Механизмы формирования белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Абаева, Анастасия Александровна

• Абаева, Анастасия Александровна
• кандидат наук
• 2014

Оглавление диссертации кандидат наук Абаева, Анастасия Александровна

Оглавление

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1 Гемостаз

1.2 Тромбоциты

1.3 Субпопуляции активированных тромбоцитов

1.4 Мембранные реакции

1.5 Влияние температуры на свертывание крови

1.6 Трансглутаминазы

1.6.1 Общие сведения о трансглутаминазах

1.6.2 Фактор XIII

1.6.3 Тканевая трансглутаминаза

Постановка задачи

Глава 2. Материалы и методы

2.1 Материалы

2.1.1 Реагенты

2.2 Методы

2.2.1 Выделение отмытых тромбоцитов

2.2.2 Получение свободной от тромбоцитов плазмы

2.2.3 Титрование активных сайтов тромбина

2.2.4 Проточная цитометрия

2.2.5 Микроскопия

2.2.6 Планшетный спектрофотометр

2.3 Статистическая обработка данных

Глава 3. Результаты

3.1 Роль трансглутаминаз и полимеризации фибрина в формировании покрытия из фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов

3.1.1 Изучение кинетики формирования двух субпопуляций тромбоцитов и распределения покрытия из фибриногена на их поверхности

3.1.1 Выявление механизмов формирования проагрегаторной активности прокоагулянтных тромбоцитов

3.2 Роль полимеризации фибрина в формировании покрытия из тромбоспондина на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов

3.3 Роль трансглутаминаз в формировании прокоагулянтной активности активированных тромбоцитов

3.3.1 Разработка методов количественного измерения прокоагулянтной активности тромбоцитов

3.3.2 Зависимость прокоагулянтной активности тромбоцитов от степени активации

3.3.3 Влияние тканевой трансглутаминазы на регуляцию прокоагулянтной активности

тромбоцитов

Глава 4. Обсуждение

Выводы

Благодарности

Список литературы

Список сокращений и обозначений

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Механизмы формирования белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов»

Введение

Свертывание крови представляет собой сложную сеть биохимических реакций, активирующихся при нарушении целостности сосудистой системы. Целью работы системы свертывания является управляемый локальный переход плазмы из жидкого состояния в желеобразное и, как результат, остановка кровотечения. Любые нарушения в тонком балансе этой системы ведут к тяжелым последствиям, связанных с тромбозами или с кровоточивостью.

Неотъемлемыми участниками свертывания крови являются тромбоциты.

Тромбоциты - специализированные клетки, способные к активации. Будучи

активированными, они принимают участие в процессе свёртывания посредством

формирования тромбоцитарного агрегата в месте повреждения кровеносного сосуда, а

также в ускорении плазменного свертывания, путем предоставления своей отрицательно

заряженной фосфолипидной поверхности для сборки ферментативных комплексов.

Поэтому очень важно понимать механизмы регуляции прокоагулянтной и агрегаторной

активности тромбоцитов. Не так давно было обнаружено, что при активации тромбоцитов

двумя физиологическими агонистами (тромбином и коллагеном), образуются две

отличные группы тромбоцитов, одна из которых характеризуется появлением на внешней

мембране фосфатидилсерина и плотного слоя из а-гранулярных белков [Dale G.L. et al.

2002; Dale G.L. 2005]. Рядом ученых было показано, что основные реакции свертывания

крови, такие как сборка комплекса протромбиназы и внутренней теназы, происходят на

поверхности именно этой субпопуляции тромбоцитов, то есть они более прокоагулянтны.

Эти тромбоциты получили название - прокоагулянтные тромбоциты, хотя в литературе

можно встретить и другие названия. Дальнейшие исследования прокоагулянтных

тромбоцитов показали, что, помимо белков а-гранул, они удерживают на своей

поверхности белки свертывания крови: факторы VIII, Villa (здесь и далее буква "а" после

номера фактора означает его активную форму), IX, IXa [Kempton C.L., Hoffman М. et al.

2005; Panteleev M.A. et al. 2005; London F.S., Marcinkiewicz M et al. 2004]. Этот факт также

свидетельствует в пользу того, что основные реакции свертывания крови происходят на

поверхности этой субпопуляции тромбоцитов. Кроме того, еще одной важной функцией

тромбоцитов, как говорилось выше, является формирование тромбоцитарной пробки.

Традиционно считалось, что прокоагулянтные тромбоциты не способны агрегировать из-

за отсутствия у них активированного GPIIbllla [Dale G.L. et al. 2002; Kulkarni S., Jackson

S.P. 2004; Bachelot-Loza C. et al. 2006; Cosemans J.M. et al. 2008; Heemskerk J.W. et al.

2012]. Однако в недавней работе Якименко А. О. и коллеги показали, что

прокоагулянтные тромбоциты вовлекаются в агрегаты за счет связывания

4

активированными рецепторами GPIIbllla на непрокоагулянтных тромбоцитах свободных концов молекул фибриногена на прокоагулянтных тромбоцитах в составе их белкового покрытия [Yakimenko А.О. et а1]. Таким образом, еще одной важной функцией белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов является вовлечение их в тромбоцитарную пробку. Механизм формирования таких тромбоцитов, как и их способность удерживать на своей поверхности покрытие из белков, на данный момент плохо изучен. Однако было установлено, что трансглутаминазные белки, входящие в число белков, секретируемых тромбоцитами, играют важную роль в формировании прокоагулянтных тромбоцитов [Dale G.L. et al. 2002]. Так, Дж. JI. Дейл с коллегами продемонстрировали в своей работе, что а-гранулярные белки являются субстратами для тромбоцитарных трансглутаминаз (тканевая трансглутаминаза и фактор XHIa). Они показали, что использование ингибиторов трансглутаминаз приводит к блокированию образования прокоагулянтных тромбоцитов, что свидетельствует о возможной роли фактора XHIa и тканевой трансглутаминазы в формировании прокоагулянтных тромбоцитов [Dale G.L. et al. 2002]. Кроме того, Роберт Сзасз с Джорджем Дейлом в 2002 году в своей работе [Szasz R. & Dale G.L. 2002] показали возможный механизм связывания а-гранулярных белков с поверхностью тромбоцитов. В этой модели при активации тромбоцитов белки а-гранул конъюгируют с серотонином через трансглутаминазную реакцию. Затем серотонин-белковые продукты соединения связываются на поверхности клетки с еще не идентифицированным серотониновым рецептором.

Кроме того, существует основание полагать, что белковое покрытие на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов возникает за счет полимеризации фибрина под действием тромбина и пассивного вовлечения остальных белков в нити фибрина [Munnix I.C. etal. 2009].

Таким образом, встает задача исследовать влияние трансглутаминаз и полимеризации фибрина на формирование фибринового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, ответственной за их вовлечение в агрегаты. А также исследовать вопрос о влиянии трансглутаминаз на регуляцию прокоагулянтной активности тромбоцитов, а также их влияние на формирование прокоагулянтных тромбоцитов.

Методы, с помощью которых ранее измеряли прокоагулянтную активность тромбоцитов, не учитывали того, что они делятся на субпопуляции [Kempton C.L., Hoffman М. et al. 2005; London F.S., Marcinkiewicz M et al. 2004]. Поэтому результаты, полученные с помощью этих методов, являются некорректными. Исходя из этого, еще

5

одной задачей данной работы была разработка метода, позволяющего количественно определить прокоагулянтную активность тромбоцитов.. С помощью метода стало бы возможным исследование влияния трансглутаминаз на прокоагулянтную активность тромбоцитов.

Целью данной работы являлось исследование механизмов формирования белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов.

Были поставлены следующие задачи исследования:

1. Исследовать роль трансглутаминаз, а также полимеризации фибрина в формировании белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, ответственной за их вовлечение в агрегаты;

2. Разработать метод, позволяющий количественно характеризовать прокоагулянтную активность тромбоцитов;

3. Исследовать роль тканевой трансглутаминазы в формировании прокоагулянтной активности тромбоцитов.

Научная новизна. В настоящей работе был выявлен механизм формирования белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов. Показано, что определяющую роль в формировании этого покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, играет полимеризация фибрина. Тканевая трансглутаминаза способна формировать покрытие из фибриногена на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, однако значимость этого механизма при активации тромбоцитов тромбином меньше, чем роль полимеризации. Также было разработано два метода количественного измерения прокоагулянтной активности тромбоцитов. Их суть заключалась в сборке ферментативных комплексов на поверхности активированных тромбоцитов: внутренней теназы или протромбиназы и измерении концентраций факторов Ха или Па, соответственно, активированных этими комплексами из предшественников. С помощью метода, основанного на сборке комплекса внутренней теназы, было показано, что добавление тканевой трансглутаминазы при активации или после нее не меняет прокоагулянтную активность тромбоцитов. При этом количество прокоагулянтных тромбоцитов при добавлении тканевой трансглутаминазы во время их активации остается неизменным.

Научно-практическим значением результатов данной работы является вклад в понимание свойств субпопуляций активированных тромбоцитов и их (пато)физиологической роли. Результаты данной работы могут быть использованы для создания новых методов антитромботической терапии, в диагностике тромбоцитопатий, а также иных нарушений гемостаза.

Положения, выносимые на защиту:

1. Полимеризация фибрина играет определяющую роль в формировании белкового покрытия на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов.

2. Трансглутаминазы способны формировать белковое покрытие на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов, однако значимость этого механизма при активации тромбоцитов тромбином меньше, чем роль полимеризации.

3. Разработано два метода, позволяющих количественно характеризовать прокоагулянтную активность тромбоцитов, основанных на сборке ферментативных комплексов протромбиназы и внутренней теназы на поверхности активированных тромбоцитов.

4. Тканевая трансглутаминаза не влияет на прокоагулянтную активность тромбоцитов, а также не влияет на количество прокоагулянтных тромбоцитов.

Глава 1. Обзор литературы 1.1 Гемостаз

Система гемостаза - это совокупность компонентов кровеносных сосудов, крови и их взаимодействий, которая обеспечивает поддержание целостности кровеносных сосудов, жидкое состояние крови внутри сосудов и остановку кровотечения при повреждении сосуда.

В остановке кровотечения участвуют сосудистое, тромбоцитарное и плазменное звенья гемостаза. Незамедлительной реакцией на травму является вазоконстрикция -сокращение гладких мышц эндотелия сосудов под действием веществ, секретируемых активированными тромбоцитами. Она приводит к сужению просвета кровеносного русла и уменьшению кровотока, что улучшает взаимодействие между тромбоцитами, факторами свертывания крови и поврежденным участком. В случае небольшой травмы вазоконстрикция может остановить кровотечение, но при обширном кровотечении она только снижает кровопотерю [Шиффман Ф.Дж. 2000].

При повреждении сосудистой стенки, покрытой эндотелием, в кровь начинают выбрасываться вещества, вызывающие активацию тромбоцитов. Будучи активированными они приклеиваются к повреждённым тканям и друг к другу, формируя агрегаты. В результате на месте повреждения образуется сравнительно рыхлая тромбоцитарная пробка, предотвращающая потерю клеток крови, но не плазмы [Пантелеев М.А., Атауллаханов Ф.И. 2008].

После образования тромбоцитарного сгустка степень сужения кровеносных сосудов уменьшается, что могло бы привести к вымыванию сгустка и возобновлению кровотечения. Однако к этому времени значительный вклад в образование сгустка начинает вносить плазменное свертывание, в ходе которого образуется фибрин, волокна которого после полимеризации образуют основу сгустка, прочно скрепляя тромбоциты и захваченные эритроциты. Через несколько часов происходит ретракция (сжатие) сгустка. Благодаря ей сгусток становится более плотным и стягивает края раны,что облегчает ее закрытие клетками соединительной ткани. По мере репарации поврежденных тканей происходит лизис сгустка системой фибринолиза, которая запускается одновременно с плазменной системой свертывания [Шмидт Р, Тевс Г.2005]

In vivo все элементы системы гемостаза находятся в тесном взаимодействии. Так, тромбоциты могут быть активированы одним из главных белков системы свертывания -тромбином. В свою очередь, после активации они предоставляют фосфолипидную поверхность, необходимую для прохождения реакций системы свертывания (их

поверхность становится прокоагулянтной вследствие изменения ее фофсолипидного состава), а также секретируют десятки веществ, воздействующих на все звенья гемостаза, в том числе факторы свертывания V и XI, фактор Виллебрандта, фибриноген и ряд ингибиторов свертывания.

В литературе чаще всего механизмы гемостаза группируют в две категории: первичный - сосудисто-тромбоцитарный, вторичный - плазменный гемостаз. Эти названия отражают существующие наблюдения: первичный гемостаз реагирует на повреждение наиболее быстро (1-3 мин), а вторичный делает сгусток прочным и предотвращает возникновение кровотечения (характерное время около 10 мин) [Шмидт Р, Тевс Г. 2005].

В зависимости от условий, каждый из механизмов может работать независимо от остальных. Вазоконстрикция может сама по себе обеспечить остановку кровотечения в маленьком сосуде [Шмидт Р, Тевс Г. 2005], но более крупные сосуды заметным образом не пережимаются. Тромбоцитарное свертывание лучше всего проходит в сосудах с быстрым течением, которое способно обеспечить эффективный принос тромбоцитов к месту повреждения и их адгезию; только потом этот агрегат "прорастает" фибриновой сеткой [Falati S et al. 2002]. Наоборот, для плазменной системы свертывания поток, вымывающий активные ферменты, является только помехой [Beltrami Е, Jesty J. 2001]. Она лучше функционирует при медленном потоке, т.к. поток уносит активные ферменты и мешает ее работе.

1.2 Тромбоциты

Как уже говорилось, одними из главных участников свертывания крови являются тромбоциты. Остановимся подробнее на их рассмотрении.

Тромбоциты представляют собой безъядерные клетки крови, присутствующие в ней в концентрации 150-300 тыс/мкл и являющиеся первой защитой организма при повреждении сосуда. Диаметр этих клеток (в направлении наибольшей длины) 1-4 мкм, а толщина 0,5-0,75 мкм. Тромбоциты образуются в костном мозгу путём отщепления участков цитоплазмы от гигантских клеток - мегакариоцитов, из каждой такой клетки может возникнуть до 1000 тромбоцитов. Тромбоциты циркулируют в крови в течение 5-11 дней и затем разрушаются в печени, лёгких и селезёнке. [Шмидт Р, Тевс Г. 2005]

Особенностью тромбоцитов является его способность к активации - быстрому и, как правило, необратимому переходу в новое состояние. Стимулом активации может служить практически любое возмущение окружающей среды, вплоть до простого

механического напряжения. Однако основными физиологическими активаторами тромбоцитов считаются:

• коллаген [Clemetson K.J., Clemetson J.M. 2007] - фибриллярный белок, составляющий основу соединительной ткани организма и обеспечивающий ее прочность и эластичность. Все кровеносные сосуды выстланы изнутри слоем эндотелия, при повреждении кровеносного сосуда волокна коллагена обнажаются и активируют циркулирующие в крови тромбоциты;

• тромбин [Clemetson K.J., Clemetson J.M. 2007, Heemskerk J.W. et al. 2002, Goldsack N.R. 1988]- глобулярный белок, играет ключевую роль в каскаде свертывания крови, переводя растворимый фибриноген в нерастворимый фибрин, который полимеризуясь, формирует сгусток. Кроме того, тромбин способен активировать тромбоциты;

• адф (аденозиндифосфат) [Clemetson K.J., Clemetson J.M. 2007, Gachet С. 2001, Reed G.L. 2007]- появляется из разрушенных клеток сосуда или секретируется самими тромбоцитами. Он также может получаться из АТФ под действием нуклеотидаз, присутствующих в плазме и на мембранах клеток крови;

• тромбоксан А2 [Clemetson K.J., Clemetson J.M. 2007, Reed G.L. 2007]- вторичный активатор, синтезируемый и выбрасываемый тромбоцитами, его дополнительная функция заключается в стимуляции вазоконстрикции.

Связываясь с соответствующими рецепторами на мембране тромбоцита, эти вещества способны переводить его в активированное состояние. Ниже перечислены основные виды ответов тромбоцита при его активации [Шмидт Р, Тевс Г. 2005].

• Изменение формы. За счет реорганизации актинового цитоскелета дисковидные тромбоциты становятся шарообразными и начинают формировать псевдоподии при их активации в суспензии или распластываются по поверхности при адгезии [Hartwig J.H. 1992; Fox J.E. 2001].

• Адгезия. Активированные тромбоциты приобретают способность прикрепляться к коллагену, а также к поверхностям, покрытым различными белками, в частности, фибриногену, за счет соответствующих рецепторов. Однако способностью к адгезии обладают и неактивированные тромбоциты. Их первичное прикрепление к месту повреждения при высоких скоростях потока происходит за счет связывания тромбоцитарных гликопротеинов (GP) Ib-V-IX с фактором Виллебранда, адсорбирующимся из плазмы крови на коллагеновых

волокнах. Последующее упрочнение связывания тромбоцитов с местом повреждения происходит последовательно посредством сигнализации через GPVI, связавшегося с коллагеном, активацию другого коллагенового рецептора интегрина (Х2Р1 и активацию GPIIbllla, важнейшего рецептора, ответственного за контакты клеток друг с другом и с эндотелием сосудов [Auger J.M. et al. 2005; NuyttensB.P. etal. 2011].

• Агрегация. Активированные тромбоциты приобретают способность скрепляться друг с другом, благодаря чему место повреждения закрывается тромбоцитарным тромбом. Главный механизм агрегации тромбоцитов связан с активацией трансмембранного белка интегрина allbp3 (GPIIbllla), который приобретает способность связывать свои лиганды - фибриноген, фактор Виллебранда, тромбоспондин и другие [Plow E.F. et al. 2007].

• Секреция. В тромбоцитах имеются гранулы, содержащие различные вещества, которые при активации тромбоцитов выплескиваются во внеклеточное пространство. В плотных гранулах содержатся нуклеотиды (АТФ, АДФ, ГТФ, ГДФ) и ионы кальция в высокой концентрации. Альфа-гранулы содержат такие высокомолекулярные вещества, как Р-селектин, фактор Виллебранда, фибронектин, фибриноген, тромбоспондин, а также некоторые хемокины и факторы свертывания крови. Кроме того, при активации тромбоцита активируется ферментативная система, катализирующая синтез тромбоксана А2 из арахидоновой кислоты, который тоже затем секретируется из клетки [Flaumenhaft R. 2003; Reed G.L. 2007].

• Формирование прокоагулянтной поверхности и везикуляция. В нормальном

состоянии мембрана тромбоцитов не поддерживает реакций свертывания. В

неактивированном тромбоците две стороны мембраны имеют различный

фосфолипидный состав: на внешней стороне мембраны преимущественно

находятся фосфатидилхолин и сфингомиелин, на внутреннем слое мембраны

сосредоточены отрицательно заряженные фосфолипиды - фосфатидилсерин и

фосфотидилэтаноламин. Это равновесие поддерживается работой 3-х ферментов:

АТФ-зависимая аминофосфолипидная транслоказа, АТФ-зависимая флопаза,

кальций-зависимая скрамблаза. АТФ-зависимая аминофосфолипидная транслоказа

быстро транспортирует фосфатидилсерин и фосфотидилэтаноламин с внешнего на

внутренний слой против градиента концентрации. АТФ-зависимая флопаза

медленно переносит с внутреннего слоя мембраны на внешний слой

фосфолипиды. Скрамблаза кальций-зависимо приводит к фосфолипидному

11

выравниванию асимметричности мембраны клетки при ее активации. Таким образом, на внешнем слое мембраны появляется большое количество отрицательно заряженного фосфатидилсерина, который необходим для связывания факторов свертывания [Zwaal R.F, Schreit A.J. 1997]. Поверхность тромбоцита становится прокоагулянтной (поддерживающей реакции свертывания), на ней формируются комплексы внутренней теназы [van Dieijen G. et al. 1981] и протромбиназы [Rosing J. et al. 1980], ускоряющие работу плазменного гемостаза на несколько порядков [Zwaal R.F. et al. 1998]. При активации от поверхности тромбоцитов также отшнуровываются микровезикулы или микрочастицы, фрагменты плазматической мембраны размером до 1 мкм, поверхность которых также является прокоагулянтной [Nieuwland R., Sturk А. 2007]. Физиологическая роль везикуляции на данный момент не ясна [Siljander P.R. 2011].

Стоит сразу отметить, что различная активация ведет к разным комбинациям описанных выше тромбоцитарных ответов [Heemskerk J.W. et al. 2002].

1.3 Субпопуляции активированных тромбоцитов

В течение многих лет исследователи предполагали, что свойства тромбоцитов при активации одинаковы, точнее, что различия между отдельными клетками не превышают обычных статистических разбросов. Только в конце 90-х годов начали появляться работы, свидетельствующие о появлении различия внутри популяций активированных тромбоцитов. [Feng Р, Tracy P.B. 1998, Pasquet J.M. et al. 1998, Heemskerk J.W. et al. 1997, Patel D. et al. 2003]

Однако официальной точкой открытия нового подкласса тромбоцитов

("укутанные" тромбоциты) можно считать работу Альберто JI. и его команды в 2000 году

[Alberio L. et al. 2000]. Они обнаружили, что при активации тромбоцитов тромбином с

коллагеном выделяется субпопуляция клеток, экспрессирующих на свою поверхность

большое количество а-гранулярного фактора V. Такие тромбоциты были названы "СОАТ-

FV" (коллаген и тромбин активированные тромбоциты с фактором V). Дальнейшие

исследования показали, что эти тромбоциты экспрессируют на свою поверхность большое

количество фосфотидилсерина. Кроме того, Альберто JI. с соавторами показали, что они

способны связывать фактор Ха, т.е. эта субпопуляция клеток прокоагулянтна [Alberio L. et

al. 2000]. В 2002 году Д.Дейл и коллеги показали, что COAT-FV тромбоциты не только

экспрессируют на свою поверхность фактор V и фосфотидилсерин, но и удерживают на

своей поверхности большое количество других а-гранулярных белков. В результате чего

12

им дали другое название «СОАТ» тромбоциты (т.е. тромбоциты, активированные коллагеном и тромбином), кроме того, это название отражает тот факт, что тромбоциты как бы "укутаны" в шубку из белков [Dale G.L. et al. 2002]. Однако одного четкого определения "укутанных" тромбоцитов не существует. Это связано с тем, что при активации тромбоцитов различными агонистами отделяющаяся субпопуляция не всегда имеет фиксированный набор свойств, отличающих ее от остальных тромбоцитов. Чаще всего "укутанными" тромбоцитами называют субпопуляцию клеток с большим количеством а-гранулярных белков и фосфатидилсерина на поверхности, появляющуюся при сильной активации тромбоцитов (тромбином, конвульксином, тромбином с конвульксином). В литературе можно встретить и другие названия "укутанных" тромбоцитов - некротические тромбоциты [Jackson S.P., Schoenwaelder S.M. 2010], SCIP-тромбоциты (тромбоциты, индуцированные повышенной концентрацией внутриклеточного кальция) [Kulkarni S., Jackson S.P. 2004], прокоагулянтные тромбоциты [Heemskerk, J. W. 2012]. В данной работе мы будем называть их прокоагулянтными тромбоцитами.

Механизмы внутриклеточной сигнализации, приводящие к разделению тромбоцитов на две субпопуляции, плохо изучены. Предположение, что тромбоциты до активации принадлежат к той или иной субпопуляции, не находит подтверждения, так как количество образующихся прокоагулянтных тромбоцитов можно менять, варьируя активаторы и их концентрацию [Kempton C.L. et al. 2005]. Было показано, что в формировании прокоагулянтных тромбоцитов играет роль гамма-цепь Fc-рецептора (FcRy), сопряженная с гликопротеином VI [Jobe S.M. et al. 2005]. Также митохондриальная пора (МРТР), по-видимому, является важным участником в формировании прокоагулянтных тромбоцитов, так как эффекторы образования МРТР регулируют появление прокоагулянтных тромбоцитов [Jobe S.M. et al. 2008]. Последнее обстоятельство и экспрессия прокоагулянтными тромбоцитами фосфатидилсерина привели к активному обсуждению в литературе возможной связи формирования прокоагулянтных тромбоцитов с процессами клеточной гибели, апоптозом и некрозом [Jackson S.P., Schoenwaelder S.M. 2010]. Было также показано, что прокоагулянтные тромбоциты характеризуются повышением концентрации внутриклеточного кальция [Topalov N.N. et al. 2012].

Дальнейшие исследования показали, что активация тромбоцитов тромбином в сочетании с конвульксином приводила к образованию субпопуляции тромбоцитов с высоким уровнем связывания на поверхности не только а -гранулярных белков, но также факторов VIII, IX, X [Kempton C.L. et al. 2005]. Кроме того, было показано, что доля

13

данной группы тромбоцитов дозо-зависимо увеличивается от повышения концентрации конвульксина при двойной активации тромбином с конвульксином. Также обнаружили, что процент тромбоцитов, которые выставляли фосфатидилсерин, измеренный связыванием аннексина V, коррелировал с процентным содержанием тромбоцитов с увеличенным связыванием коагуляционных факторов. Более того было показано, что эта субпопуляция тромбоцитов появляется как раз в тот момент, когда генерация тромбина и фактора Ха комплексами протромбиназы и внутренней теназы, соответственно, достигает своего максимума [Kempton C.L. et al. 2005].

Пантелеев М.А. с коллегами в своей работе показал, что при активации тромбоцитов тромбином образуются две субпопуляции и их отношение зависит от концентрации тромбина. Они также продемонстрировали, что одна из этих субпопуляций имеет высоко связующую способность для коагуляционных факторов (фактор 1Ха, фактор VIII и фактор X) и что эта та же самая субпопуляция, которая имеет высокий уровень фосфатидилсерина на своей поверхности. [Panteleev М.А. et al. 2005]

Также было обнаружено, что при активации тромбоцитов тромбином или PAR1-активирующем пептидом (SFLLRN) образуется субпопуляция тромбоцитов с высоким уровнем фосфатидилсерина, которая еще была способна связывать фактор 1Ха. Кроме того, с увеличением концентрации активатора процент этой субпопуляции доза-зависимо увеличивался. Более того было показано, что увеличение концентрации активатора также ведет к увеличению концентрации фактора Ха, активированного комплексом внутренней теназы [London F. S. et al. 2004]

Таким образом можно заключить, что прокоагулянтные тромбоциты способны удерживать на своей поверхности не только белки а-гранул, но и белки свертывания крови: факторы VIII, Villa, IX, IX [Kempton C.L. et al. 2005; Panteleev M.A. et al. 2005; London F. S. et al. 2004]. Кроме того, рядом ученых было показано, что именно на поверхности прокоагулянтных тромбоцитов происходят основные реакции плазменного звена системы свертывания крови [London F. S. et al. 2004; Kempton C.L. et al. 2005]. Одна из этих реакций состоит в активации фактора X, присутствующего в крови в виде неактивного предшественника. Эта реакция катализируется связанными с мембраной прокоагулянтного тромбоцита факторами Villa и 1Ха. Другая реакция катализирует превращение протромбина в тромбин, она ускоряется благодаря формированию комплекса факторами Va и Ха и также происходит на поверхности прокоагулянтного тромбоцита (Подробнее эти реакции будут рассмотрены в п. 1.4).

Описанные реакции являются важнейшими элементами каскада свертывания крови, играя значительную роль в регуляции свертывания, что может указывать на

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Абаева, Анастасия Александровна, 2014 год

Список литературы

1. Ahmad SS, London FS, Walsh PN. "The assembly of the factor X-activating complex on activated human platlets". Journal of Thrombosis and Haemostasis 2002, 1: 48-59

2. Auger J.M., Kuijpers M.J., Senis Y.A., Watson S.P., Heemskerk J.W. "Adhesion of human and mouse platelets to collagen under shear: a unifying model". FASEB J. 2005,19(7): 825827

3. Bachelot-Loza C., Badol P., Brohard-Bohn В., Fraiz N., Cano E., Rendu F. "Differential regulation of platelet aggregation and aminophospholipid exposure by calpain". Br J Haematol 2006; 133(4): 419-426

4. Bajaj SP, Harmony JA, Martinez-Carrion M, Castellino FJ. "Human plasma lipoproteins as accelerators of prothrombin activation". J Biol Chem 1976, 251: 5233-5236

5. Bale M. D., Westrick L. G., and Mosher D. F. "Incorporation of thrombospondin into fibrin clots" J. Biol. Chem. 1985, 260, 7502-7508

6. Beltrami E, Jesty J. "The role of membrane patch size and flow in regulating a proteolytic feedback threshold on a membrane: possible application in blood coagulation". Mathematical Biosciences 2001, 172: 1-13

7. Carla Esposito and Ivana Caputo. Mammalian transglutaminases. "Identification of substrates as a key to physiological function and physiopathological relevance". The FEBS Journal 272 (2005) 615-631, 2004

8. Clemetson KJ, Clemetson JM.Platelet receptors. In: Michelson AD ed., Platelets Academic Press, pp. 117-145, 2007

9. Clemetson KJ, Clemetson JM. "Collagen Receptors as Potential Targets for Novel Anti-Platelet Agents". Current Pharmaceutical Design 2007, 13, 2673-2683

10. Cosemans J.M., Iserbyt B.F., Deckmyn H., Heemskerk J.W. "Multiple ways to switch platelet integrins on and off'. J Thromb Haemost. 2008,6(8): 1253-1261

11. Cox A.D., Cevine D.V.. "Factor XIHa binding to activated platelets is mediated through activation of glycoprotein Ilb-IIIa", Blood 1994, 83(4): 1006-1016

12. Dale GL. "Coated-platelets: an emerging component of procoagulant response". Journal of Thrombosis and Haemostasis 2005, 3: 2185-2192,

13. Dale GL, Friese P, Batar P, Hamilton SF, Reed GL, Jackson KW, Clemetson KJ, Alberio L. "Stimulated platelets use serotonin to enhance their retention of procoagulant proteins on the cell surface". Nature 2002, 415:175-179

14. Falati S, Gross P, Merrill-Skoloff G, Furie ВС, Furie B. "Real-time in vivo imaging of platelets, tissue factor and fibrin during arterial thrombus formation in the mouse". Nature Medicine 2002, 8: 1175-1181

15. Feng P, Tracy PB. "Not all platelets are equal procoagulants?" Blood 1998, 98: Suppl. 350a, 1441 (abstr.)

16. Flaumenhaft R. "Molecular basis of platelet granule secretion". Arterioscler Thromb Vase Biol. 2003,23: 1152-1160

17. Fox S.C., Sasae R., Janson S., May J. A., Heptinstall S. "Quantitation of platelet aggregation and microaggregate formation in whole blood by flow cytometry". Platelets 2004, 15(2): 8593

18. Gachet Christian. "ADP receptors of platelets and their inhibition". Journal of Thrombosis and Haemostasis 2001, 86, 222-232

19. Greenberg CS, Birckbichler PJ, Rice RH. "Transglutaminases: multifunctional cross-linking enzymes that stabilize tissue". The FASEB Journal 1991, 5: 3071-3077

20. Griffin M, Casadio R, Bergamini CM. "Transglutaminases: nature's biological glues". Biochemical Journal 2002, 368: 377-396

21. Goldsack NR, Chambers RC, Dabbagh K, Laurent LG. "Molecules in focus thrombin". The International Journal of Biochemistry & CellBiology 1988, 641-646

22. Hartwig J.H. "Mechanisms of actin rearrangements mediating platelet activation". J Cell Biol. 1992, 118(6): 1421-1442

23. Heemskerk J.W., Mattheij N.J., Cosemans J.M. "Platelet-based coagulation: different populations, different functions". J Thromb Haemost. 2012

24. Heemskerk JW, Bevers EM, Lindhout T. "Platelet activation and blood coagulation", Journal of Thrombosis and Haemostasis 2002, 88(2): 186-193

25. Heemskerk JWM, Vuist WM., Feijge MAH, Reutelingsperger CPM, Lindhout T. "Collagen but not fibrinogen surfaces induce bleb formation, exposure of phosphatidylserine, and procoagulant activity of adherent platelets: evidence for regulation by protein tyrosine kinase-dependent Ca2+ responses". Blood 1997, 90(7): 2615-2625

26. Jackson S.P., Schoenwaelder S.M. "Procoagulant platelets: are they necrotic?" Blood 2010, 116:2011-2018

27. Jobe S.M., Leo L., Eastvold J.S., Dickneite G., Ratliff T.L., Lentz S.R., Di Paola J. "Role of FcRy and factor XHIa in coated platelet formation". Blood 2005,106(13): 4146-4151

28. Jobe S.M., Wilson K.M., Leo L., Raimondi A., Molkentin J.D., Lentz S.R., Di Paola J. "Critical role for the mitochondrial permeability transition pore and cyclophilin D in platelet activation and thrombosis". Blood 2008, 111: 1257-1265

29. Kempton C.L., Hoffman M., Roberts H.R., Monroe D.M. "Platelet heterogeneity: variation on coagulation complex on platelet subpopulations". Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular. Biology 2005, 25: 861-866

30. Kulkarni S., Jackson S.P. "Platelet factor XIII and calpain negatively regulate integrin alphallbbeta3 adhesive function and thrombus growth". J Biol Chem. 2004, 279(29): 3069730706

31. Lawson JH, Kalafatis M, Stram S, Mann KG. "A model for the tissue factor pathway to thrombin. I. An empirical study". J Biol Chem 1994, 269: 23357-23366

32. Lee K.N., Birckbichler P.J., Patterson M.K, Jr. "GTP hydrolysis by guinea pig liver transglutaminase", Biochemical and biophysical research communications 1989, 162: 13701375

33. London FS, Marcinkiewicz M, Walsh PN. "A subpopulation of platelets responds to thrombin- or SFLLRN-stimulation with binding site for factor IXa". Journal of Biological Chemistry 2004, 279(19): 19854-19859

34. London FS, Walsh PN. "Zymogen factor IX potentiates factor IXa-catalyzed factor X activation". Biochemistry 2000, 39, 9850-9858

35. Lorand L, Parameswaran KN, Velasco PT, Hsu LK, Siefring GE. Jr. "New colored and fluorescent amine substrates for activated fibrin stabilizing factor (Factor XHIa) and for transglutaminase". Analytical Biochemistry 1983, 131(2): 419-425

36. Meng ZH, Woldberg AS, Monroe DM, Hoffman M. "The Effect of temperature and pH on activity of factor Vila: Implications for the efficacy of high-dose factor Vila in hypothermic and acidotic patients". Journal of Trauma-Injury Infection & Critical Care 2003, 55: 886-891

37. Mattheij, N. J., Gilio, K., Kruchten, R. V., Jobe, S. M., Wieschhaus, A. J., Chishti, A. H., Collins, P., Heemskerk, J. W., and Cosemans, J. M. "Dual mechanism of integrin alphallbbeta3 closure in procoagulant platelets" J. Biol. Chem 2013

- 38. Monkovic DD, Tracy PB. "Activation of human factor V by factor Xa and thrombin". Biochemistry 1990, 29: 1118-1128

39. Munnix IC, Kuijpers M J, Auger J, Thomassen CM, Panizzi P, Van Zandvoort M A, Rosing J, Bock PE, Watson SP, Heemskerk JW. "Segregation of platelet aggregatory and procoagulant microdomains in thrombus formation regulation by transient integrin activation". Arterioscler Thromb Vase Biol. 2007, 27: 1-7

40. Munnix I.C.A., Cosemans J.M., Auger J.M., Heemskerk J.W. "Platelet response heterogeneity in thrombus formation". Thromb Haemost. 2009,102(6): 1149-1156

41. Nieuwland R., Sturk A. Platelet-derived microparticles. In: Michelson A.D. Platelets (second edition). Elsevier Inc. 2007, 403-415

42. Nemerson Y, Gentry R. "An ordered addition, essential activation model of the tissue factor pathway of coagulation: evidence for a conformational cage". Biochemistry 1986, 25: 40204033

43. Nuyttens B.P., Thijs T., Deckmyn H., Broos K. "Platelet adhesion to collagen". Thromb Res. 2011, 127(Suppl. 2): S26-S29

44. Panteleev MA, Ananyeva NM, Greco NJ, Ataullakhanov FI, Saenko EL. "Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex". Journal of Thrombosis and Haemostasis 2005, 3: 2545-2553

45. Panteleev MA, Ananyeva NM, Greco NJ, Ataullakhanov FI. "Factor Villa regulates substrate delivert to the intrinsic factor X-activating complex", The FEBS Journal 2006, 273, 374-387

46. Pasquet J.M., Dachary-Prigent J., Nurden A.T. "Microvesicle release is associated with extensive protein tyrosine dephosphorylation in platelets stimulated by A23187 or a mixture of thrombin and collagen". Biochem J. 1998, 333(Pt 3): 591-599

47. Patel D., Vaananen H., Jirouskova M., Hoffmann T., Bodian C., Coller B.S. "Dynamics of GPIIb/IIIa-mediated platelet-platelet interactions in platelet adhesion/thrombus formation on collagen in vitro as revealed by videomicroscopy". Blood 2003, 101(3): 929-936

48. Peerschke E. I. "Bound fibrinogen distribution on stimulated platelets. Examination by confocal scanning laser microscopy" Am. J. Pathol. 1995, 147, 678-687

49. Plow E.F., Pesho M.M., Ma Y.Q. Integrin allbp3. In: Michelson A.D. Platelets (second edition). Elsevier Inc. 2007, 165-179

50. Prodan CI, Joseph PM, Vincent AS, Dale GL. "Coated-platelet levels are influenced by smoking, aspirin, and selective serotonin reuptake inhibitors", Journal of Thrombosis and Haemostasis 2007, 5: 2149-2151

51. Reed GL. Platelet secretion. In: Michelson AD ed., Platelets Academic Press 2007, pp. 309319

52. Rosing J., Tans G., Govers-Riemslag J.W., Zwaal R.F., Hemker H.C. "The role of phospholipids and factor Va in the prothrombinase complex". J Biol Chem. 1980, 255: 274283

53. Szasz R, Dale GL. "COAT platelets". Current opinion in hematology 2003, 10, 351-355

54. Siljander P.R. "Platelet-derived microparticles - an updated perspective". Thromb Res. 2011, 127(Suppl 2): S30-S33

55. Sims PJ, Wiedmer T, Esmon CT, Weiss HJ, Shattil SJ. "Assembly of the platelet prothrombinase complex is linked to vesiculation of the platelet plasma membrane. Studies in Scott syndrome: an isolated defect in platelet procoagulant activity". J Biol Chem 1989 264: 17049-17057

56. Sinauridze EI, Kireev DA, Popenko NY, Pichugin AV, Panteleev MA, Krymskaya OV, Ataullakhanov FI. "Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fold higher specific procoagulant activity than activated platelets". Thromb Haemost 2007, 97: 425434

57. Schwartz M.L., Pizzo S.V., Hill R.L., McKee P.A. " The Subunit structure of human plasma and platelet factor XIII (Fibrin-stabilizing factor)", Journal of Biological Chemistry 1971, 246(18): 5851-5854

58. Szasz R, Dale GL. "COAT platelets". Current opinion in hematology. 10, 351-355, 2003

59. Szasz R., Dale G.L. "Thrombospondin and fibrinogen bind serotonin-derivatized proteins on COAT-platelets". Blood 2002, 100: 2827-2831

60. Topalov N.N., Kotova Y.N., Vasil'ev S.A., Panteleev M.A. "Identification of signal transduction pathways involved in the formation of platelet subpopulations upon activation". British Journal of Haematology 2012, 157(1): 105-115

61. van Dieijen G., Tans G., Rosing J., Hemker H.C. "The role of phospholipid and factor Villa in the activation of bovine factor X". J Biol Chem. 1981, 256: 3433-3442

62. Valaydon Z.S., Lee P., Dale G.L., Januszewski A.S., Rowley K.G., Nandurkar H., Karschimkus C., Best J.D., Lyons T.J., Jenkins A.J. "Increased coated-platelet levels in chronic haemodialysis patients". Nephrology (Carlton) 2009, 14: 148-154

63. Wang DS, Dickson DW, Maker JS. "Tissue Transglutaminase, protein cross-linking and Alzheimer 's disease: Review and Views". International Journal of Clinical and Experimental Pathology 2008, 1: 5-18

64. Weiss H.J., Hoyer L.W., Rickles F.R., Varma A., Rogers J. "Quantitative assay of a plasma factor deficient in von Willebrand's disease that is necessary for platelet aggregation. Relationship to factor VIII procoagulant activity and antigen content". J Clin Invest. 1973, 52(11): 2708-2716

65. Wolberg AS, Meng ZH, Monroe DM, Hoffman MM. "A Systematic Evaluation of the Effect of Temperature on Coagulation Enzyme Activity and Platelet Function". Journal of TraumaInjury Infection & Critical Care 2004, 65: 1221-1228

66. Yakimenko, A. O., Verholomova, F. Y., Kotova, Y. N., Ataullakhanov, F. I., and Panteleev, M. A. "Identification of different proaggregatory abilities of activated platelet subpopulations". Biophys. J. 2012, 102, 2261-2269

67. Zwaal R.F., Schroit A.J. "Pathophysiologic implications of membrane phospholipid asymmetry in blood cells". Blood 1997, 89: 1121-1132

68. Zwaal R.F., Comfiirius P., Bevers E.M. "Lipid-protein interactions in blood coagulation". Biochim Biophys Acta. 1998, 1376: 433-453

69. Козинец Г.И., Макаров В.А. Исследование системы крови в клинической практике. Триада-Х, Москва 1998; 454-455

70. Корниш-Боуден Э. Основы ферментативной кинетики. Москва: Мир, 1979

71. Пантелеев МА, Атауллаханов ФИ. Свертывание крови: биохимические основы. Клиническая онкогематология, том 1, номер 2, 174-181, 2008

72. Шиффман Ф.Дж. Патофизиология крови. M.:Binom Publishers, 2000

73. Шмидт Р, Тевс Г. Физиология человека (том 2). Москва: Мир, 2005

74. Fluorescence compensation in flow cytometry (электронный ресурс), режим доступа: http://www.abcam.com/index.html?pageconfig=resource&rid=13433.

Список сокращений и обозначений

АДФ аденозиндифосфат

АТФ аденозинтрифосфат

ГДФ гуанозиндифосфат

ГТФ гуанозинтрифосфат

дмсо диметилсульфоксид

ттг тканевая трансглутаминаза

Фактор Уа буква "а" после номера фактора означает его активную форму

ФС фосфатидилсерин

СЯР коллаген-ассоциированный пептид

ЕЭТА этилендиаминтетрауксусная кислота

тс флуоресцеинизотиоцианат

флуоресцентный канал

¥$С малоугловое рассеяние

вРРР 01у-Рго-Рго-Рго

вРЯР 01у-Рго-А^-Рго

вР гликопротеин

НЕРЕБ 2-[4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазин]этансульфоновая кислота

МРТР митохондриальная проницаемая переходная пора

РАЯ протеаза-активированный рецептор

РЕ фикоэритрин

РРАСК Фен-Про-Арг-хлорометил кетон

ЭБС боковое рассеяние

и