Молекулярно-биохимическая характеристика генома хлоропластов и биотехнология безвирусного картофеля в Таджикистане тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, доктор биологических наук Каримов, Музафар

• Каримов, Музафар
• доктор биологических наук
• 1998

Оглавление диссертации доктор биологических наук Каримов, Музафар

ВВВДШ1

шва I. обзор ттЕшти

1.1. ДНК хлоропластов

1.2. ДНК амияопяастов и хромопластов

1.3. Рестрикционный анализ хяоропластной ДНК

1.4. Клонирование ХП-ДНК в бактериях

1.5. Сравнительный рестрикционный анализ ХП-ДЖ разных видов высших растений

1.6. Молекулярная форма хлоропластной ДНК

1.7. Функция хлороплаотного генома

1.8. Идентификация хлоропластных промоторов

1.9. Различия между хлоропластными и прокариоти-ческими промоторами

1.10. Структура промоторов хлоропластных

генов

1.11. Регуляция экспрессии хлоропластных

генов

1.12. Клонирование рзМ и гЪсЬ генов хлоропластов

1.13. Взаимодействие вирусов и хлоропластов

растений

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. Объекты и методы исследования

2.2* Выделение хлоропластной ДНК

2.3» Выделение нлазмидной ДНЕ

2.4. Определение куклеотидного

состава ХП-ДНК

2.5. Определение температуры плавления

ХП-ДНЕ

2.6. Определение плавучей плотности

2.7. Выделение ядерной ДНК из высших

растений

2.8. Приготовление фрагментов ДНК

2.9. Иммобилизация ДНК на нитроцеллюлозных фильтрах

2.10. Биотехнологические методы

ШВА 3. ВЫДЕЛЕНИЕ ПЖТЙДНЫХ ДНЕ ИЗ ВЫСШИХ

РАСТШЙЁ

3.1. Получение нативных протопластов

ячменя

3.2. Процедура получения протопластов

3.3. Выделение из протопластов интактных хлоропластов сельскохозяйственных

растений

3.4. Выделение ДНК из хлоропластов

3.5. Сравнительная оценка выхода ХП-ДНК при

разных методах ее выделения

3.6. Выделение амилопластов и амилопластной ДНК

клуней картофеля

ШВА 4. ШЗЙКО-ЖШШСКЙЕ СВОЙСТВА й РЕСТР1КВДОШМ1

АНАЛИЗ ХЛОРОПЛАСТНЫХ ДНЕ

4.1. Плавучая плотность ДНЕ

4.2. Температура плавления, денатурация и отяшг

ХП~ДШС злаковых растений

4.3. Нуклеотмдяый состав ХД-ДНК злаковых

растений

4.4. Сходство нуклеотидннх последовательностей

Хй-ДЖ злаковых растений

4.5. Рестрикциошшй анализ ХП-ДНК злаковых

растений

4.6. Сравнение геномов хлороиластов и амило-

пластов картофеля

ГЛАВА 5. ОДЗИОДОГО-Вй ОХИМИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ БИОТЕХНОЛОГИИ

КАРТОФЕЛЯ В ТАДЖИКИСТАНЕ

5.1. Размножение и оздоровление исходного посадочного материала картофеля ,

5.2. Выращивание оздоровленного картофеля

5.3. Распределение вирусных болезней по зонам возделывания безвирусного посадочного

материала картофеля

5.4. Размножение картофеля методом зеленого черенкования

5.5. Интенсивность и продуктивность фотосинтеза

разных генотипов картофеля

5.6. Морфофизиологические показатели фотосинтеза картофеля

5.7. Карбоксилазная и оксигеназная активность

РБФКО в онтогенезе листа картофеля

5.8. ЭлектрофоретическиЙ анализ белков оздоровленных клубней картофеля

ШВА 6. ПРОИЗВОДСТВЕННЫЕ ПОКАЗАТЕЛИ ОЗДОРОВЛЕННОГО

КАРТОФЕЛЯ

6.1. Изучение мериетемных линий картофеля в

полевых условиях

6.2. Выращивание оздоровленных тепличных мини-

клубней картофеля в полевых условиях

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ЦИТИРОВАННАЯ ЛИТЕРАТУРА

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-биохимическая характеристика генома хлоропластов и биотехнология безвирусного картофеля в Таджикистане»

ВВЕДЕНИЕ

Исследование структурно-функциональных особенностей хлоропластного генома и его взаимодействия с ядерной генетической системой является важным вопросом современной биохимии и физиологии растений. Это объясняется тем, что о фотосинтетической деятельностью растений связано решение проблемы обеспечения человечества пищевыми и энергетическими ресурсами. Особый интерес представляет исследование генов, ответственных за синтез ключевого фермента фотосинтеза,- рибулозо-1,5-бйофосфат карбо-ксилазы-оксигеназы (К.Ф. 4.1.1.39), ее функциональной активности у различных по типам метаболизма растений. По этой причине интенсивно изучается структурная организация хлоропласт-ного генома с использованием различных рестриктаз и их клонирование, т.е. получение рекомбинантных молекул ДНК для создания банка ценных генов, нужных для генетических манипуляций растений. В этом отношении интенсивно используются хлоропласт-ные гены, ответственные за устойчивость к воздействию экстремальных факторов. Исследования в этом плане только начались, а что касается важнейщих культур возделывания в Таджикистане -хлопчатника и картофеля, они вообще отсутствуют. Вместе с тем, необходимо, прежде всего, изучить особенности этих генов, установить регуляторяый механизм экспрессии в процессе роста и развития указанных растений. Успех в этом направлении может быть достигнут при условии создания банка генов хлоропластного генома.

Молекулярно-биохимическое изучение хлоропластного генома

и создание банка генов связано о трудностями выделения высоко-очищенной ДНК хлоропластов, что ставит новую задачу - разработать методы выделения ДНК, т.к. малые выходы хлоропластной ДНК для ряда сельскохозяйственных растений, служат тормозом в плане познания и управления бшопродуктивностью растений. В связи с этим было необходимо разработать новые методы выделения хлоропластной ДНК с большим нативным выходом. В связи с чем для выделения чистой хлоропластной ДНК необходимо было разработать методы получения протопластов или использовать растения» свободные от вирусов и бактерий, т.е. получение регенерантов из апикальной меристемы, что имеет практическую ценность. Наиболее перспективным в этом плане является картофель, как одна из важнейших сельскохозяйственных культур Таджикистана, поскольку картофель в условиях Таджикистана поражается наиболее сильно вирусными заболеваниями, потери от которых составляют 35-40%. В результате этого в последние годы урожайность картофеля в республике снизилась до 80-100 ц/га.

Вместе с тем исследование генной экспрессии рибулозо-1,5-биофосфаткарбоксилазы-оксигеназы (РВФКО) открывает новые подходы в изучении конкретных механизмов, через которые реализуется кооперация ядерно-цитоплазма^ической и хлоропластной трансляционных систем (Насыров, 1975; »азуго-г 9 1978; Алиев и др., 1991; Алиев, 1995). Карбоксилазная активность РШО имеет важное значение в регуляции фотосинтеза и фотодыхания, а следовательно, и продуктивности раетений. Если исходить из относительного постоянства карбоксилазной и оксигеназной активности ферента, то увеличение фотосинтетичеекой продуктив-

а

ности будет наблюдаться при одновременном повышении фотосинтеза и фотодыхания, © другой стороны, физиологическая роль фотодыхания в форировашш продуктивности не совсем ясна в требует своего решения. Но, очевидно» что положительную связь в продукционном процессе играют карбоксилазная и океигеназная функции РВФКО и их генетическая регуляция. Цели это так, то регулирование фотосинтетичеокой продуктивности будет перспективным.

Реальный путь заключается в получении новых форм растений, обладающих высокими показателями карбоксилазной активности с применением методов биотехнологии, поскольку вирусная и бактериальная инфекции резко снижают фотосинтетическую продуктивность картофеля (Каримов и др., 1997).

Вирусные болезни картофеля широко распространены во многих странах Мира, где он является основным источником питания. Ежегодные потери урожая от вирусных болезней составляют не менее 20-30^, а от такого вируса как вирус скручивания листьев { ь ) - не менее 40$. В настоящее время известно около 20 вирусов картофеля (Зыкин, 1984). Некоторые вирусы могут довольно быстро размножаться в клетках без видимых симптомов, другие -отчетливо проявляются визуально. Независимо от проявления симптомов заболевания вирусы заметно влияют на рстение-хазяина, что сказывается на метаболитичеокой перестройке внутри клетки, на нарушений взаимодействия генетических элементов клетки (хдо-ропласты, митохондрии, ядро). Некоторые авторы причиной нарушения биохимических процессов в клетках склонны считать изменение фотосинтетической функции (Насыров, Муминджанов и др., 1997; Давлятназарова, 1997). Здесь актуальным является выяене-

ние характера взаимодействия генов хлоропластов и генов вирусов, что имеет и практическую основу в создании растений картофеля со свободным от вирусов фотосинтетическим аппаратом, что имеет важное значение в безвнрусном семеноводстве этой культуры.

В основе этого лежат методы получения безвирусной суперэлиты картофеля. Следовательно, необходимо переходить от моле-кулярно-биохимических исследований к клеточным, которые позволяют получить растения-регенеранты, свободные от вирусов. Важ-нешим элементов этой системы является оздоровление перспективных и лучших районированных сортов картофеля в Таджикистане.

Исследования влияния вирусов на фотосинтетическую активность картофеля пока единичны. Поэтому вшяенение биохимических и физиологических основ взаимодействия вирусов не только пополняют наши знания о механизмах, существующих между вирусами и геномом клетки, но также позволят разобраться в механизмах устойчивости растений к этим вредителям природы*

Кроме того, в республике практически отсутствует семеноводство высокоурожайных и устойчивых к болезням сортов. Отсюда большой интерес представляют разработка и внедрение новых биотехнологических приемов в семеноводстве картофеля, с целью внедрения в Таджикистане новых технологий выращивания семенного и товарного картофеля. Одним из перспективных приемов является использование методов биотехнологии в картофелеводстве и выявление некоторых физиолого-биохимических основ безвирусного семеноводства (Каримов и др., 1991; Алиев, Каримов, 1997; Лепешкин, 1997).

Сельскому хозяйству нужны сорта растений, обладающие нетолько высокой продуктивностью, но и устойчивостью к засухе, морозам, заболеваниям, а также к применению химических агентов и к различным вредителям. Такие возможности появятся, если будут найдены эффективные методы переноса генетической информации в растительную клетку* Поэтому начинается поиск природных векторов, т.е. растительных илазмид. Такие плазмиды обнаружены у Агробактерии, которая вызывает заболевание двудольных растений и хорошо рекомендовала себя как эффективное средство переноса генов (Пирузян, 1985).

Предполагается, что в качеств© векторов можно использовать фрагменты хлороплаетной ДНК, но эта задача пока трудно выполнима. С развитием методов молекулярной биологии процесс идентификаций генов, кодирующих хозяйственно-ценные признаки, начал находить свое решение. В тоже время регуляция экспрессии хлоропластных генов остается во многом неясной, несмотря на успехи последних лет. В большой степени это обусловлено отсутствием методов эффективной трансформации хлоропластов высших растений и, следовательно, невозможностью применять методы обратной генетики для хлоропластных генов, а также сложным взаимодействием хлоропластного и ядерного геномов в процессе развития и функционирования пластид (Алиев, 1997). Первое препятствие уже начали преодолевать, т.к. обнадеживающие успехи были ПО трансформаций С&Хажуйотопаз (ВеупЛшж ей &1„ ,1988; вхошеа ей а1. , 1989) и транзитной экспрессии в хлоропластах ВЫСШИХ растений ( Ван1е11 е-Ь &!., 1930).

Данные о структуре и регуляции хлоропластных генов еще

долго будут оставаться фундаментом для изучения этого взаимодействия. Исходя из этого, работа но изучению экспрессии хло-ропластных генов представляет интерес и в плане теоретическом и в практическом, т.е. введение мутантных генов, таких как ген (Ульмасов, 1991) и гена Ер®® -синтетазы (Урмеева, 1991) в хлоропласта, может привести к созданию новых клонов растений, устойчивых к гербициду. Особенно важно использовать в качестве объекта для создания новых форм растений картофеля, поскольку применение регенерантов из разных органов практически разработаны, известно о механизме еамоклоновой изменчивости регенерантов картофеля жта^в . Поэтому разработка и использование культуры меристем картофеля имеет также и практическую направленность (Алиев и др., 1997; Бабаев, 1997; Урузалиев, Алимга-зинова, 1997).

Необходимым требованием к новым сортам картофеля является придание им устойчивости к вирусам, вироидам и грибным заболеваниям. Не менее важное значение имеет устойчивость картофеля к стрессовым воздействиям среды (Каримов и др., 1998; Турпанов и др., 1997; Нуркиянова и др., 1997).

Одним из направлений биотехнологий, которое дает большой экономический эффект, является мик#окловальное размножение растений на безвирусной основе. Урожайность безвируеного картофеля превышает обычную на 20-50$, поэтому получение безвирусного посадочного материала становится одним из лидирующих методов получения элитных семян.

В настоящее время безвирусный меристемный картофель выращивают во всех странах и Таджикистан с его горными и чистыми

в экологическом плане зонами, наиболее перспективен для внедрения системы безвирусного картофелеводства.

Вазой безвирусного семенного картофелеводства в Таджикистане должны стать хозяйства с высокой технологией выращивания, имеющие специалистов высокого уровня и экологически чистую почву и окружающую среду; Всем этим требованиям отвечают некоторые хозяйства Файзабадского, Гарского, Джиргитальского, Ган-чинского и Шахристанского районов (Насыров, Каримов, 1991; Каримов и др., 1991).

Вместе с тем, разработка и внедрение меристемной культуры не гарантирует создание устойчивых сортов картофеля к болезням, нематодам и колорадскому жуку. В связи с этим большое внимание должно быть уделено изучению генетической и кодификационной изменчивости регенерантов картофеля in vitro , а также разработке физиолого-биохимической основы оздоровленных растений, что резко ускоряет получение новых сортов картофеля.

ШВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

q генетической автономности пластид выс-н©£вияиеь в начале нашего столетия (Корренс, 1909; layp, 1909f. цит. п© Насмреву, 1975). Открытиеявленшя, названного вдтеплазматической наследственностью (в ©тличие @т длительнее время не вызывал© ©строг© интереса еледует ©метить, чт® первые пряные дампе © существовании генов в цитоплазме были получены значительно ранее при генетическом анализе групп сцепления у Chlajnydomorias {Sager , 1954; Sager,, Hamilton , 1967; Sager, Ramanis , 1970, 1971a, 1971в). В одной из первых работ биохимического плана с помощью цитохимических методов было показан© наличие III в хлороплаетах высших растений (Сисакян, Черняк, 1952; Омеакян, Одинц©ва, i960). В 1962 г. Рис и Плаут (Bis, Plaut , 1962) и в 1965 г. лев с соавторами ( Kisleir et al. , 1965) с помощью ции цитохимического и эл@ктр®вншик|®©к@нйчеек@г© мет®д@в получили результаты, указывающие на присутствие в хлор©нлаетах дне. Однако они не были уверены в тем, чт© имеет ли обнаруженная ДНК

Молекулярные исследования начались в начале 60-х годов, когда одновременно был© показан© наличие ДИК в растительных пластидах и в митохондриях большинства эукариот (Одинцова, 1976).

Работы К@л©днера И Те вари { Kolodiier, Tewari , 1972, 1975а, I975B, I975C, 1975 d; Kolodner et al., 1975; . Koiodner et аз, 1976) подтвердили жштшв. кольцевых сужерспира-

лаз©ванных XÍI-ДЖ у высших растений, В лизатах ©чищенных нластов гороха, предварительно обработанных ДЖ-зой I, дежроте-ияязярвхшнх додещилеудьфатш ш фенолом, а затеи выдержанных е РЩ-зой и жроназой, исследователи обнаружили 25% циркулярных молекул, из которых треть имела сверхекрученную конфигурацию. В работе 1975 г. Еолоднер и Тевари е помощь© включения в ожиоан-ную выше процедуру градиентного центрифугирования в хлористом цезии с добавкой этидийбромида выделили жрежараты ХП-ДНК из нескольких растений и

формы кольцевых молекул, что позволило про них длин, и, ©«ответственно, молекулярных весов XI-ДЩ. Важно, что часть молекул была представлена в виде кольцевых димеров (3-4%) и катенанов (1-2%). Эти данные были использованы нрм кон-

Развитие работ Кояоднера & Тевари можно найти в ниях Геранна и др. ( неггшшп et al ., 1975). Слегка видоизменив метод Колоднера и Тевари (дополнительная обработка фосфо-диэетеразой и два последовательных центрмфз те хлористого цезия с этмдийбромидоы) Германн и ли жрежараты ХП-ДНК из ©чищенных хлоронлаетов львинного зева, свеклы, шпината, энотеры ш в них наблщали сверхепирализ©ванные молекулы, открытые кольцевые молекулы, а также кольцевые димерн. В дальнейшем кольцевые ДНК были обнаружены в препаратах, выделенных из хлороплаотов и других высших растений. Ниже мы приводим таблицу контурных длин молекул XI-ДНК и вычисленных из них молекулярных весов, заимствованную нами из обзора 1.6J

И4 *

С0 ч ч©

Sf ev-

S en

« M

-о

сэ «к

«Sí

© m

И

s JSS-

О

и

W Ф

tsj ©

38

»

S M

к

к

Я О

о

© в -

н. ■ «Í3S

m 64 ■ s

о s

<яз m® ■

« <K '

ы ■ Ы :■

Ръ

se

jrfj © О

(яз ©

© M

о 39

© M

Pi I

« • S3

аз «

я « «fr -

Ö, ■ « -

Ü5 » f»

« ■ cg S3

© «

« a « я

© РЪ © ^

и s '

© w

as о C0

M »

s ■ .M ■

»

да ©

еч о

» m Í А

M? « ■

Ci, ' I Pt

!>> S

Еч PO

ад

vor fcej

СЛ

<41

M

я

■Б-t СЭ

«SüjJ

О

РЦ

О и

Ри ■О

о m

см m

чо о

trv •fr -Ф

га •ИГ'

iHi

■•H ®

й

й ф

H ЬО

а m

й й

О) Ф

м £f ш

J£3 il

"О U "О

© ©

H H

® ©

î4 M

©

<—( й

о Ф

M W

© Ф

c- ЧО

4» см

СЛ о ж

о •> о а» H «fr

H о H о стч о

1 VO I tr~ t <r\ 1 03 о чо t о 1 i «fr о

л •> m •к M. «к

m «л CD 1А сл с— о со

<T> со 0% 0Л СП о\ СП СТЧ со со

H ем . А

см ы . +■1 +» I

er» £г~ as

*> 4k

lf\ ITN

Ч 00 "Ф

m ф

со

! I

H

* о

M «

+ 1 см

СМ +1

« о

о\

m (л m

•Ф (П

<м

см «к

см

от

M ©

«

f*>

CO. I оз ' -jssj

о

s*

•ssî О

9! ре>

353

Я

Й5 ^

s о

PQ <ЗЭ

« щ

f=5 О

в)

Я

8 «

п >

I "н

® У-Ч. ««—Ч

R Й й К

и да m щ

© « « чэ

РЧ со со со

О О О fr»

•ri

r« «

M -,

Й (й

•H $

4» ф

3 5

öS 0Î >>

Tí +» ®ö td Ы) ra

h p $

> 2 3

CÖ 4®

Ф «

i

■3

• -p

ra o5

eg О

■f» о о

•н

©

_ _ о d в) >н й й Й

К

s

■» &»

а X и X от

¡S5 о о о »

а, а A S!

о о о О e

о Г4 F* a

ч»<»

•н CS

й Ф

ф О

¿Í s S Ш ci Й

о а

о > > > ©

^ •и •н •H г4

43 +» ®

сЗ tí сб (S

й га га ra sâ

ф TÍ

^ Ё S й

4» w

а ♦н •н •H Й

й га ra ra •rî

ф •и •H •H PU

о Рч Ç4 ta

таблицы I

4

Зр±цао1а ©Хегасеа Зрхтас1а о1егасеа 2еа тау© 2еа шауа

45,7±*»9

42,4

ШагоХвзшз ис1©тас1азие (нарцисс) 42,6+1,2

94,6+102,8 94,3-0,6 89,0 84,7-0,6

92,0

хх

Неггтшш et а!., 1975 К©1©&тег, Тежагх, 1975а Мажа±т£ е% а!., 1972 К©1©йаег, Фешаг!, 1975а

^а!к et а1#, 1974

-иг

х - молекулярный вес расчишан по данным кинетики ренатурации, в остальных случаях

на основании длины молекул ДНК. хх - молекулярный вес определен, исходя из того, что масса на единицу длины

с '

составляет 2,16x10 дальтон мкм ( ВоЬпегй , 1973).

данных из приведенной таблицы позволяет заключить, что хлоропластные ДЖ самых различных растений примерно равны i© показателя» молекулярного веса.

Помимо вопроса о сравнении полинуклеотидных последовательностей хлоронластных ДЖ разных растений, что представляет интерес для эволюционных проблем, важными представляются вопросы молекулярной организации.хлоропластн©г© генома« Мы отнесли к ним следующие: внутримолекулярную гетерогенность нуклеотидного состава, наличие рибонуклеотидных сайтов в структуре двойной сжирали, и, наконец, гомогенмооть популяций молекул. Последний вопрос получил свое разрешение с помощью рестрикционног© анализа, в связи с чем нам представляется целесообразным рассмотреть

В дальнейшем под размером генома хлоропластов понимается

нятия генома и молекулы в тон случае, когда в хлоропласте много молекул, правомочно на основе представления об униформности

хп-днк.

Вкутрнмояекуяя|ная гетерогенность XI-piC исследовалась с помощью анализа кривых реаесоциацми фрагментов ХП-ДНК к с помощью денатурационного картирования. 1з кривых реассоциации можно также произвести вычисления размера генома II, что и бит еделано для целого ряда объектов.

Бастиа и др. ( Bastía et al ., 1971) из анализа кривых плавления и реассоциации ХП-ДНК хламидомонады пришли к выводу о внутримолекулярной гетерогенности нуклеотидного состава и m«¡ чили данные @ кинетической ©ложности, соответствующей 2.В$даль-

т©и. На внутримолекулярную гетерогенность нукяе©тидн©г§ с ©с та ва XI-IUC указывали: { Weil.®, sager , 1971) у хламйд@м®нады, ( Вауеш, Rode , 1973) у хл@рвлл1, ( Stutz., Yaadrey , 1971) у эвглены. 1 июелек©лъцев©й нери©ди в работах К©л©днера и Хевар { Kolotor, JEewari ? 1972, 1975а), Валь#1 ( WaXbot , 1977)

фракций Х1-Д11. Вну-ттшщ у II-, с пеыощью денатурациени { Koloteer, 3|е*а±1_ , 1975а). В Х1~ДНК героха были 1-1 i Г-Ц #©гатые участки, занимающие 1-2% ©§щей длины метод йозюяяет южучмть сведения © гетерогенности же в д©стат@чн© резких различий у соседних участк©». 1©н©я1й' тельные сведения ® наличии г@тер©гекн®ети м@жн© получить в работе Милленза и др. { Mielenz et al ., 1977), k©t@fl ли градиентншу центрифугированию ХП-ДЖ эвглены ж@сле ки ее рестрйкци@нн@й нуклеазой ecori и провели электрофорез фрагментов из тяжелой, средней и легкой фракции градиента. Гетерогенность icoRi -фрагментов ХЙ-ДНК по нукле©тшдн©му составу ipe-явйл©сь в том, что распределение ecori -фрагментов в гелях у разных фракций был© не одинаковым {Андрианов ш др., 1978). В ла-биохимичеекой генетики Мнститута ©бщей генетики АН СССР » доказательства, чт© гетер@генн@етысоЕ1 ~ фрагментов сохраняется жри клшнр©ва1ши их в Е»еом м, что важно для развития дальнейших исследований, клонирования материала хл©р©нластж©й природы, эти исследования ©пределали нуклеэтндный состав жри добавке актямиадина Д.

1а примере жлазшиды к©лйцин©генноети coiei е.coli

( Clewell, Eelinski , ( Grossmaim et al., 1973) был® ЖОКазаН©, ITt ЭТИ ВНехрШОСШ-шт элементы несут i структуре дв@1н©й опирали короткие рибшук-леотидные вставка. Для плазмиды Goisi были подучены доказательства, что рибонуклеотиды имеют отношение к инициации ДМК-ренли-кации и наиболее представлены у молекул, реплицирующихся в условно синтеза хл©рам|еник®л@м ( Clewell,. Kelinski- , 1972). Риб®-нуклеотидные вставки в числе 19 меет были найдены я в Xi-ДМК гороха И шпината ( Kolodner et al 1975).

Таким tipas ©м, было доказан©, что ДНЕ хлор©пласт©в имеет еверхекрученную структуру и находится в виде

I.E. ДНК амидопдастos и

и

растениях тесно связаны с кого ажнарата. Ясно, чт© сов явялется сравнение

пластид в высших

генетичес-разработке этих в©жр©-параметров ДНК пластид раз-

этапом в

пластиды цветков высших как и хл@р©Еласты, содержат ДНК. Первое

ДНЕ из

- хрен©пласты, о выделении

СHerrmaim

í). Через два года Фальк и соавт. ( Falk et al., 1974), используя процедуру Маннинга И соавт. (Marming et al., выделили препараты ДНК из очищенных хромопластов нарцисса и в них обнаружили сверхскрученные кольцевые молекулы ДНК. Контурная длина этих молекул ©казалась равной 42,€ мкм, что в перес-

чете на открытую кольцевую форму (между эяи двумя формами есть небольшая разница в нользу открытой формы) составило 44 мши Вутке ( Wuttfee ,1976) из хршшластов тюлыана ( ïuXip gesae-riaraa ) также выделил кольцевые молекулы о контурной длиной 43,6 мкм, что ©©ответствовало молекулярному весу ДЖ пластиды

в 92 мегадальтонов.

что

величины жолностью

идентичны друг, другу и весьма близки к величинам молекулярных веоов ДЖ из хромопластов других высших раотений. К сожалению, в этих исследованиях не был жроведен сравнительный анализ ДНК хромонлаетов и хлоропластов этих же растений« что могло бы дать информацию о сходстве хлоронлаетног© и хромонластного генома.

Значительно меньше известно о генетическом материале пластид, запасающих продукты метаболизма растений. Первые данные © в запасающих пластидах были жолучены ртохимическим ï-Бельговекая, 1959). Биохимическими исследованиями амилопластов клубней картофеля был© доказан© наличие в них РЖ и да (Вечер, Масько, 1966; Конарев, 1966; Badenhuizen ,

S alema , 1968; Salema,, Badenimizeii , 1969; Badealmizea , 1973). Баденхойзеном ( Badenhuizea , 1969) электронномикроекони-ческим методом в сочетании с ради©автографией i экспериментах m vivo на заиасащей ткани клубней картофеля было показано,

3 " г.........

что ír-урйдин ш I-тшидйн включался в© фракцию амилопластов.

следует отметить исследования соавт. (Лобов и др., 1977). В амилопластах картофеля была обнаружена ДНК и исследованы ее физико-химические характеристики: температура плавления и гинерхромный эффект. Был© обнаружено, что ДНЕ амилонлаетов отличается (в сторону уменьшения) so темпе-

ратуре плавления of ядерной ДНК, что свидетельствует с

составе ДНК ядер ш запасающих пластид. ДНК ка амилопласт, ©опасно эт©1

«.тс

to® порядка I.IÖ г, чт© жримерн© в 10 раз йены© ДНК на хлоропласт.

1.3 J

анаша

МЛ

л© принципиально н©вые возможности перед молекулярной генетикой. Главное свойств© рвет|йкщи©йннх #ермент@в - расщеплять ДНК в местах узнаваемых специфических последовательностей гукжеотидов, что позволяет исследователям разделять большие молекулы на ряд фрагмент®®, ©тделять шх друг es друга и тем ©ашм подвергать ажали? зу отдельные ген-снецифические участки. St© открыл© путь к расшифровке первичной структуры индивидуальных генов, ные эндонуклеазы нашли применение как ©дин из главных тов в технологии рек©м#ивантдах молекул (генетической и, что особенно важно для данной работы, в сравнительном анализе дж различных видов сельскохозяйственных растений (пшеница,

идр:.).

<леазы подразделяются на два основных класса - 1 и II. В задачу обзора не входит подробное изложение генетических механизмов ш детерминант феномена рестрикции и модификации. Отметим лишь, чт© этот феномен связан с механизмами защиты бактериальной клетки ©т чужеродной генетической информации, чт© выражается в расщеплении чужеродной ДНК энд©нуклеаз@й рестрикции. Собственная ДНК не разрушается этим ферментом, так как

сопряженная с рестрикцией система модификации метилирует ©снования в тех последовательностях, которую узнают реетрикционные эндонуклеазы, что приводит к модификации сайта узнавания. I© номенклатуре рестрикционных эндонуклеаз и метилаз, Смитом И На тане ОМ ( Smith, Hathans ем фермента рестрикции ставится в. » затем следуют первые буквы рода и вида микроорганизма - источника фермента, а также (если таковая идентифицирована) и нервые буквы генетической детерминации. 1ажриме|, наиболее широк© применяемый фермент EcoRI имеет источником кишечную палочку E*coii и в качестве генетической детерминанты - плазмиду R . Поскольку R плазмида контролирует синтез двух рестриктаз, т© для обозначения выше указанного фермента используется римская I.

Реетрикционные эндонуклеазы I класеа отличаются от ферментов II класса тем, что они производят расщежленме ДНЕ не в сайтах узнавания. Они имеют сложную структуру, требуют для своей работы источник энергии в виде АТ#, донора метильшх груш s -аденозиздетионша и ионов магния.

Реетрикционные нуклеазы II класса - это ферменты, иежользовани© которых дает исследователям перечисленные выше возможности. 0ни имеют молекулярный вес и действуют в сайтах узнавания. Ферменты II класса узнают тетра, яента и гекеануклеотиднне последовательности о разным

особенностью рестрикционных эндонуклеаз являет-линких концов у фрагментов ДЖ после ее раещеж-способ действия рестрикционных нуклеаз этого

типа на примере Ecori. Этот фермент, состоящий ив двух единиц с молекулярным весом порядка 30.600 дальтон, был очищен до гомогенного состояния { Green et ai», 1574)* Е©следователь-нос ть узнавания EcoRI. представлена ниже ( Hedgpeth et aji972):

- Р*А á ! ! У -

-lï! A IP -

Стрелками указаны связи, расщепляемые ферментом. Как видно, из характера жалиндромног© строения последовательности, вытекает, что ферменты могут быть связаны по липким концам за счет

как в яримом, так и в ©братнш направлении. Кроме т@г@, ясно, что связаны могут быть ecori -

любой природы, что дает возможность генетической инже-аналогию рекомбинации, т.е. в пробирке связывать чужеродные молекулы ДНК.

Из группы фрагментов, узнающих гексануклеотидные сайты и яроизводящих липкие концы, отметим рестрактазм sail , BamHi , BamHix , Hindin . Фрагменты ДЖ разной природы, генерируемые этими ферментами, были клонированы в кишечной палочке.

нескольких аспектов применения рестрикционных эндо-©тметим два, имеющих непосредственное отношение к ДЖ

выевих растений. Это клонирование генетической инфо-с немощью векторных плазмид и создание физических карт генома хлoponластов, сопряженное с локализацией отдельных генов. Этим исследованиям предшествовали рб©ты, в которых был прове-

йервые сведения по этшу вопросу были получены в 1976 г. и др., 1976;

и др., 1976). Они нровели ©б-

работку хл©р©1ластн@й ДМК гороха рестриктазой Ecori и мосле электрофореза в агарозном геле наблюдали 21 полосу, причем некоторые полосы с фрагментами ДНК обладали более интенсивным свечением при освещении ближним УФ после их ©краски этидийбро-мид©м. Авторы сделали выв©д о том, чт© в этих полосах м@гут находиться фрагменты ДНК, либо принадлежащие п©вт©рам последовательностей нукле©тид©в, или ,же фрагменты, неразделяемые при использованном режиме электрофореза вследствие близких значений молекулярных весов.

Сходные результаты для других ХП-ДНК были получены Веде-лем И др. ( Vedel et al 1976) й АЧИСОНОМ И др. ( Atehi-SQ® et al., 1976). Бедбрук И 1©Г©раД ( Bedbr&ofc, B@g@rad. , 1976), используя для рестрикции хлороилаетной ДЖ кукурузы различные эндонуклеазы и агарозные гели разной концентрации, получили при разделении фрагментов ©т 8 д© 17 пол©© дискретных з@ж. G помощью энденуклеазж Sail хлоропластную ДЙК кукурузы в §,75% агар®зн©м геле удалось разделить на 8 фрагментов, тогда как использование Basti в 0,85% агарозы позволило наблюдать 17 полос.