Получение и изучение биологической активности конъюгатов эпидермального фактора роста с противоопухолевыми химиотерапевтическими препаратами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Гуманов, Сергей Георгиевич

• Гуманов, Сергей Георгиевич
• кандидат биологических наук
• 2000

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Гуманов, Сергей Георгиевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Эпидермальный фактор роста

1.1.1. Структура и физико-химические свойства ЭФР

1.1.2. Видоспецифичность ЭФР

11.3. Предшественники ЭФР и ЭФР-связывающий белок

1.1.4. Ген ЭФР

1.1.5. Получение ЭФР

1.1.6. Структура и функции рецептора ЭФР

1.1.7. Механизмы митогенного действия ЭФР

1.1.8. Процессинг ЭФР-рецепторных комплексов

1.1.9. Распределение рецепторов ЭФР в организме

1.1.10. Получение химических производных ЭФР

1.1.11 Перспективы использования ЭФР в качестве вектора для адресного транспорта противоопухолевых препаратов

1.2. Противоопухолевые препараты

1.2.1. Антибиотики антрациклинового ряда

1.2.2. Использование конъюгатов антрациклинов для направленной терапии опухолей

1.2.3. Винкаалкалоиды

1.2.4. Конъюгаты с винкаалкалоидами

1.2.5. Фталоцианины как агенты для фотодинамической и темновой (каталитической)терапии

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Выделение и очистка ЭФР

2.2. Получение конъюгатов

2.2.1. Конъюгаты ФЦ(А1), ФЦ(Со) и Вк с ЭФР

2.2.2. Конъюгаты Др, Км и Вб с ЭФР

2.3. Культивирование клеток

2.4. Определение цитотоксической активности препаратов in vitro

2.4.1. Фталоцианины и их конъюгаты с ЭФР

2.4.2. Антрациклиновые антибиотики, растительные алкалоиды и их конъюгаты с ЭФР

2.4.3. Оценка жизнеспособности клеток

2.5. Исследование накопления и внутриклеточного распределения антрациклиновых антибиотиков и их конъюгатов с ЭФР

2.6. Определение противоопухолевой активности препаратов in vivo

2.7. Статистическая обработка результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Цитотоксическая активность конъюгатов ЭФР с ФЦ(А1), ФЦ(Со) и ТФ(Со)

3.2. Противоопухолевая активность конъюгата ЭФР с ТФ(Со) in vivo

3.3. Цитотоксическая активность конъюгатов ЭФР с винкаалкалоидами

3.4. Противоопухолевая активность конъюгата ЭФР с Вб in vivo

3.5. Цитотоксическая активность конъюгата ЭФР-Др

3.6. Противоопухолевая активность конъюгата ЭФР с Др in vivo

3.7. Цитотоксическая активность конъюгата ЭФР-Км

3.8. Противоопухолевая активность конъюгата ЭФР с Км in vivo

3.9. Сравнительный анализ ЦТА конъюгатов ЭФР с фталоцианинами, винкаалкалоидами и антрациклинами в отношении опухолевых клеток исследованных линий

3.10. Сравнительное исследование ЦТА, динамики накопления и внутриклеточного распределения антрациклиновых антибиотиков и их конъюгатов с ЭФР

3.10.1. ЦТА антрациклинов и их конъюгатов с ЭФР

3.10.2. Накопление свободных и связанных с ЭФР антрациклинов в чувствительных и резистентных опухолевых клетках

3.10.3. Накопление свободных и связанных с ЭФР антрациклинов в ядрах чувствительных и резистентных опухолевых клеток

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Получение и изучение биологической активности конъюгатов эпидермального фактора роста с противоопухолевыми химиотерапевтическими препаратами»

Проблема химиотерапии злокачественных новообразований занимала значительное место в медико-биологических исследованиях на протяжении всего двадцатого века. Долгое время эффективность химиотерапии была невелика, однако с начала 70-х годов, с момента создания технологий получения рекомбинантных ДНК и моноклональных антител, когда появилась возможность совершить значительный прорыв в понимании природы возникновения злокачественных новообразований, химиотерапия рака приобрела второе дыхание. Появилась надежда на возможность целенаправленного воздействия на различные этапы внутриклеточной передачи сигналов, индуцирующие превращение здоровой клетки в злокачественную (Северин С.Е. и др., 1998). Значительный прогресс был достигнут также в изучении фундаментальных отличий рецепторных и маркерных портретов раковых клеток от нормальных, что, в сочетании с применением моноклональных антител и успехами в выделении и очистке ростовых факторов, позволило возродить идею П. Эрлиха о «магической пуле», т.е. нетоксичном для клеточного окружения соединении, специфически атакующем клетку-мишень. В это же время были достигнуты значительные успехи в получении противоопухолевых антибиотиков, обладающих высокой цитотоксичностью. Тридцатилетие с начала 70-х годов было ознаменовано многочисленными попытками создания высокоспецифичных конъюгатов различных противопухолевых препаратов с векторными молекулами, селективно и с высоким сродством связывающимися с уникальными маркерами, локализованными на поверхности раковых клеток. В качестве токсических агентов широко использовали вещества различных классов - антагонисты фолиевой кислоты (метотрексат), антибиотики антрациклинового ряда (доксорубицин, дауномицин, карминомицин, эпирубицин и их многочисленные производные), растительные алкалоиды (винкристин, винбластин и др), антибиотики ендиинового класса (калихемицин, эсперамицин), белковые токсины (дифтерийный токсин, экзотоксин А из Pseudomonas, рицин), 6 различные фоточувствительные соединения на основе протопорфирина (фталоцианин, фотофрин, фотогем Р) и ряд других соединений. В качестве молекул-векторов первоначально наибольшее внимание привлекали моноклональные антитела против различных онкофетальных маркеров, и других антигенов, высокоэкспрессированых в опухолевых клетках, однако использование таких конъюгатов столкнулось с рядом фундаментальных ограничений. Эти ограничения связаны с низкой селективностью моноклональных антител в отношении опухолей, недостаточной эффективностью клеточной интернализации их конъюгатов с химиопрепаратами, а также с нестабильностью, приводящей к освобождению препарата до момента достижения контакта с опухолевой клеткой. В настоящее время для направленной доставки более перспективным представляется использование физиологических лигандов, рецепторы которых либо специфичны, либо высокоэкспрессированы на поверхности быстропролиферирующих клеток. Примерами таких лигандов могут служить трансферрин, альфа-фетопротеин, многие ростовые факторы. Последние особенно интересны в связи с высокой константой связывания с рецептором, высокой скоростью специфического эндоцитоза, а также доступностью, в большинстве случаев, в виде рекомбинантного человеческого белка.

Наша работа посвящена созданию и изучению биологической активности конъюгатов эпидермального фактора роста (ЭФР) с различными цитотоксическими агентами. К преимуществам ЭФР как молекулярного вектора следует отнести доступность белка в препаративных количествах, стабильность при комнатной температуре его и в органических растворителях, а также ряд физиологических свойств. ЭФР связывается со своим рецептором с высокой аффинностью (Кд=Ю"10 М), причем ЭФР-рецепторный комплекс достаточно быстро интернализуется. Целый ряд злокачественных опухолей экспрессирует на поверхности клеток аномально высокое количество рецепторов ЭФР, что, несмотря на убиквитарность фактора роста, обеспечивает селективность доставки химиопрепаратов, связанных с ЭФР. В настоящее время созданы штаммы-продуценты рекомбинантного человеческого ЭФР, в связи с чем белок доступен в препаративных количествах. Механизм рецепторопосредованного эндоцитоза ЭФР также представляется удобным для целенаправленной интернализации цитотоксического агента. Кроме того, особенности процесса 7 внутриклеточной компартментализации комплекса ЭФР-рецептор-цитотоксический агент могут играть определенную роль в снижении резистентности к антрациклинам, что представляет значительный интерес для клинического использования. 8

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Гуманов, Сергей Георгиевич

ВЫВОДЫ

1. Получены конъюгаты ЭФР с ФЦ(А1), ФЦ(Со), ТФ(Со), Вб, Вк, Др, Км, проявляющие более высокую ЦТА, чем свободные вещества, в отношении опухолевых клеток линий А43 1 и В16.

2. Конъюгаты Др и Км с ЭФР проявляют более высокую ЦТА, чем свободные вещества, как в отношении чувствительных к антрациклинам клеток MCF-7Wt и SKOV3, так и резистентных MCF-7AdrR и SKVLB.

3. В экспериментах in vivo на мышах с привитыми опухолями меланомы В16 показано, что терапевтическое применение конъюгатов ЭФР с ТФ(Со), Вб, Др и Км в исследуемых дозах приводит к значительному ингибированию опухолевого роста и увеличению продолжительности жизни по сравнению с контролем. Применение свободных препаратов в тех же дозах практически не оказывало влияния на эти параметры.

4. При поступлении в опухолевые клетки MCF-7 свободные и связанные с ЭФР Др и Км преимущественно накапливаются в ядрах как чувствительных, так и резистентных к антрациклинам клеток. При этом все исследуемые препараты накапливаются в ядрах чувствительных клеток с более высокой скоростью, чем в резистентных.

5. Накопление свободного Км как в резистентных, так и в чувствительных клетках MCF-7 и их ядрах происходило с более высокими скоростями и достигало более высоких уровней, чем накопление Др. Скорости накопления конъюгатов Км с ЭФР в ядрах клеток MCF-7Wt и MCF-7AdlR также превышали скорости накопления ЭФР-Др.

6. Накопление свободных антрациклинов в ядрах чувствительных и резистентных клеток MCF-7 происходит с более высокими скоростями, чем накопление их конъюгатов с ЭФР.

7. При поступлении антрациклинов в клетки MCF-7 в составе конъюгатов с ЭФР, в отличие от свободных Др и Км, их содержание в клетках, ядрах, а также их распределение между ядром и цитоплазмой практически не зависят от чувствительности клеток к антибиотикам.

8. При поступлении антрациклинов в клетки MCF-7Wt и MCF-7AdlR в составе конъюгатов с ЭФР уровень их внутриклеточной деградации заметно снижается.

84

Таким образом, в заключение рассмотрения первой концепции действия антрациклиновых антибиотиков, можно сформулировать следующие выводы: 1. Интеркаляция Др в ДНК хотя и имеет место, но не играет ведущей роли в формировании нерепарируемых двухцепочечных разрывов; 2. Ведущую роль в образовании фрагментов ДНК играет активационный комплекс антрациклин-ДНК-топоизомераза II; 3. В результате действия этого комплекса происходит фрагментация ДНК по апоптотическому механизму.

Перед детальным рассмотрением второй концепции механизма действия антрациклинов необходимо рассмотреть тесно связанные с ней данные, описывающие метаболизм антрациклиновых антибиотиков, образование свободных радикалов и проявление цитотоксической активности.

По некоторым данным, свободные радикалы, генерируемые антрациклиновыми антибиотиками, играют важную роль в проявлении их токсичности и противоопухолевой активности [Эммануэль Н.М. и др., 1984; Lown J.V. et al., 1983]. Показано, что НАДФН-цитохром Р-450 катализирует образование семихиноновых радикалов антрациклинов. Семихиноновый радикал легко отдает электрон кислороду с образованием супероксида, и снова превращается в стабильную хиноновую форму. Если кислорода недостаточно, семихиноновый радикал не отдает электрон другим акцепторам и происходит неэнзиматическое расщепление гликозидной связи с образованием 7-дезоксиагликонов [Bachur N.R. et al., 1979]. Восстановлене антрациклинов могут осуществить и другие флавопротеиды [Fisher J. et al., 1983]. Взаимодействие семихиноновых радикалов антрациклиновых антибиотиков с внутриклеточным кислородом может приводить к образованию супероксидных и гидроксильных радикалов. Важную роль могут при этом играть ионы металлов, в частности, железа [Eliot H. et al., 1984; Zweier J.L., 1984]. Главную роль в процессах образования однотяжевых разрывов ДНК играют

37

А + NADPH АН2 + NADP'

АН2 + 02 АН*+ Н02

СОД

Н02 + НО*2 Н202 + 02 каталаза

2 Н202 2 Н20 + 02

КХ Fe(III) + 02 КХ ' Fe(III) + О

КХ ' Fe(II) + Н202 KX'Fe(III) + ОН"+ ОН

ОН + ДНК образование разрывов

Рис. 7. Схема образования свободных радикалов при восстановлении -окислении антрациклиновых антибиотиков (А - антибиотик, АН семихиноновый радикал антибиотика, СОД - супероксиддисмутаза, КХ Fe(lII) и КХ' Fe(II) - комплексы ионов железа с АТФ или с белком). гидроксильные радикалы. В работе [Lown J.V. et al., 1983] предложена общая схема образования свободных радикалов при восстановлении-окислении противоопухолевых антибиотиков (рис. 7). В некоторых работах [Тараховский A.M. и др., 1983; Эммануэль Н.М. и др., 1984; Bachur N.R. et al., 1979; Lown J.V et al., 1983] предполагалось, что образование свободных радикалов может быть основой противоопухолевой активности и токсичности антрациклинов. В частности, кардиотоксичность антрациклиновых антибиотиков объясняли образованием гидроксильных радикалов или супероксида в сердечной мышце [Doroshow J.H., 1983; Nohl Н., Jordan W., 1983]. Образование свободных радикалов может стимулировать перекисное окисление липидов, что в свою очередь может вести к дезинтеграции эндоплазматического ретикулума и мембран митохондрий. Тем не менее, представляется более вероятным, что свободнорадикальный механизм все же играет вспомогательную роль в механизме проявления цитотоксичности антрациклинов. Показано, что образование разрывов ДНК и цитотоксическое действие антрациклинов в

38 культуре опухолевых клеток не зависит от присутствия кислорода [Brox L. et al., 1982; Kennedy К. A. et al., 1983]. Ингибиторы образования свободных радикалов не подавляют образования однотяжевых разрывов ДНК в присутствии Др [Pommier Y. et al., 1983]. Разрывы ДНК, индуцируемые свободными радикалами, выявляются только в хорошо аэрируемых клетках в присутствии очень высоких (2,8х10"4 М) концентраций Др, то есть значительно выше тех, которые могут быть достигнуты в плазме при внутривенном введении антибиотика в клинике. Следовательно, по имеющимся в литературе данным, противоопухолевая активность и цитотоксичность антрациклинов не могут быть связаны со свободнорадикальными механизмами.

Взаимодействие антрациклинов с клеточной мембраной

Рассмотрим вторую концепцию механизма цитотоксического действия антрациклиновых антибиотиков. Известно, что антрациклиновые антибиотики, а также другие интеркаляторы и такие противоопухолевые препараты, как актиномицин Д и соединения платины, взаимодействуют с плазматическими мембранами животных клеток [Sinha В.К., Chignell С.F., 1979]. Антрациклины, в частности, могут вызывать лизис эритроцитов и разрушение мембран теней эритроцитов [Myers С.Е. et al., 1982]. Показано, что комплекс Др-Ре3+ связывается с фосфолипидами мембраны [Demant E.J.F., 1984]. Высказывалось предположение, что первичным токсическим эффектом антрациклиновых антибиотиков является действие на мембрану. Так, например, [Tritton T.R., Yee G., 1982], сообщили, что Др может вызывать цитотоксический эффект, не проникая внутрь клетки. Они ковалентно иммобилизовали Др на агарозных гранулах. Иммобилизованный антибиотик подавлял рост клеток лейкоза LI210 так же эффективно, как и свободный, при этом в клетках Др не обнаруживался. Другие исследователи [Tokes Z.A. et al., 1982; Rogers K.E. et al., 1983] получили Др, ковалентно связанный с микросферами, образованными полиглутаральдегидом. В этом случае антибиотик также оказывал токсическое действие на опухолевые клетки, не проникая в них. Почти весь антибиотик оставался связанным с микросферами и не проникал в клетки, так что активность нельзя было объяснить его освобождением, следовательно, он действовал с поверхности клетки. При этом цитотоксичность не только сохранялась, но и в некоторых случаях значительно усиливалась. Кроме того,

39 устойчивые к Др опухолевые клетки проявляли чувствительность к антибиотику, связанному с микросферами. В этом случае, вероятно, имеет место новый механизм цитотоксического действия, не свойственный в норме антрациклинам [Rogers К.Е, Tokes Z.A., 1984]. Действительно, неактивный аналог Др, 4-деметокси-7,9-диэпирубомицин, в концентрации не влиял на рост клеток лейкоза L1210, но это же производное, связанное с микросферами, подавляло рост того же штамма на 50 %, в концентрации 2,1x10" 7М. Микросферы без антибиотика в эквивалентной концентрации не оказывали влияния на рост опухолевых клеток. Кроме того, смесь микросфер, не содержащих производного, со свободным деметоксидиэпирубомицином так же не подавляла рост клеток лейкоза L1210. Авторы работы пришли к выводу, что связанные с полимером антрациклины воздействуют на клеточную мембрану, причем не характерным для свободных антибиотиков способом.

Таким образом, можно сделать два основных вывода из проанализированных фактов, подтверждающих вторую концепцию действия Др: 1. Взаимодействуя с мембраной, антибиотик в состоянии оказывать значительное влияние на регуляцию процессов внутри клетки, вплоть до продукции цитотоксических эффектов; 2. Проникновение антибиотика внутрь клетки не является необходимым условием для проявления его цитотоксичности.

На основании представленных литературных данных можно заключить, что рассматриваемые концепции механизма действия Др являются взаимодополняющими, а не противоречащими друг другу.

1.2.2. Использование конъюгатов антрациклинов для направленной терапии опухолей

Антибиотики антрациклинового ряда, в частности, Др и рубомицин, получившие широкое распространение в химиотерапии злокачественных опухолей, были использованы для создания конъюгатов с векторными белками для направленной доставки антрациклинов в ткани-мишени. Первые работы были основаны на использовании для конъюгирования водорастворимого карбодиимида ЕДС (1-этил З-(З-диметиламинопропил)-карбодиимид) [Hurwitz Е. et al., 1975; Arnon R., Sela M., 1982], однако полученные конъюгаты с моноклональными антителами были неактивны. Несколько лучшие результаты

40 показали смешанные производные, в которых один белок служил носителем Др, а другой - вектором. При этом белок - носитель Др ковалентно связывался с моноклональным антителом, способным распознавать специфические антигены на поверхности клеток-мишеней. Полученные конъюгаты проявляли активность in vitro, лишь незначительно превышающую активность свободного препарата и характеризовались повышенной иммунной реактивностью [Hurwitz Е. et al., 1975].

Для увеличения цитотоксической активности конъюгатов предпринимались попытки повышения молярного отношения антибиотик/белок в конъюгате путем использования водорастворимых декстранов в качестве аккумуляторов антибиотика. Это позволило повысить молярное отношение с 5 до 50 раз. Однако, активность таких конъюгатов была снижена по сравнению с конъюгатами, в которых белок и Др были «сшиты» непосредственно [Arnon R., Sela М., 1982]. Хорошие результаты дало использование конъюгата связанного с Др аминодекстрана, и антител NP-4 против раково-эмбрионального антигена. Молярное отношение антибиотик/белок в конъюгате составляло 20. Антигенспецифическая активность антител, входящих в состав конъюгата, сохранялась in vitro и in vivo, однако интернализация была замедлена (порядка 5 ч) [Shih L.B. et al., 1991, 1994]. При этом предполагалось, что быстрое освобождение антибиотика из состава конъюгата внутри клетки после интернализации лиганд-рецепторных комплексов положительно скажется на его активности. С этой целью для сшивки декстрана с Др использовали различные кислотолабильные спейсеры, легко распадающиеся в лизосомах. В частности, широко и успешно использовался амид cis-аконитовой кислоты для связывания Др и даунорубицина с широким набором антител [Shen W.G., Ryser J.P., 1981; Gallego J. et al., 1984; Diener E. et al., 1986; Dillman R.O. et al., 1988]. Такие конъюгаты были стабильны при рН 7 и освобождали антрациклин при рН 5, соответствующем рН в лизосомах. Все конъюгаты проявляли антигенспецифическую активность in vitro. Кислотолабильные конъюгаты Др с гидразиновыми производными декстрана по С-13 кетогруппе и моноклональными антителами проявляли как антигенсвязывающую, так и цитотоксическую активность [Hurwitz Е. et al., 1980; Arnon R., Sela M., 1982]. Активность конъюгатов морфолинодоксорубицина, полученных при помощи гидразона и оксима с антителами против рецептора фибронектина, зависела от

41 РОССИЙскорости гидролиза; конъюгаты полученные при помощи оксима оказались стабильными при значениях pH, близких к кислотности лизосомальной среды, и не обладали цитотоксической активностью. Напротив, конъюгаты, полученные при помощи ацил- или сульфанил гидразонов, были кислотолабильными и проявляли высокую цитотоксическую активность [Muller В.М. et al., 1990]. Представляется обоснованным широко отраженное в литературе мнение, что чем более кислотолабильна связь в конъюгате, и чем выше молярное отношение антибиотик/белок (в разумных пределах, так как слишком большое количество «пришитого» антибиотика затрудняет интернализацию), тем эффективнее цитотоксическое действие препарата. Однако, к сожалению, терапевтические дозы, приведенные в литературе, даже самых эффективных конъюгатов с антрациклинами всегда были близки к максимальной толерантной дозе (кумулятивная доза составляла 27,6 мг/кг по Др). Таким образом, терапевтический индекс оставался низким, поэтому преимущество использования описанных выше конъюгатов по сравнению со свободным Др следует признать незначительным.

Одним из важных факторов, которые необходимо учитывать при создании конъюгатов, является чувствительность тканей, несущих специфические рецепторы, к токсическому агенту. Например, использование конъюгатов Др с Mab BR96 против легочной карциномы L2987, которая вообще чувствительна к Др, и где антиген BR-96 высокоэкспрессирован, может быть весьма эффективным, тогда как применение против опухолей сердечного эндотелия является недопустимым из-за опасной специфической кардиомиопатии. Эффективность применения конъюгатов в значительной мере определяется размером опухолей. Так, при применении конъюгатов против небольших опухолей иногда достигается 10-кратный выигрыш в скорости накопления по сравнению со свободным препаратом, даже введенным в максимальной толерантной дозе [Trail P.A. et al., 1993]. Необходимо также добиваться устойчивости создаваемых конъюгатов к сывороточной среде для обеспечения возможности достижения антибиотиком ткани-мишени Др, связанный с моноклональным антителом дисульфидной связью, например, хотя и проявлял неплохую модельную цитотоксическую активность, оказался, тем не менее, не пригоден для клинического использования из-за плохой фармакокинетики. В противоположность этому, терапевтический индекс

42 тиоэфирсвязанных конъюгатов Mab 1Ж64-Др и Mab BR-96-Др был высок, устойчивость в сыворотке позволяла эффективно достигать мишени, в связи с чем удалось достичь кумулятивной дозы 306 мг/кг Др/пациент [Trail P.A. et al., 1993].

1.2.3. Винкаалкалоиды

Винбластин (Вб) (рис. 8) - алкалоид, содержащийся в растениях барвинок и катарантус розовый, относится к алкалоидам индольного ряда. Вб является цитостатическим веществом, обладающим противоопухолевой активностью. Механизм противоопухолевого действия объясняется способностью препарата блокировать митоз на стадии метафазы. Вб действует угнетающе на лейкопоэз и тромбоцитопоэз, существенно не влияя на эритропоэз. Применяется Вб при лимфогрануломатозе, гематосаркомах, миеломной болезни, хориокарциноме. Успех лечения во многом определяется правильным выбором схемы терапевтического применения препарата. Курс терапии начинают с дозы 0,025 мг/кг, затем дозу постепенно повышают до 0,150,3 мг/кг. Курсовая доза составляет 100-120 мг. При отсутствии эффекта применение препарата прекращают при общей дозе 50 мг. Если наблюдается терапевтический эффект, проводят, проводя длительную поддерживающую терапию, подбирая дозу, которая при регулярном применении не уменьшает уровень лейкоцитов в крови ниже Зх109/л. Препарат вводят 1 раз в 2-4 недели. винбластин: Rj = СН3 винкристин: Rj = СНО

Рис. 8. Химическая структура винкаалкалоидов.

43

Вб широко используется в комплексной химиотерапии опухолей в сочетании с другими противоопухолевыми препаратами.

Винкристин (Вк) (рис. 8) - алкалоид, также содержащийся в растении барвинок розовый, по своему химическому строению близок к Вб. Вк обладает цитостатической активностью, механизм которой аналогичен таковому у Вб. Препарат применяется главным образом в терапии острого лейкоза, нейробластомы, используют также в комплексной терапии лимфогранулематоза, меланомы, рака молочной железы и других опухолей. Начальная доза курса химиотерапии составляет 0,05 мг/кг, конечная - 0,15 мг/кг. При применении винкристина возможна лейкопения. Препарат можнт оказывать нейротоксическое влияние и вызывать парастезии, двигательные расстройства, очаговые поражения ЦНС. В процессе лечения необходимо тщательно наблюдать за состоянием больных, проводить анализ крови.

Наряду с Вб и Вк в настоящее время в клинике используют навельбин (винорельбин) (Нб) и виндезин (Вд).

Нб относится к классу полусинтетических винкаалкалоидов [Potier Р., 1989]. Как и другие представители этого класса Нб воздействует на клетку в фазе G2 и M [Binet S., 1989; Cros S. et al., 1989]. При I фазе клинических испытаний было установлено, что лимитирующей токсичностью при применении Нб была лейкопения III и IV степени [Mathe G. et al., 1985]. В итоге клинических исследований Нб, проведенных во Франции и Японии, была рекомендована разовая доза 30 мг/м2 1 раз в неделю [Weber В. et al., 1993; Besenval M. et al., 1989]. Нб применяют при раке легкого, молочной железы, яичников и лимфомах. При применении Нб отмечалась также нейротоксичность, которая была значительно ниже, чем у Вк и Вд. По сравнению с другими винкаалкалоидами, Нб вызывал больший процент частичных ремиссий. Сравнительное изучение Нб и Вд при немелкоклеточном раке легкого показало явное превосходство Нб [Depierre A. et al., 1989].

Наибольшее число рандомизированных исследований посвящено сравнению эффективности Нб в монорежиме и в комбинации с другими препаратами: цисплатином, карбоплатином, ифосфамидом, митомицином С, вепезидом и др. Работы, проведенные Depierre и др. [Depierre A. et al., 1993], показали большую эффективность комбинации Нб+цисплатин по сравнению с одним Нб (48% и 17% соответственно). Таким образом, результаты 2 больших

44 рандомизированных исследований показали преимущество комбинированной химиотерапии Нб+цисплатин по сравнению с одним Нб или одним цисплатином.

Нб изучается также в комбинированной химиотерапии при раке молочной железы с Др, фарморубицном, митоксантроном, 5-фторурацилом. Была отмечена высокая активность Нб в комбинированной химиотерапии с антрациклинами, цисплатином, митоксантроном, таксанами [Blajman С. et al, 1993; Dabaja В.S. et al., 1995; Bruni S.S. et al., 1993; Kourousis C. et al., 1996]. В настоящее время также ведутся исследования роли Нб в адъювантной и неоадъювантной химиотерапии рака молочной железы, а также в комбинации с гормональной терапией.

Вд - первый полусинтетический винкаалкалоид, который был предложен для клинического применения. Его химическое название - дезацетил винбластин-амид сульфат. Структурно он очень схож с естествеными алкалоидами - Вк и Вб и отличается от последних наличием виндолинового кольца [Dyke R.W. et al., 1979].

Механизм действия Вд еще до конца не ясен. Как и другие барвинковые алкалоиды - Вк и Вб, Вд вызывает остановку клеточного деления в метафазе митоза. Кроме того, исследования in vitro показали, что Вд предупреждает инвазию злокачественных клеток в нормальную ткань [Nelson R.L. et al., 1979]. Однако, сравнительное изучение этих трех алкалоидов выявило резкие различия их действия на молекулярном уровне. Показано, что Вд в 3 раза эффективнее, чем Вк, и почти в 10 раз эффективнее, чем Вб; он останавливает митоз от 10 до 15 % клеток в культуре ткани. В дозах, останавливающих митоз от 40 до 50% клеток, Вд и Вк были примерно одинаково эффективны, причем оба оказались в три раза активнее Вб. Кроме того, между этими тремя алкалоидами отмечены качественные различия. Под действием низкой дозы Вб в препарате исследуемых клеток преобладают клетки в постметафазе, в которых отчетливо видны клеточная пластинка и хромосомы. Для клеток, обработанных Вк, напротив, характерна "шаровидная" метафаза с компактными хромосомами внутри сморщенного веретена. В отличие от Вб, Вд вызывает появление очень небольшого количества клеток в постметафазе. Клетки, обработанные Вд, имеют набухшие веретена с разбросанными хромосомами, которые резко отличаются от плотно упакованных хромосом в клетках, обработанных Вк

45

Rahmani В. et al., 1985; Bodey G.P. et al., 1980; Binet S., 1990; Bayssas M. et al., 1980].

Вд проявляет онколитическую активность у больных при рецидивах, возникших на фоне комбинированного лечения несколькими препаратами, включая Вк. Как у лабораторных животных, так и у человека, главная роль в экскреции Вд принадлежит желчевыводящей системе [Rahmani В. et al., 1985]. В предклинических испытаниях было показано, что Вд обладает противоопухолевой активностью, сходной с Вк, но большей, чем у Вб, при остеосаркому Риджуэя, лимфосаркоме Гарднера и карциноме 755 молочной железы. На линиях немелкоклеточного рака легкого и рака желудка было показано, что Вд проявлял одинаковую активность с Вб, но более высокую, чем Вк. Активность Вд при лейкемии Р388 была в 3 раза больше, чем у Вк и в 10 раз выше, чем у Вб [Barnett C.J. et al., 1978; Cros S. et al., 1989]. При I фазе клинических испытаний Вд было отмечено, что дозолимитирующей токсичностью является нейтропения. После более чем 30-летних клинических исследований остался нерешенным вопрос об оптимальном режиме комбинированной химиотерапии с включением Вд при немелкоклеточном раке легкого [Sorensen G.B. et al., 1987]. В настоящее время Вд применяется как в монорежиме, так и при комбинированной терапии рака молочной железы, опухолей головы и шеи, меланом, лейкозов и лимфогранулематозов [Cersosimo R.J. et al., 1983].

1.2.4. Конъюгаты с винкаалкалоидами

Большинство конъюгатов с винкаалкалоидами было получено на основе антител к 40 кДа гликопротеину, экспрессированному на поверхности клеток многочисленных карцином, таких как карцинома легких, толстого кишечника, яичников, желудка и др. В литературе эти антитела обозначаются Mab KS 1/4. При испытании полученных конъюгатов in vitro и в отношении человеческих опухолей, перевитых иммунодифецитным мышам была продемонстрирована их антигенспецифическая активность [Johnson I S. et al., 1987; Johnson D.A. et al., 1990; Gutowski 1991, Starling J.J. et al., 1992]. Конъюгаты с дезацетилвинбластином и с дезацетилвинбластингидразидом, проявляли также противоопухолевую активность на моделях с перевитыми человеческими опухолями, причем второй оказался более эффективным [Johnson I.S. et al.,

46

1987]. Более низкая активность дезацетилвинбластинового конъюгата связана с его большей лабильностью, что с учетом медленной интернализации комплекса с целевым антигеном ведет к высвобождению алкалоида из препарата на поверхности клетки [Starling J.J. et al., 1988, 1992].

В работе [Johnson I.S. et al., 1987] определили терапевтический индекс, то есть отношение максимальной толерантной дозы к минимально эффективной, для конъюгата с гидразидом дезоксивинбластина. Он оказался примерно равен 2,5. Тем не менее, этот конъюгат нельзя признать оптимальным для клинического применения, так как в диапазоне эффективных доз (40-250мг/м2) наблюдается высокая общая токсичность препарата. К тому же отмечена стимуляция конъюгатом системы комплемента [Schneck D. et al., 1989] и зафиксирована повышенная иммуногенность этого конъюгата [Petersen В.H. et al., 1991]. Таким образом, представляется необходимым дальнейшие исследования винкаалкалоидов в качестве цитотоксических компонентов средств направленного действия для терапии злокачественных опухолей. Необходим также поиск векторных молекул, способных эффективно доставлять винкаалкалоиды в опухолевые клетки.

1.2.5. Фталоцианины как агенты для фотодинамической и темновой (каталитической) терапии

В качестве соединений для синтеза конъюгата с ЭФР, перспективным является использование ряда фталоцианинов (ФЦ): фталоцианина AI как агента для фотодинамической терапии (ФДТ); фталоцианина Со и терафтала как агентов для темновой (каталитической) терапии [Van Hillegersberg R. et al., 1994; Daniell M.D. et al., 1991]. В основе ФДТ лежит использование фотосенсибилизаторов - веществ порфиринового ряда или порфириноподобных соединений, которые активируются и приобретают цитотоксические свойства только при облучении их светом определенной длины волны [Moan J., 1990].

ФДТ является одним из быстро развивающихся направлений практической онкологии [Kessel D., 1992]. Несмотря на то, что концепция ФДТ существует уже давно и используется в лечении ряда заболеваний, например, псориаза [Grand A. et al., 1993], лишь недавно началась разработка таких фотосенсибилизаторов, которые могут быть пригодны для лечения

47 злокачественных новообразований. В 1978 году в США были проведены первые широкие клинические испытания метода ФДТ, который оказался наиболее эффективным при лечении поверхностно расположенных опухолей кожи, мочевого пузыря, бронхов, женских половых органов, головы и шеи, пищевода и желудка [Van Hillegersberg R. et al., 1994]. В настоящее время в клиниках различных стран мира в качестве фотосенсибилизаторов используются гематопорфирины (фотофрин-1, фотосан). Первую фазу клинических испытаний в настоящее время проходят новые классы фотосенсибилизаторов, таких как фталоцианины и хлорины [Соколов В.В. и др., 1995; Якубовская Р.И. и др., 1997]. ФДТ может быть использована как самостоятельное направление, так и в комплексе с общепринятыми хирургическим лечением, радио- и химиотерапией. Возможно, ФДТ станет значительным шагом в терапии опухолей разного происхождения, так как к фотодинамическому процессу чувствительны клетки любой ткани [Moan J., 1990]. Этот способ лечения, вероятно, поможет решению такой проблемы современной онкологии, как проблема множественной лекарственной резистентности [Сергеева Н.С. и др., 1996]. Преимуществом ФДТ является отсутствие таких осложнений химио- и радиотерапии, как цитопения, интоксикация организма, тканевая атрофия. ФДТ практически атравматична, и единственное в чем нуждается больной из-за наличия небольших болевых ощущений в процессе лечения - это в мягкой постпроцедурной анальгезии. Через несколько дней после облучения опухоль подвергается некрозу, а через 2-3 недели происходит заживление раны путем реэпителизации [Peng Q. et al., 1991 d]. Побочным эффектом ФДТ является повреждение нормальных тканей организма при облучении опухоли и повреждение кожи и глаз естественным светом [Peng Q. et al., 199led]. Снизить риск фотосенсибилизации возможно применением тех препаратов, которые не накапливаются в коже и других нормальных тканях, быстро выводятся из организма, а также повышением избирательности их действия путем использования векторных молекул. Чтобы избежать поражения нормальных тканей при облучении для ФДТ используются лазерные источники, фокусирующиеся непосредственно на опухоль [Novodarova G.N. et al., 1996]. Другим недостатком фотосенсибилизаторов как терапевтических средств является невозможность их применения при локализации опухоли в участках, недоступных для подведения источника света. Использование темновой

48 каталитической) терапии с применением производных фталоцианинового ряда - фталоцианина Со (ФЦ(Со)) и терафтала Со (ТФ (Со)) может значительно расширить возможности метода лечения опухолей более глубокой локализации [Соколов В.В. и др., 1995].

Химическая структура и основные свойства фталоцианипов

На сегодняшний день существуют два поколения фотосенсибилизаторов. Фотосенсибилизаторы первого поколения (фотогемы) представляют собой производные гематопорфирина (ГП), а второго поколения (фотосенсы) -производные фталоцианина и хлорина. В настоящее время фотогемы и ряд фотосенсов проходят 2-ю и 1-ю фазы клинических испытаний соответственно [Соколов В.В. и др., 1995].

Наиболее широко использующимся представителем первого поколения фотосенсибилизаторов является фотофрин. Этот препарат стал первым разрешенным для клинических испытаний фотосенсибилизатором. Несколько тысяч пациентов прошли курс ГП - опосредованной терапии, которая была высоко эффективной для ранних и поверхностно расположенных форм рака [Spikes J.D. et al., 1986; Якубовская Р.И. и др., 1997]. Несмотря на успешное применение этих препаратов в клинике, продолжаются поиски новых фотосенсибилизирующих агентов. Причина поиска заключается, во-первых, в том, что используемое в настоящее время производное гематопорфирина является сложной смесью, в следствие чего метод до сих пор остается весьма эмпирическим. А во-вторых, поиски проводятся с целью повышения эффективности фотодеструкции опухоли, которая может быть достигнута при использовании фотосенсибилизаторов, имеющих полосы поглощения с высоким коэффициентом экстинкции в дальней красной и ближней инфракрасной областях (с увеличением длины волны увеличивается глубина проникновения света в ткани) [Ris H.В. et al., 1993].

Второе поколение фотосенсибилизаторов является более перспективным, так как его представители обладают более оптимальными свойствами для использования в терапии, чем препараты первого поколения, а именно, большей селективностью к опухолевым тканям, меньшей токсичностью и лучшими фотофизическими параметрами [Ris Н.В. et al., 1993]. Так, эти препараты имеют более сдвинутый в правую сторону максимум поглощения (для фталоцианинов

49

670 нм, для хлоринов - 652 нм) по сравнению с максимумом поглощения ГП (630 нм), что позволяет свету проникать в ткань на большую глубину. Во-вторых, коэффициент молярной экстинкции фотосенсов (для ФЦ(А1) - 95600 М~ ' см"1 при 670 нм) превосходит коэффициент молярной экстинкции компонентов ГП (2-3000 М-1 см"1 при 625 нм). Из группы активно изучаемых фотосенсов одним из наиболее перспективных является фталоцианин А1 (ФЦ(А1)) (рис. 9). Два других представителя фталоцианинового ряда - ФЦ(Со) и ТФ(Со) (рис. 9) могут использоваться для темновой терапии. К преимуществам ФЦ следует отнести то, что они легко синтезируются, резистентны к химическому и фотофизическому разрушению (ФЦ(А1)), низкотоксичны, легко проникают через мембрану клетки. Кроме того, ФЦ(А1) обладает оптимальными фотофизическими параметрами, а именно, продуцируют долгоживущее триплетное состояние и имеет пик поглощения в красной области спектра (670 нм) с высоким коэффициентом экстинкции [Peng Q. et al., 1991abd],

Me = Al : алюминий (II) (дисульфохлорид) фталоцианин Me = Co: кобальт (II) (дисульфохлорид) фталоцианин ноос соон кобальт (Ii) (октакарбокои) фталоцианин (терафтал)

Рис. 9. Химическая структура фталоцианинов.

50

Механизм действия фотодинамической и темповой (каталитической) терапии

Механизм действия фотосенсибилизаторов разных классов (гематопорфирины, фталоцианины, хлорины) сходен. В основе цитотоксического действия фотосенсибилизаторов лежит их преимущественное накопление в опухолевых тканях и последующая активация препаратов при облучении светом соответствующей длины волны в красной части спектра [Peng Q. et al., 1991Ь]. Цитотоксичность реализуется, главным образом, через фотоокислительные реакции двух типов [Valenzeno D., 1987; Salet С. et al., 1990]. Фотоокисление 1-го типа включает прямую реакцию возбужденного сенсибилизатора с субстратом, что приводит к образованию переходных радикалов, которые далее вступают в реакцию с кислородом. В реакции второго типа энергоперенос происходит из возбужденного триплетного состояния сенсибилизатора на молекулы кислорода с образованием синглетного кислорода [Valenzeno D., 1987], который далее вступает в реакцию с субстратами, поддающимися окислению. Кроме прямого фотохомического воздействия на опухолевые клетки, в процессе деструкции тканей при ФДТ играют роль другие механизмы: нарушение кровоснабжения опухолевой ткани за счет повреждения эндотелия кровеносных сосудов, гипертермический эффект, связанный с активным поглощением света опухолевыми клетками, цитокиновые реакции, обусловленные стимуляцией продукции фактора некроза опухоли, активацией макрофагов, лейкоцитов и лимфоцитов [Gomer C.J. et al., 1984].

Изучение внутриклеточной локализации ФЦ показало, что фотосенсибилизатор преимущественно связывается с мембранами (плазматической, митохондриальной, ядерной и мембраной шероховатого эндоплазматического ретикулума) [Valenzeno D., 1987], накапливается в лизосомах, митохондриях и, в некоторых случаях, в ядре [Salet С. et al., 1990, Rousseau J. et al., 1991; Miller К. et al., 1994]. Избыточное количество синглетного кислорода, образующееся в ходе фотодинамического процесса, приводит к формированию окисленных форм липидов, взаимодействует с индольными кольцами гистидина, триптофана, гуанина, с SH-группами белков. Таким образом, в результате фотодинамического процесса нарушается структура и функция жизненно важных биомолекул, мембран, внутриклеточных

51 органелл, что приводит к гибели клеток [Peng Q. et al., 199lab; Rousseau J. et al., 1991].

Генерация синглетного кислорода зависит от фотофизических свойств фотосенсибилизатора и условий оксигенации ткани. Для перехода кислорода из основного триплетного состояния в синглетное, необходима энергия, равная 94 кДж/моль [Valenzeno D., 1987]. В фотодинамическом процессе эта энергия доставляется фотосенсибилизатором, который под воздействием света определенной длины волны возбуждается до высокоэнергетического состояния. Процесс передачи энергии показан на рис. 10.

Рис. 10 (по [Moan J., 1990]). синглетное состояние фотосенсибилизатора А hv триплетное состояние фотосенсибилизатора

94 кДж

Окисление липидов гуанина триптофана гистидина

Таким образом, эффективными фотосенсибилизаторами являются лишь те, которые способны испускать энергию более 94 кДж/моль, и иметь максимум поглощения при длине волны менее 850 нм [Moan J., 1990]. Для нормального протекания фотодинамического процесса важны и ряд других фотофизических параметров. Один из них - время жизни триплетного состояния фотосенсибилизатора. Если оно короткое, то триплет не сможет эффективно передавать свою энергию кислороду. Другой важный параметр - глубина проникновения света вглубь ткани. Свет с длиной волны, соответствующей красной части видимого спектра (600-850 нм), проникает более глубоко (около 1 см), чем свет, соответствующий более коротковолновой части спектра (400600 нм), который проходит лишь в поверхностный слой ткани. Следовательно,

52 фотосенсибилизаторы, имеющие максимум поглощения в районе 600-850 нм являются наиболее оптимальными для ФДТ и позволят лечить опухоли, находящиеся на глубине около 1 см от облучаемой поверхности [Moan J., 1990].

В основе темновой (каталитической) терапии опухолей лежит использование таких производных ФЦ, как ФЦ(Со) и ТФ(Со). Механизм цитотоксического действия данных ФЦ заключается в их избирательном накоплении в опухолевой ткани и повреждении клеток в результате комбинированного взаимодействия этих препаратов с восстановителем, например, с аскорбиновой кислотой [Gomer C.J. et al., 1984; Novodarova G.N. et al., 1996]. Однако, детальный механизм цитотоксического действия ФЦ(Со) и ТФ(Со) до настоящего времени неясен.

Применение фталоцианина Al в качестве противоопухолевого препарата в клинике

Фталоцианин А1 в настоящее время проходит 1-ю фазу клинических испытаний в МНИОИ им. П.А.Герцена, Москва, Россия [Якубовская Р.И. и др., 1997]. Согласно результатам ФДТ, полной регрессии (ПР) опухоли удалось добиться в 68,1% случаев, частичной регрессии - в 25,5%, ограниченной регрессии - в 5% , терапевтический эффект отсутствовал лишь в 1,4% случаев. Наиболее эффективным метод ФДТ оказывается у больных базальноклеточным раком кожи (ПР в 96,9% случаев) и в группе пациентов с ранними формами рака полостных органов (ПР опухоли у 100% больных при раннем раке полости рта, трахеи, бронхов и мочевого пузыря; у 89%) - при раннем раке пищевода; у 75% - при раннем раке желудка) [Якубовская Р.И. и др., 1997].

Для проведения ФДТ в зависимости от локализации и размеров опухоли применяются три способа подведения лазерного источника излучения к пораженному участку ткани: поверхностное облучение, внутритканевое облучение с внедрением источника в опухолевую ткань и смешанное облучение. Для подведения света к опухолям внутренних органов применяются источники, введенные через канал фиброэндоскопа. Расчет дозы лазерного облучения осуществляется с учетом размеров, локализации опухоли, расстояния между световодом и поверхностью ткани. Основными параметрами воздействия являются: плотность поглощенной световой энергии (в Дж/см2), доза фотосенсибилизатора в (мг/кг), мощность излучения на выходе световода (в

53 мВт), расстояние от световода до опухоли и диаметр светового пятна (в см), время облучения (в мин) [Якубовская Р.И. и др., 1997]. Условия клинических испытаний ФЦ(А1) в сравнении с фотофрином приведены в таблице 3.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Гуманов, Сергей Георгиевич, 2000 год

1. Богуш Т А., Шубина И.Ж., Смирнова Г.Б., Сыркин А.Б., Богуш Е.А. Прижизненная количественная оценка внутриклеточного распределения доксорубицина в опухолевых клетках. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1995. №11. с. 518-521.

2. Никольский И.Н., Соркин А.Д. Сорокин А.Б. Эпидермальный фактор роста. //Л.: Наука, 1987. 200 с.

3. Северин С.Е., Катуков В.Ю., Муйжнек Е.Л., Северин Е.С. Проблемы избирательной регуляции клеточной активности от фундаментальных основ к практическим результатам // Вопр. биол., мед.,фарм. химии. 1998. №1. С. 6-15.

4. Сергеева Н.С., Стороженко И.В., Маршутина Н.В. Множественная лекарственная устойчивость как один из возможных механизмов клинической химиорезистентности опухолей человека. // Российский онкологический журнал. 1996. №3. С. 51-55.

5. Соколов В.В., Страндако Е.Ф., Жаркова H.H. и др. Фотодинамическая терапия злокачественных опухолей основных локализаций с препаратами фотогем и фотосенс (результаты 3-летних наблюдений) // Вопросы онкологии,- 1995,- т.41,- №2,- С.134-138.

6. Тараховский A.M., Жмарева E.H., Ромоданов С.А. Роль системы образования и детоксикации супероксидных радикалов в механизме противоопухолевого эффекта адриамицина // Бюллетень, экспер. биол. 1983. Т.96. №11. С. 86-88.

7. Тренин A.C. Исследование репарации повреждений ДНК, вызываемых противоопухолевым антибиотиком карминомицином. // Вестн. АМН СССР. 1981. №5. С. 71-75.85

8. Эммануэль Н.М., Богданов Г.Н, Орлов B.C. Свободнорадикальные механизмы в цитотоксическом действии противоопухолевых антибиотиков //Успехи химии. 1984. Т.53. №12. С. 1929-1958.

9. Якубовская Р.И., Соколов В.В., Немцова Е.Р. и др. Влияние фотодинамической терапии на состояние иммунной системыи антиоксидантный статус у онкологических больных // Российский онкологический журнал,- 1997,- №4,- С.27-32.

10. Arcamone F. Doxorubicin, Anticancer antibiotics // New York: Acad. Press, 1981,-369p.

11. Arnon R., Sela M. In vitro and in vivo efficacy of conjugates of daunomycin with antitumor antibodies. // Immunol. Rev. 1982. Vol. 62. P. 5-27.

12. Bachur N.R., Gordon S.L., Gee M.V. et al. NADFH cytochrome P-450 reductase activation of quinone anticancer agents to free radicals // PNAS USA. 1979. Vol. 76(2). P. 954-957.

13. Baldini N., Scotlandi K., Shikita T. et al. Nuclear immunolocalization of P-glicoprotein in multidrug-resistant cell lines showing similar mechanisms of doxorubicin distribution. //Eur J Cell Biol. 1995. Vol. 68. P. 226-239.

14. Baldwin G. S. Epidermal growth factor precursor is related to the translation product of the Moloney sarcoma virus oncogene mos // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1985. Vol. 82. P. 1921-1925.

15. Barnes D., Colowick S. P. Stimulation of sugar uptake in cultured fibroblasts by epidermal growth factor (EOF) and EGF-binding arginine esterase // J. Cell. Physiol. 1976. Vol. 89. P. 633-640.

16. Barnett C.J., Cullinan G.J., Gerzon K. et al. Structure activity relationship of dimeric Catharanthus alkaloids. Deasacetylvinblastine amide (vindesine) sulfate // J. Med. Chern. 1978. Vol. 21. P. 88-96.

17. Bayssas M., Gouveia J., Ribaud P. et al. Phase II trial with vindesine for regression induction in patients with leukemias and hematosarcomas // Cancer Chemother. Pharmacol. 1980. Vol. 2. P. 247-255.

18. Beguinot L., Lyall R., Willingham M., Pastan I. Down regulation of the epidermal growth factor receptor in KB cells is due to receptor internalization and subsequent degradation in lysosomas // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1984. Vol. 81. P. 2384-2388.86

19. Besenval M., Delgado M., Demaretz J.P. et al. Safety and tolerance of navelbine in phase I-II clinical studies// Semin. Oncol. 1989. Vol. 16. P. 37-41.

20. Binet S., Fellous A. et al. In situ analysis of the action of navelbine on various types of microtubules using immunofluorescence// Semin. Oncol. 1989. Vol.16. P 5-8.

21. Binet S., Chalneau E., Fellous A. et al. Immunofluorescence study of the action of navelbine, vincristine and vinblastine on mitotic and axonal microtubules // Int. J. Cancer. 1990. Vol. 46(2). P. 262-266.

22. Blajman C., Balbiani L., Block J. et al. Navelbine (N) and adriamycin (A) versus FAC in advanced breast cancer // Proc. Am. Soc. Clin. Oncol. 1993. Vol. 12. P.92.

23. Bodey G.P., Yap H.Y., Yap B.S. et al. Continous infusion of vindesine in solid tumors // Cancer Treat. Rep. 1980. Vol. 7. P. 39-47.

24. Boonnstra J, De Laat S.W., Ponec M. Epidermal growth factor receptor exspression related to differentiation capacity in normal and transformed keratinocytes // Exp.Cell.Res. 1985. Vol. 161. P.421-433.

25. Brissenden B. E., Ullrich A., Francke U. Human chromosomal mapping of genes for insulin-like growth factors I and II and epidermal growth factor // Nature. 1984. Vol. 310. P. 781-784.

26. Brown G., Twardzik D. R., Marquardt H., Todaro G. J. Vaccinia virus encodes a polypeptide homologous to epidermal growth factor and transforming growth factor //Nature. 1985. Vol. 313. P. 491-492.

27. Brox L., Gowans B., To R. et al. The effect of anoxia on anthracycline induced DNA damage in the RPMI 6410 human lymphoblastoid cell line // Canad. J. Biochem. 1982. Vol. 60(9). P. 873-876

28. Bruni S.S., Silvestro P., Casparro M.E. et al. Mitoxantrone and vinorelbine in salvage chemotherapy of antracycline refractory advanced breast cancer // Eur. J. Cancer. 1993. Vol. 29A (6). A. 449.

29. Burgess A. W., Lloyd C. I., Nice E. C. Murine epidermal growth factor heterogeneity on high resolution exchange chromatography // EMBO J. 1983. Vol. 2. P. 2065-2069.

30. Burmeister M., Avivi A., Schlessinger J., Soreq H. Production of EGF-containing polypeptides in Xenopus oocytes microinjected with submaxillary gland mRNA // EMBO J. 1984. Vol. 3. P. 1489-1505.

31. Burwen S. J., Barker M, E., Goldman I. S. et al. Transport of epidermal growth87factor by rat liver; Evidence for a nonlysosomal pathway // J Cell Biol. 1984. Vol. 99. P. 1259-1265.

32. Capranico G., Riva A., Tinelli S. et al. Marcedly reduced levels of antracycline-induced DNA strand breaks in resistant P388 leukemia cells and isolated nuclei // Cancer Res. 1987. Vol. 47. P. 3752-3755.

33. Capranico G., Tinelli S., Zunino F. Formation, resealing and persistance of DNA breaks produced by 4-demethoxydaunorubicin in sensitive and resistant P388 cells. // Chemico-biological Interactions. 1989. Vol. 72. P. 113-116.

34. Capranico G., de Isabella P., Penco S., Tinelli S., Zunino F. Role of DNA breakage in cytotoxisity of doxoaibicin, 9-deoxydoxorybicin, and 4- demethyl-6-deoxydoxorubicin in murine leukemia P388 cells. // Cancer Res. 1989. Vol. 49. P. 2022-2025

35. Capranico G, Jaxel C., Roberge M. et al. Nucleosome positioning as a critical determinant DNA topoisomerase II in reconstituted simian virus 40 chromatin. // Nucleic Acid Res. 1990. Vol. 18. P. 4553-4559.

36. Carpenter G. Regulation of EGF receptor activity during the modulation of protein synthesis//J Cell. Physiol. 1979. Vol. 99. P. 101-106.

37. Carpenter G. Cohen S. 125I-labeled human epidermal growth factor (hEGF): Binding, internalization, and degradation in human fibroblasts // J. Cell Sci. 1976. Vol. 71. P. 159-171.

38. Carpenter G., Lembach K. 1., Morrison M. M., Cohen S. Characterization of the binding of 12;,I-labeled epidermal growth factor to human fibroblasts // J. Biol. Chem. 1975. Vol. 250. P. 4297-4304.

39. Carpentier J.-L., White M. F., Orel L., Kahn R. C. Direct visualization of the phosphorylated epidermal growth factor receptor during its internalization in A431 cells//J. Cell Biol. 1987. Vol. 105. P. 2751-2762.

40. Cersosimo R.J., Bromer R., Licciardello J.T. et al. Pharmacology, clinical efficacy and adverse effects of vindesine sulfate, a new vinca alkaloid // Pharmacotherapy. 1983. Vol. 3. P. 259-274.

41. Cohen S., FavaR. Internalization of functional epidermal growth factor: receptor/ kinase complexes in A431 cells//J. Biol. Chem. 1985. Vol. 260. P. 12351-12358.

42. Comens P. G, Simmer R. L., Baker J. B. Direct linkage of 125I-EGF to cell surface receptor. A useful artifact of chloramine T treatment // J. Biol. Chem. 1982. Vol. 257. P. 42-45.88

43. Cros S., Wright M., Morimoto C. et al. Experimental antitumor activity of navelbine (5'-Noranhydrovinblastine, vinorelbine) // Semin. Oncol. 1989. Vol. 16. P. 15-20.

44. Dabaja B.S. et al. Treatment of metastatic breast cancer with vinorelbine and cisplatin: a clinical phase II trial // Proc. 5th Int. Congress Anti-Cancer Chemother. 1995. P. 241.

45. Daniell M.D., Hill J.S. A history of photodynamic therapy // Austraian and New Zealand Journal of Surgery.- 1991,- 61.-P. 340-348.

46. Das M. Epidermal growth factor receptor and mechanisms for animal cell division // Curr. Top. Membranes Transp. 1983. Vol. 18. P. 381—405.

47. Davis R. I., Czech M. P. Amiloride directly inhibits growth factor receptor tyrosine kinase activity//! Biol. Chem. 1985. Vol. 260. P. 2543—2551.

48. Demant E.J.F. Binding of adriamycin-Fe3+ complex to membrane phospholipids //Eur. J. Biochem. 1984. Vol. 142(3). P. 571-575.

49. Depierre A., Lemarie E., Dabouis G. et al. Efficacy of navelbine (NVB) in non-small cell lung cancer (NSCLC) // Semin. Oncol. 1989. Vol. 16. P. 33-36.

50. Depierre A. et al. Result og a phase III randomized study of Vinorelbine (V) versus Vinorelbine-Cisplatin (VP) in non small cell lung cancer (NSCLC) // Proceedings ASCO. 1993. Abst. 1138. P. 340.

51. Diener E. et al. Specific immunosupression by immunotoxins containing daunomycin // Science. 1986. Vol. 231. P. 148-150.

52. Dillman R. O., Jonson D. E., Shawler D. L., Koziol J. A. Superiority of an acid-label Daynorubicin-monoclonal antibody conjugate compared to free drug. // CanserRes. 1988. Vol. 48. P.6097-6102.

53. Doroshow J. H. Effect of anthracycline antibiotics on oxygen radical formation in rat heart // Cancer Res. 1983. Vol. 43(2). P. 460-472.

54. Dyke R.W., Nelson R.L. et al. Vindesine: a short review of preclinical and first clinical data // Cancer Chemother. Pharmacol. 1979. Vol. 2. P. 229-232.

55. Eliot H., Gianni L., Myers C. Oxidative destruction of DNA by the adriamycin-iron complex // Biochemistry. 1984. Vol. 23(5). P. 928-936.

56. Fisher J., Ramakrishnan K., Becvar J.I., Direct enzyme-catalyzed reduction of anthracyclines by reduced nicotinamide adenin dinucleotide // Biochemisry. 1983. Vol. 22(6). P. 1347-1355.89

57. Frey P., Forand R., Maciag T., Shooter E. The biosynthetic precursor of epidermal growth factor and the mechanism of its processing // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1979. Vol. 76. P. 6294-6298.

58. Gallego J., Price M. R., Baldwin R W. Preparation of four daunomycin monoclonal antibody 791T/36 conjugates with antitumor activity. // Int. J. Cancer. 1984. Vol 33. P. 737-744.

59. Gause G.F., Dydnik Y.V. Antitumor antibiotics // In Clinical Chemotherapy. Antineoplastic chemotherapy. New York: Thieme Stratton. 1984. Vol.3. P.205-223.

60. Goldin A., Johnson R. K. Antitumor effect of adriamycin in comparison with related drugs, and in combination chemotherapy // In: Adriamycin review. Ghent: European Press Medikon. 1975. P. 37-54.

61. Goldin A., Johnson R. K. Experimental tumor activity of adriamycin. (NSC-123127) //Cancer Chemother. Rep. 1975. Vol. 6(2). P. 137-145.

62. Gomer C.J., Rasum N.J. Acute skip response in albino mice following porphirin photosensitization under oxic and anoxic continions // Photochem. Photobiol -1984.-40.-P. 435-444.

63. Grand A., Gasparro F. Present and future ases of photochemotherapy in medicine // Spectrum.- 1993,- №6.-P. 28-30.

64. Green M. R, Mycock C., Smith C. G, Coachman J. R. Biochemical and ultrastructural processing of 123I epidermal growth factor in rat epidermis and hair fallicles : Accumulation of nuclear label // J. Invest. Dermatol. 1987. Vol. 88. P. 259-265.

65. Gullick W. J., Downward /., Waterfield M. D. Antibodies to the autophosphory-lation sites of the epidermal growth factor receptor protein-tyrosine kinase as probes of structure and function // EMBO J. 1985. Vol. 4. P. 2869—2877.

66. Gutowski M. C., Briggs S. L., Johnson D. A. Epidermal Growhth factor receptor-reactiv monoclonal antibodies: Xenograft antitumor activity alon and as drug immunoconjugates. //Cancer Res. 1991. Vol. 51. P.5471-5475.

67. Haigler H.T., Ash J.F., Singer S.J. Visualization by fluorescence of the binding and internalization of epidermal growth factor in human carcinoma cells A-431 // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1978. Vol. 75. P. 3317-3321.90

68. Haigler H. T., End D., Kempner E. Molecular size of the epidermal growth factor receptor-kinase as determined by radiation inactivation // J. Biol. Chem. 1985a. Vol. 260. P. 2178-2184.

69. Haigler H. T., Wiley H. S., Moehring }. H., Moehring J. M. Altered degradation of epidermal growth factor in a diphtheria toxin-resistant clone of KB cells // J. Cell. Physiol. 1985b. Vol. 124. P. 322-330.

70. Hollenberg M. D., Gregory H. Epidermal growth factor-urogastrone: biological activity and receptor binding of derivatives // Mol. Pharmacol. 1980. Vol. 17. P. 314-320.

71. Holliday L. A., Savage C. R., Cohen S., Puett D. Conformation and unfolding thermodynamics of epidermal growth factor and derivatives // Biochemistry. 1976. Vol. 15. P. 2624-2633.

72. Hurwitz E., Levy, R., Mavon R. et al. The covalent binding of daunomycin and adriamycin to antibodies with retention of both drug and antibody activities. // Cancer Res. 1975. Vol. 35. P.l 175-1181.

73. Hunter T., Gould K. L., Cooper /. A. Tyrosine protein kinases, viral transformation and the control of cell proliferation // Biochem, Soc. Trans. 1984. Vol. 12. P. 757—759.

74. Hunter T., Karin M. The regulation of transcription by phosphorilation // Cell. 1992. Vol. 70. P. 375-387.

75. Hurwitz E., Wilchek M., Pitha J. Soluble molecules as carriers for dounorubicin. // J. Appl. Biochem. Vol. 32., p. 25-35.

76. Ito F., Ito S., Shimizu N. Transmembrane delivery of polypeptide growth factors bypassing the intrinsic cell surface receptors: synthesis and biological activity of a conjugate of EOF with a,IA // Cell Struct. Funct. 1985. Vol. 9. P. 105-115.

77. Jinno H., Masakazu U., Ozawa S. et al. Epidermal growth factor receptor-dependent cytotoxic effect by an EGF-ribonuclease conjugate on human cancer cell lines. //Cancer Chemother. Pharmacol. 1996. Vol. 38. P. 303-308.

78. Johnson D. A., Baker A. L., Laguzza B. C. et al. Antitumor activity of L/1C2-4-desacetylvinblastine-3-carboxhydrazide immunocojugate in xenografts. // Cancer Res. 1990. Vol. 50. P. 1790-1794.

79. Johnson I. S., Spearman M. E., Todd G. C. et al. Monoclonal antibody drug conjugates for site-directed cancer chemotherapy: Preclinical pharmacology and toxicology studies. // Cancer Treat. Rev. 1987. Vol. 14. P. 193-196.91

80. Kanter P.M., Schwartz H. S. Effects of N-trifluoroacetyladriamycin-14-valerat and related agents on DNA strand damage and thymidine incorporation in CCRF-CEM cells// Cancer Res. 1979 Vol. 39(2). P. 448-451.

81. Kennedy K.A., Stegfried J.M., Sarttorelli A.C. et al. Effect of antracyclines on oxygenated and hipoxic cells// Cancer Res. 1983. Vol. 43(1). P. 54-59

82. Kessel D. Photodynamic therapy and neoplastue disease/ / Oncology Research.-1992,- 4.-P.219-225.

83. Knauer D. /., Cunningham D. D. Epidermal growth factor carrier protein binds to cells via a complex with released carrier protein nexin // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1982. Vol. 79. P. 2310-2314.

84. Kobayashi R., Reeve J. R, Walsh J. H. Isolation and partial characterization of canine epidermal growth factor/urogastrone//Biochem. J. 1985. Vol. 229. P. 611619.

85. Komoriya A., Hortsch M., Meyers C., Smith M., Kanety H., Schlessinger !. Biologically active synthetic fragments of epidermal growth factor: localization of a major receptor-binding region // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1984. Vol. 81. P. 1351-1355.

86. Kourousis C., Kakolyris S. et al. A preliminary report of an active salvage chemotherapy combining vinorelbine paclitaxel and CDDP in antracycline-resistant advanced breast cancer // Proc. Annu. Meet. Am. Soc. Clin. Oncol. 1996. P. 15.

87. Landreth G.E. et al. Association of the epidermal growth factor receptor kinase with the detergent-insoluble cytoskeleton of A431 cells // J. Cell Biol. 1985. Vol. 101. P. 1341-1350.

88. Liao C.W., Hseu T.H., Hwang J. A target-specific chimeric toxin composed of epidermal growth factor and Psedomonas exotoxin A with a deletion in its toxin-bindihg domain// Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. Vol. 43. P.498-507.

89. Liu L.F., Rowe T.C., Yang L., Tewey K M., Chen G.L. Cleavage of DNA topoisomerase II.//J Biol Chem. 1983. Vol. 258. P. 15365-15370.

90. Lown J.V., Hanstock C.C., Joshua A.V. et al. Structure and conformation of saframycin R determined by High field 'H and 13C NMR and its interactions with DNA in solution//J. Antibiot. 1983. Vol. 36(9). P. 1184-1194.

91. Lowry O.H., Rosenbrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with Folin phenol reagent. //J. Biol. Chem. 1951 Vol. 193. P. 265-275.92

92. Magun B. E. Planck S. R., Wagner H. N. Intracellular processing of l25I-epidermal growth factor in rat embryo fibroblasts // J. Cell. Biochem. 1982 Vol. 20. P. 259-276.

93. Marquardt H., Hunkapiller M. W., Hood L. E., Todaro G. Rat transforming growth factor type 1: structure and relation to epidermal growth factor // Science. 1984. Vol. 223. P. 1079-1082.

94. Martin-Perez J., Slegmann M.,Thomas G.,EGF, PDGF 2a and insulin induce the phosphorilation of identical S6 peptides in swiss mouse 3T3 cells: Effects of cAMP on early sites of phosphorylation. // Cell. 1984. Vol. 36. P. 287-294.

95. Mathe G., Reizenstein P. Phase I study a new vinca alkaloid Navelbine // Cancer Letters. 1985. Vol. 27. P. 285-293.

96. Matrisian L. M., Larsen B. R., Finch J. S., Magun B. E. Further purification of epidermal growth factor by HPLC // Anal. Biochem. 1982. Vol. 125. P. 339-351.

97. Mayo K. H. Epidermal growth factor from the mouse. Structural characterization by proton nuclear magnetic resonance and nuclear Overhauser experiments at 500 MHz//Biochemistry. 1984. Vol. 23. P. 3960-3973.

98. Miller K., Reich E., Grau T., Hautmann R. Uptake and phototoxic effects of aluminum-chlorophtalocyanine (AlSPc) in human bladder carcinoma cells // Urol. Res.- 1994,-22,-P. 79-83.

99. Miller K., Beardmore J. et al. Localization of the epidermal growth factor (EGF) receptor within the endosome of EGF-stimulated epidermoid carcinoma (A 431) cells // J. Cell Biol. 1986. Vol. 102. P. 500-509.

100. Minford J., Pommier Y., Filipski J. et al. Isolation of intercalator-dependent protein-linked DNA strand cleavage activity from cell nuclei and identification as topoisomerase II. //Biochemistry. 1986. Vol. 25. P. 9-13.

101. Moan J. Properties for optimal photodynamic therapy sensitizers // Journal of Photochem. And Photobiol.- 1990,- 5,- 521-524.

102. Modjtahedi H., Dean Ch. The receptor for epidermal growth factor and ligands: expression, prognostic value and target for therapy in cancar // Intern. J. Oncol. 1995. Vol. 4. P. 277-296.

103. Mosmann T. Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxity assays. // J. Immunol. Meth. 1983. Vol. 65, P. 55-63.93

104. Mueller B. M., Wrazidlo W. A., Reisfeld R. A. Antibody cojugates with morfolynodoxorubicin and acid cleavable linkers. // Bioconj. Chem. 1990. Vol. 1. P. 325-330.

105. Myers C.E., Gianni L., Simone C.B. et al. Oxidative destruction of erythrocyte ghost membranes cataiyzed by the doxorubicine-iron complex // Biochemistry. 1982. Vol. 21(8). P. 1707-1713.

106. Neidle S., Sanderson M.R. The interactions of daunomicin and adriamicin with nucleic acids // In: Molecular aspects of anti-cancer drug action/Eds. S. Neidle, M. J. Warring. London: The Mac Millan Press. 1983. P.35-55.

107. Nelson R.L., Dyke R.W., Root M.A. et al. Clinical pharmacokinetics of vindesine // Cancer Chemother. Pharmacol. 1979. Vol. 2. P. 243-246.

108. Nexj) E., Hollenberg M. D., Figuera A., Pratt R. Detection of epidermal growth factor and its receptor during fetal mouse development // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1980. Vol. 77. P. 2782-2785.

109. Nohl H., Jordan W. OH generation by adriamycin semiquinone and H202: an explanation for the cardiotoxicity of antracycline antibiotics // Biochem biophys. Res. Commun. 1983. Vol. 114(1). P. 197-205.

110. Novak-Hofer L., Thomas G. An activated S6 kinase in extracts from serum and epidermal growth factor-stimulated Swiss 3T3 cells. // J. Biol. Chem. 1984. Vol. 159. P. 5995-6000.

111. Novodarova G.N., Belkov V.M., Volpin M.E., Shaharova Z.A. The activation of dioxygen and homogeneous catalytic oxidation.- 1996 6th Intern. Symposium, Noordwijkerhout.- P. 215-216.

112. Peng Q., Moan J., Farrants G.W. et al. Location of P-II and A1PC34 in human tumor LOX in vitro and in vivo by means of computerencanced video fluorescence microscopy // Cancer lett.- 1991a 58 - P.37-47.

113. Peng Q., Farrants G.W., Madslien K. et al. Subcellular localisation, redistribution and photobleaching of sulfonated aiuminium phtalocyanines in a human melanoma cells line // Int. J. Cancer.- 1991b.- 49,- P.290-295.94

114. Peng Q., Moan J., Farrants G.W. et al. Localization of patent photosentizers in human tumors LOX by means of laser sanning microscopy // Cancer lett 1991c-58,- P. 17-27.

115. Petersen B.H. et al. The human immune response to KS1/4-desacetylvinblastine (LY256787) and KSl/4-desacetylvinblastine hydraside (LY203728) in sindle and multiple dose clinical studies // Cancer Res. 1991. Vol. 51. P. 2286-2290.

116. Petrides P. E., Bohlen P., Shiveiy 1. E. Chemical characterization of the two forms of epidermal growth factor in murine saliva // Biochem. Biophys. Res. Communs. 1984. Vol. 125. P. 218-228.

117. Pommier Y., Zwelling L.A., Mattern M.R. et al. Effects of dimethylsulfoxide thiourea upon intercalator-induced DNA single- strend breaks in mouse leukemia (1210) cells. Cancer Res. 1983. Vol. 43(12). P. 5718-5724.

118. Potier P. The synthesis of Navelbine prototype of a new series of vinblastine derivatives // Semin. Oncol. 1989. Vol. 16. P. 2-5.

119. Potmesil M., Israel M., Silber R. Two mechanisms of adriamycin-DNA interaction in L1210 cells // Biochem. Pharmacol. 1984. Vol. 33(20). P. 31373142.

120. Quigley G.J., Wang A.H.-J., Ughetto G. et al. Molecular structure of an anticancer drug-DNA complex: daunomycin plus d(CpGpTpApCpG) // PNAS USA. 1980. Vol. 77(12). P. 7204-7208.

121. Rahmani B., Kleisbauer J.P., Cano J.P. et al. Clinical pharmacokinetics of vindesine infusion // Cancer Treat. Rep. 1985. Vol. 69. P. 839-844.

122. Rakowich-Szulczynska E., Koprowski H. Identification of NGF-receptor in chromatin of melanoma cells using monoclonal antibody to cell surface NGF receptor//BBRC. 1986. Vol. 140. P. 174-180.

123. Rao Ch., Ramani N. et al. Topography of human placental receptors for epidermal growth factor//J. Biol. Chem. 1985. Vol. 260. P. 1705-1710.95

124. Ris H.B., Altermatt H.J., Stewart C.M. et al Photodynamic therapy with m-tetra-hydroxyphenylchlorin in vivo: optimization of the therapeutic index/ / Intern. Journal of cancer 1993,- 55,- P. 245-249.

125. Rogers K. E., Tokes Z A. Novel mode of cytotoxicity obtaind by coupling inactive antracycline to a polymer // Biochem. Pharmacol. 1984. Vol. 33(4). P. 605-608.

126. Rogers K. E., Carr B. I., Tokes Z. A. Cell surface-mediated cytotoxicity of polymer-bond adriamycin against drug-resistant hepatocytes // Cancer Res. 1983. Vol. 43(6). P. 2741-2748.

127. Ross W. E., Zwelling L.A., Kohn K. W. Relationship between cytotoxicity and DNA strand breakage produced by adriamycin and other intercalating agents. // Intern. J. of radiation Oncology, Biology, and Physics. 1979. Vol. 5 P 12211225.

128. Rousseau J., Boyle R.W., Maclennan A.H. et al. Biodistribution and tumor uptake of 67Ga. chlorogalliumtetraoctadecyloxy phtalocyanine and its sulfonation products in tumor bearing C3H mice // Int. J. Rad. Appl. Instrum.- 1991- 18 P. 777-782.

129. Salet C., Moreno G. Photosensitization of mitochondria. Molecular and cellular aspects. // Journal of Photochem. And Photobiol. B: Biol. 1990. Vol. 5. P. 133-150.

130. Savage C. R., Cohen S. Epidermal growth factor and a new derivative: rapid isolation procedures and biological and chemical characterization // J. Biol. Chem. 1972. Vol. 247. P. 7609-7611.

131. Savage C. R., Cohen S. Proliferation of corneal epithelium induced by epidermal growth factor//Exp. Eye Res. 1973. Vol. 15. P. 361-366.

132. Schlessinger J. Allosteric regulation of the epidermal growth factor receptors kinese//J. Cell. Biol. 1986. Vol. 103. P. 2067-2072.

133. Schneck D., Butler F. et al. Phase I studies with a murine monoclonal antibody vinca conjugate (KS1/4-DAVLB) in patients with adenicarcinoma // Antibody Immunoconj. Radiopharm. 1989. Vol. 2. P. 93-115.96

134. Schwartz H. S. Mechanism of selective cytotoxisity of adriamycin, daunomycin, and related antracyclines // In: Molecular aspects of anticancer drug action/Eds. S. Neidle, M. J. Waring. London: Mac Millan Press. 1983. P. 93-125.

135. Shen W. G., Ryser J P. cis-Aconityl spacer between daunomycin and macromolecular carriers: A model of pH sensitive linkage releasing drug from a lisosomotropic conjugate. //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1981. Vol. 102. P.1048-1054.

136. Shih L. B., Goldenberg D. M., Xuan H. et al. Internalization of an intact doxorubicin immunoconjugate. // Cancer Immunol. Immunother. 1994. Vol. 38. P.92-98.

137. Shih L. B., Goldenberg D. M., Xuan H. et al. Antracycline immunoconjugates prepared by a site-spesific linkage via an amino-dextran intermediate carrier. // Cancer Res. 1991. Vol 51. P. 4192-4198.

138. Semba K., Kamuta N., Toyoshima K., et al. A v-erb protooncogene, c-erb B-2 is distinct from the c-erB-l-EGF-receptor gene and is amplified in a human salivary gland adenocarcinoma. //PNAS. 1985. Vol.82. P.6497-6501.

139. Sinha B. K., Chignell C. F. Interaction of antitumor drugs with human erythrocyte ghost membranes and mastocytoma P815: a spin label study // Biochem. biophys. Res. Commun. 1979. Vol. 86(4). P. 1051-1057.

140. Soderquist A.M., Carpenter G. Glycosilation of the epidermal growth factor receptor in A-431 cells//J. Biol. Chem. 1984. Vol. 259. P. 12586-12594.

141. Sorensen G.B., Osterlind K., Hansen H.H. Vinca alkaloids in the treatment of non small cell lung cancer // Cancer Treat. Rev. 1987. Vol. 14. P. 29-51.

142. Sorkin A.D. et al. The endocytosis of epidermal growth factor in A-431 cells: a pH of microenvironment and the dynamics of receptor complex dissociation // Exp. Cell Res. 1987. P. 1-14.

143. Spikes J.D., Jori G. Photodynamic therapy of tumors and others disease using porphyrins // Lasers Med. Sci 1986,- 2,- P. 3-15.

144. Starling J. J., Hinson N. A., Marder P. et al. Rapid internalization of antigen-immunocojugate complexes is not required for antitumor activity of monoclonal antibody-drug conjugates. // Antibody Immunoconj. Radiopharm. 1988. Vol. 1. P. 311-324.

145. Taylor J.M. et al. Epidermal growth factor. Physical and chemical properties. //J. Biol. Chem. 1972. Vol. 247. P. 5928-5934.

146. Teslenko L.V., Kornilova E.S. et al. Recycling of epidermal growth factor in A43 1 cells // FEBS Lett. 1987. Vol. 221. P. 105-109.

147. Tewey K. M., Rowe T. C, Yang L. at all. Adriamycin-induced DNA damage mediated by mammalian topoisomerase II. // Scence. 1984. Vol. 226. P.466-469.

148. Tewey K. M., Chen G., L., Nelson E. M., Liu L. F. Interactiv antitumor drugs interfere with the breakage-reunion reaction of mammalian DNA topoisomerase II.- J. biol. Chem. 1984. Vol. 259(14). P. 9182-9187.

149. Tokes Z. A., Rogers K. E., Rembaum A. Synthesis of adriamycin coupled polyglytaraldehyde microspheres and the evaluation of their cytostatic activity // PNAS USA. 1982. Vol. 79. P. 2026-2030

150. Tokunada A., Ouda ML, Okuda T. et al. Clinical significance of epidermal growth factor, epidermal growth factor receptor and c-erb B-2 in human gastric cancer//Cancer. 1995. Vol. 65. P. 1418-1425.

151. Trail P. A., Willner D, Lasch S. J. et al. Cure of xenografted human carcinomas by BR96-doxorubicin immunoconjugates. // Scence. 1993. Vol. 261. P. 212-215

152. Tritton T. R., Yee G. The anticancer agent adriamycin can be actively cytotoxic without entering cells // Science. 1982. Vol. 217. P. 248-250.

153. Tritton T. R. Cell surface actions of adriamycin. // Pharmac.Ther. 1991. Vol. 49. P. 293-309.

154. Valenzeno D. Photomodification of biological membranes with emphasis on singlet oxygen mechanisms // Photochem. Photobiol 1987,- 46,- P. 146-160.

155. Van Hillegersberg R., Kort W.J., Wilson J.M. Current status of photodynamic therapy in oncology//Drugs 1994.-48.-P.510-527.

156. Weber B. et al. A United States multicenter phase II trial of Navelbine in advanced breast cancer // Proceedings ASCO. 1993. Abst n 46. P. 61.

157. Werth D., Pastan I. Vinculin phosphrylation in response to calcium and phorbol esters in intact cells//J. Biol. Chem. 1984. Vol. 259. P. 5264-5270.

158. Willingham M. C., Haigler H. T., Fitzgerald D. J., Gallo M. G., Rutherford A. V., Pastan I. H. The morphologic pathway of binding and internalization of epidermal growth factor in cultured cells// Exp. Cell Res. 1983. Vol.146. P. 163175.

159. Yarden Y., Gabbay M., Schlessinger J. Primary amines do not prevent the endocytosis of epidermal growth factor into 3T3 fibroblasts // Biochim. biophys. acta. 1981. Vol. 674. P. 188-203.

160. Yang M.M., Reisfeld R.A. Doxorubicin conjugated with a monoclonal antibody directed to a human melanoma-associated proteoglycan supresses the growth of established tumor xenografts in nude mice. // Proc. Natl. Acad. Sci. 1988. Vol. 85. P. 1189-1193.

161. Zidovetski R., Yarden G. et al. Microaggregation of hormone-occupied epidermal growth factor receptors on plasma membrane preparations // Eur. Mol. Biol. Org. 1986. Vol. 5. P. 247-250.

162. Zweier J. L. Reduction of O by iron-adriamycin // J. biol. Chem. 1984. Vol. 259(10). P. 6056-6058.