Механизмы гибели клеток при действии новых производных нафтоиндолдионов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.00.14, кандидат биологических наук Глазунова, Валерия Александровна

• Глазунова, Валерия Александровна
• кандидат биологических наук
• 2009

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Глазунова, Валерия Александровна

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ:.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Механизмы гибели клеток при действии новых производных нафтоиндолдионов»

Актуальность проблемы.

Антрациклины и близкие по структуре соединения - ведущий класс современных противоопухолевых препаратов. Антрацпклиновые антибиотики даунорубицин и доксорубицин широко применяются в современной химиотерапии опухолевых заболеваний человека. Однако антрациклины имеют ряд недостатков, основным из которых является кардиотоксичность. Кроме того, антрациклиновые антибиотики обладают высокой кумулятивной токсичностью, мутагенностью, канцерогенностью, миело- и иммунодепрессивным действием [71, 89]. Так, оригинальный антибиотик антрациклиновой группы - карминомицин, структурно схожий с доксорубицином, открыт в НИИ по изысканию новых антибиотиков АМН СССР и внедрен в практику отечественного здравоохранения. Карминомицин проявил высокую эффективность как препарат для лечения сарком мягких тканей и лейкозов. Его отличает от других производных антрациклинов меньшая кардиотоксичность, способность тормозить рост опухолей, устойчивых к доксорубицину и возможность перорального применения благодаря всасыванию в желудочно-кишечном тракте. Указанный пример подтверждает, что химическая модификация антрациклиновых антибиотиков, направленная на поиск препаратов с улучшенными химиотерапевтическими свойствами, главным образом, активных для опухолевых клеток с множественной лекарственной устойчивостью, является актуальной задачей онкологии [34, 89, 99].

Антрациклиновые препараты обладают множественным действием. Антрахиноны и их синтетические аналоги (аминоэтиламинантрахиноны) обладают способностью интеркалировать с ДНК, таким образом вмешиваясь в репликацию и транскрипцию. [9496]. Антрациклины также способны ингибировать топоизомеразу II. Присутствие индольного компонента в молекуле может снизить образование семихинонов и свободных радикалов, определяющих кумулятивную кардиотоксичность антрациклинов.

Антрациклиновые антибиотики, особенно доксорубицин, широко используются в клинике, однако их использование ограничено кардиотоксичностью и образованием множественной лекарственной устойчивости опухолей. С целью преодоление МЛУ были синтезированы антрациклиновые препараты нового поколения - производные нафто-[2,3-У]индол-5,10-диона, обладающие повышенной активностью против клеток с МЛУ. Они не являются субстратом для Pgp-опосредованного транспорта и, в то же время, способны запускать р53-независимые механизмы клеточной гибели и взаимодействовать с ДНК-зависимыми ферментами, топоизомеразами и теломеразой[95, 96].

Целью разработки синтетических аналогов антрациклинов является получение препаратов со сниженной органной токсичностью и сохранением цитотоксичности, сравнимой с цитотоксичностью митоксантрона и аминантрона — представителей много обещающего класса противоопухолевых препаратов, производных антрацен-5,10-дионов. Аминантрон не является источником свободных радикалов и даже обладает некторой антиоксидантной активностью. Отдельные гетероциклические аналоги аминоалкиламиноантрахинонов, такие как аналог аминантрона пиксантрон, пиразолантроны и пиразолакрадины, показывают высокую противоопухолевую активность при практически нулевой кардиотоксичности [94].

МЛУ часто является причиной неудач в терапии антрациклинами, но это явление прямо связано с химической структурой антрациклинов [34, 96, 99]. Во-первых, эти соединения могут выводиться из клетки молекулярными транспортерами (например, Pgp). Во-вторых, антрациклиновые кольца интеркалируют с ДНК, запуская клеточный ответ на повреждение ДНК, в котором р53 является основным регулятором. Гиперэкспрессия Pgp и утрата белком р53 проапоптотических функций — основные причины устойчивости опухолевых клеток к антрациклинам. Таким образом, оптимизация химической структуры препаратов предполагает, что синтетические аналоги антрациклинов нового поколения должны быть о неподходящим субстратом для выведения при помощи Pgp, и в то же время должны запускать р53-независимые пути апоптоза. Последнее можно воплотить за счет способности антрациклинов взаимодействовать с ДНК-зависимыми ферментами, такими, как топоизомеразы и теломераза [95, 96].

Некоторые производные нафто[2,3-/]индол-5,10-дионов показали заметную цитотоксичность в отношении культур клеток рака человека и большую, чем у доксорубицина и митоксантрона, способность убивать опухолевые клетки с МЛУ. Вероятно, дополнительный гетероциклический компонент может существенно увеличить связывание аналогов аминантрона с их внутриклеточными мишенями, а кольцо А доксорубицина важно для формирования третичной структиры, включающей препарат, дуплекс ДНК и топоизомеразу И.

Множественная лекарственная устойчивость злокачественных новообразований — сохранение клетками жизнеспособности в ответ на воздействие различных лекарственных веществ [34, 89, 94]. Одной из важнейших причин МЛУ является пониженное накопление токсинов в клетке, обусловленное их активным выведением в межклеточную среду. Такой транспорт осуществляется интегральным белком плазматической мембраны^ Р-гликопротеином (Pgp, масса 140-170 кДа) за счет энергии гидролиза АТФ. У человека Pgp кодируется геном MDRX (multidrug resistance 1), локализованным в хромосоме 7. Pgp -трансмембранный белок с молекулярной массой -170 кДа, состоящий из двух одинаковых частей, каждая из которых включает шесть гидрофобных трансмембранных участков. Молекула Pgp имеет два сайта связывания с АТР, что свидетельствует об энергозависимости функционирования белка. Р-гликопротеин - это очень консервативный белок. Он имеет гомологию с многочисленными бактериальными и эукариотическими транспортными белками. Показано, что семейство генов pgp принадлежит к суперсемейству генов, которые кодируют АТФ-связывающие мембранные транспортные системы в филогенетически далеких видах.

Трансмембранный Р-гликопротенд (кодируется геном АВСВХ ), транспортирующий лекарственные препараты из клетки, обеспечивает активное выведение цнтостатиков , в частности антрациклинов , что способствует при его экспрессии возникновению полирезистентности к противоопухолевым средствам . Р-гликопротеин - белок-переносчик с широкой специфичностью. Исследования in vitro показали, что спектр субстратов Pgp включает не только противоопухолевые препараты, но и препараты, используемые для реверсии МЛУ, флуоресцентные красители, стероидные гормоны. Увеличение количества иРНК MDRX и Pgp служит фактором устойчивости многих типов опухолей к лечению и, следовательно, связано с клинической агрессивностью заболевания. Причина клинической МЛУ — гиперэкспрессия MDRX и Pgp при неизменной копийности гена, что обусловлено возможностью индукции гена MDRX внеклеточными стимулами — эпигенетической активацией гена. Ген MDR1 может транскрибироваться с двух промоторов — дистального и проксимального. Функциональная роль дистального промотора невелика, подавляющее количество иРНК MDRX транскрибируется с проксимального промотора. В промоторе гена MDRX имеются несколько сайтов, опосредующих срочную активацию транскрипции в ответ на экзогенные стимулы. Следствием такой "вырожденности" является множественность участвующих в этом феномене транскрипционных факторов. Регуляция гена MDR\ осуществляется на многих уровнях; возможны "обходы" сигналов, если тот или иной механизм не функционирует. Такая взаимозаменяемость механизмов надежно обеспечивает развитие резистентности при действии лекарств.

Антрациклиновые антибиотики (адриамицин, даунорубицин), винкаалкалоиды (винкристин, винбластин), таксаны (таксол, таксотер), митоксантрон, ингибиторы топоизомераз (этопозид) — вот неполный перечень групп противоопухолевых препаратов, устойчивость к которым обусловлена Pgp-опосредованным транспортом [34, 89,94, 95].

Дисфункция р53, приводящая к инактивации или ограничению р53-зависимого апоптоза, может обусловить недостаточную выраженность цитотоксического сигналинга, запускаемого противоопухолевым препаратом, позволяя клетке пережить воздействие [70, 95, 127]. Требуется идентификация внутриклеточной мишени новых соединений и выяснение механизмов гибели - регулируемых р53 и независимых от этого фактора - в ответ на действие новых производных нафтоиндолдионов. Такими механизмами могут быть митохондриальный путь апоптоза: активация генов PUMA, Noxa, инактивация анти-апоптотических генов семейства Вс1-2. Эти механизмы могут быть сбалансированы активацией продуктов анти-апоптотических генов. Так, вероятно участие ядерного фактора каппа В (NFkB) - регулятора выживания клеток, активирующего, в частности, гены семейства IAP (inhibitor of apoptosis) в ответ на действие ряда противоопухолевых препаратов.

Таким образом, актуальность проблемы обусловлена необходимостью углубления знаний о молекулярных механизмах цитотоксичности химических соединений для создания новых противоопухолевых препаратов, преодоления резистентности опухолевых клеток и повышения эффективности противоопухолевой терапии.

Научная новизна

• впервые исследованы новые оригинальные производные нафтоиндолдионов, вызывающие гибель опухолевых клеток, в том числе клеток с молекулярными детерминантами лекарственной устойчивости - Р-гликопротеином и нефункционирующим р53;

• впервые идентифицирована внутриклеточная мишень наиболее активного нового соединения - 3-аминометил-производного 4,11 -дигидроксинафто[2,3-/]шгдол-5,10-диона, отобранного по данным скрининга химической мини-библиотеки;

• впервые установлены отдельные механизмы передачи внутриклеточных сигналов, регулирующих выживание и гибель клеток при действии 3-аминометил-производного 4,11 - диг и д роксинафто [2.3:/] индол-5,10-диона;

• исследована роль р53 и отдельных механизмов митохондриального пути гибели в цитотоксичности избранного соединения.

Научно-практическая значимость исследования

Изучение механизмов цитотоксического действия новых производных нафтоиндолдионов с оптимизированными свойствами позволит обосновать использование этого класса противоопухолевых препаратов для лечения онкологических заболеваний.

Цель исследования - установить механизмы гибели опухолевых клеток человека при действии новых производных нафтоиндолдионов.

Задачи:

1) из химической библиотеки новых производных нафтоиндолдионов отобрать соединения, токсичные для клеток с экспрессией Р-гликопротеина и нефункционирующим р53, и определить диапазон концентраций, в которых деления р53 приводит к выживанию клеток;

2) исследовать взаимодействие наиболее активного соединения с возможной внутриклеточной мишенью — ДНК: тип связывания, константа равновесия комплексообразованиия;

3) изучить основные механизмы гибели клеток при действии отобранного нового производного нафтоиндолдионов.

Заключение диссертации по теме «Онкология», Глазунова, Валерия Александровна

Глава 5. ВЫВОДЫ

1. Среди производных нафтоиндолдионов выявлены соединения, вызывающие гибель культивируемых опухолевых клеток человека, в том числе клеток с молекулярными детерминантами лекарственной устойчивости - экспрессией Р-гликопротеина и нефункционирующим р53.

2. Одной из внутриклеточных мишеней, важных для цитотоксичности 3-аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-/)индол-5,10-диона, является двухцепочечная ДНК, с которой соединение образует высокоаффинные интеркаляционные комплексы. Константа равновесия комплексообразования и количество мест связывания определяются соотношением концентраций соединения и ДНК.

3. З-Аминометил-производное 4,11 -дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона в микромолярных концентрациях вызывает апоптоз клеток с диким типом р53. Делеция р53 обусловливает долговременное выживание клеток после воздействия субтоксических концентраций соединения; при более высоких концентрациях гибель клеток осуществляется независимо от статуса р53.

4. Молекулярный механизм ограничения апоптоза в клетках с делецией р53 связан с увеличением экспрессии гена SLUG.

5. Антиоксидант N-ацетилцистеин потенцирует гибель клеток при действии 3-аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона независимо от статуса р53.

Автор выражает благодарность доктору химических наук А.Е.Щекотихину и профессору М.Н.Преображенской за предоставление новых производных нафтоиндолдионов.

Глава 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Антибиотики антрациклинового ряда, в частности, доксорубицин и сходные по структуре карминомицин, рубомицин, идарубицин и др., широко используются в онкологической клинике как эффективные препараты при лечении солидных и мезенхимальных опухолей. Вместе с тем, их клиническое применение ограничено органной токсичностью и развитием лекарственной устойчивости опухолевых клеток. Второе обстоятельство еще более важно, чем общерезорбтивная токсичность: существующие меры борьбы с органной токсичностью так или иначе позволяют уменьшить это неблагоприятное, однако, вероятно, неизбежное побочное действие противоопухолевых препаратов. Лекарственная же устойчивость нередко становится множественной, т.е. клетки опухоли выживают при действии нескольких лекарств. Среди фенотипов множественной лекарственной устойчивости экспрессия трансмембранного АТФ-зависимого транспортера Р-гликопротеина и родственных белков признана одним из ведущих. Действительно, указанные белки, выводя из клетки молекулы многих ксенобиотиков, уменьшают их внутриклеточную концентрацию, снижая возможность индукции клеточной гибели. Однако активация трансмембранного транспорта - не единственная возможность опухолевой клетки избежать гибели. Внутриклеточные механизмы ограничения гибели являются "следующим барьером". Среди таких механизмов - белок р53, участие которого в анти-апоптотическом сигналинге многообразно. Таким образом, создание и исследование механизмов действия новых лекарств, способных преодолевать указанный барьер, т.е. вызывать гибель опухолевых клеток, устойчивых к другим препаратам (и, шире, другим противоопухолевым воздействиям) является актуальной задачей на стыке медицинской химии природных соединений, клеточной и молекулярной онкологии.

Химические модификации антрациклиновых антибиотиков включают, в частности, изменения гетероциклических колец фармакофора и боковых цепей. В НИИ по изысканию новых антибиотиков им.Г.Ф.Гаузе РАМН проводится многолетняя работа по химической трансформации природных и полусинтетических производных доксорубицина, митоксантрона и других соединений. В настоящей работе нам была предоставлена серия новых уникальных производных нафто-[2,3-/]индол-5,10-диона, синтезированных А.Е.Щекотихиным в указанном институте под руководством М.Н.Преображенской. Эти соединения являются прототипами противоопухолевых препаратов нового поколения - более активных для клеток с механизмами лекарственной устойчивости.

На первом этапе исследования мы провели скрининг серий новых производных нафто-[2,3-/]индол-5,10-диона на способность вызывать гибель культивируемых опухолевых клеток человека. Для решения вопроса о способности новых соединений преодолевать Р-гликопротеин-зависимый активный транспорт, сравнивали цитотоксичность соединений для клеток линии лейкоза К562 (дикий тип) и изогенной сублинии K562i/S9 с экспрессией Р-гликопротеина, достигаемой после введения в клетки дикого типа ретровирусной конструкции, несущей полноразмерный ген этого белка. Такая модель позволяет вычленить роль одного механизма - Р-гликопротеина - в выживаемости клеток, что важно, поскольку ступенчатый отбор устойчивых к лекарствам потомков может сохранить и другие факторы выживания. Нам удалось выявить соединения, вызывающие гибель клеток дикого типа и инфектантов в субмикромолярных концентрациях.

После этого возникла необходимость идентификации внутриклеточной мишени новых соединений и выяснения механизмов гибели, регулируемых р53 и независимых от этого фактора, в ответ на действие новых производных нафтоиндолдионов для структурной оптимизации препаратов и отбора из модификационных рядов веществ, перспективных для клинического применения.

На модели клеток рака толстой кишки (линия НСТ116 с диким типом р53) и сублинии НСТ116р53КО с генетической инактивацией этого белка нами установлено, что р53-негативные клетки получают преимущество в выживании при инкубации с каждым соединением из анализируемого модификационного ряда. Возник закономерный вопрос, действительно ли отсутствие в клетках р53 позволяет им пережить воздействие препарата или просто обеспечивает отсроченную гибель обработанных клеток? В следующем эксперименте мы установили, что отсутствие р53 действительно дает клеткам возможность пережить однократное воздействие препарата и восстановить логарифмический рост культуры. Был сделан вывод, что р53 принадлежит существенная роль в регуляции баланса "выживание-гибель" при действии ЛХТА-1116 (аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона). Это соединение было выбрано для изучения из-за достаточно высокой цитотоксичности и явно выраженного окна эффекта р-53, что было важно для изучения механизмов влияния р53 на гибель клеток от препаратов данного модификационного ряда.

Чтобы убедиться, что различия в выживаемости клеток не связаны с разницей во внутриклеточном накоплении препарата, мы изучили накопление препарата в клетках НСТ116 и НСТ116р53КО при помощи проточной цитофлутриметрии. Как и ожидалось, различий в накоплении препарата клетками с разным статусом р53 не установлено.

Следующим этапом исследования стало выявление внутриклеточной мишени аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-/|индол-5,10-диона. По аналогии с антрациклинами, чей механизм действия уже изучен, мы предположили, что это соединение может взаимодействовать с ДНК.

Методом проточной цитофлуориметрии исследована деградация ДНК под воздействием аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-1]индол-5,10-диона. Оказалось, что в клетках НСТ-116 дикого типа аминометил-производное 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона вызывает деградацию ДНК, тогда как в сублинии НСТ116р53КО этот важный механизм клеточной гибели отсутствует. Таким образом, наличие р53 в клетке предотвращает деградацию ДНК при воздействии J1XTA-1116.

С помощью измерения флуоресценции и поглощения свечения соединения в комплексе с двухцепочечной ДНК установлено, что JIXTA-l 16 является интеркалятором, причем константа диссоциации и плотность посадки молекул этого препарата на двухцепочечную ДНК зависят от его концентрации.

Рассчитанные константы равновесия комплексообразования в микромолярном диапазоне указывают на то, что аминометил-производное 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона образует "сильные" (высокоаффинные) комплексы с двухцепочечной ДНК в условиях, близких к физиологическим. Одно интеркаляционное событие приходится на один завиток спирали макромолекулы. Эти расчеты важны для утверждения о том, что ДНК является мишенью (возможно, не единственной), с которой аминометил-производное 4,1 Ьдигидроксинафто^З-^индол-ЗЛО-диона может взаимодействовать внутри клетки. В дальнейшем изучении механизмов гибели клеток при действии аминометил-производное 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона мы исходили из повреждения структуры ДНК этим соединением как пускового события в индукции гибели клеток.

Важнейший элемент ответа клетки на повреждение ДНК - нарушение конформации дуплекса и/или самой структуры макромолекулы (изменения нуклеотидной последовательности) - активация р53-зависимых процессов. Для того чтобы выяснить, вызывает ли аминометил-производное 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона транскрипционную активацию р53, мы использовали модель трансактивации р53-зависимого промотора в клетках, обработанных исследуемым соединением. Было установлено, что воздействие аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона вызывает транскрипционную активацию р53, что подтвердило гипотезу об участии р53 в гибели или выживании клеток при обработке их аминометил-производным 4,11-дигидроксинафто[2,3-/|индол-5,10-диона.

Также методом изучения цитотоксичности аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона в комбинации с антиоксидантом показано, что антиоксидант М-ацетил-Ь-цистеин потенцирует гибель клеток. Этот эффект проявляется в клетках независимо от статуса р53. Эксперимент на сублинии НСТ-116ConALacZ подтвердил, что добавление N-ацетил-Ь-цистеина не влияет на транскрипционную активность р53. Было выдвинуто предположение, что смещение редокс-баланса снимает анти-апоптотическую активность NFkB и контролируемых этим фактором генов.

Обработка клеток ингибитором поли(АДФ-рибозо)полимеразы (PARP) ЕВ-47 и пан-каспазным ингибитором z-VAD-FMC не вызвала снижения цитотоксичности аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-Диндол-5,10-диона и также не влияла на потенцирующее действие 1Ч-ацетил-Ь-цистеина. Это может указывать на то, что цитотоксическое действие JIXTA-116 непосредственно не связано с активацией каспазозависимых каскадов.

Чтобы определить, является ли гибель клеток при действии аминометил-производного 4,11 -дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона действительно апоптотической, были использованы три метода. Анализ межнуклеосомной фрагментации ДНК оказался отрицательным, но при исследовании обработанных препаратом в течение суток клеток с помощью электронной микроскопии для концентрация 1,6 мкМ аминометил-производного 4,11 -дигидроксинафто[2,3-1]индол-5,10-диона обнаружены клетки с фрагментацией ядра, характерной для апоптоза. При воздействии 6,4 мкМ/мл клетки оказывались некротизированными. В обоих случаях на фотографии были видны вакуоли лизосомального типа, предположительно содержащие аминометил-производное 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона. Для исследования нарушения фаз клеточного цикла в ответ на действие аминометилпроизводного 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона проведен анализ распределения плоидности ДНК методом проточной цитофлуориметрии. Было установлено, что ареста клеточного цикла не происходит, тогда как в раннее время воздействия появляется sub-Gl пик, свидетельствующий о наличии апоптоза.

На основе этих данных был сделан вывод, что при малых концентрациях препарата гибель клеток идет по механизмам апоптоза, а при дальнейшем повышении концентрации препарата переходит в некроз либо завершается по некротическому типу.

Далее требовалось выяснить, на каком уровне происходит регуляция гибели и выживания обработанных препаратом клеток. В качестве основной рабочей гипотезы мы приняли возможность митохондриального пути клеточной гибели.

Наиболее интересными кандидатами на роль механизмов гибели могли быть PUMA и NOXA - гены проапоптотических белков семейства Bcl-2, для которых р53 является важнейшим активатором. Их индукцию в культурах клеток с различным статусом р53 мы проверяли методом ПЦР после обратной транскрипции, анализируя воздействие препарата в концентрации 1,6 мкМ/мл на клетки при разном времени воздействия.

Однако существенных отличий в экспрессионном профиле изогенных культур клеток с р53 дикого типа и нокаутным р53 на предшествующем этапе не было, и следующим объектом исследования стали гены SLUG и SNAIL, играющие важную роль в апоптотическом каскаде, запускаемом повреждением ДНК.

Изучение мРНК SLUG показало как практически полное ее отсутствие в клетках с р53 дикого типа, так и явную активацию SLUG в культуре с нокаутным р53 в ответ на воздействие аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона в период до 12 часов после внесения препарата, с некоторым падением уровня мРНК через 3 часа воздействия. В необработанной культуре, как и через 24 часа после внесения аминометил-производного 4,11-дигидроксинафто[2,3-/]индол-5,10-диона, экспрессия SLUG оказался слабой. Эти результаты позволили сделать вывод, что отсутствие SLUG является ключевым элементом выживания клеток с инактивацией р53. В дальнейшем планируется более точное количественное сравнение экспрессии SLUG при разном времени воздействия аминометил-производного 4,11 -дигидроксинафто[2,3^индол-5,10-диона.

Таким образом, проанализированы возможные механизмы действия препаратов, преодолевающих трансмембранный барьер, что важно для их дальнейшего практического применения в терапии опухолей. Экспериментально установлена зависимость эффективности действия препаратов от р53-статуса опухолевых клеток, причем предварительно выявлен возможный механизм, обуславливающий р53-зависимую устойчивость опухолевых клеток к химиотерапии. Уточнение и преодоление этого механизма может способствовать появлению и внедрению в практику новых, более эффективных противоопухолевых препаратов.

Индукция апоптоза в опухолевых клетках - одно из перспективных направлений поиска химиотерапевтических препаратов. Однако, р53-независимый апоптоз существенно замедлен по сравнению с р53-зависимой гибелью, а опухоли в делецией р53 встречаются весьма часто. По результатам нашего исследования, наиболее вероятным механизмом защиты клеток с нефункционирующим р53 от индуцируемого противоопухолевыми препаратами апоптоза является антиапоптотический ген SLUG, играющий важную роль как в нормальном онтогенезе, так и в опухолевой трансформации. В клетках с нормальным р53 SLUG, вероятно, экспрессия этого гена репрессирована посредством р53, блокируя действие SLUG на проапоптотические гены {PUMA, ВАХ), и функционирует путь митохондриального апоптоза, индуцированного повреждением ДНК. В клетках же с нефункционирующим р53 в ответ на повреждение ДНК, помимо р53-независимых апоптотических путей, активируется и SLUG, продукт которого способен блокировать митохондриальный апоптоз. Увеличение концентрации препарата в экспериментальных условиях ведет к некротической гибели клетки независимо от р53 статуса, но так как на практике высокие концентрации препаратов использовать нельзя, целесообразно применять апоптогенные концентрации препаратов в комбинации с воздействием на SLUG.

Результаты настоящего исследования открывают дальнейшие направления исследования механизмов гибели опухолевых клеток при действии новых производных нафтоиндолдионов и, шире, ДНК-повреждающих противоопухолевых соединений. Предстоит выявить прямую роль экспрессии SLUG в клетках с разным статусом р53, используя антисмысловые конструкции. Исследование регуляции экспрессии SLUG на транскрипционном и посттранскрипционном уровнях позволит обнаружить низкомолекуляриые соединения, взаимодействующие с промоторными областями и ингибирующие транскрипцию. Регуляция SLUG на уровне белка является новым направлением в молекулярной онкологии. С практических позиций требуется подобрать комбинации современных противоопухолевых лекарств и способы инактивации SLUG с целью повышения эффективности гибели клеток.

Возможно, выявленные механизмы гибели клеток, индуцируемые новыми производными нафтоиндолдионов - не единственные. Требуются дальнейшие усилия по установлению роли других событий, как регулируемых р53, так и независимых от этого механизма. Важен механизм взаимопереключения апоптоза и некроза. Однако наше исследование позволяет утверждать, что данный класс химических соединений перспективен для использования в клинике, молекулярные механизмы гибели опухолевых клеток при действии наиболее активных производных нафтоиндолдионов имеют своеобразие, и их изучение важно как пример практически ориентированного экспериментального исследования в молекулярной и клеточной онкологии.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Глазунова, Валерия Александровна, 2009 год

1. Adrain С, Slee Е.А., Harte М.Т., Martin S.J. 1999. Regulation of apoptotic protease activating factor-1 oligomerization and apoptosis by the WD-40 repeat region. J Biol Chem. 274(30), 20855-60.

2. Allena R.T., Cluckb M.W., Agrawal D.K. 1998. Mechanisms controlling cellular suicide: role of Bcl-2 and caspases. Cell. Mol. Life Sci. 54,427—445.

3. Aybara M. et al. 2004. A balance between the anti-apoptotic activity of Slug and the apoptotic activity of msxl is required for the proper development of the neural crest Developmental Biology 275, 325- 342

4. Barbieri D., D. Malagoli, B. Cuoghi and E. Ottaviani 2001 An anti-Bcl-2 antibody prevents 2-deoxy-D-ribose-induced apoptosis in the IPLB-LdFB insect cell line, Cell. Mol. Life Sci. 58, 653-659

5. Basma H. et al. 2005. BCL-2 antisense and cisplatin combination treatment of MCF-7 breast cancer cells with or without functional p53 Journal of Biomedical Science 12, 999-1011

6. Bauer J. and Stephen L. Helfand 2006 New tricks of an old molecule: lifespan regulation by p53. Aging Cell. 5, 437-440

7. Bellyei S. et al. 2007. Inhibition of cell death by a novel 16.2 kD heat shock protein predominantly via Hsp90 mediated lipid rafts stabilization and Akt activation pathway Apoptosis 12, 97-112

8. Berneburg M. et al. Repair of mitochondrial DNA in aging and carcinogenesis Photochem. Photobiol. Sci., 2006, 5, 190-198

9. Berry D.A. at al. 2000. HER-2/neu and p53 Expression Versus Tamoxifen Resistance in Estrogen Receptor-Positive, Node-Positive Breast Cancer. Clin. Oncol, 18, 34713479.

10. Binder С. et al. 1996. Expression of Bax in relation to Bcl-2 amd other predictive parameters in breast cancer. Annals of Oncology, 7, P. 129- 133.

11. Binder C., Hiddemann W. 1994. Programmtd cell death many questions still to be answered. Ann. Hematol. 69(1). 45-55.

12. Bonnet S., Archer S.L., Allalunis-Turner J., et al. 2007. A mitochondria-K+ channel axis is suppressed in cancer and its normalization promotes apoptosis and inhibits cancer growth. Cancer Cell 11, 37-51.

13. Borner C. 2003. The Bcl-2 protein family: sensors and checkpoints for life-or-death decisions. Mol Immunol. 39, 615-647.

14. Broker LE, Kruyt FA, Giaccone G. 2005. Cell death independent of caspases: a review. Clin Cancer Res 11, 3155-3162

15. Brooks C. and Wei Gu. 2006. p53 Ubiquitination: Mdm2 and Beyond, Mol Cell Volume 21,307-315

16. Burstein Ezra and Colin S Duckett 2003. Dying for NF-kB? Control of cell death by transcriptional regulation of the apoptotic machinery Current Opinion in Cell Biology, 15, 732-737

17. Castedo M, Perfettini JL, Roumier T, Kroemer G. 2002. Cyclin-dependent kinase-1: linking apoptosis to cell cycle and mitotic catastrophe. Cell Death Differ. 12, 1287-93.

18. Castedo M. et al. 2004. Cell death by mitotic catastrophe: a molecular definition Oncogene 23, 2825-2837

19. Cheng E„ Wei M.C., Weiler S., et al. 2001. Bcl-2, Bcl-XL sequester BH3 domain-only molecules preventing Bax- and Bak-mediated mitochondrial apoptosis. Mol. Cell. 8, 705711.

20. Cheung H., Vinay Arora, Robert G. Korneluk. 2006. Abnormalities of cell structures in tumors: apoptosis in tumors. Cancer: Cell Structures, Carcinogens and Genomic Instability Verlag/Switzerland

21. Chipuk J.E. and D.R. Green. 2006. Dissecting p53-dependent apoptosis. Cell Death and Differentiation. 13, 994-1002

22. Chipuk J.E., Kuwana Т., Bouchier-Hayes L., et al. 2004. Direct activation of Bax by p53 mediates mitochondrial membrane permeabilization and apoptosis. Science. 303, 1010— 1014.

23. Chumakov P.M. 2000. Function of the p53 gene: choice between life and death. Biochemistry. 1, 28-40.

24. Cline S.D., P.C Hanawalt. 2004 Who's on first in the cellular response to DNA damage? Nature Reviews Mol. Cell Biol. 5, 361-372

25. Cohen. M.E., Yin, M., Paznekas, W.A., Schertzer, M., Wood, S. and Jabs, E.W. 1998. Human SLUG gene organization, expression, and chromosome map location on 8q. Genomics, 51, 468-471.

26. Criollo A. et al. 2007. Mitochondrial control of cell death induced by hyperosmotic stress Apoptosis 12, 3-18.

27. Douglas R. Green 2000 Apoptotic Pathways: Paper Wraps Stone Blunts Scissors, Cell, 102, 1-4

28. Erster S. et al. 2004. In Vivo Mitochondrial p53 Translocation Triggers a Rapid First Wave of Cell Death in Response to DNA Damage That Can Precede p53 Target Gene Activation Molecular And Cellular Biology, Aug., 6728-6741

29. Fan T.J, Xia L, Han Y.R. 2001. Mitochondrion and apoptosis. Acta Biochim Biophys Sin, 33, 7-12

30. Finkel E. 2001. The mitochondrion: is it central to apoptosis? Science. 292, 624-626.

31. Franck Toledo and Geoffrey M. Wahl. 2006 Regulating the p53 pathway: in vitro hypotheses, in vivo Veritas Nature Reviews Cancer 6, 909-923

32. Fu Y.F., Fan T.J. 2002. Bcl-2 family proteins and apoptosis. Acta Biochim Biophys Sin 34,389-394

33. Galluzzi L., Larochette N., Zamzami N., Kroemer G. 2006. Mitochondria as therapeutic targets for cancer chemotherapy. Oncogene. 25, 4812^4830.

34. Gu W., Roeder R.G. 1997. Activation of p53 sequence-specific DNA binding by acetylation of the p53 C-terminal domain. Cell. 90, 595-606.

35. Guo Y., Srinivasula S.M., Druilhe A., et al. 2002. Caspase-2 induces apoptosis by releasing pro apoptotic proteins from mitochondria. J. Biol. Chem. 277, 13430-13437.

36. Heeg-Truesdell E., C.La Bonne. 2004. A Slug, a Fox, a Pair of Sox: Transcriptional Responses to Neural Crest Inducing Signals Birth Defects Res. Cell. 72(2), 124139,

37. Heiko Dumann et al. 2003 Outer mitochondrial membrane permeabilization during apoptosis triggers caspase-independent mitochondrial and caspase-dependent plasma membrane potential depolarization: a single-cell analysis JCS116, 525-536.

38. Hemann M.T., Zilfou J.T., Zhao Z., et al. 2004. Suppression of tumorigenesis by the p53 target Puma. Proc. Natl. Acad. Sci. 101, 9333-9338.

39. Hirsch Т., Marzo I., Kroemer G. 1997. Role of the mitochondrial permeability transition pore in apoptosis. Bioscience Rep. 1, 67-76.

40. Holcik M, Korneluk RG. 2001. XIAP, the guardian angel. Nat Rev Mol Cell Biol. 2(7), 550-6

41. Hotz В. et al. 2007. Epithelial to Mesenchymal Transition: Expression of the Regulators Snail, Slug, and Twist in Pancreatic Cancer Clin Cancer Res 13(16), 4776-4769

42. Hussain S. P., Harris C.C. 2006. Biological network: at the crossroads of the cellular-stress response pathway and molecular carcinogenesis. J. Nippon Med. School. 73, 5464.

43. Inukai Т., Akira Inoue, Hidemitsu Kurosawa. 1999. SLUG, a ces-/-Related Zinc Finger TranscriptionFactor Gene with Antiapoptotic Activityjs a Downstream Target of the E2A-HLF Oncoprotein, Molecular Cell, 4, 343—352

44. Ito M., Nishiyama H., Watanabe J., et al. 2006. Association of the PIGS promoter polymorphism with invasive bladder cancer in a Japanese population. Jap. J. Clin. Oncol. 2, 116-120.

45. Jian G. et al. 2004. Induction of p53-regulated genes in lung cancer cells: implications of the mechanism for adenoviral p53-mediated apoptosis. Oncogene 23, 13001307

46. Jiang X., Wang X. 2000. Cytochrome с promotes caspase-9 activation by inducing nucleotide binding to Apaf-1. J. Biol. Chem, 275, 31199-31203.

47. Jiang. R., Lan, Y., Norton, C.R., Sundberg, J.P. and Gridley, Т. 1998. The Slug gene is not essential for mesoderm or neural crest development in mice. Dev. Biol., 198, 277285.

48. Kagedal K, Johansson AC, Johansson U et al. 2005. Lysosomal membrane permeabilization during apoptosis-involvement of Bax? IntJExp Pathol 86,309-321

49. Kang J., Ferguson D., Song H., et al. 2005. Functional interaction of H2AX, NBS1, and p53 in ATM-dependent DNA damage responses and tumor suppression. Mol. Cell Biol. 25, 661-670.

50. Karst A.M., Li G., 2007. ВНЗ-only proteins in tumorigenesis and malignant melanoma. Cell. Mol. Life Sci. 64, 318-330.

51. Kelly M. В., Salvesen G. S. 2003. Mechanisms of caspase activation Cell Biol. 15, 725-731

52. Kerr L.E., Birse-Archbold J.-L.A., Short D.M., et al. 2007. Nucleophosmin is a novel Bax chaperone that regulates apoptotic cell death. Oncogene. 26, 2554-2562.

53. Kim R., M. Emi, K. Tanabe, and S. Murakami Role of the unfolded protein response in cell death Apoptosis 2006; 11: 5-13

54. Klaus Schulze-Osthoff et al. 1998. Apoptosis signaling by death receptors Eur. J. Biochem. 254, 439-459

55. Kroemer G. et al, 2005. Classification of cell death: recommendations of the Nomenclature Committee on Cell Death. Cell Death and Differentiation 12, 1463-1467

56. Kuwana Т., Mackey M.R., Perkins G., et al. 2002. Bid, bax, and lipids cooperate to form supramolecular openings in the outer mitochondrial membrane. Cell. Ill, 331-342.

57. Lakhani, S. A. et al. 2006. Caspases 3 and 7: key mediators of mitochondrial events of apoptosis. Science 311, 847-851

58. Lambert P.F., Kashanchi F., Radonovich M.F., et al. 1998. Phosphorylation of p53 serine 15 increases interaction with СВР. J. Biol. Chem. 273, 33048-33053.

59. Launay S et al. 2005. Vital functions for lethal caspases. Oncogene, 24, 5137-5148

60. Leist M., Jaattela M. 2001. Four deaths and a funeral: from caspases to alternative mechanisms. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2, 589-598.

61. Levine A.J., W Hu and Z Feng. 2006. The P53 pathway: what questions remain to be explored? Cell Death and Differentiation 13, 1027-1036

62. Liu Z., Lu H., Shi H., et al. 2005. Puma overexpression induces reactive oxygen species generation and proteasome-mediated stathmin degradation in colorectal cancer cells. Cancer Res. 65, 1647-1654.

63. Lti CX, Fan TJ, Hu GB, Cong RS. 2003. Apoptosis-inducing factor and apoptosis. Acta Biochim Biophys Sin 35, 881-885

64. Lukyanova N.Y. et al. 2000. Expression of p53 and bcl-2 proteins in epithelial ovarian carcinoma with different grade of differentiation Experimental Oncology 22, 91-93

65. Luo J., Li M., Tang Y., et al. 2004. Acetylation of p53 augments its site-specific DNA binding both in vitro and in vivo. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 2259-2264.

66. Man Jiang et al. 2004. Role of p53 in cisplatin-induced tubular cell apoptosis: dependence on p53 transcriptional activity. Am J Physiol Renal Physiol 287, 1140-1147

67. Martinou J.-C., Green D. R. 2001. Breaking the mitochondrial barrier. Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2, 63-67.

68. Melegh B. et al. 2007 p53 in health and disease Nature Reviews Molecular Cell Biology 8, 275-283

69. Michael B. Kastan and Elijahu Berkovich. 2007. p53: a two-faced cancer gene Nature Cell Biology 9(5)

70. Middelburg R. et al. 2005 Induction of p53 Up-Regulated Modulator of Apoptosis Messenger RNA by Chemotherapeutic Treatment of Locally Advanced Breast Cancer Clinical Cancer Research 11, 1863—1869

71. Mikule, K. et al. 2006. Loss of centrosome integrity induces p38-p53-p21-dependent Gl-S arrest, Nature Cell Biol. 24

72. Ming L., Wang P., Bank A., et al. 2006. Puma dissotiates Bax and Bcl-xL to induce apoptosis in colon cancer cells. J. Biol. Chem. 281, 16034-16042.

73. Murray A. 2004 Recycling the Cell Cycle: Cyclins Revisited Cell, Vol. 116, 221234

74. Nagathihalli S. Nagaraj et al. 2007. Hypoxia inhibits TRAIL-induced tumor cell apoptosis: Involvement of lysosomal cathepsins Apoptosis 12,125-139

75. Nakano К., Vousden K.H. 2001. Puma, a novel proapoptotie gene, is induced by p53. Mol. Cell, 7, 683-694.

76. Nieto A. 2002 The SNAIL superfamily of zinc-finger transcription Nature Reviews Molecular Cell Biology 3, 155-166

77. Norbury C.J., Hickson I.D. 2001. DNA Damage Repair Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 4(13) 367-401

78. Oda E., Ohki R., Murasawa H., et al. 2000. Noxa, a ВНЗ-only member of the Bcl-2 family and candidate mediator of p53-induced apoptosis. Science. 288, 1053-1058.

79. Ohtsuka T. et al. 2004. ASC is a Bax adaptor and regulates the p53-Bax mitochondrial apoptosis pathway. Nature Cell Biol. 6, 121-128.

80. Olive K. et al. 2006. Mutant Gain of Function in Two Mouse Models of Li-Fraumeni Syndrome. Cell 119(6) Pages 847-860

81. Oram, K.F., Carver, E.A. and Gridley, T. 2003. Slug expression during organogenesis in mice. Anat. Rec., 271, 189-191.

82. Orrenius S., Gogvadze V., Zhivotovsky B. 2007. Mitochondrial oxidative stress: implications for cell death. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 47, 19.1-19.41.

83. Paroni G., Henderson C., Schneider C., Brancolini C. 2002. Caspase-2 can trigger cytochrome с release and apoptosis from the nucleus. J. Biol. Chem. 277, 15147-15161.

84. Paul B. S. Lai, Tian-Yi Chi. 2007. George G. Chen Different levels of p53 induced either apoptosis or cell cycle arrest in a doxycycline-regulated hepatocellular carcinoma cell line in vitro Apoptosis. 12, 387—393

85. Perez-Mancera P. et al. 2007 Adipose tissue mass is modulated by SLUG (SNAI2) Human Molecular Genetics, 16(23), 2972-2986

86. Qanungo S. et al. 2004. N-Acetyl-L-cysteine Enhances Apoptosis through Inhibition of Nuclear Factor-kB in Hypoxic Murine Embryonic Fibroblasts The Journal Of Biological Chemistry 279(48), 50455-50464,

87. Qingwen Wan et al. 2007. Reticulon 3 mediates Bcl-2 accumulation in mitochondria in response to endoplasmic reticulum stress. Apoptosis 12, 319-328

88. Ravi D., Das K.C. 2004. Redox-cycling of anthracyclines by thioredoxin system: increased superoxide generation and DNA damage. Cancer Chemother. Pharmacol. 54, 449458.

89. Rieber M., Mary Strasberg Rieber. 2003 N-Acetylcysteine enhances UY-mediated caspase-3 activation,fragmentation of E2F-4, and apoptosis in human C8161melanoma: inhibition by ectopic Bcl-2 expression. Biochemical Pharmacology 65, 1593-1601

90. Roy M. Golsteyn. 2005. Cdkl and Cdk2 complexes (cyclin dependent kinases) in apoptosis: a role beyond the cell cycle. Cancer Letters 217, 129-138

91. Sax, J. K. et al. 2002. BID regulation by p53 contributes to chemosensitivity. Nat. Cell Biol. 4, 842-849

92. Seth R., Yang C., Kaushal V., et al. 2005. P53-dependent caspase-2 activation in mitochondrial release of apoptosis-indusing factor and its role in renal tubular epithelial cell injury. J. Biol. Chem. 280, 31230-31239.

93. Shchekotikhin et al. 2006. Synthesis and structure-activity relationship studies of 4,ll-diaminonaphtho2,3-/|indole-5,10-diones. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 14. 52415251.

94. Shchekotikhin et al. 2007. Naphthoindole-based analogues of tryptophan and tryptamine: synthesis and cytotoxic properties. Bioorg. Med. Chem. 15(7), 2651-2659;

95. Shchekotikhin et al. 2009. Synthesis and cytotoxic properties of 4,11-bis(aminoethyl)amino.anthra[2,3-Z?]thiophene-5,10-diones, novel analogues of antitumor anthracene-9,10-diones. Bioorg Med Chem., 17(5), 1861-1869.

96. Simbula G. et al. 2007. Increased ROS generation and p53 activation in a-lipoic acid-induced apoptosis of hepatoma cells Apoptosis 12, 113-123

97. Skulachev V.P. 1997. Membrane-linked systems preventing superoxide formation. Bioscience Rep, 3, 347-366.

98. Soldatenkov V.A., Potaman V.N. 2004. DNA-binding properties of poly(ADP-ribose) polymerase: a target for anticancer therapy. Curr. Drug Targets. 5, 357-365.

99. Strasser A., O'Connor L., Dixit V.M. 2000. Apoptosis signaling. Annu. Rev. Biochem. 69, 217-245.

100. Tilly J.L., J.K.Pra, B.R.Rueda. 2004. Роль апоптоза в развитии, функционировании и нарушении функции яичников, The Ovary Ch. 19, 321-345

101. Tobiume J.K. 2005. Involvement of Bcl-2 family proteins in p53-induced apoptosis. J. Nippon Med. School. 72, 192-193.

102. Tsujimoto Y. 2002. Bcl-2 Family of proteins: life-or-death switch in mitochondria Bioscience Rep. 22, 47-58.

103. Venot C., Maratrat M., Dureuil C., et al. 1998. The requirement for the p53 proline-rich functional domain for mediation of apoptosis is correlated with specific PIG3 gene transactivation and with transcriptional repression. EMBO J. 17, 4668-4679.

104. Vieira H.L.A., Kroemer G. 1999. Pathophysiology of mitochondrial cell death control. Cell. Mol. Life Sci. 56, 971-976.

105. Villunger A., Michalak E.M., Coultas L., et al. 2003. P53- and drug-induced apoptotic responses mediated by ВНЗ-only proteins Puma and Noxa. Science. 302, 1036 1038.

106. Wajant H. 2002. The Fas signaling pathway: more than a paradigm. Science 296, 1635-1636

107. Wang A.L. et al. 2006. A dual effect of N-acetylcysteine on acute ethanol-induced liver damage in mice. Hepatol Res. 23

108. Wang X. 2001. The expanding role of mitochondria in apoptosis. Genes Dev. 15, 2922-2933.

109. Wang Z.B., Liu Y.Q., Cui Y.F. 2005. Pathways to caspase activation. Cell Biol. Int. 29, 489-496.

110. Wei M.C., Zong W.X., Cheng E.H., et al. 2001. Proapototic Bax and Bak: a requisite gateway to mitochondrial dysfunction and death. Science. 292, 727-730.

111. Wei-Xing Zong and Craig B. Thompson. 2006. Necrotic death as a cell fate, Genes & Development 20, 1—15

112. Wen-Shu Wu et al. 2005. Slug Antagonizes p53-Mediated Apoptosis of Hematopoietic Progenitors by Repressing puma Cell, 123, 641-653

113. Willis S„ Day C.L., Hinds M.G., Huang D.C.S. 2003. The Bcl-2-regulated apoptotic pathway. J.Cell Sci. 116, 4053-4056.

114. Wolter K.G., Hsu Y.-T., Smith C.L., et al. 1997. Movement of Bax from the cytosol to mitochondria during apoptosis. J.Cell Biol. 139, 1281—1292.

115. Wyttenbach A., Tolkovsky A.M. 2006. The ВНЗ-only protein Puma is both necessary and sufficient for neuronal apoptosis induced by DNA damage in sympathetic neurons. J! Neurochem. 96, 1213-1226.

116. Xiaofeng Bao et al. 2007. The roles of endogenous reactive oxygen species and nitric oxide in triptolide-induced apoptotic cell death in macrophages J Mol Med. 85, 85-98

117. Xiao-Ming Yin. 2000. Bid, a critical mediator for apoptosis induced by the activation of Fas/TNF-Rl death receptors in hepatocytes. J Mol Med 78, 203-211

118. Yakovlev A.G., Giovanni S.D, Wang G., et al. 2004. Bok and Noxa are essential mediators of p53-dependent apoptosis. J. Biol. Chem. 279, 28367-28374.

119. Yamaguchi H., Chen J., Bhalla K., Wang H.-G. 2004. Regulation of Bax activation and apoptotic response to microtubule-damaging agents by p53 transcription-dependent and independent pathways. J. Biol. Chem. 219, 39431-39437.

120. Yonish-Rounash E., Grunwald D., Wilder S. et al. P53-mediated cell death:relationship to cell cycle control. // Mol Cell Biol, 1993, V.13, P.1415-1423.

121. Young Rok Seo and Hwa Jin Jung. 2004. The potential roles of p53 tumor suppressor in nucleotide excision repair (NER) and base excision repair (BER) Experimental And Molecular Medicine, 36 (6), 505-509

122. Yu J., Wang Z., Kinzler K.W., et al. 2003. Puma mediates the apoptotic response to p53 in colorectal cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100, 1931-1936.

123. Yu J., Zhang L., Hwang P.M., et al. 2001. Puma induces the rapid apoptosis of colorectal cancer cells. Mol. Cell. 7, 673-682.

124. Глазко Г.В. и соавт. 2002. Классификационный анализ «горячих» сайтов мутации гена р53. Экспериментальная онкология 24,32-37.

125. Скулачев В. П. Альтернативные функции клеточного дыхания. РОО "Мир Науки и Культуры". ISSN 1684-9876.

126. Чумаков П.М. Функция генар53: выбор между жизнью и смертью. Биохимия. 1, 34-47. Chumakov P.M. 2000. Function of the p53 gene: choice between life and death. Biochemistry (Moscow). 1, 28-40.