Исследование свойств и механизмов формирования субпопуляций активированных тромбоцитов тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, кандидат биологических наук Топалов, Николай Николаевич

• Топалов, Николай Николаевич
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Топалов, Николай Николаевич

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Тромбоциты

Свертывание крови

Активация тромбоцитов

Основные виды ответов тромбоцитов при активации

Рецепторы тромбоцитов и основные пути внутриклеточной сигнализации

в тромбоцитах

Кальциевая сигнализация в тромбоцитах

Субпопуляции активированных тромбоцитов

Методики изучения субпопуляций активированных тромбоцитов

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материалы. В работе использовались следующие материалы

Выделение тромбоцитов

Загрузка тромбоцитов флуоресцентными красителями, чувствительными

к концентрации внутриклеточного кальция

Окраска тромбоцитов меченными антителами

Активация тромбоцитов

Проточная цитометрия. Настройка параметров прибора

Изучение кинетики формирования субпопуляций

Изучение роли секреции в формировании субпопуляций

Изучение роли межклеточных взаимодействий в формировании

субпопуляций

Обработка полученных результатов

РЕЗУЛЬТАТЫ

Подбор краски, чувствительной к концентрации кальция

Кинетика кальция в субпопуляциях активированных тромбоцитов

Существование третьей субпопуляции активированных тромбоцитов

Исследование свойств тромбоцитарных субпопуляций

Исследование роли секреции АДФ в формировании субпопуляций

Исследование роли секреции в формировании субпопуляций

Исследование роли межклеточных взаимодействий в формировании

субпопуляций

ОБСУЖДЕНИЕ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Исследование свойств и механизмов формирования субпопуляций активированных тромбоцитов»

ВВЕДЕНИЕ

Тромбоциты - это безъядерные клетки крови, основной функцией которых является участие в свертывании крови, процессе, предотвращающем кровопотерю при повреждении кровеносного сосуда. Повреждение кровеносного сосуда приводит к активации системы гемостаза, включающей плазменное и тромбоцитарное звенья. Основные активаторы тромбоцитов это коллаген, высвобождающийся при повреждении сосуда, тромбин, ключевой белок каскада плазменного гемостаза, АДФ и тромбоксан А2, секретируемые тромбоцитами в процессе активации. При активации тромбоцит может изменять форму, подвергаться адгезии в месте повреждения, агрегировать с другими тромбоцитами, секретировать различные вещества, формировать прокоагулянтную поверхность, содержащую фосфатидилсерин, и отделять микровезикулы.

Интактные тромбоциты, как и большинство других клеток человека, поддерживают асимметрию плазматической мембраны. Отрицательно заряженные фосфолипиды фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин АТФ-зависимым образом переносятся с внешнего слоя мембраны на внутренний при помощи специфичных фосфолипидтранслоказ и флипазы. Однако в тромбоцитах эти ферменты не обнаружены. Также существуют указания на то, что в определенных условиях осуществляется обратный АТФ-зависимый перенос отрицательно заряженных фосфолипидов на внешний слой плазматической мембраны, однако фермент, который мог бы быть в этом задействован (уже названый скрамблазой), до сих пор не выявлен.

Способность тромбоцитов экспрессировать фосфатидилсерин на внешнем слое мембраны является чрезвычайно важной для сбалансированного функционирования всей системы гемостаза, поскольку фосфатидилсерин в составе мембраны обеспечивает нормальную работу многих белков плазменного гемостаза, значительно ускоряя их реакции. Пациенты с синдромом Скотта, врожденной патологией тромбоцитов, при

которой нарушаются механизмы экспрессии фосфатидилсерина, страдают от кровоточивости.в результате снижения активности теназного и протромбиназного комплексов. Таким образом, изучение процессов внутриклеточной сигнализации, регулирующих экспрессию фосфатидилсерина тромбоцитами, представляется важной и актуальной задачей.

Известно, что только сильные активаторы, такие как тромбин и коллаген, приводят к экспрессии фосфатидилсерина и разделению всех тромбоцитов на две субпопуляции, обладающие различными свойствами. Формируется субпопуляция так называемых укутанных тромбоцитов, которые экспрессируют фосфатидилсерин и связывают различные белки альфа-гранулярного происхождения. Именно укутанные тромбоциты обладают прокоагулянтными свойствами и существенно ускоряют реакции плазменного гемостаза.

Очень мало известно о механизмах формирования субпопуляций тромбоцитов. Показано, что добавление различных активаторов в различных дозах in vitro ведет к формированию разного числа укутанных тромбоцитов, что говорит о том, что гетерогенность тромбоцитов развивается именно в процессе активации. Существует ряд косвенных свидетельств участия различных митохохондриальных процессов и кальциевой сигнализации в экспрессии фосфатидилсерина. Одной важной и загадочной деталью, касающейся укутанных тромбоцитов, является тот факт, что интегрин аПЬрЗа, основной белок, обеспечивающий агрегацию тромбоцитов, в них, в отличие от неукутанных тромбоцитов, не активен. Несмотря на большое количество противоречивых данных об агрегации тромбоцитов различных субпопуляций, в настоящее время появляется все больше указаний на сниженную агрегационную способность укутанных тромбоцитов.

В большинстве работ, посвященных изучению субпопуляций активированых тромбоцитов, использовались достаточно сильно разбавленные препараты тромбоцитов, в которых концентрация тромбоцитов

составляла около 1х107/мл, что на порядок ниже их физиологической концентрации. Таким образом, в данный момент существует необходимость детального изучения процессов, происходящих в тромбоцитах при их активации в физиологической концентрации, что, возможно, позволит прояснить ряд противоречий и выявить дополнительные механизмы, ведущие к экспрессии фосфатидилсерина при активации тромбоцитов. В этой связи данная работа посвящена исследованию экспрессии фосфатидилсерина при активации тромбоцитов в физиологической концентрации.

Цель работы: Изучить свойства и механизмы формирования фосфатидилсерин-положительных тромбоцитов в физиологических концентрациях.

Задачи исследования:

1. Подобрать оптимальный внутриклеточный Са -флуорофор, подходящий для достоверной оценки изменений концентраций кальция, характерных для сильной активации тромбоцитов.

2. Исследовать кальциевую сигнализацию в тромбоцитах при использовании различных активаторов.

3. Исследовать зависимость кальциевой сигнализации и экспрессии фосфатидилсерина от концентрации активированных тромбоцитов.

4. Выявить механизмы, регулирующие экспрессию фосфатидилсерина при активации тромбоцитов в физиологической концентрации.

Научная новизна. При активации тромбоцитов в физиологических

Я Я

концентрациях (2x10 /мл-4><10 /мл) впервые выявлена гетерогенность среди ФС-положительных тромбоцитов. Помимо известной ранее ФС-положительной субпопуляции с устойчиво повышенной концентрацией внутриклеточного кальция, выявлена новая, также ФС-положительная субпопуляция с низкой концентрацией кальция, не превышающей уровня, характерного для неактивированных тромбоцитов. Для тромбоцитов новой

6

ФС-положительной субпопуляции характерны высокие значения прямого и бокового светорассеяния, способность связывать фибриноген/фибрин и наличие активного интегрина allbß3a. Показано, что секреция тромбоцитов в процессе активации увеличивает количество тромбоцитов в обеих ФС-положительных субпопуляциях, но не влияет на соотношение между ними. Показано, что тромбоциты новой субпопуляции формируются в результате межклеточных взаимодействий с участием интегрина allbß3a. При снижении

у

концентрации активируемых тромбоцитов ниже 5x107мл, вновь выявленная вторая ФС-положительная субпопуляция не образуется.

Научно-практическое значение. Полученные результаты позволяют по-новому взглянуть на роль активации тромбоцитов в свертывании крови. Тромбоциты вновь открытой субпопуляции, сочетающие прокоагулянтные и агрегационные способности, представляются наиболее важными участниками свертывания крови. Полученные результаты по-новому раскрывают роль межклеточных взаимодействий в процессе активации тромбоцитов. Также результаты, полученные в работе, дают новое представление о возможном дополнительном влиянии на гемостаз антагонистов интегрина allbß3a, использующихся в терапии сердечнососудистых заболеваний.

Положения, выносимые на защиту:

1) Концентрации кальция, наблюдаемые в тромбоцитах при сильной активации, находятся в пределах динамического диапазона флуоресцентного Са2+-флуорофора Fura Red. В отличие от Calcium Green-1, она может использоваться для исследования кальциевой сигнализации в субпопуляциях тромбоцитов крови.

2) Экспрессия фосфатидилсерина укутанными тромбоцитами сопровождается продолжительным увеличением концентрации кальция в цитоплазме.

3) При активации тромбоцитов в физиологических концентрациях формируется новая субпопуляция тромбоцитов, экспрессирующих фосфатидилсерин, которая характеризуется:

а) низким уровнем внутриклеточного кальция

б) более высоким сигналом прямого и бокового светорассеяния, чем у укутанных тромбоцитов

в) поверхностью, покрытой фибриногеном

г) наличием активированного интегрина аПЬрЗ, в отличие от ранее описанных укутанных тромбоцитов.

4) Формирование этой субпопуляции прокоагулянтных тромбоцитов при физиологической концентрации обусловлено межклеточными взаимодействиями через интегрин аПЬрЗ в процессе активации.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Тромбоциты

Тромбоциты - это безъядерные клетки крови, циркулирующие в крови в концентрации 180 000-320 000 мкл"1. Тромбоциты имеют дисковидную форму с характерным диаметром 2-4 мкм. Тромбоциты формируются в красном костном мозге, отделяясь от клеток-предшественников мегакариоцитов, циркулируют в кровотоке в течение 2-10 дней с момента образования, после чего удаляются из кровотока посредством фагоцитоза в селезенке и печени.

Основной функцией тромбоцитов является препятствование кровопотере при повреждении кровеносного сосуда. Также тромбоциты участвуют в регенерации поврежденных тканей, секретируя факторы роста, стимулирующие рост и деление поврежденных клеток.

Свертывание крови

Свертывание крови - это комплекс ответов организма, препятствующих кровопотере при повреждении кровеносного сосуда. Этот процесс принято условно разделять на три составляющие: сосудистый гемостаз, обеспечивающий сужение кровеносного сосуда в месте повреждения, тромбоцитарный гемостаз, состоящий в активации тромбоцитов и их адгезии в месте повреждения, и плазменный гемостаз, состоящий в образовании фибринового сгустка \

Плазменный гемостаз представляет собой каскад реакций, в которых принимают участие растворимые белки плазмы крови, сериновые протеиназы, называемые факторами свертывания. Данный каскад реакций инициируется особым трансмембранным белком тканевым фактором, который присутствует на поверхности практически всех клеток организма, за исключением эндотелия, непосредственно контактирующего с кровотоком. Каскад реакций приводит к преобразованию неактивного белка протромбина в тромбин, являющийся центральным элементом плазменного гемостаза. Тромбин расщепляет растворимый белок фибриноген с образованием

нерастворимого фибрина, который, полимеризуясь, образует фибриновую сеть, препятствующую кровопотере.

Тромбоцитарный гемостаз состоит в активации тромбоцитов и их адгезии в месте повреждения. Повреждение сосуда приводит к высвобождению коллагена, который является сильнейшим активатором тромбоцитов. Новые тромбоциты, принесеные кровотоком к месту повреждения, участвуют в агрегации, что препятствует кровопотере.

Разделение гемостаза на отдельные составляющие является достаточно условным, все три системы неразрывно связаны друг с другом. Так, тромбин является сильным активатором тромбоцитов, а секреция тромбоцитов в процессе активации способствует сужению просвета сосуда. Кроме того, ключевую роль в плазменном гемостазе играют комплексы внутренней теназы (комплекс факторов 1Ха-ХШа) и протромбиназы (комплекс факторов Ха-Уа), ферментативная активность которых возрастает в 3-5 раз в присутствии мембранной поверхности, предоставляемой активированными тромбоцитами 2. Стоит также отметить, что различные звенья играют более или менее важную роль в гемостазе в зависимости от размера сосуда и скорости кровотока.

Активация тромбоцитов

В условиях целостности кровеносного сосуда тромбоциты циркулируют в крови в неактивированном состоянии, однако, по своей природе тромбоциты способны реагировать на малейшие нарушения целостности кровеносного русла. Существует огромное количество веществ и факторов, способных переводить тромбоцит в активированное состояние, вплоть до простого механического воздействия или изменения температуры .

Среди многообразия этих факторов можно выделить основные вещества, способные активировать тромбоциты. Выделяют четыре главных активатора тромбоцитов. Наиболее сильные из них - коллаген и тромбин, другие два -это АДФ и тромбоксан А2 . Коллаген - это основной белок соединительной ткани человека, обеспечивающий ее прочность и эластичность . При

повреждении кровеносного сосуда волокна коллагена приходят в контакт с кровью, что приводит к адгезии тромбоцитов и их последующей активации. Сериновая протеиназа тромбин представляет собой ключевой элемент всего гемостаза, поскольку соединяет в себе функции главного фермента плазменного свертывания, расщепляющего фибриноген с образованием фибрина, и сильного активатора тромбоцитов. АДФ в высочайшей концентрации содержится в плотных гранулах тромбоцитов и секретируется во внеклеточное пространство в процессе их активации. В крови присутствуют ферменты, которые в дальнейшем расщепляют АДФ до АМФ и, таким образом, предотвращают возможную активацию тромбоцитов вне места повреждения. Тромбоксан А2 синтезируется в тромбоцитах в процессе их активации из арахидоновой кислоты и в дальнейшем выбрасывается во внеклеточное пространство.

Помимо описанных выше физиологических активаторов существует большое количество нефизиологических, которые в основном применяются в экспериментах in vitro. Одно из таких веществ это конвульксин, выделяемый из яда змеи, который способен активировать главный коллагеновый рецептор тромбоцитов гликопротеина VI4. Также существуют пептиды SFLLRN и AY-NH2, активирующие отдельные тромбиновые PAR-рецепторы, стабильный аналог тромбоксана А2 U46619, а также кальциевые ионофоры, вызывающие вход ионов кальция через плазматическую мембрану в цитоплазму тромбоцитов 5"7.

Основные виды ответов тромбоцитов при активации

Активация тромбоцита - это сложный комплекс внутриклеточных

сигнальных процессов, которые в конечном счете приводят к тем или иным

ответам. Стоит отметить, что различная активация ведет к различным

ответам тромбоцитов. Эти ответы можно условно разделить на более и менее

значительные: некоторые из этих ответов проявляются и при относительно

2 ^

слабой активации, а какие-то требуют более сильной активации . При всей

условности такой градации, ответы тромбоцитов перечислены ниже в порядке увеличения значимости.

1) Изменение формы. В интактном состоянии тромбоцит имеет характерную дисковидную форму, что обуславливает альтернативное название тромбоцитов "кровяные пластинки", а также их англоязычное название "platelets" (доел, "тарелочки"). Активация тромбоцита приводит к реорганизации актинового цитоскелета, что приводит к изменению формы тромбоцита: из дисковидного он становится шаровидным 8. Более сильная активация приводит к формированию тромбоцитами псевдоподий. Активация тромбоцита в потоке может приводить к его распластыванию по поверхности, к которой происходит адгезия тромбоцитов 9'10.

2) Адгезия в месте повреждения. Первоочередной задачей, которая стоит перед тромбоцитом при повреждении кровеносного сосуда, является адгезия в местуе повреждения. Как было сказано выше, при повреждении сосуда высвобождаются волокна коллагена, к которому способны прикрепляться тромбоциты. Первичное прикрепление тромбоцитов происходит при связывании тромбоцитарного рецептора гликопротеина Ib-IX-V с коллагеном через фактор фон Виллебранда. Считается, что такое связывание практически не вызывает активации тромбоцита, его активация происходит при дальнейшем связывании коллагена с рецептором гликопротеином VI, что обеспечивает более прочную и необратимую адгезию тромбоцита в месте повреждения 3'10;11.

Существует ряд заболеваний, при которых нарушается способность тромбоцитов адгезировать к месту повреждения., что ведет к кровоточивости. Наиболее распространенным из них является болезнь фон Виллебранда, при которой имеет место дисфункция или отсутствие фактора фон Виллебранда, что приводит к кровотечениям. Еще одним, более редким заболеванием является синдром Бернара-Сулье, обусловленный отсутствием

или дисфункцией гликопротеина Ib-IX-V, что, как и в случае болезни фон

12

Виллебранда, ведет к кровоточивости .

Стоит отметить, что тромбоциты обладают способностью к адгезии на различных поверхностях, что зачастую используется в экспериментах in vitro. В частности, тромбоциты способны прочно и необратимо связываться со стеклянной поверхностью, на которой иммобилизирован фибриноген, что с успехом применяется в экспериментах по изучению тромбоцитов в

9

проточных камерах .

3) Агрегация. Вышеописанный механизм адгезии тромбоцитов к коллагеновым волокнам в сущности позволяет тромбоцитам сформировать монослой в месте повреждения сосуда, чего явно недостаточно для предотвращения кровопотери. После формирования такого монослоя новые тромбоциты приносятся кровотоком, активируются и приобретают способность агрегировать с уже закрепившимися тромбоцитами. Агрегация клеток и взаимодействия между ними происходят благодаря наличию трансмембранных белков, называемых интегринами. Эти белки представляют собой гетеродимеры, состоящие из субъединиц а и р. Основной интегрин, обеспечивающий агрегацию тромбоцитов, - это интегрин аПЬрЗа, также называемый гликопротеином Ilb-IIIa. Этот интегрин присутствует только в тромбоцитах, и обеспечивает их агрегацию за счет способности связывать фибриноген и другие белки, присутствующие в плазме крови. Активация тромбоцита приводит к активации интегрина аПЬрЗа, которая происходит вследствие изменения его конформации. В результате значительно повышается сродство к фибриногену, и между разными тромбоцитами при участии интегринов образовываются

13 15

фибриногеновые "мостики" " .

Существует множество заболеваний, при которых нарушается агрегация тромбоцитов. К наиболее распространенным из них относятся тромбастения Гланцмана, заболевание, обусловленное дисфункцией или отсутствием интегрина аПЬрЗа. Еще одним таким заболеванием является афибриногенемия, при которой наблюдается полное или частичное уменьшение количества фибриногена 12.

Вообще, способность тромбоцитов к агрегации в той или иной степени нарушается при множестве заболеваний совершенно различной природы. Способность тромбоцитов к агрегации, наряду с концентрацией тромбоцитов в крови, является наиболее важным клиническим показателем функции тромбоцитов. Способность тромбоцитов к агрегации оценивается в тесте агрегометрии, в котором тромбоциты активируются тем или иным активатором в специальной освещаемой кювете и подвергаются перемешиванию. О способности тромбоцитов к агрегации судят по изменению светопропускания образца 16.

4) Секреция. В тромбоцитах содержатся два типа гранул, клеточных органелл, в которых запасаются различные вещества. Это плотные гранулы, содержащие нуклеотиды (АТФ, АДФ, ГТФ, ГДФ), а также ионы кальция в высокой концентрации, и ос-гранулы, содержащие различные белки, такие как Р-селектин, фактор фон Виллебранта, фибронектин, фибриноген, тромбоспондин, а также некоторые хемокины и факторы свертывания крови. Активация тромбоцита приводит к секреции гранул, то есть выбросу их

17' 18

содержимого во внеклеточное пространство ' .

Существует ряд нарушений функции тромбоцитов, так или иначе связанных с секрецией. К ним относятся, в частности, описанная выше афибригенемия, а также синдром серых тромбоцитов. При этом заболевании наблюдается снижение количества альфа-гранулярных белков, тромбоциты имеют неестественно крупный размер12.

5) Формирование прокоагулянтной поверхности и везикуляция. Как и большинство клеток организма, тромбоциты в интактном состоянии поддерживают асимметрию плазматической мембраны. Отрицательно заряженные фосфолипиды фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин при участии ферментов флипазы и специфических фосфолипидтранслоказ АТФ-зависимым образом переносятся из внешнего слоя мембраны во внутренний 19,20. Активация тромбоцита приводит к потере асимметрии плазматической мембраны и экспрессии фосфатидилсерина. Мембранные поверхности,

содержащие фосфатидилсерин, называются прокоагулянтными, поскольку они критически важны для протекания реакций плазменного гемостаза. В частности они важны для реакции внутренней теназы (комплекс факторов IXa-XIIIa), которая катализирует переход фактора X в активную форму, и

протромбиназы (комплекс факторов Xa-Va), которая катализирует переход

21 '22

протромбина в тромбин ' . Описанные выше реакции в присутствии

прокоагулянтной поверхности активированных тромбоцитов ускоряются на

22

3-5 порядков .

Также тромбоциты в процессе активации могут отщеплять прокоагулянтные микровезикулы, мембранные частицы диаметром до 1 мкм 22,24. Микровезикулы различного происхождения (от тромбоцитов, моноцитов или клеток эндотелия) хорошо охарактеризованы, в экспериментах in vitro убедительно доказано, что микровезикулы могут усиливать генерацию тромбина, а также влиять на формирование и стабильность фибринового сгустка 25. Физиологическая роль везикуляции на данный момент не ясна,

однако известно, что микровезикулы различного происхождения могут

26 28

играть роль в развитии некоторых сердечно-сосудистых заболеваний " . В частности, существуют данные о существенном повышении уровня микровезикул в крови пациентов, склонных к тромботическим осложнениям

27

Несмотря на то, что механизмы экспрессии фосфатидилсерина изучены недостаточно хорошо, известна патология, при которой этот процесс существенно нарушен. Это синдром Скотта, при котором за счет нарушения экспрессии фосфатидилсерина описанные выше теназный и

протромбиназный комплексы работают недостаточно эффективно, что ведет

12

к неполной активации фактора X и протромбина .

Рецепторы тромбоцитов и основные пути внутриклеточной сигнализации в тромбоцитах

Как было сказано выше, существует огромное число веществ, способных вызывать активацию тромбоцитов. В данном разделе будут более

подробным образом изложены основные рецепторы тромбоцитов и сигнальные пути, задействованные в их активации. Общая схема сигнальных путей, задействованных в активации тромбоцитов, изображена на рисунке 1.1.

1) Рецепторы коллагена.

В тромбоцитах существует три основных рецептора коллагена: гликопротеин 1Ь-1Х-У, интегрин а2{31 и гликопротеин VI (СРУ1). Первый взаимодействуют с коллагеном через фактор фон Виллебранта, два последних - непосредственно. Считается, что первые два рецептора отвечают скорее за прикрепление тромбоцита к поврежденной поверхности, чем за его активацию. Сигнализация через эти два рецептора вызывает лишь изменение формы тромбоцита за счет реорганизации цитоскелета, что ведет к его более плотному прикреплению к месту повреждения сосуда.

Рисунок 1.1. Схема основных сигнальных путей, задействованных в активации тромбоцитов.

После прикрепления тромбоцита происходит его активация через гликопротеин VI. Это один из наиболее сильных типов активации тромбоцита, ведущий к проявлению всех характерных для активации ответов, которые удобно исследовать с использованием активатора гликопротеина VI конвульксина. Коллаген вызывает кластеризацию молекул гликопротеина VI, что ведет к кросс-фосфорилированию рецептора и дальнейшему связыванию и активации Syk-киназы. Syk-киназа далее активирует у-изоформу фосфолипазы С (PLC), которая гидролизирует мембранный фосфолипид фосфотодилинозитол 4,5-дифосфат с образованием инозитол 1,4,5-трифосфата (IP3) и диацилглицерола (DAG). Инозитолтрифосфат диссоциирует в цитоплазму, связывается с рецептором на мембране плотных гранул, что вызывает открытие кальциевых каналов, выход ионов кальция в цитоплазму из плотных гранул и дальнейший вток кальция в цитоплазму из внеклеточного пространства. Далее происходит активация различных изоформ протеинкиназы С и активация каскада фосфорилирования 3'п'29"31.

2) Рецепторы тромбина.

В тромбоцитах существует два основных рецептора тромбина - это так называемые PARI и PAR4 (PAR от protease activated receptor) рецепторы. Эти рецепторы очень схожи друг с другом по сигнальным путям, которые инициируются их активацией, и по ответам, вызываемым их специфичными пептидами-активаторами. Оба эти рецептора относятся к семейству сопряженных с G-белками рецепторов и, предположительно, оба связаны с белками Gi, Gq и G12/13. Основным существенным отличием этих двух рецепторов является на два порядка различающееся сродство к тромбину (1 и 100 нМ, соответственно), что, вероятно, может предполагать различие в активации тромбоцитов при низких и высоких концентрациях тромбина. Активация тромбоцитов тромбином считается достаточно сильной и, так же как активация через гликопротеин VI, способна вызывать все известные ответы тромбоцитов.

Активация РАЛ-рецепторов происходит посредством отщепления Ы-концевого пептида, что приводит к появлению нового N-концевого пептида, который и является ковалентно привязанным активатором. Являющиеся ГТФ-азами гетеротримерные О-белки, в неактивном состоянии а-субъединицей связывают ГДФ, который при активации меняется на ГТФ, что приводит к диссоциации а-субъединицы. Субъединица Gqa активирует Р-изоформу фосфолипазы С, которая гидролизирует мембранный фосфолипид фосфотодилинозитол 4,5-дифосфат с образованием инозитол 1,4,5-трифосфата и диацилглицерола. Далее происходит выход ионов кальция, активация протеинкиназы С и активация нижележащего каскада фосфорилирования. Субъединица 01а ингибирует фермент аденилатциклазу, катализирующую синтез цАМФ, в результате чего происходит снижение уровня цАМФ и усиление ответа тромбоцита. Субъединица 012/1 За активирует так называемые факторы обмена гуаниновых нуклеотидов

31 35

(ОЕРз), стимулирующие нижележащие сигнальные процессы " .

3) Рецепторы АДФ.

В тромбоцитах существует два основных рецептора АДФ, называемых пуринэргическими рецепторами. Это рецепторы Р2У1 и Р2У12. Рецепторы Р2У1 и Р2У12 являются, подобно РА11-рецепторам, О-белок связанными рецепторами, однако, в отличие от них, они связаны с различными О-белками. Так, рецептор Р2У1 связан с белком Од, в то время как Р2У12 связан с белком 01. В соответствии с этим, активация тромбоцита через рецептор Р2У1 ведет к активации фосфолипазы С, выбросу кальция и активации протеин киназы С, в то время как активация через рецептор Р2У12

31 -36 39

ведет к ингибированию аденилатциклазы ' " .

Таким образом, основные начальные этапы сигнализации в тромбоцитах достаточно единообразны. Они состоят либо в активации инозитолтрифосфатного пути различными изоформами фосфолипазы С, либо в ингибировании аденилатциклазы. К сожалению, более поздние этапы сигнализации изучены недостаточно хорошо.

Кальциевая сигнализация в тромбоцитах

Ионы кальция являются универсальным и исключительно важным сигнальным веществом во многих клетках организма. Как правило, концентрация кальция в цитоплазме клетки поддерживается на исключительно низком уровне благодаря АТФ-зависимому транспорту во внеклеточное пространство и такие органеллы, как эндоплазматический ретикулум и митохондрии. Различные воздействия на клетки организма могут приводить к повышению концентрации кальция в цитоплазме, которое стимулирует те или иные ответы клеток 40. Кальциевый ответ клетки на стимуляцию может быть более сложным, чем простое увеличение его концентрации: иногда наблюдаются колебания или даже волны в изменениях

41

концентрации цитоплазматического кальция .

В неактивированном тромбоците концентрация кальция поддерживается на уровне десятков нМ 42,42. Активация тромбоцита многими веществами может приводить к быстрому и резкому росту концентрации кальция в цитоплазме благодаря активации фосфолипазы С и синтезу инозитолтрифосфата. Концентрация кальция в цитоплазме тромбоцита в процессе активации может возростать на порядок и составлять десятки мкМ 42,43. Кальциевая сигнализация является важнейшим сигнальным элементом, задействованным в активации тромбоцитов. Огромное количество сигнальных молекул и трансмембранных белков, таких как интегрин аПЬ(ЗЗа, имеют сайты связывания ионов кальция и могут напрямую ими активироваться 13. Эксперименты с использованием кальциевых ионофоров показали, что вход ионов кальция в цитоплазму может напрямую вызывать такие ответы тромбоцита как изменение формы, секреция гранул и формирование прокоагулянтной поверхности 7'8'44. Кроме того известно что, использование кальциевых хелаторов, таких как ВАРТА АМ, может негативно регулировать активацию тромбоцитов45'46.

Существует огромное количество работ, в которых исследовали кальциевую сигнализацию в тромбоцитах 46~50. Для этих целей использовали

различные методы: флуориметрию, проточную цитометрию и флуоресцентную микроскопию (более подробно методы исследования кальциевой сигнализации будут ниже). Наибольший интерес представляют работы, в которых изучали кальциевый ответ индивидуальных тромбоцитов, а не всех тромбоцитов суспензии.

•>0П

K.Ü

т -

50

A UP

;ii

; I

h И1

" i

v

/" 's" V Л

ль »/ * 'Д// V'jV -V

I__L__1_____JL

V\

I 1

т so

151

ÜÜ

Tiriii? *!:•;

I >

Рисунок 1.2. Кальциевые^колебания в тромбоците при активации АДФ. Тромбоциты закреплялись на подложку с иммобилизованным фибриногеном и активировались АДФ. При помощи цифровой видеокамеры фиксировались изменения флуоресценции краски fura-2. Представлена зависимость флуоресценции краски fura-2 от времени. Heemskerk JW, Hoyland J, Mason WT, Sage SO.Biochem J. 1992 Apr 15;283.

Дж. Хеемскерк с коллегами изучали кальциевую сигнализацию в тромбоцитах, прикрепленных к подложке с иммобилизованным фибриногеном, методом флуоресцентной микроскопии 47. Тромбоциты предварительно загружались флуоресцентным красителем fura-2, меняющим интенсивность флуоресценции в зависимости от концентрации внутриклеточного кальция. В данной работе показано, что активация тромбоцитов АДФ приводит к установлению нерегулярных колебаний концентрации цитоплазматического кальция на протяжение по крайней мере нескольких минут. Типичная зависимость флуоресценции fura-2 от времени

20

представлена на рисунке 1.2. Парадоксальным образом, увеличение концентрации АДФ ведет скорее к росту частоты наблюдаемых колебаний, но не к увеличению их амплитуды. Активация тромбоцитов тромбином приводит к быстрому росту концентрации кальция, колебаний при этом не наблюдается.

Субпопуляции активированных тромбоцитов

В начале 1990-х годов в литературе впервые появилась информация о том, что не все тромбоциты, формируемые в процессе активации, обладают одинаковыми свойствами. В 1992 году было впервые замечено, что при активации тромбоцитов коллагеном или тромбином с коллагеном только часть тромбоцитов экспрессирует фосфатидилсерин 51. В 1996 году впервые появились косвенные данные о том, что экспрессия фосфатидила частью

со

тромбоцитов является кальций-зависимым событием . В 1998 году аналогичный феномен деления тромбоцитов на две группы с разными уровнями экспрессии фосфатидилсерина наблюдали в эксперименте по активации тромбоцитов в результате их адгезии на коллагеновую подложку

со

. В 2000 году было показано, что при активации тромбином и конвульксином только часть тромбоцитов приобретает способность связывать фактор V 44. Тогда же авторами был впервые предложен термин COAT platelets (collagen and thrombin induced platelets) для обозначения тромбоцитов, связывающих фактор V 44'54. Впоследствии название таких тромбоцитов несколько трансформировалось, и их стали называть укутанными тромбоцитами (coated platelets), поскольку поверхность таких тромбоцитов покрыта слоем белков альфа-гранулярного происхождения 55.

Итак, любая сильная активация тромбоцитов (тромбином, конвульксином, тромбином с конвульксином, а также пептидами-активаторами PAR-рецепторов) приводит к разделению тромбоцитов на две субпопуляции, называемые укутанными и неукутанными тромбоцитами 44'55. Данный феномен активно изучался в последние десятилетия.

Первым и наиболее важным с точки зрения физиологии свойством укутанных тромбоцитов является экспрессия фосфатидилсерина. Оценка экспрессии фосфатидилсерина производится путем окраски исследуемых клеток флуоресцентно меченным аннексином V, белком, специфично и кальций-зависимо связывающимся с фосфатидилсерином 51. На рисунке 1.3 представлены распределения тромбоцитов по флуоресценции меченного аннексина V до и после активации тромбином с конвульксином 44. Видно, что активированные тромбоциты (серая кривая) разделяются на две группы, лишь одна из которых (регион М2) связывает аннексии V, что говорит об экспрессии фосфатидилсерина такими клетками. Следует отметить, что неукутанные тромбоциты практически не отличаются от неактивированных по уровню связывания аннексина V, в то время как укутанные тромбоциты связывают его на 3 порядка лучше. Таким образом, можно говорить о том, что лишь укутанные тромбоциты, образующиеся в процессе активации, экспрессируют фосфатидилсерин, необходимый для ускорения реакций теназного и протромбиназного комплексов. Данный факт свидетельствует об исключительной физиологической важности укутанных тромбоцитов, способных поддерживать генерацию тромбина в районе места повреждения сосуда.

Укутанные тромбоциты получили свое название вследствие того, что поверхность таких тромбоцитов покрыта слоем белков альфа-гранулярного происхождения. Это было впервые показано в работе 56, в которой тромбоциты активировались тромбином с конвульксином, окрашивались антителами к различным альфа-гранулярным белкам и анализировались при помощи проточной цитометрии. В данной работе показано, что укутанные тромбоциты содержат на своей поверхности такие белки, как фактор V, фибриноген, фактор фон Виллебранта, фибронектин, антиплазмин и тромбоспондин. Существует ряд работ, в которых показана роль серотонина в пришивании альфа-гранулярных белков к поверхности укутанных тромбоцитов 56'57. Показано, что укутанные тромбоциты способны связывать

такие факторы плазменного свертывания как факторы IXa, VIII, IX, X и протромбин 45;58;59. Пантелеев М.А. в своих исследованиях продемонстрировал, что укутанные тромбоциты предоставляют сайты

связывания для факторов Xla, VIII и X, входящих в состав теназного

60

комплекса .

Рисунок 1.3. Гетерогенность тромбоцитов. Представлены

распределения тромбоцитов по

флуоресценции фикоэритрин-меченного антитела на фактор V. Тромбоциты активировали 5 нМ тромбина и 500 нг/мл конвульксина. Черная кривая соответствует распределению неактивированных

тромбоцитов, серые области-

активированным.

Dale G. L. et al. Blood. 2000. Mar 1;95(5): 1694-702

Стоит отметить, что связывание альфа-гранулярных белков на тромбоците происходит только в присутствии тромбина. При активации тромбоцитов конвульксином, пептидами-активаторами РАЯ-рецепторов или кальциевым ионофором формируется субпопуляция тромбоцитов, экспрессирующих фосфатидилсерин, но не способных связывать альфа-гранулярные белки 55. Вероятно, связывание альфа-гранулярных белков с поверхностью укутанных тромбоцитов обуславливается ферментативной активностью тромбина, но не сигнальными путями, запускающимися в тромбоцитах в ходе активации. Недавно было показано, что ферменты трансглутаминазы, в частности фактор ХШа, участвуют в формировании укутанных тромбоцитов 56'61. Таким образом, связывание белков с

поверхностью тромбоцитов может иметь место в результате работы трансглутаминаз, которые могут ковалентно сшивать белки друг с другом и с поверхностью тромбоцита . Однако, существует альтернативная гипотеза, согласно которой такое связывание может быть обусловлено полимеризацией фибрина на поверхности укутанных тромбоцитов 63.

Еще одной важной особенностью укутанных тромбоцитов является способность отделять прокоагулянтные микровезикулы. Микровезикулы -это мембранные образования менее 1 мкм в диаметре, содержащие фосфатидилсерин во внешнем слое мембраны и обладающие

23*24

прокоагулянтной активностью ' . Показано, что укутанные тромбоциты в процессе активации отделяют до 25 таких микровезикул в результате отшнуровывания псевдоподий 55'64. Источниками микровезикул могут служить и другие клетки организма, в частности клетки эндотелия и моноциты 25'27. Физиологическая роль этих в высшей степени прокоагулянтных частиц не ясна. Микровезикулы циркулируют в крови здоровых доноров в незначительных концентрациях, их уровень может существенно повышаться при различных сердечно-сосудистых заболеваниях, сопровождающихся тромботическими осложнениями.

Еще одной исключительно важной особенностью укутанных тромбоцитов является наличие неактивированного интегрина аПЬрЗа на поверхности таких клеток, впервые продемонстрированное Дж. Дейлом в 2002 году 56. В данной работе тромбоциты окрашивали меченными аннексином V и антителом РАС-1 (антителом к активной изоформе интегрина аПЬрЗа). На рисунке 1.4 представлена типичная точечная диаграмма флуоресценции антитела РАС-1 (ось абсцисс) и аннексина V (ось ординат). Из рисунка видно, что укутанные тромбоциты (выделенные на рисунке в квадратный регион) связывают антитело РАС-1 в значительной степени хуже, чем неукутанные тромбоциты. Таким образом, интегрин аПЬрЗа, важнейший белок, обеспечивающий агрегацию тромбоцитов, неактивен на поверхности укутанных тромбоцитов. Этот факт наводит на

гипотезу о том, что укутанные тромбоциты обладают пониженной способностью вовлекаться в тромбоцитарные агрегаты, чем неукутанные тромбоциты. Существуют противоречивые данные об агрегации субпопуляций активированных тромбоцитов, и четкого ответа на данный вопрос в сейчас не существует 65'66. Стоит отметить, что активация интегрина аПЬрЗа и последующая агрегация является относительно слабым ответом тромбоцитов, имеющая место, например, при активации тромбоцитов АДФ. Таким образом, физиологическая роль укутанных тромбоцитов в гемостазе представляется противоречивой. С одной стороны, такие тромбоциты обладают прокоагулянтными свойствами, необходимыми для нормальной генерации тромбина, но, с другой стороны, дезактивация интегрина аПЬрЗа позволяет предположить, что такие тромбоциты в меньшей степени локализуются в месте повреждения кровеносного сосуда, поскольку не участвуют в формировании тромбоцитарного агрегата.

Механизмы внутриклеточной сигнализации, приводящие к разделению тромбоцитов на две субпопуляции, изучены недостаточно хорошо. Самым очевидным предположением о механизме такого разделения может состоять в том, что гетерогенность тромбоцитов берет свое начало в процессе их формирования в костном мозге. Другими словами, согласно такой гипотезе, конкретный тромбоцит еще до активации принадлежит к той или иной субпопуляции, что проявляется в тех или иных его ответах в ходе активации. Однако эта гипотеза не находит подтверждения, поскольку используя различные дозы и сочетания активаторов, можно варьировать численность субпопуляции укутанных тромбоцитах в пределах от 0% до 100% от общего числа тромбоцитов. Таким образом, разделение тромбоцитов на субпопуляции - процесс, происходящий именно в ходе активации, в соответствии с теми физиологическими условиями, в которые помещаются тромбоциты.

i; ñ 102

mm

цПк; ям _ ~ ■ -a

m. , , * * » «

■■ \ / г .«

■ % %í * "

1G1 102 103 FL1-H

Рисунок 1.4. Неактивный интегнин allb/ЗЗа на

поверхности укутанных

тромбоцитов. Представлена типичная точечная диаграмма распределения тромбоцитов,

активированных тромбином с конвульксином, по флуоресценции атитела РАС-1 (ось абсцисс) и аннексина V (ось ординат). Dale GL et al. Nature. 2002:415:175-179.

В последние годы, в том числе в нашей лаборатории, активно изучался вклад различных механизмов внутриклеточной сигнализации в формировании укутаннных тромбоцитов. Котова Я.Н. в своих экспериментах при помощи различных фармакологических ингибиторов изучала роль сигнальных путей, в том числе киназных, в формировании укутанных тромбоцитов. Было показано, что аденилатциклазный, фосфоинозитид 3-киназный, 8гс тирозин киназный пути, но не МАРК киназный путь, в значительной степени задействованы в формировании укутанных тромбоцитов. Описанные выше пути регулируют формирование укутанных тромбоцитов, однако ни один из них не является контролирующим. Точные сигнальные механизмы, ведущие к формировании гетерогенности тромбоцитов, на данный момент неизвестны.

Также Котова Я.Н. анализировала вклады различных положительных обратных связей, обусловленных секрецией тромбоцитов в процессе активации, в формировании укутанных тромбоцитов. Было показано, что секреция АДФ, но не тромбоксана А2, положительно регулирует

формирование укутанных тромбоцитов, увеличивая численность этой субпопуляции. Используя активаторы и ингибиторы отдельных пуринэргических рецепторов, Котова Я.Н. показала, что АДФ регулирует формирование укутанных тромбоцитов посредством сигнализации через рецептор Р2У1, но не Р2У12 67. Также, используя различные комбинации ингибиторов и активаторов тромбиновых РАЯ-рецепторов, Котова Я.Н. показала, что оба РАЯ-рецептора вносят существенный вклад в формирование укутанных тромбоцитов.

В работе П. Уолша было показано, что при активации ЗБЫЛШ важную роль в формировании тромбоцитарных субпопуляций вносит кальциевая сигнализация 45. Активация 8Р1ХЮЧ является нефизиологической, к тому же, как известно, активация БРЫЛЫ ведет к формированию субпопуляции тромбоцитов, экспрессирующих фосфатидилсерин, но не способных связывать альфа-гранулярные белки. Поэтому, вопрос о роли кальциевой сигнализации в формировании укутанных тромбоцитов изучен недостаточно хорошо.

В последние годы все чаще обсуждается возможная связь формирования укутанных тромбоцитов с процессами клеточной гибели - апоптозом и некрозом 68;69. Апоптоз - это процесс программируемой клеточной гибели, приводящий к деградации и удалению фагоцитозом поврежденных или состарившихся клеток. Апоптоз может индуцироваться множеством различных внутри- и внеклеточных факторов, таких как гипоксия, нарушение клеточного цикла, активация соответствующих рецепторов, разрыв внешней мембранны митохондрий. Происходит активация каскада белков каспаз, что в конечном итоге приводит к деградации клетки, ее распаду на апоптотические тельца и последующему фагоцитозу макрофагами или окружающими клетками. Одним из маркеров апоптоза является нарушение асимметрии плазматической мембраны и экспрессия фосфатидилсерина, позволяющая макрофагам распознать апоптотические клетки. В отличие от апоптоза, некроз - более драматический процесс, обусловленный влиянием

различных неблагоприятных факторов, в результате которого происходят необратимые изменения клеточного метаболизма, приводящие к гибели клетки. Апоптоз и некроз имеют большое количество общих черт, в частности, они оба характеризуются экспрессией фосфатидилсерина, также имеющей место при формировании укутанных тромбоцитов. В последние годы появилось несколько работ, в которых обнаружена связь процессов, характерных для клеточной гибели, с формированием укутанных тромбоцитов 69. В частности, было показано, что укутанные тромбоциты характеризуются потерей целостности митохондриальной мембраны 70. Добавление активаторов и ингибиторов открывания митохондриальной поры (mPTP - mitochondrial permeability transition роге), также как и активных форм кислорода, влияет на количество формируемых укутанных

П1

тромбоцитов . Кроме того, опыты с использованием загрузки тромбоцитов кальцеином показали, что плазматическая мембрана укутанных тромбоцитов может теряеть целостность. Таким образом, связь формирования укутанных тромбоциов с апоптозом и некрозом представляется весьма вероятной. Однако детальные механизмы, обуславливающие формирование укутанных тромбоцитов, до сих пор не выяснены.

Следует отметить, что поддержание асимметрии плазматической мембраны, так же как и потеря этой асимметрии в ходе описанных выше процессов клеточной гибели является универсальным феноменом, характерным для клеток эукариот. Отрицательно заряженные фосфолипиды, такие как фосфатидилсерин и фосфатидилэтаноламин АТФ-зависимым образом переносятся во внутренний слой мембраны при помощи ферментов транслоказы и флиппазы . Потеря асимметрии плазматической мембраны

72*73

осуществляется при помощи фермента, называемого скрамблазой ' . Этот фермент до сих пор не найден, несмотря на то что обнаружен ряд белков, задействованных в данном процессе 73'74. Несмотря на то, что конкретный фермент до сих пор не найден, считается, что он производит перенос фосфолипидов по градиенту их концентраций, нарушая тем самым

асимметрию плазматической мембраны 74. Считается, что данный фермент активируется ионами кальция, кроме того хорошо известно, что повышение концентрации внутриклеточного кальция приводит к экспрессии фосфатидилсерина. Стоит отметить, что в последние годы появилась информация о существовании двух различных механизмов экспрессии фосфатидилсерина в тромбоцитах: один из них связан с повышением концентрации внутриклеточного кальция, а другой - с активацией каспаз и

75

белков семейства Вак/Вах .

В последние годы появилось несколько работ, в которых показано влияние количества укутанных тромбоцитов на течение различных патологий 76-78. В частности, было показано существенное снижение количества укутанных тромбоцитов у пациентов, склонных к внутричерепным кровотечениям 79. Обнаружено существенное повышение количества укутанных тромбоцитов у пациентов, подвергающихся процедуре гемодиализа 80. Показано, что больные тяжелой формой гемофилии А, имеющие различный клинический фенотип, также имеют различные уровни укутанных тромбоцитов 81. Так, у пациентов, имевших более 6 эпизодов кровотечения (в среднем 14±4.9) за 6 месяцев, предшествовавших исследованию, количество укутанных тромбоцитов при активации тромбином с конвульксином было существенно больше, чем у пациентов с более легким течением болезни (в среднем 1.6±1.2 эпизода кровотечения).

Методики изучения субпопуляций активированных тромбоцитов

Поскольку тромбоциты разных субпопуляций отличаются друг от друга наличием тех или иных поверхностных антигенов, их исследование проводят при помощи специфичных флуоресцентно меченых антител. Те или иные антитела коньюгируются с подходящими флуоресцентными метками, антитела добавляются к суспензии активированных тромбоцитов, и, таким образом, происходит окраска тех клеток, которые содержат на своей поверхности исследуемый антиген. Общепринятым маркером на

фосфатидилсерин является белок аннексии V, специфично связывающийся с фосфатидилсерином в присутствии ионов кальция.

Для возбуждения и детекции флуоресценции исследуемых клеток применяют различные подходы: флуориметрию, флуоресцентную микроскопию, проточную цитометрию Флуориметрия - наиболее простой из подходов, позволяет исследовать характерную суммарную флуоресценцию всех клеток суспензии, при этом информация о возможной гетерогенности исследуемого образца оказывается утерянной. Поскольку при активации тромбоциты разделяются на субпопуляции, имеющие принципиально различные свойства, данный подход не подходит для изучения этих процессов.

Еще одним подходом, часто используемым для изучения свойств образцов флуоресцентно окрашенных клеток, является флуоресцентная микроскопия. Этот подход успешно применяется для изучения активации тромбоцитов, в том числе для изучения субпопуляций активированных тромбоцитов. Как правило, используется следующая методика исследования 47,61'66. Фибриноген или коллаген иммобилизуют на поверхности покровного стекла, собирают проточную камеру, в которую помещают исследуемые тромбоциты. Не связавшиеся тромбоциты отмывают, и проточную камеру помещают под объектив флуоресцентного микроскопа. Далее наслаивают антитела и вещества-активаторы, и при помощи цифровой камеры детектируют флуоресценцию исследуемых антител. В последние годы появилось большое количество новых подходов в микроскопии, таких как конфокальная микроскопия и микроскопия дифференциально-интерференционного контраста (Б1С). Эти подходы позволяют получать высококачественные изображения изучаемых клеток как в видимом свете, так и в о флуоресцентных каналах.

Микроскопия является методом, прекрасно подходящим для изучения отдельных клеток суспензии. Этот подход позволяет детально изучать морфологические особенности различных клеток, в том числе тромбоцитов

разных субпопуляций. Благодаря развитию средств цифровой фототехники стало возможно изучение в реальном времени процессов, происходящих в тромбоцитах при активации. Важно отметить, что микроскопия не требует особенного приготовления образца, в частности фиксации, что позволяет изучать прижизненные события в исследуемых клетках.

Однако, данный подход имеет ряд ограничений и неудобств. Во-первых, процедура проведения одного эксперимента достаточно продолжительна, что не позволяет анализировать большое количество образцов. Во-вторых, она плохо подходит для оценки численности той или иной клеточной субпопуляции, такая процедура в рамках микроскопии требует ручного анализа нескольких изображений (полей зрения). Таким образом, изучение регуляции численности субпопуляций активированных тромбоцитов при помощи флуоресцентной микроскопии представляется крайне неудобным.

Наиболее часто используемым подходом для анализа сложных клеточных популяций является проточная цитометрия, которая позволяет проводить быстрый анализ отдельных клеток исследуемой суспензии. Принципиальная схема устройства проточного цитометра представлена на рисунке 1.5. Исследуемая суспензия клеток под давлением прокачивается через капилляр, через коаксиальный капилляру канал прокачивается так называемая обжимающая жидкость. Канал с жидкостью сужается, и пропорционально сужается область, в которой протекают клетки, таким образом клетки в потоке выстраиваются одна за другой. Такой принцип пространственного разделения исследуемых клеток называется гидродинамической фокусировкой. Клетки далее освещаются сфокусированным лазерным лучом, который рассеивается на клетках и возбуждает флуоресценцию меченых антител. Световой поток при помощи системы дихроических зеркал и оптических фильтров разделяется, и свет различных длин волн попадает на соответствующие детекторы (фотоэлектронные умножители). Сигнал фототока с детекторов попадает в ЭВМ, где происходит его оцифровка и формирование файла, являющегося результатом измерения.

Лазерный луч Поток клеток

ЭВМ

Детекторы

Рисунок 1.5. Схема устройства проточного цитометра.

Результатом анализа в проточной цитометрии является файл, представляющий собой таблицу, строки которой соответствуют клеткам суспензии (они в проточной цитометрии называются событиями), а столбцы содержат информацию об измеренных параметрах этих клеток. В проточной цитометрии анализируются следующие параметры клеток. 1) Прямое или малоугловое светорассеяние (forward scattering, FSC) - это параметр, характеризующий размер исследуемых клеток. Детектор FSC установлен на линии лазерного луча за потоком клеток, на него попадает свет, рассеянный клетками на углы 2-10°. 2) Боковое светорассеяние (side scattering, SSC) - это параметр, характеризующий так называемую гранулярность, то есть, условно говоря, сложность внутреннего строения клеток. На детектор SSC попадает свет, рассеянный клетками на угол 90°. Стоит отметить, что параметры светорассеяния не несут глубокого биологического смысла, они используются для отделения различных клеток друг от друга, а также от клеточного мусора (так, используя диаграмму светорассеяния, можно

разделять лимфоциты, моноциты и гранулоциты, не используя антитела). 3) Параметры флуоресценции (Fil, F12, F13) характеризуют интенсивность флуоресценции антител, которыми окрашены исследуемые клетки. Три канала флуоресценции имеют различные полосы пропускания (530±15 нм для F11, 585±21 нм для F12, >670 нм для F13), антитела подбираются таким образом, чтобы спектры эмиссии флуоресцентных меток попадали в полосы пропускания разных каналов флуоресценции.

Для обработки данных проточной цитометрии используются специальное программное обеспечение. Такие программы позволяют строить гистограммы распределения событий по тому или иному параметру, а также точечные диаграммы, на которых каждая точка соответствует определенному событию и имеет соответствующие координаты. В итоге оценивается относительная численность клеточных субпопуляций, а также средняя флуоресценция тех или иных флуоресцентных меток.

Итак, проточная цитометрия является методом, позволяющим производить очень быстрый анализ сложных клеточных популяций, изучать численность различных субпопуляций, а также определять характерные для них поверхностные антигены. Именно проточная цитометрия является методом, с использованием которого был открыт феномен разделения тромбоцитов на субпопуляции в процессе активации, а также получена большая часть информации о свойствах тромбоцитарных субпопуляций и механизмах их формирования.

В последние десятки лет помимо окраски флуоресцентно мечеными антителами появилась масса дополнительных возможностей для анализа биологических процессов, происходящих в живых клеток in vitro. Одним из таких методов является загрузка клеток флуоресцентными красителями,

интенсивность флуоресценции которых меняется при изменении

82

концентрации кальция в цитоплазме исследуемых клеток . Это хелаторы Са2+, аналогичные EDTA, способные проникать в клетки, в цитоплазме которых эфирная группа красителей гидролизуется неспецифичными

эстеразами, в результате чего теряются их способность к обратному выходу из клеток.

Основными характеристиками таких красителей являются спектры

82*83

возбуждения и эмиссии, а также константы связывания ионов кальция ' . Константы связывания ионов кальция определяют скорость их связывания с красителем и диапазон концентраций кальция, в пределах которого флуоресценция красителя зависит от концентрации кальция. На рисунке 1.6. представлены графики зависимости флуоресценции красок Calcium Green-1 и Fura Red от концентрации кальция. Видно, что флуоресценция красок меняется в определенном диапазоне концентраций кальция; в областях высоких и низких концентраций кальция имеется область плато. Таким образом, для изучения кальциевой сигнализации в клетках требуется предварительный подбор флуоресцентной краски исходя из концентраций кальция, характерных для изучаемого объекта.

D: Calcium Green-1 F: Fu га-Red

1.0 0.8

*ts и

ш с

Ф e¿

SS (J

1 Ё *

и о

о s

¡2¡

fe

0,4 0.2

0.0

i i ■ л i »i

8 7 6 5 4 3 2

6.0 5.0

3.0 2.0 1.0 0.0 J

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Топалов, Николай Николаевич, 2012 год

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Пантелеев М.А. АФИ. Свертывание крови: биохимические основы. Клиническая онкогематология 200850-62.

2. Heemskerk JW, Bevers ЕМ, Lindhout Т. Platelet activation and blood coagulation. Thromb.Haemost. 2002;88:186-193.

3. Clemetson KJ, Clemetson JM. Platelet collagen receptors. Thromb.Haemost. 2001;86:189-197.

4. Polgar J, Clemetson JM, Kehrel BE et al. Platelet activation and signal transduction by convulxin, a C-type lectin from Crotalus durissus terrificus (tropical rattlesnake) venom via the p62/GPVI collagen receptor. J.Biol.Chem. 1997;272:13576-13583.

5. Ceruso MA, McComsey DF, Leo GC et al. Thrombin receptor-activating peptides (TRAPs): investigation of bioactive conformations via structure-activity, spectroscopic, and computational studies. Bioorg.Med.Chem. 1999;7:2353-2371.

6. Kattelman EJ, Venton DL, Le Breton GC. Characterization of U46619 binding in unactivated, intact human platelets and determination of binding site affinities of four TXA2/PGH2 receptor antagonists (13-АРА, BM 13.177, ONO 3708 and SQ 29,548). Thromb.Res. 1986;41:471-481.

7. Pressman BC. Biological applications of ionophores. Annu.Rev.Biochem. 1976;45:501-530.

8. Fox JE. Cytoskeletal proteins and platelet signaling. Thromb.Haemost. 2001;86:198-213.

9. Lee D, Fong KP, King MR, Brass LF, Hammer DA. Differential dynamics of platelet contact and spreading. Biophys.J. 2012;102:472-482.

10. Saelman EU, Nieuwenhuis HK, Hese KM et al. Platelet adhesion to collagen types I through VIII under conditions of stasis and flow is mediated by GPIa/IIa (alpha 2 beta 1-integrin). Blood 1994;83:1244-1250.

11. Robert K.Andrews lMCBlaJAL. The Glycoprotein Ib-IX-V Complex. In: Alan D.Michelson, ed. Platelets, Second edition. 2007:145-165.

12. Alan T.Nurden and Paquita Nurden. Inherited Disorders of Platelet Function. In: Alan D.Michelson, ed. Platelets, Second Edition. 2008:10291051.

13. Edward F.Plow MMPaY-QM. Integrin allbb3. In: Alan D.Michelson, ed. Platelets, Second Edition. 2008:165-179.

14. Shattil SJ, Newman PJ. Integrins: dynamic scaffolds for adhesion and signaling in platelets. Blood 2004;104:1606-1615.

15. Prevost N, Kato H, Bodin L, Shattil SJ. Platelet integrin adhesive functions and signaling. Methods Enzymol. 2007;426:103-115.

16. Lisa K.Jennings and Melanie McCabe White. Platelet Aggregation. In: Alan D.Michelson, ed. Platelets, Second Edition. 2008:495-509.

17. Guy L.Reed. Platelet Secretion. In: Alan D.Michelson, ed. Platelets, Second Edition. 2008:431-445.

18. Flaumenhaft R. Molecular basis of platelet granule secretion. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 2003;23:1152-1160.

19. Zwaal RF, Schroit AJ. Pathophysiologic implications of membrane phospholipid asymmetry in blood cells. Blood 1997;89:1121-1132.

20. Zwaal RF, Comfurius P, Bevers EM. Lipid-protein interactions in blood coagulation. Biochim.Biophys.Acta 1998;1376:433-453.

21. van DG, Tans G, Rosing J, Hemker HC. The role of phospholipid and factor Villa in the activation of bovine factor X. J.Biol.Chem. 1981;256:3433-3442.

22. Rosing J, Tans G, Govers-Riemslag JW, Zwaal RF, Hemker HC. The role of phospholipids and factor Va in the prothrombinase complex. J.Biol.Chem. 1980;255:274-283.

23. Rienk Nieuwland and Augueste Sturk. Platelet-Derived Microparticles. In: Alan D.Michelson, ed. Platelets, Second Edition. 2008:403-415.

24. Siljander PR. Platelet-derived microparticles - an updated perspective. Thromb.Res. 2011; 127 Suppl 2:S30-S33.

25. Aleman MM, Gardiner C, Harrison P, Wolberg AS. Differential contributions of monocyte- and platelet-derived microparticles towards thrombin generation and fibrin formation and stability. J.Thromb.Haemost. 2011;9:2251-2261.

26. Fontana V, Jy W, Ahn ER et al. Increased procoagulant cell-derived microparticles (C-MP) in splenectomized patients with ITP. Thromb.Res. 2008;122:599-603.

27. Baran J, Baj-Krzyworzeka M, Weglarczyk K et al. Circulating tumour-derived microvesicles in plasma of gastric cancer patients. Cancer Immunol.Immunother. 2010;59:841-850.

28. Zwicker JI, Trenor CC, III, Furie BC, Furie B. Tissue factor-bearing microparticles and thrombus formation. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 2011;31:728-733.

29. Nieswandt B, Watson SP. Platelet-collagen interaction: is GPVI the central receptor? Blood 2003;102:449-461.

30. Quinter PG, Dangelmaier CA, Quinton TM, Kunapuli SP, Daniel JL. Glycoprotein VI agonists have distinct dependences on the lipid raft environment. J.Thromb.Haemost. 2007;5:362-368.

31. Kenneth J.Clemetson and Jeannine M.Clemetson. Platelet Receptors. In: Alan D.Michelson, ed. Platelets, Second Edition. 2008:117-145.

32. Wadie F.Bahou. Thrombin Receptors. In: Alan D.Michelson, ed. Platelets, Second Edition. 2008:179-201.

33. Brass LF. Thrombin and platelet activation. Chest 2003;124:18S-25S.

34. Covic L, Gresser AL, Kuliopulos A. Biphasic kinetics of activation and signaling for PARI and PAR4 thrombin receptors in platelets. Biochemistry 2000;39:5458-5467.

35. Dorsam RT, Tuluc M, Kunapuli SP. Role of protease-activated and ADP receptor subtypes in thrombin generation on human platelets. J.Thromb.Haemost. 2004;2:804-812.

36. Marco Cattaneo. The Platelet P2 Receptors. In: Alan D.Michelson, ed. Platelets, Second Edition. 2008:201-221.

37. Woulfe D, Yang J, Brass L. ADP and platelets: the end of the beginning. J.Clin.Invest 2001; 107:1503 -1505.

38. Jin J, Daniel JL, Kunapuli SP. Molecular basis for ADP-induced platelet activation. II. The P2Y1 receptor mediates ADP-induced intracellular calcium mobilization and shape change in platelets. J.Biol.Chem. 1998;273:2030-2034.

39. Oury C, Toth-Zsamboki E, Vermylen J, Hoylaerts MF. The platelet ATP and ADP receptors. Curr.Pharm.Des 2006;12:859-875.

40. Sargeant P, Sage SO. Calcium signalling in platelets and other nonexcitable cells. Pharmacol.Ther. 1994;64:395-443.

41. Jaffe LF. Fast calcium waves. Cell Calcium 2010;48:102-113.

42. Merritt JE, McCarthy SA, Davies MP, Moores KE. Use of fluo-3 to measure cytosolic Ca2+ in platelets and neutrophils. Loading cells with the dye, calibration of traces, measurements in the presence of plasma, and buffering of cytosolic Ca2+. Biochem.J. 1990;269:513-519.

43. Davies TA, Drotts DL, Weil GJ, Simons ER. Cytoplasmic Ca2+ is necessary for thrombin-induced platelet activation. J.Biol.Chem. 1989;264:19600-19606.

44. Alberio L, Safa O, Clemetson KJ, Esmon CT, Dale GL. Surface expression and functional characterization of alpha-granule factor V in human platelets: effects of ionophore A23187, thrombin, collagen, and convulxin. Blood 2000;95:1694-1702.

45. London FS, Marcinkiewicz M, Walsh PN. PAR-1-stimulated factor IXa binding to a small platelet subpopulation requires a pronounced and sustained increase of cytoplasmic calcium. Biochemistry 2006;45:7289-7298.

46. Mason MJ, Mahaut-Smith MP. Measurement and manipulation of intracellular Ca2+ in single platelets and megakaryocytes. Methods Mol.Biol. 2004;273:251-276.

47. Heemskerk JW, Hoyland J, Mason WT, Sage SO. Spiking in cytosolic calcium concentration in single fibrinogen-bound fura-2-loaded human platelets. Biochem.J. 1992;283 (Pt 2):379-383.

48. Hussain JF, Mahaut-Smith MP. Reversible and irreversible intracellular Ca2+ spiking in single isolated human platelets. J.Physiol 1999;514 (Pt 3):713-718.

49. Kuwahara M, Sugimoto M, Tsuji S, Miyata S, Yoshioka A. Cytosolic calcium changes in a process of platelet adhesion and cohesion on a von Willebrand factor-coated surface under flow conditions. Blood 1999;94:1149-1155.

50. Jennings LK, Dockter ME, Wall CD, Fox CF, Kennedy DM. Calcium mobilization in human platelets using indo-1 and flow cytometry. Blood 1989;74:2674-2680.

51. chary-Prigent J, Freyssinet JM, Pasquet JM, Carron JC, Nurden AT. Annexin V as a probe of aminophospholipid exposure and platelet membrane vesiculation: a flow cytometry study showing a role for free sulfhydryl groups. Blood 1993;81:2554-2565.

52. Pasquet JM, chary-Prigent J, Nurden AT. Calcium influx is a determining factor of calpain activation and microparticle formation in platelets. Eur.J.Biochem. 1996;239:647-654.

53. Alberio L, Dale GL. Flow cytometric analysis of platelet activation by different collagen types present in the vessel wall. Br.J.Haematol. 1998;102:1212-1218.

54. Batar P, Dale GL. Simultaneous engagement of thrombin and Fc gamma RIIA receptors results in platelets expressing high levels of procoagulant proteins. J.Lab Clin.Med. 2001;138:393-402.

55. Dale GL. Coated-platelets: an emerging component of the procoagulant response. J.Thromb.Haemost. 2005;3:2185-2192.

56. Dale GL, Friese P, Batar P et al. Stimulated platelets use serotonin to enhance their retention of procoagulant proteins on the cell surface. Nature 2002;415:175-179.

57. Szasz R, Dale GL. Thrombospondin and fibrinogen bind serotonin-derivatized proteins on COAT-platelets. Blood 2002;100:2827-2831.

58. Bevers EM, Janssen MP, Comfurius P et al. Quantitative determination of the binding of beta2-glycoprotein I and prothrombin to phosphatidylserine-exposing blood platelets. Biochem.J. 2005;386:271-279.

59. Kempton CL, Hoffman M, Roberts HR, Monroe DM. Platelet heterogeneity: variation in coagulation complexes on platelet subpopulations. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 2005;25:861 -866.

60. Panteleev MA, Ananyeva NM, Greco NJ, Ataullakhanov FI, Saenko EL. Two subpopulations of thrombin-activated platelets differ in their binding of the components of the intrinsic factor X-activating complex. J.Thromb.Haemost. 2005;3:2545-2553.

61. Kulkarni S, Jackson SP. Platelet factor XIII and calpain negatively regulate integrin alphallbbeta3 adhesive function and thrombus growth. J.Biol.Chem. 2004;279:30697-30706.

62. Szasz R, Dale GL. COAT platelets. Curr.Opin.Hematol. 2003;10:351-355.

63. Phillips JE, Lord ST, Gilbert GE. Fibrin stimulates platelets to increase factor Villa binding site expression. J.Thromb.Haemost. 2004;2:1806-1815.

64. Dale GL, Remenyi G, Friese P. Quantitation of microparticles released from coated-platelets. J.Thromb.Haemost. 2005;3:2081-2088.

65. Munnix IC, Cosemans JM, Auger JM, Heemskerk JW. Platelet response heterogeneity in thrombus formation. Thromb.Haemost. 2009; 102:11491156.

66. Munnix IC, Kuijpers MJ, Auger J et al. Segregation of platelet aggregatory and procoagulant microdomains in thrombus formation: regulation by

transient integrin activation. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 2007;27:2484-2490.

67. Kotova YN, Ataullakhanov FI, Panteleev MA. Formation of coated platelets is regulated by the dense granule secretion of adenosine 5'diphosphate acting via the P2Y12 receptor. J.Thromb.Haemost. 2008;6:1603-1605.

68. Jackson SP, Schoenwaelder SM. Procoagulant platelets: are they necrotic? Blood 2010;116:2011-2018.

69. Dale GL, Friese P. Bax activators potentiate coated-platelet formation. J.Thromb.Haemost. 2006;4:2664-2669.

70. Remenyi G, Szasz R, Friese P, Dale GL. Role of mitochondrial permeability transition pore in coated-platelet formation. Arterioscler.Thromb.Vasc.Biol. 2005;25:467-471.

71. Jobe SM, Wilson KM, Leo L et al. Critical role for the mitochondrial permeability transition pore and cyclophilin D in platelet activation and thrombosis. Blood 2008; 111:1257-1265.

72. Wolfs JL, Comfurius P, Rasmussen JT et al. Activated scramblase and inhibited aminophospholipid translocase cause phosphatidylserine exposure in a distinct platelet fraction. Cell Mol.Life Sei. 2005;62:1514-1525.

73. Smrz D, Lebduska P, Draberova L, Korb J, Draber P. Engagement of phospholipid scramblase 1 in activated cells: implication for

phosphatidylserine externalization and exocytosis. J.Biol.Chem. 2008;283:10904-10918.

74. Bevers EM, Williamson PL. Phospholipid scramblase: an update. FEBS Lett. 2010;584:2724-2730.

75. Schoenwaelder SM, Yuan Y, Josefsson EC et al. Two distinct pathways regulate platelet phosphatidylserine exposure and procoagulant function. Blood 2009;114:663-666.

76. Prodan CI, Vincent AS, Dale GL. Coated-platelet levels are elevated in patients with transient ischemic attack. Transl.Res. 2011;158:71-75.

77. Prodan CI, Ross ED, Vincent AS, Dale GL. Rate of progression in Alzheimer's disease correlates with coated-platelet levels~a longitudinal study. Transl.Res. 2008;152:99-102.

78. Norgard NB, Saya S, Hann CL et al. Clopidogrel attenuates coated-platelet production in patients undergoing elective coronary catheterization. J.Cardiovasc.Pharmacol. 2008;52:536-539.

79. Prodan CI, Vincent AS, Padmanabhan R, Dale GL. Coated-platelet levels are low in patients with spontaneous intracerebral hemorrhage. Stroke 2009;40:2578-2580.

80. Valaydon ZS, Lee P, Dale GL et al. Increased coated-platelet levels in chronic haemodialysis patients. Nephrology.(Carlton.) 2009;14:148-154.

81. Saxena K, Pethe K, Dale GL. Coated-platelet levels may explain some variability in clinical phenotypes observed with severe hemophilia. J.Thromb.Haemost. 2010;8:1140-1142.

82. Thomas D, Tovey SC, Collins TJ et al. A comparison of fluorescent Ca2+ indicator properties and their use in measuring elementary and global Ca2+ signals. Cell Calcium 2000;28:213-223.

83. Lee SK, Lee JY, Lee MY, Chung SM, Chung JH. Advantages of calcium green-1 over other fluorescent dyes in measuring cytosolic calcium in platelets. Anal.Biochem. 1999;273:186-191.

84. Timmons S, Hawiger J. Isolation of human platelets by albumin gradient and gel filtration. Methods Enzymol. 1989; 169:11-21.

85. Hemker HC, Al DR, De SE, Beguin S. Thrombin generation, a function test of the haemostatic-thrombotic system. Thromb.Haemost. 2006;96:553-561.

86. Shcherbina A, Cooley J, Lutskiy MI et al. WASP plays a novel role in regulating platelet responses dependent on alphallbbeta3 integrin outside-in signalling. Br.J.Haematol. 2010;148:416-427.

87. Goschnick MW, Lau LM, Wee JL et al. Impaired "outside-in" integrin alphallbbeta3 signaling and thrombus stability in TSSC6-deficient mice. Blood 2006;108:1911-1918.

88. Law DA, DeGuzman FR, Heiser P et al. Integrin cytoplasmic tyrosine motif is required for outside-in alphallbbeta3 signalling and platelet function. Nature 1999;401:808-811.