Генетический контроль реакций фотосинтеза у ядерных мутантов гороха тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Божок, Галина Владимирована

• Божок, Галина Владимирована
• кандидат биологических наук
• 1984

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Божок, Галина Владимирована

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Характеристика пластидного генома.

1.2. Исследование фотосинтетических мутантов.

1.2.1. Идентификация ядерных генов, влияющих на активность К! П.

1.2.2. Идентификация ядерных генов, определяю. . . щих активность <Ю I.

1.2.3. Идентификация пластидных генов, определяющих активность <Ю I или ФС П.

1.2.4. Идентификация ядерных генов, контроли . . руюцих обе фотосистемы.

1.2.5. Овнарунение ядерных генов, контролирующих транспорт электронов между фотосистемами.

1.2.6. Обнаружение мутаций, блокирующих энер . . гообразовательную функцию.

1.2.7. Генетический контроль реакций, • связан. ных с восстановлением НАДФ+.

1.2.8. Мутации, фенотипическое проявление которых' зависит от'влияния'внешней ' среды.

1.2.9. Выявление мутаций, ведущих к повышению активности фотохимических реакций.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ.

2.1. Объект исследования.

2.2. Метод регистрации послесвечения.

2*3. Метод электронного парамагнитного резонанса.

2.4. Методы, характеризующие реакции'электронтранспортной цепи хлоропластов.

2.5. Определение содержания цитохромов.

2.6. Определение фиксации COg и продуктов фотосинтеза.

2.7. Определение активности карбоксилирукщих ферментов.

3. ГЕНЕТИЧЕСКАЯ И ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МУТАНТОВ ГОРОХА.

3.1. Анализ расщепления в потомстве гетерозиготных линий гороха.

3.2. Исследование' аллелизма у пяти хлорофильных му. . тантов.

3.3. Количественная характеристика растений, гете. . розиготных по хлорофильным мутациям.

3.4. Исследования'микроскопического строения хлоро . пластов.

3.5. Содержание хлорофильных пигментов и их спект . ральная характеристика.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Генетический контроль реакций фотосинтеза у ядерных мутантов гороха»

Исследование генетической автономии пластид, а также функциональных связей между локализованной в них генетической информацией и геномом ядра привлекает большое внимание исследователей, поскольку это открывает новые перспективы в понимании генетических систем, ответственных за эффективность превращения световой энергии в химическую и за формирование структур,в которых осуществляется этот процесс. В настоящее время установлено, что хлоропласты растений содержат свою собственную генетическую информацию, представленную несколькими идентичными молекулами хлоропластной ДНК.

Успехи в познании генетической организации пластома, связанные с развитием методов генной инженерии, клонированием отдельных генов хлоропластного генома, созданием рекомби-нантных молекул ДНК, установлением полной нуклеотидной последовательности отдельных генов хлоропластного генома, ставят вопрос о возможности использования знаний генетики фотосинтеза в практической селекции. Поскольку фотосинтез поставляет энергию, необходимую для всех биологических функций, а также определяет материальную основу, от которой зависят биосинтетические процессы, то он играет ключевую роль в продукционном процессе. Быстрый прогресс в исследованиях по генетике фотосинтеза позволяет надеяться, что в ближайшем будущем генетики и селекционеры смогут оценивать эффективность фотосинтеза разных растений не только по фенотипическим особенностям, но и непосредственно по генотипу.

Изучение генетики фотосинтеза показало, что помимо хло-ропластных генов многие гены, влияющие на структуру и функции фотосинтетического аппарата, локализованы в геноме ядра,. Установлено, что большинство функционально активных белков хлоропластов состоят из единиц, кодирующихся ядерными и хло-ропластными генами. Активно работающий фотосинтетический ал-парат, определяющий метаболизм, рост и развитие растений, создается на основе тесного взаимодействия двух генетических систем - генома ядра и пластома.

Изучение фундаментальной природы взаимодействия этих генетических факторов растительной клетки в биогенезе и функционировании хлоропластов может открыть новые возможности усовершенствования самого фотосинтетического аппарата и путей повышения эффективности его работы.

Одним из возможных подходов изучения генетического контроля фотосинтеза у высших растений является выделение и изучение мутантов, у которых блокированы отдельные этапы становления и функционирования фотосинтетического аппарата. При этом наиболее удобными объектами исследования будут те организмы, у которых возможно сочетать физиолого - биохимический и генетический анализ.

В своей работе мы поставили задачу через исследование мутантных форм выяснить влияние генов ядра на определенные реакции фотосинтеза и создать генетическую модель, удобную для разрешения проблем взаимодействия и регуляции генетических систем растительной клетки. Нам представлялось важным исследовать у мутантов физиолого-биохимические параметры фотосинтетического аппарата, чтобы выявить взаимосвязь между генетической системой ядра и фотосинтетической активностью хлоропласта. Биохимическая характеристика мутантов и установление конкретных блоков в реакциях фотосинтеза дает возможность определить, какие из этих реакций контролируются генами ядра. Кроме того, биохимическая идентификация генетических блоков позволяет использовать мутанты в качестве модельных объектов в исследованиях механизмов фотосинтеза и его регуляции.

В качестве объекта исследования был выбран посевной горох ( Pisum sativum L. ) - растение, позволяющее сочетать генетические и физиологические методы анализа.

В работе решались следующие задачи:

1. Изучение генетической природы использованных мутантов гороха.

2. Исследование фенотипических проявлений индуцированной мутации у ядерных мутантов гороха.

3. Изучение активности карбоксилирующих ферментов и распределение меченого углерода в продуктах фотосинтеза у нормальных и мутантных растений гороха.

4. Анализ фотохимических реакций электронтранспортной цепи у ядерных мутантов гороха.

5. Количественная оценка отдельных компонентов электронтранспортной цепи у ядерных мутантов гороха и их исходных сортов.

Основные положения, которые выносятся на защиту:

1. Индуцированная хлорофильная мутация приводит к по -вреждению рецессивных неаллельных генов ядра.

2. Отсутствие углеродфиксирущей активности связано с мутационными нарушениями фотохимических реакций, но не карбоксилирующих процессов.

3. Идентифицированные нарушения реакций фотосинтеза у исследованных мутантов гороха обусловлены мутациями ядерных генов.

4. Моногенные рецессивные ядерные мутации у исследованных линий гороха оказывают множественный плейотропный эффект*

Новизна.

На основании комплексного исследования фотосинтетического аппарата у пяти ядерных неаллельных рецессивных мутантов гороха впервые охарактеризованы последствия генетических нарушений ядра на всех этапах фотосинтеза у высших растений; определены компоненты, функциональная активность которых детерминируется ядерным геномом; выявлен плейотропный характер моногенных ядерных мутаций, влияющих как на активность многих фотосинтетических реакций, так и на структуру хлоропласта.

Практическая значимость.

Исследование биохимической детерминированности отдельных ядерных генов может оказаться очень полезным в установлении взаимосвязи между процессами фотосинтеза и продуктивностью растений. Изучение мутантов, у которых нарушен только один ядерный ген, контролирующий ту или иную реакцию фото -синтеза, поможет оценить значение этой реакции в процессах, обуславливающих общую урожайность растений. Осуществленное нами всестороннее исследование фотосинтетических мутантов гороха позволило установить роль ядерных генов в формировании и функционировании фотосинтетического аппарата.

Фотосинтетические мутанты гороха уже в настоящее время широко применяются как модельные объекты в изучении природы и молекулярных механизмов различных реакций фотосинтеза. Исследованные нами мутанты гороха с генетическим блокированием реакций ФС I и <Ю П используются на кафедре биофизики Биологического факультета МГУ для изучения и понимания природы замедленной флуоресценции. Эта же группа мутантов была использована сотрудниками Института фотосинтеза для установления механизмов регуляции темновых реакций фотосинтеза. Кроме своего основного научного значения, коллекция хлорофильных мутантов гороха используется на кафедре генетики и селекции Биологического факультета МГУ для учебных целей при демонстрации основных менделевских закономерностей расщепления. Нет сомнений, что в дальнейшем фотосинтетические мутанты гороха найдут еще более широкое применение в изучении самых разнообразных областей генетики, физиологии, биохимии и биофизики растений.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

I.I. Характеристика пластидного генома

Интенсивные исследования генетической системы хлоропласта позволили установить, что пластидная ДНК - это кольце -вая, ковалентно связанная двунитевая молекула, выделяющаяся в виде суперспирали или замкнутого кольца. Длина контура и молекулярный вес хлоропластной ДНК колеблется у представителей разных видов, но в среднем составляет 45у^ с М.м. 1*10^ дальтон. Характерной особенностью ДНК пластид и их отличием от ядерной ДНК является отсутствие 5-метилцитозина и гистоноподобных белков. Содержание Г-Ц пар может колебаться ОТ 28 ( Euglena gracilis ) ДО А1% у высших растений.

Число молекул ДНК на пластиду также значительно варьирует не только в зависимости от вида растений, но и в зависимости от состояния развития и дифференциации клеток и тканей. Так, например, при зеленении и появлении первых настоящих листьев у. гороха число хлоропластов на клетку увеличивается (без параллельного увеличения количества ядерной ДНК), и одновременно происходит уменьшение числа копий хлоропластной ДНК на хлоропласт /129/. Такое.же явление наблвдали и при развитии листьев шпината /175/.

Тем не менее, отношение хлоропластной ДНК к ядерной в клетке всегда постоянно, несмотря на то, что на один цикл репликации ядерной ДНК приходится 1,5 цикла репликации плас-тидной молекулы. Предполагается, что происходит постоянное разрушение молекул хлоропластной ДНК за счет действия специфических нуклеаз, которые активируются красным светом и разрушают молекулы хлоропластной ДНК, регулируя, таким образом,

Рис. I.I. Схема кольцевидной физической карты ДНК хлоропластов. Стрелками указаны обращенные повторы. Спейсер кодирует тРНК количественные отношения между двумя видами ДНК в клетке и поддерживая их на постоянном уровне /184/.

Репликация хлоропластной ДНК осуществляется хлоропласт-ной ДНК-полимеразой, которая кодируется ядерным геномом, транскрибируется и синтезируется на цитоплазматических рибосомах, а затем транспортируется в пластиды. Такой вывод основывается как на результатах экспериментов с использованием ингибиторного анализа /66/, так и на результатах экспериментов с использованием пластомных мутантов, имеющих дефект пластидных рибосом /82, 108, НО/. Эти пластомные мутанты, тем не менее регулярно реплицировали хлоропластную ДНК, что может свидетельствовать о том, что ее биосинтез осуществляется не на пластидных, а на цитоплазматических рибосомах.

Кроме собственной ДНК пластида обладает собственной специфической транскрипционно-трансляционной системой.Транскрипция внутри хлоропласта осуществляется пластидной ДНК -зависимой РНК полимеразой, которая, как было показано,прочно связана с мембранами /79, 182/. Пластидная РНК полимераза . также кодируется ядерной ДНК, синтезируется на цитоплазматических рибосомах и лишь затем транспортируется в пластиду /82, 109/. Очищенная РНК полимераза была выделена из хлоропластов кукурузы, шпината, хламидомонады /81, 182, 188/.Фермент состоит из нескольких субъединиц, количество которых и молекулярная масса каждой субъединицы отличаются у разных видов растений /81, 182/.

Из хлоропластов хламидомонады был выделен специфический белок (предполагаемый & -фактор), который стимулировал транскрипцию РНК полимеразы /188/. s-фактор, необходимый для начала транскрипции с хлоропластной ДНК был выделен из препаратов хлоропластной РНК полимеразы кукурузы /125/.

Среди продуктов хлоропластной транскрипции были найдены рибосомальные РНК (рРНК), матричные РНК (мРНК) и транспорт -ные РНК (тРНК). Их транскрибирование стимулируется светом, и количество их увеличивается по мере дифференциации хлоропласта /125/.

Для выяснения структуры хлоропластной ДНК огромный вклад внесли эксперименты по фрагментированию молекул ДНК специфическими рестрикционными эндонуклеазами. Комбинация фрагмен -тов пластидной ДНК, полученных при использовании целого ряда рестриктаз, расщепляющих молекулы хлоропластной ДНК в строго специфических участках, позволила сконструировать рестрикци-онные карты пластидной хромосомы для многих представителей высших растений и одноклеточных зеленых водорослей /109,117, 198, 204/,

Дострестрикционные сайты хлоропластной ДНК подвергали гибридизации с РНК и ДНК, а также клонировали их в составе специфических плазмид. Все эти эксперименты позволили сконструировать физическую карту пластидной хромосомы и локализовать на ней специфические гены для тРНК, мРНК и рРНК и ряда полипептидов, необходимых для построения мембран хлоропласта /183/.

Хлоропластная ДНК большинства видов содержит большие инвертированные повторы, которые отделены друг от друга на кольцевидной молекуле ДНК большими и маленькими уникальными областями /66, 78, 109, 163/ (рис. I.I). Эти инвертированные повторы включают в себя гены для хлоропластной рРНК. Наличие трех тандемных повторов характерно для Euglena gracilis/107/. Не обнаружено повторов на хлоропластной ДНК vicia fаЪа /162/ для которой характерен лишь один участок генов,кодирующих pPHK.

Гены для pPHK располагаются и считываются с хлоропластной ДНК в строго определенном порядке, начиная с 3' по 5' конец: I6S - 23s - 5s рРНК.

У высших растений между генами 23 s и 5 s pPHK существует интрон, размером 55-103 нуклеотида, кодирующий РНК 4,5 s, ассоциирующей с 50 s рибосомальной субъединицей /203/,но функция которой еще не известна. У хламидомонады выявлено наличие между-генами 16 s pPHK и 23 s pPHK области, с которой транскрибируются гены 7s и 3 s РНК. Кроме того, гены 23S рРНК прерываются инвертированной последовательностью в 870 пар основании /109, 204Д Гены 16 s и 23 s рРНК отделены друг от друга спейсером, длина которого различается у разных видов, а гибридизация соответствующих тРНК с данной областью пластидной ДНК позволила локализовать в этом сайте определенные тРНК. Помимо этой области гены тРНК локализованы в двух уникальных областях хлоропластного генома. В настоящее время на карте хлоропластной ДНК шпината локализован 21 ген, кодирующий тРНК 14 различных аминокислот, причем 15 генов, соответствующих 12 различным аминокислотам, были определены в большой уникальной последовательности. У кукурузы на хлоро -пластной ДНК локализованы 13 генов идентифицированных тРНК, из них .9 генов локализованы в большой уникальной области. У эвглены из 10 локализованных хлоропластных тРНК 7 также расположены в большой уникальной области /66, 109, 204/. Были определены нуклеотидные последовательности ряда хлоропластных тРНК. Одной из особенностей хлоропластных тРНК является наличие метилированных Г-Г оснований в дигидроурединовой петле и преобладание Т-ОД-А оснований в антикодоновой петле 1У по сравнению с Т-У-Ц-Г последовательностью, которая характерна для нехлоропластных тРНК /83/, Отмечается очень высокая степень гомологии между прокариотическими и хлоропластными тРНК, а также между тРНК, выделенными из хлоропластов различных видов высших растений. Это предполагает стабильность первичной структуры тРНК во время эволюции, В то же время между тРНК хлоропластов эвглены и хлоропластной ДНК высших растений отмечалась очень слабая гибридизация /109/,что может свидетельствовать о различии нуклеотидных последовательностей в первичной структуре эвглены и высших растений.

Формирование структуры хлоропластов при освещении растений связано с биосинтезом специфических хлоропластных белков. Из 30 известных тилакоидных полипептидов, функционирующих в фотосинтезе, как установлено в настоящее время, девять кодируются хлоропластной ДНК, и синтезируются на хлоропластных рибосомах, а семь кодируются ядерной ДНК, синтезируются на цитоплазматических рибосомах, а затем переносятся в хлоропласт /19,9/. Показано также, что образование некоторых белков находится под двойным ядерно-хлоропластным контролем. Это сложные белки, состоящие из нескольких субъединиц,причем часть субъединиц синтезируется в цитоплазме, а часть - в хлоропластах.Объединение их в активный комплекс происходит в хлоропласте. Кроме сложных белков двойной контроль может осуществляться на уровне преобразования синтезированного белка-предшественника в собственно мембранный белок. Примером такого подипептида является тилакоидный белок 32 кило-дальтона (КД), который входит в комплекс ФС П /77, 199/.Появление и накопление этого фоторегуляторного тилакоидного белка регистрируется во время освещения растений и дифференциадии хлоропластов. Причем, вначале образуется белок-предшественник с большей молекулярной массой. Биосинтез предшественника идет на хлоропластных рибосомах, считывание его происходит с мРНК пластид, а кодирующий его ген локализован на хлоропластной ДНК/77, 109, НО, 117, 183, 199/. Действие гена не проявляется в пропластидах и этиохлоропластах,но при освещении происходит активация фитохромной системы и индуцируется экспрессия этого гена. При этом отмечается резкое увеличение активности пластидной РНК полимеразы. Преобразование белка-предшественника 34,5 КД в тилакоидный полипептид 32 КД и встраивание его в мембрану находится под контролем ядерных . генов /134/. Так показано, что белок 32 КД отсутствует у ядерных мутантов /51, 70, 85, 132, .134/, Возможной причиной этого может быть дефект ядерного гена, ответственного за преобразование белка-предшественника.

Положение гена на хлоропластной ДНК, кодирующего белок 32 ЕД, было определено для целого ряда представителей высших растений и одноклеточных водорослей /66, 77, 78, 109, 117, 183, 199, 204/. Он локализован в области большой уникальной последовательности около одного из инвертированных повторов. Нуклеотидная последовательность этого гена установлена для шпината и табака /204, 208/. Гены этих двух видов обладают 95% .гомологии друг к другу и определяют 353 аминокислотных остатка. Причем молекулярный вес белка-предшественника, определенный в этих экспериментах, оказался равен 38950 дальтон, что значительно больше,.чем оценивалось ранее по гель-элект-рофоретическому анализу. Одной из выявленных особенностей этого белка является то, что он не содержит лизиновых остатков и гидрофобных аминокислот. Под действием ядерных генов происходит отщепление низкомолекулярной части, а белок 32 КД встраивается в мембрану.

Такому же типу ядерно-хлоропластного контроля подвергается и биосинтез цитохрома f /117,205/. Он также кодируется хлоропластной ДНК и синтезируется на хлоропластных рибосомах в виде более высокомолекулярного белка-предшественника. Впоследствии от него отщепляется низкомолекулярная часть (л 30 аминокислотных остатков) и происходит встраивание функционального белка в фотосинтетическую мембрану. Последний этап этого процесса может кодироваться и осуществляться под контролем ядерных генов. .

На хлоропластной ДНК картированы также гены для полипептидов Д£ и Д^, функция которых пока неизвестна, гены для оС , Jb и t субъединиц сопрягающего фактора ср^ и субъединиц I и Ш компоненты cfq АТФ-синтазного комплекса, цитохрома в^д, а также ген, кодируадий образование большой субъединицы рибуле-зо-1,5-дифосфаткарбоксилазы (Н.Ф. 4.1.1.39). Все эти гены располагаются в большой уникальной области /94, 117, 124 , 199, 204, 205/. Для некоторых видов растений определены нук-леотидные последовательности хлоропластных генов, определяющих биосинтез отдельных субъединиц АТФ-синтазного комплекса. Сборка функционального нативного комплекса зависит и от действия ядерных генов. Так,ft и & - субъединицы сопрягающего фактора ci^ и субъединица П компонента С]?0 кодируются ядерной ДНК .и синтезируются на цитоплазматических рибосомах. Предполагают, что их синтез может быть или мембраносвязанным, или они синтезируются также в виде более крупных предшественников, которые затем транспортируются в хлоропласт. При этом происходит отделение низкомолекулярной части и объединение с субъединицами, синтезированными в хлоропласте, в активный функциональный комплекс /117, 199, 204/.

Ключевой фермент фотосинтетической фиксации углерода ри-булезо-1,5-дифосфаткарбоксилаза (РДФК) также является белком, чье образование кодируется и контролируется двумя генетическими системами. РДФК in vivo является октомером и состоит из 4-х идентичных больших субъединиц (М.м. около 56000) и четырех идентичных малых субъединиц (М.м. около 12000). Малые субъединицы кодируются ядерной ДНК и наследуются по законам Менделя. Большие субъединицы кодируются хлоропластной ДНК и наследуются по материнской линии.

В настоящее время пластидный ген для большой субъединицы РДФК является наиболее изученным из всех пластидных генов. Он был картирован на физической карте пластидной ДНК различных видов растений /66, 78, 77, 80, 92, 109, 117, 167, 183, 199, 204, 209/. Показано, что кодирующая последовательность белка состоит из 1425 нуклеотидных пар и располагается на хлоропластной ДНК в большой уникальной области. У различных видов растений существует сильная гомология между фрагментами хлоро -пластной ДНК, несущими гены большой субъединицы РДФК, что указывает на стабильность природы этого гена. Анализ нуклеотидных последовательностей в гене большой субъединицы РДФК показал отсутствие "нонсенс" кодонов и "классических" промо-торных последовательностей, для этого гена характерно использование всех кодирующих триплетов для синтеза аминокислот. Фрагменты хлоропластной ДНК, содержащие ген большой субъединицы РДФК были выделены, клонированы с плазмидами е.сони был осуществлен биосинтез бежа in vitro/98, 99/.

Одна лишь собственная хлоропластная система не в состоянии обеспечить хлоропласт воеми компонентами, необходимыми для формирования и функционирования фотосинтетического аппарата. Существенная роль в этом процессе принадлежит ядру. Под контролем ядерных генов находится биосинтез ферментов,ответственных за репликацию самой хлоропластной ДНК, ферментов восстановительного цикла углерода и полипептидов,входящих в состав фотосинтетической мембраны, а также пигментов.

Информацию о роли ядерного генома при сборке активной фотосинтетической мембраны, способной утилизировать энергию света, можно получить, применяя в исследованиях ядерные мутанты, у которых заблокированы определенные реакции фотосинтеза.

Изучение большой серии ядерных хлорофильных мутантов ячменя позволило выявить генетическую регуляцию, закономерность и последовательность биосинтеза хлорофилла /126, 200, 201/.

Конкретная локализация генетического блока представляет интерес для выяснения генетического контроля фотосинтетического аппарата. Поэтому одним из первыж этапов работы с мутантами является генетическая характеристика мутаций и анализ тех физиологических процессов, которые первично блокированы данной мутацией.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Божок, Галина Владимирована

ВЫВОДЫ

I. В результате генетического анализа пяти фотосинтетических мутантов гороха установлено, что их фенотип обусловлен рецессивными неаллельными мутациями ядерных генов.

2. На основании исследования физиологических и биохимических параметров у мутантных форм показано, что идентифицированные ядерные гены контролируют следующие этапы фотосинтеза: а) у линии й I мутантный ген контролирует транспорт электронов на участке, связанном с фоторазложением воды; б) у линии )£ 19 мутация ядерного гена вызывает потерю активности компонента, связанного с реакционным центром ФС II; в) у линии № 5 мутация ядерного гена приводит к частичному нарушению реакций ФС I; г) у линии № 22 мутантный ген блокирует реакции, связанные с пластоцианином; д) у линии № 21 одновременное мутирование двух ядерных генов в разных хромосомах приводит к нарушению функционирования реакционного центра ФС I.

3. Выявлен плейотропный эффект фотосинтетических мутаций у гороха: а) блокирование реакций ФС П приводит к отсутствию высокопотенциальной формы цитохрома уменьшению скоростей реакций на участке ФС I; б) блокирование реакций ФС I приводит к уменьшению биосинтеза цитохромов f и Bg - компонентов электронтранспортной цепи ФС I; в) любые нарушения в ФС I или ФС II отражаются на ультраструктурной организации хлоропластов, изменяется общий метаболизм растительной клетки, что приводит к появлению хлоро-фильного дефекта.

4. Показано, что увеличение концентрации COg в газовой фазе оказывает стимулирующий эффект на углеродфиксиру-ющую способность мутантов, дефектных по ФС I. Это действие повышенных концентраций COg проявляется на уровне ФС П.

5. Исследование мутантов выявило существование альтернативных путей переноса электронов в нециклической эле-ктронтранспортной цепи.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Знание механизмов генетического контроля фотохимической активности хлоропластов необходимо не только потому, что фотосинтез качественно и количественно определяет урожай растений. В настоящее время показано, что устойчивость расте -ний к гербицидам, патогенам, стерильность и другие хозяйст -венно важные признаки также определяются молекулярно-гене -тической организацией хлоропластов.

Успехи в области генной инженерии и молекулярной генетики позволили локализовать ряд генов в хлоропластной ДНК . Клонирование этих генов in vitro даст возможность получить специфические хлоропластные белки, изучить их функцию и возможно даже перенести ген данного белка в другие виды расте -ний.

В изучении ядерного контроля процессов фотосинтеза таких больших успехов пока не достигнуто. Связано это,вероятно, с недостаточностью данных о функции и локализации генов ядра, осуществляющих контроль над реакциями фотосинтеза.

В данной работе исследованы пять ядерных неаллельных рецессивных мутантов гороха. Полученные результаты обобщены в виде таблицы, в которой, оставшаяся активность электронтранс-портной цепи и содержание ее отдельных компонентов, а также активность РДФ-карбоксилазы, представлены в процентах от этих же параметров у исходных сортов.

Мутантные линии фенотипически отличаются от растений нормального фенотипа более светлой окраской листьев. Однако биосинтез хлорофильных пигментов не блокируется ядерной мутацией. Уменьшение пигментации на более поздних этапах онтогенеза связано с нарушением общего метаболизма мутантных

Обобщенные данные, характеризующие изменения в фотосинтетическом аппарате мутантов гороха в процентах)

Исследуемые реакции !---- ! № I ! И 9 Лин ! № 5 и и ! №21 ! №22

Скорость транспортае :

Н20-^- ФЦ 20 I 71 76 87

ДФК—^ ФЦ 89 19

Н20—^НАДФ+ 3 0 47 II 16

ДХФИФ/аск. Яа^НАДФ+ 25 21 57 0 6

Н20-»-цит. f 100 60 50 20 18

ДХФИФ/аск. Na->-nHT.f 150 180 70 40 2 н2о-0 10 63 0 0

ДХФИФ/аск. 1Та-*4Щ 0 0 - 0 0

Фиксация С02 за I мин:

0,03^ С02 23 4 - 4 9

0,5$ С02 22 4 10 20 29

Содержание цитохром- ных компонентов: цит. f, 166 118 43 69 43 в559 в*п* 0 0 137 75 44 в559 н-п- 184 164 100 134 29 в6 81 ИЗ 55 67 45

Содержание хлорофиллов 42 50 61 46 23

Содержание белка фракции I 100 100 100 82 85

Удельная активность РДФК . 75 83 76 63 41

Спектральные характеристики : сигнал I ЭДР в листе + - — + в хлоропласте + + + послесвечение — + + + отсутствие определенной формы хлорофилла "а",нм -648 -648 + -708 + растений вследствие отсутствия у них автотрофной фиксации углекислого газа. Некоторое увеличение фиксации С02 у линий № 21 и № 22 наблюдали при повышении концентрации COg в газовой среде до 0,5%, в то время как при естественной концентрации углекислоты (0,03%) у этих же линий фиксация практически отсутствовала. Однако , подобного концентрационного действия GOg на фиксирующую способность не отмечалось у мутантных линий № I и № 19.

Исследование активности карбоксилиругацих ферментов показало, что активность РДФК и у исходных линий, и у мутантов гороха на два порядка выше активности ФЕПК, которая практически не отличалась у исследованных вариантов. Все мутантные линии, за исключением № 22, обладали довольно высокой удельной и общей активностью РДФК. Следовательно, отсутствие фиксации COg у мутантов не связано с дефектом основного карбо-ксилирущего фермента. Некоторое снижение удельной и общей активности РДФК у мутантов свидетельствует о том, что для проявления ее функции требуется хотя бы часть энергии, запасаемой в фотосинтетической электронтранспортной цепи. Необходимость энергии световых реакций в процессах активации РДФК была показана Тогасаки и Левиным /189/.

Наблвдаемые изменения свойств фермента (термостабильности, температурного оптимума и энергии активации) у мутантов также, очевидно, связаны с нарушениями энергетики листа.

Измененная энергетика листа приводит к нарушению нор -мального распределения меченого углерода во фракцию свободных Сахаров и накоплению метки в фосфорилированных эфирах Сахаров. Мутанты не способны накапливать запасные питательные вещества, на что указывает отсутствие в хлоропластах мутантов крахмальных зерен /43/.

Индукционные кривые послесвечения, отсутствие стимулирования электронного потока при фотовозбуждении преимущественно ФС П, низкий уровень темнового восстановления цитохрома f в листьях и выделенных хлоропластах, блокирование фотовосстановления феррицианида и НАДФ+, а также эндогенного пластоцианина у линий № I и № 19 указывает на наличие блока в ФС П. При добавлении в реакционную среду экзогенных доноров электронов для ФС I функционирование участка цепи, связанного с редокс-превращениями цитохрома f, у этих мутантов идет довольно эффективно. Следовательно, цитохром f не затрагивается мутацией. Об этом же свидетельствует и количественное содержание этого компонента у данных линий.

Снижение скорости восстановления НАДФ+ с электрондонор-ной парой ДХФИФ/аскорбат Na У мутантов $ I и № 19 указывает на плейотропное действие мутации. Использование экзогенных доноров и акцепторов в реакциях ФС П показало, что у линий № I и 16 19 .мутации не идентичны. Так, у линии lb I блок локализуется на участке фоторазложения воды, и донирование электронов дифенилкарбазидом стимулировало электронный поток, вызывая увеличение скорости восстановления феррицианида. Подобного действия дифенилкарбазида не отмечалось у линии № 19, у которой, возможно, блокирован компонент q . У обоих мутантных линий имеется .прямая корреляция между потерей активности ФС П и отсутствием высокопотенциальной формы цитохрома в559* -Исследование .распределения цитохромов в гранальных и стромальных тилакоидах хлоропластов показало, что высокопотенциальный цитохром в^^д встречается только в гранальных областях тилакоидных мембран /60/.

Для мутантов № I и № 19 характерно нарушение гран хлоропласта. У них отсутствует истинная электронплотная полоса контакта между тилакоидами гран и развиваются мощные спрессованные суперграны /43, 51, 164/. Более подробный анализ особенностей строения внутренних мембран хлоропластов мутантной линии № I был проведен И.И.Филиппович и др. /51/. Разделение мембран хлоропластов в ступенчатом градиенте сахарозы позволило получить у мутанта и у исходного сорта два типа мембранных фракций - "тяжелую" фракцию I и "легкую" фракцию П. Эле-ктронномикроскопическое исследование показало, что у исходного сорта "тяжелая" фракция образует скопление тилакоидов, а "легкая" фракция состоит из тилакоидов гран, связанных с фретами, имеющими вид сетей. У мутантной линии № I "легкая" фракция состоит из двух типов структур: типа фрет, где вместо нормальных тилакоидов имеются уплотнения неправильной формы, и типа мембран, имеющих ячеистый характер. Диаметр ячеек равен диаметру тилакоидов макрогран. Как тилакоиды гран у нормальных растений, так и ячейки у мутанта способны к "стыковке" друг с другом в присутствии полипептидов и других мембранных компонентов, ответственных за этот процесс, только у нормальных растений образуются истинные граны, а у мутанта -макрограны. Исследование полипептидного состава установило, что у мутанта № I практически отсутствует полипептид с М.м. 32000 дальтон и сильно снижено содержание полипептида с М.м. 35000 дальтон, который, по всей вероятности, является предшественником полипептида 32000 дальтон и синтезируется в хлоропластах. Вполне возможно, что белок 32000 дальтон необходим для формирования нормальных тилакоидов гран и процессов "стыковки" тилакоидов в гране, а также обеспечения функционирования ФС П. Поскольку синтез белка-предшественника с М.м. 35000 дальтон и полипептида с М.м. 32000 дальтон идет в хлоропласте,то высказывается предположение о нарушении транскрипции ответственной за синтез этого бежа мРНК /51/, при чем, вероятно, этот процесс контролируется ядерным геномом.

Редукция белка 32000 дальтон, связанная с потерей активности ФС П, наблюдалась также у мутантов кукурузы /132/ и ячменя /146/. Отсутствие у обоих мутантов гороха Л 19 и й I. высокопотенциальной формы цитохрома можно также объяснить нарушением контроля со стороны ядерного генома над процессами синтеза, идущими на хлоропластных рибосомах,поскольку и высокопотенциальный цитохром в55д, и белок с М.м.32000 дальтон являются продуктами, синтезируемыми в хлоропласте /34, 35, 94/. У данных мутантов отмечается плейотропное действие мутации, уменьшающее активность реакций ФС I, и этот факт коррелирует со слабым развитием межгранных ламелл /43, 51/. Мутантные линии № I и № 19 являются не аллельными и поэтому, несмотря на то, что у обоих линий имеются сходные дефекты в хлоропластной структуре и активности реакций ФС П , мутация повреждает разные гены ядра.

Исследование мутантных линий № 5, № 21 и № 22 показало, что у них нарушены электронтранспортные реакции ФС I. У мутантов 21 и № 22 полностью отсутствовало восстановление НАДФ+ с электрондонорной парой ДХФИФ/аскорбат Na ,а слабое окисление цитохрома f при включении света не стимулировалось внесением в реакционную среду этого экзогенного источника электронов. У этих же линий не наблюдали фотовосстановления экзогенного пластоцианина. Редокс-превращения эндогенного переносчика у линии № 21 имели очень низкий уровень, а у линии № 22 вообще отсутствовали. У мутанта № 21 ни в листьях, ни в хлоропластах не возникал светоиндуцированный сигнал I ЭПР, который характеризует функционирование реакционного центра ФС I - P^qq. На основании этих результатов можно полагать, что у линии № 21 мутационное повреждение ядерного гена блокирует функциональную активность реакционного центра ФС I - Prj/QQ, а у линии № 22 блок потока электронов локализуется на участке, связанном с пластоцианином. У обоих линий наблвдали деградацию межгранных ламелл и нарушение ориентации ламеллярной системы вдоль большой оси хлоропласта /43/. Дефекты хлоропластной ультраструктуры коррелируют с отсутствием ряда, фотохимических реакций, характерных для ФС I, поскольку известно, что электронтранспортные компоненты этой фотосистемы локализованы в мембранах межгранных ламелл /52/. Плейотропное действие мутации;у линий № 21 и № 22 проявляется в снижении биосинтеза цитохромов f и Bg - компонентов электронтранспортной цепи ФС I. Для линии № 22 характерно также значительное снижение содержания всех цитохромов,включая также высоко- и низкопотенциальные цнтохромы В559»& также уменьшение вдвое удельной активности РДФК. Этот мутант по своим фотохимическим характеристикам чрезвычайно похож на мутант ас-20 из коллекции Левина /106, 135, 142, 144, 189/. У мутанта ас-20 весь спектр нарушений связан с мутацией одного ядерного гена, под контролем которого находится образование хлоропластных рибосом, количество которых резко уменьшено у данного штамма /106, 135/. Поскольку синтез цитохромов f , Bg и Bg5Q, а также больших субъединиц РДФК, от которых зависит удельная активность фермента, идет на хлоропластных рибосомах /34, 35, 90/, то при мутации, ведущей к дефекту этих структур, наблюдается нарушение биосинтеза всех компонентов, осуществляющегося на хлоропластных рибосомах. Можно предположить также, что у линий № 22 мутация ядерного гена приводит к аномалии хлоропластных рибосом.

Что касается линии № 5, то все исследованные параметры указывают на неполное проявление мутации, затрагивающей реакции ФС I. У этой линии гранально-ламеллярная структура хлоропласта почти не отличалась от таковой, свойственной растениям нормального фенотипа.

Кроме того, ядерная мутация, ведущая к потере активности фотосистем, может нарушать также структурный и количественный синтез сразу нескольких компонентов электронтранспортной цепи. Это проявляется в уменьшении количественного содержания исследованных цитохромов.

Такое множественное действие мутации, затрагивающей функционирование сразу нескольких компонентов, хотя сама мута -ция была моногенной, отмечается еще в ряде работ /61, 85, 86, 132, 137/. Возможным объяснением такого плейотропного действия моногенной мутации может то, что синтез и функциональное состояние нескольких компонентов может находиться под положительным или отрицательным контролем одного гена ядра - гена-регулятора /137/. Мутационное повреждение такого гена-регулятора вызывает изменение биохимической активности сразу не -скольких белковых веществ. Вторым объяснением наблюдаемого плейотропного эффекта на множество параметров фотосинтеза может быть то, что в фотосинтетической мембране все компоненты организованы в комплексы, расположенные в определенной пространственной взаимосвязи относительно друг друга /199/. Если в результате стации наблвдается выпадение одного из компонентов, входящих в комплекс, это приводит к нарушению функции не только данного комплекса, но и всей фотосинтетической мембраны. Именно этим можно объяснить множественный эффект моногенной ядерной мутации, приводящей к нарушению реакций фотосинтеза.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Божок, Галина Владимирована, 1984 год

1. Авдеев Ю.И. Явление моногибридного гетерозиса у томатов. - Цитол. и генет., 1980, т. 14, № 4, с. 74-80.

2. Авдеев Ю.И. Генетические особенности летальных мутаций и перспективы их использования в селекции на примере томатов. Генетика, 1983, т. 19, Ж1, с. 1876-1886.

3. Акулова Е.А., Рощина В.В. Светоиндуцированные окислительно-восстановительные превращения цитохрома f в листьях гороха. Биохимия, 1976, т. 41, в. 10, 1742-1747.

4. Акулова Е.А., Рощина В.В. Фотосинтетический перенос электронов на уровне цитохрома f и пластоцианина. Биохимия, 1977, т. 42,.в. 12, 2140-2148.

5. Божок Г.В., Карпилова И.Ф., Гостимский С.А. Фотохимическая и физиолого-биохимическая характеристика желто-зеленых мутантов гороха с неактивными фотосистемами I и П. Физиол. раст.,1982, т. 29, в.4, 705-712.

6. Венедиктов П.С. Исследование послесвечения зеленых растений. Автореф. канд. дисс., МГУ, 1969.

7. Венедиктов П.С., Маторин Д.Н., Рубин А.Б. Изучение зависимости послесвечения фотосинтезирующих организмов от интенсивности возбуждающего света. Научн. докл. высш.школы. Биол. науки, 1969, №. 2, 46-51.

8. Венедиктов П.С., Маторин Д.Н. Применение методов региотрации послесвечения в исследовании фотосинтеза. -"Методы исследования фотосинтетического транспорта электронов". Материалы У Всесоюзного семинара в июле 1973 г., Пущино-на-Оке, 1974, с. 185-191.

9. Вершинин А.В., Соколов В.А., Шумный В.К. Физиолого-биохимические аспекты гетерозиса, полученного на основе хлорофильных мутантов гороха. Ш. Анализ роста. Генетика,1979, т. 15, №11, с. 2006-2012.

10. Гостимский С.А. Генетический контроль фотосинтеза у высших растений. Докт. дисс., М., 1981.

11. Гостимский С.А., Ежова Т.А., Маторин Д.Н. Генетический контроль фотосинтеза у Pisum sativum L.- Физиол.раст.,1981, т. 28, в. 2, 269-279.

12. Ежова Т.А. Цитогенетическое исследование хлорофильных мутантов гороха ( piSUm sativum l.)• Автореф.канд.дисс., 1977, МГУ.

13. Ежова Т.А.,Гостимский С.А. Генетический анализ хлорофильных мутантов гороха. Генетика, 1979, т. 156, в. 4, 691-699.

14. Костиков А.П., Ладыгин В.Г., Мезенцев В.В.,Ильин Ю.Н. Установление места нарушения электронтранспортной цепи хлоропластов у мутантов Chlamydomonas с неактивной фотосистемой П. Биофизика, 1979, т. 24, № 5, 925-927.

15. Кээрберг О.Ф., Вийль Ю.А. Системы регуляции и энергетика восстановительного пентозофосфатного цикла. -Сб. "Физиология фотосинтеза", М., Наука, 1982, с. I04-II8.

16. Ладыгин В.Г. Получение и отбор мутантов одноклеточных водорослей с нарушением цепи фотосинтетического переноса электронов. Физиол. раст., 1976, т. 23, в. 5, 880-884.

17. Ладыгин В.Г. Метод выделения фотосинтезирувдих мутантов по признаку карликовости колоний. Генетика, 1977, т. 13, № 5, 905-909.

18. Ладыгин В. Г. Пигментные мутанты Chlamydomonas ге-inhardi, индуцированные П-нитрозоэтилмочевиной и ультрафиолетовыми лучами. Генетика, 1970, т.6, № 3, 42-50.

19. Ладыгин В.Г. Флуоресценция и формы хлорофилла фотосистемы I и П Chlamydomonas reinhardii . ДАН СССР, Г979, т. 248, .№ 4 , 984-987.

20. Ладыгин В.Г., Биль К.Я., Божок Г.В. Формы хлорофилла и структура хлоропластов мутантов Pisum sativum с потерейактивности фотосистемы I или фотосистемы П. Физиол. раст.,1982, т. 29, в. 3, 479-487.

21. Ладыгин В.Г., Климов В.В., Шувалов В.А.,Тагеева С.В, Характеристика фотохимических реакционных центров трех типов мутантов chlamydomonas reinhardii с неактивными фотосистемами. Физиол. раст., 1976, т. 23, вып. 4, 681-689.

22. Ладыгин В.Г., Садовникова Л.Г. Генетический анализ светлозеленых мутантов Chlamydomonas гeihhardi;.-Генетика, 1973, т. 9, № 6, 45-50.

23. Ладыгин В.Г., Семенова Г.А., Тагеева С.В.Спектральные формы хлорофилла и структура хлоропластов мутантов Chlamydomonas ° нарушениями в светособирающих пигментах. Биофизика, 1979, т. 24, № 4, 681-687.

24. Ладыгин В.Г., Семенова Г.А., Тагеева С.В. Фотохимические свойства и структура мембран хлоропластов гибридного штамма chlamydomonas с неактивными <Ю I и ФС П. Физиол. раст., 1980, т. 27, в. I, 91-99.

25. Литвин Ф.Ф., Шувалов В.А. Изучение фотосинтетических пигментов по спектрам излучения и возбуждения хемилшинесцен-ции хлорофилла в высших растениях. Биохимия, 1966, т. 31, в. 6, 1264-1275.

26. Маторин Д.Н. Изучение связи процессов послесвечения с электронтранспортными реакциями фотосинтеза. Автореф. канд. дисс., 1972, МГУ.

27. Москаленко А.А., Ладыгин В.Г. Белковый состав мембран хлоропластов мутантов Chlamydomonas reinhardii с неактивными фотосистемами I и П. -ДАН СССР, т.249, № 4, I0I7-I0I9.

28. Назарова З.А., Якубова М.М., Кренделева Т.Е. 0 фотохимической активности мутанта Arabidopsis thaliana , выращенного в разных световых условиях. Физиол. раст., 1980,т. 27, в. 3, 525-529.

29. Насыров 10.С. Фотосинтез и генетика хлоропластов. 1975, М., Наука.

30. Насыров Ю.С. Генетическая регуляция формирования активности фотосинтетического аппарата. Сб." Физиология фотосинтеза, М., Наука, 1982, с. 146-164.

31. Попов В.й., Тагеева С.В., Ладыгин В.Г. Надмолекулярная организация мембран хлоропластов у мутантов Chiamydomonas reinhardi с неактивными фотосистемами. Изв. АН СССР, сер. Биология, 1977, № 6, 856-868.

32. Рокицкий П.Ф. Биологическая статистика. Минск, Вы-шэйшая школа, 1967, 327 с.

33. Романова А.К. Биохимические методы изучения автотро-фии у микроорганизмов. М., Наука, 1980.

34. Рощина В.В., Акулова Е.А. Окислительно-восстанови -тельные превращения цитохрома f в изолированных хлоропластах гороха. Физиол. раст., 1975, т. 22, в. 3, 471-478.

35. Рощина В»В., Акулова Е.А., Шубин Л.М. Светоиндуциро-ванные изменения абсорбции при 590 нм в изолированных хлоропластах гороха и их связь с пластоцианином. Молекулярная биология, 1976, т. 10, в. 6, I3II-I3I9.

36. Рощина В.В., Ладыгин В.Г. Определение цитохромов в хлоропластах мутантов Chlamydomonas reiiihardii . Прикл. биохимия и.микробиология, 1979, т. 15,.№ 6, 883-888.

37. Рощина В.В., Таукелева Ш.И. Исследование цитохромов хлоропластов. пшеницы. Физиол. и биохим. культурных растений, 1980, т. 12,. № 3, 252-257.

38. Рощина В.В., Божок Г.В., Гостимский С.А. Исследование фотохимической активности мутантов гороха с нарушениемфотосистем. Биохимия, 1982, т. 47, в. 9, I5I2-I52I.

39. Рубин А.Б., Фохт А.С., Венедиктов П.С. Исследование кинетики затухания послесвечения фотосинтезирувдих организмов. Биофизика, 1966, т. П, в. 2, 299-305.

40. Семенова Г.А., Ладыгин В.Г., Тагеева С.В. Ультраструктурная организация мембранной системы хлоропластов .Chlamy-domonas reinhardii с неактивными фотосистемами. Физиол. раст., 1977, т. 24, в. I, 18-22.

41. Сидорова К.К. Генетика мутантов гороха. Новосибирск, Наука, 1981, 168 с.

42. Современные.методы исследования фотобиологических процессов. МГУ, 1974. .

43. Тарчевский И.А., Карпилов D.C. К вопросу о природе продуктов кратковременного фотосинтеза. Физиол. раст.,1963, т. 10, в. 2, 229-231.

44. Храмова Г.А., Якубова М.М., Кренделева Т.Е. Первичные реакции фотосинтеза у различающихся по продуктивности мутантов хлопчатника. Изв. АН ТаджССР, отд. биологических наук, 1971, № 4, 35-41.

45. Щувалов В.А., Литвин Ф.Ф. О механизме длительного послесвечения листьев растений и запасания энергии в реакционных центрах фотосинтеза. Молекулярная биология, 1969, т. 3, в. I, 59-73.

46. Якубова М.М., Назарова З.А., Кренделева Т.Е. Структурные и функциональные особенности фотосинтетического аппарата мутантов Axabidopsis thaiiana . Биохимия, 1980, т. 45, № 5 , 864-872.

47. Якубова М.М., Назарова З.А., Кренделева Т.Е. Фотохимическая активность хлоропластов пигментных мутантов Arabi-dopsis thaliana • Научные доклады высшей школы, биологические науки, 1981, № 9, 35-39.

48. Якубова М.М., Храмова Г.А., Кренделева Т.Е. Особенности структурной и функциональной активности электронтранс-портной цепи фотосинтеза в связи с продуктивностью у хлопчатника. Сельскохозяйственная биология, 1980, т. 15, № I, 96100.

49. Acker S., Picaud A., Duranten J. Des activites photo-synthetiques sans les complexes pigmentaires CP I et CP2. -Biochim.Biophys.Acta, 1976, N 1, p.269-277.

50. Anderson J.M. Distribution on the cytochromes of spinach chloroplasts between the appressed membranes of grana stacks and stroma exposed thylakoid regions. FEBS Lett., 1982, vol.158, N 1, p.62-66.

51. Anderson J.M., Levin R.P. Membrane polypeptides ofsome higher plants chloroplast. -Biochim.Biophys.Acta, 1974, vol.33$, N 2, p.378-387.

52. Arnold W., Thompson J. Delayed light production byуblue-green algae, red algae and purple bacteria. -J.Gen.Physiol., 1951, vol.34, N 6, p.809-820.

53. Arnone D.I. Copper enzymes in isolated chloroplasts: Polyphenoloxidase in Beta vulgaris. -Plant Physiol., 1949, vol. 24, IT 1, p. 1-9.

54. Arnone D.I., Tsujimoto H.Y., Tang G.M.S. Proton transport in photоoxidation of water: A new perspective on photosynthesis. -Proc.Nat.Acad.Sci.USA, 1981, vol.78, N 3, p.2942-2946.

55. Bar-Nun S., Schants R., Ohad I. Appearance and composition of chlorophyll-protein complexes I and II during chloroplast membrane biogenesis in Chiamydomonas reinhardi y-I. -Biochim.Biophys.Acta, 1977» vol.439, N 2, p.431-467.

56. Bedbrook J.R., Kolodner R. The structure of chloroplast DNA. -Ann.Rev.Plant Physiol., 1979, vol.30, p.593-620.

57. Bendall D.S., Davanport H.E., Hill R. Cytochrome contents in chloroplasts of the higher plants. -Methods in Enzymology, 1971» vol.23, p.327-344.

58. Bennoun P., Girard J., Chua N.-H. A uniparerent mutant of chiamydomonas reinhardtii deficient in chlorophyll-protein complex CP I. -Molec.Gen.Genet., 1977, vol.133, N 1, p.343-348.

59. Bennoun P., Levine R.P. Detecting mutants that have impaired photosynthesis by their level of fluorescence. -Plant Physiol., 1967, vol.42, N 9, p.1284-1287.

60. Bennoun P., Wollmann F.A., Diner B.A. Thylakoid polypeptides associated with photosystem II centers in "Chlamydomonas reinhardi II": comparison of system II mutants and particles. -5th. Intern.Сongr.Photоsynth., Halkidiki, 1980, p.55.

61. Bertsch W.F., Azzi J.R., Davidson J.B. Identification of the oxygen-evolving photoreaction as the delayed light emitter in mutant of Scenedesmus obliques. -Biochim.Biophys. Acta, 1967, vol.145, N 1, p.115-129.

62. Bishop N.I. Preparation and properties of mutants: Scenedesmus. -In: Methods in Enzymology, 1971, vol.23A, p.130-145.73* Blixt S. Mutation genetics in Pisum. -Agri.Hort.Genet., 1972, vol.30, p.1-293.

63. Blixt S. Linkage studies in Pisum. XVI. Chi-genes, de-terminin mutation type chlorotica. -Agri.Hort.Genet., 1978, vol. 36, p.23-47.

64. Blixt S. The pea. -In: Handbook of Genetics, 1975, vol. 2, p.181-221.

65. Boardman N.K., Anderson I.M., Biller E.G., Kahn A., Roughan P.G., Triffry F.E., Thorne S.W. Biosynthesis of the photosynthetic apparatus during chloroplast development in higher plants. -Proc.2nd Intern.Congr.Photosynthetic research, 1972.

66. Bogorad L. Chloroplast. -J.Cell Biol., 1981, vol.91, N 3, p.256-270.

67. Bohnert H.J., Crouse E.J., Schmitt J.M. Organization and expression of plastid genomes. -Encyclopedia of Plant Physiology: Nucleic Acids and Proteins in Plants, 1982, vol.14B, P.475-530.

68. Bottomley W., Whitfeld P.R. Cell-free transcription and translation of total spinach chloroplast DNA. -Eur.J.Bio-chem., 1979, vol.93, N 1, p.31-39.

69. Briat J.F., Mache R. Properties and characterization of a spinach chloroplast RNA polymerase isolated from a transcriptionally active ША-protein complex. -Eur.J.Biochem., 1980, vol.3, N 2, p.503-509.

70. Bunger W., Feierabend J. Capacity for RNA synthesis in 70 S ribosome-deficient plastids of heat-bleached rye leaves. -Planta, 1980, vol. 14-9, N 2, p.163-169.

71. Chua N-H., Levine R.P. The photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardii: VIII. The 520 nm light-induced absorbance change in the wild-type and mutant strains. -Plant Physiol., 1969, vol.44, N 1, p.1-6.

72. Chua N-H, Bennoun P. Thylakoid membrane polypeptides of Chlamydomonas reinhardii: Wild type, mutant strains deficient in photosystem 2 reactional center. -Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1975, vol.72, it 6, p.2175-2179.

73. Chua N-H., Maltin K., Bennoun P. A chlorophyll-protein complex lacking in photosystem I of Chlamydomonas rein-hardtii. -J.Cell Biol., 1975, vol.67, N 1, p.361-377.

74. Chua N-H. Photooxydation of 3-3,-diaminobenzidine byblue green algae and Chlamydomonas reinhardtii. -Biochim.Biophys.Acta, 1972, vol.267, N 1, p.179-189.

75. Chua N-H, Gillham N.W. The sites of synthesis of the principal thylakoid membranes polypeptides in Chlamydomonas reinhardtii. -J.Cell Biol., 1977, vol.74, N 2, p.441-4-52.

76. Commoner В., Heise J.J., Lippincott B.B. et al. Biological activity of free radicals. -Science, 1957, vol.126,1. N 5265, p.57-65.

77. Ellis J.R. Chloroplast proteins: synthesis transport and assembly. -Annu.Rev.Plant Physiol., 1981, vol,52, p.W-157.

78. Epel B.L., Butler W.L., Levine R.P. A spectroscopic analysis of low-fluorescent mutant of Chlamydomonas reinhardtii blocked in their water-splitting oxygen-evolving apparatus. -Biochim.Biophys.Acta, 1972, vol,275, N 5, p,595-400.

79. Gibbons G.G., Smillie R.M. Chlorophyll fluorescence photography to detect mutants, chilling injury and heat stress, -Carlsberg Res.Commun., 1980, vol.45, N 4, p.269-282.

80. Girard J., Chua N-H., Bennoun P. Studies on mutants deficient in the chlorophyll-protein complex CP I in Chlamydomonas reinhardtii. -5th Intern.Congr.Photosynth., 1980, Halkidiki, p.209.

81. Gorman D.C., Levine R.P. Photosynthetic electrontransport chain of Chlamydomonas reinhardtii. IV. Electron transport in mutant strains lacking either cytochrome 553 or plastocyanin. -Plant Physiol., 1966, vol.41, N 10, p.1648-1656.

82. Gorman D.C., Levine R.P. Cytochrome f and plastocyanin their sequence in the photosynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardtii. -Proc.Natl,Acad.Sci.USA, 1965, vol.54, N 6, p.1665-1669.

83. Govindjii, van Rensen J.J. Bicarbonate effects on the electron flow in isolated broken chloroplasts. -Biochim. Biophys.Acta, 1978, vol.505, N 2, p.183-213.

84. Goodenough U.W., Levine R.P. Chloroplast structure and function in ac-20, a mutant strain of Chlamydomonas reinhardtii. III. Chloroplast ribosomes and membrane organization. -J.Cell Biol., 1970, vol.44, N 3, p.547-562.

85. Gray P.W., Hallick R.B. Physical mapping ША and ri-bosomal RNA gene region. -Biochemistry, 1978, vol.17, N 1, p. 284-289.

86. Hagemann R. Genetics and molecular biology of plastids of higher plants. -Stadler Sympos,, 1979, vol.11, p.91-115.

87. Hagemann R., Borner T. Extranuclear inheritance. Plas-tid genetics. -Progress in Botany, 1981, vol.43, p.159-173.

88. Hagemann R., Borner F. Plastid ribosom deficient mutants of higher plants as a tool in studying chloroplast biogenesis. -Chloroplast development, 1978, vol.2, p.709-720.

89. Hardt H., Malkin S., Epel B. Fluorescence and triggered luminescence of mutants of Chlamydomonas reinhardtii with lesions associated with photosystem II. -Proc.3d Intern.Congr. Photоsynth., 1974.

90. Hiller E.G., Moller B.L., Hover-Hansen G. Characterization of six putative photosystem I mutants of barley. -Carlsberg Res.Commun., 1980, vol.45, N 4, p.315-328.

91. Hind G., Nakataki H.G. Determination of the concentration and the redox potential of chloroplast cytochrome 559. -Biochim.Biophys.Acta, 1970, vol.216, N 1, p.223-225.

92. Hopkings W.G., Hayden D.B., Neuffer M.G. A light-sensitive mutant in maize. I, Chlorophyll, chlorophyll-proteinand ultrastructural studies. -Z.Pflanzenphysiol., 1980, vol. 99, N 5, p.417-426.

93. Hopkings W.G., German J.В., Hayden D.B. A light-sensitive mutant in maize. II. Photosynthetic properties. -Z.Pflanzenphysiol., 1980, vol.100, N 1, p.15-24,

94. Howe C.J., Bowman C.M., Dyer T.A., Gray J. The genes for the alpha and proton-translocation subunits of wheat chloroplast ATP synthase are close togёther on the same strand of chloroplast DNA. -Mol.Gen.Genet., 1983, vol.190, N 1, p.51-55.

95. Jolly S.O., Bogorad L. Prefential transcription of cloned maize chloroplast DNA sequences by maize chloroplast RNA polymerase. -Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1980, vol.77, N 2, p.822-826.

96. Kahn A., Avivi-Bleiser N., Wettstein von D. Genetic regulation of chlorophyll synthesis analyzed with double mutants in barley. In: Genetics and Biogenesis of chloroplasts and mitochondria, 1976, p.119-131.

97. Kawashima N., Wildman S.G. Studies on fraction I protein. IV. Mode of inheritance of primary structure in relation to whether chloroplast or nuclear DNA contains the code for a chloroplast protein. -Biochim.Biophys.Acta, 1972, vol.262, N 1, p.42-49.

98. Kohl D.H., Townsend J., Commoner B. et al. Effect of isotopic substitution on electron spin resonance signals in pho-tosynthetic organism. -Nature, 1965, vol.206, N 4989, p.1105-1110,

99. Lamppa G.K., Elliot L.V., Bendich A.J. Changes in chloroplast number during pea leaf development. An analysis of protoplast population. -Planta, 1980, vol.148, N 5, p.437-443.

100. Levine R.P. Genetic dissection of photosynthesis. -Science, 1968, vol.162, p.768-771.

101. Levine R.P., Ebersold W.T. The genetic and cytology of Chlamydomonas. -Annu.Rev.Microbiol,, 1960, vol,14, p,197-216,

102. Levine R.P., Gorman D.S. Photоsynthetic electron transport chain of Chlamydomonas reinhardtii. III. Light-induced absorbance changes in chloroplast fragments of wild type and mutant strains. -Plant Physiol., 1966, vol.41, N 8, p.1293-1300.

103. Levine R.P,, Paszewski A. Chloroplast structure and function in ac-20, a mutant strain of Chlamydomonas reinhardtii. II. Photosynthefcic electron transport. -J.Cell Biol., 1970, vol. 44, N 3, p.540-546.

104. Levine R.P., Piette L. An investigation of electron spin resonance in wild type Chlamydomonas reinhardi and mutant strain having impaired photosynthesis. -Bioph.J., 1962, vol,2,1. N 5, P.369-375.

105. Levine R.P., Togasaki R.K. A mutant strain of Chlamydomonas reinhardi lacking ribulosediphosphate carboxylase activity. -Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1965, vol.53, N 5, p.987-990.

106. Lowry O.H., Rosenbrough N., Farr L., Randall R. Protein measurement with Folin phenol reagent. -J.Biol.Chem., 1951, vol.193, N 1, p.265-275.

107. Machold 0., Hoyer-Hansen G. Polipeptide composition of thylakoids from viridis and xantha mutants of barley. -Carlsberg Res.Commun,, 1976, vol.41, N 6, p.359-366.

108. Manual on Mutation Breeding. 1977»

109. Maroc J., Garnier J. Recherche du cytochrome et du P^qq chez trois mutants non photosynthetiques de Chlamydomonas reinhardtii. -Biochim.Biophys.Acta, 1973j vol.292, N 2,p.477-490.

110. Maroc J., Garnier J. Gel electrophoresis of chloroplast membranes of mutants of Chlamydomonas reinhardtii which have impaired photosystem II function and lack photоsynthetic cytochromes. -Biochim,Biophys.Acta, 1981, vol.657» N 5, p.475-480.

111. Matorin D.N., Venedictov P.S., Gostimskii S.A., Kren-deleva Т.Е., Timofeev K.N., Rubin A.B. Delayed light emission of photosynthetic mutant of Pisum sativum, blocked at photosystem II. -Studia biophys., 1974, vol.44, N 2, p.85-92.

112. Miles D. Mutants of higher plants: Maize. -In: Methods in Enzymology, 1980, vol.69, P.C, p.5-23.155* Miles D., Daniel D.J. Chloroplast reactions of photosynthetic mutants in Zea mays. -Plant Physiol,, 1974» vol.53» N 4, p.589-595.

113. Moller B.L., Smillie R.M., Hoyer-Hansen C. A photo-system I mutant in barley. -Carlsberg Res.Commun., 1980, vol.45, N 2, p.87-99.

114. Nolan W.S., Bishop D.G. The site of inhibition of photosynthetic electron transfer by Amphotericin B. -Arch.Bio-chem.and Biophys,, 1975, vol.166, N 1, p.525-529.

115. Nugent J.H.A., Moller B.L., Evans M.C.W. EPR detection of the primary photochemistry on photosystem II in a barley mutant lacking photosystem I activity. -EEBS Lett., 1980, vol. 121, N 2, p.555-557.

116. Palmer J.D., Thompson W.E. Chloroplast DNA rearrangements are more frequent when a large inverted repeat sequence is loss. -Cell, 1982, vol.29, p.537-550.

117. Palmer J.D., Singh G.P., Pillay D.T.N. Structure and sequence evolution of three legume chloroplast DNAs. -Mol.Gen. Genet., 1985, vol.190, N 1, p.15-19.

118. Popov V.I., Matorin D.N., Gostimsky S.A., Tageeva S.V., Allakh.verd.ov B.L. Ultrastructural organization of chloroplast membranes in mutants of Pisum sativum L. with impaired, activity in the photоsystems. -Planta, 1981, vol.151, N 6,p.512-524.

119. Punnett T. Influence of growth conditions on the enhancement of photophosphorylation by carbon dioxide. -Plant Physiol., 1965, vol.40, N 6, p.1283-1284.

120. Rosa F.F., Galvan Т., Losada M. Cytochrome b-559 as an energy-transducing redox system in noncyclic photophospho-rylation. -5th Int.Congr.Photosynth,, 1980, Halkidiki, p.1-484.

121. Roschina V.V., Akulova E.A. Light-induced absorption changes at 590 nm in pea etioplasts associated with plastocya-nin. -Plant Science Lett., 1977, vol.9, N 3, p.253-258.

122. Sager R., Ramanis Z. Chloroplast genetics of Chlamydomonas. I. Allelic segregation rations. -Genetics, 1976, vol. 83, N 6, p.303-321.

123. Sato V.L., Levine R.P., Newmann J. Photosynthetic phosphorylation in Chlamydomonas reinhardtii.Effect of a mutation altering an ATP-synthesizing enzyme. -Biochim.Biophys.Acta, 1971, vol.253, N 2, p.437-448.

124. Satoh K. Further characterization of a photosystem1. chlorophyll-a-protein complex from digitonin extracts of spinach chloroplasts.-5th Int.Congr.Photosynth.,Halkidiki, 198O,p.501.

125. Schwelitz F.D., Dilley R.A., Crane F.L. Biochemical and biophysical characteristics of a photosynthetic mutant of Euglena gracilis blocked in Photosystem II. -Plant Physiol., 1972, vol.50, N 1, p.161-165.

126. Schwelitz F.D., Dilley R.A., Crane F.L. Structural characteristics of photosynthetic mutants of Euglena gracilis blocked in Photosystem II. -Plant Physiol., 1972, vol.50, N 1, p.166-170.

127. Scott U.S., Possingham J.V. Chloroplast DNA in expanding spinach leaves, -J.Exp.Bot., 1980, vol,31, N 125, p.1081-1092.

128. Shneyour A. On the site of electron donation to the photosynthetic electron transport chain by 1,5-diphenilcarbazide. -Biochem.Biophys.Res.Commun., 1973, vol.51, N 2, p.391-398.

129. Simpson D.J., Wettstein von D. Macromolecular physiology of plastids. XIV. Viridis mutants in barley: genetic, fluoroscopic and ultrastructural characterization. -Carlsberg Res.Comm., 1980, vol,45, N 4, p.283-314,

130. Singh S., Wildman S.G. Chloroplast DNA codes for the ribulose diphosphate carboxylase catalytic site on fraction I protein of Nicotiana species. -Mol.Gen.Genet., 1973, vol.124, N 3, p.187-196.

131. Smillie E.M., Neilsen N.C., Henningsen K.W., Wettstein von D, Development of photochemical activity in chloroplast membranes. I. Studies with mutants of barley grown under a single environment. -Austral.J.Plant Physiol., 1977, vol.4, N 3, p.415-438.

132. Smillie R.M., Neilsen N.C., Henningsen K.W., Wettstein von D. Development of photochemical activity in chloroplast membranes. II. Studies with a mutant barley grown under different environments. -Aust.J.Plant Physiol., 1977, vol.4, N 3, p.439-449.

133. Smillie R.M., Henningsen K.W., Bain J.M., Critchley C., Pester Т., Wettstein von D. Mutants of barley heat-sensitive for chloroplast development. -Carlsberg Res.Commun., 1978, vol.43,1. N 5, p.351-364.

134. Smith H.J., Bogorad L. The polypeptide subunit structure of the DNA-dependent RNA polymerase of Zea mays chloroplast. -Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1974, vol.71, N 2, p.4839-4842.

135. Surzycki S.J., Shellenbarger D.L. Purification andcharacterization of a putative sigma factor from Chlamydomonas reinhardtii. -Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1976, vol.73, N II, p.3961-3963.

136. Togasaki R.K., Levine R.P. Chloroplast structure and function in ac-20, a mutant strain of Chlamydomonas reinhardtii. I. C02 fixation and ribulose-1,5-diphosphat carboxylase synthesis. -J.Cell Biol., 1970, vol.44, N 3, p.331-539.

137. Trebst A. Energy conservation in photоsynthetic electron transport of chloroplast. -Annu.Rev.Plant Physiol., 1974, vol.25, p.423-458.

138. Trecharne R.W., Brown Т.Е., Vernon L.P. Separation of two light-induced EPR signals in several algae species. -Biochim. Biophys.Acta, 1963, vol.75, N 3, p.324-332.

139. Vernon L.P. Spectrophotometric determination of chlorophyll and pheophetins in plant extracts. -Analyt.Chem., 1960, vol.32, p.1144-1152.

140. Vernon L.P., Shaw E.R. Photoreduction of 2,6-dichlor-phenolindophenol by catalysed by tris-washed chloroplasts and subchloroplast .fragments. -Plant Physiol., 1969, vol.44, N II, p.1645-1649.

141. Weaver E.C., Bishop N. Photosynthetic mutants separate EPR signals of Scenedesmus. -Science, 1965, vol.140, N 5571, p.1095-1097.

142. Wettstein von D. Chloroplast and Nucleus: Concerted interplay between genomes of different cell organelles. -Intern. Cell Biol., 1981, p.250-272.

143. Wettstein von D., Kristiansen K. Stocklist for nuclear gene mutants affecting the chloroplast. -Barley Genet.Newsletter, 1975, vol.5, p.115-117.

144. Wettstein von D., Lundquist U., Wettstein von K.P. The mutagen specificities of 44 eceriferum loci in barley. -Mutations in Plant Breeding. II. Vienna, IAEA, 1968, p.275-276.

145. Whatley F.R., Arnon D.I. Photosynthetic phosphorylation in plants. -In: Methods in Enzymology, 1965, vol.6, p.508-515.

146. Whitfeld P.R., Leaver C.J., Bottomley W., Atchison B.A. Low molecular weight (4,5S) ribonucleic acid in higher plant chloroplast ribosomes, -Biochem.J., 1978, vol.175, N 5, p.1105-1112.

147. Whitfeld P.R., Bottomley W. Chloroplast DNA. -Ann.Rev. Plant physiol., 1985, vol.54, р.279-5Ю.

148. Willey D.L., Huttly A.K., Phillips A.L., Gray J.C. Localization of the gene for cytochrome f in pea chloroplast DNA.-Mol.Gen.Genet., 1983, vol.189, N 1, p.85-89.

149. Yakubova M.N., Nazarova Z.A., Chramova G.A., Usmanov P.D., Rubin A.B. On primary processes of the photosynthetic electron transport in chloroplast and intact leaves of Arabidop-sis thaliana L. -2nd Int.Symp.Arabidopsis Res., 1976, p.144-146.

150. Zielinski R.E., Hind G. Synthesis of thylakoid membrane proteins by chloroplasts isolated from spinach. Cytochrome b-559 and Pr^-chlorophyll a protein. -J.Cell Biol., 1930, vol.85, N 2, p.455-445.

151. Zurawski G., Bottomley W., Whitfeld P.R. The structure of the large subunit of ribulose-1,5-biphosphate carboxylase from spinach chloroplast DNA. -Nucleic Acids Res., 1981, vol.9,1. N 5, p.5251-3270.