Особенности структуры и эволюции пластидных геномов паразитических и хищных растений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Груздев Евгений Владимирович

• Груздев Евгений Владимирович
• кандидат наук
• 2021

Оглавление диссертации кандидат наук Груздев Евгений Владимирович

СОДЕРЖАНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. История обнаружения ДНК в пластидах

1.2. Структура и генный состав пластидных геномов

1.3. Паразитические растения

1.4. Хищные растения

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Пластидный геном микогетеротрофного растения Monotropa hypopitys

3.2. Пластидный геном паразитического растения Diphelypaea coccinea

3.3. Пластидный геном хищного растения Drosera rotundifolia

3.4. Пластидный геном хищного растения Nepenthes х ventrata

3.5. Структурные перестройки и потери генов в пластидных геномах хищных ^

растений

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Большинство растений являются фотоавтотрофными организмами, получая органические вещества в результате фотосинтеза. Однако, две группы растений, паразитические и хищные, способны получать питательные вещества из других организмов. Паразитические растения могут получать питательные вещества либо напрямую от других растений, либо от микоризных грибов (микрогетеротрофы). Растения-паразиты зависят от органического углерода, получаемого от их хозяев. Некоторые из них сохраняют фотосинтез, но известны и полностью нефотосинтезирующие виды. У хищных (насекомоядных) растений получаемые питательные вещества в основном используются как источник азота и фосфора. Хотя хищные растения могут получать из своей добычи и органический углерод, все они зависят от фотосинтеза и не могут расти гетеротрофно.

В настоящее время известно около 700 видов хищных растений и более 3500 паразитических. Обе группы являются полифилитическими, так паразитизм возникал в процессе эволюции независимо не менее 11 раз, а хищничество минимум 6 раз. Несмотря на независимое происхождение, наблюдается конвергенция по морфологическим и физиологическим признакам, как среди паразитических растений, так и среди хищных. Общими признаками паразитических и хищных растений являются сниженная зависимость от фотосинтеза, сокращение доли фотосинтезирующих тканей.

Сниженная зависимость от фотосинтеза отражается на пластидах - клеточных органеллах, участвующими в фотосинтезе. Эти органеллы имеют собственный геном, содержащий гены фотосинтетического аппарата и гены «домашнего хозяйства». Пластидные геномы (пластомы) паразитических и хищных растений являются удобной модельной системой для изучения влияния сниженного селективного давления на функцию фотосинтеза на геном растения. Невостребованность фотосинтетической функции хлоропластов у паразитических растений сказывается на структуре пластидного генома и наборе содержащихся в нем генов. Практически неизвестно, каким образом способность получать питательные вещества из других организмов сказывается на пластидном геноме хищных растений.

Таким образом, задача изучения структуры и генетической организации пластидных геномов хищных и паразитических растений является актуальной и представляет интерес для фундаментальных исследований эволюционных процессов, сопряженных с переходом растений к паразитизму и хищничеству.

Степень разработанности темы

С появлением технологий высокопроизводительного секвенирования открылась возможность массового прочтения органелльных геномов растений. В настоящее время известно более 5700 полных последовательностей пластидных геномов наземных растений (согласно данным NCBI). Первый пластидный геном паразитического растения бы просеквенирован еще 30 лет назад (dePamphilis and Palmer, 1990) и к настоящему времени их известно уже несколько десятков. Анализ этих геномов показал, что почти у всех гетеротрофных растений наблюдается редукция пластидных геномов, от минимальной у фотосинтезирующих гемипаразитов до экстремальной у нефотосинтезирующих эндопаразитических видов и даже его полной потери (Rafflesia lagascae, Molina et al., 2014). Паразитические растения могут получать питательные вещества напрямую от других растений (прямые паразиты), либо через микоризу грибов (микрогетеротрофы). Микогетеротрофия независимо возникала, по крайней мере, в 50 линиях растений. Большинство микрогетеротрофов относятся к однодольным. В отличие от растений-паразитов, на момент начала этой работы было просеквенировано менее десятка пластомов микогетеротрофных растений, все они представляли однодольные. Поэтому в качестве одного из объектов исследования был выбран подъельник обыкновенный (Monotropa hypopitys), представляющий семейство двудольных растений Ericaceae. Второй объект - редкое и малоизученное паразитическое растение Diphelypaea coccinea семейства Orobanchaceae, которое включает как автотрофные виды, так и гемипаразитов и нефотосинтезирующих голопаразитов. Это семейство является идеальной модельной группой для изучения эволюции пластидного генома на разных этапах перехода к паразитизму (Wicke et al., 2013). Пластидный геном Diphelypaea coccinea использован нами для сравнительного анализа пластидных геномов Orobanchaceae, а также уточнения филогенетического положения рода Diphelypaea.

В отличие от паразитических растений, пластидные геномы растений-хищников изучены мало. На момент начала нашей работы было просеквенировано всего 4 генома хищных растений (Pinguicula ehlersiae, Utricularia macrorhiza, Utricularia gibba и Genlisea margaretae), все они представляли семейство Lentibulariaceae (порядок Lamíales). Их анализ выявил отсутствие структурных перестроек в пластомах, потерю генов NAD(P)H дегидрогеназы у двух из 4-х видов, а также увеличение скорости накопления мутаций в отдельных генах. В качестве хищных растений-объектов исследования выбраны представители порядка Caryophyllales - росянка круглолистная (Drosera rotundifolia, семейство Droseraceae) и непентес (Nepenthes х ventrata, семейство Nepenthaceae).

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Особенности структуры и эволюции пластидных геномов паразитических и хищных растений»

Цель работы

Изучение особенностей структурно-функциональной организации и эволюции пластидных геномов хищных и паразитических растений.

Задачи работы

1. Определение полных нуклеотидных последовательностей пластидных геномов паразитических растений Monotropa hypopitys и Diphelypaea coccinea, и хищных растений Droseria rotundifolia и Nepenthes х ventrata.

2. Аннотация последовательностей исследуемых пластидных геномов.

3. Определение структурных особенностей организации исследуемых пластидных геномов.

4. Сравнительный анализ исследуемых геномов с другими гетеротрофными и автотрофными растениями по структуре и набору кодируемых генов.

Научная новизна

Впервые определены и проанализированы полные нуклеотидные последовательности пластидных геномов паразитических растений Monotropa hypopitys и Diphelypaea coccinea, и хищных растений Droseria rotundifolia и Nepenthes х ventrata. Выявлены особенности структуры пластидных геномов, наборы присутствующих в них генов, вывалены сходные изменения на разных стадиях эволюции пластидных геномов хищных и паразитических растений. Показана функциональная потеря генов фотосинтетического аппарата не только в пластидном, но и в ядерном геноме M. hypopitys.

Научная и практическая значимость

Полученные результаты вносят вклад в понимание механизмов эволюции пластидных геномов растений при переходе от полностью автотрофного образа жизни к паразитизму или хищничеству. Сходные изменения наблюдаются в разных эволюционных линиях. На ранних этапах перехода к паразитизму растение сохраняет способность к фотосинтезу, а хлоропластный геном сохраняет консервативную структуру и набор генов. Такое же состояние хлоропластного генома обнаружено нами у хищного растения Nepenthes x ventrata. Следующий этап редукции хлоропластного генома при переходе к паразитизму - масштабные структурные перестройки, сопровождающиеся потерей генов, функционирование которых не критично для функции фотосинтеза (в первую очередь NAD(P)H дегидрогеназы), но с сохранением генов фотосинтетического аппарата. Этот этап редукции хлоропластных геномов характерен для многих фотосинтезирующих гемипаразитов. Подобные же изменения хлоропластного генома наблюдаются у D. rotundifolia. Еще одной общей чертой, пластидных геномов паразитических и хищных

5

растений, является «упрощение» собственного тгенетического аппарата, выражающееся в потере интронов и сайтов редактирования РНК в сохранившихся генах. На последующих этапах, возможных только у растений-паразитов, но не хищников, происходит потеря генов аппарата фотосинтеза. Вначале, несмотря на обширные перестройки пластома и потери генов, ещё сохраняется типичная четырехсекторная структура, как у D. coccinea. На более поздних этапах, соответствующих состоянию пластома M. hypopitys, продолжаются потери генов «домашнего хозяйства» пластид, сокращение размера пластома и полностью утрачивается его четырехсекторная структура.

Личный вклад автора

Личный вклад соискателя состоит в анализе литературных данных, планировании и проведении основных экспериментов, обработке полученных экспериментальных данных, анализе результатов и подготовке публикаций. Образцы растений M. hypopitys, D. rotundifolia и D. coccinea и препараты РНК из M. hypopitys и D. rotundifolia были предоставлены сотрудниками лаборатории системной биологии растений ФИЦ Биотехнологии РАН. Работы по биоинформатическому анализу проводились совместно с А.В. Белецким (ФИЦ Биотехнологии РАН). Работы по секвенированию на Illumina HiSeq2500 были выполнены компанией «Мой Ген». Имена соавторов работы указаны в публикациях.

Методология и методы исследования

Исследования выполнены с использованием современных методов молекулярной биологии, биоинформатики и генетической инженерии. Для расшифровки полных нуклеотидных последовательностей пластидных геномов и транскриптомного анализа использовали методы высокопроизводительного секвенирования - пиросеквенирование и технологии Illumina. Биоинформатическую обработку данных проводили с использованием общепринятых методов и программ на сервере ФИЦ Биотехнологии РАН. Для аннотации геномных последовательностей использовали веб-сервис DOGMA и базы данных NCBI.

Положения, выносимые на защиту

1. Пластидный геном микогетеротрофного растения Monotropa hypopitys по сравнению с типичными пластидными геномами фотосинтезирующих цветковых растений редуцирован по размеру, структурно перестроен и не имеет типичную четырехсекторную структуру. В пластидном геноме M. hypopitys отсутствуют гены NAD^)H дегидрогеназы,

6

гены фотосинтетического аппарата, АТФ синтазы и РНК полимеразы, гены ycf1 и ycf2, а также некоторые консервативные гены тРНК и рибосомных белков.

2. Большинство локализованных в ядерном геноме у фотосинтезирующих цветковых растений генов компонентов фотосинтетического аппарата пластид и генов пути биосинтеза хлорофилла у M. hypopitys не экспрессируются или потеряны.

3. Пластидный геном паразитического растения Diphelypaea coccínea редуцирован по размеру, характеризуется большим числом перестроек по сравнению со стандартной структурой пластома цветковых растений, но сохранил четырехсекторную структуру. В пластоме отсутствуют гены NAD(P)H дегидрогеназы, гены фотосинтетического аппарата, АТФ синтазы и РНК полимеразы, а также 5 консервативных генов тРНК.

4. Пластидный геном насекомоядного растения Drosera rotundifolia характеризуется большим числом перестроек по сравнению со стандартной структурой пластома цветковых растений и значительной долей повторяющихся последовательностей. В нем отсутствуют гены NAD(P)H дегидрогеназы, гены ycf1 и ycf2, а также три консервативных гена тРНК. Количество сайтов редактирования РНК пластоме Drosera rotundifolia меньше, чем у большинства фотосинтезирующих цветковых растений.

5. Пластидный геном насекомоядного растения Nepenthes x ventrata по структуре и набору генов отличается от типичных пластидных геномов цветковых растений только отсутствием полноразмерного гена ccsA, участвующего в биогенезе цитохромов С.

6. В эволюции пластидных геномов хищных и паразитических растений обнаруживаются сходные изменения, в том числе структурные перестройки пластома, потеря некоторых генов, потеря интронов и сайтов редактирования РНК в сохранившихся генах.

Степень достоверности и апробация результатов

Результаты были получены с использованием современных методик и качественных расходных материалов на исправно работающем оборудовании. По теме диссертационной работы опубликовано 5 статей в рецензируемых научных изданиях, рекомендованных для защиты в диссертационном совете МГУ по специальности 03.01.03 - молекулярная биология.

Материалы работы были представлены на 20-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука 21 века" (Пущино, 2016), The 10th International conference on bioinformatics of genome regulation and Structure\Systems biology (BGRS\SB-2016)" (Новосибирск, 2016), The Global Conference on Plant Science and Molecular Biology (Валенсия, Испания, 2017), The 5th Conference on Plant Genome Evolution (Ситжес, Испания, 2019).

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1 История обнаружения ДНК в пластидах

Пластиды - полиморфные органеллы растительных клеток, играющие важнейшую роль в процессах энергетического обмена и фотосинтеза. Наиболее распространённой формой пластид являются хлоропласты, осуществляющие процессы фотосинтеза, другие формы пластид участвуют в синтезе и хранении сложных органических соединений (хромопласты, лейкопласты), некоторые формы лейкопластов задействованы в геотаксисе. Обычно все пластиды разделяют на две группы: окрашенные (хлоропласты и хромопласты) и лишённые пигмента (лейкопласты, амилопласты, элайопласты, протеинопласты и этиопласты). Интересно, что все формы пластид тесно связаны сетью взаимопревращений, при этом онтогенетическими предшественниками всех типов пластидов служат не дифференцированные протопласты. Несмотря на различные функции и морфологическое строение, все типы пластид характеризуются двумя ключевыми особенностями: наличие двойной мембраны и присутствие собственного генома (Sato, 2007).

Впервые пластиды были описаны как «гранулы растительной клетки» Comparetti в 1791 году (Даниленко и др. 2003), однако первое описание и термин пластиды обычно приписывают Franz W.S., который также отметил некоторое сходство пластид с цианобактериями в своих работах 1883-1885 годов. В дальнейшем предположение связи между пластидами и цианобактериями было развито отечественным биологом К.С. Мережковским в теорию симбиогенеза. Согласно данной концепции пластиды проявились в результате захвата растительной клеткой цианобактерий. На цианобактериальное происхождение пластид указывало их внутреннее строение, размеры и способ репродукции (обзоры Wolf, 2012; Захаров, 2010), а как было выяснено позже - и структура генома. Стоит отметить, что современник Мережковского - А.С. Фаминцын так же рассматривал происхождение хлоропластов в результате симбиогенеза, однако, по его мнению, предшественниками пластид были не цианобактерии. Первоначально теория симбиогенеза была воспринята неоднозначно научным обществом, однако, во второй половине ХХ века была широко принята. В настоящее время, эволюционная связь пластид и цианобактерий имеет множество подтверждений (Martin et al. 2012, Turner et al. 1999; Xu. et al. 1990).

В 1909 Бауэр и Коренс опубликовали первые данные о не-менделевском наследовании, основанных на исследовании окраски высших растений. На некоторых пятнистых бело-зеленых листьях было показано, что их наследование не подчиняется

законам Менделя, а дальнейший анализ показал, что генетические детерминанты данных признаков связаны с хлоропластами. Более того, сложность получения специфических пластидных мутаций для изучения не-менделеевского наследования, явилась причиной того, что большая часть данных о внеядерной генетике были получены на одноклеточных водорослях Chlamydomonas (Sugiura, 1992). Демонстрация уникальности хлоропластной ДНК сподвигла к активным исследованиям её структуры и экспрессии. Начиная с середины 1970-х появившиеся технологии клонирования и секвенирования ДНК значительно способствовали исследованиям пластидных геномов. Так в 1976 была создана первая физическая карта хлоропластного генома кукурузы (Bedbrook and Bogorad L. 1976), а первый ген был проклонирован уже в 1977 (Bedbrook et al., 1977).

Наличие двухцепочечной высокомолекулярной ДНК в хлоропластах было продемонстрировано центрифугированием в градиенте CsCl (Chun et. al. 1963). С тех пор метод центрифугирование в градиенте CsCl широко использовался для идентификации и выделения хлоропластной ДНК из растений. (Sager and Schlanger. 1976) Однако, на ранних этапах затруднение вызывала схожая плавучесть хлоропластной и ядерной ДНК. В дальнейших исследованиях хлоропластную ДНК получали из очищенных интактных хлоропластов. Впервые кольцевая структура хлоропластной ДНК была показана с помощь методов электронной микроскопии. На препарате из хлоропластного лизата Euglena были обнаружены кольцевые структуры ДНК с окружностью в 44,5 мкм. (Manning. et al. 1971) Далее кольцевые хлоропластные ДНК обнаружены у множества других растений. Было обнаружено, что длина окружности хпДНК внутри вида постоянна, а идентичность молекул показана с помощь рестрикционного анализа (Bedbrook and Kolodner 1979). Впервые кольцевая рестрикционная карта была построена для хлоропластной ДНК кукурузы (Bedbrook and Bogorad 1976), позднее для кукурузы было показано, существование и линейных хлоропластных геномов (Oldenburg and Bendich, 2004).

1.2 Структура и генный состав пластидных геномов

Впервые полные хлоропластные геномы были просеквенированы у Marchantía polymorpha (Ohyama et al. 1986) и Nicotiana tabacum (Рис. 1.1) (Shinozaki et al. 1986). В настоящее время в открытых базах данные доступна информация о нескольких тысячах хлоропластных геномах растений и водорослей.

Большинство хлоропластных геномов покрытосемянных имеют размер 120 - 160 т.п.н. (Palmer 1985) Однако, встречаются значительные отклонения, так минимальный геном из известных принадлежит Pilostyles aethiopica - 11348 п.н. (Bellot and Renner. 2015), а максимальный Pelargonium endlicherianum - 230 т.п.н. (Weng et. al, 2017).

i

Я ШЮТ* WBHI». ILS№

П мало Ъалт tren

■ <»Vt

□ <* ractatfo

Рисунок 1.1. Генетическая карта хлоропластного генома N. tabacum (NC_001879.2).

Обычно геном пластид представлен однородной популяцией хпДНК. Однако,

некоторых случаях, например, у бурой водоросли Pylaiella littoralis хлоропластный геном

представлен молекулами двух типов, имеющих размер 133 т.п.н. и 58 т.п.н. Несмотря на

то, что большинство хлоропластов содержат гомогенные популяции хпДНК, часто

встречается, что в одной популяции молекулы имеют разнонаправленные однокопийные

10

участки (Palmer 1983). Так же в популяциях встречаются в малых количествах димерные, тримерные и тетрамерные формы.

Одной из главных особенностей структуры пластидных геномов является наличие протяженных инвертированных повторов. Длина инвертированных повторов в пластидных геномах наземных растений обычно варьирует в пределах от 5 т.п.н. до 30 т.п.н. (на один повтор). В большинстве случаев разница в размере хлоропластных геномов и числе генов обуславливается именно разницей размеров инвертированных повторов. Инвертированные повторы разделены большим (LSC) и малым однокопийными участками (SSC, рис. 1.1, табл. 1.1)

Для хпДНК характерно низкое содержание GC-пар, доля которых составляет обычно 30-40% (Shimda and Sugiuro 1991). Большинство растительных хлоропластных геномов содержат около 70 уникальных белок-кодирующих генов, а также около 40 генов, кодирующих тРНК и рРНК (Reith and Munholland 1995, Sato et al. 1999, Ohta et al. 2003) (Табл. 1.1). Гены, кодируемые хлоропластным геномом можно разделить на три большие группы (Табл. 1.2): (1) гены собственного генетического аппарата, (2) гены фотосинтетического аппарата и (3) все оставшиеся гены, в том числе и кодирующие консервативные рамки считывания с неизвестной функцией.

Гены собственного генетического аппарата кодируют рибосомные РНК (rRNA гены), включающие субъединицы 16S, 23S, 5S и 4.5S рРНК. В некоторых случаях состав субъединицы рРНК может отличаться, так у некоторых водорослей, например Chlamydomonas имеются дополнительные гены 7S и 3S рРНК, в то время как у Euglena gracilis отсутствует ген 4,5S рРНК. Наряду с генами рРНК, хпДНК содержит гены большой (rpl) и малой (rns) субъединиц рибосомы. В сборке хлоропластной рибосомы участвуют около 60 белков, в среднем 25 белков для построения малой субъединицы и 35 белков - большой субъединицы (Eneas-Filho et al., 1981). ХпДНК кодирует около 25 рибосомных белков, остальные кодируются ядерным геномом. Например, хлоропластная рибосома табака содержит 58 белков, из них 24 белка составляют малую субъединицу и 34 - большую, из них пластом содержит гены, кодирующие только 21 белок (12 для малой и 9 - большой), остальные содержатся в ядерном геноме (Shinozaki et al. 1986).

Помимо компонентов рибосом, к первой группе генов, относятся гены тРНК. Всреднем пластидный геном содержит около 30 генов. Предполагается, что недостающие тРНК могут переносится из ядра, однако прямого подтверждения этому пока нет (Sugiura 1992, Sugiura et al. 1998).

Первая группа генов также включает гены РНК-полимеразы. Хлоропластная РНК-полимераза имеет структуру подобную полимеразе E. coli. Хлоропластная РНК-

11

полимераза кодируется четырьмя генами: rpoA, rpoB, rpoC1 и rpoC2 (Sugiura 1992). К собственному генетическому аппарату, также относится ген matK, кодирующий интронную матуразу. Этот фермент участвует в вырезании интронов из пластидных мРНК. Интересно отметить, что, как правило, сам ген matK расположен в интроне одного из генов тРНК.

Таблица 1.1. Структуры хлоропластных геномов растений (Wakasugi et al., 2001).

Растения Общий размер (пн) Инвертированные повторы (пн)с Количество генов Количество интронова

Однодольные Oryza sativa 134525 20799 110 18/16

Zea mays 140387 22748 110 18/17

Triticum aestivum 134540 20702 110 18/18

Двудольные Nicotiana tabacum 155939 25341 113 21/18

Spinacia oleracea 150725 25073 113 20/17

Arabidopsis thaliana 154478 26264 113 21/18

Oenothera elata 159443 27807 112 19/17

Lotus japonicus 150519 25156 111 20/18

Epifagus virginianaa 70028 19799 42 8/6

Голосемянные Pinus thunbergi0 119707 495 108 16/14

Папаротник Psilotum nudum 138829 18954 118 19/17

Мхи Marchantia polymorpha 121024 10058 122 20/18

a, - не фотосинтезирующее паразитическое растение

b, - не содержит генов NAD(P)H-дегидрогеназы

c, - без учетаycf15 иycf68-76

d, - число интронов/генов с интронами.

Таблица 1.2. Основные гены хпДНК у цветковых растений

Белковый комплекс/ Кол-во Набор генов

функциональная категория генов

Группа I: Гены собственного

генетического аппарата

РНК полимераза 4 гроА, гроВ, * гроС1, гроС2

Матураза 1 таК

Фактор инициации трансляции 1 т/А

Белки малой субъединицы рибосомы 14 гр&2, rps3, гр&4, гр&7, гр$8, rps11, *rps12, rps14, гр&15, * гр&16, гр&18, ^19

Белки большой субъединицы рибосомы 11 *гр12, гр114, * гр116, гр120, гр122, гр123, гр132, гр133, гр136

рРНК 4 ггп23, ггп16, ггп5, ггп4.5

тРНК 30 * КпА-иОС, ^пЯ-АСО, КпК-иСи, гтЫ-вии, гтВ-ОШ, КпС-ОСА, trnQ-ииО, 1тпЕ-ииС, 1тпО-ОСС, * 1тпО-иСС, ^пИ-ОиО, * Ш-ОАи, Ш-САи, * ШЬ-иАА, ШЬ-САА, ШЬ-иАО, * ^пК-иии, Ш/М-САи, ^пЫ-САи, ПпР-ОАА, 1тпР-иОО, ШБ-ООА, ШБ-иОА, ^пБ-ОСЦ ^пТ-ООЦ ^пТ-иОЦ ^пШ-ССА, ШУ-ОШ, ^пУ-ОАС, * ^пУ-ШС

Группа II: Гены фотосинтеза и

энергетического обмена

Фотосистема I 5 ртА, ртВ, ртС, рт1, р&аЗ

Фотосистема II 15 psЪA, psЪB, psЪC, psЪD, р&ЪЕ, р&Ъ¥, р&ЪИ, р$Ы, psЪJ, р&ЪК, psЪL, psЪM, р^^ЪШ, psЪT (ус/8), р&Ъ2 (ус/9)

Комплекс цитохрома Ь/Я 6 petA, * petB, * petD, petО, рвЛ, реШ

КЛВ(Р)И-дегидрогеназа 11 *пёИА, * пёИВ, пёИС, ndhD, пёИЕ, пёИЕ, пёИО, ndhИ, пЛЫ, пЛЫ, ndhK

АТФаза atpA, atpB, atpE, * atpF, atpИ, atpI

RuBisCO (большая субъединица) 1 гЪ^

Группа III: Другие гены

Бета субъединица ацетил-КоА карбоксилазы 1 accD

Белок, участвующий в синтезе 1 сс&А (ус/5)

цитохрома С

Субъединица протеазы 1 *с1рР

Консервативные ОРС 6 ус/1, ус/2, ус/3, ус/4, cemA, ус/15

* гены с интронами (rps12 - образуется при транс-сплайсинге)

Вторая группа, включающая гены фотосинтетического аппарата, содержит только

белок-кодирующие гены. В эту группу входит ген гЪеЬ, кодирующий большую

13

субъединицу рибулозодифосфаткарбоксилазы. Этот фермент состоит из двух субъединиц: малой (12-13 кДа) и большой (53-55 кДа). Ген, кодирующий малую субъединицу (гЬс8) у высших растений кодируется ядерным геномом. Описаны редкие случаи, когда хлоропластный геном содержит оба упомянутых гена, например у цианелл, причем оба гена входят в один оперон, подобный оперон также описан и у цианобактерий (Sugiura, 1992). Поскольку гЬ^ достаточно консервативен, его последовательность используется в филогенетическом анализе (Shinozaki et я1. 1986, Rivadavia et я1. 2003). Поэтому он является одним из самых представленных хлоропластных генов в открытых базах данных.

Вторая группа также включает гены, кодирующие субъединицы фотосистемы I и II. Как правило, фотосистема I представлена 5 генами ^аА, psaB, psaC, psaI, psaJ), фотосистема II - не менее чем 15 генами (psbA, psbB, psbC, psbD, psbE, psbF, psbH, psbI, psbJ, psbK, psbL, psbM, psbN, psbT, psbZ). В систему энергетического обмена пластид, помимо первой и второй фотосистем входит, комплекс цитохромов Ь^, в большинстве случаев представленный 6 генами (petA, petB, petD, petG, petL, petN,), АТФ-синтазы (atpA, atpB, atpE, atpF, atpH и atpГ) и NAD(P)H-дегидрогеназы (ndhA-K). Большая часть генов фотосинтетического аппарата хлоропластов (Рис. 1.2) кодируется ядерным геномом.

Третья группа включает все оставшиеся гены, в которые входит accD, ccsA, сфР и консервативные белки с неизвестным функциями ycf.

Рисунок 1.2. Фотосинтетический аппарат тилакоидных мембран хлоропластов. (Leister, 2003)

1.3 Паразитические растения

Паразитический образ жизни широко распространен в живой природе, и царство растений не стало исключением. Паразитические растения - это специализированная группа растений, компенсирующая нехватку питательных веществ за счет других растений, получая их непосредственно из сосудистых тканей другого растения (прямые паразиты) или посредствам взаимодействия с грибной микоризой (микогетеротрофные растения). Так как одним из наиболее важных ресурсов в растительном мире является солнечный свет, то, по всей видимости, паразитизм эволюционно вызван присутствием в экосистеме растений, способных более эффективно поглощать солнечный свет, а так же ярусностью растительных сообществ, ведущей к слабой освещенности растений нижних ярусов.

Среди цветковых растений паразитизм не является монофилетическим явлением и возникал независимо примерно в десяти линиях (Вагктап et а1. 2007). Паразитические растения являются представителями как минимум 22 семейств, 265 родов и порядка 40004500 видов, что составляет примерно 1% от всех покрытосемянных (So1tis et а1, 2012.; Tesitel 2016).

Независимо от происхождения все паразитические растения можно разделить на несколько групп по ряду признаков. По зависимости от организма-хозяина можно выделить облигатные и факультативные паразитические виды. Факультативные растения-паразиты способны к свободному существованию, однако в присутствии растений-хозяев способны получать из них питательные вещества. Облигатным паразитам необходимо растение-хозяин, как минимум на одном этапе развития или же на протяжении всего существования. Ещё одним признаком для классификации паразитических растений является способность к фотосинтезу. В данном случае паразитические растения можно разделить на гемипаразитические виды и голопаразитичские. Гемипаразитические виды -способны к фотосинтезу, хотя бы на одном из этапов развития, а голопаразитические -абсолютно не способные к фотосинтезу, обычно полностью лишенные хлорофилла растения (Вагктап et а1. 2007). Таким образом, все голопаразитические виды являются облигатными паразитами, в то время как гемипаразитические могут быть как облигатными, так и факультативными.

Растения паразиты так же делят в зависимости от способа получения питательных

веществ на: микогетеротрофные и гаусториальные паразитические виды. Гаусториальные

паразиты получают питательные вещества напрямую из хозяйского растения, через

специальное клеточное взаимодействие - гаусторий. Микогетеротрофные растения

образуют связь с грибной микоризой, через которую получают питательные вещества от

15

растения-хозяина. Ярким примером микогетеротрофного растения является Monotropa hypopitys.

В семействе Orobanchaceae паразитизм представлен наиболее обширно, так как встречается большинство комбинаций паразитизма от факультативных гемипаразитических видов, до облигатных голопаразитических. Таким образом, на примере данного семейства можно рассматривать эволюционные процессы связанные с паразитическим образом жизни (Westwood et al. 2010). Считается, что паразитизм в Orobanchaceae имеет полифилетическое происхождение. При этом, потеря фотосинтеза происходила независимо как минимум 3 раза (Bennett et al. 2006; McNeal et al. 2013).

Классификация паразитических растений по морфологическим признакам долгое время была затруднена из-за значительной редукции или видоизменения морфологии, происходящей в голопаразитарных линиях. Дополнительную сложность вносит морфологическая конвергенция нефотосинтезирующих видов. Определение филогенетического положения паразитических видов растений по молекулярным маркерам так же проблематично в связи с повышенной вариабельностью кодирующих последовательностей и редукцией ряда генов. В настоящее время классификация паразитических растений базируется на митохондриальных последовательностях генов: atpl, coxI и matK. (Barkman et al., 2007).

Особенности пластидных геномов паразитических растений

Эволюционный переход к паразитизму у растений сопровождается рядом характерных морфологических изменений, так называемый «синдром редукции паразитов», и наблюдается во всех линиях паразитических растений. Так к общим морфологическим признакам можно отнести появление видоизмененных корневых структур - гаусториев, уменьшение высоты растения, сокращение количества фотосинтетической ткани, вплоть до полной её потери (Barrett et al. 2014). На генетическом уровне «Синдром редукции паразитов» отражается на радикальном сокращении пластидных геномов, сопряженном с множественными потерями генов и накоплением мутаций.

На данный момент известны последовательности более ста пластидных геномов

паразитических растений, среди которых встречаются как частичные гетеротрофы, так и

полностью бесхлорофилльные нефотосинтезирующие виды. Размер известных

пластидных геномов паразитических растений сильно варьируется от 11 до 161 т.п.н. В

пластидных геномах сопоставимых по размерам с обычными автотрофными растениями

зачастую уже наблюдаются первые признаки редукции, выраженные в накоплении

16

мутаций и псевдогенизации некоторых генов, чаще всего генов КАй(Р)Н-дегидрогеназы. С преобладанием паразитического образа жизни редукция геномов усиливается. Так на примере Orobanchaceae и Orchidaceae можно отследить диапазон сокращения размеров пластидного генома. Так Lathraea squamaria (Orobanchaceae; Samigullin et al., 2016) имеет самый большой пластом бесхлорофилльного растения с длиной 150504 п.н., содержащий 112 кодирующую последовательность, из которых 32 являются псевдогенами. Пластом паразитического растения Schoepfia jasminodora относится к крупным, имеет размер 119 т.п.н. и содержит 103 гена, включая три псевдогена (Su & Hu, 2016). Минимальные пластидные геномы на данный момент известны у растений Pilostyles aethiopica и Pilostyles hamiltonii, имеют размеры 11348 п.н и 15167 п.н, соответственно. В обоих геномах содержится предположительно 5 функциональных генов (Bellot & Renner, 2015). Наконец, полная потеря пластидного генома предположительно произошла у Rafflesia lagascae (Molina et al., 2014).

Поскольку пластидные геномы содержат гены различных функциональных категорий, их потеря при переходе от автотрофного фотосинтезирующего растения к гемипаразитам, а затем к нефотосинтезирующим голопаразитам, не является случайной и следует определенным закономерностям (Barrett & Davis, 2012; Barrett et al., 2014; Graham, Lam & Merckx, 2017). Первыми, как правило, теряются гены NAD(P)H-дегидрогеназы (ndh), за ними следуют гены, связанные с фотосинтезом (psa, psb, pet, rbcL и atp) и гены пластидной РНК полимеразы. Гены «домашнего хозяйства», кодирующие рибосомные РНК, рибосомные белки и тРНК, теряются в последнюю очередь.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Груздев Евгений Владимирович, 2021 год

Б- - -

tteKs. У1

Позиция в повторе 1 2 3 4 5 6 7

Встречаемость G-67; Q-40; K-70; Q-46; P-52; N-47; I-39;

определнных S-5; K-17; M-3 E-18; L-11; Y-26 V-29;

аминокислот A-1 P-16 S-4; A-6; L-3;

P-4; S-4 A-2

K-1

В. Orf641 1 MDKDKKS—KGKRPFRIRCPQIKSGDQISYRNVRLINKFLSRKTAEIFPRRITKLTFKQQR 59 MDK K+ K KR FR R P I+SGD+I Y+N+ L+++F+S + +I RR+T+LT KQQR 1 MDKSKRPFRKSKRSFRRRLPPIQSGDRIDYKNMSLLSRFIS-EQGKILSRRVTRLTLKQQR 60

Orf641 60 LLSSAIKQARILSLLPFFKYPEKRFTKDQKRFKKDTKRFKKYKKRKIQKT L++ AIKQARILSLLPF EK+F + 61 LITKAIKQARILSLLPFLNN-EKQFER 8 6

Рисунок 3.15. Анализ последовательности ORF641

A. Аминокислотная последовательность Orf641. Желтым отмечен N-концевой регион, содержащий 73 копии повтора GQKQPNI. Серым - Rps18 подобный регион.

Б. Консенсусная последовательность повтора.

B. Выравнивание аминокислотных последовательностей Rps-18 подобного региона из Orf641 D. rotundifolia (отмечен серым) и 86 а.к. консенсусной последовательности хлоропластного домена Rps18 (CHL00077).

Сравнение фланкирующих ген rps18 участков пластидного генома, включающих гены rpl33 и rpl20, показало, что богатая повторами часть orf641 окружена последовательностями, консервативными у родственных видов, включая F. esculentum (Рис. 3.16). Мы предлагаем, следующие два возможных объяснения происхождения orf641 у D. rotundifolia. Первое объяснение состоит в том, что богатая повторами часть ORF641 была приобретена в результате горизонтального переноса из другого организма. Существует множество свидетельств горизонтального переноса генов в митохондриальный и ядерный геномы растений (Sanchez-Puerta, 2014), особенно часто встречающиеся в паразитических линиях (Davies and Xi, 2015), но, насколько нам известно, перенос генов из ядерного генома в пластидный не был документирован для

наземных растений. Другое предположение заключается в том, что ОЯБ641 у Б. rotundifolia может быть результатом недавней множественной тандемной дупликации повтора в 5'-концевой области «родительского» гена гр$18. Анализ нуклеотидных последовательностей генов гр&18 показал, что накопление повторов длиной приблизительно 21 п.н. в этом регионе происходило у многих видов покрытосеменных (особенно в семействах Роасеае и Сатрапи1асеае), однако число повторов не превышает 15. У некоторых видов повторы присутствуют также в 3'-концевой области гр&18.

Оба объяснения образования повторов в ОЯБ641 оставляют открытым вопрос о функциональности rps18-подобной части ОЯБ641. Сохранение рамки считывания в пределах всего гена, несмотря на наличие множества повторов, указывает на его функциональность, хотя наличие большой ^концевой вставки в Rps18 может быть несовместимо со структурой рибосомы. Возможно, что образование белка, близкого к нативному Rps18, происходит благодаря использованию внутренних стартовых кодонов внутри ОЯБ641.

Рисунок 3.16. Сравнение областей пластидных геномов, содержащих гены гр133, гр&18 и гр120 для Б. rotundifolia, Б. erythrorhiza и Е. esculentum.

Показаны области между началом гр133 и началом гр120; нумерация координат для каждого пластома начинается с начала гена гр133. Гены обозначены прямоугольниками со стрелками. Черные треугольники внутри прямоугольника orf641 указывают на 73 копии повторяющейся последовательности длиной 21 п.н., кодирующей пептид с консенсусом GQKQPNI у Б. rotundifolia. Часть orf641, которая соответствует последовательности гр&18., обозначена синим. Заливкой красным цветом выделены гомологичные участки.

Наряду с потерей некоторых консервативных генов, особенностью пластидного генома Б. rotundifolia является потеря интронов в некоторых оставшихся генах. Интроны обнаружены в генах atpF, petB, petD, гр116, rpoC1, ycf3 (2 интрона), 1т1-ОАи и 1тЬ-иАЛ, в то время как в генах ЫрР, гр12 и rps16 интроны утрачены. мРНК гена rps12 формируется

в результате транс-сплайсинга, как и в большинстве других покрытосеменных, но он состоит только из двух, а не трех экзонов, что указывает на отсутствие одного (цис-сплайсированного) интрона. Необычной особенностью пластома D. rotundifolia является потеря интрона в гене trnK-UUU, который обычно содержит ген matK, кодирующий матуразу для сплайсинга интронов группы IIA (Zoschke et al., 2010). Ген matK сохраняется в пластоме D. rotundifolia и расположен отдельно от безинтронного гена trnK. Присутствие matK коррелирует с сохранением интронов группы IIA в генах atpF и trnl-GAU. Потеря гена trnK и сохранение отдельного matK были описаны для разных линий растений, включая паразитические виды (Duffy et al., 2009; McNeal et al., 2009), но присутствие безинтронного гена trnK необычно.

Структурные перестройки и дупликации в пластоме D. rotundifolia

Сравнение порядка генов в хлоропластном геноме D. rotundifolia относительно стандартного для цветковых растений показало, что пластом D. rotundifolia, помимо вышеупомянутых делеций отдельных генов, характеризуется крупномасштабными перестройками - инверсиями, транслокациями и дупликациями генов (рис. 3.17). Среди этих перестроек - перенос генов psaA-petN из большего однокопийного участка (LSC) в малый (SSC), вставка фрагмента petA-psal в этот кластер, инверсия и транслокация atpA-rpoC2 в пределах LSC и т.д. Однако пластом сохраняет интактные структуры высококонсервативного оперона S10 (rpsll, rpl36, infA, rps8, rpl14, rpl16, rps3, rpl22, rps19, rpl2, rpl23) и кластера генов rrn (rrn16-rrn23-rrn4.5-rrn5). Эти опероны обеспечивают скоординированную экспрессию компонентов, необходимых для сборки рибосомы, и сохраняют свою структуру в абсолютном большинстве хлоропластных геномов.

Вероятно, одним из основных драйверов структурных перестроек и увеличения

размера генома было дуплицирование протяженных фрагментов ДНК, сопровождающееся

вставкой их дополнительных копий в другие области генома с последующей

дивергенцией последовательностей. Анализ присутствия повторяющихся

последовательностей показал, что (без учета второй копии большого инвертированного

повтора), пластидный геном D. rotundifolia имеет гораздо большую долю повторяющихся

последовательностей, чем геномы филогенетически родственных видов и других хищных

растений. Повторяющиеся последовательности составляют около 23% пластома D.

rotundifolia, в то время как это значение составляет менее 5% в пластомах других хищных

растений (Табл. 3.6). Повышенное содержание повторов не связано с накоплением

коротких тандемных повторов, часто встречающихся в геномах хлоропластов (Levinson

68

and Gutman, 1987; Cai et al., 2008), так как в пластоме D. rotundifolia оно не выше, чем в большинстве других растений (табл. 3.6)

Fagopyrum oscubnluw Droserэ mturxhfotia

Рисунок 3.17. Сравнение порядка генов в пластидных геномах Б. rotundifolia и Е. esculentum.

Инвертированный повтор обозначен оранжевым прямоугольником на главной линии; показана только одна его копия. Прямоугольники представляют гены, транскрибируемые в противоположных направлениях, показаны слева и справа от основной линии. Серые области между генами указывают местоположения идентичных генов. ¥ обозначает псевдогены.

Таблица 3.6. Содержание повторяющихся последовательностей в пластидных геномах (данные указаны без учета второго инвертированного повтора).

Вид Размер Повторы (bp) Доля Тандемные

пластома (bp) * повторов * повторы (bp)

Caryophyllales; Droseraceae

Drosera rotundifolia 192,912 32,380 23,13% 736

Drosera erythrorhiza 134,391 4,708 4,84% 164

Drosera regia 136,810 1,883 1,66% 175

Dionaea muscipula 117,589 5,599 4,90% 460

Aldrovanda vesiculosa 141,568 2,514 2,20% 326

Caryophyllales; Nepenthaceae

Nepenthes x ventrata 156,637 664 0,51% 82

Nepenthes mirabilis 156,381 5,426 4,20% 237

Caryophyllales; Caryophyllaceae

Silene noctiflora 151,639 2,852 2,34% 225

Silene chalcedonica 148,081 4,566 3,67% 135

Silene conica 147,208 1,785 1,48% 40

Silene conoidea 147,896 1,615 1,33% 151

Silene paradoxa 151,632 2,023 1,60% 256

Silene latifolia 151,736 1,189 0,94% 20

Silene vulgaris 151,583 1,121 0,89% 181

Agrostemma githago 151,733 1,297 1,03% 105

Lamiales; Lentibulariaceae

Pinguicula ehlersiae 147,147 893 0,74% 151

Utricularia macrorhiza 153,228 632 0,50% 476

Genlisea margaretae 141,255 500 0,43% 440

Высокое содержание повторов согласуется с наличием дополнительных копий некоторых белок-кодирующих и тРНК генов. Большинство из них сохраняются в виде укороченных псевдогенов (т£А, psaB (2*), psbI (2 х), psbJ (2х), psaJ (2*)), но три дуплицированных гена остаются интактными и, вероятно, могут быть функциональными {^14, КпЫ-СЛии КпР-иОО).

Идентификация сайтов редактирования РНК

Редактирование РНК в пластидах цветковых растений представляет собой посттранскрипционную модификацию, которая заменяет цитозин (С) на урацил (и), образуя мРНК, которые отличаются от ДНК-матрицы (Воск, 2000). Редактирование РНК может изменять аминокислотную последовательность белков, а также может приводить к образованию новых стартовых и стоп-кодонов (Воск, 2000). Среднее количество сайтов

редактирования у непаразитических высших растений составляет 30-40 (Zeng et al., 2007), но у некоторых паразитических растений наблюдается сокращение количества сайтов редактирования (Funk et al., 2007). Чтобы определить число сайтов редактирования в хлоропластном геноме D. rotundifolia, мы выполнили анализ in silico для предсказания потенциальных сайтов редактирования с помощью программы PREP-Cp (она предсказывает сайты, в которых замена С на U «восстанавливает» консервативную аминокислоту в соответствующей позиции в белке) и идентифицировали их экспериментально, используя RNA-seq анализ. Эффективность редактирования определялась по отношению прочтенных нуклеотидов C и U в соответствующей позиции в чтениях транскриптома по данным RNA-seq.

С помощью RNA-seq анализа в хлоропластном геноме D. rotundifolia обнаружено только шесть сайтов редактирования РНК (табл. 3.7). Пять из них также были предсказаны PREP-Cp и соответствовали консервативным сайтам редактирования в генах atpF, rps2 (2 сайта), rps14 и rpl23, обнаруженных в других покрытосеменных растениях (Zeng et al., 2007). Еще один сайт в позиции 73 кодона в rpl22 может превращать серин в лейцин, хотя эта позиция не консервативна в Rpl22. Дополнительные 24 сайта были предсказаны PREP-Cp, но не подтверждены RNA-seq. Только два из них (редактирование кодона 2 в petL и кодона 27 в rps14) консервативны в пластомах покрытосеменных (Zeng et al., 2007).

Таблица 3.7. Паттерн редактирования РНК в пластоме D. rotundifolia, идентифицированный в результате секвенирования транскриптома.

Ген Позиция Кодон* Аминокислотная Эффективность PREP-Cp editing

(а.о.) замена редактирования score

atpF 31 CcA P>L 98% 0.86

rps2 54 AcA T>I 72% 0.71

92 TcA S>L 93% 1.00

rps14 50 CcA P>L 67% 1.00

rpl22 73 TcA S>L 70% -

rpl23 24 TcT S>F 81% 0.71

* выделено редактируемое основание - с

3.4 Пластидный геном хищного растения Nepenthes х ventrata.

Nepenthes х ventrata - насекомоядное растение, естественный гибрид Nepenthes alata и Nepenthes ventricosa (рис. 3.18). Данное растение является эндемичным видом, ареал которого расположен на Филлипинских островах. В нашей работы мы использовали оранжерейный образец N. х ventrata. Как и D. rotundifolia - Nepenthes х ventrata принадлежит к порядку Caryophyllales.

Рисунок 3.18. Фотография Nepenthas х ventrata

Структура пластидного генома и набор генов

Пластидный геном Nepenthes х ventrata представляет собой кольцевую молекулу ДНК размером 156637 п.н. и содержит инвертированные повторы. Размер каждого инвертированного повтора составляет 25190 п.н, размер малого однокопийного участка 19208 п.н. большего - 87049 п.н (Рис. 3.19). В отличие от D. rotundifolia, у N. х ventrata не произошло «разрастания» инвертированных повторов, а их размер, как и размер всего хлоропластного генома, сопоставим с хлоропластными геномами большинства цветковых растений. Среднее значения GC-состава для всего хлоропластного генома N. х ventrata составляет 37,03%, для инвертированных повторов 43,11%, для малого и большого однокопийных участков -30.83% и 34,88%, соответственно.

Набор генов в хлоропластном геноме N. х ventrata типичен для цветковых растений и практически идентичен набору генов у F. esculentum (Logacheva et al., 2008). В отличии

от Г. в8сп1впЫт ген гр123 в пластоме N. х ventrata, по-видимому, интактен, как и у большинства покрытосеменных (Wakasugi et а1., 2001). Хлоропластный геном N. х увЫг^а содержит 112 уникальных предположительно интактных генов (Табл. 3.8), включая гены, кодирующие компоненты фотосинтетического аппарата, РНК-полимеразы и рибосомы, а также консервативные гены т/Л, таК, свтА, с1рР, ассБ, ус/1 и ус/2. В отличие от большинства проанализированных хищных растений, пластом N.х ventrata содержит полный набор генов, кодирующих комплекс NAD(P)H-дегидрогеназы (пйЪЛ-К).

Единственной значимой потерей белок-кодирующего гена является псевдогенизация гена ccsЛ из-за вставки длиной 22 п.н. после 507 п.н от старт-кодона, что приводит к сдвигу рамки считывания.

□ ЫАОН ОеЬуОгс^.---

■ ПиЬзСО 1а»де виЬип*

■ ЯЫА ро1ут0га5в

□ гЬозсжпа! рпхапв (Эви) В гЬояота! ргс-липя (I Эи)

■ с1рР, та!К

■ «Ьег доез

□ ЬурсйЬенса» сЫогор1а51 геанЯпд (гатеа <ус*>

■ 1гапа»вг ЯКАа

■ гЬовота! НИАя

Рисунок 3.19 Структура хлоропластного генома N. х увЫга1а

Гены, расположенные на внешнем круге, транскрибируются по часовой стрелке, расположенные на внутреннем - против. Различными оттенками зеленого обозначены гены, кодирующие компоненты фотосинтетического аппарата: белки фотосистемы I и II, цитохрома Ь6£, АТФ синтазы и RbcL; желтым - компоненты NAD(P)H-дегидрогеназы; вишневым отмечены гены субъединиц РНК-полимеразы; коричневым - гены рибосомных белков, оранжевым - с1рР и таК, синим - гены тРНК, красным - гены рРНК.

V

■ рГ)0|03у8№ГП I

■ рЛоЮТуЯвгп II

■ сугостоте ЬТ соотр1е* О АТР вущНавв

В пластидном геноме N. х \еМга1а было идентифицировано 30 генов тРНК, семь из которых дуплицированы в инвертированных повторах (табл. 3.8). В отличие от Б. гоЫпЛ/оНа, набор генов тРНК в пластоме N. х ventrata является полным. Анализ хлоропластного генома N. х ventrata выявил присутствие всех интронов, обычно обнаруживаемых в генах пластид. Как и в большинстве пластомов других покрытосеменных, ген rps12 состоит из трех экзонов, при этом формирование мРНК происходит за счет транс-сплайсинга. Структура и порядок генов хлоропластного генома N. х ventrata совпадает с таковыми у табака (8Ыпо2аЫ й а1., 1986) и Е. е8си1епЫш (Logacheva et а1., 2008). Структурных перестроек или увеличения количества повторов не обнаружено.

Таблица 3.8. Гены, найденные в пластоме Nepenthes х ventrata

Функция Гены *

Фотосистема I psaA, psaB, psaC, psal, psaJ, ycf3 \ ycf4

Фотосистема II psbA, psbB, psbC, psbD, psbE, psbF, psbH, psbl, psbJ, psbK, psbL, psbM, psbN, psbT, psbZ

Комплекс petA, petB1, petD1, petG, petL, petN

цитохрома b6f

ATP синтаза atpA, atpB, atpE, atpF \ atpH, atpl

NAD(P)H- ndhA \ ndhB \ ndhC, ndhD, ndhE, ndhF, ndhG, ndhH, ndhI,

дегидрогеназа ndhJ, ndhK

РНК полимераза rpoA, rpoB, rpoCl \ rpoC2

Рибосомные белки (большая субъединица) rpl2 \rpl14, rpl16 \ rpl20, rpl22, rpl23, rpl32, rpl33, rpl36

Рибосомные белки (малая субъединица) rps2, rps3, rps4, rps7, rps8, rpsll, rps12 \ rps14, rps15, rps16 \ rps18, rps19

Другие белок- rbcL, infA, matK, cemA, clpP \ accD, ycf1, ycf2

кодирующие гены

Гены рРНК rrn16, rrn23, rrn4.5, rrn5

Гены тРНК trnA-UGCi, trnC-GCA, trnD-GUC, trnE-UUC, trnF-GAA, trnG-GCC, trnG-UCCi, trnH-GUG, trnl-CAU, trnl-GAUi, trnK-UUUl, trnL-CAA, trnL-UAAl, trnL-UAG, trnM-CAU, trnfM-CAU, trnN-GUU, trnP-UGG), trnQ-UUG, trnR-ACG, trnR-UCU, trnS-GCU, trnS-GGA, trnS-UGA, trnT-GGU, trnT-UGU, trnV-GAC, trnV-UACi, trnW-CCA, trnY-GUA

Псевдогены yycf!5, yycf68, yccsA

* Гены, дуплицированные в инвертированных повторах сосчитаны один раз, 1 - интрон-содержащие гены, включая образующийся в результате транс-сплайсинга rps12

Сайты редактирования РНК в пластоме N. х ventrata.

Анализ транскриптома (RNA-seq) выявил 56 сайтов редактирования РНК в 32 генах в хлоропластном геноме N. х ventrata (табл. 3.9). Наибольшее количество сайтов редактирования наблюдалось в генах пёИБ (10 сайтов), гроС1 (6 сайтов) и пёИБ (5 сайтов). Тридцать шесть из этих сайтов также были предсказаны программой РЯЕР-Ср, что указывает на то, что обнаруженные изменения восстанавливали консервативные аминокислотные остатки в соответствующих белках. Кроме того, PREP-Cp предсказал 29 дополнительных сайтов, не обнаруженных в данных RNA-seq, которые предположительно остаются без редактирования. В целом, количество и распределение сайтов редактирования РНК в пластоме N. х ventrata сходны с теми, которые наблюдаются у других покрытосеменных растений (Zeng et а1., 2007), что указывает на отсутствие отбора в направлении потери сайтов редактирования.

Таблица 3.9. Паттерн редактирования РНК в пластоме N. х ventrata, предсказанный PREP-Cp и идентифицированный с помощью анализа транскриптома (RNAseq).

Ген Позиция Кодон* Аминокислот PREP-Cp Подтверждено

(а.°.) ная замена editing score RNAseq, эффективность

accD 65 cAT H>Y 0.75

127 CcG P>L 0.75

238 cTT L>F 1.00

264 TcG S>L 0.80 Да, 87%

461 CcA P>L не предсказан Да, 70%

atpA 258 TcA S>L 1.00 Да, 78%

305 TcA S>L 1.00 Да, 75%

424 cCC P>S 1.00

481 AcA 1М не предсказан Да, 62%

atpF 31 CcA P>L 0.86 Да, 77%

atpI 210 TcA S>L 1.00 Да, 96%

ccsA 203 cTT L>F 0.71

clpP 186 cAT H>Y 1.00 Да, 82%

matK 24 cTT L>F 1.00

152 cAT H>Y 1.00 Да, 93%

214 cAT H>Y 1.00 Да, 74%

229 cCC P>S 1.00

237 TcT S>F не предсказан Да, 89%

412 TcT S>F 0.71

ndhA 114 TcA S>L 1.00

193 TcA S>L 1.00

ndhB 50 TcA S>L 1.00 Да, 88%

156 CcA P>L 1.00 Да, 65%

181 AcG T>M 1.00 Да, 67%

196 cAT H>Y 1.00 Да, 52%

204 TcA S>L 0.80

246 СсА Р>Ь 1.00 Да, 91%

249 ТсТ 8>Б 1.00 Да, 83%

277 ТсА Б>Ь 1.00 Да, 63%

279 ТсА Б>Ь 1.00 Да, 56%

392 СсС Р>Ь не предсказан Да, 24%

494 СсА Р>Ь 1.00 Да, 53%

пёИС 108 ТсА Б>Ь КА Да, 44%

пёИБ 123 ТсА Б>Ь 1.00 Да, 38%

220 ТсА Б>Ь 1.00 Да, 64%

288 ТсА Б>Ь 1.00 Да, 64%

291 СсС Б>Ь 1.00 Да, 50%

428 ТсА Б>Ь 0.80 Да, 56%

432 ТсА Б>Ь 0.80

пёИЕ 78 СсА Р>Ь КА Да, 91%

пйк¥ 46 ТсА Б>Ь 0.80

97 ТсА Б>Ь 1.00 Да, 60%

196 сТТ Ь>Б 0.80

502 ТсТ 8>Б 1.00

582 АсА Т>1 1.00

пёИО 56 сАТ И>У 0.80

105 АсА Т>1 0.80

пёИК 22 ТсА Б>Ь КА Да, 92%

рвгВ 144 сОО 1.00 Да, 93%

регБ 139 ОсО А>У 0.86

р^Ь 2 СсТ Р>Ь не предсказан Да, 47%

рт1 29 сАТ И>У не предсказан Да, 69%

р&ЬЕ 72 сСТ Р>Б 1.00 Да, 91%

р&Ь¥ 26 ТсТ 8>Б 1.00 Да, 89%

17 ТсА Б>Ь КА Да, 33%

гроА 67 ТсТ 8>Б не предсказан Да, 49%

123 ТсА Б>Ь 1.00

281 сСС Р>Б 0.71

гроВ 113 ТсТ 8>Б 1.00 Да, 100%

184 ТсА Б>Ь 1.00 Да, 100%

189 ТсО Б>Ь 1.00 Да, 100%

797 ТСс 8>Б не предсказан Да, 28%

809 ТсА Б>Ь 0.86 Да, 52%

гроС1 14 ТсА Б>Ь 1.00 Да, 57%

153 СсС Р>Ь не предсказан Да, 28%

213 АсТ Т>1 0.86

220 ОсА А>У 0.71

347 СсА Р>Ь не предсказан Да, 24%

384 сОТ Я>С не предсказан Да, 26%

424 ТсО Б>Ь не предсказан Да, 26%

438 СсО Р>Ь не предсказан Да, 31%

664 сТТ Ь>Б 0.71

гроС2 238 АсО Т>М 0.75

502 АсО Т>М 0.86

533 сТТ Ь>Б 1.00

764 сОО R>W 1.00

994 сАТ И>У не предсказан Да, 93%

гр&2 45 АсА Т>1 0.71 Да, 100%

83 ТсА Б>Ь 1.00 Да, 89%

гр&8 48 ОсО А>У 1.00

гр&12 36 ТсА Б>Ь КА Да, 86%

гр&14 27 ТСА Б>Ь 1.00 Да, 96%

50 ССА Р>Ь 1.00 Да, 88%

гр&18 74 ТсО Б>Ь КА Да, 64%

гр123 24 ТсТ 8>Б 0.71 Да, 77%

КА- ген отсутствует в базе данных PREP-Cp.

3.5. Структурные перестройки и потери генов в пластидных геномах хищных растений

Используя полные последовательности хлоропластных геномов хищных растений порядка Caryophyllales, мы провели сравнительный анализ структур пластидных геномов. Для анализа бралась последовательность всего генома без учета второй копии инвертированного повтора. Построение карты перестроек осуществлялось с помощью алгоритма Mauve (v 20150226 build 10) (Darling et al. 2004) со стандартными настройками для прогрессивного выравнивания. В роли референсной последовательности выступал хлоропластный геном N. tabacum (рис. 3.20).

я

Ммот )B(Mtt#t.ltMe

Рисунок 3.20. Структурные перестройки в пластидных геномах представителей порядка Caryophyllales.

На полученной схеме перестроек хлоропластных геномов можно отметить, что N. x

ventrata, N. mirabilis, A. vesiculosa и D. regia содержат незначительные перестройки в

пластидном геноме, в то время как D. erythrorhiza, D. rotundifolia и D. muscipula имеют

множественные перестройки, инверсии, делеции и дупликации. Таким образом, на

78

примере пластидных геномов Caryophyllales можно наблюдать различные стадии их эволюции.

В целом можно говорить, что пластидные геномы ряда представителей Droseraceae демонстрируют множественные перестройки, потери генов и значительные колебания в размере как всего генома, так и инвертированных повторов. В то время как семейство Nepenthaceae является консервативным с точки зрения структуры и генного состава.

Несмотря на то, что хлоропластные геномы высших растений является высоко консервативным, известны многочисленные случаи потери некоторых генов в разных линиях. Наиболее часто теряется ген infA, кодирующий фактор инициации трансляции, потеря которого была описана как минимум в 24 линиях покрытосеменных растений (Millen et al., 2001). Также известны случаи потери генов отдельных рибосомальных белков (Gantt et al., 1991; Jansen et al., 2007; Ueda et al., 2007, 2008). Было показано, что, в некоторых случаях, происходит перенос пластидных генов в ядерный геном, а их продукты с помощью сигнальных последовательностей транспортируются в хлоропласты (Millen et al., 2001; Ueda et al., 2007). Из всех генов рибосомных белков в пластоме D. rotundifolia только ген rps18, возможно, является псевдогеном. Можно предположить, что интактный Rps18 доставляется в хлоропласты D. rotundifolia из ядерного генома; однако анализ RNA-seq не выявил транскриптов RpslB-подобных белков, несущих хлоропластный транзитный пептид.

В целом, потеря генов у D. rotundifolia в некоторой степени схожа с наблюдаемой у паразитических растений (табл. 3.10). В соответствии с моделью последовательных стадий редукции пластидного генома при переходе к гетеротрофному образу жизни, предложенной Barrett and Davis (2012), сначала теряются гены КЛВ(Р)И-дегидрогеназы, затем гены, ответственные за фотосинтез (psa, psb, pet, rbcL и др.), далее гены РНК-полимеразы и АТФ-синтазы. Последними утрачиваются гены, кодирующие рибосомные РНК и тРНК, рибосомные белки и ряд других важных генов (accD, clpP, matK, ycfl, ycf2). Потеря генов сопровождается уменьшением размера пластома, потерей интронов, геномными перестройками и потерей характерной четырехсекторной структуры. Анализ пластидных геномов D. rotundifolia и N. x ventrata, показал, что они, соответственно, находится на промежуточной и самой ранней стадиях аналогичного процесса. В то же время, зависимость хищных растений от фотосинтеза определяет сохранение полного набора генов фотосинтетического аппарата, а также генов РНК-полимеразы и АТФ-синтазы.

Частичная или полная потеря 11 генов кодирующих субъединицы тилакоидного комплекса КЛВ(Р)И-дегидрогеназы из пластидного генома, часто встречается у

79

паразитических растений (McNeal et al., 2007; Wicke et al., 2013; Kim et al., 2015), так же у некоторых автотрофных растений (например, Pinaceae; Wakasugi et al., 1994). Комплекс КАй(Р)Н-дегидрогеназы обеспечивает циркуляцию электронов в фотосистеме I и балансирует соотношение ATP и NADH. Последний используется для фиксации углерода в цикле Кальвина (Rumeau et al., 2007). NAD(P)H-дегидрогеназа не является абсолютно необходимой в нормальных условиях, но она важна в условиях стресса, таких как повышенная или пониженная интенсивность света и низкие концентрации CO2 (Horvâth et al., 2000; Ruhlman et al., 2015).

Потеря NAD(P)H-дегидрогеназы была отмечена у хищных растений семейства Lentibulariaceae (Wicke et al., 2014; Silva et al., 2016, 2018). У Genlisea margaretae гены ndhC, D, F, G, H, J и K были потеряны из пластомы, ndhA, B, E и I остаются в виде псевдогенов, а ndhB интактен (Wicke et al., 2014). Пластом Pinguicula ehlersiae содержит псевдогены ndhB, ndhA, D, E, G, H, I, J и K и полностью лишен генов ndhC и F (Wicke et al., 2014). Другая картина была обнаружена в Utricularia reniformis, где гены ndhC, F, J и K были потеряны из пластома, а гены ndhA, B, D, E, G, Ни I присутствуют в виде псевдогенов (Silva et al., 2016). Полный набор ndh генов был обнаружен в пластомах Utricularia macrorhiza и Utricularia gibba (Wicke et al., 2014; Ibarra-Laclette et al., 2013). Вероятно, пониженная зависимость росянки и некоторых других хищных растений от фотосинтеза и относительно стабильная среда обитания приводит к потере NAD(P)H дегидрогеназы.

Интересным является потеря генов ycfl и ycf2 у D. rotundifolia, которого не наблюдалось в пластидах хищных растений семейства Lentibulariaceae. В отличие от ndh генов, на табаке показано, что ycfl и ycf2 являются жизненно-важными (Drescher et al., 2000), однако потери этих генов без переноса в ядерный геном были обнаружены в пластидах некоторых других растений (например, Wakasugi et al., 2001; Cai et al., 2006), особенно у многих паразитических растений (Wicke et al., 2013). Было высказано предположение, что Ycf1 участвует в импорте белка в хлоропласты (Kikuchi et al., 2013), но данное предложение было позже подвергнуто сомнению (Bölter and Soll, 2017).

Пластомы трех видов Nepenthas, N. х ventrata, N. graciliflora (MH286314) и N. mirabilis (MH346374, MK397881, и MK397880), имеют стандартную структуру и типичный набор генов для цветковых растений. Единственной значимой потерей у N. х ventrata является псевдогенизация гена ccsA из-за вставки длиной 22 п.н. после 507 п.н от старт-кодона, что приводит к сдвигу рамки считывания. Поиски в GenBank показали, что подобные вставки со сдвигом рамки считывания присутствуют в генах ccsA у Nepenthes graciliflora (MH286314) и Nepenthes mirabilis (MH346374 Zhu et al., 2018, MK397881 и

80

MK397880), что указывает на то, что данное явление может быть общим для рода Nepenthes. Ген ccsA кодирует белок биогенеза цитохрома-С и сохраняется у фотосинтезирующих растений (Wakasugi et al., 2001), но он теряется вместе с другими генами, связанными с фотосинтезом, у безхлорофильных паразитических растений (Delannoy et al., 2011; Wicke et al., 2011; Lam et al., 2015; Ravin et al., 2016). Единственным, известным в настоящее время, примером функциональной потери ccsA у фотосинтезирующих растений является псевдогенизация данного гена у облигатного гемипаразитического вида Viscum album (Santalales: Viscaceae) (Petersen et al., 2015). Возможно, эта потеря также может быть обусловлена снижением зависимости гемипаразитических и хищных растений от фотосинтеза.

Изменение в пластидном геноме D. rotundifolia похожи на описанные для гемипаразитических растений - потеря не только NAD(P)H-дегидрогеназы, но также и других консервативных генов, утрата интронов, накопление повторов и множественные перестройки генома. Однако, полностью сохраняется аппарат фотосинтеза. Похожие структуры пластомов и состава генов были недавно описаны для четырех других видов Droseraceae: D. erythrorhiza, D. regia, A. vesiculosa и D. muscipula (Nevill et al., 2019). Во всех четырех пластомах полностью отсутствуют ndh гены. В пластоме D.erythrorhiza также отсутствуют функциональные ycf1, ycf2, rpl23, rps16 и возможно, psbK и rpl32. В пластомах других трех видах не описано потери белок-кодирующих генов помимо ndh (Nevill et al., 2019). В тоже время, как и в случае D. rotundifolia, в них были описаны потери необходимых генов тРНК, у D. muscipula trnG-UUC и trnV-UAC, D. erythrorhiza -trnA-UGC, trnG-UCC, trnI-GAUи trnV-GAC.

Таблица 3.10. Набор генов, обнаруженных в пластидных геномах хищных растений.

accD

atpA

atpB

atpE

atpF

Caryophyllales

n

e

l ul

c s e

u

ruopy

Fago

+

+

+

+

+

+

s

b rab

s

e the

nt

e p

peN

+

+

+

+

+

+

tra nt

e

§

s

e the

nt

e p

peN

+

+

+

+

+

+

sa los

ul

ic si

e v

da vand

o

r dr

+

+

+

+

+

+

ai li

olif di

n

ut ot

r

ra

e s o

r Dr

+

+

+

+

+

+

al

ul ip

ic s u

a e a n io Di

+

+

+

+

+

+

ia gi

e r

a r e s o

r Dr

+

+

+

+

+

+

a iz hi

r o

r thr

try

e

a r e s o

r Dr

+

+

+

+

+

+

Lamíales

e tae

e

targare

a e

si li

nl

e Ge

+

+

+

+

+

+

e

ai rsi

rle hl

e

u

ci cingui

£

+

+

+

+

+

+

r orif ni

e r

«

lari ul

c

Ut

+

+

+

+

+

+

a zi rhi

o roc

a

ai lari

ul

ci triU

+

+

+

+

+

+

a b

ib gi

«

lari ul

ci cUtri

+

+