Методы корреляционной и диффузионной спектроскопии ЯМР в определении молекулярного строения блок-сополимеров тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Иванова Валерия Антоновна

• Иванова Валерия Антоновна
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Иванова Валерия Антоновна

Объекты и методы исследования

Практическая значимость работы

Положения, выносимые на защиту:

Личный вклад автора

Достоверность результатов

Апробация работы

Публикации

Структура диссертационной работы

1. Обзор литературы

1.1. Тренды фармацевтики

1.2. Наноконтейнеры для повышения эффективности лекарственных средств

1.3. Блок-сополимеры для создания наноконтейнеров

1.4. Наноконтейнеры на базе блок-сополимеров различной архитектуры

1.5. Примеры медицинского применения наноконтейнеров

1.6. Причины выбора блок-сополимеров на основе МПА, ПЛА и ПЭГ

1.7. Контроль структуры блок-сополимеров - ЯМР

1.8. Использование альгината натрия в медицинских целях

1.9. Теория ЯМР

1.10. Применение спектроскопии ЯМР для определения характеристик блок-сополимеров

1.11. Формулировка задач

2. Материалы и методы

2.1. Материалы

2.2. ЯМР высокого разрешения

2.2.1. !Н-ЯМР

2.2.2. 13С-ЯМР

2.2.3. COSY

2.2.4. TOCSY

2.2.5. HSQC

2.2.6. HMBC

2.2.7. DOSY

3. Развитие корреляционных методов спектроскопии ЯМР применительно к блок-сополимерам

3.1. BOLTRON

3.2. Гипперазвтевленные блок-сополимеры

3.3. Линейные блок-сополимеры

4. Развитие диффузионных методов применительно к блок-сополимерам

4.1. Подбор методов обработки

4.2. Симуляция данных для проверки обработки

4.3. Смеси ПЭГ

4.4. Смеси блок-сополимер/гомополимер

4.5. Применение результатов диффузионного эксперимента для оценки характеристик блок-сополимеров

5. Методы спектроскопии ЯМР для изучения сшивания альгината натрия ионами металлов

6. Выводы

Список использованных источников

Актуальность темы исследований

Разработка биоразлагаемых наноконтейнеров для адресной доставки лекарственных средств является одним из ведущих трендов персонализированной медицины и высокотехнологичного здравоохранения, входящих в стратегию научно-технического развития Российской Федерации. Использование инкапсулированных лекарственных препаратов обладает рядом преимуществ, таких как увеличение эффективности действия без превышения порога токсичности, раскрытие терапевтического потенциала ранее неиспользуемых биоактивных компонентов за счет повышения их растворимости. Инкапсулирующие наноконтейнеры могут быть адаптированы для переноса различных действующих веществ. В качестве материалов для подобных транспортировщиков лекарственных средств широко применяются блок-сополимеры и гели на основе биоразлагаемых полимеров, которые не наносят вреда для организма и полностью выводятся из него. Перспективными являются материалы на основе полилактида, полиэтиленгликоля, альгината натрия, демонстрирующие высокую биосовместимость.

Внедрение в массовое производство средств повышения эффективности лекарственных препаратов требует упрощенного синтеза носителей. Однако масштабирование производства ведёт к увеличению количества примесей и уменьшению избирательности синтеза, а именно увеличению дисперсии молекулярных масс полимерных носителей, и потому требует тщательного контроля структуры «строительных блоков» переносчиков. Для решения задачи контроля используются методы спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР), позволяющие получить детальную информацию об особенностях структуры и динамики соединения без его разрушения, в условиях, которые могут быть максимально приближенны к целевым. Несмотря на то, что ЯМР является весьма информативным методом для анализа органических соединений, использование его для оценки

количественных характеристик блок-сополимеров и полимерных гелей сопряжено с рядом сложностей. Спецификой блок-сополимеров является зависимость химического сдвига однотипных групп в спектрах ЯМР от положения звена в цепи блок-сополимера, поэтому существенным препятствием является невозможность однозначной интерпретации одномерного спектра ЯМР без использования корреляционных методов. Более того, использование синтеза с меньшим количеством стадий для больших масштабов производства ведет к появлению побочных продуктов, структура и состав которых частично может совпадать с целевым, что приводит к искажению интенсивности резонансных сигналов, используемых для определения количественных характеристик.

Целью работы является создание методики, позволяющей анализировать строение линейных, гиперразветвлённых блок-сополимеров на основе полимолочной кислоты и гелей на основе альгината натрия с блоками маннуроновой и глюкуроновой кислот, сшитых ионами металлов с использованием корреляционных и диффузионных методов спектроскопии ЯМР.

Для достижения сформулированной цели были поставлены следующие задачи:

- Создать оптимальную по информативности и времени эксперимента серию корреляционных методов спектроскопии ЯМР для определения структуры блок-сополимеров на основе полилактида;

- Выбрать и обосновать метод контроля количества примесей в ходе синтеза блок-сополимеров с полилактидом на основе диффузионного эксперимента ЯМР;

- Разработать метод обработки кинетических данных диффузионного эксперимента ЯМР, позволяющий оценить число компонентов в смеси, а также долю каждого из компонентов;

- Разработать метод оценки характеристик - степени сшивки, соотношения блоков, длины блоков - блок-сополимеров гиперразветвлённой и линейной архитектуры, а также биополимерных гелей на основе корреляционных и диффузионных методов спектроскопии ЯМР.

Объекты и методы исследования

Основными объектами исследования являются блок-сополимеры гиперразветвленной и линейной архитектуры, а также биополимерные гели как предельный случай сшивания полимеров:

1. Гиперразветленный полиэфир BOLTORN Ш0 - полиэфир четвертого поколения 2,2-(бис)метилолпропионовой кислоты с ядром триметилпропана в качестве базы для гиперразветвленных блок-сополимеров;

2. Гиперразветвленные блок-сополимеры BOLTORN Ш0 - PLAn с варьируемой длиной полилактидного блока;

3. Линейные блок-сополимеры mPEG113-PLAn с фиксированной длиной полиэтиленгликолевого блока в 113 звеньев и варьируемой длиной полилактидного блока;

4. Смеси линейных блок-сополимеров mPEG113-PLAn с свободным полилактидом, длина которого совпадает с длиной полилактидного блока;

5. Гели на основе альгината натрия, сшитого ионами Ca2+, $г2+, Zn2+ или

Для анализа характеристик перечисленных объектов применялись следующие методы исследования:

1. 1Н-ЯМР для определения соотношения концевых, стыковых и внутренних звеньев в структуре блок-сополимеров, а также для качественного контроля изменения степени сшивки;

2. 13С-ЯМР для получения спектров с высоким разрешением сигналов ядер в слабо отличающемся магнитном окружении;

3. Гомоядерный корреляционный эксперимент COSY ЯМР для детектирования внутримолекулярного взаимодействия ядер водорода в составе концевых и внутренних звеньев блок-сополимеров;

4. Гетероядерный корреляционный эксперимент HSQC ЯМР для детектирования внутримолекулярного взаимодействия непосредственно связанных ядер водорода и углерода в составе блок-сополимеров;

5. Гетероядерный корреляционный эксперимент HMBC ЯМР для детектирования внутримолекулярного взаимодействия ядер водорода и углерода в составе блок-сополимеров, связанных через несколько связей;

Диффузионный эксперимент DOSY ЯМР, направленный на поиск количества компонент в исследуемом образце, их долей и подвижностей.

Научная новизна

- Установлена структура и количественные характеристики биоразлагаемых сополимеров BOLTORN и полилактида (PLA), сополимеров полилактида и метокси(поли)этиленгликоля (mPEG) на основе однозначной интерпретации 1Н-ЯМР спектра с малоинтенсивными сигналами концевых звеньев;

- Показано различие механизмов сшивки альгината натрия в случае использования ионов Ca2+ и Sr2+;

- Впервые реализован оригинальный метод обработки диффузионных экспериментов, позволяющий оценить массовые доли компонентов в смесях

блок-сополимеров и гомополимеров (мономеров и/или олигомеров), сигналы которых в протонном спектре плохо разрешены. Показано, что предложенный метод обработки диффузионных данных позволяет надежно выделять число компонент и их долю. Валидация проводилась на смесях блок-сополимеров полилактид-метокси(поли)этиленгликоль и полилактида с соответствующей длиной цепи;

- Впервые получена достоверная интерпретация 1Н-ЯМР спектров блок-сополимеров BOLTORN-PLA и PLA-mPEG, составляющих основу для создания наноконтейнеров;

- Впервые решена задача определения количественных характеристик блок-сополимеров в присутствии неустранимых примесей гомологичных продуктов синтеза.

Практическая значимость работы

Разработанные методы комплексного анализа молекулярного строения блок-сополимеров различной архитектуры позволяют стандартизировать методику определения строения различных типов блок-сополимеров, дают возможность контроля строения и характеристик в процессе синтеза. Апробированная комбинация методов позволяет определить степень сшивки ионами металлов биополимерных гелей с целью оптимизации характеристик геля применительно к конкретной медицинской задаче. Выработанная методика применима к широкому спектру биоразлагаемых соединений и позволяет оперативно контролировать результаты синтеза. Результаты могут быть использованы для научно обоснованного подбора наноконтейнеров разной архитектуры, размера, состава с целью адаптации к каждому конкретному лекарственному препарату.

Положения, выносимые на защиту:

1. Комплексная методика определения молекулярного строения блок-сополимеров различной архитектуры, включающая серию одномерных, а также корреляционных и диффузионных экспериментов спектроскопии ЯМР.

2. Подход к анализу состава смесей блок-сополимеров с гомологичными мономерами или олигомерами, характеризуемых неразрешенными сигналами в спектрах ЯМР, на основе диффузионного эксперимента ЯМР.

3. Метод обработки данных диффузионного эксперимента ЯМР, направленный на поиск количества компонентов смеси и их массовых долей.

4. Структура, включающая соотношение блоков и количество звеньев в каждом из блоков блок-сополимеров гиперразветвленной архитектуры на основе гиперразветвленного полиэфира БОЬТОКЫ (полиэфир 2,2-бис-метилолпропионовй кислоты) и полилактида с различной длиной полилактидного блока, установленная с использованием комплексной методики на базе спектроскопии ЯМР.

5. Структура, включающая длины входящих блоков линейных блок-сополимеров метоксиполиэтиленгликоля и полилактида с варьируемой длиной полилактидного блока, установленная с использованием комплексной методики на базе спектроскопии ЯМР.

6. Степень сшивки и различие механизма сшивки альгината натрия ионами двухвалентных металлов, определенные с использованием методов спектроскопии ЯМР.

Личный вклад автора

Все этапы исследования, включающие постановку научной задачи; выбор методов решения; планирование, подбор параметров и проведение экспериментов ЯМР; подготовка калибровочных смесей для проверки работы

диффузионных методов проводились при непосредственном участии Ивановой В.А. Автором лично проведены эксперименты на базе спектроскопии ЯМР для определения строения гиперразветвленного полиэфира BOLTORN H40, гиперразветвленных и линейных блок-сополимеров. Автор лично проводил все калибровочные эксперименты при определении чувствительности диффузионного эксперимента DOSY к количеству примеси и размеру примеси. Автор лично проводил эксперименты на базе спектроскопии ЯМР для определения степени и механизма сшивки для гелей из альгината натрия, сшитого различными ионами двухвалентных металлов. Автором осуществлены интерпретация полученных спектров, обработка и анализ результатов, выполнение расчетов, направленных на оценку характеристик блок-сополимеров и биополимерных гелей, а также подготовка материалов к публикации.

Достоверность результатов обеспечивается использованием стандартных импульсных последовательностей экспериментов ЯМР, математически обусловленных методов обработки и определения погрешности; повторяемостью и стабильностью измеряемых величин в многочисленных экспериментах, а также сходимостью результатов, полученных с применением различных методов.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Методы корреляционной и диффузионной спектроскопии ЯМР в определении молекулярного строения блок-сополимеров»

Апробация работы

Основные результаты работы были представлены на следующих конференциях: Всероссийская научная конференция МФТИ (г. Долгопрудный, 2019, 2021 и 2023 г.), Международная конференция-конкурс молодых физиков (г. Москва, 2019 г.), Пятый Всероссийский молодёжный форум Наука будущего - наука молодых (онлайн, 2020 г.), XII International Conference on Chemistry for Young Scientists «Mendeleev 2021» (г. Москва, 2021 г.), 19th International School-Conference Magnetic resonance and its applications/ SPINUS - 2022 (г. Санкт-Петербург, 2022 г.), IX Всероссийская научная

молодёжная школа-конференция «Химия, физика, биология: пути интеграции» (г. Москва, 2022 г.).

Публикации

1. В.А. Шпотя (Иванова), В.И. Гомзяк, А.М. Перепухов, А.В. Максимычев, С.Н. Чвалун, «Методы корреляционной спектроскопии ЯМР в изучении структуры гиперразветвлённого полиэфира BOLTORN H40» -Труды МФТИ, 2020 г. Т. 12. № 2 (46). С. 131-140.

2. V. Shpotya (Ivanova), A. Perepukhov, A. Maksimychev, V. Gomzyak, N. Sedush, S. Chvalun, Structure determination of hyperbranched polyester BOLTORN H40 by 1D- and 2D-NMR spectroscopy - Polymer Bulletin, 2022. Vol. 80. № 4. P. 4523-4534.

3. V. Gomzyak, N. Bychkov, A. Aduev, V. Ivanova, A. Koshelev, S. Chvalun, Polymerization of D,L-lactide in the presence of Boltorn(TM) polyester polyol - Fine Chemical Technologies, 2022. Vol. 17. № 3. P. 242-252.

4. A. Forysenkova, V. Ivanova, I. Fadeeva, G. Mamin, J. Rau, 1H NMR and EPR Spectroscopies Investigation of Alginate Cross-Linking by Divalent Ions -Materials, 2023. Vol. 16. № 7. P. 2832.

5. V. Palmin, A. Mukhin, V. Ivanova, A. Perepukhov, A. Nozik, Automated component analysis in DOSY NMR using information criteria - Journal of Magnetic Resonance, 2023. Vol. 355. № 17. P. 107541

Структура диссертационной работы.

Объем диссертационной работы составляет 127 страниц текста, включающих 51 рисунок, 7 таблиц и 124 источника литературы. В работе выделены введение, литературный обзор (глава 1), описание используемых методов и материалов (глава 2), обсуждение результатов (главы 3, 4 и 5), выводы и список литературы.

1. Обзор литературы

1.1. Тренды фармацевтики

Современные тенденции повышения уровня жизни населения находят отражение в изменении концепции здравоохранения и переходу к персонализированной медицине и рациональному использованию лекарственных средств. Важность этого процесса отмечена на государственном уровне - указом президента РФ от 2016 года персонализированная медицина включена в список приоритетных направлений стратегии научно-технологического развития Российской федерации [1], а в 2018 году приказом Министерства здравоохранения была утверждена концепция предикативной, превентивной и персонализированной медицины [2].

Персонализированная медицина тесно связана с индивидуальным подбором материалов и лекарственных средств под каждый клинический случай. Это включает использование функциональных материалов для протезов и имплантов с заданными физико-химическими свойствами, повторяющими свойства тканей организма или позволяющих добиться определённых эффектов. Кроме того, персонализированное лечение требует высоких показателей эффективности используемых лекарств, что может быть достигнуто с помощью адресной доставки лекарственных средств к пораженным тканям или клеткам. При этом требования к транспортировщикам биоактивных соединений достаточно высоки - они должны быть нетоксичны, биосовместимы, контролируемы с точки зрения среды и времени высвобождения гостевой молекулы, стабильны в краткосрочной перспективе (до достижения целевых клеток или тканей) и биоразлагаемы.

В течении последних лет было предложено множество вариантов реализации транспортировщика для адресной доставки (Рис. 1) [3]. Среди них

можно выделить нанокристаллы, липосомы, наноконтеинеры мицеллярного типа, белковые и неорганические наночастицы.

Помимо наноразмерных транспортировщиков лекарственных средств возможно использование различных полимерных гелеи и пленок, способных постепенно высвобождать биоактивные вещества по мере деградации [4].

Рис. 1. Примеры наноконтейнеров для адресной доставки лекарственных средств: а) гиперразветвлённый блок-сополимер; б) мицелла на основе линейных блок-сополимеров; в) звёздообразный блок-сополимер; г) липосома; д) квантовые точки; е) белковые наноконтейнеры

1.2. Наноконтейнеры для повышения эффективности лекарственных средств

Каждый тип переносчика имеет свою область применения, преимущества и недостатки. Но все они работают на повышение эффективности лекарственного средства. Так, наноконтейнеры способствуют снижению терапевтической концентрации биоактивного вещества. Это происходит за счет изолирования молекулы-гостя от агрессивных внешних сред (таких, как желудочный сок), и высвобождения гостя только в средах с определенными свойствами - температурой, кислотностью, и прочее. Более направленная доставка активного вещества обеспечивает достаточный терапевтический эффект при меньшем общем количестве используемого вещества, поскольку значительно снижается поправка на те молекулы, которые в ходе растворения в крови попадут в нецелевые ткани и клетки. Это позволяет эффективно использовать лекарственное средство с меньшей вероятностью превышения порога токсичности [3, 5, 6, 7, 8].

В случае с использованием полимерных гелей достигается пролонгированный эффект действия лекарственных средств, что особенно важно при лечении повреждений внутренних органов и ран [4, 9].

Условия для высвобождения гостевой молекулы можно менять за счёт изменения структурных характеристик наноконтейнера. Это позволяет сделать на базе наноконтейнера определенного типа и состава целый спектр транспортировщиков, адаптированных под каждое конкретное лекарственное средство и для разных целевых тканей.

1.3. Блок-сополимеры для создания наноконтейнеров

Наноконтейнеры мицеллярного типа являются одними из самых удобных в синтезе и адаптации для различных лекарственных средств [10]. Такие структуры создаются на основе амфифильных блок-сополимеров. Блок-

сополимеры - это сополимеры, состоящие из гомополимерных блоков, соединенных между собой непосредственно или через низкомолекулярное соединение отличного состава (Рис. 2) [11]. Для блок-сополимеров характерно проявление свойств, типичных для каждого из входящих в состав и представляющих отдельный блок полимеров.

о II сн, 1 О II сн, 1 н2 н2 н2 Нг

но^с^ 1 хн ^ 1 ,0. __

с II 4О^ ^с' II с Н, 0 ""С нг 'X' О'' Нг нг

сн5 О сн3 О

Д ибяок-е опси шмер

Триблок-сополимер типа АБА

Рис. 2. Строение блок-сополимеров

Благодаря своей структуре амфифильные блок-сополимеры образуют в водных растворах мицеллы. Гидрофобные свойства одного из блоков позволяют наноконтейнеру слабо связываться с инкапсулируемой молекулой - биоактивным веществом, которое должно быть доставлено к нужным клеткам или тканям. Гидрофильные свойства другого блока позволяют всему наноконтейнеру растворяться в воде, и, как следствие, сделать переносимую молекулу биодоступной. Это открывает дорогу целому ряду веществ, которые имеют потенциал в лечении болезней, но не были использованы ранее из-за их слабой растворимости в водных растворах. Возможно дополнение структуры и другими блоками или соединениями, позволяющими специфично связываться с определенными клетками или проявлять светочувствительные

свойства для ещё большего контроля над высвобождением гостевой молекулы.

1.4. Наноконтейнеры на базе блок-сополимеров различной

Для наноконтейнеров могут быть использованы амфифильные биоразлагаемые блок-сополимеры различной архитектуры - дендритной, гиперразветвлённой, звездообразной и линейной (Рис. 3). Первые три типа способны образовывать мономолекулярные мицеллы, для которых характерно инкапсулирование гостя в удлинённых ветвях разветвлённого полимера. В случае линейных блок-сополимеров более характерно образование мицеллы из большого количества молекул блок-сополимеров, причем соотношение блоков в значительной мере влияет на форму мицеллы и, соответственно, ее свойства.

архитектуры

г

I

ч

а)

б)

в)

Рис. 3. Блок-сополимеры различной архитектуры: а) линейный; б) гиперразветвлённый (при максимальном разветвлении - дендритный);

в) звёздообразный

Каждая из представленных архитектур блок-сополимеров имеет свои особенности и показатели, характеризующие их строение. Общей характеристикой можно назвать степень полимеризации, которая определяется глубиной протекания реакции блок-сополимеризации, и зависит от условий синтеза.

Дендритные блок-сополимер представляют собой идеальный дендример, к концам ветвей которого присоединены линейные полимеры другого состава. В структуре дендримера есть только два типа звеньев -дендритные, являющиеся разветвляющим узлом, и терминальные, заканчивающие ветвь. К существенным параметр, характеризующим идеальную структуру дендримера, можно отнести только количество генераций и количество ветвей из ядра полимера. Количество генераций - это число уровней ветвления (называемого еще номером поколения), которое отвечает за размер всего полимера. Количество ветвей из ядра дендримера зависит от строения ядра и чаще всего составляет три или четыре ветви, раздваивающиеся с каждым новым звеном. Благодаря своей кроноподобной структуре блок-сополимеры на основе дендримеров могут инкапсулировать молекулу-гостя, и в воде мономолекулярной мицеллы проникать через кровь к целевым клеткам и тканям. Дендримеры удобны в описании, их чётко определенная структура позволяет легко воспроизводить результаты экспериментов, однако же синтез таких полимеров для создания дендримеров с идеальной структуры сложный и экономически затратный, что препятствует распространению в фармацевтике [12, 13].

Гиперразветвлённые блок-сополимеры во многом похожи на дендридные блок-сополимеры - они также представляют собой кроноподобный полимер с пришитыми к ветвям линейными цепочками другого состава и могут образовывать мономолекулярные мицеллы для транспортировки гостевой молекулы. При этом в структуре гиперразветвлённых блок-сополимеров возможно три типа звеньев -

дендридные ф), разветвляющие текущую цепь; линейные (Ъ), продолжающие цепь без разветвления; и терминальные (Т), заканчивающие цепь (Рис. 4). Соотношение дендридных и линейных звеньев определяет разветвлённость всего полимера и степень его приближенности к идеальному дендримеру - чем больше доля дендридных звеньев, тем ближе его структура к идеальной и тем меньше она вариативна [14]. Увеличение доли линейных звеньев не только ведёт к росту числа вариаций финальной структуры гиперразветвлённого полимера, но и увеличивает число активных центров, к которым возможно дальнейшее присоединение других полимерных цепей или прочих соединений. Кроме того, линейные звенья в структуре гиперразветвлённых блок-сополимеры склоны к сворачиванию, что ведёт к увеличению запутанности финальной структуры. Однако, менее жёсткая в статистическом плане структура может быть реализована в значительно упрощенном синтезе (относительно синтеза дендримеров), что перспективно для массового использования наноконтейнеров на основе гиперразветвлённых блок-сополимеров [15].

он

но

J

Рис. 4. Структура ветви гиперразветвлённого полиэфира BOLTORN H40 с выделенными звеньями: красным дендридные (D); синим линейные (L); зелёным терминальные (T)

Для оценки разветвлённости структуры гипперазветвлённых блок-сополимеров исследователями было предложено несколько характеристик, зависящих от соотношения линейных и дендридных звеньев. Исторически первая характеристка, получившая название степень разветвления (DB, от английского degree of branching), была предложена Хокером (1) [16]:

D + T (1)

DB =-, ( )

D + L + T'

где D, L и Т - количество дендридных, линейных и терминальных звеньев, соответственно. Чем ближе значение степени разветвления к 1, тем ближе структура гиперразветвлённого полимера к идеальной дендримерной. Чаще всего значение степени разветвления лежит в диапазоне от 0,4 до 0,8. Такая характеристика наглядна и удобна для использования с данными интенсивностей сигнал ЯМР-спектра. Однако позже Фреем было показано [17], что такая характеристика не является универсальной для гиперразветвлённых полимеров различного размера. Он, в свою очередь, предложил следующую формулу для определения степени разветвления (2):

2D (2)

DB =-. ( )

2D + L

Предложенная формула (2) основывается на наблюдении, что в структуре гиперразветвлённого полимера количество дендридных и терминальных звеньев очень близко из-за связи числа разветвляющих узлов и числа ветвей на последнем уровне генерации и, соответственно, их концов. Такая связь характерна и для гиперразветвлённых полимеров с отличным по строению ядром, задающим начальное количество ветвей (формула применима для больших макромолекул). При этом количество линейных звеньев никак не зависит от числа дендридных и терминальных звеньев. К

преимуществам формулы (2) можно отнести меньшее число требуемых параметров, что может быть значительным при извлечении интенсивностей сигналов протонов из разных типов звеньев, которые могут быть недостаточно разрешены в ЯМР-спектре.

Формулы (1) и (2) применимы для гиперразветвлённых полимеров типа АВ2, в которых дендридные звенья разветвляют цепь только на два направления. Для случаев с большим количеством разветвлений используются более сложные формулы, выводимые статистическими методами.

Для блок-сополимеров на основе гиперразветвлённых полимеров существенным становится количество пришитых полимерных цепочек, которое зависит не только от количества терминальных звеньев блок-сополимера (к каждому терминальному звену можно присоединить две полимерные цепочки), но и от числа линейных звеньев. Присоединение к линейным звеньям может быть стерически затруднительно, поэтому оценить число пришитых в ходе блок-сополимеризации цепей только по величине степени разветвления гиперразветвленного полимера не представляется возможным, можно лишь предсказать максимально возможное значение. Соотношение пришитых цепочек к числу активных центров гиперразветвленного полимера можно определить из ЯМР спектра [18, 19].

Среди преимуществ гиперразветвлённых блок-сополимеров, помимо их упрощенного синтеза, пригодного для массового производства, можно выделить следующие: компактная структура с меньшей степенью запутанности (чем, например, в мицеллах, образованных линейными блок-сополимерами); сильный эффект концевых групп; низкая вязкость при растворении и плавлении; высокая растворимость в распространённых растворителях. Так же структура гиперразветвлённых блок-сополимеров позволяет постепенно присоединять новые функциональные группы или более крупные химические соединения, тем самым обеспечивая широкий

спектр дополнительных свойств, необходимых для более эффективного связывания с лекарством и его адресной доставки [20-23].

Звездообразные блок-сополимеры основываются на соответствующих полимерах, представляющих собой ядро с множеством радиально расходящихся полимерных лучей. В отличие от дендридных и гиперразветвлённых полимеров, в их структуре нет дендридных разветвляющих звеньев, а есть только линейные и терминальные. По сравнению с линейными полимерами подобного состава, звездообразные полимеры имеют большее количество терминальных звеньев, проявляющих гидрофильные свойства и способствующие лучшему растворению. Характеристиками блок-сополимеров на основе звездообразных полимеров являются длины лучей и присоединённых полимерных цепей [24].

В случае линейных блок-сополимеров две или более полимерные цепочки соединяются последовательно. На свойства таких блок-сополимеров оказывают влияние длины входящих блоков. Они проще в синтезе и легче поддаются внешнему контролю, в том числе методами ЯМР спектроскопии. Кроме того, тот факт, что линейные блок-сополимеры образуют многомолекулярную мицеллу, отделяет это вид блок-сополимеров от всех вышеперечисленных. Такие мицеллы больше по размерам, чем мономицеллы, что делает их более пригодными для транспортировки крупных гостевых молекул [25].

1.5. Примеры медицинского применения наноконтейнеров

Поскольку одним из основных направлений применения гиперразветвлённых, звездообразных и линейных блок-сополимеров является адресная доставка лекарственных средств, то к настоящему моменту проведено достаточно много исследований по использованию блок-сополимеров в составе наноконтейнеров. Наиболее перспективным является использование наноконтейнеров в противораковой терапии, поскольку в

таком формате доставки лекарственных средств есть возможность снабдить контейнер распознавательным элементом, реагирующим на раковые клетки. В работе Ханнанова и соавторов [26] показана возможность использования гиперразветвлённых блок-сополимеров на основе полиэфира BOLTORN для инкапсуляции противоопухолевого препарата доксорубицина. Нагрузка наноконтейнеров в виде мономицелл из гиперразветвлённого полиэфира BOLTORN Н40 с полилактидом, полиэтиленгликолем и фолатами для распознавания раковых клеток описана и в работе Прабахарана [27]. Другой вариант противоракового средства с использованием наноконтейнеров был предложен в работе Абандансари и соавторов [28], в которой они предлагали инкапсулировать гидрофобный противораковый компонент пакслитаксел в наногель на основе гиперразветвлённого полиэфира BOLTORN с рН-чувствительными мостиками из поливинилпиридина и вставками из полиэтиленгликоля для лучшей растворимости. Для ряда различных противораковых лекарств подобраны разные варианты наноконтейнеров, позволяющих добиться высокой эффективности в лечении различных форм раковых опухолей [6, 29-31].

Помимо противораковой терапии, адресная доставка лекарственных средств с помощью мицеллярных блок-сополимеров используется и в противогрибковой, и в противовоспалительной терапиях [32, 33]. Среди последних достижений фармакологии можно отметить создание российскими учеными лекарства от СОУГО-19 на основе пептидного дендримера [34].

Большая адаптивность наноконтейнеров позволяет инкапсулировать не только лекарственные средства, но и молекулы ДНК, что открывает путь к использованию в области генетики [35].

Адресная доставка лекарственных средств может осуществляться не только при оральном или внутривенном введении наноконтейнеров с биоактивными соединениями, но и не инвазивно, для лечения кожных

заболеваний. В своей работе [22] Ду и соавторы показали, что использование наноконтейнеров на основе гиперразветвлённых блок-сополимеров (гиперразветвлённый полиглицерол+поликапролактон +полиэтиленгликоль) с нагрузкой в виде противовоспалительного препарата дексаметазона приводит к улучшению проникновения действующего вещества в кожные покровы, при этом проявляя отличную стабильность наноконтейнера и его совместимость с клетками.

Использование блок-сополимеров не ограничивается адресной доставкой лекарственных средств. В медицинской сфере блок-сополимеры применяются и для создания гелей и более плотных материалов для имплантов. В такие материалы можно добавлять лекарственные средства, которые будут медленно высвобождаться по мере деградации материала. Кроме того, механические свойства подобных материалов можно варьировать за счет изменения характеристик блок-сополимеров, что позволяет адаптировать материал под свойства натуральных тканей.

1.6. Причины выбора блок-сополимеров на основе МПА, ПЛА и ПЭГ

Как уже обсуждалось ранее, блок-сополимеры, используемые в качестве строительного материала для наноконтейнеров, должны обладать рядом свойств, среди которых особенно важны биосовместимость, нетоксичность, биоразлагаемость. При этом их структура должна быть хорошо контролируемой для воспроизводимости результатов. По этой причине природные полисахариды не всегда подходят, так как структура таких соединений сильно варьируется даже внутри одного образца, и на неё влияют условия происхождения биополимера.

Особое место среди биоразлагаемых полимеров занимает полилактид (PLA). Этот полимер синтезируется на основе растительного сырья, он биосовместим, термопластичен, обладает хорошими механическими

свойствами. Мономером полилактида служит молочная кислота, которая оптически активна и может образовывать право- и левовращающие оптические изомеры. Использование оптически активных элементов позволяет добавить ещё один контролируемый параметр в структуру полимера, что делает его ещё более адаптивным для разных целей [36].

2,2-Бис(метилол)пропионовая кислота (bMPA) синтезируется из нефтепродуктов. Тем не менее, этот углеводород показывает высокую биосовместимость, биоразлагаем, а также проявляет низкую токсичность. При всех перечисленных выше преимуществах тот факт, что на основе бис метилол пропионовой кислоты можно создавать огромное количество различных структурных полимеров, дополняя их функциональными группами для задания нужных свойств, делает это соединение крайне перспективным для адресной доставки лекарственных средств. Серия коммерческих гиперразветвленных полиэфиров Boltorn (TM) основана на использовании bMPA в качестве мономера и включает в себя полиэфиры с разными ядрами и разным количеством генераций. Наличие гидроксильных групп на концах ветвей полиэфиров позволяет достаточно легко проводить реакции блок -сополимеризации с другими полимерами, такими как полилактид, полиэтиленгликоль, поликапралактон и другими.

Ещё одним полимером, часто используемым в блок-сополимерах, является полиэтиленгликоль (ПЭГ, PEG). ПЭГ был впервые синтезирован более полувека назад, и к настоящему времени активно используется в фармацевтической и косметической областях. Биоразлагаемость этого полимера доказана для экземпляров со средней молекулярной массой менее 20кДа. Вкупе с хорошей растворимостью, низкой токсичностью и давно налаженным синтезом, это делает ПЭГ одним из наиболее частых полимеров, используемых в составе блок-сополимеров для различных целей.

1.7. Контроль структуры блок-сополимеров - ЯМР

Поскольку соотношение блоков в составе блок-сополимера играет большую роль для свойств всего наноконтейнера, критически важным становится контроль этих характеристик. Методов, которые могут быть полезны в определении свойств блок-сополимеров, достаточно много. Так, для определения средней молекулярной массы (MMA - molar mass averages) и распределения молекулярной массы (MMD - molar mass distribution) используются методы гельпроникающей хроматографии (SEC - size-exclusion chromatography) в тандеме с многоугольным рассеянием света (MALS - multi-angle light scattering) или масс-спектрометрией с матрично-активированной лазерной десорбцией/ионизацией МАЛДИ (MALDI TOF - matrix assisted laser desorbtion/ionization time-of-flight spectrometry) [37-39]. Абсолютная среднечисленная молекулярная масса определяется методом паровой осмометрии. Вязкость раствора блок-сополимеров и их производных исследуют связкой методов гельпроникающей хроматографии и вискозиметрии. Большое количество термодинамических характеристик можно определить методом обратной газовой хроматографии. Методами дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC - differential scanning calorimetry) и инфракрасной спектроскопией с Фурье-преобразованием (FTIR - Fourier-transform infrared spectroscopy) изучают термические характеристики, а термическую стабильность исследуют с помощью термогравического анализа (TGA - thermogravimetric analysis). Особенности кристаллической структуры и поверхностные свойства изучают с помощью рентгеноструктурного анализа (X-ray diffraction) и методами атомно-силовой микроскопии (AFM - atomic-force microscope) [40-42]. Однако единственным методом, который может связать структуру звеньев блок-сополимеров с их количественными характеристиками, является метод спектроскопии ядерного магнитного резонанса (ЯМР). Используя этот метод, можно не только определить количественное соотношение блоков, но и зарегистрировать взаимодействие этих блоков для подтверждения сополимеризации, выявить концевые и стыковые звенья, определить диффузионные характеристики и по

подвижности различить блок-сополимеры с другими компонентами смеси [4349]. Кроме того, метод спектроскопии ЯМР применяется и для выявления побочных реакций синтеза, влияющих на структуру и ключевые характеристики продукта [50-55].

1.8. Использование альгината натрия в медицинских целях

Полимерные гели также представляют интерес в области доставки лекарственных средств. Их можно считать крайним случаем полимеризации блоков, в котором вещество представляет собой единую среду для инкапсуляции лекарственных средств. Соответственно, область применения таких средств тоже немного отличается от блок-сополимеров - гели удобно использовать при лечении кожных заболеваний, для обработки раневых поверхностей, или же для создания временных имплантов [56-59].

Альгинат натрия относится к природным полисахаридам, получаемым из бурых водорослей или бактерий. Структура альгината представляет собой неразветвленный двойной сополимер, включающий остатки Р-О-маннуроновой (М) и а-Ь-глюкуроновой (О) кислот. Структура альгината изображена на рис. 5 [60].

4 ОН

1

Маннуроновая кислота (М) Глюкуроновая кислота (в)

Рис. 5. Структура маннуронового (М) и глюкуронового блоков альгината натрия

Благодаря биосовместимости и биоразлагаемости альгинат перспективен для использования в медицинских целях. Один из вариантов его использования - создание геля с включением терапевтических доз лекарственных средств (антибактериальных, противовоспалительных и т.д.), которые будут постепенно высвобождаться в ткани по мере деградации геля. Образование геля возможно с помощью сшивания альгината ионами двухвалентных металлов (Ca2+, Ba2+, Sr2+ и т.п.), которые образуют связи между GG-блоками разных участков альгината. Плотность геля и степень сшивания можно регулировать, используя разные ионы металлов, которые с различной эффективностью связываются с глюкуроновой кислотой, а также варьируя концентрацию этих металлов [61-70].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Иванова Валерия Антоновна, 2024 год

Список использованных источников

1. О Стратегии научно-технологического развития Российской Федерации: указ Президента Российской Федерации от 1 декабря 2016 №642// ГАРАНТ: информационно-правовая система. URL: https://base.garant.ru/71551998/?ysclid=limvzcuff382034050 (дата обращения 08.06.2023).

2. Об утверждении Концепции предикативной, превентивной и персонализированной медицины: приказ Министерства здравоохранения РФ от 24 апреля 2018 г. № 186// ГАРАНТ: информационно-правовая система. URL:

https://www. garant.ru/products/ipo/prime/doc/71847662/?ysclid=limw5xbjyx1066 63492 (дата обращения 08.06.2023).

3. Shah A. et al. Nanocarriers for targeted drug delivery// Journal of Drug Delivery Science and Technology. 2021. Vol. 62. № 102426.

4. Yong K., Mooney D.J. Progress in Polymer Science Alginate: Properties and Biomedical Applications// Progress in Polymer Science. 2012. Vol. 37. P. 106-126.

5. Torchilin V.P. Micellar Nanocarriers: Pharmaceutical Perspectives// Pharmaceutical Research. 2006. Vol. 24. № 1 . P. 1-16.

6. Avramovic N. et al. Polymeric Nanocarriers of Drug Delivery Systems in Cancer Therapy// Pharmaceutics. 2020. Vol. 12. № 298. P. 1-17.

7. Carbal H., Miyata K., Osada K., Kataoka K. Block Copolymer Micelles in Nanomedicine Application// Chemical Reviews. 2018. Vol. 118. № 14. P. 68446892.

8. Kaditi E., Mountrichas G., Pispas S., Demetzos C. Block Copolymers for Drug Delivery Nano Systems (DDnSs)// Current Medical Chemistry. 2012. Vol. 19. № 29. P. 5088-5100.

9. Paredes Juarez G.A. et al. Immunological and Technical Considerations in Applications of Alginate-Based Microencapsulation Systems// Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 2014. Vol. 2. P. 26.

10. Gaucher G. et al. Block copolymer micelles: preparation, characterization and application in drug delivery// Journal of Control Release. 2005. Vol. 109. P. 169188.

11. Abetz V. Block Copolymers I. Springer Berlin, Heidelberg. 2005. 238 p.

12. Chia A.A. et al. Application and Limitation of Dendrimers in Biomedicine// Molecules. 2020. Vol. 25. № 17. P. 3982.

13. Gardikis K. et al. Dendrimers and the development of new complex nanomaterials for biomedical applications// Current Medicinal Chemistry. 2012. Vol. 19. № 29. P. 4913-4928.

14. Frechet J.M.J. Functional Polymers and Dendrimers: Reactivity, Molecular Architecture, and Interfacila Energy// Science. 1994. Vol. 263. № 5154. P. 17101715.

15. Jena K.K. et al. Hyperbranched Polyesteres: Synthesis, Characterization, and Molecular Simulations// Journal of Physical Chemistry. 2007. Vol. 111. P. 88018811.

16. Hawker C.J., Lee R., Frechet J.M.J. One-Step Synthesis of Hyperbranched Dendritic Polyesters// Journal of American Chemical Society. 1991. Vol. 113. P. 4583-4588.

17. Holter D., Burgath A., Frey H. Degree of branching in hyperbranched polymers// Acta Polymerica. 1997. Vol. 48. № 1-2. P. 30-35.

18. Bates C.M., Bates F.S. 50th Anniversary Perspective: Block Copolymers -Pure Potentional// Materials. 2017. Vol. 50. P. 3-22.

19. Xue Y. et al. Synthesis, self-assembly and drug solubilization of hyperbranched block polyethers// Journal of Molecular Liquids. 2018. Vol. 249. P. 16-23.

20. Xue Y. et al. Effect of block sequence of hyperbranched block copolymers on the aggregation behavior, drug solubilization and release property// Journal of Molecular Liquids. 2019. Vol. 278. P. 320-328.

21. Claesson H. et al. Synthesis and characterization of star branched polyesters with dendritic cores and the effect of structural variations on zero shear rate viscosity// Polymer. 2002. Vol. 43. P. 3511-3518.

22. Du F. et al. Development of biodegradable hyperbranched core-multishell nanocarriers for efficient topical drug delivery// Journal of Controlled Release. 2016. Vol. 242. P. 42-49.

23. Malmstrom E., Johansson M., Hult A. Hyperbranched Aliphatic Polyesters// Macromolecules. 1995. Vol. 28. P. 1698-1703.

24. Wolf F.K., Fischer A.M., Frey H. Poly(glycolide) multi-arm star polymers: Improved solubility via limited arm length// Beilstein Journal of Organic Chemistry. 2010. Vol. 6. № 67. P. 1-9.

25. Dau H. et al. Linear Block Copolymer Synthesis// Chemical Reviews. 2022. Vol. 122. № 18. P. 14471-14553.

26. Ханнанов А.А. и др. Инкапсулирование противоопухолевого препарата доксорубицина гиперразветвленными полиэфирполикарбоновыми кислотами// Вестник Казанского технологического университета. 2013. С. 229233.

27. Prabaharan M. et al. Folate-conjugated amphiphilic hyperbranched block copolymers based on BOLTORN H40, poly(L-lactide) and poly(ethylene glycol) for tumor-targeted drug delivery// Biomaterials. 2009. Vol. 30. P. 3009-3019.

28. Abandansari H.S. et al. pH-sensitive nanogels based on BOLTORN H40 and poly(vinylpyridine) using mini-emulsion polymerization for delivery of hydrophobic anticancer drugs// Polymer. 2014. Vol. 55. P. 3579-3590.

29. Kim T.-Y. et al. Phase I and Pharmacokinetic Study of Genexol-PM, a Cremophot-Free, Polymeric Micelle-Formulated Paclitaxel, in Patients with Advanced Malignancies// Clinical Cancer Research. 2004. Vol. 10. P. 3708-3716.

30. Ramasway M. et al. Human Plasma Distribution of Free Paclitaxel and Paclitaxel Associated with Diblock Copolymers// Journal of Pharmaceutical Sciences. 1997. Vol. 86. № 4. P. 460-464.

31. Uchino H. et al. Cisplatin-incorporating polymeric micelles (NC-6004) can reduce nephrotoxicity and neurotoxicity of cisplatin in rats// British Journal of Cancer. 2005. Vol. 93. P. 678-687.

32. Coma-Cros E.M. et al. Micelle carriers based on dendritic macromolecules containing bis-MPA and glycine for antimalarial drug delivery// Biomaterials Science. 2019. P. 1-14.

33. Кутырева М.П. и др. Биохимическая активность гиперразветвленного полиола BOLTORN H20 и поликарбоксиBOLTORN H20 по отношению к индуцируемой секреторной аспарагиновой протеиназе Candida Albicans// Биомедецинская химия. 2010. Том 56. № 5. С. 552-561.

34. Khaitov M. et al. Trearment of COVID-19 patients with a SARS-CoV-2-specific siRNA-peptide dendrimer formulation// Allergy. 2023. Vol. 78. № 6. P. 1639-1653.

35. Schnitzler T., Herrmann A. DNA Block Copolymers: Functional Materials for Nanoscience and Biomedicine// Accounts of Chemical Research. 2012. Vol. 45. № 9. P. 1419-1430.

36. Weidner S.M., Kricheldorf H.R. SnOct2-catalyzed ROPs of L-lactide initiated by acidic OH-compounds: Switching from ROP to poycondensation and cyclisation// Journal of Polymer Science. 2021. Vol. 1. P. 1-9.

37. Baimark Y., Srisuwan Y. Thermal and mechanical properties of highly flexible poly(L-lactide)-b-poly(ethylene glycol)-b-poly(L-lactide) bioplastics: Effects of poly(ethylene glycol) block length and chain extender// Journal of Elastomers and Plastics. 2019. P. 1-17.

38. Chick L., Tessier M., Fradet A. NMR and MALDI-TOF MS study of side reactions in hyperbranched polyesters based on 2,2-bis(hydroxymethyl)propanoic acid// Polymer. 2007. Vol. 48. P. 1884-1892.

39. Chikh L., Tessier M., Fradet A. Poludispersity of Hyperbranched Polyesters Based on 2,2-bis(hydroxymethyl)propanoic acid: SEC/MALDI-TOF MS and 13C NMR/Kinetic-Recursive Probability Analysis// Macromolecules. 2008. Vol. 41. P. 9044-9050.

40. Zagar E., Zigon M. Aliphatic hyperbranched polyesters based on 2,2-bis(methylol)propionic acid - Determination of structure, solution and bulk properties// Progress in Polymer Science. 2011. Vol. 36. P. 53-88.

41. Zagar E., Zigon M., Podzimek S. Caracterization of commercial aliphatic hyperbranched polyesters// 2006. Vol. 47. P. 166-175.

42. Zagar E., Zigon M. Characterization of a Commercial Hyperbranched Aliphatic Polyester Based on 2,2-bis(methylol)propionic Acid// Macromolecules. 2002. Vol. 35. P. 9913-9925.

43. Сивов Н.А., Меняшев М.Р., Герасин В.А. Методики расчета состава сополимеров по данным ЯМР спектроскопии и элементного анализа//Евразийское научное объединение. 2017. P. 1-9.

44. Markelov D. A., Furstenberg F., Dolgushev M. NMR relaxation in semiflexible Vicsek fractals// Polymer. 2018. Vol. 144. P. 65-71.

45. Sacarescu L. et al. Highly Crosslinked Polysilane-Schiff Base// Polymer Bulletin. 2005. Vol. 54. P. 29-37.

46. Andreis M., Koenig J.L. Application of NMR to Crosslinked Polymer Systems// Polymer Characterization/ Polymer Solutions. 2005. Vol. 89. P. 69-160.

47. Hatada K. et al. NMR Measurement of Identical Polimer Samples by Round Robin Method V. Determination of Degree of Polymerization for Isotactic Poly(methyl methacrylate) Having a t-Butil End Group// Polymer Journal. 2003. Vol. 35. № 4. P. 393-398.

48. Fielding L. Determination of Association Constants (Ka) from Solution NMR Data// Tetrahedron. 2000. Vol. 56. P. 6151-6170.

49. Walderhaug H. and Soderman O. NMR studies of block copolymer micelles// Current Opinion in Colloid & Interface Science. 2009. Vol. 14. P. 171-177.

50. Kricheldorf H.R., Weidner S.M., Scheliga F. Cyclic Poly(Lactide)s via the ROPPOC Method Catalyzed by Alkyl- or Aryltin Chlorides// Journal of Polymer Science, Part A. 2019. P. 1-9.

51. Chikh L. et al. Cyclization in Hyperbranched Aliphatic Polyesters and Polyamides// Macromol. Symp. 2003. Vol. 199. P. 209-221.

52. Olejniczak J., Chan M., Almutairi A. Light-Triggered Intramolecular Cyclization in Poly(lactic-co-glycolic acid)-Based Polymers for Controlled Degradation// Macromolecules. 2015. Vol. 48. № 10. P. 3166-3172.

53. Dusek K. et al. Role of cyclization in the degree-of-polymerization distribution of hyperbranched polymers// Polymer Bulletin. 1999. Vol. 42. P. 489496.

54. Ahmadi M. et al. Connectivity Defects and Collective Assemblies in Model Metallo-Supramolecular Dual-Network Hydrogels// Macromolecular Chemistry and Physics. 2020. Vol. 221. P. 1-14.

55. Husik M. et al. The synthesis and characterization of phenolic resin with a high content of dimethylene ether bridges// International Journal of Polymer Analysis and Characterisation. 2021. Vol. 26. № 7. P. 651-659.

56. Zhang M., Zhao X. Alginate Hydrogel Dressings for Advanced Wound Management// International Journal of Biological Macromolecules. 2020. Vol. 162.

P. 1414-1428.

57. Brochhausen C. et al. Current Strategies and Future Perspectives for Intraperitoneal Adhesion Prevention// Journal of Gastrointestinal Surgery. 2012. Vol. 16. P. 1256-1274.

58. Schaumann K., Weide G. Enzymatic Degradation of Alginate by Marine Fungi// Hydrobiologia. 1990. Vol. 204. P. 589-596.

59. Roquero D.M., Katz E. "Smart" Alginate Hydrogels in Biosensing, Bioactuation and Biocomputing: State-of-the-Art and Perspectives// Sensors and Actuators Reports. 2022. Vol. 4. P. 100095.

60. Lopes M. et al. Preparation Methods and Applications behind Alginate-Based Particles// Expert Opinion on Drug Delivery. 2017. Vol. 14. P. 769-782.

61. Hecht H., Srebnik S. Structural Characterization of Sodium Alginate and Calcium Alginate// Biomacromolecules. 2016. Vol. 17. P. 2160-2167.

62. Bode S. et al. Self-healing metallopolymers based on cadmium bis(terpyridine) complex containing polymer networks// Polymer Chemistry. 2013. P. 1-8.

63. Wang R. et al. Kinetically stable metal ligand charge transfer complexes as crosslinks in nanogels/hydrogels: Physical properties and cytotoxicity// Acta Biomaterialia. 2015. Vol. 26. P. 136-144.

64. Chaturvedi A.A. et al. Prevention on Postsurgical Adhesions Using an Ultrapure Alginate-Based Gel// British Journal of Surgery. 2016. Vol. 100. P. 904910.

65. Hernandez-Gonzalez A.C., Tellez-Jurado L., Rodrigez-Lorenzo L.M. Alginate Hydrogels for Bone Tissue Engineering from Injectables to Bioprinting: A review// Carbohydrate polymers. 2020. Vol. 229. P. 115514.

66. Zhang X. et al. Strontium Ion Substituted Alginate-Based Hydrogel Fibers and Its Coordination Blinding Model// Journal of Applied Polymer Science. 2020. Vol. 137. P. 48571.

67. Kuo C.K., Ma P.X. Maintaining Dimensions and Mechanical Properties of Ionically Crosslinked Alginate Hydrogel Scaffolds in Vitro// Journal of Biomedical Materials Research. 2008. Vol. 84. P. 899-907.

68. Kaygusuz H. et al. Surfactant and Metal Ion Effect on the Mechanical Properties of Alginate Hydrogels// International Journal of Biological Macromolecules. 2016. Vol. 92. P. 220-224.

69. Morch Y.A. et al. Effect of Ca2+, Ba2+ and Sr2+ on Alginate Microbeads// Biomacromolecules. 2006. Vol. 7. P. 1471-1480.

70. Emmerichs N. et al. Interaction between Alginates and Manganese Cations: Identification of Preffered Cation Binding Sites// International Journal of Biological Macromolecules. 2004. Vol. 34. P. 73-79.

71. Manz B. et al. Cross-Linking Properties of Alginate Gels Determined by Using Advanced NMR Imaging and Cu2+ as Contrast Agent// European Biophysics Journal. 2004. Vol. 33. P. 50-58.

72. Lattner D., Flemming H.C., Mayer C. 13C-NMR Study of the Interactions of Bacterial Alginate with Bivalent Cations// International Journal of Biological Macromolecules. 2003. Vol. 33. P. 81-88.

73. Deramos C.M. et al. NMR and Molecular Modeling Studies of Alginic Acid Binding with Alkaline Earth and Lanthanide Metal Ions// Inorganica Chimia Acta. 1997. Vol. 256. P. 69-75.

74. Llanes F. et al. Examination of Sodium Alginate from Sargassum by NMR Spectroscopy// Canadian Journal of Chemistry. 1997. Vol. 13. P. 104-116.

75. Holzgrabe U., Wawer I., Diehl B. NMR Spectroscopy in Drug Development and Analysis. Wiley-VCH. Weinheim, 1999.

76. Хауссер К.Х., Кальбитцер Х.Р. ЯМР в медицине и биологии: структура молекул, томография, спектроскопия in-vivo. Издательство Наукова думка. Киев, 1993.

77. Абрагам А. Ядерный магнитный резонанс. Издательство иностранной литературы. Москва, 1963.

78. Эмсли Дж., Финей Дж., Сатклиф Л. Спектроскопия ядерного магнитного резонанса высокого разрешения. Издательство Мир. Москва, 1968.

79. Керрингтон А., Мак-Лечлан Э. Магнитный резонанс и его применение в химии. Издательство Мир. Москва, 1970.

80. Breitmair E. Structure Elucidation by NMR in Organic Chemistry. A Practical Guide. John Wiley & Sons. 2002.

81. Дероум Э. Современные методы ЯМР для химических исследований. Издательство Мир. Москва, 1992.

82. Эрнст Р., Боденхаузен Дж., Вокаун А. ЯМР в одном и двух измерениях. Издательство Мир. Москва, 1990.

83. Breger S., Braun S. 200 and More NMR Experiments: A Practical Course. Wiley-VCH. Weinheim, 2004.

84. Stilbs P. Diffusion and Electrophoretic NMR. Walter de Gruyter GmbH. Berlin/Boston, 2019.

85. Zhang X., Dai Y., Dai G. Advances in amphiphilic hyperbranched copolymers with an aliphatic hyperbranched 2,2-bis(methylol)propionic acid-based polyester core// Polymer Chemistry. 2020. Vol. 5. P. 1-10.

86. Махиянов Н., Сафин Д.Х. Строение и молекулярные характеристики полиэфирных блок-сополимеров на основе оксидов пропилена и этилена по данным спектроскопии ЯМР// Высокомолекулярные соединения, серия Б. 2006. Том 48. № 2. С. 359-369.

87. Каратаева Ф.Х. и др. Изучение методом спектроскопии ЯМР (1D и 2D) структуры и характера ассоциаций гиперразветвлённого полиэфира полиола BOLTORN H20-OH// Ученые записки Казанского государственного университета. 2009. Том 151. № 1. С. 37-45.

88. Каратаева Ф.Х. и др. Изучение методом спектроскопии ЯМР (1D и 2D) структуры и характера ассоциаций гиперразветвлённого полиэфира полиола BOLTORN H20-COOH и комплекса Co12[BH20(COOH)] на его основе// Ученые записки Казанского государственного университета. 2009. Том 151. №2 4. С. 58-66.

89. Donovan A.R., Moad G. A novel method for determination of polyester end-group by NMR spectroscopy// Polymer. 2005. Vol. 46. P. 5005-5011.

90. Kim J., Jung H.Y., Park M.J. End-Group Chemistry and Junction Chemistry in Polymer Science: Past, Present and Future// Macromolecules. 2020. Vol. 53. № 3. P. 746-763.

91. Haddad T.S. et al. NMR Analysis of Hydroxyl-Terminated Polybutandiene End Groups and Reactivity Differences with Monoisocyanates// Journal of Polymer Science. 2018. P. 1-7.

92. Smeets A. et al. End Group-Functionalization and Synthesis of Block-Copolythiophenes by Modified Nickel Initiators// Macromolecules. 2011. Vol. 44. P. 6017-6025.

93. Tanaka K. et al. Structural Analysis of the End Groups and Substructures of Commercial Poly(ethylene terephthalate) by Multiple-WET 1H/13C NMR// Macromolecules. 2016. Vol. 49. № 15. P. 5750-5754.

94. Twum E.B. et al. Characterization of end groups and branching structures in copolymers of vinylidiene fluoride with hexafluoropropylene using

multidimensional NMR spectroscopy// European Polymer Journal. 2014. Vol. 51. P. 136-150.

95. Chernysh Yu.E. et al. The use of selective methods of heteronuclear NMR spectroscopy in studies of multicomponent systems// Russian Chemical Reviews. 2005. Vol. 74. № 4. P. 317-337.

96. Caytan E. et al. Evaluation of Band-Selective HSQC and HMBC: Methodological Validation on the Cyclosporin Cyclic Peptide and Application for Poly(3-hydroxyalkanoate)s Stereoregularity Determination// Polymers. 2018. Vol. 10. № 553. P. 1-14.

97. Karataeva F. Kh., Rezepova M.V., Baltaev A.A. One- and Two-Dimensional NMR Study on Structural Features of Polyesters Derived from BOLTORN H20-OH Polyol and Maleic Acid// Russian Journal of General Chemistry. 2012. Vol. 82. № 12. P. 1982-1986.

98. Каратаева Ф.Х., Резепова М.В., Юльметов А.Р. Структура карбоксилированного производного BOLTORN H20-OH с малеиновым ангидридом// Ученые записки Казанского университета. 2011. Том 153. № 3. С. 85-90.

99. Каратаева Ф.Х., Резепова М.В., Юльметов А.Р. Двумерные эксперименты ЯМР для определения особенностей строения гиперразветвленных полимеров// Ученые записки Казанского университета. 2012. Том 154. № 1. С. 112-118.

100. Karataeva F.Kh. et al. Data of One- and Two-Dimensional NMR Spectroscopy in the Study of Structure and Nature of Associations of Hyperbranched Polyester Polyol BOLTORN H20-OH// Russian Journal of General Chemistry. 2010. Vol. 80. № 12. P. 2478-2486.

101. Karataeva F.Kh. et al. Strucutre of Hyper-Branched Polyester Polyol BOLTORN H20-COOH. NMR Data// Russian Journal of General Chemistry. 2010. Vol. 80. № 9. P. 1831-1835.

102. Kutyreva M.P. et al. Polydentate Nanoplatform Based on Hyperbranched Polyol BOLTORN// Russian Journal of General Chemistry. 2009. Vol. 79. № 3. P. 511-512.

103. Bakkour Y. et al. Diffusion ordered spectroscopy (DOSY) as a powerful tool for amphiphilic block copolymer characterization and for critical micelle concentration (CMC) determination// Polymer Chemistry. 2006. Vol. 3. P. 20062010.

104. Hiller W. Quantitative Studies of Block Copolymers and Their Containing Homopolymer Components by Diffusion Ordered Spectroscopy// Macromolecular Chemistry and Physics. 2019. № 1900255. P. 1-13.

105. Stejskal E.O. and Tanner J.E. Spin Diffusion Measurements: Spin Echoes in the Presence of a Time Dependent Field Gradient// Journal of Chemical Physics. 1965. Vol. 42. № 1. P. 288-292.

106. Lin E. et al. High-Resolution Reconstruction for Diffusion-Ordered NMR Spetroscopy// Analytical Chemistry. 2019. P. 1-7.

107. Day I.J. On the inversion of diffusion NMR data: Tikhonov regularization and optimal choice of the regularization parameter// Journal of Magnetic Resonance. 2011. Vol. 211. P. 178-185.

108. Guo J., Xie R., Liu M. A Robust Algorithm for 2D NMR Diffusion-Related Spectra Inversion// IEEE Geoscience and Remote Sensing Letters. 2018. Vol. 15. № 10. P. 1545-1549.

109. Arrabal-Campos F.M. et al. Algebraic Reconstruction Technique for Diffusion NMR Experiments. Application to the Molecular Weight Prediction of Polymers// Journal of Physical Chemistry. 2019. Vol. 123. P. 943-950.

110. Cherni A., Chouzenoux E., Delsuc M.-A. PALMA, an improved algorithm for DOSY signal processing// Analyst. 2017. Vol. 142. P. 772-779.

111. Fricke S.N. et al. Data processing in NMR relaxometry using the matrix pencil// Journal of magnetic Resonance. 2020. Vol. 313. №106704. P. 1-8.

112. Lamanna R. On the Inversion of Multicomponent NMR Relaxation and Diffusion Decays in Heterogeneous Systems// Concepts in Magnetic Resonance. 2005. Vol. 26A. № 2. P. 78-90.

113. Reci A., Sederman A.J., Gladden L.F. Retaining both discrete and smooth features in 1D and 2D NMR relaxation and diffusion experiments//Journal of Magnetic Resonance. 2017. Vol. 284. P. 39-47.

114. Teal P.D., Novotny E.H. Improved data efficiency for NMR diffusionrelaxation processing// Journal of Magnetic Resonance. 2022. Vol. 335. № 107124. P. 1-7.

115. Urbanczyk M. et al. Monitoring polydispersity by NMR diffusometry with tailored norm regularization and moving-frame processing// Analyst. 2016. Vol. 141. P. 1745-1752.

116. Xu K., Zang S. Trust-Region Algorithm for the Inversion of Molecular Diffusion NMR Data// Analytical Chemistry. 2014. Vol. 86. P. 592-599.

117. Перепухов А.М., Шестаков С.Л. Алгоритм обратного преобразования Лапласа для обработки сложных релаксационных зависимостей// Труды МФТИ. 2010. Том 2. № 2. С. 35-40.

118. Yuan B. et al. Reconstructing Diffusion Ordered NMR Spectroscopy by Simultaneous Inversion of Laplace Transform// Journal of Magnetic Resonance. 2017. Vol. 278. P. 1-7.

119. Ahola S. et al. Ultrafast multidimensional Laplace NMR for a rapid and sensitive chemical analysis// Nature Communications. 2015. Vol. 18. № 6. P. 83638370.

120. Zhivonitko V.V., Ullah M.S., Telkki V.-V. Nonlinear sampling in ultrafast Laplace NMR// Journal of Magnetic Resonance. 2019. Vol. 307. № 106571. P. 1-5.

121. Pelta M.D. et al. A one-shot sequence for high-resolution diffusion-ordered spectroscopy// Magnetic Resonance in Chemistry. 2002. Vol. 40. P. S147-S152.

122. Pelta M.D. et al. Pulse sequences for high-resolution diffusion-ordered spectroscopy (HR-DOSY)// Magnetic Resonance in Chemistry. 1998. Vol. 36. P. 706-714.

123. Wu D., Chen A., Johnson C.S. An Improved Diffusion-Ordered Spectroscopy Experiment Incorporating Bipolar-Gradient Pulses// Journal of Magnetic Resonance. 1995. Vol. 115. P. 260-264.

124. Mishra R., Dumez J.-N. Quadratic spacing of the effective gradient area for spatially encoded diffusion NMR//Journal of Magnetic Resonance. 2022. Vol. 334. № 107114. P. 1-9.