Исследование механизма образования двух пиков на кривой генерации тромбина и возможность применения этого эффекта для предсказания геморрагических осложнений тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат наук Тарандовский, Иван Дмитриевич

• Тарандовский, Иван Дмитриевич
• кандидат наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат наук Тарандовский, Иван Дмитриевич

Оглавление

Список сокращений

Введение

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Система свертывания крови

1.1.1. Структура системы гемостаза

1.1.2. Тромбоцитарный гемостаз

1.1.2. Плазменный гемостаз

1.2. Интегральные тесты оценки статуса системы свертывания

1.2.1. Стандартные времена свертывания

1.2.2. Тромбоэластография

1.2.3. Тромбодинамика

1.2.3. Тест генерации тромбина: основы метода

1.2.4. Тест генерации тромбина: использование богатой тромбоцитами плазмы

1.3. Разнообразие клинических фенотипов тяжелой формы гемофилии

1.4. Постановка задачи

Глава 2. Пациенты, материалы и методы

2.1. Основные растворы

2.2. Пациенты и здоровые доноры крови

2.3. Процедура забора крови

2.4. Выделение плазмы крови и приготовление суспензии тромбоцитов

2.5. Приготовление суспензии фосфолипидных везикул

2.6. Проведение теста генерации тромбина

2.7. Определение погрешности измерения концентрации тромбина в ТГТ

2.8. Проточная цитометрия для исследования активации суспензии тромбоцитов

2.9. Тромбоэластография в цельной крови

2.10. Проведение теста тромбодинамики

Глава 3. Результаты

3.1. Исследование влияния ингибиторов активации тромбоцитов на генерацию тромбина в РКР

3.2. Влияние ПГЕ1 на образование второго пика на кривой генерации тромбина в Р11Р

3.3. Исследование активации суспензии тромбоцитов

3.4. Влияние количества тромбоцитов на формирование двух пиков на кривой генерации тромбина в РКР

3.5. Метод оценки параметров двухпиковых кривых генерации тромбина

3.6. Статистика параметров первого и второго пиков. Возможность создания новой модификации теста генерации тромбина

3.7 Исследование статуса свертывания у больных гемофилией

3.7.1 Уровень фУШ и АЧТВ

3.7.2 Тромбоэластография

3.7.3 Тромбодинамика

3.7.4 Генерация тромбина

Глава 4. Обсуждение результатов

4.1. Эффекты ингибиторов активации тромбоцитов в тесте генерации тромбина

4.2. Клиническая значимость появления двух пиков на кривой генерациТГтромбина

Выводы

Благодарности

Список литературы

Приложение

Список сокращений

АДФ, аденозиндифосфорная кислота АТФ, аденозинтрифосфорная кислота АПС, активированный протеин С АТШ, антитромбин III

АЧТВ, активированное частичное тромбопластиновое время

АТФ, аденозинтрифосфорная кислота

БСА, бычий сывороточный альбумин

ВМК, высокомолекулярный кининоген

ГКП, гепариновый кофактор II

ГПУ1, гликопротеин VI

ППЬЛХ/У, гликопротеин 1Ь/1Х/У

ГПНЫНа, гликопротеин ПЫНа

ДМСО, диметилсульфоксид

ИФА, иммуноферментный анализ

КГТ, кривая генерации тромбина

КТИ, корнтрипсин ингибитор, ингибитор трипсина из зерен кукурузы (ингибитор фактора ХПа)

МЕТ-АМФ, 2-метилтиоаденозин-5'-0-монофосфат МТФР, метилентетрагидрофолатредуктаза ПАИ-1, ингибитор активатора плазминогена

ПАИ-2, ингибитор активатора плазминогена

ПВ, протромбиновое время

ПГЕ1, простагландин Е1

Протромбин G20120A, протромботическая мутация в гене протромбина

ПС, протеин С

ТВ, тромбиновое время

ТГТ, тест генерации тромбоина

ТД, тромбодинамика

ТАФИ, активируемый тромбином ингибитор фибринолиза

ТМ, тромбомодулин

тПА, тканевой активатор плазминогена

ТФПИ, ингибитор пути тканевого фактора

ТФ, тканевый фактор

ТЭГ, тромбоэластография

ФДЭ, фосфатидилэтаноламин

ФС, фосфатидилсерин

ФХ, фосфатидилхолин

ФИТЦ, флуоресцеинизотиоцианат

ФЭ, фикоэритрин

фП - протромбин

ф1Х(а), фактор IX свертывания крови (активированный)

фУ(а), фактор V свертывания крови (активированный)

фУ Лейден, мутация гена фактора V, при которой фУ не ингибируется АПС

фУП(а), фактор VII свертывания крови (активированный)

фУШ(а), фактор VIII свертывания крови (активированный)

фХ1(а), фактор XI свертывания крови (активированный)

фХП(а), фактор XII свертывания крови (активированный)

5

фХШ(а), фактор XIII свертывания крови (активированный)

фУШ:С, прокоагулянтная активность фУШ

ф1Х:С, прокоагулянтная активность ф1Х

ЭТП, эндогенный тромбиновый потенциал

Ü2M, аг-макроглобулин

AMC - 4-метил-7-аминокумарин

Cl И, Cl-ингибитор

CRP, коллаген-ассоциированный пептид FSC, прямое светорассеяние

HEPES, 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтаносульфоновая кислота

PARI, тромбоцитарный рецептор для тромбина (Protease-Activated Receptor 1)

PAR4, тромбоцитарный рецептор для тромбина (Protease-Activated Receptor 4)

PFP, свободная от тромбоцитов плазма

PRP, богатая тромбоцитами плазма

РРР, бедная тромбоцитами плазма

PS, протеин S

SFLLRN, агонист рецептора PARI

SNARE, протеиноваый комплекс, участвующий в секреции гранул (Soluble NSF Attachement Protein Receptor)

SSC, боковое светорассеяние

TBXA2R, рецептор для тромбоксана А2

tSNARE, комплексы SNARE, расположенные на внутренней стороне мембран тромбоцитов

TMEM16F, белок, предположительно являющийся тромбоцитарной скрамблазой (Transmembrane protein 16F)

vSNARE, комплексы SNARE, расположенные на мембранах а-гранул

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование механизма образования двух пиков на кривой генерации тромбина и возможность применения этого эффекта для предсказания геморрагических осложнений»

Введение

Система гемостаза является одной из важнейших систем организма, служащей для предотвращения кровопотери при нарушении целостности сосуда. Результатом работы этой системы является тромб, локализованный в месте повреждения сосуда и препятствующий выходу крови из него. Изучение этой системы является важной задачей для понимания принципов ее работы и предупреждения тромбозов и кровотечений в клинике. В настоящее время существует множество методов исследования свертывания. Тромбоцитарную часть системы гемостаза изучают, в основном, с помощью агрегометрии, микроскопии и проточной цитометрии. Для диагностики плазменного звена помимо исследования активности отдельных плазменных белков существуют так называемые интегральные тесты. Они призваны оценивать работу системы свертывания в целом. Самыми простыми из таких тестов являются времена свертывания, однако, на сегодняшний момент стало ясно, что они не дают достаточной информации о функционировании системы. В связи с этим развиваются новые интегральные тесты, более чувствительные к патологиям плазменного звена. Кроме того, активно исследуются возможности проводить эти тесты с участием тромбоцитов.

К современным интегральным тестам можно отнести тромбоэластографию, тест тромбодинамики и тест генерации тромбина, которому, в основном, и посвящена данная работа. Идея метода заключается в измерении кинетики производства и расходования тромбина в сворачивающейся крови или плазме крови с помощью предварительно добавленного в образец флюорогенного субстрата, специфичного к тромбину. Как правило, в результате получают кривую с одним максимумом. В данной работе впервые было показано, что ингибиторы активации тромбоцитов способствуют образованию двух максимумов на кривой генерации тромбина при свертывании богатой тромбоцитами плазмы. Был определен механизм этого явления и предложена новая модификация теста генерации тромбина. Показано, что эта модификация способна отражать тенденцию к кровоточивости у пациентов, страдающих тяжелой формой гемофилии А, в то время как другие современные интегральные тесты этого не продемонстрировали. На основании полученных результатов был сделан вывод о главной роли тромбоцитарного звена гемостаза в формировании клинического фенотипа гемофилии А среди прочих возможных механизмов.

Цель работы. Исследовать механизм образования двух максимумов на кривой генерации тромбина и оценить возможность применения этого эффекта для предсказания кровотечений у пациентов с тяжелой формой гемофилии А.

Задачи исследования.

1. Исследовать влияние малых концентраций ингибиторов активации тромбоцитов на генерацию тромбина в богатой тромбоцитами плазме, показав возможность образования двух максимумов на кривой генерации тромбина.

2. Исследовать влияние этих ингибиторов на секрецию а-гранул и экспрессию фосфатидилсерина тромбоцитами с помощью проточного цитометра.

3. Разработать метод оценки параметров кривой генерации тромбина с двумя пиками.

4. Исследовать статус системы свертывания у пациентов с легким и тяжелым течениями тяжелой формы гемофилии А с помощью теста генерации тромбина в богатой тромбоцитами плазме и в присутствии небольшой концентрации ингибитора тромбоцитов, позволяющей получить два пика на кривой. Сравнить полученные результаты с данными других современных интегральных тестов.

Научная новизна. Впервые показано, что при добавлении в богатую тромбоцитами плазму веществ, ингибирующих активацию тромбоцитов на кривой генерации тромбина образуются два пика. Определен механизм образования двух максимумов на этой кривой. При добавлении ингибиторов активации тромбоцитов скорость экспрессии фосфатидилсерина на них снижается. Вследствие этого фосфолипидная поверхность, предоставляемая активированными тромбоцитами, появляется в плазме позже, и пик производства тромбина разделяется на два. Следует заметить, что ингибиторы в выбранных концентрациях не оказывают влияние на секрецию тромбоцитами а-гранул. Таким образом, второй пик на кривой генерации тромбина формируется только за счет замедленного экспонирования фосфатидилсерина тромбоцитами. Первый пик формируется, главным образом, за счет реакций свертывания на фосфолипидах плазмы и секреции а-гранулярных белков. Далее был разработан метод анализа параметров двух пиков, базирующийся на аппроксимации кривой экстремальным распределением первого типа (распределением Гумбеля). Предложена возможность создания новой модификации теста генерации тромбина в богатой тромбоцитами плазме, в основу которой положено явление образования двух пиков на кривой генерации тромбина при добавлении диметилсульфоксида. Впервые были исследованы статусы системы гемостаза у больных тяжелой формой гемофилии А с помощью различных современных интегральных тестов. Было показано, что амплитуда второго пика и эндогенный тромбиновый потенциал в тесте генерации тромбина в богатой тромбоцитами плазме являются единственными параметрами, достоверно отличающимися между группами пациентов с разной тенденцией к кровоточивости.

Научно-практическое значение. Информация о механизме образования двух пиков на кривой генерации тромбина в богатой тромбоцитами плазме может быть полезной для изучения влияния активации тромбоцитов на плазменное звено свертывания. Помимо использования в фундаментальных исследованиях системы гемостаза, образование второго пика на кривой генерации тромбина может быть использовано и непосредственно в клинике. В данной работе ингибиторы тромбоцитов использовали в концентрациях, близких к применяемым в лабораторно-диагностической и клинической практике. До сих пор влияние таких доз на генерацию тромбина не было исследовано. Появление двух пиков на кривой генерации тромбина может свидетельствовать о том, что тромбоциты донора демонстрируют замедленную скорость экспонирования фосфатидилсерина. Эта информация может быть полезной при выборе доз антиагрегантов и антикоагулянтов. Также в данной работе предложен новый метод, позволяющий отражать клиническое состояние больных тяжелой формой гемофилии А. Кроме того, показано, что использование других вариантов современных интегральных тестов гемостаза не может помочь в определении тенденции к кровоточивости. Полученные результаты позволяют предполагать, что коррекция фенотипа гемофилии связана, главным образом, с тромбоцитами, экспрессирующими фосфатидилсерин в процессе их активации. Более детальное исследование активации тромбоцитов у людей, страдающих гемофилией, поможет более установить детально установить механизм коррекции фенотипа гемофилии. Выяснение причин появления легкого клинического фенотипа гемофилии может позволить создать новые препараты и стратегии лечения для пациентов, которым на данный момент не помогает заместительная терапия.

Положения, выносимые на защиту:

1. Показано, что ингибиторы активации тромбоцитов вызывают формирование двух пиков на кривой генерации тромбина путем снижения скорости экспонирования фосфатидилсерина на мембранах тромбоцитов.

2. Разработан метод оценки параметров кривой генерации тромбина с двумя максимумами

3. Предложена возможность создания новой модификации теста генерации тромбина в богатой тромбоцитами плазме

4. Показано, что амплитуда второго пика на кривой генерации тромбина и эндогенный тромби новый потенциал в богатой тромобцитами плазме являются единственными параметрами коагуляционных тестов, различающимися у людей с легким и тяжелым фенотипами гемофилии А.

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Система свертывания крови

1.1.1. Структура системы гемостаза

Систему гемостаза обычно разделяют на сосудистый, тромбоцитарный и плазменный гемостаз. Это разделение весьма условно, так как эти части свертывания сильно взаимосвязаны друг с другом [1, 2]. К сосудистому гемостазу относят механизмы вазоконстрикции и участие сосудистой стенки в регуляции тромбоцитарного и плазменного звеньев гемостаза [3, 4]. Считается, что первыми на повреждение сосуда реагируют тромбоциты. Они меняют свою форму с дисковидной на шарообразную, адгезируют к месту повреждения и формируют первичный тромб [5]. После этого начинает работать каскад ферментативных реакций сериновых протеаз плазменного звена гемостаза, что приводит к образованию тромбина [6]. Тромбин, в свою очередь, расщепляет растворимый белок фибриноген, превращая его в нерастворимый фибрин. Фибриновые нити стабилизируют тромбоцитарный тромб, тем самым препятствуя выходу плазмы крови из кровотока. Тромбоцитарное и плазменное звенья гемостаза взаимодействуют между собой, способствуя нормальной регуляции гемостаза. Так, на мембранах активированных тромбоцитов экспонирован фосфатидилсерин (ФС) и белки-факторы плазменного звена [7, 8]. Это ускоряет реакции плазменного свертывания на несколько порядков [9], что приводит к взрывообразному образованию тромбина, который, в свою очередь, является одним из главных активаторов тромбоцитов [10]. Механизмы, по которым идет взаимодействие тромбоцитарного и плазменного звеньев свертывания, сейчас активно изучаются во всем мире. Ниже рассмотрены подробнее тромбоцитарная и плазменная части гемостаза.

1.1.2. Тромбоцитарный гемостаз

Тромбоциты представляют собой безъядерные клетки крови дисковидной формы, активация которых в месте повреждения сосуда приводит к появлению первичного тромбоцитарного тромба. Нормальная концентрация этих клеток в крови составляет 180-320 тысяч на 1 мкл [2]. Активация тромбоцитов представляет собой сложный процесс, в котором участвуют многочисленные вещества и задействованы различные пути клеточной сигнализации [1, 4, 5, 9, 10]. Тромбоциты могут активироваться в ответ на механическое напряжение, изменение температуры [11, 12], а также на контакт с веществами-активаторами. По вызываемым ответам активаторы тромбоцитов условно делят на слабые (АДФ, АТФ, тромбоксан А2) и сильные (тромбин, коллаген). Кроме природных существуют также нефизиологические активаторы тромбоцитов, используемые в исследованиях in vitro. К ним

11

относятся агонисты тромбоцитарного рецептора гликопротеина VI (rilVI): конвульксин (белок, вьщеленный из яда змеи Crotalus durissus terrifîcus [13]) и коллаген-ассоциированный пептид (CRP, [14]). Кроме того, в лабораторных исследованиях широко используют агонист рецептора PARI (Protease-Activated Receptor 1) синтетический пептид SFLLRN и кальциевые ионофоры [15-18]. Активация тромбоцитов может проходить через разнообразные рецепторы на мембране тромбоцитов, в зависимости от активирующего вещества. Тромбин активирует тромбоциты через рецепторы PARI, PAR4 и гликопротеин Ib/IX/V (ГШЬ/IX/V) [19, 20]. Главным рецептором для коллагена является ГПУ1 [21-23]. Тромбоксан А2 участвует в активации тромбоцитов через тромбоксановый рецептор (TBXA2R) [24-26]. Рецепторами для АДФ на тромбоцитах являются так называемые пуринэргические рецепторы (Р2 рецепторы) P2Y1, P2Y12 и Р2Х1 [27-29]. Причем Р2Х1 может быть активирован также с помощью АТФ [29]. Основными ответами тромбоцитов на активацию являются изменение формы, агрегация, секреция гранул и экспрессия ФС на мембранах [27, 29-31].

К данной работе непосредственное отношение имеют функции тромбоцитов, регулирующие работу плазменного звена системы гемостаза. К прокоагулянтным (поддерживающим плазменное свертывание) ответам тромбоцитов на активацию относятся секреция a-гранул и экспрессия ФС. a-гранулы присутствуют в интактных тромбоцитах. Их размеры бывают от 200 до 500 нм [32], и они составляют примерно 10% от всего объема тромбоцита [33]. В отличие от другого типа тромбоцитарных гранул (плотных гранул), содержащих низкомолекулярные вещества [1, 34], a-гранулы содержат в себе белки. Это Р-селектин, фактор Виллебранда, фибронектин, тромбоспондин, фибриноген, разного рода рецепторы, хемокины, протеины фибринолиза и плазменного свертывания [35-38]. К последним относятся факторы V, XI и XIII [36] и ингибиторы Cl-ингибитор [39], ингибитор пути тканевого фактора (ТФПИ) [40], а также протеин S [41] и протеаза нексин-2 [42]. Кроме того, в a-гранулах содержится высокомолекулярный кининоген, участвующий в активации плазменного звена свертывания по внутреннему пути [43]. При активации тромбоцитов содержимое a-гранул секретируется из клетки в кровоток или остается на внешней стороне тромбоцитарной мембраны. При контакте с плазмой крови, эти белки активно участвуют в регуляции свертывания. Процесс секреции осуществляется с помощью протеиновых комплексов SNARE (Soluble NSF Attachement Protein Receptor) [44]. Помимо тромбоцитов эти белки найдены во множестве типов клеток и также выполняют в них секреторные функции. Комплексы SNARE расположены на внешних сторонах мембран a-гранул (vSNARJE) и на внутренних сторонах мембран тромоцитов (tSNARE). В состав vSNARE входят несколько видов синаптобревинов (VAMP-2, -3, -7 и -8), в то время как tSNARE состоят из синтаксинов 2,

4, 7 и 11 и белков SNAP-23, -25 и -29 [45-51]. При секреции а-гранулярные vSNARE связываются с тромбоцитарными tSNARE, после чего мембраны а-гранул и тромбоцитов соединяются [44]. При этом внутренняя сторона мембраны а-гранулы становится частью внешней мембраны тромбоцита, и содержимое а-гранулы оказывается во внеклеточном пространстве. На рис. 1 представлена роль комплексов SNARE в секреции а-гранул.

ч

Cytosol

г*-—* SNAP-23

■ syntaxln .V. a-granule «идо

Рис. 1. Схема секреции а-гранул. (А) Комплекс vSNARE на а-грануле состоит из белков VAMP. Главным среди них считается VAMP-8. Тромбоцитарные tSNARE включают в себя синтаксины и SNAP-23. Комплексы vSNARE и tSNARE связываются, что приводит к притягиванию а-гранулы к мембране тромбоцита (В). (С) Связывание vSNARE и tSNARE высвобождает энергию для слияния мембран, и содержимое а-гранул покидает тромбоцит. Рисунок воспроизведен из работы [33].

Еще одним прокоагулянтным ответом тромбоцитов на активацию является

экспонирование ФС на мембране. Мембрана интактного тромбоцита ассиметрична по

фосфолипидному составу: на внешней стороне находится фосфатидилхолин (ФХ), в то время

как на внутренней - фосфатидилсерин (ФС) и фосфатидилэтаноламин (ФДЭ) [52]. Это

состояние поддерживает фермент аминофосфолипидная транслоказа, переносящая ФС и ФДЭ с

внешнего на внутренний слой мембраны [53, 54]. Также, АТФ-зависимая флопаза переносит

фосфолипиды с внутреннего слоя на внешний [53, 54]. При активации концентрация ионов Са2+

в тромбоците резко повышается, и эти ферменты прекращают работать. Таким образом, ФС с

внутреннего слоя мембраны начинает переходить на внешний по градиенту концентрации. В

литературе активно идет дискуссия о присутствии в тромбоцитах фермента скрамблазы,

найденного в других клетках организма [55]. Этот фермент Са -зависимо переносит ФС на

внешний слой мембраны клетки. В последние несколько лет предполагают, что

тромбоцитарной скрамблазой может являться трансмембранный белок TMEM16F [53, 56].

Показано, что этот фермент формирует Са2+-зависимый канал, необходимый для

13

экспонирования ФС на мембране тромбоцита [56, 57]. Однако, не показано, что TMEM16F действительно сам переносит ФС с внутренней стороны мембраны на внешнюю.

Помимо вопроса о скрамблазе существует еще один не менее интересный аспект в механизме экспрессии ФС тромбоцитами. Показано, что не все активированные тромбоциты экспонируют ФС на мембране [58-60]. Кроме того, субпопуляция ФС-положительных тромбоцитов также содержит на мембране большое количество a-гранулярных белков [8, 60]. На мембранах этих тромбоцитов локализованы факторы свертывания крови IX, VIII, X и протромбин [61-63]. Интересен факт, что ФС-положительные тромбоциты испускают прокоагулянтные везикулы [64], роль которых в гемостазе пока не определена. Также, недавно было показано, что на самом деле сама популяция ФС-положительных тромбоцитов разделяется на две по размерам и концентрации ионов Са [65]. Тромбоциты новой, третьей субпопуляции практически не содержат Са2+. Главную роль в образовании этой Са2+-отрицательной субпопуляции ФС-положительных тромбоцитов играет интегрин гликопротеин IlblIIa (ГПНЫПа), отвечающий, в основном, за агрегационную функцию тромбоцитов [66]. ФС-положительные тромбоциты с низким содержанием Са демонстрируют способность к агрегации, тогда как до этого считалось, что тромбоциты с экспонированным ФС на мембране между собой агрегировать не могут. Механизмы образования гетерогенности активированных тромбоцитов пока недостаточно изучены. Т. к. количество ФС-положительных тромбоцитов можно менять, изменяя концентрации активаторов, тромбоциты не могут принадлежать к той или другой субпопуляции до того, как были активированы [62]. Существуют работы, указывающие роль FC-рецептора и ГПУ1 в этом процессе [16]. Также предполагают механизм, связанный с образованием митохондриальной поры [17]. Широко обсуждается возможная связь образования ФС-положительных тромбоцитов с процессами апоптоза и некроза [67].

Тромбоциты являются одними из самых малоизученных клеток из-за того, что существенная часть методов изучения свойств клеток, таких, как электропорация, микроинъекция и культивирование, неприменима для них. Одним из самых распространенных современных методов оценки прокоагулянтных свойств тромбоцитов является проточная цитометрия. Приборы, где реализован этот метод, называются проточными цитометрами. Этот метод ориентирован на измерение параметров единичной клетки. Суспензию предварительно инкубируют с флуоресцентными красителями (обычно это антитела, связанные с флуоресцентными метками). После этого под давлением пропускают через капилляр. В этой методике используется принцип гидродинамической фокусировки, благодаря которому клетки по одной выстраиваются в цепочку (рис. 2). Это дает возможность с помощью лазера исследовать флуоресценцию отдельной клетки.

Образец Обволакивающая ^ жидкость

жидкость

Лазер

Рассеяние и флуоресценция

Рис. 2. Схема проточной ячейки цитометра. Суспензия исследуемых клеток, смешивается в камере с обволакивающей жидкостью. Благодаря ламинарности течения, клетки выстраиваются друг за другом по мере сужения камеры. После этого с помощью лазера регистрируется флуоресценция отдельных клеток. Схема воспроизведена из электронного ресурса http://flo\vbook.denovosoftware.com/Flow_Book/Chapter 2%ЗА The Flow Cytometer

Современные цитометры обладают возможностью фиксировать прямое (РБС) и боковое светорассеяние (ББС) от клеток. Кроме того, возможно измерять флуоресценцию от разных красителей используя детекторы, настроенные на разные длины волн (рис.3). С помощью проточной цитометрии можно исследовать процессы экспонирования фосфатидилсерина на мембране и получить представление о секреции а-гранул, окрасив клетки на а-гранулярные белки, остающиеся после секреции на мембране тромбоцита (например, на Р-селектин).

Рис. 3. Принципиальная схема устройства проточного цитометра. После того, как клетка исследуемой суспензии прошла через луч лазера, детекторы регистрируют интенсивность светорассеяния и флуоресценции. Рисунок воспроизведен из электронного ресурса Ь«р://ги-ш.invitrogen.coш/site/ru/ru/home/support/Tutorials.htшl.

Блок обработки информации

бокового (SSC) и

малоуглового (FSC) рассеяния

1.12. Плазменный гемостаз

Плазменное звено свертывания крови представляет собой совокупность белков, растворенных в плазме. Ее главная задача - образование фибриновой сети, скрепляющей тромбоцитарную пробку и препятствующей выходу плазмы из сосудистого русла [68]. Основные реакции плазменного свертывания показаны на рис. 4 и 5. Система состоит из реакций активации по внешнему пути, контактной активации, каскада сериновых протеаз, активации кофакторов V и VIII, системы протеина С и других ингибиторов свертывания [1,2,

Рис. 4. Основные реакции плазменной системы свертывания крови. Ферментативный катализ и превращения под его действием показаны серыми и черными стрелками, соответственно Ингибирование показано короткими пустыми стрелками. Связывание тромбина с тромбомодулином, активация тромбоцитов какими-либо активаторами кроме тромбина, секреция тромбоцитов не показаны. Воспроизведено и модифицировано из [68].

Главным путем активации плазменного звена свертывания считается так называемый внешний путь, или путь тканевого фактора (ТФ) [70]. Это трансмембранный гликопротеин, кот орый присутствует на поверхности всех клеток, не контактирующих с кровью. Он входит с неи в контакт только при повреждении сосуда [71, 72]. Циркулирующая в крови сериновая протеаза активированный фактор VII (фУПа) связывается с ТФ, образуя так называемый

69].

Чужеродная поверхность

Реакции контактной активации

комплекс внешней теназы [73, 74]. Этот комплекс способен активировать факторы IX и X (ф1Х и фХ соответственно) [75, 76], запуская каскад сериновых протеаз. ФУПа без ТФ практически не обладает ферментативной активностью [77, 78], однако существует данные, что при определенных условиях он способен самостоятельно активировать фХ [79, 80].

Другой путь активации называется внутренним, или контактным. Он состоит из профермента фактора XII (фХН), высокомолекулярного кининогена (ВМК) и прекалликреина (рис. 5). Они объединены сетью положительных обратных связей. ФХП активируется от контакта с любой чужеродной отрицательно заряженной поверхностью [81, 82]. После этого активируется весь блок контактной активации, что приводит к активации фактора XI (фХ1). В настоящее время физиологическая роль контактного пути не ясна. Известно, что люди с недостатком фХН не страдают кровоточивостью [83]. Однако, существуют данные, позволяющие предположить, что внутренний путь может играть ключевую роль в развитии тромбозов [84, 85]. Также показано, что полифосфаты, секретируемые активированными тромбоцитами, могут активировать свертывания по внутреннему пути [86].

Рис.5 Контактный путь активации свертывания. ПК - прекалликреин, К - калликреин, ВМК -высокомолекулярный кининоген. Стрелки показывают каталитическое действие ферментов и комплексов Тонкие черные стрелки - протеолитические реакции активации факторов и кофакторов. Воспроизведено из [87].

Каскад сериновых протеаз состоит из проферментов фХ1, ф1Х, фХ и протромбина (фН) [1, 69]. На каждой стадии каскада профермент (неактивированный фактор) превращается в сериновую протеазу (активированный фактор) и активирует следующий профермент. Когда фХ1 становится активированным, он может активировать ф1Х, тот, в свою очередь, активирует фХ, а активированный фХ (фХа) превращает протромбин в тромбин [88-90]. Тромбин отщепляет фибринопептиды А и В от растворимого белка фибриногена [91], и он переходит в

нерастворимую форму - фибрин [68]. Трансглутаминаза активированный фактор XIII (фХШа) перекрестно сшивает мономеры фибрина, стабилизируя получающийся сгусток [92, 93]. Таким образом, первичная тромбоцитарная пробка стабилизируется фибриновыми нитями. Помимо своей основной функции, тромбин способен активировать фХ1 [94], фУН [95] и кофакторы V и VIII (фУ и фУШ соответственно) [96-98]. Активируясь, фУ и фУШ соединяются с фХа и ф1Ха, формируя так называемые комплексы протромбиназы (фХа-фУа) и внутренней теназы (ф1Ха-фVilla) [99-101]. Это ускоряет активацию протромбина и фХ на 5 порядков [96, 100-104]. Образование протромбиназы и внутренней теназы возможно только на фосфолипидной

Л I

поверхности, содержащей ФС в присутствии ионов Са [100, 105]. Такую поверхность предоставляет внешняя сторона мембраны активированнго тромбоцита [9]. Также, фосфолипиды содержатся непосредственно в плазме [106, 107]. Таким образом, реализуются петли положительной обратной связи в системе свертывания. Недостаток фУШ и ф1Х может привести к серьезным геморрагическим осложнениям. Наследственные заболевания, связанные с недостатком этих факторов называются гемофилиями А (недостаток фУШ) и В (недостаток ф1Х) [108].

В плазменном звене свертывания крови для предотвращения тромбозов существует ряд белков, ингибирующих сериновые протеазы и кофакторы свертывания. Главными из них можно назвать постоянные ингибиторы сериновых протеаз антитромбин III (ATIII), а,2-макроблобулин (агМ), гепариновый кофактор II (ГКН) и С1-ингибитор (С1И); ингибитор типа Куница ТФПИ и систему протеина С [4, 109, 110]. В эту систему входят мембранный белок тромбомодулин (ТМ), локализованный на стенке сосуда, профермент протеин С (ПС) и кофактор PS [111]. Тромбин способен активировать ПС, превращая его в сериновую протеазу активированный протеин С (АПС), которая при участии PS расщепляет активированные факторы V и VIII как в свободном виде, так и в составе прокоагулянтных комплексов, тем самым существенно снижая скорость наработки тромбина [111, 112]. Скорость активации ПС тромбином повышается в 20000 раз, если тромбин работает в комплексе с ТМ [109, 111, 113]. При этом скорость активации фУ и фУШ комплексом тромбин-ТМ в 100 раз ниже, чем тромбином [113]. Существуют гипотеза, что система протеина С осуществляет функцию локализации тромба непосредственно в месте повреждения и нераспространения его вглубь сосудов [114-117]. ATIII, в отличие от системы протеина С, не нуждается в активации. Этот серпин способен ингибировать все сериновые протеазы каскада плазменного свертывания [4, 118, 119]. Единственным фактором системы, не ингибируемым ATIII, является фУНа. Для ингибирования реакций внешнего пути в системе существует специальный ингибитор со сложным механизмом действия - ТФПИ [120]. Этот ингибитор способен связывать фУПа

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Тарандовский, Иван Дмитриевич, 2013 год

Список литературы

1. Н. J. Colman RW, Marder VJ, Saltzman EW. Hemostasis and Thrombosis:Basic Principles and Clinical Practice. (Philadelphia, Lippincott Company), 1994.

2. P. Шмидт, Г. Тевс. Физиология человека (том 2). (Москва, Мир), 1996.

3. М. Kalafatis, N. A. Swords, М. D. Rand, К. G. Mann. Membrane-dependent reactions in blood coagulation: role of the vitamin K-dependent enzyme complexes, Biochim Biophys Acta, 1227, 113-29, 1994.

4. В. П. Балуда, M. В. Балуда, И. И. Деянов, И. JI. Тлепшуков. Физиология системы гемостаза. (Москва), 1995.

5. S. Butenas, R. F. Branda, С. van't Veer, К. М. Cawthern, К. G. Mann. Platelets and phospholipids in tissue factor-initiated thrombin generation, Thromb Haemost, 86, 660-7, 2001.

6. K. G. Mann, K. Brummel, S. Butenas. What is all that thrombin for?, J Thromb Haemost, 1, 1504-14, 2003.

7. R. F. Zwaal, P. Comfurius, E. M. Bevers. Lipid-protein interactions in blood coagulation, Biochim Biophys Acta, 1376, 433-53, 1998.

8. G. L. Dale, P. Friese, P. Batar, S. F. Hamilton, G. L. Reed, K. W. Jackson, K. J. Clemetson, L. Alberio. Stimulated platelets use serotonin to enhance their retention of procoagulant proteins on the cell surface, Nature, 415, 175-9, 2002.

9. J. W. Heemskerk, E. M. Bevers, T. Lindhout. Platelet activation and blood coagulation, Thromb Haemost, 88, 186-93, 2002.

10. R. D. Smith, W. G. Owen. Platelet responses to compound interactions with thrombin, Biochemistry, 38, 8936-47, 1999.

11. Y. Ando, M. Steiner, M. Baldini. Effect of chilling on membrane related functions of platelets, Transfusion, 14, 453-61, 1974.

12. E. Maurer-Spurej, G. Pfeiler, N. Maurer, H. Lindner, O. Glatter, D. V. Devine. Room temperature activates human blood platelets, Lab Invest, 81, 581-92, 2001.

13. J. Polgar, J. M. Clemetson, В. E. Kehrel, M. Wiedemann, E. M. Magnenat, T. N. Wells, K. J. Clemetson. Platelet activation and signal transduction by convulxin, a C-type lectin from Crotalus durissus terrificus (tropical rattlesnake) venom via the p62/GPVI collagen receptor, J BiolChem, 272, 13576-83, 1997.

14. L. F. Morton, P. G. Hargreaves, R. W. Farndale, R. D. Young, M. J. Barnes. Integrin alpha 2 beta 1-independent activation of platelets by simple collagen-like peptides: collagen tertiary (triple-helical) and quaternary (polymeric) structures are sufficient alone for alpha 2 beta 1-independent platelet reactivity, Biochem J, 306 (Pt 2), 337-44, 1995.

15. G. L. Dale, G. Remenyi, P. Friese. Quantitation of microparticles released from coated-platelets, J Thromb Haemost, 3, 2081-8, 2005.

16. S. M. Jobe, L. Leo, J. S. Eastvold, G. Dickneite, T. L. Ratliff, S. R. Lentz, J. Di Paola. Role of FcRgamma and factor XIIIA in coated platelet formation, Blood, 106, 4146-51, 2005.

17. S. M. Jobe, K. M. Wilson, L. Leo, A. Raimondi, J. D. Molkentin, S. R. Lentz, J. Di Paola. Critical role for the mitochondrial permeability transition pore and cyclophilin D in platelet activation and thrombosis, Blood, 111, 1257-65, 2008.

18. N. N. Topalov, Y. N. Kotova, S. A. Vasil'ev, M. A. Panteleev. Identification of signal transduction pathways involved in the formation of platelet subpopulations upon activation, Br J Haematol, 157, 105-15,2012.

19. L. F. Brass. Thrombin and platelet activation, Chest, 124,18S-25S, 2003.

20. S. Offermanns. Activation of platelet function through G protein-coupled receptors, Circ Res, 99, 1293-304, 2006.

21. B. Nieswandt, S. P. Watson. Platelet-collagen interaction: is GPVI the central receptor?, Blood, 102, 449-61,2003.

22. S. P. Watson, J. M. Auger, O. J. McCarty, A. C. Pearce. GPVI and integrin alphallb beta3 signaling in platelets, J Thromb Haemost, 3, 1752-62, 2005.

23. P. G. Quinter, C. A. Dangelmaier, T. M. Quinton, S. P. Kunapuli, J. L. Daniel. Glycoprotein VI agonists have distinct dependences on the lipid raft environment, J Thromb Haemost, 5, 3628, 2007.

24. G. W. Dorn, 2nd. Distinct platelet thromboxane A2/prostaglandin H2 receptor subtypes. A radioligand binding study of human platelets, J Clin Invest, 84,1883-91, 1989.

25. K. Takahara, R. Murray, G. A. FitzGerald, D. J. Fitzgerald. The response to thromboxane A2 analogues in human platelets. Discrimination of two binding sites linked to distinct effector systems, J Biol Chem, 265, 6836-44, 1990.

26. N. Wettschureck, S. Offermanns. Mammalian G proteins and their cell type specific functions, Physiol Rev, 85, 1159-204, 2005.

27. J. Jin, J. L. Daniel, S. P. Kunapuli. Molecular basis for ADP-induced platelet activation. II. The P2Y1 receptor mediates ADP-induced intracellular calcium mobilization and shape change in platelets, J Biol Chem, 273, 2030-4, 1998.

28. G. Hollopeter, H. M. Jantzen, D. Vincent, G. Li, L. England, V. Ramakrishnan, R. B. Yang, P. Nurden, A. Nurden, D. Julius, P. B. Conley. Identification of the platelet ADP receptor targeted by antithrombotic drugs, Nature, 409, 202-7, 2001.

29. B. N. Kahner, H. Shankar, S. Murugappan, G. L. Prasad, S. P. Kunapuli. Nucleotide receptor signaling in platelets, J Thromb Haemost, 4, 2317-26, 2006.

70

30. C. Dangelmaier, J. Jin, J. B. Smith, S. P. Kunapuli. Potentiation of thromboxane A2-induced platelet secretion by Gi signaling through the phosphoinositide-3 kinase pathway, Thromb Haemost, 85, 341-8, 2001.

31. J. A. Erhardt, J. R. Toomey, S. A. Douglas, D. G. Johns. P2X1 stimulation promotes thrombin receptor-mediated platelet aggregation, J Thromb Haemost, 4, 882-90, 2006.

32. M. M. Frojmovic, J. G. Milton. Human platelet size, shape, and related functions in health and disease, Physiol Rev, 62, 185-261, 1982.

33. P. Blair, R. Flaumenhaft. Platelet alpha-granules: basic biology and clinical correlates, Blood Rev, 23, 177-89, 2009.

34. S. Butenas, K. M. Cawthern, C. van't Veer, M. E. DiLorenzo, J. B. Lock, K. G. Mann. Antiplatelet agents in tissue factor-induced blood coagulation, Blood, 97, 2314-22, 2001.

35. H. R. Gralnick, S. B. Williams, L. P. McKeown, D. M. Krizek, B. C. Shafer, M. E. Rick. Platelet von Willebrand factor: comparison with plasma von Willebrand factor, Thromb Res, 38, 623-33, 1985.

36. F. Rendu, B. Brohard-Bohn. The platelet release reaction: granules' constituents, secretion and functions, Platelets, 12, 261-73, 2001.

37. T. Bombeli, B. R. Schwartz, J. M. Harlan. Adhesion of activated platelets to endothelial cells: evidence for a GPIIbllla-dependent bridging mechanism and novel roles for endothelial intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1), alphavbeta3 integrin, and GPIbalpha, J Exp Med, 187,329-39,1998.

38. P. von Hundelshausen, C. Weber. Platelets as immune cells: bridging inflammation and cardiovascular disease, Circ Res, 100, 27-40, 2007.

39. A. H. Schmaier, P. M. Smith, R. W. Colman. Platelet CI- inhibitor. A secreted alpha-granule protein, J Clin Invest, 75, 242-50, 1985.

40. W. F. Novotny, T. J. Girard, J. P. Miletich, G. J. Broze, Jr. Platelets secrete a coagulation inhibitor functionally and antigenically similar to the lipoprotein associated coagulation inhibitor, Blood, 72, 2020-5, 1988.

41. H. P. Schwarz, M. J. Heeb, J. D. Wencel-Drake, J. H. Griffin. Identification and quantitation of protein S in human platelets, Blood, 66, 1452-5, 1985.

42. F. Xu, M. L. Previti, W. E. Van Nostrand. Increased severity of hemorrhage in transgenic mice expressing cerebral protease nexin-2/amyloid beta-protein precursor, Stroke, 38, 2598-601, 2007.

43. D. M. Maynard, H. F. Heijnen, M. K. Home, J. G. White, W. A. Gahl. Proteomic analysis of platelet alpha-granules using mass spectrometry, J Thromb Haemost, 5, 1945-55, 2007.

44. T. C. Sudhof, J. E. Rothman. Membrane fusion: grappling with SNARE and SM proteins, Science, 323,474-7, 2009.

45. P. P. Lemons, D. Chen, A. M. Bernstein, M. K. Bennett, S. W. Whiteheart. Regulated secretion in platelets: identification of elements of the platelet exocytosis machinery, Blood, 90, 1490-500,1997.

46. R. Flaumenhaft, K. Croce, E. Chen, B. Furie, B. C. Furie. Proteins of the exocytotic core complex mediate platelet alpha-granule secretion. Roles of vesicle-associated membrane protein, SNAP-23, and syntaxin 4, J Biol Chem, 274, 2492-501,1999.

47. A. M. Bernstein, S. W. Whiteheart. Identification of a cellubrevin/vesicle associated membrane protein 3 homologue in human platelets, Blood, 93, 571-9, 1999.

48. J. Polgar, S. H. Chung, G. L. Reed. Vesicle-associated membrane protein 3 (VAMP-3) and VAMP-8 are present in human platelets and are required for granule secretion, Blood, 100, 10813, 2002.

49. J. Polgar, W. S. Lane, S. H. Chung, A. K. Houng, G. L. Reed. Phosphorylation of SNAP-23 in activated human platelets, J Biol Chem, 278,44369-76, 2003.

50. Q. Ren, H. K. Barber, G. L. Crawford, Z. A. Karim, C. Zhao, W. Choi, C. C. Wang, W. Hong, S. W. Whiteheart. Endobrevin/VAMP-8 is the primary v-SNARE for the platelet release reaction, Mol Biol Cell, 18, 24-33, 2007.

51. D. Chen, A. M. Bernstein, P. P. Lemons, S. W. Whiteheart. Molecular mechanisms of platelet exocytosis: role of SNAP-23 and syntaxin 2 in dense core granule release, Blood, 95, 921-9, 2000.

52. R. F. Zwaal, A. J. Schroit. Pathophysiologic implications of membrane phospholipid asymmetry in blood cells, Blood, 89, 1121-32, 1997.

53. T. Lhermusier, H. Chap, B. Payrastre. Platelet membrane phospholipid asymmetry: from the characterization of a scramblase activity to the identification of an essential protein mutated in Scott syndrome, J Thromb Haemost, 9, 1883-91, 2011.

54. L. M. van der Velden, S. F. van de Graaf, L. W. Klomp. Biochemical and cellular functions of P4 ATPases, Biochem J, 431, 1-11, 2010.

55. S. K. Sahu, S. N. Gummadi, N. Manoj, G. K. Aradhyam. Phospholipid scramblases: an overview, Arch Biochem Biophys, 462, 103-14, 2007.

56. H. Yang, A. Kim, T. David, D. Palmer, T. Jin, J. Tien, F. Huang, T. Cheng, S. R. Coughlin, Y. N. Jan, L. Y. Jan. TMEM16F forms a Ca2+-activated cation channel required for lipid scrambling in platelets during blood coagulation, Cell, 151,111-22, 2012.

57. J. Suzuki, M. Umeda, P. J. Sims, S. Nagata. Calcium-dependent phospholipid scrambling by TMEM16F, Nature, 468, 834-8, 2010.

58. J. W. Heemskerk, W. M. Vuist, M. A. Feijge, C. P. Reutelingsperger, T. Lindhout. Collagen but not fibrinogen surfaces induce bleb formation, exposure of phosphatidylserine, and procoagulant activity of adherent platelets: evidence for regulation by protein tyrosine kinase-dependent Ca2+ responses, Blood, 90, 2615-25, 1997.

59. J. M. Pasquet, J. Dachary-Prigent, A. T. Nurden. Microvesicle release is associated with extensive protein tyrosine dephosphorylation in platelets stimulated by A23187 or a mixture of thrombin and collagen, Biochem J, 333 (Pt 3), 591-9, 1998.

60. L. Alberio, O. Safa, K. J. Clemetson, С. T. Esmon, G. L. Dale. Surface expression and functional characterization of alpha-granule factor V in human platelets: effects of ionophore A23187, thrombin, collagen, and convulxin, Blood, 95, 1694-702, 2000.

61. E. M. Bevers, M. P. Janssen, P. Comfurius, K. Balasubramanian, A. J. Schroit, R. F. Zwaal, G. M. Willems. Quantitative determination of the binding of beta2-glycoprotein I and prothrombin to phosphatidylserine-exposing blood platelets, Biochem J, 386,271-9,2005.

62. C. L. Kempton, M. Hoffman, H. R. Roberts, D. M. Monroe. Platelet heterogeneity: variation in coagulation complexes on platelet subpopulations, Arterioscler Thromb Vase Biol, 25, 861-6, 2005.

63. M. A. Panteleev, N. M. Ananyeva, N. J. Greco, F. I. Ataullakhanov, E. L. Saenko. Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex, J Thromb Haemost, 3, 2545-53, 2005.

64. G. L. Dale. Coated-platelets: an emerging component of the procoagulant response, J Thromb Haemost, 3, 2185-92, 2005.

65. N. N. Topalov, A. O. Yakimenko, M. Canault, E. O. Artemenko, N. V. Zakharova, A. A. Abaeva, M. Loosveld, F. I. Ataullakhanov, A. T. Nurden, M. C. Alessi, M. A. Panteleev. Two types of procoagulant platelets are formed upon physiological activation and are controlled by integrin alpha(IIb)beta(3), Arterioscler Thromb Vase Biol, 32, 2475-83,2012.

66. K. Bledzka, S. S. Smyth, E. F. Plow. Integrin alphallbbeta3: From Discovery to Efficacious Therapeutic Target, Circ Res, 112, 1189-200, 2013.

67. S. P. Jackson, S. M. Schoenwaelder. PI 3-Kinase pllObeta regulation of platelet integrin alpha(IIb)beta3, Curr Top Microbiol Immunol, 346, 203-24, 2010.

68. M. А. Пантелеев, С. А. Васильев, E. И. Синауридзе, А. И. Воробьев, Ф. И. Атауллаханов. Практическая коагулология (Москва, Практическая медицина), 2011.

69. S. Butenas, К. G. Mann. Blood coagulation, Biochemistry (Mosc), 67, 3-12, 2002.

70. J. H. Lawson, M. Kalafatis, S. Stram, K. G. Mann. A model for the tissue factor pathway to thrombin. I. An empirical study, J Biol Chem, 269, 23357-66, 1994.

71. M. T. Wiiger, H. Prydz. The changing faces of tissue factor biology. A personal tribute to the understanding of the "extrinsic coagulation activation", Thromb Haemost, 98, 38-42, 2007.

72. N. Mackman. Role of tissue factor in hemostasis, thrombosis, and vascular development, Arterioscler Thromb Vase Biol, 24,1015-22, 2004.

73. S. Butenas, C. van 't Veer, K. G. Mann. Evaluation of the initiation phase of blood coagulation using ultrasensitive assays for serine proteases, J Biol Chem, 272, 21527-33, 1997.

74. Y. Nemerson. Tissue factor and hemostasis, Blood, 71, 1-8, 1988.

75. J. Jesty, S. A. Silverberg. Kinetics of the tissue factor-dependent activation of coagulation Factors IX and X in a bovine plasma system, J Biol Chem, 254, 12337-45, 1979.

76. L. V. Rao, T. Robinson, A. D. Hoang. Factor Vila/tissue factor-catalyzed activation of factors IX and X on a cell surface and in suspension: a kinetic study, Thromb Haemost, 67, 6549, 1992.

77. S. Higashi, N. Matsumoto, S. Iwanaga. Molecular mechanism of tissue factor-mediated acceleration of factor Vila activity, J Biol Chem, 271,26569-74, 1996.

78. W. Ruf, A. Rehemtulla, J. H. Morrissey, T. S. Edgington. Phospholipid-independent and -dependent interactions required for tissue factor receptor and cofactor function, J Biol Chem, 266, 16256,1991.

79. Y. Komiyama, A. H. Pedersen, W. Kisiel. Proteolytic activation of human factors IX and X by recombinant human factor Vila: effects of calcium, phospholipids, and tissue factor, Biochemistry, 29, 9418-25, 1990.

80. D. M. Monroe, M. Hoffman, J. A. Oliver, H. R. Roberts. Platelet activity of high-dose factor Vila is independent of tissue factor, Br J Haematol, 99, 542-7, 1997.

81. R. W. Colman, A. H. Schmaier. Contact system: a vascular biology modulator with anticoagulant, pro fibrinolytic, antiadhesive, and proinflammatory attributes, Blood, 90, 3819-43, 1997.

82. S. D. Revak, C. G. Cochrane, B. N. Bouma, J. H. Griffin. Surface and fluid phase activities of two forms of activated Hageman factor produced during contact activation of plasma, J Exp Med, 147,719-29, 1978.

83. U. Seligsohn. Factor XI deficiency, Thromb Haemost, 70, 68-71, 1993.

84. C. Kleinschnitz, G. Stoll, M. Bendszus, K. Schuh, H. U. Pauer, P. Burfeind, C. Renne, D. Gailani, B. Nieswandt, T. Renne. Targeting coagulation factor XII provides protection from pathological thrombosis in cerebral ischemia without interfering with hemostasis, J Exp Med, 203,513-8,2006.

85. T. Renne, B. Nieswandt, D. Gailani. The intrinsic pathway of coagulation is essential for thrombus stability in mice, Blood Cells Mol Dis, 36, 148-51, 2006.

74

86. F. Muller, Т. Renne. Platelet polyphosphates: the nexus of primary and secondary hemostasis, ScandJClin Lab Invest, 71, 82-6, 2011.

87. M. В. Ованесов. Влияние факторов внутреннего пути свертывания крови на пространственную динамику роста сгустка: дис. канд. биол. наук, ГУ ГНЦ РАМН, Москва, 2002.

88. D. Gailani, D. Но, М. F. Sun, Q. Cheng, P. N. Walsh. Model for a factor IX activation complex on blood platelets: dimeric conformation of factor XIa is essential, Blood, 97, 3117-22, 2001.

89. E. W. Davie, O. D. Ratnoff. Waterfall Sequence for Intrinsic Blood Clotting, Science, 145, 1310-2, 1964.

90. R. G. Macfarlane. An Enzyme Cascade in the Blood Clotting Mechanism, and Its Function as a Biochemical Amplifier, Nature, 202, 498-9, 1964.

91. B. Blomback, B. Hessel, D. Hogg, L. Therkildsen. A two-step fibrinogen—fibrin transition in blood coagulation, Nature, 275, 501-5, 1978.

92. B. Blomback. Fibrinogen and fibrin—proteins with complex roles in hemostasis and thrombosis, Thromb Res, 83, 1-75, 1996.

93. К. E. Brummel, S. Butenas, K. G. Mann. An integrated study of fibrinogen during blood coagulation, J Biol Chem, 274, 22862-70, 1999.

94. D. Gailani, G. J. Broze, Jr. Factor XI activation in a revised model of blood coagulation, Science, 253,909-12, 1991.

95. S. Butenas, K. G. Mann. Kinetics of human factor VII activation, Biochemistry, 35, 1904-10, 1996.

96. M. E. Nesheim, K. G. Mann. Thrombin-catalyzed activation of single chain bovine factor V, J Biol Chem, 254, 1326-34, 1979.

97. M. E. Rick, L. W. Hoyer. Thrombin activation of factor VIII: the effect of inhibitors, Br J Haematol, 36, 585-97, 1977.

98. J. Pieters, G. Willems, H. C. Hemker, T. Lindhout. Inhibition of factor IXa and factor Xa by antithrombin III/heparin during factor X activation, J Biol Chem, 263, 15313-8, 1988.

99. P. G. Barton, С. M. Jackson, D. J. Hanahan. Relationship between factor V and activated factor X in the generation of prothrombinase, Nature, 214, 923-4, 1967.

100. K. G. Mann, M. E. Nesheim, W. R. Church, P. Haley, S. Krishnaswamy. Surface-dependent reactions of the vitamin K-dependent enzyme complexes, Blood, 76, 1-16, 1990.

101. K. G. Mann, S. Krishnaswamy, J. H. Lawson. Surface-dependent hemostasis, Semin Hematol, 29,213-26, 1992.

102. D. С. Hill-Eubanks, P. Lollar. von Willebrand factor is a cofactor for thrombin-catalyzed cleavage of the factor VIII light chain, J Biol Chem, 265, 17854-8, 1990.

103. D. D. Monkovic, P. B. Tracy. Activation of human factor V by factor Xa and thrombin, Biochemistry, 29, 1118-28, 1990.

104. G. van Dieijen, G. Tans, J. Rosing, H. C. Hemker. The role of phospholipid and factor Villa in the activation of bovine factor X, J Biol Chem, 256, 3433-42, 1981.

105. M. E. Nesheim, J. B. Taswell, K. G. Mann. The contribution of bovine Factor V and Factor Va to the activity of prothrombinase, J Biol Chem, 254, 10952-62, 1979.

106. M. P. Moyer, R. P. Tracy, P. B. Tracy, C. van't Veer, С. E. Sparks, K. G. Mann. Plasma lipoproteins support prothrombinase and other procoagulant enzymatic complexes, Arterioscler Thromb Vase Biol, 18, 458-65, 1998.

107. S. P. Bajaj, J. A. Harmony, M. Martinez-Carrion, F. J. Castellino. Human plasma lipoproteins as accelerators of prothrombin activation, J Biol Chem, 251, 5233-6, 1976.

108. 3. С. Баркаган. Геморрагические заболевания и синдромы. (Москва), 1988.

109. Ф. Д. Шиффман. Патофизиология крови. (Binom Publishers), 2000.

110. К. G. Mann. Biochemistry and physiology of blood coagulation, Thromb Haemost, 82, 16574, 1999.

111. С. T. Esmon. Regulation of blood coagulation, Biochim Biophys Acta, 1477, 349-60, 2000.

112. S. Solymoss, M. M. Tucker, P. B. Tracy. Kinetics of inactivation of membrane-bound factor Va by activated protein C. Protein S modulates factor Xa protection, J Biol Chem, 263, 1488490,1988.

113. A. Baerga-Ortiz, A. R. Rezaie, E. A. Komives. Electrostatic dependence of the thrombin-thrombomodulin interaction, J Mol Biol, 296, 651-8, 2000.

114. Ф. И. Атауллаханов, Г. Т. Гурия. Пространственные аспекты свертывания крови. ГГипотеза., Биофизика, 39, 98-96, 1994.

115. V. I. Zarnitsina, А. V. Pokhilko, F. I. Ataullakhanov. A mathematical model for the spatiotemporal dynamics of intrinsic pathway of blood coagulation. II. Results, Thromb Res, 84, 33344, 1996.

116. M. A. Panteleev, M. V. Ovanesov, D. A. Kireev, A. M. Shibeko, E. I. Sinauridze, N. M. Ananyeva, A. A. Butylin, E. L. Saenko, F. I. Ataullakhanov. Spatial propagation and localization of blood coagulation are regulated by intrinsic and protein С pathways, respectively, Biophys J, 90, 1489-500, 2006.

117. B. Lammle, J. H. Griffin. Formation of the fibrin clot: the balance of procoagulant and inhibitory factors, Clin Haematol, 14, 281-342, 1985.

118. Я. М. Ена, Т. Н. Платонова, Е. А. Сушко, Т. В. Шевчук. Антитромбин III: функциональная характеристика и клиническое значение, Биохимия, 9, 18, 1993.

119. R. С. Friedberg, Р. О. Hagen, S. V. Pizzo. The role of endothelium in factor Xa regulation: the effect of plasma proteinase inhibitors and hirudin, Blood, 71, 1321-8, 1988.

120. H. S. Chand, D. C. Foster, W. Kisiel. Structure, function and biology of tissue factor pathway inhibitor-2, Thromb Haemost, 94, 1122-30, 2005.

121. Т. M. Hackeng, J. Rosing. Protein S as cofactor for TFPI, Arterioscler Thromb Vase Biol, 29, 2015-20,2009.

122. V. De Stefano, G. Finazzi, P. M. Mannucci. Inherited thrombophilia: pathogenesis, clinical syndromes, and management, Blood, 87, 3531-44,1996.

123. M. Kalafatis, K. G. Mann. Factor VLeiden and thrombophilia, Arterioscler Thromb Vase Biol, 17, 620-7, 1997.

124. 3. С. Баркаган, Момот, А.П. Основы диагностики нарушений гемостаза. (Москва),

1999.

125. D. Lillicrap, N. Key, М. Makris, O'Shaughnessy. Practical Hemostasis and Thrombosis. (Wiley-Blackwell, Wiley-Blackwell), 2009.

126. M. Popovic, K. Smiljanic, B. Dobutovic, T. Syrovets, T. Simmet, E. R. Isenovic. Thrombin and vascular inflammation, Mol Cell Biochem, 359, 301-13, 2012.

127. J. Deinum, C. Mattsson, T. Inghardt, M. Elg. Biochemical and pharmacological effects of the direct thrombin inhibitor AR-H067637, Thromb Haemost, 101,1051-9, 2009.

128. J. van Ryn, J. Stangier, S. Haertter, К. H. Liesenfeld, W. Wienen, M. Feuring, A. Clemens. Dabigatran etexilate—a novel, reversible, oral direct thrombin inhibitor: interpretation of coagulation assays and reversal of anticoagulant activity, Thromb Haemost, 103, 1116-27, 2010.

129. Г. E. Ройтберг, А. В. Струтынский. Лабораторная и инструментальная диагностика внутренних органов. (Москва, Бином), 2003.

130. Н. С. Hemker, R. A1 Dieri, Е. De Smedt, S. Beguin. Thrombin generation, a function test of the haemostatic-thrombotic system, Thromb Haemost, 96, 553-61, 2006.

131. H. C. Hemker, S. Beguin. Phenotyping the clotting system, Thromb Haemost, 84, 747-51,

2000.

132. H. Hartert. Blutgerinnungsstudienmit der Thrombelastographie, einem neuen Untersuchungsverfahren, Klin Wochenschr, 26, 577-83, 1948.

133. M. van Geffen, W. L. van Heerde. Global haemostasis assays, from bench to bedside, Thromb Res, 2012.

134. R. J. Luddington. Thrombelastography/thromboelastometry, Clin Lab Haematol, 27, 81-90, 2005.

135. К. Oshita, Т. Az-ma, Y. Osawa, О. Yuge. Quantitative measurement of thromboelastography as a function of platelet count, Anesth Analg, 89, 296-9, 1999.

136. G. F. Genet, S. R. Ostrowski, A. M. Sorensen, P. I. Johansson. Detection of tPA-induced hyperfibrinolysis in whole blood by RapidTEG, KaolinTEG, and functional fibrinogenTEG in healthy individuals, ClinAppl Thromb Hemost, 18, 638-44, 2012.

137. M. J. Gallimore, S. L. Harris, K. A. Tappenden, M. Winter, D. W. Jones. Urokinase induced fibrinolysis in thromboelastography: a model for studying fibrinolysis and coagulation in whole blood, J Thromb Haemost, 3, 2506-13, 2005.

138. A. Kupesiz, M. Rajpurkar, I. Warrier, W. Hollon, O. Tosun, J. Lusher, M. Chitlur. Tissue plasminogen activator induced fibrinolysis: standardization of method using thromboelastography, Blood Coagul Fibrinolysis, 21, 320-4, 2010.

139. G. E. Rivard, К. E. Brummel-Ziedins, K. G. Mann, L. Fan, A. Hofer, E. Cohen. Evaluation of the profile of thrombin generation during the process of whole blood clotting as assessed by thrombelastography, J Thromb Haemost, 3, 2039-43, 2005.

140. Y. G. Kang, D. J. Martin, J. Marquez, J. H. Lewis, F. A. Bontempo, B. W. Shaw, Jr., Т. E. Starzl, P. M. Winter. Intraoperative changes in blood coagulation and thrombelastographic monitoring in liver transplantation, Anesth Analg, 64, 888-96, 1985.

141. U. Cammerer, W. Dietrich, T. Rampf, S. L. Braun, J. A. Richter. The predictive value of modified computerized thromboelastography and platelet function analysis for postoperative blood loss in routine cardiac surgery, Anesth Analg, 96, 51-7, table of contents, 2003.

142. О. M. Akay, Z. Ustuner, Z. Canturk, F. S. Mutlu, Z. Gulbas. Laboratory investigation of hypercoagulability in cancer patients using rotation thrombelastography, Med Oncol, 26, 358-64, 2009.

143. P. W. Collins, L. I. Macchiavello, S. J. Lewis, N. J. Macartney, A. G. Saayman, R. Luddington, T. Baglin, G. P. Findlay. Global tests of haemostasis in critically ill patients with severe sepsis syndrome compared to controls, Br J Haematol, 135, 220-7, 2006.

144. А. В. Кречетова. Нарушение гемостаза при сепсисе у онкогематологических больных в период миелотоксического агранулоцитоза: дисс. канд. мед. наук, ФГБУ ГНЦ МЗСР РФ, Москва, 2011.

145. О. A. Fadeeva, М. A. Panteleev, S. S. Karamzin, А. N. Balandina, I. V. Smirnov, F. I. Ataullakhanov. Thromboplastin immobilized on polystyrene surface exhibits kinetic characteristics close to those for the native protein and activates in vitro blood coagulation similarly to thromboplastin on fibroblasts, Biochemistry (Mosc), 75, 734-43, 2010.

146. L. A. Parunov, O. A. Fadeeva, A. N. Balandina, N. P. Soshitova, K. G. Kopylov, M. A. Kumskova, J. C. Gilbert, R. G. Schaub, К. E. McGinness, F. I. Ataullakhanov, M. A. Panteleev.

78

Improvement of spatial fibrin formation by the anti-TFPI aptamer BAX499: changing clot size by targeting extrinsic pathway initiation, J Thromb Haemost, 9, 1825-34, 2011.

147. M. V. Ovanesov, N. M. Ananyeva, M. A. Panteleev, F. I. Ataullakhanov, E. L. Saenko. Initiation and propagation of coagulation from tissue factor-bearing cell monolayers to plasma: initiator cells do not regulate spatial growth ratq, J Thromb Haemost, 3, 321-31, 2005.

148. M. V. Ovanesov, M. A. Panteleev, E. I. Sinauridze, D. A. Kireev, O. P. Plyushch, K. G. Kopylov, E. G. Lopatina, E. L. Saenko, F. I. Ataullakhanov. Mechanisms of action of recombinant activated factor VII in the context of tissue factor concentration and distribution, Blood Coagul Fibrinolysis, 19, 743-55, 2008.

149. N. P. Soshitova, S. S. Karamzin, A. N. Balandina, O. A. Fadeeva, A. V. Kretchetova, G. M. Galstian, M. A. Panteleev, F. I. Ataullakhanov. Predicting prothrombotic tendencies in sepsis using spatial clot growth dynamics, Blood Coagul Fibrinolysis, 23, 498-507, 2012.

150. N. M. Dashkevich, M. V. Ovanesov, A. N. Balandina, S. S. Karamzin, P. I. Shestakov, N. P. Soshitova, A. A. Tokarev, M. A. Panteleev, F. I. Ataullakhanov. Thrombin activity propagates in space during blood coagulation as an excitation wave, Biophys J, 103, 2233-40, 2012.

151. U. M. Okorie, S. L. Diamond. Matrix protein microarrays for spatially and compositionally controlled microspot thrombosis under laminar flow, Biophys J, 91, 3474-81, 2006.

152. M. V. Ovanesov, J. V. Krasotkina, L. I. Ul'yanova, K. V. Abushinova, O. P. Plyushch, S. P. Domogatskii, A. I. Vorob'ev, F. I. Ataullakhanov. Hemophilia A and B are associated with abnormal spatial dynamics of clot growth, Biochim Biophys Acta, 1572,45-57, 2002.

153. F. I. Ataullakhanov, N. M. Dashkevich, C. Negrier, M. A. Panteleev. Factor XI and traveling waves: the key to understanding coagulation in hemophilia?, Expert Rev Hematol, 6, 111-3,2013.

154. W. R. Pitney, J. V. Dacie. A simple method of studying the generation of thrombin in recalcified plasma; application in the investigation of haemophilia, J Clin Pathol, 6, 9-14,1953.

155. H. C. Hemker, P. Giesen, R. AlDieri, V. Regnault, E. de Smed, R. Wagenvoord, T. Lecompte, S. Beguin. The calibrated automated thrombogram (CAT): a universal routine test for hyper- and hypocoagulability, Pathophysiol Haemost Thromb, 32, 249-53, 2002.

156. Y. Dargaud, M. C. Trzeciak, J. C. Bordet, J. Ninet, C. Negrier. Use of calibrated automated thrombinography +/- thrombomodulin to recognise the prothrombotic phenotype, Thromb Haemost, 96, 562-7, 2006.

157. K. A. Tanaka, F. Szlam, H. Y. Sun, T. Taketomi, J. H. Levy. Thrombin generation assay and viscoelastic coagulation monitors demonstrate differences in the mode of thrombin inhibition between unfractionated heparin and bivalirudin, Anesth Analg, 105, 933-9, table of contents, 2007.

158. S. Beguin, I. Keularts, R. A1 Dieri, S. Bellucci, J. Caen, H. C. Hemker. Fibrin polymerization is crucial for thrombin generation in platelet-rich plasma in a VWF-GPIb-dependent process, defective in Bernard-Soulier syndrome, J Thromb Haemost, 2, 170-6, 2004.

159. M. S. Goel, S. L. Diamond. Neutrophil cathepsin G promotes prothrombinase and fibrin formation under flow conditions by activating fibrinogen-adherent platelets, J Biol Chem, 278, 9458-63,2003.

160. K. Vanschoonbeek, M. A. Feijge, R. J. Van Kampen, H. Kenis, H. C. Hemker, P. L. Giesen, J. W. Heemskerk. Initiating and potentiating role of platelets in tissue factor-induced thrombin generation in the presence of plasma: subject-dependent variation in thrombogram characteristics, J Thromb Haemost, 2, 476-84, 2004.

161. P. E. van der Meijden, M. A. Feijge, P. L. Giesen, M. Huijberts, L. P. van Raak, J. W. Heemskerk. Platelet P2Y12 receptors enhance signalling towards procoagulant activity and thrombin generation. A study with healthy subjects and patients at thrombotic risk, Thromb Haemost, 93, 1128-36, 2005.

162. R. Altman, A. Scazziota, S. Santoro, C. Gonzalez. Abciximab does not inhibit the increase of thrombin generation produced in platelet-rich plasma in vitro by sodium arachidonate or tissue factor, Clin Appl Thromb Hemost, 11, 271-7, 2005.

163. V. Ollivier, J. Wang, D. Manly, K. R. Machlus, A. S. Wolberg, M. Jandrot-Perrus, N. Mackman. Detection of endogenous tissue factor levels in plasma using the calibrated automated thrombogram assay, Thromb Res, 125, 90-6, 2010.

164.1. Lopez-Vilchez, M. Diaz-Ricart, J. G. White, G. Escolar, A. M. Galan. Serotonin enhances platelet procoagulant properties and their activation induced during platelet tissue factor uptake, Cardiovasc Res, 84, 309-16, 2009.

165. F. Semeraro, C. T. Ammollo, J. H. Morrissey, G. L. Dale, P. Friese, N. L. Esmon, C. T. Esmon. Extracellular histones promote thrombin generation through platelet-dependent mechanisms: involvement of platelet TLR2 and TLR4, Blood, 118, 1952-61, 2011.

166. Y. Dargaud, R. Luddington, T. P. Baglin. Elimination of contact factor activation improves measurement of platelet-dependent thrombin generation by calibrated automated thrombography at low-concentration tissue factor, J Thromb Haemost, 4, 1160-1, 2006.

167. R. Luddington, T. Baglin. Clinical measurement of thrombin generation by calibrated automated thrombography requires contact factor inhibition, J Thromb Haemost, 2, 1954-9, 2004.

168. G. T. Gerotziafas, F. Depasse, T. Chakroun, M. M. Samama, I. Elalamy. Recombinant factor Vila partially reverses the inhibitory effect of fondaparinux on thrombin generation after

tissue factor activation in platelet rich plasma and whole blood, Thromb Haemost, 91, 531-7, 2004.

169. T. Baglin. The measurement and application of thrombin generation, Br J Haematol, 130, 653-61,2005.

170. H. Haidl, C. Cimenti, B. Leschnik, D. Zach, W. Muntean. Age-dependency of thrombin generation measured by means of calibrated automated thrombography (CAT), Thromb Haemost, 95, 772-5, 2006.

171. R. Altman, A. Scazziota, D. E. L. H. M, C. Gonzalez. Recombinant factor Vila reverses the inhibitory effect of aspirin or aspirin plus clopidogrel on in vitro thrombin generation, J Thromb Haemost, 4, 2022-7, 2006.

172. Y. Dargaud, R. Luddington, E. Gray, C. Negrier, T. Lecompte, S. Petros, J. Hogwood, J. C. Bordet, V. Regnault, A. Siegemund, T. Baglin. Effect of standardization and normalization on imprecision of calibrated automated thrombography: an international multicentre study, Br J Haematol, 139, 303-9, 2007.

173. S. J. Lewis, E. Stephens, G. Florou, N. J. Macartney, L. S. Hathaway, J. Knipping, P. W. Collins. Measurement of global haemostasis in severe haemophilia A following factor VIII infusion, Br J Haematol, 138, 775-82, 2007.

174. H. C. Hemker, P. L. Giesen, M. Ramjee, R. Wagenvoord, S. Beguin. The thrombogram: monitoring thrombin generation in platelet-rich plasma, Thromb Haemost, 83, 589-91,2000.

175. F. Lanza. Bernard-Soulier syndrome (hemorrhagiparous thrombocytic dystrophy), Orphanet J Rare Dis, 1, 46, 2006.

176. T. Siegemund, S. Petros, A. Siegemund, U. Scholz, L. Engelmann. Thrombin generation in severe haemophilia A and B: the endogenous thrombin potential in platelet-rich plasma, Thromb Haemost, 90, 781-6, 2003.

177. E. Santagostino, M. E. Mancuso, A. Tripodi, V. Chantarangkul, M. Clerici, I. Garagiola, P. M. Mannucci. Severe hemophilia with mild bleeding phenotype: molecular characterization and global coagulation profile, J Thromb Haemost, 8, 737-43, 2010.

178. G. T. Gerotziafas, A. D. Petropoulou, E. Verdy, M. M. Samama, I. Elalamy. Effect of the anti-factor Xa and anti-factor Ha activities of low-molecular-weight heparins upon the phases of thrombin generation, J Thromb Haemost, 5, 955-62, 2007.

179. B. Tardy-Poncet, M. Piot, C. Chapelle, G. France, L. Campos, O. Garraud, H. Decousus, P. Mismetti, B. Tardy. Thrombin generation and heparin-induced thrombocytopenia, J Thromb Haemost, 7, 1474-81, 2009.

180. C. G. Faber, J. Lodder, F. Kessels, J. Troost. Thrombin generation in platelet-rich plasma as a tool for the detection of hypercoagulability in young stroke patients, Pathophysiol Haemost Thromb, 33, 52-8, 2003.

181. R. Altaian, A. Scazziota, M. de Lourdes Herrera, C. D. Gonzalez. The hemostatic profile of recombinant activated factor VII. Can low concentrations stop bleeding in off-label indications?, Thromb J, 8, 8,2010.

182. C. Duckers, P. Simioni, L. Spiezia, C. Radu, P. Dabrilli, S. Gavasso, J. Rosing, E. Castoldi. Residual platelet factor V ensures thrombin generation in patients with severe congenital factor V deficiency and mild bleeding symptoms, Blood, 115, 879-86, 2010.

183. E. Castoldi, C. Duckers, C. Radu, L. Spiezia, V. Rossetto, G. Tagariello, J. Rosing, P. Simioni. Homozygous F5 deep-intronic splicing mutation resulting in severe factor V deficiency and undetectable thrombin generation in platelet-rich plasma, J Thromb Haemost, 9, 959-68, 2011.

184. R. Wagenvoord, P. W. Hemker, H. C. Hemker. The limits of simulation of the clotting system, J Thromb Haemost, 4, 1331-8, 2006.

185. K. R. Machlus, E. A. Colby, J. R. Wu, G. G. Koch, N. S. Key, A. S. Wolberg. Effects of tissue factor, thrombomodulin and elevated clotting factor levels on thrombin generation in the calibrated automated thrombogram, Thromb Haemost, 102, 936-44, 2009.

186. Towards a recommendation for the standardization of the measurement of platelet-dependent thrombin generation, J Thromb Haemost, 9, 1859-61, 2011.

187. P. J. Lenting, J. A. van Mourik, K. Mertens. The life cycle of coagulation factor VIII in view of its structure and function, Blood, 92, 3983-96, 1998.

188. F. Giannelli, K. H. Choo, D. J. Rees, Y. Boyd, C. R. Rizza, G. G. Brownlee. Gene deletions in patients with haemophilia B and anti-factor IX antibodies, Nature, 303, 181-2, 1983.

189. J. M. Soucie, B. Evatt, D. Jackson. Occurrence of hemophilia in the United States. The Hemophilia Surveillance System Project Investigators, Am JHematol, 59, 288-94,1998.

190. C. Hermans, P. De Moerloose, K. Fischer, K. Holstein, R. Klamroth, T. Lambert, G. Lavigne-Lissalde, R. Perez, M. Richards, G. Dolan. Management of acute haemarthrosis in haemophilia A without inhibitors: literature review, European survey and recommendations, Haemophilia, 17, 383-92, 2011.

191. M. J. Manco-Johnson, T. C. Abshire, A. D. Shapiro, B. Riske, M. R. Hacker, R. Kilcoyne, J. D. Ingram, M. L. Manco-Johnson, S. Funk, L. Jacobson, L. A. Valentino, W. K. Hoots, G. R. Buchanan, D. DiMichele, M. Recht, D. Brown, C. Leissinger, S. Bleak, A. Cohen, P. Mathew, A. Matsunaga, D. Medeiros, D. Nugent, G. A. Thomas, A. A. Thompson, K. McRedmond, J. M.

Soucie, H. Austin, B. L. Evatt. Prophylaxis versus episodic treatment to prevent joint disease in boys with severe hemophilia, N Engl J Med, 357, 535-44, 2007.

192. T. W. Barrowcliffe, S. Raut, D. Sands, A. R. Hubbard. Coagulation and chromogenic assays of factor VIII activity: general aspects, standardization, and recommendations, Semin Thromb Hemost, 28, 247-56, 2002.

193. R. L. Lundblad, H. S. Kingdon, K. G. Mann, G. C. White. Issues with the assay of factor VIII activity in plasma and factor VIII concentrates, Thromb Haemost, 84, 942-8, 2000.

194. W. L. Chandler, C. Ferrell, J. Lee, T. Tun, H. Kha. Comparison of three methods for measuring factor VIII levels in plasma, Am J Clin Pathol, 120, 34-9, 2003.

195. S. Cinotti, G. Longo, A. Messori, M. Morfini, M. Blomback, K. Schimpf, K. Schumacher, H. Kjellman, A. Novakova-Banet, U. Delvos. Reproducibility of one-stage, two-stage and chromogenic assays of factor VIII activity: a multi-center study, Thromb Res, 61, 385-93, 1991.

196. S. Butenas, B. Parhami-Seren, A. Undas, D. N. Fass, K. G. Mann. The "normal" factor VIII concentration in plasma, Thromb Res, 126, 119-23, 2010.

197. J. Oldenburg, A. Pavlova. Discrepancy between one-stage and chromogenic factor VIII activity assay results can lead to misdiagnosis of haemophilia A phenotype, Hamostaseologie, 30,207-11,2010.

198. G. C. White, 2nd, F. Rosendaal, L. M. Aledort, J. M. Lusher, C. Rothschild, J. Ingerslev. Definitions in hemophilia. Recommendation of the scientific subcommittee on factor VIII and factor IX of the scientific and standardization committee of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, Thromb Haemost, 85, 560,2001.

199. M. Franchini, M. Montagnana, G. Targher, D. Veneri, M. Zaffanello, G. L. Salvagno, F. Manzato, G. Lippi. Interpatient phenotypic inconsistency in severe congenital hemophilia: a systematic review of the role of inherited thrombophilia, Semin Thromb Hemost, 35, 307-12, 2009.

200. H. M. van den Berg, P. H. De Groot, K. Fischer. Phenotypic heterogeneity in severe hemophilia, J Thromb Haemost, 5 Suppl 1, 151-6, 2007.

201. C. P. Beltran-Miranda, A. Khan, A. R. Jaloma-Cruz, M. A. Laffan. Thrombin generation and phenotypic correlation in haemophilia A, Haemophilia, 11, 326-34, 2005.

202. M. Bladen, E. Main, N. Hubert, E. Koutoumanou, R. Liesner, K. Khair. Factors affecting the Haemophilia Joint Health Score in children with severe haemophilia, Haemophilia, 2013.

203. S. Shetty, K. Ghosh. Reduced clinical severity in a mutationally well-characterized cohort of severe hemophilia with associated thrombophilia, Am J Clin Pathol, 130, 84-7; quiz 146, 2008.

204. R. K. Pruthi, J. A. Heit, M. M. Green, L. M. Emiliusen, W. L. Nichols, J. L. Wilke, D. A. Gastineau. Venous thromboembolism after hip fracture surgery in a patient with haemophilia B and factor V Arg506Gln (factor V Leiden), Haemophilia, 6, 631-4, 2000.

205. C. E. Ettingshausen, I. M. Saguer, W. Kreuz. Portal vein thrombosis in a patient with severe haemophilia A and F V G1691A mutation during continuous infusion of F VIII after intramural jejunal bleeding—successful thrombolysis under heparin therapy, Eur J Pediatr, 158 Suppl 3, SI 80-2, 1999.

206. V. De Stefano, G. Leone. Resistance to activated protein C due to mutated factor V as a novel cause of inherited thrombophilia, Haematologica, 80, 344-56, 1995.

207. M. Franchini, G. Lippi. Factor V Leiden and hemophilia, Thromb Res, 125, 119-23, 2010.

208. U. Nowak-Gottl, C. Escuriola, K. Kurnik, R. Schobess, S. Horneff, A. Kosch, W. Kreuz, H. Pollmann. Haemophilia and thrombophilia. What do we learn about combined inheritance of both genetic variations?, Hamostaseologie, 23, 36-40, 2003.

209. K. Kurnik, W. Kreuz, S. Horneff, C. During, R. Schobess, C. Bidlingmaier, C. E. Ettingshausen, A. Krumpel, N. Bogdanova, U. Nowak-Gottl. Effects of the factor V G1691A mutation and the factor II G20210A variant on the clinical expression of severe hemophilia A in children-results of a multicenter studys, Haematologica, 92, 982-5, 2007.

210. D. H. Lee, I. R. Walker, J. Teitel, M. C. Poon, B. Ritchie, J. Akabutu, G. D. Sinclair, M. Pai, J. W. Wu, S. Reddy, C. Carter, G. Growe, D. Lillicrap, M. Lam, M. A. Blajchman. Effect of the factor V Leiden mutation on the clinical expression of severe hemophilia A, Thromb Haemost, 83, 387-91, 2000.

211. S. Shetty, S. Vora, B. Kulkarni, L. Mota, M. Vijapurkar, L. Quadros, K. Ghosh. Contribution of natural anticoagulant and fibrinolytic factors in modulating the clinical severity of haemophilia patients, Br J Haematol, 138, 541-4, 2007.

212. V. R. Arruda, J. M. Annichino-Bizzacchi, S. V. Antunes, F. F. Coasta. Association of severe haemophilia A and factor V Leiden: report of three cases, Haemopilia, 2, 51-53, 1996.

213. F. Araujo, M. Fraga, I. Henriques, F. Monteiro, E. Meireles, C. Pereira, P. Lacerda, L. M. Cunha-Ribeiro. The clinical phenotype modulation of haemophilia by prothrombotic gene mutations, Haemophilia, 9, 235-6, 2003.

214. J. A. Schneider, D. C. Rees, Y. T. Liu, J. B. Clegg. Worldwide distribution of a common methylenetetrahydrofolate reductase mutation, Am J Hum Genet, 62, 1258-60, 1998.

215. M. Fodinger, W. H. Horl, G. Sunder-Plassmann. Molecular biology of 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase, J Nephrol, 13, 20-33, 2000.

216. M. Grunewald, A. Siegemund, A. Grunewald, A. Konegan, M. Koksch, M. Griesshammer. Paradoxical hyperfibrinolysis is associated with a more intensely haemorrhagic phenotype in severe congenital haemophilia, Haemophilia, 8, 768-75, 2002.

217. P. Kubisz, J. Stasko, M. Dobrotova, J. Ivankova, D. Mesko. Severe hemophilia and physiologic inhibitors of coagulation, Clin Appl Thromb Hemost, 11, 331-4,2005.

218. M. Young, H. Inaba, L. W. Hoyer, M. Higuchi, H. H. Kazazian, Jr., S. E. Antonarakis. Partial correction of a severe molecular defect in hemophilia A, because of errors during expression of the factor VIII gene, Am J Hum Genet, 60, 565-73, 1997.

219. J. Oldenburg, J. Schroder, C. Schmitt, H. H. Brackmann, R. Schwaab. Small deletion/insertion mutations within poly-A runs of the factor VIII gene mitigate the severe haemophilia A phenotype, Thromb Haemost, 79, 452-3, 1998.

220. K. Saxena, K. Pethe, G. L. Dale. Coated-platelet levels may explain some variability in clinical phenotypes observed with severe hemophilia, J Thromb Haemost, 8,1140-2,2010.

221. U. Wartiovaara-Kautto, L. Joutsi-Korhonen, S. Ilveskero, E. Armstrong, R. Lassila. Platelets significantly modify procoagulant activities in haemophilia A, Haemophilia, 17, 74351,2011.

222. H. Pettersson. Radiographic scores and implications, Semin Hematol, 30, 7-9, 1993.

223. J. J. van Veen, A. Gatt, A. E. Bowyer, P. C. Cooper, S. Kitchen, M. Makris. Calibrated automated thrombin generation and modified thromboelastometry in haemophilia A, Thromb Res, 123,895-901,2009.

224. K. E. Brummel-Ziedins, M. F. Whelihan, M. Gissel, K. G. Mann, G. E. Rivard. Thrombin generation and bleeding in haemophilia A, Haemophilia, 15, 1118-25, 2009.

225. J. A. Penner. Haemophilic patients with inhibitors to factor VIII or IX: variables affecting treatment response, Haemophilia, 7, 103-8, 2001.

226. C. R. Rizza, R. J. Spooner. Treatment of haemophilia and related disorders in Britain and Northern Ireland during 1976-80: report on behalf of the directors of haemophilia centres in the United Kingdom, Br Med J (Clin Res Ed), 286, 929-33, 1983.

227. B. Verbruggen, I. Novakova, H. Wessels, J. Boezeman, M. van den Berg, E. Mauser-Bunschoten. The Nijmegen modification of the Bethesda assay for factor VIII:C inhibitors: improved specificity and reliability, Thromb Haemost, 73, 247-51, 1995.

228. E. I. Sinauridze, D. A. Kireev, N. Y. Popenko, A. V. Pichugin, M. A. Panteleev, O. V. Krymskaya, F. I. Ataullakhanov. Platelet microparticle membranes have 50- to 100-fold higher specific procoagulant activity than activated platelets, Thromb Haemost, 97,425-34,2007.

229. Н. С. Hemker, P. Giesen, R. A1 Dieri, V. Regnault, E. de Smedt, R. Wagenvoord, T. Lecompte, S. Beguin. Calibrated automated thrombin generation measurement in clotting plasma, Pathophysiol Haemost Thromb, 33, 4-15, 2003.

230. H. С. Бахвалов, Жидков, Н.П., Кобельков, Г.М. Численные методы. (Москва, Бином. Лаборатория знаний), 2003.

231. J. P. Brammer, М. Н. Maguire. Arachidonate metabolism, 5-hydroxytryptamine release and aggregation in human platelets activated by palmitaldehyde acetal phosphatidic acid, Br J Pharmacol, 82, 61-72, 1984.

232. H. П. Сошитова. Выявление нарушений гемостаза при сепсисе с помощью метода пространственного роста сгустка: дисс. канд. биол. наук, ФГБУ ГНЦ МЗСР РФ, Москва, 2012.

233. G. С. Holtz, R. В. Davis. Inhibition of human platelet aggregation by dimethylsulfoxide, dimethylacetamide, and sodium glycerophosphate, Proc Soc Exp Biol Med, 141, 244-8, 1972.

234. L. Asmis, F. C. Tanner, I. Sudano, T. F. Luscher, G. G. Camici. DMSO inhibits human platelet activation through cyclooxygenase-1 inhibition. A novel agent for drug eluting stents?, Biochem Biophys Res Commun, 391, 1629-33, 2010.

235. E. J. Gumbel. Statistical theory of extreme values and some practical applications; a series of lectures. (Washington,, U.S. Govt. Print. Office), 1954.

236. D. M. Monroe, M. Hoffman, H. R. Roberts. Platelets and thrombin generation, Arterioscler Thromb Vase Biol, 22, 1381-9, 2002.

237. J. Caen, Q. Wu. Hageman factor, platelets and polyphosphates: early history and recent connection, J Thromb Haemost, 8, 1670-4, 2010.

238. D. Iyu, M. Juttner, J. R. Glenn, A. E. White, A. J. Johnson, S. C. Fox, S. Heptinstall. PGE1 and PGE2 modify platelet function through different prostanoid receptors, Prostaglandins Other Lipid Mediat, 94, 9-16, 2011.

239. G. G. Camici, J. Steffel, A. Akhmedov, N. Schafer, J. Baldinger, U. Schulz, K. Shojaati, C. M. Matter, Z. Yang, T. F. Luscher, F. C. Tanner. Dimethyl sulfoxide inhibits tissue factor expression, thrombus formation, and vascular smooth muscle cell activation: a potential treatment strategy for drug-eluting stents, Circulation, 114, 1512-21, 2006.

240. M. Cetin, B. Eser, O. Er, A. Unal, E. Kilic, T. Patiroglu, H. S. Coskun, M. Altinbas, D. Arslan, O. Ilhan. Effects of DMSO on platelet functions and P-selectin expression during storage, Transfus Apher Sci, 24, 261-7, 2001.

241. S. W. Jacob, J. C. de la Torre. Pharmacology of dimethyl sulfoxide in cardiac and CNS damage, Pharmacol Rep, 61, 225-35, 2009.

242. L. P. Mueller, S. Theurich, M. Christopeit, W. Grothe, A. Muetherig, T. Weber, S. Guenther, G. Behre. Neurotoxicity upon infusion of dimethylsulfoxide-cryopreserved peripheral blood stem cells in patients with and without pre-existing cerebral disease, Eur J Haematol, 78, 527-31,2007.

243. A. S. Chen-Plotkin, K. A. Vossel, M. A. Samuels, M. H. Chen. Encephalopathy, stroke, and myocardial infarction with DMSO use in stem cell transplantation, Neurology, 68, 859-61, 2007.

244. G. A. Martin-Henao, P. M. Resano, J. M. Villegas, P. P. Manero, J. M. Sanchez, M. P. Bosch, A. E. Codins, M. S. Bruguera, L. R. Infante, A. P. Oyarzabal, R. N. Soldevila, D. C. Caiz, L. M. Bosch, E. C. Barbeta, J. R. Ronda. Adverse reactions during transfusion of thawed haematopoietic progenitor cells from apheresis are closely related to the number of granulocyte cells in the leukapheresis product, Fox Sang, 99, 267-73, 2010.

245. B. X. Hoang, D. M. Tran, H. Q. Tran, P. T. Nguyen, T. D. Pham, H. V. Dang, T. V. Ha, H. D. Tran, C. Hoang, K. N. Luong, D. G. Shaw. Dimethyl sulfoxide and sodium bicarbonate in the treatment of refractory cancer pain, J Pain Palliat Care Pharmacother, 25, 19-24,2011.

246. M. Ozaki, M. Ogata, T. Yokoyama, T. Kawasaki, A. Shigematsu, T. Sata. Prevention of thrombosis with prostaglandin El in a patient with catastrophic antiphospholipid syndrome, Can JAnaesth, 52, 143-7, 2005.

247. S. A. Kozek-Langenecker, O. Wanzel, R. Berger, S. C. Kettner, F. Coraim. Increased anticoagulation during cardiopulmonary bypass by prostaglandin El, Anesth Analg, 87, 985-8, 1998.

248. W. Cawello, A. Leonhardt, H. Schweer, H. W. Seyberth, R. Bonn, A. L. Lomeli. Dose proportional pharmacokinetics of alprostadil (prostaglandin El) in healthy volunteers following intravenous infusion, Br J Clin Pharmacol, 40, 273-6, 1995.

249. R. P. Kreutz, P. Nystrom, Y. Kreutz, J. Miao, R. Kovacs, Z. Desta, D. A. Flockhart, Y. Jin. Inhibition of platelet aggregation by prostaglandin El (PGE1) in diabetic patients during therapy with clopidogrel and aspirin, Platelets, 24, 145-50, 2013.

250. W. Roberts, S. Magwenzi, A. Aburima, K. M. Naseem. Thrombospondin-1 induces platelet activation through CD36-dependent inhibition of the cAMP/protein kinase A signaling cascade, Blood, 116, 4297-306, 2010.

251. H. Neubauer, S. Lask, A. Engelhardt, A. Mugge. How to optimise clopidogrel therapy? Reducing the low-response incidence by aggregometry-guided therapy modification, Thromb Haemost, 99, 357-62, 2008.

252. P. Andre, T. LaRocca, S. M. Delaney, P. H. Lin, D. Vincent, U. Sinha, P. B. Conley, D. R. Phillips. Anticoagulants (thrombin inhibitors) and aspirin synergize with P2Y12 receptor antagonism in thrombosis, Circulation, 108, 2697-703, 2003.

253. S. Butenas, K. G. Mann. Caution in the interpretation of continuous thrombin generation assays, J Thromb Haemost, 5, 1084-5; author reply 1085-7, 2007.