Микроорганизмы деструкторы полихлорированных бифенилов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Капранов, Владимир Владимирович

• Капранов, Владимир Владимирович
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Капранов, Владимир Владимирович

СПИСОК УСЛОВНЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Химико-токсикологическая характеристика ПХБ.

1.2 Метаболизм ПХБ микроорганизмами-деструкторами

1.3 Детоксикация почв, загрязненных ПХБ, с помощью физико-химических 13 методов.

1.4 Микробная деградация ПХБ в почве.

1.4.1 Активизации естественной микрофлоры почвы.

1.4.2 Интродукции штаммов микроорганизмов-деструкторов

ПХБ в почву. ' •!*- '.

1.4.3 Выделение микроорганизмов-деструкторов ПХБ из почв.л.:.'.:. К.

1.4.4 Изучение безопасности микроорганизмов-деструкторов ПХБ для теплокровных животных.

1.4.5 Технологии биоремедиации почв, загрязненных ПХБ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Микроорганизмы деструкторы полихлорированных бифенилов»

Поколение людей, живущих на Земле сегодня, не должно удовлетворять свои нужды за счет лишения будущих поколений возможности жить на чистой планете. Люди в своей хозяйственной деятельности все больше и больше используют различные вещества, искусственно созданные ими - ксенобиотики, которые вследствие деятельности человека непрерывно поступают в окружающую среду, загрязняя ее.

Одними из самых опасных веществ искусственного происхождения являются стойкие хлорорганические соединения. В природных условиях они практически не подвергаются распаду из-за своей высокой устойчивости к химическому, биологическому и фотолитическому разложению. Распространяясь по планете благодаря их широкому использованию в промышленности, сельском хозяйстве и вследствие своих физико - химических свойств эти стойкие органические соединения наносят ущерб здоровью людей даже там, где они не применялись. Контроль над распространением этих загрязнителей, их запрет, и уничтожение являются одной из приоритетных задач мирового сообщества.

Полихлорированные бифенилы (ПХБ) относятся к токсичным хлорорганическим соединениям, диоксиноподобным веществам первой группы опасности /7,54/. Они входят, по списку 1ЖЕР, в "черную дюжину" наиболее стойких и опасных органических загрязнителей, угрожающих окружающей среде планеты.

ПХБ производились с 30-х годов и нашли свое применение, в основном, в электротехнической промышленности. Естественного образования их в окружающей среде не установлено /36/. ПХБ, вследствие своей токсичности и сспособности к биоаккумуляции, с 1978 года запрещены к широкому применению в промышленности, за исключением эксплуатации уже выпущенных трансформаторов и конденсаторов.

ПХБ - политропные яды, поражающие практически все органы и системы организма, данные ВОЗ свидетельствуют, что наиболее чувствительным к ним является человек. Поэтому с начала 80-х годов производство этих опасных соединений свернуто. Сейчас ведутся работы по их планомерному уничтожению, но проблема ПХБ, попавших в окружающую среду, так и остается нерешенной ввиду их очень высокой химической и биологической инертности /36, 54/.

В настоящее время очистка почв, загрязненных ПХБ, ведется физико-химическими методами, что приводит к неблагоприятному изменению свойств почв и к возникновению их вторичных загрязнений /36,54/. Альтернативным способом является метод микробной деградации ПХБ, который позволяет не только понизить концентрацию ПХБ в почве, но и свести к минимуму ущерб для окружающей среды.

Целью исследования является разработка метода микробной деструкции полихлорбифенилов в загрязненных почвах in situ.

Для достижения этой цели в работе были поставлены следующие задачи:

1. Выделить из загрязненных почв и идентифицировать штаммы микроорганизмов, разлагающие полихлорбифенилы.

2. Провести токсикологические испытания выделенных штаммов микроорганизмов на безопасность для теплокровных животных.

3. Найти оптимальный температурный интервал и определить наиболее эффективную концентрацию вносимой микробной суспензии при проведения микробиологической деструкции ПХБ в почве.

4. Изучить динамику содержания микроорганизмов- деструкторов ПХБ в почве и их взаимоотношение с естественной почвенной микрофлорой.

5. Провести полевые испытания разработанного метода биоремедиации на участках почвы, подвергшихся длительному и массированному загрязнению ПХБ.

6. Сравнить токсичность почвы, загрязненной ПХБ, до и после проведения биоремиднации, для теплокровных животных и дафний.

На защиту выносится: Система мероприятий по экологически безопасной санации in situ загрязненной полихлорированными бифенилами почвы с помощью микроорганизмов-деструкторов.

Научная новизна:

1. Разработан метод санации почвы in situ с помощью микроорганизмов-деструкторов ПХБ Alcaligenes latus TXD-13 и Hansenulla californica AT.

2. Впервые показано, что доя деструкции ПХБ могут быть использованы дрожжи Hansenulla californica, способные активно разлагать эти ксенобиотики.

3. В полевых условиях изучено взаимоотношение микроорганизмов-деструкторов ПХБ и аборигенной почвенной микрофлоры.

4. Предложена методика определения токсичности почв в процессе микробиологической санации с помощью животных-биотестов.

Практическая ценность: 1. Организован музей микроорганизмов-деструкторов ПХБ. Штаммы Alcaligenes latus TXD-13 и Hansenulla californica AT Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номерами В 75-05 и Y

2284. На них получены две международные патентные заявки PCT/RU 98/00036 и PCT/RU 98/00037 соответственно и оформляются два патента Российской Федерации.

2. На основании исследований в лабораторных и полевых условиях разработаны практические рекомендации по применению метода in situ для детоксикации почв, загрязненных ПХБ.

Работа проводилась по контракту с Японской корпорацией Toyta Motors, а также в рамках научных исследований по проекту № 228 Международного Научно-технического Центра, совместно с фирмами Heuro. GR - Германия, Osis Project - США, Biotec Engineering LTD -Великобритания.

Материалы, изложенные в диссертации, доложены на конгрессах, научных и научно-практических конференциях в России, США, Германии, Швейцарии, опубликованы в итоговом сборнике "Труды научно-практической конференции, посвященной 50-летию Федерального Управления Медбиоэкстрема", журнале "Токсикологический вестник", оформлены в виде международных патентных заявок РСТ, патентов Российской Федерации, 2 лабораторных регламентов, отчетов к проекту № 228, методик. Всего по теме диссертации опубликовано 16 работ.

Автор сердечно благодарит академика РАСХН, профессора, доктора биологических наук М.С. Соколова, профессора, доктора ветеринарных наук Р.В. Боровика за помощь в разработке направлений исследований и обсуждении концепции диссертации. Автор благодарит кандидата биологических наук С.П. Рыбалкина с сотрудниками, кандидата биологических наук А.И. Марченко, научных сотрудников В.А. Блохина, В.Н. Алдобаева, сотрудников НИЦТБП, оказавших методическую помощь в выполнении отдельных этапов исследований.

1.0Б30Р ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Капранов, Владимир Владимирович

ВЫВОДЫ:

1. Проведен поиск на загрязненных территориях микроорганизмов, способных разлагать в почве ПХБ. Выделены из почв и охарактеризованы 18 штаммов микроорганизмов-деструкторов ПХБ.

2. Наиболее эффективными оказались штаммы деструкторов ПХБ бактерий Alcaligenes latus ТХД-13 и дрожжей Hansemila californica. AT. Они депонированы во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов под номерами В - 7505, Y- 2284. На них получены две международные патентные заявки по системе РСТ и оформляются два патента Российской Федерации. В полевых опытах установлено, что степень деструкции ПХБ микроорганизмами в почве in situ составила для Alealigenus latus ТХД-13 от 52 % до 78 %, для Hansenula californica AT от 60 % до 90 %.

3. Токсикологические испытания бактерий Alcaligenes latus ТХД-13 и дрожжей Hansenula californica AT показана их безопасность для теплокровных животных по показателям вирулентности, токсичности, токсигенности и диссеминации во внутренних органах белых мышей. Эти микроорганизмы пригодны для использования при биоремедиации почв in situ.

4. Интродукция штаммов бактерий Alcaligenes latus ТХД-13 и дрожжей Hansenula californica AT в почву не оказывает существенного влияния на численность почвенной микрофлоры. В течение трех месяцев их численность неуклонно снижается с 106 до 104 КОЕ/г почвы для Alealigenus latus ТХД-13 и для Hansenula californica AT с 105 до 103 КОЕ/г почвы, достигая минимального уровня к концу 3 месяца.

5. Оптимальная концентрация суспензии микроорганизмов,вносимых в почву, загрязненную полихлорированными бифенилами, роставляет: для

Alcaligenus latus ТХД-13 - 107 кл./мл, для Hansenula californica AT - 106 кл./мл. Норма расхода микробной суспензии составила 1 л/м2 почвы. При температуре воздуха 20-30°С и влажности почвы 60-80% достигается максимальная степень деструкции ПХБ в почве.

6. Оценена интегральная токсичность почвы, до и после проведения полевого эксперимента методом биотестирования и показано снижение интегральной токсичности почвы в процессе биоремедиации. Для почв, обработанных Alcaligenus latus ТХД-13, интегральная токсичность снизилась в течение трех месяцев со 100 до 69 %, для Hansenula californica AT со 100 до70%.

7. Токсикологическая оценка рекультивированной почвы, проведенная на белых крысах, показала отсутствие выраженных патологических изменений в органах и крови лабораторных животных.

Заключение

В результате наших лабораторных и полевых экспериментов из загрязненных почв, находящихся в районе Серпуховского завода "Конденсатор", выделены природные штаммы микроорганизмов, способные разлагать ПХБ. Проведена их идентификация, организован банк штаммов выделенных микроорганизмов-деструкторов полихлорбифенилов.

Проведены токсикологические исследования и выбраны штаммы микроорганизмов-деструкторов, безопасные для человека и теплокровных животных, при этом учитывались следующие показатели: уровень средних летальных доз микроорганизмов при различных путях введения лабораторным животным (LD50); токсичность (наличие эндотоксинов, гибельных для лабораторных животных при определенных уровнях доз); токсигенность (наличие экзотоксинов, выделяемых в окружающую среду); диссеминация (способность микроорганизмов распространяться в организме теплокровных животных и персистировать в течение длительного времени.)

Жесткие критерии отбора, регламентированные общегосударственными методическими требованиями, из общего числа исследованных штаммов позволили охарактеризовать в качестве безвредных всего лишь два микроорганизма-деструктора ПХБ, являющиеся дрожжами Hansenula californica AT и бактериями Alcaligenes latus ТХД-13. Штаммы не вирулентны - LD50 для мышей и крыс

7 Q превышает 10 кл. при внутрибрюшинном введении и 10 при внутрижелудочном. На основании результатов проведенных исследований указанные штаммы могут быть отнесены к IV классу опасности микроорганизмов (малоопасные). Это позволяет использовать их без ограничений в окружающей природной среде в качестве биодеструкторов ПХБ.

Выбранные и охарактеризованные нами штаммы (Hansenula californica AT и Alcaligenes latus ТХД-13) депонированы во Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (приложение 6,7) и на них оформлены 2 международные заявки РСТ (приложение 4,5).

Определен уровень разложения ПХБ в почве микроорганизмами-деструкторами, условия влияющие на этот процесс. Максимальный уровень разложения ПХБ наблюдается при температуре 20 - 30° С, влажности почвы 60 - 80 % и посевной дозе микроорганизмов 1 литр на 1 м 2 при концентрации микробной суспензии 107 клеток/см3 для бактерий Alcaligenes latus, а для дрожжей Hansenula californica — 105 клеток/см3.

Проведенные полевые испытания показали, что выбранные штаммы микроорганизмов активно разлагают ПХБ, находящиеся в почве в различных концентрациях.

После рекультивационных мероприятий с внесением в почву микроорганизмов-биодеструкторов, было проведено изучение токсичности водного экстракта почвы на лабораторных животных. Результаты исследований показали значительное снижение токсического действия экстракта почвы на теплокровных животных. Морфологические и биохимические показатели крови крыс соответствовали физиологической норме и не отличались от таковых у животных контрольной группы, гонадотоксический эффект отсутствовал.

Таким образом, предлагаемый биологический метод рекультивации почв с использованием микроорганизмов-биодеструкторов может быть признан потенциально безопасным. В пользу этого свидетельствует ряд фактов:

1. культура микроорганизмов вносится в почву в концентрациях (10 -10 кл/мл), значительно уступающих испытанным на животных (109 кл/мл);

2. почва является естественной средой обитания данных микроорганизмов, на основании чего можно сделать заключение о невозможности изменения их свойств (патогенности) в процессе рекультивационных мероприятий;

3. в процессе санации происходит снижение численности интродуцированных микроорганизмов в почве до исходного уровня вследствие установления межвидового равновесия;

4. при внесении микроорганизмов-биодеструкторов происходит снижение уровня ПХБ в почве до относительно низких концентраций, не оказывающих общетоксического действия на организм теплокровных животных;

5. в результате жизнедеятельности микроорганизмов не происходит образования и накопления в почве токсических продуктов распада исследуемых ксенобиотиков.

На основании проведенных исследований нами сделано заключение, что для санации почв, загрязненных полихлорированными бифенилами, in situ, с высокой эффективностью может быть использовано внесение в почву микроорганизмов-деструкторов. Составлено с учетом полученных экспериментальных данных методическое руководство по использованию микроорганизмов-деструкторов для детоксикации почв, загрязненных полихлорированными бифенилами (приложение 3).

Разработана принципиальная схема микробиологической санации почв, загрязненных ПХБ, (рисунок 13)

МОНИТОРИНГ ЗЕМЕЛЬ НА ИНТЕГРАЛЬНУЮ ТОКСИЧНОСТЬ

ШТАММ МИРООРГАНИЗМА- 4,

ДЕСТРУКТОРА ИЗ МУЗЕЯ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ

УРОВНЯ И ГРАНИЦ

ЗАГРЯЗНЕНИЯ ПХБ

НАРАБОТКА БИОМАССЫ

МИРООРГАНИЗМА-ДЕСТРУКТОРА

ПХБ

1 ПРЕДВАРИТЕЛЬНАЯ

ОБРАБОТКА УЧАСТКА

4,

ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧЕЙ ВНЕСЕНИЕ

СУСПЕНЗИИ МИРООРГАНИЗМА МИКРООРГАНИЗМОВ

ДЕСТРУКТОРОВ ПХБ

ПРОВЕДЕНИЕ

КОНТРОЛЬ ЗА ПРОЦЕССОМ <— БИОРЕМЕДИАЦИИ ПОЧВ

БИОРЕМЕДИАЦИИ

ОФОРМЛЕНИЕ ПАСПОРТА НА САНИРОВАННЫЙ УЧАСТОК

Рис 13. Принципиальная схема биоремадйации почв загрязненных ПХБ при помощи микроорганизмов-деструкторов

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Капранов, Владимир Владимирович, 2000 год

1. Ашмарин И.П., Воробьев А. А. Статистические методы в микробиологических исследованиях Л.: Государственное издательство медицинской литературы, 1962. - 180с.

2. Безвредная и эффективная очистка почвы // Земледелие. 1991.-№9.-77 с.

3. Бобовникова Ц.И. и др. // Гигиена и санитария. 1988. -№7.- С.4-8.

4. Всемирная организация здравоохранения. Бюллетень. -Женева .: 1981.Т. 59. № 6.- С. 20-27.

5. Всемирная организация здравоохранения. Полихлорированные бифенилы и терфенилы. Доклад. Женева .: 1980.-83 с.

6. Всесоюзная научная конференция. "Микроорганизмы в сельском хозяйстве", Пущино, 20-24 января 1992 г. Пущино, 1992.-С. 14-15.

7. Вредные химические вещества Л.: Химия, 1993. Т 6. С. 56-61.

8. Герхардт. Ф. и др., Методы общей бактериологии М.:-Мир 1983. 405с.

9. Добровольская Т. Г., Скворцова И.Н., Лысак Л.В., Методы выделения и идентификации почвенных бактерий.-Московский Университет.-1989. 35с.

10. Ю.Звягинцев Д.Г., Методы почвенной микробиологии и биохимии М.: Московский Университет.-1991. 304 с.

11. П.Звягинцев Д.Г., Почва и микроорганизмы- М.: Московский Университет 1987. 256с.

12. Карасевич Ю.Н., Основы селекции микроорганизмов, утилизирующих синтетические органические соединения- М.: -Наука.-1982. 144с.

13. Материалы зональной конференции молодых ученых-биологов. Актуальные проблемы современной биологии-Казань, 1989. С.64-70

14. Н.Методические указания. Минздрав СССР. №-№ 4263-87, 2620-82. 63с.

15. Методическое руководство по биотестированию почвы / Мособлкомприрода, вх. № 621 от 08.08.95. Серпухов, Архив НИЦТБП, 1994-13 с.

16. Методические указания по гигиенической оценке микробных средств защиты растений от насекомых и растений и болезней на основе неспоровых микроорганизмов №2620-82-Киев. 1982 23с.

17. Набока М.В. Об использовании биотестирования в гигиенической оценке качества воды // Гигиена и санитария. -1993.-№6.-С. 75-76.

18. Новые способы очистки почвы // Земледелие. 1992. - № 4.- 18с.19.0ксенгендлер Г.И., Яды и организм. Проблема химической опасности Санкт-Петербург. Наука, 1991. - 319 с.

19. Очистка почвы на территории промышленных предприятий. Usine nouv., 1990, № 2294, с. 86-87.

20. Патент № 52259 Япония, В 461004516. Способ получения оптически активного альфа-фенилэтилового спирта путем культивирования микроорганизмов рода Pseudomonas на питательной среде, содержащей ПХБ.- 10.02.86.

21. Патент №162766, Япония, А 23030682 Метод получения метана из соединений бифенила.-08.02.91.

22. Патент № 453895, США, А 4981793. Биологический и химический способ гидроксилирования 4-замещенных ПХБ и продукты, полученные этим способом. 12. 20. 1989 31

23. Патент №53822, Япония, В 456017919. 5 -бензоилфталовая кислота, ее производные фи-формы и способ их получения. 24.04 81.

24. Патент №162765, Япония, А 30306773. Новый ген bph а, b,c,d, имеющий функции метаболизма ПХБ и новая бактерия несущая этот ген. -08.02.91.

25. Патент №4,843,007,США, Alcaligenes eutropis for biodégradation PSB. Jun.27,1989.

26. Почвы. Общие требования к отбору проб // ГОСТ 17.4.3.01 -83 (CT СЭВ 3847 82).- М., 1984. - 4 с.

27. Практикум по микробиологии. -Московский Университет.-1976. 307 с. 40.

28. Рацион кормления .-Приказ Минздрав СССР № 755 от 12.08.1977 г. 85с.

29. Прядко А.Л., Оконский А.И., ВеличкоВ.А., Черников В. А. Эколого-гигиеническая оценка промышленных отходов -химических мелиорантов почв // Известия Тимирязевской Сельскохозяйственной Академии. 1996. - Выпуск 4. - С. 107— 115.

30. Соколов М.С., Монастырский O.A., Пикушова Э.А. Экологизация защиты растений. Пущино: ОНТИ ПНЦ РАН, 1994 г.-462 с.

31. Сурнина Н.Н, В.В. Тарасов. Некоторые аспекты загрязнения внешней среды полихлорированными бифенилами и терфенилами // Журнал экологической химии. -1991. С. 5-20.

32. Справочник. Методы определения микроколичеств пестицидов в продуктах питания , кормах и окружающей среде. -М.: -Агропромиздат Т. 2. 1992. 416 с.

33. Санитарным правилам по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев).- Минздрав СССР.- 06.07.1973 г. 65с.

34. Тарасов В.В. Загрязнение окружающей среды полихлорированными бифенилами и пути минимизации их воздействия. // Сборник научных трудов РХТУ LXXV лет/ Основные достижения в науке. М.: 1996. - С. 24-41.

35. Токсичность полихлорбифенилов и проблема их промышленного использования. Гражданская оборона ,- 1986. 284с.

36. Харченко А.Т. и др .Российский химический журнал. 1993. T.XXXVII. №3. С.40-43.

37. Abramowicz D.A. Aerobic and anaerobic biodégradation of PSBs: a review / CRC Critical Reviews in Biotechnology, 1990, vlO, p 241-250.

38. Ahmed M- and D.D. Focht. Degradation of polychlorinated biphenils by two species of Achromobacter / Can. J. Microbial., 1973, vl9,p 47-52.

39. Bedard D.L., Wagner R. E., Brennan M.J., Haberl M.L., Brown J. F. Extensive degradation of Aroclors and environmentally transformed polychlorinated biphenyls by Alcaligenes eutrophus Н850/ Appl. Environ. Microbiol., 1987, v 53 p 11031112.

40. Bedard D.L., Wagner R. E., Brennan M.J, Haberl M.L., Brown J. F. Extensive degradation of Arochlors and environmentally transformed polychlorinated biphenyl by Alcaligenes eutrophus U1850/ Appl. Environ. Microbiol., 1987, v 54 pi094-1102.

41. Bedard D.L., Untcrman., Bopp L.H., Brennan M.J. Extensive degradation of polychlorinated biphenyl Afoclois and environmentally transformed polychlorinated biphenyl by Alcaligenes eutrophus FV50/ Appl. Environ. Microbiol, 1986, v51: p761-768.

42. BergeyAs manual determinative bacteriology. T.S. Williams, Gibbons N. E. (Eds.). Baltimore, 1994. Vol. 4.

43. Bridges O., Bridges J., Losing V., Hope M. The environment and health in Russia. Alddershot Brookfield/ Hong Kong. - Singapore Sydney. - 1996. - 266 p.

44. Deckwer W.-D. Weppen P. Обзор технологий по санации загрязненной почвы и заброшенных территорий, загрязненных вредными отходами. Chemie-Ingenieur-Technik., 1987, Vol. 59, p. 457-464.

45. Evans В.S., Dudley C.A., Klasson KT. Sequential Anaerobic- Aerobic Biodegradation of PSB in Soil Slurry Microcosms/ Applied Biochemistry and Biotechnology, 1996, v 57-8, Iss SPR, p 885-894.

46. Harkeness M.R., and all. In situ stimulation of aerobic PCB biodégradation in Hudson River sediments / Science, 1993, v. 259, #22, p. 503-507.

47. Haddoc J.D., Horton J.R., Gibson D.T. Dihydroxylation and dechlorination of chlorination biphenilus by purifield biphenil 2,3 dioxygenases from Pseudomonas sp. LB 400 / J. Bacteriologi, 1995, # 177, p. 20-26.

48. Kreger-van Rij N. J. W. (ed.) The yeasts. A taxonomic stady. 3d. Elsevier, 1984.

49. Pfieger-Bruss S., Hanf V., Behnisch P., Hagenmaier H., Rune G. M. Effect of PSBs on spermatogenesis/ Lancet, N8981, p. 1040-1041.

50. Schöndorf T., Münz K.H. Удаление полихлорированных бифенилов из загрязненной почвы. Chem. Rosch. (Schweiz.), 1988, v. 41, №45, s. 18.

51. UNEP. Субрегиональное совещание по выявлению и оценке выбросов стойких органических загрязнителей. Санкт-Петербург.: 1997. - 288 с.

52. UNEP. Inventory of wold-wide РСВ destruction capacity. First Issue. 1998, s 85.