МикроРНК-21 и белок-мишень PDCD4 в слизистой оболочке желудка как прогностические маркеры риска развития аденокарциномы желудка тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.02, кандидат наук Рубцов Вячеслав Александрович

• Рубцов Вячеслав Александрович
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Рубцов Вячеслав Александрович

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. СПОСОБЫ ОЦЕНКИ РИСКА РАЗВИТИЯ РАКА ЖЕЛУДКА, РОЛЬ МИКРОРНК В ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ КАНЦЕРОГЕНЕЗА (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1. Способы классификации хронического гастрита и оценки

риска развития рака желудка

1.1.1. Морфологические классификации хронического гастрита

как основа оценки риска развития рака желудка

1.1.2. Молекулярно-генетические маркеры как предикторы

и основа классификации рака желудка

1.2. Роль микроРНК и их белков-мишеней в эпигенетической регуляции молекулярных механизмов канцерогенеза

1.2.1. МикроРНК как эпигенетические регуляторы молекулярных механизмов канцерогенеза

1.2.2. РБСВ4 - ключевой белок-мишень miR-21

в регуляции молекулярных механизмов канцерогенеза

1.3. Заключение

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Организация исследования

2.2. Материалы исследования

2.3. Методы исследования

2.3.1. Подготовка образцов и гистологическая проводка

2.3.2. Гистологические методы исследования

2.3.3. Метод детекции экспрессии miR-21

2.3.4 Методика формирования тканевых матриц

2.3.5 Гистохимические методы исследования

2.3.6. Иммуногистохимический метод исследования

2.3.7. Методы статистической обработки данных

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Гистопатологическая оценка и сравнение морфологического фенотипа исследуемых групп

3.2. Гистохимическая характеристика и сравнение групп биопсийного исследования и дистантной зоны операционного материала

3.3. Эпителиальная экспрессия PDCD4 на этапах каскада канцерогенеза в желудке

3.4. Оценка потенциала индекса белка PDCD4 в качестве диагностического маркера интраэпителиальной

дисплазии/неоплазии

3.5. Характеристика экспрессии miR-21 в тканях слизистой оболочки желудка при хроническом гастрите и раке желудка

3.6. Регрессионный анализ экспрессии miR-21 в образцах дистантной зоны операционного материала и биоптатах слизистой оболочки желудка

3.7. Корреляционный анализ взаимосвязи экспрессии miR-21 и индекса белка PDCD4 в исследуемых группах

Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

4.1. Особенности продукции белка PDCD4 в слизистой оболочке желудка при хроническом гастрите и в тканях аденокарциномы

4.1.1. Особенности внутриклеточной локализации белка РВСЭ4

в слизистой оболочке желудка

4.1.2. Особенности внутриклеточной локализации белка РВСЭ4

в тканях аденокарциномы желудка

4.1.3. Способы оценки иммуногистохимической метки PDCD4

4.2. Особенности экспрессии miR-21 в слизистой оболочке желудка

при хроническом гастрите и в тканях аденокарциномы

4.2.1. Особенности экспрессии miR-21 в слизистой оболочке

желудка

4.2.2. Особенности экспрессии miR-21 в тканях аденокарциномы желудка

4.2.3. Характеристика прогностического потенциала экспрессии ш1Я-21 в слизистой оболочке желудка

4.3. Характеристика корреляционной взаимосвязи экспрессии miR-21

и индекса белка PDCD4 в слизистой оболочке желудка

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ВВЕДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «МикроРНК-21 и белок-мишень PDCD4 в слизистой оболочке желудка как прогностические маркеры риска развития аденокарциномы желудка»

Актуальность исследования

Рак желудка занимает пятое место по частоте и третье по уровню смертности от злокачественных опухолей в мире, при этом кумулятивный риск возникновения рака желудка в течение жизни для мужчин равен 1,87%, для женщин - 0,79% [95]. Наиболее часто инициация канцерогенеза аденокарциномы желудка ассоциирована с персистирующей воспалительной инфильтрацией слизистой оболочки желудка, в 90% случаев запускаемой Helicobacter pylori (H.pylori-ассоциированный хронический гастрит), которая ведет к прогрессирующей атрофии и кишечной метаплазии в слизистой оболочке желудка, затем интраэпителиальной неоплазии/дисплазии и в финале - аденокарциноме (каскад P. Correa) [59]. H. pylori-ассоциированный хронический гастрит - основной фактор риска развития рака желудка, ответственный за возникновение 90% случаев [94]. Но при этом из 100 человек, инфицированных в детском возрасте, только у 2 возникает аденокарцинома желудка [5]. Соответственно, для диагностики группы высокого риска развития рака желудка необходимо выявить индивидуальные особенности, факторы, которые позволят выделить таких индивидов из общей популяции.

Основой существующих методов предикции рака желудка является морфологическая диагностика необратимых этапов этого каскада - атрофии и интраэпителиальной неоплазии/дисплазии при исследовании биоптатов слизистой оболочки желудка. Но эффективность применения наиболее широко распространенных способов гистологической оценки риска развития рака желудка -Модифицированной Сиднейской системы, системы OLGA/OLGIM ограничена из-за частого нарушения протокола забора и подготовки материала для гистологического исследования, субъективности и зачастую невозможностью оценки выраженности атрофии при недостаточном качестве исследуемого материала [34].

Иным способом решения проблемы персонифицированной оценки риска развития рака желудка может быть детекция молекулярных маркеров, ассоциированых с канцерогенезом. В ряде исследований была продемонстрирована важная роль в канцерогенезе многих злокачественных опухолей, в том числе рака желудка,

нарушений в эпигеномных механизмах регуляции клетки, таких как микроРНК, которые являясь некодирующими РНК, эпигенетически подавляют экспрессию генов за счет связывания и последующего разрушения соответствующих мРНК [49, 138]. Участие микроРНК и их белков-мишеней в молекулярных механизмах, имеющих ключевое значение в канцерогенезе, делает оценку их уровня в эпителиальных клетках слизистой оболочки желудка актуальной в аспекте поиска молекулярных маркеров предикции риска развития, ранней диагностики рака желудка.

Степень разработанности темы исследования

Хорошо известно, что микроРНК, эпигенетически ингибируя экспрессию большого количества генов, подавляют синтез белков из ключевых сигнальных путей клетки, участвуя тем самым в регуляции пролиферации и дифференцировки [171], апоптоза [113], эпителиально-мезенхимального перехода [16] - процессов, играющих ключевую роль в канцерогенезе, что подтверждается аберрантной экспрессией микроРНК во многих опухолях, в том числе и при раке желудка [7, 36, 138]. При этом одной из наиболее яркой по данным ряда публикаций, в том числе мета-анализов, при раке желудка представляется роль miR-21 [89, 137, 168, 191].

Важнейшим белком-мишенью ш1Я-21, за счет подавления синтеза которого она реализует свое влияние на ключевые биологические процессы клетки такие как пролиферация, апоптоз, эпителиально-мезенхимальный переход, является белок РБСВ4 [72, 100, 132, 183]. Как один из ключевых белков-онкосупрессоров он подавляет избыточный синтез белков за счет регуляции активности эукариотического комплекса инициации трансляции, поэтому понятно выраженное снижение его количества в клетках злокачественных опухолей [62].

Несмотря на большое количество работ, посвященных экспрессии ш1Я-21 и ее белка-мишени РВСЭ4, в литературе не в полной мере представлены изменения их уровней на разных этапах каскада канцерогенеза при формировании рака желудка. Неясными остаются и взаимосвязи ш1Я-21 и ее белка-мишени РВСЭ4 с морфологическими изменениями в слизистой оболочке желудка при хроническом гастрите и раке желудка. Неизвестно, могут ли эти две биологически сопряженные молекулы выступать предикторами рака желудка.

Цель исследования

Оценить возможность использования экспрессии miR-21 и ее белка-мишени PDCD4 в качестве маркеров предикции риска развития аденокарциномы желудка при ранних предраковых изменениях слизистой оболочки желудка.

Задачи исследования

1. Исследовать продукцию белка-мишени PDCD4 в эпителии эндоскопических биоптатов слизистой оболочки желудка при хроническом гастрите с разной степенью выраженности воспаления, атрофии и в операционном материале при аденокарциноме желудка - в тканях аденокарциномы и дистантой зоне, вне опухолевого роста.

2. Оценить экспрессию miR-21 в эндоскопических биоптатах слизистой оболочки желудка при хроническом гастрите с разной степенью выраженности воспаления, атрофии и в операционном материале при аденокарциноме желудка -в тканях аденокарциномы и дистантой зоне, вне опухолевого роста.

3. Сопоставить уровни экспрессии miR-21 и ее белка-мишени PDCD4 при ранних предраковых изменениях, аденокарциноме желудка и оценить валидность их использования в качестве компонентов предиктивной модели стратифицированной оценки риска развития аденокарциномы желудка.

Научная новизна

В результате проведенного исследования уточнен характер продукции и локализации белка PDCD4 в эпителиоцитах слизистой оболочки желудка при хроническом гастрите, интраэпителиальной дисплазии/неоплазии и аденокарциноме. Разработан способ полуколичественной оценки белка PDCD4, при его иммуногистохимической идентификации, позволяющий проводить дифференцированную оценку ядерной и цитоплазматической фракции белка в соответствии с их биологической и диагностической значимостью при аденокарциноме желудка и хроническом гастрите. Определена высокая валидность белка PDCD4 (чувствительность, специфичность) иммуногистохимического маркера интраэпителиальной дисплазии/неоплазии и аденокарциномы желудка. Показана более высокая (в сравнении с определением стадии хронического

гастрита и индекса преобладания гастрита тела) предиктивная значимость уровня экспрессии miR-21 в отношении риска развития аденокарциномы желудка.

Теоретическая и практическая значимость

Полученные данные об уровне экспрессии miR-21 в слизистой оболочке желудка могут послужить теоретической базой для разработки системы ранней оценки риска развития аденокарциномы желудка.

Способ полуколичественной иммуногистохимической оценки белка PDCD4, позволяет проводить дифференцированную оценку ядерной и цитоплазматической фракции белка, что может быть использовано в качестве дополнительного иммуногистохимического маркера аденокарциномы и интраэпителиальной дисплазии/неоплазии желудка в системе поддержки принятия решения.

Разработана оригинальная модификация способа формирования тканевых матриц для проведения гистохимического и иммуногистохимического методов исследования, позволяющая увеличить эффективность и снизить продолжительность проведения гистохимического и иммуногистохимического методов исследования в практике патологической анатомии.

Предиктивная статистическая модель, включающая морфологические показатели - стадия хронического гастрита, индекс преобладания гастрита тела желудка в сочетании с уровнем тканевой экспрессии miR-21, демонстрирует высокую валидность в отношении стратифицированной оценки риска развития аденокарциномы желудка.

Методология и методы исследования

В соответствии с целью и задачами разработан дизайн одномоментного исследования методом поперечного среза. В качестве объекта исследования выступали биоптаты слизистой оболочки желудка и операционный материал желудков, удаленных по поводу аденокарциномы. Предмет исследования -морфологические изменения слизистой оболочки желудка, уровень экспрессии ш1Я-2 1 и иммуногистохимически определяемая продукция белка PDCD4 в тканях слизистой оболочки желудка при хроническом гастрите и аденокарциноме желудка. В работе были использованы гистологический, гистохимический,

иммуногистохимический, молекулярно-генетический методы исследования с последующей описательной и аналитической статистической обработкой полученных данных.

Основные положения, выносимые на защиту

1. В слизистой оболочке желудка уровень экспрессии miR-21 является фактором предикции аденокарциномы желудка, что позволяет использовать данный маркер в качестве компонента системы оценки риска развития аденокарциномы желудка. Предиктивная статистическая модель, включающая морфологические показатели - стадия хронического гастрита, индекс преобладания гастрита тела желудка в сочетании с уровнем тканевой экспрессии ш1Я-21, позволяет повысить прогностическую ценность биопсийного исследования в отношении стратифицированной оценки риска развития аденокарциномы желудка.

2. Полуколичественная иммуногистохимическая оценка продукции белка PDCD4 обладает высоким уровнем диагностической ценности в качестве молекулярного маркера клеток аденокарциномы желудка, что позволяет использовать его в системе поддержки принятия решений при дифференциальной диагностике неопределенной и истинной дисплазии эпителия слизистой оболочки желудка, однако при этом исключает возможность применения в качестве фактора предикции риска развития аденокарциномы желудка.

Степень достоверности результатов

Достоверность полученных результатов обосновывается достаточным объемом исследуемых групп, превышающим вычисленный минимальный объем выборки. А также применением внутреннего положительного и отрицательных контролей при проведении иммуногистохимического исследования, нормализацией значений экспрессии miR-21 на малую РНК иб, использованием способов описательной статистики и критериев статистического анализа в зависимости от типа данных и соответствия задачам статистичесческой обработки с использованием актуального пакета статистического программного обеспечения.

Апробация результатов исследования

Основные материалы и положения диссертации доложены на II Всероссийской научно-практической конференции "Современные подходы к морфологической диагностике новообразований человека" (г. Челябинск, 18-19 марта 2016 г.), V съезде Российского общества патологоанатомов (г. Челябинск, 1-4 июня 2017 г.), Общероссийском научно-практическом мероприятии «Эстафета вузовской науки-2019» (г. Москва, Сеченовский Университет, 27-28 февраля 2019 г.), региональной конференции OPEN INNOVATIONS STARTUP TOUR Фонда «Сколково» (г. Омск, 12-13 февраля 2019 г.), V Межвузовской научной сессии молодых ученых и студентов (г. Омск, 19-20 апреля 2019 г.), 31 Международном Европейском конгрессе патологов (Франция, г. Ница, 7-11 сентября 2019 г.), IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Современные подходы к морфологической диагностике новообразований человека» (г. Челябинск, 11 -12 октября 2019 г.), XII Научной конференции молодых ученых ОмГМУ (г. Омск, 22 января 2020 г.), VI Межвузовской научной сессии молодых ученых и студентов (г. Омск, 2020 г.).

Внедрение результатов исследования

Данные, полученные в результате исследования и сформированные в виде зарегистрированной базы данных «Роль микроРНК в эпигенетической регуляции экспрессии генов при развитии рака желудка», внедрены в учебный процесс (специалитет) в объеме образовательных программ дисциплин «патологическая анатомия, клиническая патологическая анатомия», «патологическая анатомия», «патологическая анатомия, секционный курс» кафедры патологической анатомии ФГБОУ ВО «ОмГМУ» Минздрава России.

Грантовая поддержка

Работа выполнена при поддержке гранта «УМНИК ХЕЛСНЕТ НТИ» № 39778 «Разработка предсказательной тест-системы для персонифицированной ранней оценки риска развития рака желудка» 2018-2020 гг, «Фонд Содействия Инноваций». Иммуногистохимический раздел исследования был выполнен в

рамках реализации Гранта Президента РФ «Разработка высоковалидных молекулярно-клеточных и эпигеномных сигнатур для оценки персонифицированного риска и ранней диагностики рака желудка» № госрегистрации НИР - AAAA-A17-117041210205-6, Грант МД-692.2017.7.

Публикации

По теме диссертационного исследования опубликовано 10 печатных работ, из них в журналах, входящих в перечень рецензируемых изданий, рекомендованных ВАК для публикации основных научных результатов диссертаций по специальности патологическая анатомия - 3 статьи, одна из которых в журнале, индексируемом в базе данных SCOPUS, 2 публикации в зарубежном журнале, индексируемом в базе данных SCOPUS. Получено 2 патента на изобретение, патент на полезную модель - 1, зарегистрирована база данных - 1.

Личный вклад автора

Автором были выполнены следующие этапы работы: анализ публикаций по теме диссертационного исследования, систематический литературный обзор, вырезка операционного материала желудков, ориентировка фрагментов группы биопсийного материала, формирование тканевых матриц, гистологическое, гистохимическое, иммуногистохимическое исследование, подготовка проб и анализ результатов молекулярно-генетического исследования, статистическая обработка и анализ полученных результатов, подготовка к публикации печатных работ и заявок на получение патентов.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 229 страницах компьютерного текста. Состоит из введения (8 страниц), обзора литературы (35 страниц), описания материала и методов исследования (34 страниц), результатов собственных исследований (95 страниц), обсуждения результатов собственных исследований (21 страница), заключения и выводов (5 страниц), практических рекомендаций (1 страница), списка сокращений (2 страницы), списка литературы (23 страницы). Работа иллюстрирована 31 таблицей и 98 рисунками. Список

литературы состоит из 218 источников, включающих 36 отечественных и 182 зарубежных публикаций.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ Глава 1. СПОСОБЫ ОЦЕНКИ РИСКА РАЗВИТИЯ РАКА ЖЕЛУДКА, РОЛЬ МИКРОРНК В ЭПИГЕНЕТИЧЕСКОЙ РЕГУЛЯЦИИ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МЕХАНИЗМОВ КАНЦЕРОГЕНЕЗА

1.1 Способы классификации хронического гастрита и оценки риска

развития рака желудка

1.1.1. Морфологические классификации хронического гастрита как основа оценки риска развития рака желудка

Возникновение хронического, персистирующего воспаления слизистой оболочки желудка, хронического гастрита рассматривается как отправная точка канцерогенеза при раке желудка, известного как каскад P. Correa, завершающегося формированием аденокарциномы желудка [59]. В 8090% случаев причиной хронического гастрита и, соответственно, пусковым механизмом каскада канцерогенеза P. Correa является инфицирование бактерией H. pylori [174].

Международное агентство по исследованию рака на основании эпидемиологических исследований в 1994 году назвало H. pylori канцерогенном I типа при раке желудка [73, 182], ряд исследований, в том числе и мета-анализы, показывают снижение риска развития рака желудка после эрадикации H. pylori [44]. При этом инфицированность населения H. pylori в России по данным мета-анализа составляет около 80% [96]. H. pylori-ассоциированный хронический гастрит - основной фактор риска развития рака желудка, ответственный за возникновение 90% случаев [94]. Однако из 100 человек, инфицированных в детском возрасте, только у 2 возникает аденокарцинома желудка [5].

Также можно отметить менее частые причины хронического гастрита, например, вирус Эпштейна-Барр. Один из основных транскриптов вируса - LMP-1, встраиваясь в мембрану клетки хозяина за счет мимикрии рецептора фактора некроза опухоли-а (TNF-а), вызывает не только хроническое воспаление, но и может быть связан с канцерогенезом за счет нарушения регуляции пролиферации и дифференцировки клеток [35]. При этом несмотря на то, что большинство людей (>90%) инфицируются этим вирусом через слюну в первые месяцы жизни, считается, что вирус Эпштейна-Барр-ассоциированная аденокарцинома желудка может составлять только 10% всех случаев рака желудка [2, 203].

Соответственно, для диагностики группы высокого риска развития рака желудка необходимо выявить индивидуальные особенности, факторы, которые позволят выделить таких индивидов из общей популяции.

Золотым стандартом оценки риска развития рака желудка является патоморфологический мониторинг с гистологическим исследованием биоптатов слизистой оболочки желудка и морфологической оценкой выраженности атрофии, наличия кишечной метаплазии и интраэпителиальной неоплазии/дисплазии -необратимых этапов каскада P. Correa [61, 155]. Для обнаружения и оценки степени выраженности атрофии слизистой оболочки желудка, от которой зависит риск развития рака желудка, протокол наиболее широко распространенных способов гистологической оценки риска развития рака желудка - Модифицированной Сиднейской системы, системы OLGA (Operative Link on Gastritis Assessment) -предполагает забор биоптатов из 5 точек: малая и большая кривизна антрального отдела, угол желудка, малая и большая кривизна тела желудка [61, 155].

В модифицированной Сиднейской системе предложено оценивать в каждом фрагменте слизистой оболочки желудка выраженность 5 морфологических параметров (воспаление, активность, колонизация H. pylori, кишечная метаплазия, атрофия в антральном отделе и теле желудка) по градации визуально-аналоговой шкалы: нет признака, слабая степень, умеренная, выраженная (рисунок 1) [61]. Но на основании модифицированной Сиднейской системы можно говорить только об абстрактном высоком, либо низком уровне риска.

Рисунок 1 - Визуально-аналоговая шкала модифицированной Сиднейской системы [61]

Система OLGA предполагает формирование интегральной оценки выраженности воспалительного инфильтрата (как нейтрофильными лейкоцитами, так и мононуклеарными клетками) и атрофии слизистой оболочки желудка в 5 исследуемых фрагментах с формированием соответственно степени и стадии хронического гастрита от 0 до IV [90, 155]. Для определения стадии в каждом фрагменте сначала оценивают 10 правильно ориентированных желез и вычисляют процент атрофированных желез, затем путем суммации и последующего деления на 2 для тела желудка и 3 - для антрального отдела слизистой оболочки желудка, получают средний процент атрофии желез отдела. Средний процент переводится в баллы в следующем порядке: 0% - 0 баллов, 1-30% - 1 балл, 31-60% - 2 балла, >60% - 3 балла (рисунок 2.а, б). Баллы оценки антрального отдела и тела желудка определяют стадию хронического гастрита согласно таблице (рисунок 2.в).

Al 70% I т ▼ п л & ® & го

А2 90% TiTí^s ▼ ▼ ▼ ▼ т ▼ т о о4 О 45 Л <л О

A3 70% ▼ т Ai tJo чо® Up ¿Í м» <

Атрофия в антруме=(70+90+70):3=76% (>60%) - 3 балла

б

С1 40% к. ЮТ1 «/ V 1 (1 Г г j v. j v^ сч II -р о4 О -О V

С2 70% к ▼_Т_▼_1 , О&ЖЙ о У \ да 5? О 00 Л л а и

в CasO Casi Cos2 Cas3

AasO Stage 0 Stage 1 Stage II Stage II

Aasl Slagel Stage 1 Slage II Slage III

Ads2 Stage II Slage II Stage III Stage IV

Aas3 Slage III Stage III Stage iv Stage IV

Атрофия в теле=(40+70):2=55% (>30% <60%) - 2 балла

Рисунок 2 - Пример оценки стадии хронического гастрита по системе OLGA: а. -схема оценки выраженности атрофии и перевода ее в баллы в трех фрагментах слизистой оболочки антрального отдела желудка; б. - схема оценки выраженности атрофии и перевода ее в баллы в двух фрагментах слизистой оболочки тела желудка; в. - таблица для определения на основании балльной оценки стадии хронического гастрита [155]

Распространенная выраженная атрофия (в том числе метапластическая) слизистой оболочки желудка, соответствующая стадии III-IV, ассоциируется с риском развития рака желудка, в 6 раз превышающим общепопуляционный [91]. Несмотря на попытку увеличить объективность оценки атрофии за счет подсчета процента атрофированных желез, сохраняется проблема, связанная с субъективностью критериев атрофии железы и невозможностью объективного определения длины желез при практической оценке зачастую неправильно ориентированных биоптатов слизистой оболочки желудка [30].

В 2010 г. была предложена модификация системы OLGA, в которой для увеличения объективности оценки атрофии было предложено использовать только легко диагностируемую кишечную метаплазию, не включая в оценку абсолютную атрофию [200]. Но при повышении согласия международной группы экспертов,

проводивших диагностику, использование системы OLGIM (Operative Link on Intestinal Metaplasia Assessment), закономерно привело к снижению чувствительности. При проведении сравнения систем OLGA и OLGIM на диагностической выборке из 4552 случаев около 6% из них, которые были отнесены к группе высокого риска по системе OLGA (стадия III-IV), при использовании OLGIM были диагностированы как стадия II, соответствующая низкому риску развития рака желудка. Пример такого случая, сочетающегося с уже реализовавшейся аденокарциномой, который по системе OLGIM отнесен к группе низкого риска, представлен на рисунке 3 [157]. Более того, увеличение риска развития рака желудка напрямую не связано с самой кишечной метаплазией, которая, скорее, является маркером длительности существования атрофического гастрита [97,125].

Рисунок 3 - Пример снижения стадии при использовании OLGIM по сравнению с OLGA в клиническом случае при состоявшемся раке желудка. АА - абсолютная атрофия, КМ - кишечная метаплазия [157]

В 2009 г., III съездом Российского общества патологоанатомов был принят Российский пересмотр системы классификации хронического гастрита OLGA. Основная отличительная особенность - интегральная оценка атрофии отделов слизистой оболочки желудка на основании сравнения гистологической картины с пиктограммами визуально-аналоговой шкалы вместо многоступенчатых вычислений оригинальной системы OLGA (рисунок 4).

Рисунок 4 - Визуально-аналоговая шкала стадии хронического гастрита Российского пересмотра Международной классификации OLGA [30]

В дальнейшем Европейское общество патологов в 2012 г. в принятом протоколе мониторинга предопухолевых изменений желудка MAPS (management of precancerous conditions and lesions in the stomach) [124], его пересмотре 2019 г. (MAPS II) [121] так же, как участники V Маастрихтского консенсуса [123], предложили считать приемлемым ограничение объема забора биоптатов для исследования 2 точками антрального отдела и 2 - тела желудка, а из угла желудка в случае отсутствия эндоскопически определяемых изменений производить забор биоптата не обязательно [34].

Еще одним предложенным вариантом оценки хронического гастрита является индекс преобладания гастрита тела. Он основан на схеме забора биоптатов и первичной оценке морфологических изменений по протоколу и визуально-аналоговым шкалам Модифицированной Сиднейской системы, но на первый план в оценке риска развития рака желудка авторы предлагают вынести выраженность воспаления и активности в слизистой оболочке тела желудка. В случае, если комбинация активности и воспаления, вычисленная по визуально-аналоговой шкале, в теле желудка не равна единице и в тоже время выше или равна эквивалентным оценкам антрального отдела, следует говорить о преобладании гастрита тела и высоком риске развития рака желудка [189].

Однако эффективность применения Модифицированной Сиднейской системы, системы OLGA и их модификаций резко ограничены за счет субъективности оценки, высоких требований к качеству исследуемых биоптатов слизистой оболочки желудка, а также нарушений протокола, этапов забора и подготовки материала для гистологического исследования [116], и только малая часть всех образцов, полученных из слизистой оболочки желудка, может быть пригодна для оценки степени риска развития рака [34]. Для возможности детекции атрофии по международным системам требуется четкое соблюдение протокола забора биоптатов из 4-5 точек слизистой оболочки желудка, что редко выполняется в рутинной практике. В российском исследовании был проведен пересмотр 21156 гистологических препаратов из материала гастробиопсий 9312 пациентов с анализом возможности оценки риска развития рака желудка по системе OLGA. По результатам исследования, только 4 % случаев оказались пригодными для оценки по системе OLGA [18]. Исследование, выполненное в США R. M. Genta и соавторами, в ходе которого было оценено 400738 гастробиоптатов на предмет их соответствия требованиям Модифицированной Сиднейской системы, установило, что данное значение не превышает 3,9% эндоскопических биопсий [116]. Кроме того, при проведении сопоставления результатов интерпретации биопсийного материала был установлен недостаточно высокий уровень совпадения мнений экспертов по результатам оценки градации предраковых изменений, как атрофии

[18], так и интраэпителиальной неоплазии/дисплазии [14, 84, 202]. Так, при оценке воспроизводимости Российского пересмотра Международной классификации хронического гастрита OLGA-system по показателю выраженности и распространенности атрофии слизистой оболочки желудка с использованием метода каппа-статистики критерий согласия каппа (к), отражающий уровень согласия экспертов, колебался от удовлетворительного - к = 0,27 до умеренного (среднего) - к = 0,42 [30], что совпадает с показателями, достигнутыми международной группой экспертов, участвовавших в первичной разработки и апробации классификации OLGA-system [200]. Следовательно, субъективность определения атрофии может снижать диагностическую и предиктивную ценность исследования.

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Рубцов Вячеслав Александрович, 2020 год

г - л

л »

яа*

f .

®Vcï

¿"'у.

Рисунок 58 - Образцы слизистой оболочки желудка дистантной зоны операционного материала: а. - тело желудка, с наличием выраженного воспаления, слабой активности, выраженная продукция РВСЭ4 в железах с регенераторными изменениями эпителиоцитов, Х400; б. - антральный отдел, с наличием выраженного воспаления, отмечается отсутствие продукции белка РВСЭ4 в светлом центре лимфоидного фолликула. Х100

а

Наличие и степень выраженности абсолютной атрофии не оказывало влияния на экспрессию PDCD4, интенсивная ядерная метка отмечалась в подавляющем большинстве эпителиальных клеток слизистой оболочки желудка, при этом сохранялась в образцах тела и антрального отдела желудка как в группе дистантной зоны операционного материала, так и группы биопсийного исследования (рисунок 59).

Рисунок 59 - Образцы слизистой оболочки желудка с наличием выраженной ядерной экспрессии белка РВСЭ4: а. - слизистая оболочка тела желудка дистантной зоны операционного материала, умеренное воспаление, слабая абсолютная атрофия, Х100; б. - биоптат антрального отдела желудка, слабое воспаление, умеренная абсолютная атрофия. Х200

В очагах кишечной метаплазии ядерная экспрессия РВСЭ4 сохранялась на высоком уровне, в отдельных случаях даже несколько превышая по интенсивности ядерную метку в эпителиоцитах фовеолярного типа, желез фундального/пилорического типа, что наблюдалось вне зависимости от типа: как в случае полной (тип I), так и неполной (тип II и тип III) кишечной метаплазии (рисунок 60).

и' е У 4 Л.. »-)).

рврир^п ^ * »

✓

-к

/у •• ,. >

у-;' '.л : ? - .-<£

- "Л -»к * . • ^ <*- ч

Ч . . '

\ Л * V./." ' </( "

Ч Ч.Г • ■ > V Т

. * • к ш и Г 1 t^'. ,

. ■ » ; . ° »'* -к •?

I ; ■ • V

* ".<г , * . ^

V л *: ; ?$ у' Я • /11 * > ' "' £

• - -г, сь, . • Л -1 ' I N » 1 *<*V5

11

у »

В « ;

> V ' ч" ■

Ър • ,

/: /'Л'«' ' г"

Рисунок 60 - Образцы слизистой оболочки желудка с наличием кишечной метаплазии, выраженная, преимущественно ядерная экспрессия РВСЭ4: а. - тело желудка дистантной зоны операционного материала, умеренное воспаление, распространенная неполная (тип II) кишечная метаплазия, Х 200; б. -антральный отдел желудка дистантной зоны операционного материала, умеренное воспаление, очаг полной (тип I) кишечной метаплазии. Х400

Было отмечено, что интенсивность цитоплазматической экспрессии в зонах как полной (тип I), так и неполной кишечной метаплазии (тип II и тип III) имела тенденцию к снижению при увеличении объема содержащегося в клетке муцина, что также наблюдалось в случае гипермукоидизации эпителиоцитов желудочного типа, но при этом снижение уровня цитоплазматической метки РВСЭ4 нивелировалось высокой экспрессией в ядре и снижения общего значения индекса полуколичественной иммуногистохимической экспрессии белка PDCD4 обнаружено не было (рисунок 61).

У -

»*•■ % г* г % '

е.*-«!. *- *\>л с

"• • :-ёГ% *•••• ййчй^Д• I • ил•• ч

"^ШШФ гп ' -"

а

Рисунок 61 - Образцы слизистой оболочки желудка с наличием кишечной метаплазии, снижение цитоплазматической метки при увеличении объема содержащегося в клетке муцина: а. - биоптат антрального отдела желудка, слабое воспаление, сочетание очагов полной (тип I) и неполной (тип II) кишечной метаплазии выраженная метапластическая атрофия, Х200; б. - антральный отдел желудка дистантной зоны операционного материала, умеренное воспаление, полная (тип I) кишечная метаплазия. Х400

Результаты полуколичественной иммуногистохимической оценки белка PDCD4 в биоптатах слизистой оболочки желудка

При анализе результатов полуколичественной иммуногистохимической оценки с подсчетом индекса белка PDCD4 [31] в тканях группы биоптатов слизистой оболочки желудка был получено высокое значение индекса белка РВСЭ4: медиана составила 10 баллов, интерквартильная широта - от 10 до 11 баллов, максимальное значение индекса РВСЭ4 11 баллов, минимальное - 9 баллов. Были зафиксированы выбросы с значениями индекса РВСЭ4 5, 6, 7 и 8 баллов (рисунок 62).

Рисунок 62 - Биоптат слизистой оболочки тела желудка. Слабая мононуклеарная воспалительная инфильтрация собственной пластинки слизистой оболочки. Продукция белка PDCD4 наиболее выражена в шеечных отделах желез с преимущественно ядерной локализацией в эпителиальных клетках. х200. Справа на графике - результаты полуколичественной иммуногистохимической оценки белка PDCD4 в баллах, группа биопсийного материала слизистой оболочки желудка

При этом по результатам сравнения с использованием критерия Краскела-Уоллиса статистически значимые отличия уровня белка PDCD4 в биоптатах слизистой оболочки желудка в зависимости от выраженности воспаления ф= 0,8479), атрофии ф = 0,4615), степени ф = 0,5328) и стадии ф = 0,1766), наличия и типа кишечной и пилорической метаплазии ф = 0,2375) так же, как от наличия либо отсутствия индекса преобладания гастрита тела ф = 0,59), И pylori-колонизации ф = 0,21), отдела слизистой оболочки желудка ф = 0,44) обнаружены не были (рисунок 63, 64).

12 11 10

О Ü о

CL

в

*

Ф

KW-H(3;310) = 0,8066; р = 0,8479

Ч,

%л

Воспаление

I т т

KW-H(3;310) = 2,1958; р = 0,5328

IV

Степень

7

Q '

О

S 6

О С П " X S

4

3 2 1 О

б

- » I

KW-H(3;310) = 2,5771; р = 0,4615

ч

ч X

Атрофия

? . g "

KW-H(4;310) = 6,3182; р = 0,1766

I II III IV

Стадия

а

Г

Рисунок 63 - Значения индекса полуколичественной иммуногистохимической оценки белка PDCD4 в биоптатах слизистой оболочки желудка в зависимости от: а. - выраженности воспаления; б. - выраженности атрофии; в - степени хронического гастрита согласно OLGA system; г. - стадии хронического гастрита согласно OLGA system

а

щ с

ч 5

X

s 4

3 2 1 О

M-WUTest:p=0,59

12

10 1 "

т

Q 7

о f а R

9 г

s

2 1 0

M-W U Test: р=0,21 M-W U Test:p = 0,44

О 1

Индекс преобладания гастрита тела

б

нет пилорическая

тип I тип II Метаплазия

кишечная 0 1 тело антрум

тип III в Н. pylori-колонизация г Отдел

слизистой оболочки желудка

□ -медиана; | - 25-75 процентиль; - мин-макс значение.

Рисунок 64 - Значения индекса полуколичественной иммуногистохимической оценки белка РВСЭ4 в биоптатах слизистой оболочки желудка в зависимости от: а. - индекса преобладания гастрита тела; б. -наличия и типа метаплазии; в. - наличия Н. ру1оп-колонизации, г. - отдела желудка

Тенденция к снижению значений интерквартильной широты индекса белка PDCD4 в подгруппе образцов со стадией III с учетом увеличения ее значения при стадии IV и идентичных значениях медиан была расценена как незначимая. Можно отметить, что медианное значение для всех подгрупп было одинаковым и составило 10 баллов, что также подтверждает отсутствие влияния морфологических изменений в группе биоптатов слизистой оболочки желудка на уровень продукции белка PDCD4.

Результаты полуколичественной иммуногистохимической оценки белка PDCD4 в образцах дистантной зоны операционного материала

В группе дистантной зоны операционного материала желудков при анализе результатов полуколичественной иммуногистохимической оценки белка PDCD4 высокий уровень продукции белка PDCD4 сохранялся как в образцах с признаками выраженного воспаления и атрофии желез, так и в случае наличия кишечной либо пилорической метаплазии. Медиана индекса белка PDCD4 составила 10 баллов, интерквартильная широта - от 10 до 11 баллов, максимальное значение индекса

РВСЭ4 11 баллов, минимальное - 9 баллов. Были зафиксированы выбросы с значениями индекса РВСЭ4 5, 6, 7 и 8 баллов (рисунок 65).

Рисунок 65 - Группа дистантной зоны операционного материала желудков, образец слизистой оболочки антрального отдела. Умеренная мононуклеарная воспалительная инфильтрация собственной пластинки, полная (тип I) кишечная метаплазия, выраженная атрофия. Преимущественно ядерная локализация PDCD4 в эпителиоцитах и клетках воспалительного инфильтрата. Х100. Справа на графике - результаты полуколичественной иммуногистохимической оценки белка PDCD4 в баллах

При этом по результатам сравнения с использованием критерия Краскела-Уоллиса статистически значимые отличия в уровне белка РВСЭ4 в образцах дистантной зоны операционного материала желудков зависимости от выраженности воспаления (р= 0,59), атрофии (р = 0,66), степени (р = 0,18) и стадии (р = 0,16) хронического гастрита, наличия и типа кишечной и пилорической метаплазии (р = 0,92), наличия индекса преобладания гастрита тела (р = 0,25),

12

Г~! -медиана;

- 25-75 процентиль

- мин-макс значение О - выбросы.

а также отдела слизистой оболочки обнаружены (рисунок 66, 67).

желудка (p = 0,65) не были

■з-

о Ü о

Q.

о ^

(D d X

12 11

10

9 8 7 6 5 4 3 2 1 0

а

12 11 10

■чГ

О О о 0.

О а: Ф Ч х

в

-1

KW-H(3;240) =1,9104; р = 0,5912

Ч,

Воспаление

I

KW-H(3;240) = 4,8618; р = 0,1822

IV

12 11

10 9

^ 8 Q

8 7

t в

¡si

ф R

et 5

X

s 4 3 2 1 О

б

т Q О Q Q.

У

0 Ч

1

12 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 О

Степень

KW-H(3;240) = 1,5768; р = 0,6647

•ч.

Атрофия

I

KW-H(4;240) = 6,6449; р - 0,1559

IV

Стадия

г

□ -медиана; | - 25-75 процентиль;-- мин-макс значение.

Рисунок 66 - Значения индекса полуколичественной иммуногистохимической оценки белка PDCD4 в операционном материале слизистой оболочки дистантной зоны желудков в зависимости от: а. - выраженности воспаления; б. - выраженности атрофии; в. - степени хронического гастрита; г. - стадии хронического гастрита

1 О

Индекс преобладания гастрита тела

кишечная кишечная кишечная тип I тип II тип III

Метаплазия

12

10

° 7

о 7 а

t 6

X Ф

? 5 s

4

3 2 1 0

" *

M-W U Test:p= 0,65

пилорическая

в

антрум тело Отдел

слизистой оболочки желудка

Рисунок 67 - Значения индекса полуколичественной иммуногистохимической оценки белка РВСЭ4 в операционном материале слизистой оболочки дистантной зоны желудков в зависимости от: а. - наличия и типа метаплазии; б. - индекса преобладания гастрита тела; в. - отдела желудка

Отсутствие каких-либо закономерностей и отличий в уровне продукции белка РВСЭ4, идентичные значения медиан в подгруппах равные 10 баллам индекса полуколичественной иммуногистохимической оценки белка РВСЭ4, являются подтверждением отсутствия влияния оцениваемых морфологических изменений в группе дистантной зоны слизистой оболочки операционного материала желудка на уровень продукции белка РБСВ4.

Результаты полуколичественной иммуногистохимической оценки белка PDCD4 в тканях аденокарциномы желудка

В тканях аденокарциномы группы операционного материала желудков при анализе результатов полуколичественной иммуногистохимической оценки белка РВСЭ4 отмечался низкий уровень продукции белка РВСЭ4. Медиана индекса белка РВСЭ4 составила 3 балла, интерквартильная широта - от 1 до 4 баллов, минимальное значение - 0 баллов, максимальное 6 баллов, выбросы зафиксированы не были (рисунок 68).

□ -медиана; | - 25-75 процентиль; ДД - мин-макс значение

Рисунок 68 - Образец высокодифференцированной аденокарциномы желудка. Полная утрата ядерной фракции PDCD4, в отдельных клетках цитоплазматическая метка слабой интенсивности метка. Выраженная ядерная экспрессия PDCD4 в клетках воспалительного инфильтрата (внутренний положительный контроль) х200. Справа на графике - результаты полуколичественной иммуногистохимической оценки белка PDCD4 в баллах

При этом в первую очередь происходит утрата ядерной фракции PDCD4 - в 71% случаев фрагментов ткани аденокарциномы индекс окраски ядра не превышал 2 балла, полная утрата ядерной фракции отмечалась в 29% случаев. Тогда как цитоплазменная метка может оставаться умеренной и даже выраженной (рисунок 69).

Рисунок 69 - Умеренодифференцированная аденокарцинома желудка. Полная утрата ядерной фракции РВСЭ4 (индекс экспрессии в ядре - 0) при выраженной цитоплазматической метке (индекс окрашивания цитоплазмы - 3) в опухолевых клетках. Х400

По результатам сравнения значений индекса полуколичественной иммуногистохимической оценки белка РВСЭ4 в образцах ткани аденокарциномы в зависимости от степени дифференцировки (высокой, умеренной, низкой) и локализации опухоли в отделе желудка (антральном, теле желудка, кардиальном) статистически значимые отличия обнаружены не были р=0,85 и р=0,17 соответственно (рисунок 70).

12 11 10 9

а а7

В е

У 5 £ 4

К\Л/-Н (2;60) = 0,3305; р = 0,8477

#

Ф

Высокая Умереная Низкая Степень дифференцировки

12 11 10

О О о 0_

б

Ш-Н(2;60) = 3,5059; р = 0,1733

■■ ЯШ дд

Антральный Тело желудка Кардиальный Отдел желудка

а

П -медиана; | - 25-75 процентиль; - мин-макс значение.

Рисунок 70 - Значения индекса полуколичественной иммуногистохимической оценки белка PDCD4 в тканях аденокарциномы желудка в зависимости от: а. - степени дифференцировки опухоли; б. -отдела желудка

Таким образом, по результатам оценки подгрупп можно сделать вывод, что обнаруженное в образцах ткани аденокарциномы желудка падение индекса полуколичественной иммуногистохимической оценки белка PDCD4 не имеет зависимости от локализации и степени дифференцировки опухоли.

Сравнительная характеристика индекса белка PDCD4 в исследуемых группах

При сравнении значений индекса белка PDCD4 между тканями аденокарциномы, дистантной зоны операционного материала и биопсийного материала с использованием критерия Краскела-Уоллиса было выявлено наличие статистически значимых отличий между исследуемыми группами ф=0,00001). При апостериорном попарном сравнении с использованием ^критерия Манна-Уитни с поправкой Бонферрони для множественных сравнений (критический уровень значимости p=0,017) было выявлено статистически значимое падение уровня PDCD4 в ткани опухоли по отношению как к группе биоптатов слизистой оболочки желудка, так и образцам дистантной зоны ф= 0,00001). При этом статистически

значимых отличий индекса полуколичественной иммуногистохимической оценки белка PDCD4 между группой биоптатов слизистой оболочки желудка и группой дистантной зоны операционного материала желудков выявлено не было, р=0,48 (рисунок 71).

Исследуемые группы

Рисунок 71 - Значения индекса полуколичественной иммуногистохимической оценки белка РВСЭ4 в тканях исследуемых групп: 1. - группа биоптатов слизистой оболочки желудка, 2. - дистантная зона группы операционного материала желудков, 3. - ткань аденокарциномы группы операционного материала желудков

Таким образом, на основании анализа результатов оценки продукции белка РВСЭ4 в исследуемых группах было обнаружено падение индекса белка РВСЭ4 в образцах ткани аденокарциномы желудка, что наблюдалось вне зависимости от локализации и степени дифференцировки опухоли, при этом отмечался стабильно высокий уровень индекса полуколичественной иммуногистохимической оценки белка РВСЭ4 и отсутствие его зависимости от наличия и выраженности всех

исследованных морфологических изменений в слизистой оболочки желудка группы биоптатов и дистантной зоны операционного материала желудков.

3.4. Оценка потенциала индекса белка PDCD4 в качестве диагностического маркера интраэпителиальной дисплазии/неоплазии

Наличие статистически значимого снижения полуколичественного индекса иммугистохимической экспрессии PDCD4 в тканях аденокарциномы, по сравнению со слизистой оболочкой желудка вне опухолевого роста, представляет интерес в аспекте теста поддержки принятия решения при дифференциальной диагностики неопределенной дисплазии/неоплазии (реактивные и воспалительные изменения слизистой оболочки) и истинной дисплазии эпителия - категория выраженных предраковых изменений слизистой оболочки желудка. Интересным представляется обнаружение очаговой интраэпителиальной дисплазии/неоплазии низкой степени при подрезке 2 из 4 образцов группы дистантной зоны с низким значением индекса PDCD4, соответствующего выбросам. Была проведена полуколичественная иммуногистохимическая оценка PDCD4 в этих двух образцах, совместно с 10 образцами с наличием интраэпителиальной дисплазии/неоплазией, обнаруженными в ходе дополнительного скринингового исследования фрагментов операционного материала желудков, забранных отдельно от основной группы (рисунок 72). При анализе результатов индекс полуколичественной иммуногистохимической оценки белка PDCD4 в очагах интраэпителиальной неоплазии/дисплазии низкой степени равный 0 баллов был обнаружен в 1 образце, 2 балла - в 1 образе, 3 балла - в 2 образцах, 4 балла - в 4 образцах. При этом в очагах с интраэпителиальной неоплазией/дисплазией высокой степени индекс белка PDCD4 равный 2 балла выявлен в 1 образце, 3 балла - в 2 образцах, 6 баллов - в1 образце. Суммарно с учетом образцов с наличием интраэпителиальной неоплазии/дисплазии низкой и высокой степени распределение значений индекса белка PDCD4 имело следующий вид: 0 баллов было обнаружено в 1 образце,

2 балла - в 2 образцах, 3 балла - в 4 образцах, 4 балла - в 4 образцах, 6 баллов - в 1 образце.

¿до ямы.-,г г- ■

" V » • • « Л»! * -

1 ~ я /Л» ' 1 Г ■ # ^ »

а !> б ; I I -л'. <■-•» . _

Рисунок 72 - Образцы слизистой оболочки дистантной зоны желудков операционного материала с признаками интраэпителиальной неоплазии/дисплазии, выраженное падение ядерной экспрессии PDCD4: а. -низкой степени; б. - высокой степени. Х200

Самым частым вариантом значения индекса белка PDCD4 было 3-4 балла, а максимальное обнаруженное значение не привысило 6 баллов. Таким образом, характер продукции белка PDCD4 принципиально не отличался от такового в тканях аденокарциномы, также отмечалось выраженное снижение индекса белка PDCD4 преимущественно за счет падения ядерной метки.

Для оценки значимости белка в дифференциальной диагностике была построена модель простой логистической регрессии, где в качестве независимой переменной выступал индекс белка PDCD4. Каждый случай в построенной модели был представлен одним образцом слизистой оболочки желудка дистантной зоны и одним - ткани аденокарциномы. Бинарная переменная отклика принимала

значение 1 для образцов ткани аденокарциномы желудка, и 0 - для образцов слизистой оболочки желудка дистантной зоны операционного материала (таблица 13).

Таблица 13 - Модель простой логистической регрессии, переменная отклика -принадлежность к ткани аденокарциномы желудка, предикторная переменная -индекс полуколичественной иммугистохимической экспрессии PDCD4

Основные параметры модели: -2 Log likelihood: 8,5; критерий согласия х2 (1)=157,85; p=0,00001

N=120 Константа(ВО) Индекс PDCD4

Коэффициент (в) 12,58 -2,2

Стандартная ошибка 4,26 0,77

p-значение 0,004 0,005

-95%ДИ 4,15 -3,73

+95%ДИ 21,02 -0,67

Критерий Вальда х2 8,73 8,06

p-значение 0.003 0,005

Отношение шансов 291270 0,11

-95%ДИ 63,26 0,02

+95%ДИ 1341082000 0,51

Как видно из таблицы 13, индекс полуколичественной иммугистохимической экспрессии PDCD4 показал статистически значимую отрицательную связь с аденокарциномой желудка, при увеличении значения индекса PDCD4 на 1 балл вероятность принадлежности образца к ткани аденокарциномы снижалась в 9 раз (0Ш=0,11, 95% ДИ=[0,02-0,51]; Критерий Вальда х2 =8,06, p=0,005). Графическое представление модели логистической регрессии представлено на диаграмме рассеивания (рисунок 73).

«

=г

<•>

то о. ю

О а,

к г ? о

X

О)

о Э О

X I-

о о

§

о.

ф

ш

1,1 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0,0 -0,1

1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Г^ г> о ^ ^

^Ч 1 1 \ 1 1 \ 1 I

\1 1

\ А/а1й ) = 0 'з X2 ,005 = 8,06; V 1 \ 1

г 1 \ 1 1 \ 1 1 \ 1

г 1 \ 1

1 \ 1 1 \ 1

\ 1 | \ 1 ( V 1 | \ 1

| \!

1 и

1 | \

| ■ \

1 ■

^ ^ ^ ^

■1 0 1

8 9 10 11 12 13

О -

Индекс полуколичественной иммугистохимической экспрессии РБСВ4

образцы группы операционного материала;--линия тренда;

интервал ложноположительных/ложноотрицательных значений.

Рисунок 73 - График диаграммы рассеивания модели простой логистической регрессии, переменная отклика - вероятность принадлежности образца к ткани аденокарциномы желудка, предикторная переменная - индекс полуколичественной иммугистохимической экспрессии РВСЭ4

Предварительная оценка качества модели

Для предварительной оценки качества модели был проведен анализ остатков, по результатам которого модель показала достаточный уровень достоверности: гистограмма остатков соответствовала нормальному распределению, при построении графика нормально-вероятностных остатков систематических отклонений фактических данных от теоретической нормальной прямой не наблюдалось (рисунок 74.а, б), зависимости остатков от предсказанных значений модели регрессии значений отклика не обнаружено (рисунок 74.в).

распределение, соответствующее нормальному

-1,0 -0,8 -0,6 -0,4 -0,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8

Остатки

Рисунок 74 - Анализ остатков регрессионной модели: а. - гистограмма частотного распределения остатков; б. - нормально-вероятностный график остатков; в. - график зависимости остатков от предсказанных значений модели

Результаты предварительной оценки свидетельствуют о высоком качестве и статистической достоверности построенной модели простой логистической регрессии и позволяют перейти к дальнейшим этапам оценки результатов, для чего была проведена проверка соответствия модели исходным данным.

Оценка показателя диагностической точности индекса белка РБСБ4 Предсказанная принадлежность исследуемого образца в группе слизистой оболочки желудка дистантной зоны операционного материала совпадала с фактическими данными в 97% случаев, в группе образцов аденокарциномы - в 97% случаев. Построенная модель значимо лучше (ОШ 841) соответствует фактическим данным, чем случайное распределение образцов в группу ткани аденокарциномы желудка и группу слизистой оболочки желудка вне опухолевого роста (таблица 14).

Таблица 14 - Фактические и прогнозируемые частоты распределения случаев согласно построенной модели

ОШ: 841. Диагностическая точность: 96,7%

Фактические значения Прогнозируемые значения Совпадение прогноза с фактическими значениями

Дистантная зона Аденокарцинома

Дистантная зона 58 2 96,7%

Аденокарцинома 2 58 96,7%

Следовательно, согласно результатам сопоставления прогнозируемых и фактических данных распределения образцов чувствительность модели, а, соответственно, и белка РВСЭ4 как маркера ткани аденокарциномы желудка составила 97%, специфичность - 97%, диагностическая точность - 97%. Ложноотрицательный ответ был зафиксирован в 3%, а ложноположительный в 3% случаев.

Для дополнительной оценки эффективности модели и определения порога отсечения был проведен ROC-анализ, по результатам которого площадь под кривой АиС составила 0,99 (рисунок 75).

Порог отсечения, соответствующий максимальной суммарной чувствительности и специфичности модели, составил 6 баллов индекса полуколичественной иммуногистохимической экспрессии РВСЭ4, при этом значение индекса РВСЭ4 менее 6 баллов являлось оптимальным в отношении определения образца как принадлежащего к ткани аденокарциномы, тогда как показатель индекса равный 6 и более свидетельствовал о том, что образец к ней не относится (таблица 15).

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 1-Специфичность

Рисунок 75 - ROC-кривая модели простой логистической регрессии, переменная отклика - принадлежность к ткани аденокарциномы желудка, предикторная переменная - индекс полуколичественной иммугистохимической экспрессии белка PDCD4.

Таблица 15 - Значения порогов отсечения по результатам ROC-анализа в зависимости от целевого критерия

Целевой критерий Значение порога Чувствительность Специфичность

Максимальная 4 86,7% 100%

чувствительность

Максимальная специфичность 7 100% 93,3%

Максимальная 6 96,7% 96,7%

суммарная чувствительность и специфичность

т

/

С учетом того, что индекс PDCD4 является производным показателем визуально полуколичественно оцениваемой иммуногистохимической метки, расчет чувствительности и специфичности был также проведен при разделении данных на интервалы: от 0 до 4, от 5 до 6, от 7 до 12 баллов. Интервалы были выбраны в соответствии с таблицей порогов отсечения, соответствующим максимальной чувствительности и специфичности, полученной по результатам ROC-анализа (таблица 15), и диаграммой рассеивания модели простой логистической регрессии (рисунок 72).

При выделении интервала со значением индекса, при котором отсутствуют ложноотрицательные ответы - от 0 до 4, была получена максимальная специфичность индекса белка PDCD4 как диагностического теста (таблица 16).

Таблица 16 - Фактические и прогнозируемые частоты распределения случаев при выделении интервала от 0 до 4

Фактические значения Прогнозируемые значения Совпадение прогноза с фактическими значениями

Дистантная зона Аденокарцинома

Дистантная зона 60 0 100%

Аденокарцинома 8 52 86,7%

Таким образом, в случае выделения интервала от 0 до 4 специфичность показателя индекса полуколичественной иммуногистохимической экспрессии PDCD4 как маркера аденокарциномы желудка составила 100%, чувствительность -87%.

Напротив, при выделении интервала со значением индекса, при котором отсутствуют ложноположительные ответы (от 7 до 12), была получена максимальная чувствительность диагностического теста (таблица 17).

Таблица 17 - Фактические и прогнозируемые частоты распределения случаев при выделении интервала от 7 до 12

Фактические значения Прогнозируемые значения Совпадение прогноза с фактическими значениями

Дистантная зона Аденокарцинома

Дистантная зона 56 4 93,3%

Аденокарцинома 0 60 100%

Выделение интервала от 7 до 12 баллов сопровождалось увеличением чувствительности показателя индекса полуколичественной

иммуногистохимической экспрессии PDCD4 как маркера аденокарциномы желудка до 100%, но при этом специфичность снижается до 93%.

Закономерным представляется наименьший уровень чувствительности и специфичности индекса полуколичественной иммуногистохимической экспрессии PDCD4 как диагностического теста в интервале от 5 до 6 баллов, в котором отмечалось наличие ложноположительных и ложноотрицательных ответов (таблица 18).

Таблица 18 - Фактические и прогнозируемые частоты распределения случаев при выделении интервала от 5 до 6

Фактические значения Прогнозируемые значения Совпадение прогноза с фактическими значениями

Дистантная зона Аденокарцинома

Дистантная зона 56 4 93,3%

Аденокарцинома 8 52 86,7%

Можно отметить, что при выделении интервала индекса полуколичественной иммугистохимической экспрессии PDCD4 от 5 до 6 как значений, показывающих ложноположительные и ложноотрицательные результаты, отмечается падение

чувствительности маркера до 87%, но при этом специфичность сохраняется на достаточно высоком уровне, составившем 93%.

В проанализированных нами образцах слизистой оболочки желудка при выраженном воспалении и активности хронического гастрита с наличием признаков регенераторных изменений отмечалась регулярная высокая интенсивность ядерной экспрессии PDCD4, что свидетельствует о сохранных молекулярных механизмах регуляции клеток. Таким образом, индекс белка PDCD4 может быть использован при оценке феномена неопределенной интраэпителиальной дисплазии/неоплазии: в случае сохранной высокой продукции белка PDCD4 в эпителиоцитах слизистой оболочки желудка изменения в образце следует рассматривать как проявления реактивных изменений при регенераторной пролиферации, в случае падения индекса белка PDCD4 ниже порога отсечения, вероятно, можно считать проявлениями истинной интраэпителиальной дисплазии/неоплазии. Таким образом, согласно полученным результатам, в слизистой оболочке желудка высокий уровень продукции белка PDCD4 сохраняется вне зависимости от выраженности атрофии, воспаления и наличия кишечной метаплазии, при этом в тканях аденокарциномы желудка отмечается падение индекса белка PDCD4 за счет исчезновения ядерной экспрессии.

Разработанная методика полуколичественной иммуногистохимической оценки PDCD4 обеспечивает высокий уровень чувствительности и специфичности в качестве маркера ткани аденокарциномы желудка, превышающий 96%. Максимальная валидность отмечалась в интервалах от 0 до 4 и от 7 до 12 баллов.

3.5. Характеристика экспрессии ш1Я-21 в тканях слизистой оболочки желудка при хроническом гастрите и раке желудка

Экспрессия miR-21 в биоптатах слизистой оболочки желудка

При анализе результатов оценки экспрессии ш1Я-21 методом полуколичественной ОТ-ПЦР в реальном времени в группе биоптатов слизистой оболочки желудка был выявлен низкий относительный уровень экспрессии miR-

21: медиана равна 42, при этом разброс значений был выражен слабо, интерквартильная широта составила от 33 до 83, выбросов зафиксировано не было (рисунок 75.б). При этом согласно гистограмме, критериям Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка распределение не соответствовало нормальному, отмечалось бимодальный характер распределения (рисунок 76.а)

К-Э Е» = 0,1183; р < 0,05; Э\У-\У = 0,9261; р = 0,0011

800

СМ

о: 700 Е

| 600 о

о ф

о- 500 О

о

.0 400

X

О) ш

о 300

-о 200

х

л

£ 100 ^

о о

б

О

-100

10 20 3 0 40 50 6 0 70 80 90 100 110

Относительный уровень экспрессии пнК-21

□ -медиана;_ - мин-макс значение;

| - 25-75 процентиль; о " выбросы.

Рисунок 76 - Результаты оценки экспрессии ш1Я-21 в группе биоптатов слизистой оболочки желудка: а. - гистограмма частот встречаемости вариант с предоставлением критериев соответствия распределения нормальному -Колмогорова-Смирнова и Шапиро-Уилка; б. - относительный уровень экспрессии ш1Я-21 в группе биоптатов слизистой оболочки желудка

При сравнении уровня относительной экспрессии ш1Я-21 с использованием критериев Краскела-Уоллиса и Ц-критерия Манна-Уитни статистически значимых отличий в подгруппах биоптатов слизистой оболочки желудка в зависимости от выраженности воспаления (р= 0,5354), атрофии (р = 0,1716), степени (р = 0,1322) и стадии (р = 0,299) хронического гастрита, наличия индекса преобладания гастрита

тела (р = 0,515), наличия и типа кишечной метаплазии (р = 0,5512), Н. ру1оп-колонизации (р = 0,178) выявлено не было (рисунок 77, 78).

X X, X

Воспаление

KW-H(3;62) = 5,6099; р = 0,1322