Характеристика сократительной функции тромбоцитов при патологии гемостаза тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Евтюгина Наталья Геннадьевна

• Евтюгина Наталья Геннадьевна
• кандидат наук
• 2024

Оглавление диссертации кандидат наук Евтюгина Наталья Геннадьевна

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Биохимия свертывания крови

1.1.1 Гемостаз и его компоненты

1.1.1.1 Сосудистый гемостаз

1.1.1.2 Тромбоцитарный гемостаз

1.1.1.3 Плазменный гемостаз

1.1.2 Фибринолитическая система

1.1.3 Физиологические антикоагулянты

1.2 Тромбоциты

1.2.1 Общая характеристика тромбоцитов

1.2.2 Строение тромбоцитов

1.2.3 Рецепторы тромбоцитов

1.2.4 Активация, адгезия и агрегация тромбоцитов

1.3 Контракция (ретракция) сгустков крови и тромбов как проявление сократительной функции тромбоцитов

1.3.1 Молекулярные и клеточные механизмы контракции сгустков крови

1.3.2 Зависимость контракции сгустков от состава крови

1.3.3 Структурные признаки и функциональные последствия контракции сгустков крови

1.3.4 Нарушения контракции сгустков крови при патологии гемостаза

1.4 Заключение по обзору литературы

2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 Характеристика клинического материала. Разрешения этических комитетов

2.2 Оборудование и реактивы

2.3 Получение крови и ее компонентов

2.4 Определение кинетики контракции сгустков крови и плазмы

2.5 Выделение тромбоцитов их характеристика

2.5.1 Получение тромбоцитов методом гель-фильтрации

2.5.2 Проточная цитометрия тромбоцитов

2.5.3 Сканирующая электронная микроскопия тромбоцитов

2.5.4 Трансмиссионная электронная микроскопия тромбоцитов

2.6 Выделение и характеристика эритроцитов

2.6.1 Осаждение и отмывка эритроцитов

2.6.2 Проточная цитометрия эритроцитов

2.7 Тест генерации тромбина

2.8 Сканирующая электронная микроскопия сгустков крови

2.9 Определение концентрации АТФ в сыворотке крови процессе контракции сгустков

2.10 Тромбоэластография

2.11 Молекулярно-генетические исследования

2.12 Стандартные методы клинико-лабораторного исследования крови

2.13 Микроскопические исследования мазков крови

2.14 Определение концентрации фибриногена в плазме крови крыс

2.15 Определение уровня гомоцистеина в плазме крови крыс

2.16 Статистический анализ результатов

3 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Связь механочувствительных ионных каналов Piezo1 клеток крови с контракцией сгустков крови

3.1.1 Влияние активации и ингибирования механочувствительных ионных каналов Piezo1 клеток крови на контракцию сгустков

3.1.2 Вызываемое Yoda1 уменьшение объема эритроцитов как механизм усиленной контракции сгустка

3.1.3 Влияние Yoda1 на прокогулянтные свойства эритроцитов, обусловленные экстернализацией фосфатидилсерина

3.1.4 Исследование возможной роли внеклеточных адениловых нуклеотидов как стимуляторов контракции сгустков крови

Заключение по разделу

3.2 Нарушения контракции сгустков крови при гипергомоцистеинемии

3.2.1 Влияние гомоцистеина на кинетику контракции сгустков крови

3.2.2 Влияние гомоцистеина на функциональное состояние тромбоцитов

3.2.3 Влияние ГГЦ на контракцию сгустков крови in vivo

3.2.4 Изменения состава крови при ГГЦ, влияющие на контракцию сгустков крови

Заключение по разделу

3.3 Сократительная функция тромбоцитов при мутации гена MYH9

3.3.1 Мутация гена MYH9, выявленная при молекулярно-генетическом анализе

3.3.2 Морфология клеток крови у пациенток с мутацией гена MYH9 как доказательство аномалии Мея-Хегглина

3.3.3 Параметры контракции сгустков крови у пациенток с мутацией гена MYH9

3.3.4 Функциональное состояние тромбоцитов у пациенток с мутацией гена MYH9

3.3.5 Гематологические показатели у пациенток с мутацией гена MYH9 и членов их семьи

3.3.6 Изменение формы и размера тромбоцитов у пациенток с мутацией гена MYH9

3.3.7 Изменения ультраструктуры тромбоцитов у пациенток с мутацией гена MYH9

Заключение по разделу

3.4 Нарушение контракции сгустков крови как предшественник и показатель высокого риска тромбоза

3.4.1 Параметры контракции сгустков крови у нейрохирургических пациентов до и после операции при наличии и отсутствии послеоперационного тромбоза

3.4.2 Фазовый анализ кинетики контракции сгустков крови у нейрохирургических пациентов до и после операции при наличии и отсутствии послеоперационного тромбоза

3.4.3 Связь параметров контракции сгустков крови с клиническими характеристиками и лабораторными показателями у нейрохирургических пациентов

Заключение по разделу

3.5 Нарушения контракции сгустков крови у пациентов с СОУГО-19

3.5.1 Сравнительная кинетика контракции сгустков крови у пациентов с СОУГО-19 и здоровых доноров

3.5.2 Связь параметров контракции сгустков крови при СОУГО-

19 с клинической картиной заболевания

3.5.3 Связь контракции сгустков крови при СОУГО-19 с изменениями клеточного и белкового состава крови

3.5.4 Строение и состав контрактированных сгустков крови у пациентов с СОУГО-19

3.5.5 Изменения морфофункционального состояния тромбоцитов при СОУГО-19

Заключение по разделу

ОБЩЕЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования

Совокупность биохимических и физиологических реакций, направленных на остановку кровотечения, образует систему гемостаза, которая сформировалась эволюционно для остановки кровотечения при повреждении кровеносного сосуда. Нарушения гемостаза встречаются при различных патологических состояниях, и проявляются либо кровоточивостью, либо тромбозом, т.е. закупоркой физически целого кровеносного сосуда сгустком крови [Атауллаханов, 2015]. По международной классификации болезней тромбозы относятся к сердечно-сосудистым заболеваниям. Сердечно-сосудистые заболевания, включая тромбозы, являются главной причиной смертности во всем мире, на их долю в 2021 году пришлось более 19 млн. смертей, и эта цифра в ближайшие годы, по прогнозам ВОЗ, будет расти [Di Cesare, 2022]. В Российской Федерации доля болезней системы кровообращения в общей структуре заболеваемости составляет более 56% [Галкин, 2022]. Однако высокий риск тромботических осложнений присутствует не только при сердечно-сосудистых, но и при инфекционных (сепсис, COVID-19) и аутоиммунных (системная красная волчанка) заболеваниях, при нарушениях обмена веществ (наследственная или приобретенная гипергомоцистеинемия, дислипидемия), обширных хирургических вмешательствах, осложнениях беременности и при многих других патологических состояниях. Известно, что 80% тромбозов можно предотвратить, если предвидеть тромбоз и начать своевременную профилактику [Henke, 2020]. Не меньшее медицинское и социальное значение имеют нарушения гемостаза, как генетические, так и приобретенные, которые проявляются кровоточивостью с высоким риском кровоизлияния в жизненно важные органы или обширной кровопотери.

Настоящая работа находится в русле современных исследований по молекулярным механизмам развития, прогнозированию, предупреждению и ранней диагностике внутрисосудистого тромбообразования и

геморрагического диатеза как наиболее частых и опасных видов нарушений свертывания крови.

Важную роль в реакциях гемостаза и их нарушениях играют тромбоциты - циркулирующие в крови безъядерные фрагменты мегакариоцитов костного мозга. Среди разнообразных функций тромбоцитов одной из наименее изученных является их способность к механическому сокращению посредством выростов плазматической мембраны, называемых филоподиями. Благодаря взаимодействию сократительных белков - актина и немышечного миозина IIA - тромбоциты вызывают сжатие (контракцию, ретракцию) сгустков крови. Таким образом, объемное сжатие сгустков крови, или контракция, является видимым проявлением и количественной характеристикой сократительной активности тромбоцитов. Как показали исследования последних лет, контракция сгустков происходит не только in vitro, но и внутри кровеносных сосудов при образовании гемостатических сгустков или патологических обтурационных тромбов [Cines, 2014, Muthard, 2012; Samson, 2017; Litvinov, 2023].

Несмотря на клиническую важность, молекулярные механизмы, лежащие в основе механохимического ремоделирования сгустков крови и тромбов, остаются не до конца понятными, хотя сокращение белков цитоскелета тромбоцитов имеет большое значение как для биологии, так и для медицины. В частности, не до конца исследована роль механочувствительных ионных каналов при деформации клеток крови; нет данных об изменении сократительной функции тромбоцитов при метаболических расстройствах, таких как гипергомоцистеинемия; нет доказательств связи мутаций сократительных белков с морфофункциональным состоянием тромбоцитов и фенотипическими проявлениями сократительной дисфункции; почти не изучены нарушения сократительной функции тромбоцитов при системных нарушениях гемостаза, включая воспалительные тромбозы, осложняющие инфекционные заболевания, в том числе вирусные, такие как COVID-19.

Исходя из сказанного, целью работы является выявление

молекулярных механизмов сократительной функции тромбоцитов в норме и при нарушениях гемостаза различной этиологии.

Основные задачи исследования

1) Определить роль механочувствительных ионных каналов Piezo1 эритроцитов в контракции сгустков крови и их связь с сократительной функцией тромбоцитов.

2) Выявить влияние гомоцистеина как фактора риска тромбоза на сократительную функцию тромбоцитов in vitro и in vivo на модели алиментарной гипергомоцистеинемии у крыс.

3) Исследовать структурные и функциональные изменения тромбоцитов при мутации в гене MYH9, кодирующем немышечный миозин IIA, ответственный за сократительную функцию тромбоцитов.

4) Оценить нарушения сократительной функции тромбоцитов и контракции сгустков крови как факторов риска послеоперационного тромбоза.

5) Установить связь нарушений сократительной функции тромбоцитов и показателей свертываемости крови при воспалительном тромбозе на примере COVID-19.

6) Оценить прогностическую и диагностическую ценность теста контракции сгустков крови как проявления сократительной функции тромбоцитов при нарушениях гемостаза.

Научная новизна

Впервые показана роль механочувствительных ионных каналов Piezo1 тромбоцитов и эритроцитов в контракции сгустков крови. Установлены молекулярные механизмы влияния активации и ингибирования ионных каналов Piezol на полноту и скорость контракции сгустков крови. Показано, что механочувствительные ионные каналы Piezol, экспрессируемые в эритроцитах и тромбоцитах, — это ранее не известный молекулярный посредник между биомеханикой клеток крови и свертыванием крови.

Установлено, что гомоцистеин модулирует параметры контракции сгустков крови за счет прямого влияния на сократительную функцию тромбоцитов и косвенного влияния на контракцию сгустков через изменения клеточного и белкового состава крови. При этом стимулирующее действие гомоцистеина на контракцию сгустков крови in vivo сочетается со снижением гематокрита и гипофибриногенемией, которые уменьшают эластичность и повышают деформируемость сгустков. Таким образом, изменения степени контракции сгустков крови и тромбов при гипергомоцистеинемии могут определять риск тромбоза и влиять на обструктивность тромбов, их чувствительность к фибринолизу и эмбологенность.

Обнаружены множественные функциональные и структурные аномалии тромбоцитов при мутации гена MYH9, включая повышенную фоновую активацию тромбоцитов в сочетании с их частичной рефрактерностью и сократительной дисфункцией. Эти данные указывают на важную роль дефекта сократительной активности тромбоцитов, который усугубляет последствия тромбоцитопении в виде кровоточивости у пациентов с мутацией гена MYH9.

Впервые установлена связь между нарушением контракции сгустков крови в раннем послеоперационном периоде и частотой венозного тромбоза на отдаленных сроках после операции. Это наблюдение дает основание утверждать, что угнетение сократительной функции тромбоцитов является патогенетическим механизмом и фактором риска венозного тромбоза.

Выявлена патогенетическая роль нарушений сократительной функции тромбоцитов при нарушениях гемостаза и системном воспалении, сопровождающих вирусную инфекцию COVID-19.

Теоретическая и практическая значимость

Работа представляет собой систематическое исследование малоизученной сократительной функции тромбоцитов в норме и при патологии. Результаты проведенного исследования расширяют и углубляют

фундаментальные представления о функциях тромбоцитов и их роли в нарушениях гемостаза.

Впервые выявлена роль механочувствительных ионных каналов Piezol, экспрессируемых в эритроцитах и тромбоцитах, в ремоделировании сгустков крови, что указывает на Piezol как потенциальную терапевтическую мишень для коррекции нарушений гемостаза.

Обнаружение стимулирующего влияния гомоцистеина на сократительную функцию тромбоцитов объясняет высокий риск тромбоза при гипергомоцистеинемии с одновременным нарушением контракции сгустков крови, что влияет на обструктивность тромбов, их чувствительность к фибринолизу и эмбологенность. Эти данные указывают на потенциальную диагностическую и прогностическую ценность исследования контракции сгустков крови как лабораторного теста для выявления угрожающего или текущего тромбоза при гипергомоцистеинемии.

Исследование качественных дефектов тромбоцитов, вызванных мутацией гена MYH9, демонстрирует важную роль немышечного миозина IIa в сократительной способностью активированных тромбоцитов, а также ряде сопутствующих функциональных и структурных нарушений, лежащих в основе геморрагического диатеза при наследственной аномалии Мея-Хегглина.

Результаты исследования контракции сгустков крови до и после хирургической операции имеют важное практическое применение, доказывая, что данный тест можно использовать для оценки риска и прогнозирования послеоперационных тромбоэмболических осложнений.

Исследование взаимосвязи нарушений свёртывания крови с течением и исходами COVID-19 было проведено летом 2020 года, на пике пандемии и показало, что COVID-19 нужно рассматривать как (пред)тромботическое состояние, при котором необходим мониторинг состояния гемостаза. Полученные результаты обосновывают информативность теста кинетики контракции сгустков крови для лабораторного контроля за изменениями

системы гемостаза, эффективностью тромбопрофилактики и общим течением заболевания.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Активация механочувствительных ионных каналов Piezo1 деформированных эритроцитов усиливает контракцию сгустков крови опосредованно через стимуляцию сократительной функции тромбоцитов эндогенным тромбином.

2. Сократительная функция тромбоцитов в норме и при (про)тромботических состояниях модулируется генетическими и внешними биохимическими факторами.

3. Снижение степени контракции сгустков крови является лабораторным показателем угрожающего и текущего тромбоза при различных видах патологии с высоким риском тромботических осложнений.

Степень достоверности результатов

Достоверность результатов исследования обусловлена тщательным выбором и характеристикой объектов исследования, большим количеством экспериментальных данных, полученных на современном оборудовании, и детальным анализом результатов, в том числе с использованием обоснованных методов статистической обработки. Методы исследования современны, соответствуют мировому уровню и поставленным задачам. Все результаты исследования представлены и обсуждены на научных конференциях с участием специалистов и опубликованы в рецензируемых российских и зарубежных изданиях.

Личный вклад автора

Работа выполнена автором за период 2018-2023 гг. в научно-исследовательской лаборатории «Белково-клеточные взаимодействия» кафедры биохимии, биотехнологии и фармакологии Института фундаментальной медицины и биологии Казанского (Приволжского)

федерального университета. Подавляющая часть экспериментальных и лабораторно-клинических исследований выполнена автором собственноручно. Сканирующая и трансмиссионная электронная микроскопия выполнена на базе междисциплинарного центра "Аналитическая микроскопия" Казанского (Приволжского) федерального университета. Определение уровня гомоцистеина в крови крыс проведено совместно с д.х.н. Гузель Камилевной Зиятдиновой из Химического института им. Бутлерова Казанского (Приволжского) федерального университета. Молекулярно-генетические исследования осуществлены совместно с к.б.н. Ольгой Александровной Кравцовой, доцентом кафедры биохимии, биотехнологии и фармакологии Казанского (Приволжского) федерального университета. Тест генерации тромбина был выполнен совместно с к.б.н. Алиной Дмитриевной Пешковой. Тромбоэластография проводилась совместно с Алиной Ильшатовной Хабировой.

Образцы крови здоровых доноров и пациентов, использованные в работе, предоставлены врачами: гематологом, к.м.н. Светланой Ильдаровной Сафиуллиной из медицинского центра «Айболит» г. Казани, Светланой Сергеевной Санниковой из Городской больницы №16 г. Казани, нейрохирургом Арсением Анатольевичем Пичугиным и гематологом-трансфузиологом Люцией Суляймановной Фатхуллиной из Межрегионального клинико-диагностического центра г. Казани.

Цель и задачи исследования сформулированы совместно с научным руководителем. Автор лично участвовал на всех этапах получения и обработки результатов, их анализа и подготовки публикаций. Текст диссертации написан автором самостоятельно и отредактирован научным руководителем.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Характеристика сократительной функции тромбоцитов при патологии гемостаза»

Апробация работы

Основные результаты исследования были доложены на следующих научных конференциях и съездах:

• Итоговая научная конференция сотрудников Казанского университета

за 2021 год, Казань, 07.02.2023;

• 30-й Конгресс Международного общества по тромбозу и гемостазу, Лондон, Великобритания, 9.06.2022 - 13.06.2022;

• Российский Форум по тромбозу и гемостазу, Москва, Россия, 17-19 марта 2022 года;

• Итоговая научная конференция сотрудников Казанского университета за 2021 год, Казань, 3.02.2022;

• III Объединенный научный форум (VII Съезд Физиологов СНГ; VII Съезд биохимиков России; Х Российский симпозиум «Белки и пептиды»), Сочи, Россия. 03.10.2021 - 08.10.2021;

• Конгресс Международного общества по тромбозу и гемостазу. Филадельфия, США 17.07.2021 - 21.07.2021;

• Итоговая научная конференция сотрудников Казанского университета за 2020 год, Казань, 5.02.2021;

• Российский Форум по тромбозу и гемостазу совместно с 10-ой (юбилейной) конференцией по клинической гемостазиологии и гемореологии, Москва, Россия, 8.10.2020 - 10.10.2020;

• II Объединенный научный форум (VI Съезд Физиологов СНГ; VI Съезд биохимиков России; IX Российский симпозиум «Белки и пептиды»). Сочи, Россия, 01.10.2019 - 06.10.2019;

• V Международная конференция П0СТГЕН0М'2018 «В поисках моделей персонализированной медицины». Казань, Россия. 29.10.2018 -02.10.2018.

Публикация результатов работы

Материалы диссертации отражены в 14 публикациях, в том числе 7 научных статьях в журналах ВАК и международных журналах, индексируемых в базах данных Scopus и/или WoS.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, общего заключения, списка цитированной литературы и приложения. Работа изложена на 163 страницах машинописного текста, содержит 43 рисунка, 10 таблиц в основном тексте и 3 дополнительные таблицы. Библиография включает 173 наименования.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 Биохимия свертывания крови

Способность крови свертываться с образованием желеобразного сгустка - филогенетически древний механизм остановки кровотечения в месте повреждения сосуда, называемый гемостазом (от греческих слов haema -кровь и stasis - остановка). Однако при некоторых патологических состояниях сгусток крови образуется внутри физически целого сосуда, перекрывая его просвет и нарушая естественный кровоток; такой патологический сгусток называется тромбом, а процесс его образования - тромбозом. Баланс между жидким состоянием крови и образованием сгустков - это сложный физиологический и биохимический процесс, нарушения которого ведут к опасным для жизни состояниям в виде кровотечения или тромботической окклюзии кровеносных сосудов.

1.1.1 Гемостаз и его компоненты

Совокупность реакций, приводящих к остановке кровотечения, образует систему гемостаза [Previtali, 2011]. Эти реакции условно разделяются на три группы, называемые компонентами гемостаза.

1.1.1.1 Сосудистый гемостаз включает в себя сужение просвета кровеносных сосудов (вазоконстрикцию), обнажение адгезивной поверхности субэндотелия и прокоагулянтную активность поврежденных эндотелиоцитов.

Сокращение гладкомышечных клеток стенки сосуда происходит под действием двух веществ, секретируемых активированными тромбоцитами, -серотонина и тромбоксана А2 (ТхА2).

При повреждении стенки сосудов обнажается коллаген, находящийся в базальной мембране под слоем эндотелиальных клеток и в субэндотелиальном слое. К коллагену прилипают активированные тромбоциты, которые «заклеивают» повреждение [Stalker, 2013].

Интактный эндотелий сосудов обладает тромборезистентностью, которая обусловлена следующими его свойствами: (1) предупреждением агрегации тромбоцитов, благодаря отрицательному поверхностному заряду, а также синтезу и секреции антиагреганта простациклина; (2) подавлением коагуляционного гемостаза вследствие связывания тромбина тромбомодулином и инактивации других прокоагулянтов (факторов V, VIII, IX и X); (3) образованием и секрецией антикоагулянтов; (4) способностью активировать фибринолиз; (5) способностью метаболизировать биологически активные вещества, влияющие на гемостаз (биогенные амины, атерогенные липопротеиды); (6) продукцией оксида азота, обладающего антитромботическими свойствами [Порядина, 2013]. Механически поврежденный или биохимически активированный эндотелий трансформируется в прокоагулянтную поверхность. Снижается продукция физиологического ингибитора тромбоцитов, простациклина, и увеличивается секреция активаторов тромбоцитов, таких как адреналин, АДФ и тромбоксан А2. Подавляется антикоагулянтная активность активированного эндотелия: снижается экспрессия тромбомодулина и синтез протеина S, а также уровни антитромбина III и ингибитора пути тканевого фактора. Одновременно возрастает прокоагулянтный потенциал, прежде всего за счет экспрессии на поверхности эндотелия тканевого фактора и секреции фактора Виллебранда. Понижается синтез тканевого активатора плазминогена и возрастает выделение в кровь его ингибиторов [Palta, 2014].

1.1.1.2 Тромбоцитарный гемостаз включает в себя активацию тромбоцитов, их адгезию (прилипание) в месте повреждения эндотелия и их агрегацию с образованием тромбоцитарной «пробки». Кроме того, активированные тромбоциты выделяют большое количество биологически активных веществ и создают прокоагулянтную поверхность на плазматической мембране.

Активация тромбоцитов инициируется взаимодействием внеклеточных биохимических агонистов со специфическими рецепторами на

плазматической мембране тромбоцитов [Gorbet, 2004]. Основными физиологическими активаторами тромбоцитов являются коллаген, тромбин, АДФ, АТФ и TxA2. Действие каждого из тромбоцитарных активаторов опосредуется через специализированные рецепторы в плазматической мембране тромбоцита. Коллаген активирует тромбоциты через гликопротеин VI и интегрин a2ß1, тромбин имеет два рецептора, PAR1 и PAR4, действие АДФ происходит через пуриновые рецепторы P2Yi и P2Yi2, АТФ - через рецепторы P2X1. TxA2 высвобождается тромбоцитами и взаимодействует с собственным рецептором, приводя к секреции плотных гранул. TxA2 активирует, главным образом, белки Gq и G12/G13. Через компонент Gq гетеротримерного G-белка активируется фосфолипаза C, которая гидролизует фосфатидилинозитолфосфат до диацилглицерола (DAG) и инозитолтрифосфата, что приводит к активации протеинкиназы C, а также накопление внутриклеточного Ca2+ [Offermanns, 2006]. Стимуляция любого из рецепторов ведет к активации сложного каскада внутриклеточных реакций, причем разные рецепторы запускают разные ферментативные пути -тирозинкиназный путь и путь, опосредованный G -белками [Пантелеев, 2008]. Действие различных активаторов тромбоцитов показано на рисунке 1.

Рисунок 1 - Действие активаторов тромбоцитов через специфические рецепторы и функциональные последствия активации тромбоцитов.

Синие стрелки - путь, индуцированный АДФ; фиолетовые стрелки - путь, индуцированный ТХА2; черная стрелка - влияние связывания vWF с комплексом GPIb-IX-V на секрецию АДФ; коричневая стрелка - кальций-независимый путь, связывающий GPVI с секрецией гранул и продукцией TXA2; пунктирная коричневая стрелка - путь, заканчивающийся цитоплазматической PLA2; пунктирная серая стрелка - индуцированная коллагеном и зависимая от кальция потеря асимметрии фосфатидилсерина.ТХА2 - тромбоксан А2, PI3K -фосфоинозитид-3-киназа, DAG - диацилглицерин, PKC - протеинкиназа С, PLCß -

фосфолипаза Cß, PLCy2 - фосфолипаза Су2, PAR - рецептор, активируемый протеазой, сPLA2 - цитозольная фосфолипаза А2, COX1 - циклооксигеназа-1, TP -рецептор к тромбоксану А2, GPVI - гликопротеин VI, vWF - фактор Виллебранда,

ФС - фосфатидилсерин [Reviakine, 2015]

Адгезия активированных тромбоцитов к поврежденной стенке сосуда происходит за счет взаимодействия мембранных рецепторов с субэндотелиальным коллагеном двумя способами: или непосредственно, или через фактор Виллебранда (vWF). vWF, секретируемый активированными эндотелиальными клетками и тромбоцитами, связывается с коллагеном и опосредует адгезию тромбоцитов через рецепторы GP1b. Одновременно тромбоциты прямо связываются с волокнами коллагена сначала через рецепторы GPVI, после чего взаимодействие усиливается через интегрин а2р1

[ЯитЬаШ:, 2010; Ruggeri, 2009]. Далее, происходит агрегация тромбоцитов под действием растворимых в крови стимуляторов, основными из которых являются тромбин, TxA2 и AДФ. Агрегация тромбоцитов в конечном итоге приводит к образованию первичной гемостатической «пробки», закупоривающей небольшой дефект в сосудистой стенке. Помимо тромбоцитов, в формировании гемостатической пробки участвует белок плазмы крови фибриноген, который, превращаясь в фибрин, «склеивает» между собой тромбоциты и их агрегаты [Покровский, 2007]. Тромбоцитарный компонент гемостаза подробно рассмотрен в разделе 1.2.

1.1.1.3 Плазменный гемостаз представляет собой каскад ферментативных реакций, ведущих к свертыванию крови (гемокоагуляции), т. е. образованию желеобразного сгустка.

Вещества, участвующие в образовании сгустков, называют факторами свертывания крови. Большинство из них представляет собой сериновые протеазы, которые циркулируют в крови в неактивной форме (проферменты, зимогены). Связывание с поверхностью клеточных мембран заметно усиливает каталитическую активность протеаз. Белковые кофакторы каскада свертывания крови также циркулируют в плазме как инертные прокофакторы, которые превращаются в активные кофакторы посредством ограниченного протеолиза. Дефицит одного или нескольких факторов свертывания крови в большинстве случаев вызывает кровоточивость, которую называют геморрагическим диатезом.

Существуют два основных механизма, по которым запускается каскад свертывания крови, известные как контактный путь (внутренний путь свертывания крови) и путь тканевого фактора (внешний путь свертывания крови). Схема свертывания крови по внутреннему и внешнему путям показана на рисунке 2.

Внутренний путь свертывания крови, или контактный путь, начинается с того, что кровь вступает в контакт с определенными типами отрицательно заряженных поверхностей, искусственных или естественных.

Стекло, диатомовая земля (целит) и каолин являются особенно сильными активаторами контактного пути и широко используются в лабораторной диагностике нарушений гемостаза [Grover, 2019]. Естественными активаторами контактного пути свертывания крови являются коллаген, полифосфаты и другие субэндотелиальные структуры, приходящие в соприкосновение с кровью при повреждении эндотелия. Контактный путь гемокоагуляции начинается с активации профермента фактора XII с участием высокомолекулярного кининогена и (пре)калликреина плазмы крови [Versteeg, 2013]. Контакт крови с активирующей поверхностью приводит к изменению конформации фактора XII с образованием активного фермента -фактора XIIa [Ivanov, 2017]. Этот фермент активирует прекалликреин в калликреин, который по механизму положительной обратной связи активирует новые молекулы фактора XII.

Образовавшийся фактор XIIa активирует свой субстрат, фактор XI, превращая его в активный фактор XIa. Ограниченный протеолиз фактора IX до фактора IXa под действием фактора XIa вызывает образование комплекса «внутренней теназы» (комплекс факторов IXa, VIIIa, мембранных фосфолипидов и ионов Ca2+), который, в свою очередь, активирует фактор X до фактора Xa. Термин «теназа» (tenase) происходит от названия субстрата -фактора X (ten) (рисунок 3).

Общий путь свертывания крови начинается с образования фактора Xa; он приводит к генерации активного тромбина и превращению растворимого фибриногена в нерастворимый фибрин, который является конечным продуктом светывания крови, образуя структурную основу сгустка крови [Periayah, 2017].

Рисунок 2 - Ферментативный каскад свертывания крови [Литвинов, 2014]

Внешний путь свертывания крови, или путь тканевого фактора, назван по белку, который его запускает, известному как тканевый фактор (tissue factor, TF) [Morrissey, 2013]. TF - это интегральный белок плазматической мембраны, который экспрессируется на поверхность при активации многих типов клеток, таких как эндотелиоциты, моноциты и другие, независимо от природы активации. Внешний путь свертывания крови инициирует внутрисосудитое фибринообразование при многих типах тромбоза. Когда клетки, экспрессирующие TF, контактируют с кровью, это запускает ферментативный каскад свертывания, как показано на рисунке 2.

Ферментный комплекс, запускающий внешний путь свертывания крови, называется «внешней теназой» и состоит из сериновой протеазы фактора VIIa, в комплексе с TF, который выполняет функцию кофактора, усиливающего ферментативную активность фактора VIta в тысячи раз (рисунок 3). Комплекс TF и фактора VIIa [TF:VIIa], скрепляемый ионами Ca2+, ассоциирован с клеточной поверхностью, поскольку TF является мембранным

белком [Morrissey, 2013]. После своего формирования внешний теназный комплекс [TF:VIIa-Ca2+] активирует фактор X, который преобразуется в активный фермент - фактор Xa. В свою очередь, фактор Xa при участии Ca2+ образует на фосфолипидной мембранной поверхности клеток или микровезикул комплекс с фактором Va [Smith, 2015].

Рисунок 3 - Строение внутренней и внешней теназы и протромбиназы

[Mann, 1997]

Внешний и внутренний пути свертывания крови in vivo активируются одновременно, при этом компоненты обоих путей могут взаимодействовать между собой.

С момента образования фактора Xа дальнейшие реакции образуют общий путь свертывания крови. Активный комплекс [Ха-Va-Ca^], образующийся на фосфолипидной поверхности клеточной мембраны, называется протромбиназой по названию субстрата - протромбина. Протромбиназа расщепляет протромбин, что приводит к образованию активного тромбина [Krishnaswamy, 2013].

Активный тромбин катализирует полимеризацию фибрина, отщепляя короткие пептиды от белка плазмы крови - фибриногена. Растворимый фибриноген после частичного протеолиза образует мономерный фибрин, который начинает полимеризоваться, превращаясь в нерастворимый фибрин (рисунок 4). Фибрин образует разветвленный механический каркас сгустков крови, усиливая гемостаз и предотвращая кровопотерю [Furie, 2009].

Рисунок 4 - Стадии превращения фибриногена в фибрин. Мономеры фибрина образуются после отщепления от фибриногена тромбином фибринопептидов А и В (БрА и БрВ). Молекулы мономерного фибрина

образуют двухнитевыые протофибриллы, которые стабилизируются взаимодействиями между центральными доменами Е и периферийными доменами D. Фактор XШa - транстлутаминаза, прошивающая фибрин ковалентными связями [Rojas-Murillo, 2022]

В процессе полимеризации и после нее фибрин подвергается ковалентной «сшивке» под действием плазменной трансглутаминазы -фактора XШa, который также активируется тромбином при участии Са2+ и обеспечивает дополнительную механическую и химическую стабильность сгустка крови [Bagoly, 2012] (рисунок 5).

О

с=о

ны

-л

ГЧН2 +

Трансглутаминаза

Фактор XII 1а

N4

0=С

Глутамил

Лизил

о

с=о

NN

+ NN4+

N4

о=с

е-(у-глутамил)-лизиновая связь

Рисунок 5 - Стабилизация фибрина фактором XШa

Кроме образования фибрина, тромбин является сильным активатором тромбоцитов, способствуя формированию защитной гемостатической пробки или патологического тромба. По мере образования сгустка крови или тромба в его состав, помимо фибрина и тромбоцитов, вовлекаются эритроциты и лейкоциты [Л^ш^Ы, 2021].

1.1.2 Фибринолитическая система

Через какое-то время после закрытия дефекта в стенке кровеносного сосуда сгусток крови необходимо удалить, чтобы ликвидировать полную или частичную закупорку сосуда и восстановить локальный кровоток. Расщепление фибриновой основы сгустков крови катализирует протеолитический фермент плазмин, который образуется из неактивного плазминогена на поверхности фибрина. Протеолитическая активация плазминогена катализируется либо тканевым активатором плазминогена (^ РА), либо активатором плазминогена урокиназного типа (u-PA), циркулирующими в крови в активной форме [Няцаг, 2014]. Основным субстратом плазмина является фибрин, который ускоряет собственное расщепление, связывая плазминоген и ^РА на своей поверхности и тем самым локализуя и ускоряя образование плазмина. В присутствии фибрина

каталитическая (протеолитическая) эффективность t-PA многократно повышается.

Для предотвращения избыточной нерегулируемой фибринолитической активности существуют ингибиторы плазмина и активаторов плазминогена. Фибринолитические ферменты нейтрализуются ингибиторами сериновых протеаз, или серпинами, которые образуют неактивные ферментные комплексы. Наиболее важны для регуляции фибринолиза ингибитор активатора плазминогена-1 (PAI-1), ингибитор активатора плазминогена-2 (PAI-2) и а2-антиплазмин (a2-AP). Циркулирующий плазмин и а2-АР образуют неактивный комплекс; однако, когда плазмин связан с фибрином, он защищен от ингибирования [Cesarman-Maus, 2005]. Аналогично, растворимые в крови активаторы плазминогена t-PA и u-PA быстро ингибируются PAI-1, который высвобождается в кровоток из эндотелиальных клеток, тромбоцитов и других клеток [Schneider, 2004].

Плазмин расщепляет фибрин, образуя растворимые продукты распада, которые выводятся из кровотока. Гемокоагуляционная и фибринолитическая системы взаимосвязаны посредством механизмов, обеспечивающих гемостатический баланс между жидким состоянием крови и образованием сгустков [Chapin, 2015].

1.1.3 Физиологические антикоагулянты

Известно, что тромбин, образующийся при свертывании 1 мл крови, способен превратить в фибрин весь фибриноген, имеющийся в 3 л крови. Во избежание неконтролируемого фибринообразования в крови существуют противосвертывающие компоненты, важнейшими из которых являются плазменные белки протеин S, протеин С, антитромбин III (ATIII), и ингибитор пути тканевого фактора (TFPI) [Атауллаханов, 2015].

ATIII является наиболее важным физиологическим антикоагулянтом: он нейтрализует фактор Xa и тромбин, образуя комплекс, в котором блокируется активный сайт фермента. В отсутствие гепарина

комплексообразование происходит медленно, однако в присутствии гепарина или гепарансульфата (в составе гликокаликса на эндотелии) эффективность ингибирования значительно возрастает. ATIII способен ингибировать факторы IXa, XIa и XIIa, хотя и с меньшей эффективностью по сравнению с тромбином и фактором Xa [Huntington, 2011].

Высокоактивный комплекс [TF-VIIa] имеет специфический плазменный ингибитор, называемый ингибитором пути тканевого фактора (TFPI). Тромбоциты содержат 10% общего TFPI в крови и высвобождают его после стимуляции тромбином и другими агонистами. Активированные моноциты также могут высвобождать TFPI. TFPI имеет два ингибирующих сайта, один для фактора Xa и один для комплекса [TF-VIIa]. Инактивация фактора Xa посредством связывания с TFPI необходима для ингибирования комплекса [TF-VIIa] [Wood, 2013].

Эндотелий участвует в регуляции активности тромбина через мембранный белок тромбомодулин. Тромбин связывается с тромбомодулином на эндотелиальных клетках, после чего этот комплекс активирует растворимый протеин С, который является витамин К-зависимым белком [Griffin, 2007]. Активированный протеин С протеолитически инактивирует факторы Va и VIIIa. Протеин S, еще один витамин К-зависимый белок плазмы крови, является кофактором активации протеина С [O'Donnell, 2019].

1.2 Тромбоциты

1.2.1 Общая характеристика тромбоцитов

Тромбоциты представляют собой безъядерные клеточные фрагменты диаметром 2-4 мкм, часто называемые форменными элементами или клетками крови. В норме тромбоциты циркулируют в крови человека 7-10 дней, после чего элиминируются макрофагами селезенки и печени [Quach, 2018]. Нормальное содержание тромбоцитов в крови от 150*106 до 400*106 тромбоцитов в 1 мл. Тромбоцитопоэз (образование тромбоцитов) происходит в основном в костном мозге в результате дифференцировки гемопоэтических

стволовых клеток в полиплоидные мегакариоциты диаметром 50-100 мкм, которые образуют ветвящиеся цитоплазматические выпячивания, называемые протромбоцитами, в просвет кровеносных синусоидов. От протромбоцитов под действием гидродинамических сил кровотока при участии цитоскелета «отшнуровываются» тромбоциты. Тромбоцитопоэз управляется несколькими транскрипционными факторами, а также цитокином тромбопоэтином. Тромбопоэтин, который вырабатывается в печени, связывается со своими рецепторами на мегакариоцитах, стимулируя образование протромбоцитов, особенно при снижении числа тромбоцитов в крови (тромбоцитопении) [Grozovsky, 2015]. Один мегакариоцит может образовать и выделить в кровь от 5000 до 10000 тромбоцитов.

Обычно тромбоциты циркулируют в крови в состоянии функционального покоя, однако при активации тромбоциты меняют форму с дисковидной на сферическую с длинными выростами (филоподиями или ламеллоподиями), увеличивающими активную клеточную поверхность. Тромбоциты содержат актин и немышечный миозин IIA, которые способны к сокращению, вызывая изменение формы тромбоцитов и сжатие (контракцию, ретракцию) сгустков крови за счет передачи внутриклеточных тракционных сил на внеклеточный фибрин через молекулы интегрина (механотрансдукция).

1.2.2 Строение тромбоцитов

Морфологически тромбоцит представляет собой дисковидный безъядерный клеточный фрагмент размером 2-4 мкм, содержащий а-гранулы, плотные гранулы, лизосомы, митохондрии, открытую канальцевую систему, плотную тубулярную систему и цитоскелет (рисунок 6).

Митохондрия

Рисунок 6 - Схематичное изображение структуры тромбоцита

2013]

Тромбоциты имеют два типа секреторных гранул, а именно: а-гранулы (50-80 на тромбоцит) и 5-гранулы, или плотные гранулы (3-8 на тромбоцит) [Sharda, 2018], функция которых заключается в хранении и выделении биологически активных молекул. а-Гранулы содержат белки, которые участвуют в гемокоагуляции и адгезии тромбоцитов. Плотные гранулы хранят низкомолекулярные вещества: катехоламины, гистамин, серотонин, ионизированный кальций, аденозин-5'-дифосфат (АДФ) и аденозин-5'-трифосфат (АТФ) [Heemskerk, 2002].

Тромбоциты не содержат ядра, но имеют ДНК-содержащие митохондрии, а также мРНК и рибосомы, наследуемые от мегакариоцитов, за счет которых происходит синтез белков. Плазматическая мембрана тромбоцитов состоит из двойного слоя фосфолипидов, включая липидные рафты, и является местом экспрессии поверхностных рецепторов, которые опосредуют передачу метаболических сигналов «изнутри наружу» или

«снаружи внутрь». Активация рецепторов сопровождается высвобождением а- и 5-гранул, содержимое которых играет важную роль в гемокоагуляции, воспалении, атеросклерозе, антимикробной защите, ангиогенезе, заживлении ран и онкогенезе [Blair, 2009]. Мембранная асимметрия фосфолипидов (отрицительно заряженные фосфатидилсерин и фосфатидилинозитол присутствуют преимущественно во внутреннем листке плазматической мембраны), делает поверхность покоящихся тромбоцитов нейтральной по отношению к реакциям свертывания крови. Нарушение мембранной асимметрии при активации тромбоцитов, напротив, делает их поверхность прокоагулянтной, т.е. стимулирующей свертывание крови [Ghoshal, 2014].

Открытая канальцевая система (OCS) представляет собой мембраннные «туннели», пронизывающие тромбоцит и образующие поры в плазматической мембране. Каналы OCS в тромбоцитах человека занимают примерно 3-4% от общего объема [Mountford, 2015]. Основной функцией OCS является транспорт веществ внутрь тромбоцитов из внеклеточного пространства и наоборот.

Несмотря на наличие рибосом и мРНК, тромбоциты обладают низкой белковосинтетической активностью, поэтому белки или «наследуются» от родительского мегакариоцита или поглощаются из плазмы. Интернализация белков происходит в основном через OCS, при этом ряд белков плазмы, например, фибриноген, распределяются по органеллам внутри тромбоцитов, включая а-гранулы [Selvadurai, 2018]. Еще одной особенностью OCS является функция «мембранного резерва» во время активации тромбоцитов, которая сопровождается образованием филоподий, ламеллоподий и других выростов, требующих увеличения поверхности плазматической мембраны [Hartwig, 2006].

Плотная тубулярная система (DTS) тромбоцитов представляет собой сеть замкнутых каналов эндоплазматического ретикулума, который остался от родительского мегакариоцита. DTS тромбоцитов является основным местом синтеза эндоперекисей простагландинов и тромбоксана A2, а также

внутриклеточным депо ионизированного кальция, который высвобождается из DTS после стимуляции тромбоцитов тромбином. Таким образом, DTS играет важную роль в активации тромбоцитов [Ebbeling, 1992].

Тромбоциты содержат несколько первичных и вторичных лизосом. Эти лизосомы содержат много кислых гидролаз и катепсинов и экспрессируют CD63 и LAMP-2 на своей мембране. Функция лизосом тромбоцитов изучена недостаточно. Они могут играть роль в эндосомальном пищеварении, как это наблюдается в ядерных клетках [Flaumenhaft, 2013].

Цитоскелет тромбоцитов в основном состоит из актина, тубулина, спектрина и филамина. Спектрин, имеющий двумерную паутинную структуру, находится на цитоплазматической стороне плазматической мембраны. Актин существует в составе полимера, где филамин и а-актинин действуют как сшивающие агенты. В покоящихся тромбоцитах спирали микротрубочек, полимеры аР-тубулина, располагаются под плазматической мембраной, поддерживая дисковидную форму неактивированных тромбоцитов [Smyth, 2010].

1.2.3 Рецепторы тромбоцитов

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Евтюгина Наталья Геннадьевна, 2024 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Атауллаханов, Ф.И. Применение теста тромбодинамики для оценки состояния системы гемостаза [Текст] / Ф.И. Атауллаханов, А.Н. Баландина, Д. М. Варданян [и др] // Изд-во Первого Московского государственного университета им. Сеченова. - 2015. - С72.

2. Бобылев, С.Н. Российский статистический ежегодник 2022 [Текст] / С.Н. Бобылев, Е.А. Бурлакова, И.С. Ваган [и др] // Росстат. - 2022. - Т.76. -С.691.

3. Литвинов, Р.И. 9^2 уроков по биохимии свертывания крови: Учебно-практическое руководство [Рисунок] / Р.И. Литвинов. - Казань: КФУ, 2014. - С128.

4. Литвинов Р.И. Специфичность и чувствительность паракоагуляционныъ тестов [Текст] / Р.И. Литвинов, И.Е. Воронина, С.З. Габитов // Лабораторное дело. - 1980. - Т. 11. - С662-666.

5. Наместников, Ю.А. Тест генерации тромбина - интегральный показатель состояния системы свертывания крови [Рисунок] / Ю.А. Наместников // Гематология и трансфузиология. -2011. - Т.55. - №2 - С.32-39.

6. Пантелеев, М.А. Свертывание крови: биохимические основы [Текст] / М. А. Пантелеев, Ф. И. Атауллаханов // Клиническая онкогематология. - 2008. - Т.1. - №1 - С.50-62.

7. Пешкова, А.Д. Изменения гемостаза по данным тестов тромбодинамики и контракции сгустков крови у женщин с привычным невынашиванием беременности в анамнезем [Текст] / А.Д. Пешкова, С.И. Сафиуллина, Д.Г. Асарова [и др] // Акушерство и гинекология. - 2019. - Т. 12. -С. 111-119.

8. Покровский, В.М. Физиология человека [Текст] / В.М. Покровский, Г.Ф. Коротько // М.: Медицина. - 2007. - С.656.

9. Порядина, Г.В. Патофизиология системы гемостаза [Текст] / Г.В. Порядина // Методические разработки для самостоятельной работы студентов лечебного и педиатрического факультетов, РГМУ. - 2013. - С.35.

10. Adhikari, A.S. Strain tunes proteolytic degradation and diffusive transport in fibrin networks [Text] / A.S. Adhikari, A.H. Mekhdjian, A.R. Dunn // Biomacromolecules. - 2012. - V.13. - No.2. - P.499-506.

11. Alkarithi, G. Thrombus structural composition in cardiovascular disease [Text] / G. Alkarithi, C. Duval, Y. Shi, F.L. Macrae, R.A.S. Ariens // Arterioscler Thromb Vasc Biol. - 2021. - V.41. - No.9. - P.2370-2383.

12. Andrews, R.K. The glycoprotein Ib-IX-V complex [Text] / R.K. Andrews, M.C. Berndt, J.A. Lopez // Platelets. 2nd ed. San Diego (CA): Elsevier Academic Press. - 2007. - P. 145-165.

13. Asensio-Juárez, G. Linking the landscape of MYH9-related diseases to the molecular mechanisms that control non-muscle myosin II-A function in cells [Text] / G. Asensio-Juárez, C. Llorente-González, M. Vicente-Manzanares // Cells. -2020. - V.9. - No.6. - 1458.

14. Bae, C. The mechanosensitive ion channel Piezo1 is inhibited by the peptide GsMTx4 [Text] / C. Bae, F. Sachs, P.A. Gottlieb // Biochemistry. - 2011. -V.50. - No.29. - P.6295-6300.

15. Bagoly, Z. Factor XIII, clot structure, thrombosis [Text] / Z. Bagoly, Z. Koncz, J. Hársfalvi, L. Muszbek // Thromb Res. - 2012. - V.129. - No.3. - P.382-387.

16. Bagriantsev, S.N. Piezo proteins: regulators of mechanosensation and other cellular processes [Text] / S.N. Bagriantsev, E.O. Gracheva, P.G. Gallagher // J Biol Chem. - 2014. - V.289. - P.31673-31681.

17. Baumann, J. Reduced platelet forces underlie impaired hemostasis in mouse models ofMYH9-related disease [Text] / J. Baumann, L. Sachs, O. Otto [et al.] // Sci Adv. - 2022. - V.8. - eabn2627.

18. Beutler, B. Inferences, questions and possibilities in Toll-like receptor signalling [Text] / B. Beutler // Nature. - 2004. - V.430. - No.6. - P.257-263.

19. Blair, P. Platelet a-granules: Basic biology and clinical correlates [Text] / P. Blair, R. Flaumenhaft // Blood Rev. - 2009. - V.23. - No.4. - P.177-189.

20. Bonaventura, A. Endothelial dysfunction and immunothrombosis as key pathogenic mechanisms in COVID-19 [Text] / A. Bonaventura, A. Vecchie, L. Dagna [et al.] // Nat Rev Immunol. - 2021. - V.21. - No.5. - P.319-329.

21. Boyanova, D. PlateletWeb: a systems biologic analysis of signaling networks in human platelets [Text] / D. Boyanova, S. Nilla, I. Birschmann [et al.] // Blood. - 2012. - V. 119. - P.e22-34.

22. Boylan, B. Identification of FcRIIa as the ITAM-bearing receptor mediating alphaIIbbeta3 outside-in integrin signaling in human platelets [Text] / B. Boylan, C. Gao, V. Rathore [et al.] // Blood. - 2008. - V. 112. - No.7. - P.2780-2786.

23. Breen, F.A. Ethanol gelation: a rapid screening test for intravascular coagulation [Text] / F.A. Breen, J.L. Tullis // Ann Intern Med. - 1968. - V.69. -P.1197-1206.

24. Burkhart, J.M. The first comprehensive and quantitative analysis of human platelet protein composition allows the comparative analysis of structural and functional pathways [Text] / J.M. Burkhart, M. Vaudel, S. Gambaryan [et al.] // Blood. - 2012. - V.120. - P.e73-82.

25. Byrnes, J.R. Factor XIIIa- dependent retention of red blood cells in clots is mediated by fibrin alpha-chain crosslinking [Text] / J.R. Byrnes, C. Duval, Y. Wang [et al.] // Blood. - 2015. - V.126. - P.1940-1948.

26. Cahalan, S.M. Piezo1 links mechanical forces to red blood cell volume [Text] / S.M. Cahalan, V. Lukacs, S.S. Ranade [et al.] // Elife. - 2015. - V.4. - e07370.

27. Carr, M.E. Development of platelet contractile force as a research and clinical measure of platelet function. [Text] / M.E. Carr // Cell Biochem Biophys. -2003. - V.38. - P.55-78.

28. Cesarman-Maus, G. Molecular mechanisms of fibrinolysis [Text] / G. Cesarman-Maus, K.A. Hajjara // Br. J. Haematol. - 2005. - V. 129. - P.307-321.

29. Chang, J.C. The integrin alpha6beta1 modulation of PI3K and Cdc42 activities induces dynamic filopodium formation in human platelets [Text] / J.C. Chang, H.H. Chang, C.T. Lin, S.J. Lo // J Cell Biol. - 2005. - V.12. - No.6. - P.881-898.

30. Chapin, J. C. Fibrinolysis and the control of blood coagulation [Text] / J.C. Chapin, K.A. Hajjara // Blood Rev. - 2015. - V.29. - No. 1. - P.17-24.

31. Cinar, E. Piezo1 regulates mechanotransductive release of ATP from human RBCs [Text] / E. Cinar, S. Zhou, J. DeCourcey [et al.] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2015. - V. 112. - P. 11783-11788.

32. Cines, D.B. Clot contraction: compression of erythrocytes into tightly packed polyhedra and redistribution of platelets and fibrin [Text] / D.B. Cines, T. Lebedeva, C. Nagaswami [et al.] // Blood. - 2014. - V. 123. - P.1596-603.

33. Clark, S.R. Platelet TLR4 activates neutrophil extracellular traps to ensnare bacteria in septic blood [Text] / S.R. Clark, A.C. Ma, S.A. Tavener [et al.] // Nat Med. - 2007. - V.13. - No.4. - P.463-469.

34. Cone, S.J. Inherent fibrin fiber tension propels mechanisms of network clearance during fibrinolysis [Text] / S.J. Cone, A.T. Fuquay, J.M. Litofsky [et al.] // Acta Biomater. - 2020. - V.107. - P.164-177.

35. Coste, B. Piezo1 and Piezo2 are essential components of distinct mechanically activated cation channels [Text] / B. Coste, J. Mathur, M. Schmidt [et al.] // Science. - 2010. - V.330. - P.55-60.

36. Coughlin, S.R. Protease-activated receptors in hemostasis, thrombosis and vascular biology [Text] / S.R. Coughlin // J Thromb Haemost. - 2005. - V.3. -No.8. - P.1800-1814.

37. Danen, E.H. The fibronectin-binding integrins alpha5beta1 and alphavbeta3 differentially modulate RhoA-GTP loading, organization of cell matrix adhesions, and fibronectin fibrillogenesis [Text] / E.H. Danen, P. Sonneveld, C. Brakebusch [et al.] // J Cell Biol. - 2002. - V.159. - No.6. - P.1071-1086.

38. De Vriese, A.S. Endothelium-derived hyperpolarizing factor-mediated renal vasodilatory response is impaired during acute and chronic hyperhomocysteinemia [Text] / A.S. De Vriese, H.J. Blom, S.G. Heil [et al.] // Circulation. - 2004. - V.109. - P.2331-2336.

39. Den Heijer, M. Homocysteine, MTHFR and risk of venous thrombosis: A meta-analysis of published epidemiological studies [Text] / M. Den Heijer, S. Lewington, R. Clarke // J. Thromb. Haemost. - 2005. - V.3. - P.292-299.

40. Di Cesare, М. World Heart Report 2023: Confronting the World's Number One Killer [Text] / M. Di Cesare, H. Bixby, T. Gaziano [et al.] // Geneva, Switzerland. World Heart Federation. - 2023. - P.49.

41. Diacovo, T.G. A functional integrin ligand on the surface of platelets: intercellular adhesion molecule-2 [Text] / T.G. Diacovo, A.R. deFougerolles, D.F. Bainton, T.A. Springer // J Clin Invest. - 1994. - V.94. - No.3. - P. 1243-1251.

42. Dulyaninova, N.G. Regulation of myosin-IIA assembly and Mts1 binding by heavy chain phosphorylation [Text] / N.G. Dulyaninova, V.N. Malashkevich, S.C. Almo, A.R. Bresnick // Biochemistry. - 2005. - V.44. - P.6867-6876.

43. Duval, C. Elimination of fibrin gamma-chain cross-linking by FXIIIa increases pulmonary embolism arising from murine inferior vena cava thrombi [Text] / C. Duval, A. Baranauskas, T. Feller [et al.] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2021. -V.118. - 2103226118.

44. Ebbeling, L. Rapid ultrastructural changes in the dense tubular system following platelet activation [Text] / L. Ebbeling, C. Robertson, A. McNicol, J.M. Gerrard // Blood. - 1992. - V.80. - No.3. - P.718-723.

45. Eckly, A. Abnormal megakaryocyte morphology and proplatelet formation in mice with megakaryocyte-restricted MYH9 inactivation [Text] / A. Eckly, C. Strassel, M. Freund [et al.] // Blood. - 2009. - V.113. - P.3182-3189.

46. Egot, M. Biphasic myosin II light chain activation during clot retraction [Text] / M. Egot, A. Kauskot, D. Lasne [et al.] // Thromb Haemost. - 2013. - V. 110. - P.1215-1222.

47. Ellefsen, K.L. Myosin-II mediated traction forces evoke localized Piezo1-dependent Ca2+ flickers [Text] / K.L. Ellefsen, J.R. Holt, A.C. Chang [et al.] // Commun Biol. - 2019. - V.2. - P.298.

48. Faes, C. Red blood cells modulate structure and dynamics of venous clot formation in sickle cell disease [Text] / C. Faes, A. Ilich, A. Sotiaux [et al.] // Blood.

- 2019. - V.133. - P.2529-2541.

49. Falati, S. Accumulation of tissue factor into developing thrombi in vivo is dependent upon microparticle P-selectin glycoprotein ligand-1 and platelet P-selectin [Text] / S. Falati, Q. Liu, P. Gross [et al.] // J Exp Med. - 2003. - V.197. -No.11. - P.1585-1598.

50. Faucherre, A. Piezo1 plays a role in erythrocyte volume homeostasis [Text] / A. Faucherre, K. Kissa, J. Nargeot [et al.] // Haematologica. - 2014. - V.99.

- P.70-75.

51. Fitch-Tewfik, J.L. Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells [Figure] / J.L. Fitch-Tewfik, R. Flaumenhaft // Front. Endocrinol. -2013. - V.4. - No77. -P.1-11.

52. Flaumenhaft, R. Platelet secretion [Text] / R. Flaumenhaft // Platelets, 3rd Edn, ed. A. D. Michelson (London: Academic Press). - 2013. - P.343-366.

53. Fong, K.P. Cleavage of talin by calpain promotes platelet-mediated fibrin clot contraction [Text] / K.P. Fong, K.S. Molnar, N. Agard [et al.] // Blood Adv.

- 2021. - V.5. - P.4901-4909.

54. Furie, B. Pathogenesis of thrombosis [Text] / B. Furie // Hematology Am Soc Hematol Educ Program. - 2009. - P.255-258.

55. Ganguly, P. Role of homocysteine in the development of cardiovascular disease [Text] / P. Ganguly, S.F. Alam // Nutr J. - 2015. - V. 14. - P.6.

56. Gebhard, C. Impact of sex and gender on COVID-19 outcomes in Europe [Text] / C. Gebhard, V. Regitz-Zagrosek, H.K. Neuhauser [et al.] // Biol Sex Differ. 2020. - V.11. - No.1. - P.29.

57. Ghoshal, K. Overview of platelet physiology: its hemostatic and nonhemostatic role in disease pathogenesis [Text] / K. Ghoshal, M. Bhattacharyya // Sci. World J. - 2014. - V.2014. - 781857.

58. Gnanasambandam, R. Ionic selectivity and permeation properties of human piezo1 channels [Text] / R. Gnanasambandam, C. Bae, P.A. Gottlieb, F. Sachs // PLoS One. - 2015. - V.10. - No.e0125503.

59. Gorbet, M. B. Biomaterial-associated thrombosis: roles ofcoagulation factors, complement, platelets and leukocytes [Text] / M.B. Gorbet, M.V. Sefton // Biomaterials. - 2004. - V.25. - P.5681-5703.

60. Grover, S.P. Intrinsic pathway of coagulation and thrombosis [Text] / S.P. Grover, N. Mackman // Arterioscler Thromb Vasc Biol. - 2019. - V.39. - No.3. - P.331-338.

61. Grozovsky, R. Regulating billions of blood platelets: glycans and beyond [Text] / R. Grozovsky, S. Giannini, H. Falet, K. M. Hoffmeister // Blood. -2015. - V.126. - P.1877-1884.

62. Gryglewski, R.J. Prostacyclin among prostanoids [Text] /. Pharmacol Rep. - 2008. - V.60. - P.3-11.

63. Hajjar, K. A. The molecular basis of fibrinolysis [Text] / K.A. Hajjar, S.A. Orkin [et al.] // Nathan and Orkin's Hematology of Infancy and Childhood. 8. Philadelphia: Saunders/Elsevier. - 2014. - P. 1425-1447.

64. Hall, J.E. Guyton and Hall textbook of medical physiology 12th ed. [Text] / J.E. Hall, A.C. Guyton // Philadelphia: Saunders/Elsevier. - 2011. - P.7.

65. Hartmann, M. Elevated pre- and postoperative ROTEM clot lysis indices indicate reduced clot retraction and increased mortality in patients undergoing liver transplantation [Text] / M. Hartmann, B. Lorenz, T. Brenner, F.H. Saner // Biomedicines. - 2022. - V.10. - 1975.

66. Hartwig, J.H. The platelet: Form and function [Text] / J.H. Hartwig // Semin Hematol. - 2006. - 43. - No.1, Suppl 1. - P.S94-100.

67. Hechler, B. P2 receptors and platelet function [Text] / B. Hechler, C. Gachet // Purinergic Signal. - 2011. - V.7. - No.3. - P.293-303.

68. Heemskerk, J.W. Platelet activation and blood coagulation [Text] / J.W. Heemskerk, E.M. Bevers, T. Lindhout // Thromb Haemost. - 2002. - V.88. - P.186-193.

69. Henke, r.K Call to action to prevent venous thromboembolism in hospitalized patients: a policy statement from the American Heart Association [Text] / P.K. Henke, S.R. Kahn, C.J. Pannucci // Pradhan and On behalf of the American Heart Association Advocacy Coordinating Committee. - 2020. - V.141. - P.e914-e931.

70. Huang, J. Platelet integrin aIIbß3: signal transduction, regulation, and its therapeutic targeting [Text] / J. Huang, X. Li, X. Shi [et al.] // J Hematol Oncol. -2019. - V.12. - P. 26.

71. Huntington, J.A. Serpin structure, function and dysfunction [Text] / J.A. Huntington // J Thromb Haemost. - 2011. - V.9, Suppl 1. - P.26-34.

72. Hosseini, E. Down-regulation of platelet adhesion receptors is a controlling mechanism of thrombosis, while also affecting post-transfusion efficacy of stored platelets [Text] / E. Hosseini, M. Mohtashami, M. Ghasemzadeh // Thrombosis J. - 2019. - V.17. - No.20.

73. Ilkan, Z. Evidence for shear-mediated Ca2+ entry through mechanosensitive cation channels in human platelets and a megakaryocytic cell line [Text] / Z. Ilkan, J.R. Wright, A.H. Goodall [et al.] // J Biol Chem. - 2017. - V.292.

- P.9204-9217.

74. Israels, S.J. CD63 modulates spreading and tyrosine phosphorylation of platelets on immobilized fibrinogen [Text] / S.J. Israels, E.M. McMillan-Ward // Thromb Haemost. - 2005. - V.93. - P.311-318.

75. Ivanov, I. Proteolytic properties of single-chain factor XII: a mechanism for triggering contact activation [Text] / I. Ivanov, A. Matafonov, M.F. Sun [et al.] // Blood. - 2017. - V. 129. - P.1527-1537.

76. Lacroix, J.J. Probing the gating mechanism of the mechanosensitive channel Piezo1 with the small molecule Yoda1 [Text] / J.J. Lacroix, W.M. Botello-Smith, Y. Luo // Nat. Commun. - 2018. - V.9. - 2029.

77. Jacobsen, D.W. Hyperhomocysteinemia and oxidative stress: Time for a reality check? [Text] / D.W. Jacobsen // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. - 2000.

- V.20. - P.1182-1184.

78. Jankovsky, N. Recent advances in the pathophysiology of Piezo1-related hereditary xerocytosis [Text] / N. Jankovsky, A. Caulier, J. Demagny [et al.] // Am J Hematol. - 2021. - V.96. - P.1017-1026.

79. Jennings, L.K. Mechanisms of platelet activation: need for new strategies to protect against platelet-mediated atherothrombosis [Text] / L.K. Jennings // Thromb Haemost. - 2009. - V.102. - No.2. - P.248-257.

80. Johnson, S. Mechanical behavior of in vitro blood clots and the implications for acute ischemic stroke treatment [Text] / S. Johnson, J. Chueh, M.J. Gounis [et al.] // J Neurointerv Surg. - 2020. - V. 12. - P.853-857.

81. Kamajaya, A. The structure of a conserved piezo channel domain reveals a topologically distinct ß sandwich fold [Text] / A. Kamajaya, J.T. Kaiser, J. Lee [et al.] // Structure. - 2014. - V.22. - No.10. - P.1520-1527.

82. Kasahara, K. Clot retraction is mediated by factor XIII-dependent fibrin-alphaIIbbeta3-myosin axis in platelet sphingomyelin-rich membrane rafts [Text] / K. Kasahara, M. Kaneda, T. Miki [et al.] // Blood. - 2013. - V. 122. - P.3340-3348.

83. Kasirer-Friede, A. Platelet integrins and immunoreceptors [Text] / A. Kasirer-Friede, M.L. Kahn, S.J. Shattil // Immunol Rev. - 2007. - V.218. - P.247-264.

84. Khismatullin, R.R. Extent of intravital contraction of arterial and venous thrombi and pulmonary emboli [Text] / R.R. Khismatullin, S. Abdullayeva, A.D. Peshkova [et al.] // Blood Adv. - 2022. - V.6. - No.6. - P.1708-1718.

85. Kim, O.V. Quantitative structural mechanobiology of platelet-driven blood clot contraction [Text] / O.V. Kim, R.I. Litvinov, M.S. Alber, J.W. Weisel // Nat Commun. - 2017. - V.8. - 1274.

86. Kojima, H. CD226 mediates platelet and megakaryocyte cell adhesion to vascular endothelial cells [Text] / H. Kojima, H. Kanada, S. Shimizu [et al.] // J Biol Chem. 2003. - V.278. - No.38. - P.36748-3653.

87. Koupenova, M. Biology of Platelet Purinergic Receptors and Implications for Platelet Heterogeneity [Text] / M. Koupenova, K. Ravid // Front Pharmacol. - 2018. - V.9. - P.37.

88. Kovalenko, T.A. Asymmetrical forces dictate the distribution and morphology of platelets in blood clots [Text] / T.A. Kovalenko, M.N. Giraud, A. Eckly [et al.] // Cells. - 2021. - V.10. - P.584.

89. Krishnaswamy, S. The transition of prothrombin to thrombin [Text] / S. Krishnaswamy //J Thromb Haemost. - 2013. - V.11, Suppl 1. - P.265-276.

90. Kuck, L. Active modulation of human erythrocyte mechanics [Text] / L. Kuck, J.N. Peart, M.J. Simmonds // Am J Physiol Cell Physiol. - 2020. - V.319. -No.2. - P.C250-C257.

91. Kuck, L. Piezo1 regulates shear-dependent nitric oxide production in human erythrocytes [Text] / L. Kuck, J.N. Peart, M.J. Simmonds // Am J Physiol Heart Circ Physiol. - 2022. - V.323 - P.H24-37.

92. Kuchel, P.W. Enhanced Ca2+ influx in mechanically distorted red blood cells measured with 19F nuclear magnetic resonance spectroscopy [Text] / P.W. Kuchel, K. Romanenko, D. Shishmarev [et al.] // Sci Rep. - 2021. - V. 11. - No.3749.

93. Labelle, M. Direct signaling between platelets and cancer cells induces an epithelial-mesenchymal-like transition and promotes metastasis [Text] / M. Labelle, S. Begum, R.O. Hynes // Cancer cell. - 2011. - V.20. - No.5. - P.576-590.

94. Lam, W.A. Mechanics and contraction dynamics of single platelets and implications for clot stiffening [Text] / W.A. Lam, O. Chaudhuri, A. Crow [et al.] // Nat Mater. - 2011. - V.10. - P. 61-66.

95. Le Minh, G. Impaired contraction of blood clots as a novel prothrombotic mechanism in systemic lupus erythematosus [Text] / G. Le Minh, A.D. Peshkova, I.A. Andrianova [et al.] // Clin Sci (Lond). - 2018. - V.2. - P.243-254.

96. Lei, X. Anfibatide, a novel GPIb complex antagonist, inhibits platelet adhesion and thrombus formation in vitro and in vivo in murine models of thrombosis [Text] / X. Lei, A. Reheman, Y. Hou [et al.] // Thromb Haemost. - 2014. - V.111. -No.2. - P.279-289.

97. Leong, L. Clot stability as a determinant of effective factor VIII replacement in hemophilia A [Text] / L. Leong, I.N. Chernysh, Y. Xu [et al.] // Res Pract Thromb Haemost. - 2017. - V.1. - P.231-241.0

98. Lewis, 2015

99. Li, J. Cytoskeletal dynamics of human erythrocyte [Text] / J. Li, G. Lykotrafitis, M. Dao, S. Suresh // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2017. - V. 104. - No. 12.

- P.4937-4942.

100. Litvinov, R.I. Blood clot contraction: Mechanisms, pathophysiology, and disease [Text] / R.I. Litvinov, J.W. Weisel // Res Pract Thromb Haemost. - 2023.

- V.7. - 100023.

101. Liu, L. Inhibition of shear-induced platelet aggregation by Xueshuantong via targeting Piezo1 channel-mediated Ca2+ signaling pathway [Text] / L. Liu, Q. Zhang, S. Xiao [et al.] // Front Pharmacol. - 2021. - V. 12. - 606245.

102. Luo, F. Effect of homocysteine on platelet activation induced by collagen [Text] / F. Luo, X. Liu, S. Wang, H. Chen // Nutrition. - 2006. - V.22. -P.69-75.

103. Mammadova-Bach, E. Platelet mechanotransduction: Regulatory cross talk between mechanosensitive receptors and calcium channels [Text] / E. Mammadova-Bach, T. Gudermann, A. Braun // Arterioscler Thromb Vasc Biol. -2023. - V.43. - No.8. - P.1339-1348.

104. Malinowska, J. Homocysteine and its thiolactone-mediated modification of fibrinogen affect blood platelet adhesion [Text] / J. Malinowska, B. Olas // Platelets. - 2012. - V.23. - P.409-412

105. Mann, K.G. Coagulation explosion [Figure] / K.G. Mann // Vermont Business Graphics. - 1997. -P.266.

106. Marieb, E. N. Human Anatomy & Physiology (8th ed.) [Text] / E. N. Marieb, K. Hoehn // San Francisco: Benjamin Cummings. - 2010. - P. 649-650.

107. Martins, P.J.F. Physiological variation in plasma total homocysteine concentrations in rats [Text] / P.J.F. Martins, L.C. Galdieri, F.G. Souza [et al.] // Life Sci. - 2005. - V.76. - P.2621-2629.

108. Martins, J.R. Piezo1-dependent regulation of urinary osmolarity [Text] / Martins JR, Penton D, Peyronnet R, [et al.] // Pflugers Arch. - 2016. - V.468. -P.1197-1206.

109. McEver, R.P. P-Selectin/PSGL-1 and other interactions between platelets, leukocytes, and endothelium [Text] / R.P. McEver // Platelets. 2nd ed. San Diego (CA): Elsevier/Academic Press. - 2007. - P.231-249.

110. Mondoro, T.H. Active GPIIb-IIIa conformations that link ligand interaction with cytoskeletal reorganization [Text] / T.H. Mondoro, M.M. White, L.K. Jennings // Blood. - 2000. - V.96. - P.2487-2495.

111. Moreno, J.J. Eicosanoid receptors: Targets for the treatment of disrupted intestinal epithelial homeostasis [Text] / J.J. Moreno // Eur J Pharmacol. -2017. - V.796. - P.7-19.

112. Moroi, M. Platelet glycoprotein VI: its structure and function [Text] / M. Moroi, S.M. Jung // Thromb Res. - 2004. - V. 114. - No.4. - P.221-233.

113. Morrissey, J.H. Tissue factor and the initiation and regulation (TFPI) of coagulation. Hemostasis and Thrombosis [Text] / J.H. Morrissey, G.J. Jr. Broze // Basic Principles and Clinical Practice. 6th. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins. - 2013. - P.163-168.

114. Motiejunaite, J. Adrenergic receptors and cardiovascular effects of catecholamines [Text] / J. Motiejunaite, L. Amar, E. Vidal-Petiot // Ann Endocrinol (Paris). - 2021. - V.82. - P.193-197.

115. Mountford, J.K. The class II PI 3-kinase, PI3KC2alpha, links platelet internal membrane structure to shear-dependent adhesive function [Text] / J.K. Mountford, C. Petitjean, H.W. Putra [et al.] // Nat Commun. - 2015. - V.6. - 6535.

116. Muthard, R.W. Blood clots are rapidly assembled hemodynamic sensors: flow arrest triggers intraluminal thrombus contraction [Text] / R.W. Muthard, S.L. Diamond // Arterioscler Thromb Vasc Biol. - 2012. - V.32. - No. 12. - P.2938-2945.

117. Newman, D.K. Inhibition of antigen-receptor signaling by Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1 (CD31) requires functional ITIMs, SHP-2, and

p56(lck) [Text] / D.K. Newman, C. Hamilton, P.J. Newman // Blood. - 2001. - V.97.

- No.8. - P.2351-2357.

118. O'Donnell, J.S. Advances in understanding the molecular mechanisms that maintain normal haemostasis [Text] / J.S. O'Donnell, J.M. O'Sullivan, R.J.S. Preston // Br J Haematol. - 2019. - V.186. - P.24-36.

119. Offermanns, S. Activation of platelet function through G proteincoupled receptors [Text] / S. Offermanns //Circ Res. - 2006. - V.99. - No.12. -P.1293-1304.

120. Ozaki, Y. Novel interactions in platelet biology: CLEC-2/podoplanin and laminin/GPVI [Text] / Y. Ozaki, K. Suzuki-Inoue, O. Inoue // Thromb Haemost.

- 2009. - V.7. - No.1. - P.191-194.

121. Palta, S. Overview of the coagulation system [Text] / S. Palta, R. Saroa, A. Palta // Indian J Anaesth. - 2014. - V.58. - No.5. - P.515-523.

122. Peacock, M. Calcium metabolism in health and disease [Text] / M. Peacock // Clin J Am Soc Nephrol. - 2010. - V.5. - P.S23-30.

123. Pecci, A. MYH9: Structure, functions and role of non-muscle myosin IIA in human disease [Figure] / A. Pecci, X. Ma, A. Savoia, R.S. Adelstein // Gene. -2018. - V.664. - P.152-167.

124. Periayah, M.H. Mechanism action of platelets and crucial blood coagulation pathways in hemostasis [Text] / M.H. Periayah, A.S. Halim, A.Z. Mat Saad // Int J Hematol Oncol Stem Cell Res. - 2017. - V.11. - No.4. - P.319-327.

125. Peshkova, A.D. Activated monocytes enhance platelet-driven contraction of blood clots via tissue factor expression [Text] / A.D. Peshkova, G. Le Minh, V. Tutwiler [et al.] // Sci Rep. - 2017. - V.7. - 5149.

126. Peshkova, A.D. Reduced contraction of blood clots in venous thromboembolism is a potential thrombogenic and embologenic mechanism [Text] / A.D. Peshkova, D.V. Malyasyov, R.A. Bredikhin [et al.] // TH Open. - 2018. - V.2.

- No.1. - P.104-115.

127. Peshkova, A.D. Accelerated spatial fibrin growth and impaired contraction of blood clots in patients with rheumatoid arthritis [Text] / A.D. Peshkova, T.A. Evdokimova, T.B. Sibgatullin [et al.] // Int J Mol Sci. - 2020. - V.21. - 9434.

128. Petrich, B.G. The antithrombotic potential of selective blockade of talin-dependent integrin alpha IIb beta 3 (platelet GPIIb-IIIa) activation [Text] / B.G. Petrich, P. Fogelstrand, A.W. Partridge [et al.] // J Clin Invest. - 2007. - V.117. -P.2250-2259.

129. Picard, V. Clinical and biological features in Piezo1-hereditary xerocytosis and Gardos channelopathy: a retrospective series of 126 patients [Text] / V. Picard, C. Guitton, I. Thuret [et al.] // Haematologica. - 2019. - V.104. - P.1554-1564.

130. Previtali, E. Risk factors for venous and arterial thrombosis [Text] / E. Previtali, P. Bucciarelli, S. M. Passamonti, I. Martinelli // J. Blood Transfus. - 2011. - V.9 - P.120-138.

131. Quach, M. E. Mechanisms of platelet clearance and translation to improve platelet storage [Text] / M.E. Quach, W. Chen, R. Li // Blood. - 2018. -V.131. - P.1512-1521.

132. Ranade, S.S. Piezo1, a mechanically activated ion channel, is required for vascular development in mice [Text] / S.S. Ranade, Z. Qiu, S.H. Woo [et al.] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2014. - V.111. - P.10347-10352.

133. Rehman, T. Cysteine and homocysteine as biomarker of various diseases [Text] / T. Rehman, M.A. Shabbir, M. Inam-Ur-Raheem [et al.] // Food Sci. Nutr. - 2020. - V.8. - P.4696-4707.

134. Reviakine, I. New horizons in platelet research: understanding and harnessing platelet functional diversity [Figure] / I. Reviakine // Clin Hemorheol Microcirc. - 2015. - V.60. - No.1. - P.133-152.

135. Riba, R. Altered platelet reactivity in peripheral vascular disease complicated with elevated plasma homocysteine levels [Text] / R. Riba, A. Nicolaou, M. Troxler [et al.] // Atherosclerosis. - 2004. - V.175. - P.69-75.

136. Rijken, D.C. Compaction of fibrin clots reveals the antifibrinolytic effect of factor XIII [Text] / D.C. Rijken, S. Abdul, J.J. Malfliet [et al.] // J Thromb Haemost. - 2016. - V.14. - P.1453-1461.

137. Rojas-Murillo, J.A. Physical, Mechanical, and Biological Properties of Fibrin Scaffolds for Cartilage Repair [Figure] / J.A. Rojas-Murillo, M.A. Simental-Mendia, N.K. Moncada-Saucedo [et al.] // Int J Mol Sci. - 2022. - V.23. - No.17. -9879.

138. Ruggeri, Z.M. Platelet adhesion under flow [Text] / Z.M. Ruggeri // Microcirculation. - 2009. - V.16. - No.1. -P.58-83.

139. Rumbaut, R. E. Platelet-Vessel Wall Interactions in Hemostasis and Thrombosis [Text] / R. E. Rumbaut, P. Thiagarajan // San Rafael (CA): Morgan & Claypool Life Sciences. - 2010. - P.75.

140. Saboor, M. Platelet receptors; an instrumental of platelet physiology [Text] / M. Saboor, Q. Ayub, S. Ilyas, A. Moinuddin // Pak J Med Sci. - 2013. - V.29.

- No.3. - P.891-896.

141. Sabovic, M. Biochemical and biophysical conditions for blood clot lysis [Text] / M. Sabovic, A. Blinc // Pflugers Arch. - 2000. - V.440. - P.R134-136.

142. Samson, A.L. Endogenous fibrinolysis facilitates clot retraction in vivo [Text] / A.L. Samson, I. Alwis, J.A.A. Maclean [et al.] // Blood. - 2017. - V.130. -P.2453-2462.

143. Santoso, S. Association of the platelet glycoprotein Ia C807 T genepolymorphism with nonfatal myocardial infarction in younger patients [Text] / S. Santoso, T.J. Kunicki, H. Kroll [et al.] // Blood. - 1999. - V.93. - P.2449-2453.

144. Schneider, M. A study of the protection of plasmin from antiplasmin inhibition within an intact fibrin clot during the course of clot lysis [Text] / M. Schneider, M. Nesheim // J Biol Chem. - 2004. - V.279. - No. 14. - P.13333-13339.

145. Selvadurai, M.V. Structure and function of the open canalicular system

- the platelet's specialized internal membrane network [Text] / M.V. Selvadurai, J.R. Hamilton // Platelets. - 2018. - V.29. - No.4. - P.319-325.

146. Seri, M. Mutations in MYH9 result in the May-Hegglin anomaly, and Fechtner and Sebastian syndromes [Text] / M. Seri, R. Cusano, S. Gangarossa [et al.] // Nat Genet. - 2000. - V.26. - No.1. - P.103-105.

147. Signorello, M.G. Homocysteine decreases platelet NO level via protein kinase C activation [Text] / M.G. Signorello, A. Segantin, M. Passalacqua, G. Leoncini // Nitric Oxide. - 2009. - V.20. - P. 104-113.

148. Sharda, A. The life cycle of platelet granules [Text] / A. Sharda, R. Flaumenhaftt // F1000Res. - 2018. -V.7. - 236.

149. Smith, S. A. How it all starts: initiation of the clotting cascade [Text] / S.A. Smith, R.J. Travers, J.H. Morrissey // Crit Rev Biochem Mol Biol. - 2015. -V.50. - No.4. - P.326-336.

150. Smyth, S.S. Platelet morphology, biochemistry, and function [Text] / S.S. Smyth, S. Whiteheart, J.E.J. Italiano, B.S. Coller // Williams Hematology, ed: The McGraw-Hill Companies, Inc. - 2010. - P.1735-1814.

151. Stalker, T.J. Hierarchical organization in the hemostatic response and its relationship to the platelet-signaling network [Text] / T.J. Stalker, E.A. Traxler, J. Wu [et al.] // Blood. - 2013. - V.121. - No.10. - P.1875-1885.

152. Stegner, D. Platelet receptor signaling in thrombus formation [Text] / D. Stegner, B. Nieswandt // J. Mol. Med. - 2011. - V.89. - No.2. - P.109-121.

153. Swieringa, F. Integrating platelet and coagulation activation in fibrin clot formation [Text] / F. Swieringa, H.M.H. Spronk, J.W.M. Heemskerk, P.E.J. van der Meijden // Res Pract Thromb Haemost. - 2018. -V.2. - No.3. -P.450-460.

154. Tang, N. Abnormal coagulation parameters are associated with poor prognosis in patients with novel coronavirus pneumonia [Text] / N. Tang, D. Li, X. Wang, Z. Sun // J. Thromb. Haemost. - 2020. - V.18. - P.844-847.

155. Thomas, M.R. The role of platelets in inflammation [Figure] / M.R. Thomas, R.F. Storey // Thromb Haemost. - 2015. - V. 114. - No.3. - P.449-458.

156. Tomasiak-Lozowska, M.M. Reduced clot retraction rate and altered platelet energy production in patients with asthma [Text] / M.M. Tomasiak-

Lozowska, T. Rusak, T. Misztal [et al.] // J Asthma. 2016. - V.53. - No.6. - P.589-598.

157. Tutwiler, V. Kinetics and mechanics of clot contraction are governed by the molecular and cellular composition of the blood [Text] / V. Tutwiler, R.I. Litvinov, A.P. Lozhkin // Blood. - 2016. - V.127. - P. 149-159.

158. Tutwiler, V. Interplay of platelet contractility and elasticity of fibrin/erythrocytes in blood clot retraction [Text] / V. Tutwiler, H. Wang, R.I. Litvinov [et al.] // Biophys J. - 2017. - V. 112. - P.714-723.

159. Tutwiler, V. Shape changes of erythrocytes during blood clot contraction and the structure of polyhedrocytes retraction [Text] / V. Tutwiler, A.R. Mukhitov, A.D. Peshkova [et al.] // Sci Rep. - 2018. - V.8. - No.1. - 17907

160. Tutwiler, V. Rupture of blood clots: Mechanics and pathophysiology retraction [Text] / V. Tutwiler, J. Singh, R.I. Litvinov [et al.] // Sci Adv. - 2020. -V.6. - eabc0496.

161. Tutwiler, V. Pathologically stiff erythrocytes impede contraction of blood clots retraction [Text] / V. Tutwiler, R.I. Litvinov, A. Protopopova [et al.] // J Thromb Haemost. - 2021. - V.19. - P.1990-2001.

162. van der Meijden, P.E.J. Platelet biology and functions: new concepts and clinical perspectives retraction [Figure] / P.E.J. van der Meijden, J.W.M. Heemskerk // Nat Rev Cardiol. - 2019. - V.16. - P.166-179.

163. Varga-Szabo, D. Cell adhesion mechanisms in platelets retraction [Text] / D. Varga-Szabo, I. Pleines, B. Nieswandt // Arterioscler Thromb Vasc Biol. - 2008. - V.28. - P.403-412.

164. Versteeg, H.H. New fundamentals in hemostasis retraction [Text] / H.H. Versteeg, J.W. Heemskerk, M. Levi, P.H. Reitsma // Physiol. Rev. - 2013. - V.93. -P.327-358.

165. Vicente-Manzanares, M. Non-muscle myosin II takes centre stage in cell adhesion and migration retraction [Figure] / M. Vicente-Manzanares, X. Ma, R. Adelstein [et al.] // Nat Rev Mol Cell Biol. - 2009. - V.10. - P.778-790.

166. Wadud, R. Yoda1 and phosphatidylserine exposure in red cells from patients with sickle cell anaemia retraction [Text] / R. Wadud, A. Hannemann, D.C. Rees [et al.] // Sci Rep. - 2020. - V.10. - 20110.

167. Wald, D.S. Homocysteine and cardiovascular disease: Evidence on causality from a meta-analysis retraction [Text] / D.S. Wald, M. Law, J.K. Morris // Br. Med. J. - 2002. - V.325. - P.1202-1206.

168. Wells, P.S. Evaluation of D-dimer in the diagnosis of suspected deep-vein thrombosis retraction [Text] / P.S. Wells, D.R. Anderson, M. Rodger [et al.] // N Engl J Med. - 2003. - V.349. - P.1227-1235.

169. Wood, J.P. Tissue factor pathway inhibitor-alpha inhibits prothrombinase during the initiation of blood coagulation retraction [Text] / J.P. Wood, M.W. Bunce, S.A. Maroney [et al.] // Proc Natl Acad Sci U S A. - 2013. -V.110. - No.44. - P.17838-17843.

170. Wufsus, A.R. Elastic behavior and platelet retraction in low- and high-density fibrin gels retraction [Text] / A.R. Wufsus, K. Rana, A. Brown [et al.] // Biophys J. - 2015. - V.108. - P.173-183.

171. Yakovleva, O. Hydrogen sulfide alleviates anxiety, motor, and cognitive dysfunctions in rats with maternal hyperhomocysteinemia via mitigation of oxidative stress retraction [Text] / O. Yakovleva, K. Bogatova, R. Mukhtarova [et al.] // Biomolecules. - 2020. - V.10. - 995.

172. Zarychanski, R. Mutations in the mechanotransduction protein PIEZO1 are associated with hereditary xerocytosis retraction [Text] / R. Zarychanski, V.P. Schulz, B.L. Houston [et al.] // Blood. - 2012. - V.120. - P.1908-1915.

173. Zhao, W. Piezo1 initiates platelet hyperreactivity and accelerates thrombosis in hypertension retraction [Text] / W. Zhao, Z. Wei, G. Xin [et al.] // J Thromb Haemost. - 2021. - V.19. - P.3113-3125.

ПРИЛОЖЕНИЕ

Дополнительная таблица 1

Клиническая характеристика нейрохирургических пациентов

Клинические характеристики Общее количество пациентов (П=78) Клинические подгруппы

Без послеоперацион ного ТГВ (П=55) С послеоперацион ным ТГВ (П=23)

Возраст, лет 59±1 57±1 63±2

Пол Женщины 59 (79%) 39 (71%) 20 (87%)

Мужчины 19 (21%) 16 (29%) 3 (13%)

Основной диагноз

Вид опухоли Злокачественная опухоль 22 (28%) 16 (29%) 6 (26%)

Доброкачественная опухоль 56 (72%) 39 (71%) 17 (74%)

Сопутствующие заболевания

Атеросклероз 61 (78%) 43 (78%) 18 (78%)

Артериальная гипертензия 32 (41%) 22 (40%) 10 (43%)

Сердечная недостаточность 21 (27%) 11 (20%) 10 (43%)*

Хроническая болезнь легких 6 (8%) 2 (4%) 4 (17%)*

Сахарный диабет 9 (12%) 7 (13%) 2 (9%)

Факторы развития тромбоза

Острые нарушения мозгового кровообращения в анамнезе 6 (8%) 3 (5%) 3 (13%)

Инфаркт миокарда в анамнезе 3 (4%) 1 (2%) 2 (9%)

Продолжитель ность операции > 4 часов 23 (29%) 16 (29%) 7 (30%)

< 4 часов 55 (71%) 39 (71%) 16 (70%)

Иммобилизация более 4 дней 5 (6%) 2 (4%) 3 (13%)

Ожирение (ИМТ>30 кг/м2) 20 (26%) 13 (24%) 7 (30%)

Прием стероидных препаратов до операции (дексаметазон, гидрокортизон) 36 (46%) 24 (44%) 12 (52%)

*р<0.05 между пациентами без и с послеоперационным тромбозом глубоких вен (ТГВ), тест хи-квадрат

Дополнительная таблица 2

Демографические и клинические характеристики пациентов с COVID-19, включенных в исследование

Клинические характеристики Число пациентов (П=235)

Пол Мужчины 107 (46%)

Женщины 128 (54%)

Возраст <65 84 (36%)

>65 151 (64%)

Степень тяжести заболевания Средне-тяжелая 177 (75%)

Тяжелая 58 (25%)

Степень поражения легких (КТ) 1 -я степень 47 (20%)

1-2-я степень 111 (47%)

3-4-я степень 77 (33%)

Длительность заболевания на момент обследования <7 дней от начала заболевания 18 (8%)

7-14 дней от начала заболевания 103 (44%)

>14 дней от начала заболевания 114 (49%)

Исход заболевания Благоприятный 217 (92%)

Летальный 18 (8%)

Сопутствующие заболевания и факторы риска т ромбозов

Гемобластозы 8 (4%)

Гипертоническая болезнь 131 (56%)

Сахарный диабет 56 (24%)

Ишемическая болезнь сердца 44 (18%)

Острый инфаркт миокарда 18 (8%)

Острые нарушения мозгового кровообращения 26 (11%)

Тромбофлебит сосудов нижних конечностей 10 (4%)

Курение 16 (7%)

Ожирение (ИМТ>30 кг/м2) 78 (33%)

Лечение

Низкомолекулярные гепарины Профилактическая доза 100 (42%)

Высокая профилактическая и лечебная дозы 118 (48%)

Глюкокортикостероиды (дексаметазон, метилпреднизолон, преднизолон) 221 (94%)

Ингибитор интерлейкина-6 (тоцилизумаб) 7 (3%)

Противовирусные препараты (ингавирин, арбидол) 60 (26%)

Муколитики (АЦЦ, амброксол) 120 (51%)

Гидроксихлорохин (плаквенил) 82 (35%)

ИВЛ 13 (6%)

Дополнительная таблица 3

Последовательности праймеров для секвенирования экзонов гена МУИ9

Экзон Мутация Последовательность праймеров Размер амплификатов, п.н.

2 Ш3Я F: 5'-СААСТТаТТТТТТСАаШАШСАСАТС-З' F: 5' - АСТССТТСААОСССССТТСТСААС-3' 675

11 К37Ш F: 5'-ОТОаСТТТСТТССТСТСТОСТСС-3' R: 5' -АТТОТаСААаААССОТАСТСАааТС-3' 367

17 Я702С F: 5' -ТССАААССТОТаааСТОТАаСа-3' R: 5' -АСТСАОТТСТАСАТОаАТааАааАС-3' 384

31 Б1424К Б: 5' -САТААСТОааСАаАТСССТааТО-3' R: 5' -СТСТААОСАСТОаССССОСАС-3' 513

39 Е1841К F: 5'-АОСАААааССТСССТАСОТаАТС-3' R: 5' -аСАОТССТТТСТТааТОАСАТТСа-3' 668

41 Ю933Х F: 5'-ОСТОТааСТСССААаАСТСС-3' R: 5' -ааСАааАааАааСАТаТТСАС-3' 1722