±1,96

CI % (8,21-25,33) (25,79-33,63) (21,74-32,11) (25,79-33,63)

х2 6,17 0,66

p (pfdr) 0,013 (0,220) 0,417 (0,718)

OR (CI) 0,43 (0,23-0,82)

Выявлено, что носители аллеля rs1143634*C и генотипа rs1143634*C/C имеют повышенный риск развития высоко- и умереннодифференцированного РЖ (Х2=8,18; p=0,004; OR=1,87; 95%CI 1,23-2,85 и х2=8,25; p=0,004; OR=2,13; 95%CI 1,29-3,53, соответственно), в свою очередь носительство аллеля rs1143634*T и генотипа rs1143634*C/T оказывает протективный эффект в отношении развития данной патологии (х2=8,18; p=0,004; 0R=0,53; 95%CI 0,35-0,81 и ^=4,86; p=0,027; 0R=0,54; 95%CI 0,32-0,91, соответственно) (Юсупова и др., 2019) (табл. 10). После введения поправки FDR статистически значимые результаты сохранились (pfdr<0,05) (табл. 10).

Таблица 10 - Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного локуса ^1143634 гена в выборках больных РЖ и индивидов контрольной группы в зависимости от клинических особенностей заболевания

гэ1143634

Больные РЖ, Высоко- и Низко- и

Генотип, умершие в Контроль умереннодиф- Контроль недифферен- Контроль

аллель последующие (в целом) ференцирован- (в целом) цированный (в целом)

2-3 года ный РЖ РЖ

1 2 3 4 5 6 7 8

С/С ^ 34 135 61 135 62 135

Рi±Sp 55,74±6,36 49,63±3,03 67,78±4,93 49,63±3,03 51,24±4,54 49,63±3,03

а % (42,45-68,45) (43,54-55,73) (57,10-77,25) (43,54-55,73) (41,99-60,43) (43,54-55,73)

х2 0,52 8,25 0,03

Р ^г) 0,471 (0,707) 0,004 (0,012) 0,853 (0,990)

OR (а) 2,13 (1,29-3,53)

С/Т 24 113 25 113 49 113

Рi±Sp 39,34±6,25 41,54±2,99 27,78±4,72 41,54±2,99 40,50±4,46 41,54±2,99

а % (27,07-52,69) (35,62-47,65) (18,85-38,22) (35,62-47,65) (31,67-49,80) (35,62-47,65)

х2 0,03 4,86 0,01

Р ^г) 0,864 (0,987) 0,027 (0,041) 0,933 (0,990)

OR (а) 0,54 (0,32-0,91)

Т/Т ni 3 24 4 24 10 24

Рi±Sp 4,92±2,77 8,82±1,72 4,44±2,17 8,82±1,72 8,26±2,50 8,82±1,72

а % (1,03-13,71) (5,74-12,84) (1,22-10,99) (5,74-12,84) (4,03-14,67) (5,74-12,84)

х2 0,56 1,26 0,0002

Р (Рfdr) 0,453 (0,707) 0,263 (0,840) 0,990 (0,995)

1 2 3 4 5 6 7 8

с П1 92 383 147 383 173 383

75,41±3,90 70,40±1,96 81,67±2,88 70,40±1,96 71,49±2,90 70,40±1,96

С1 % (66,79-82,75) (66,37-74,21) (75,23-87,03) (66,37-74,21) (65,35-77,09) (66,37-74,21)

х2 0,99 8,18 0,05

Р 1 0,320 (0,727) 0,004 (0,047) 0,823 (0,824)

ОЯ (С1) 1,87 (1,23-2,85)

т П1 30 161 33 161 69 161

24,59±3,90 29,60±1,96 18,33±2,88 29,60±1,96 28,51±2,90 29,60±1,96

С1 % (17,25-33,21) (25,79-33,63) (12,97-24,77) (25,79-33,63) (22,91-34,65) (25,79-33,63)

х2 0,99 8,18 0,05

Р 1 0,320 (0,727) 0,004 (0,047) 0,823 (0,824)

ОЯ (С1) 0,53 (0,35-0,81)

В данном исследовании также проведен анализ распределения частот аллелей и генотипов однонуклеотидной замены rs 16944 гена ILlß у больных РЖ и здоровых доноров из Республики Башкортостан, результаты которого представлены в таблицах 11-13 и в приложении А: табл. А3, A4 (табл. 11-13, приложение А: табл. A3, A4). Анализ распределения частот аллелей полиморфного локуса rs16944 гена ILlß показал, что в выборках нашего региона чаще обнаруживался аллель rs16944*C, выявленный у больных в различных этнических группах с частотой 58,25-67,00%, а у здоровых доноров - с частотой 52,40-60,74%. Аллель rs16944*T среди больных РЖ различной этнической принадлежности встречался с частотой 33,00-41,75%, что в незначительной степени отличается от частоты встречаемости данного аллеля в группе контроля -39,26-47,60%. Среди генотипов чаще встречаемыми оказались генотип rs16944*C/T (больные - 50,00-50,52%, контроль - 39,42-44,44%) и генотип rs16944*C/C (больные - 32,99-42,00%, контроль - 32,69-38,52%) (табл. 11).

Сравнительный анализ выявил, что аллель rs16944*C в целом (без разделения выборки на подгруппы в зависимости от этнической, либо гендерной принадлежности, а также клинических особенностей заболевания) является маркером повышенного риска развития РЖ для жителей нашего региона (х2=4,44; p=0,035; OR=1,33; 95%CI 1,03-1,71). Маркерами пониженного риска развития злокачественных опухолей желудка для выборки в целом являются аллель rs16944*T и генотип rs16944*T/T (^=4,44; p=0,035; 0R=0,75; 95%CI 0,58-0,97 и Х2=6,51; p=0,011; 0R=0,52; 95%CI 0,32-0,84, соответственно) (табл. 11).

Показано, что генотип rs16944*T/T достоверно реже встречается у пациентов с III стадией развития РЖ (в 12,16% случаев), чем у здоровых доноров (в 21,86% случаев) (х2=5,41; p=0,020; 0R=0,49; 95%CI 0,28-0,87) (табл. 12). Этот же генотип rs16944*T/T является маркером пониженного риска развития низко- и недифференцированного РЖ (х2=4,32; p=0,038; 0R=0,51; 95%CI 0,27-0,93) (Юсупова и др., 2019) (табл. 13). Следует отметить, что после коррекции на множественность сравнений, статистически значимые результаты сохранились только в отношении генотипа rs16944*T/T для выборки в целом (табл. 11-13).

индивидов контрольной группы в зависимости от этнической принадлежности

^16944

Генотип, аллель Больные (в целом) Контроль (в целом) Русские с РЖ Русские контроль Татары с РЖ Татары контроль

1 2 3 4 5 6 7 8

С/С П1 85 95 42 52 32 34

С1 % 38,46±3,27 (32,02-45,22) 34,05±2,84 (28,51-39,94) 42,00±4,94 (32,20-52,29) 38,52±4,19 (30,28-47,28) 32,99±4,77 (23,78-43,27) 32,69±4,60 (23,81-42,59)

х2 0,86 0,16 0,01

Р (Ы 0,354 0,816) 0,686 0,975) 0,916 1,000)

С/Т П1 108 123 50 60 49 41

С1 % 48,87±3,36 (42,11-55,66) 44,09±2,97 (38,17-50,13) 50,00±5,00 (39,83-60,17) 44,44±4,28 (35,90±53,24) 50,52±5,08 (40,17-60,83) 39,42±4,79 (29,98-49,49)

х2 0,95 0,51 2,07

Р (Ы 0,330 ¡0,354) 0,477 ;0,686) 0,150 ¡0,225)

Т/Т П1 28 61 8 23 16 29

Р1±БР С1 % 12,67±2,24 (8,59-17,79) 21,86±2,47 (17,16-27,18) 8,00±2,71 (3,52-15,16) 17,04±3,24 (11,12±24,46) 16,49±3,77 (9,73-25,40) 27,88±4,40 (19,54-37,53)

х2 6,51 3,35 3,12

Р (Рйг) 0,011 (0,032) 0,067 (0,202) 0,077 (0,225)

ОЯ (С1) 0,52 (0,32-0,84)

1 2 3 4 5 6 7 8

С 278 313 134 164 113 109

Рi±Sp 62,90±2,30 56,09±2,10 67,00±3,32 60,74±2,97 58,25±3,54 52,40±3,46

а % (58,20-67,41) (51,86-60,26) (60,02-73,47) (54,64-66,60) (50,97-65,27) (45,38-59,35)

х2 4,44 1,68 1,16

р (ы 0,035 (0,248) 0,195 (0,405) 0,281 (0,955)

OR (а) 1,33 (1,03-1,71)

Т ni 164 245 66 106 81 99

Рi±Sp 37,10±2,30 43,91±2,10 33,00±3,32 39,26±2,97 41,75±3,54 47,60±3,46

а % (32,59-41,80) (39,74-48,14) (26,53-39,98) (33,40-45,36) (34,73-49,03) (40,65-54,62)

х2 4,44 1,68 1,16

Р (Рfdr) 0,035 (0,248) 0,195 (0,405) 0,281 (0,955)

OR (а) 0,75 (0,58-0,97)

Tаблица 12 - Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного локуса rs16944 гена ILlß в выборках больных РЖ различной стадии и индивидов

контрольной группы

rs16944

Генотип, аллель Контроль (в целом) Контроль (в целом)

II стадия РЖ III стадия РЖ

1 2 3 4 5 6

C/C П1 13 95 57 95

pi±Sp 33,33±7,55 34,05±2,84 38,51±4,00 34,05±2,84

CI % (19,09-50,22) (28,51-39,94) (30,64-46,86) (28,51-39,94)

х2 0,008 0,66

p (pfdr) 0,927 0,997) 0,418 0,976)

C/T ni 19 123 73 123

pi±Sp 48,72±8,00 44,09±2,97 49,32±4,11 44,09±2,97

CI % (32,42-65,22) (38,17-50,13) (41,02-57,66) (38,17-50,13)

х2 0,14 0,87

p (pfdr) 0,709 0,927) 0,351 0,418)

T/T ni 7 61 18 61

pi±Sp 17,95±6,15 21,86±2,47 12,16±2,69 21,86±2,47

CI % (7,54-33,53) (17,16-27,18) (7,37-18,54) (17,16-27,18)

х2 0,12 5,41

p (pfdr) 0,726 (0,927) 0,020 (0,060)

OR (CI) 0,49 (0,28-0,87)

C ni 45 313 187 313

pi±Sp 57,69±5,59 56,09±2,10 63,18±2,80 56,09±2,10

CI % (45,98-68,81) (51,86-60,26) (57,40-68,68) (51,86-60,26)

х2 0,02 3,71

p (pfdr) 0,885 0,923) 0,054 0,285)

T ni 33 245 109 245

pi±Sp 42,31±5,59 43,91±2,10 36,82±2,80 43,91±2,10

CI % (31,19-54,02) (39,74-48,14) (31,32-42,60) (39,74-48,14)

х2 0,02 3,71

p (pfdr) 0,885 (0,923) 0,054 (0,285)

индивидов контрольной группы в зависимости от клинических особенностей заболевания

^16944

Больные РЖ, Высоко- и Низко- и

Генотип, умершие в Контроль умереннодиф- Контроль недифферен- Контроль

аллель последующие (в целом) ференцирован- (в целом) цированный (в целом)

2-3 года ный РЖ РЖ

1 2 3 4 5 6 7 8

С/С П1 19 95 34 95 46 95

Р1±Эр 31,15±5,93 34,05±2,84 37,78±5,11 34,05±2,84 38,02±4,41 34,05±2,84

С1 % (19,90-44,29) (28,51-39,94) (27,77-48,62) (28,51-39,94) (29,35-47,29) (28,51-39,94)

х2 0,08 0,27 0,42

Р 1 0,775 (0,987) 0,605 (0,624) 0,516 (0,980)

С/Т П1 34 123 43 123 60 123

55,74±6,36 44,09±2,97 47,78±5,27 44,09±2,97 49,59±4,55 44,09±2,97

С1 % (42,45-68,45) (38,17-50,13) (37,13-58,57) (38,17-50,13) (40,37-58,82) (38,17-50,13)

х2 2,29 0,24 0,82

Р 1 0,131 (0,259) 0,624 (0,990) 0,365 (0,516)

Т/Т П1 8 61 13 61 15 61

13,11±4,32 21,86±2,47 14,44±3,71 21,86±2,47 12,40±3,00 21,86±2,47

С1 % (5,84-24,22) (17,16-27,18) (7,92-23,43) (17,16-27,18) (7,11-19,62) (17,16-27,18)

х2 1,86 1,90 4,32

Р 1 0,173 (0,259) 0,168 (0,505) 0,038 (0,113)

ОЯ(С1) 0,51 (0,27-0,93)

1 2 3 4 5 6 7 8

С 72 313 111 313 152 313

Рi±Sp 59,02±4,45 56,09±2,10 61,67±3,62 56,09±2,10 62,81±3,11 56,09±2,10

а % (49,75-67,83) (51,86-60,26) (54,14-68,80) (51,86-60,26) (56,39-68,92) (51,86-60,26)

х2 0,24 1,51 2,86

р (ы 0,625 (0,727) 0,219 (0,614) 0,091 ¡0,470)

Т ni 50 245 69 245 90 245

Рi±Sp 40,98±4,45 43,91±2,10 38,33±3,62 43,91±2,10 37,19±3,11 43,91±2,10

а % (32,17-50,25) (39,74-48,14) (31,20-45,86) (39,74-48,14) (31,08-43,61) (39,74-48,14)

х2 0,24 1,51 2,86

Р (Рfdr) 0,625 (0,727) 0,219 (0,614) 0,091 (0,470)

Существует множество исследований, посвященных изучению влияния полиморфных вариантов гена ILlß на риск развития РЖ (Юсупова и др., 2019). Так Zhang с коллегами провели мета-анализ на основе 33 опубликованных исследований. Авторы установили взаимосвязь аллеля rs1143634*T с повышенным риском онкопатологии желудка, однако значимость такой ассоциации имела лишь пограничный уровень (Zhang et al., 2012). В результате другого мета-анализа ученые пришли к выводу, что аллель rs16944*T гена ILlß коррелирует со статистически значимым повышением риска развития РЖ для представителей европейской популяции, однако эта корреляция статистически не значима для индивидов из Азии (Vincenzi et al., 2008). Данный мета-анализ способствовал объяснению противоречивых результатов, полученных разными исследователями при анализе ассоциации аллелей rs16944 гена ILlß с риском развития РЖ, свидетельствующих о важности учета этнической принадлежности анализируемых групп при интерпретации полученных результатов. Отличия в полученных результатах могут объясняться особенностями генетической структуры рассматриваемой нами популяции (Юсупова и др., 2019).

IL1RN также, как и ген ILlß, расположен на длинном плече хромосомы 2, в позиции 2q14.1 (Юсупова и др., 2019). В гене IL1RN определен минисателлитный полиморфный вариант - вариабельность по числу 86-членных тандемных повторов (VNTR - Variable Number of Tandem Repeats) во 2-м интроне (rs2234663), который предполагает существование пяти аллелей, имеющих определенное число повторов (Witkin et al., 2002). В выборках нашего региона выявлено пять вариантов аллелей: IL1RN*1, IL1RN*2, IL1RN*3, IL1RN*4, IL1RN*5 и семь вариантов возможных генотипов: IL1RN*1/1, IL1RN*1/2, IL1RN*1/3, IL1RN*1/4, IL1RN*1/5, IL1RN*2/2 и IL1RN*2/3 (Юсупова и др., 2019) (приложение А: табл. А5-А9).

При сравнении групп больных РЖ со здоровыми донорами согласно их этнической и гендерной принадлежности, а также клинических особенностей заболевания, статистически значимых ассоциаций аллелей и генотипов rs2234663

гена IL1RN с риском развития РЖ не обнаружено (Юсупова и др., 2019) (приложение А: табл. А5-А9).

В литературных источниках есть данные о влиянии аллеля 2 данного локуса на уровень экспрессии гена (Юсупова и др., 2019). Так в 2017 году Raza с коллегами опубликовали работу, в которой исследовали роль полиморфных вариантов генов IL1RN и ILlß в развитии гастрита и РЖ у населения Пакистана, инфицированного бактерией H. pylori. Ученые обнаружили, что для жителей Пакистана, инфицированных H. pylori, повышенный риск развития РЖ ассоциирован с носительством аллеля IL1RN*2 и IL1ß-511*T (Raza et al., 2017).

Аллель IL1RN*2 в качестве маркера повышенного риска развития онкопатологии желудка описывают многие авторы для различных этнических групп, в их числе Wang, Xue, Zhang и другие (Wang et al., 2007; Xue et al., 2010; Zhang et al., 2012).

Нельзя сказать, что полученные нами данные согласуются с результатами научных работ, проведенных в других странах, поскольку статистически значимых ассоциаций аллелей rs2234663 гена IL1RN с риском развития РЖ в Республике Башкортостан не обнаружено (Юсупова и др., 2019). Возможно, увеличение количества испытуемых в обеих репрезентативных выборках позволит нам выявить значимые различия в распределении частот аллелей/генотипов rs2234663 гена IL1RN между больными РЖ и здоровыми индивидами (Юсупова и др., 2019).

3.1.2. Анализ ассоциации полиморфных вариантов rs4073 гена ILS с

раком желудка

В локусе гена ILS идентифицировано множество функциональных SNP, некоторые из которых способны изменять его экспрессию (Цыган и др., 2010).

Нами проведен анализ распределения частот аллелей и генотипов полиморфного локуса rs4073 гена ILS у больных РЖ и здоровых доноров из Республики Башкортостан, результаты которого представлены в таблице 1 4 и в приложении А: табл. А10-А13 (табл. 14, приложение А: табл. А10-А13).

Анализ полиморфного локуса rs4073 гена IL8 показал, что в группе больных чаще встречается генотип rs4073*A/T (53,84%), что в незначительной степени отличается от частоты встречаемости данного генотипа в группе контроля (51,33%). Генотипы rs4073*T/T и rs4073*A/A в группе больных РЖ выявлены с частотами 24,89% и 21,27%, соответственно. В контрольной группе генотип rs4073*T/T был обнаружен у 29,28% индивидов, а генотип rs4073*A/A - у 19,39%. Сравнение частот встречаемости аллелей rs4073*T и rs4073*A в группе больных и группе контроля не выявило существенных различий, в среднем аллель rs4073*T обнаружен с частотой 53,38%, а аллель rs4073*A - с частотой 46,62% (табл. 14). Разделение выборки больных и контроля на подгруппы в зависимости от этнической и гендерной принадлежности, а также клинических особенностей РЖ не выявило ассоциаций описываемого ДНК-локуса с риском развития РЖ (Юсупова и др., 2019).

Изучению полиморфного локуса rs4073 гена IL8 уделяется пристальное внимание, однако результаты исследований весьма противоречивы. Так в Бразилии было показано, что рисковым для развития РЖ является генотип rs4073*A/T, а генотип rs4073*A/A выполняет протективную функцию, в то время как среди населения Польши ассоциации аллелей и генотипов данного полиморфного локуса с риском развития заболевания не обнаружено (Savage et al., 2006; Felipe et al., 2012). В 2017 году Ma с соавторами выяснили, что носительство генотипа rs4073*A/T гена IL8 наряду с носительством генотипа rs16944*C/T гена ILlß может выступать в качестве маркера повышенного риска развития заболеваний, связанных с H. pylori, включая язвенную болезнь и РЖ (Ma et al., 2017). В нашем исследовании показано, что среди татар, больных РЖ, обнаружена выраженная тенденция к увеличению частоты встречаемости аллеля rs4073*A/T гена IL8 по сравнению со здоровыми донорами, однако различия оказались статистически незначимы (табл. 14). Для разъяснения подобных противоречий необходимо провести дополнительные исследования увеличив объем выборки (Юсупова и др., 2019).

индивидов контрольной группы в зависимости от этнической принадлежности

rs4073

Генотип, Больные Контроль Русские Русские Татары Татары

аллель (в целом) (в целом) с РЖ контроль с РЖ контроль

1 2 3 4 5 6 7 8

T/T ni 55 77 27 33 22 29

Pi±Sp 24,89±2,91 29,28±2,81 27,00±4,44 27,27±4,05 22,68±4,25 29,59±4,61

CI % (19,33-31,13) (23,85-35,18) (18,61-36,80) (19,57-36,12) (14,79-32,30) (20,79-39,66)

х2 0,96 0,01 0,87

P (Pfdr) 0,328 ;0,691) 0,915 ;0,994) 0,350 0,525)

A/T ni 119 135 49 69 54 44

Pi±Sp 53,84±3,35 51,33±3,08 49,00±5,00 57,03±4,50 55,67±5,04 44,90±5,02

CI % (47,03-60,55) (45,11-57,52) (38,86-59,20) (47,71±65,99) (45,23-65,76) (34,83-55,28)

X2 0,21 1,11 1,85

P (Pfdr) 0,645 ;0,691) 0,291 ;0,437) 0,174 0,521)

A/A ni 47 51 24 19 21 25

Pi±Sp 21,27±2,75 19,39±2,44 24,00±4,27 15,70±3,31 21,65±4,18 25,51±4,40

CI % (16,06-27,26) (14,79-24,70) (16,02-33,57) (9,73-23,43) (13,93-31,17) (17,24-35,31)

X2 0,16 1,91 0,22

P (Pfdr) 0,691 0,953) 0,168 0,437) 0,641 (0,927)

T ni 229 289 103 135 98 102