Механизм поступления цисплатина в клетки с участием системы транспорта меди тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, доктор биологических наук Скворцов, Алексей Николаевич

• Скворцов, Алексей Николаевич
• доктор биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации доктор биологических наук Скворцов, Алексей Николаевич

Список основных используемых обозначений и сокращений.

Общая характеристика работы.

Введение.

Глава 1. Анализ последовательности высокоаффинного транспортера меди СТШ в контексте предпосылок связывания меди, серебра и платиновых препаратов.

1.1. Свойства последовательности белка СТЯ1 хордовых предполагают значительную функциональную консервативность его доменов.

1.2. Предполагаемая роль медьсвязывающих мотивов концевого фрагмента СТЯ1 в транспорте ионов меди.'

1.3. Докинг медьсвязывающих мотивов Л^-конца ЬСТЯ1 с предполагаемыми донорами меди.

1.4. Металлсвязывающие свойства и потенциальная функциональная роль С-конца СТЮ позвоночных.

1.5. Гипотетическая модель функционирования СПИ при транспорте меди.

1.6. Предпосылки транспорта ионов серебра через СТШ.

1.7. Гипотетическая модель транспорта платиновых препаратов через СТБи.

Глава 2. Тканеспецифическая экспрессия гена СТШ у млекопитающих.

2.1. Экспрессия гена СТШ в печени и статус меди у крыс в онтогенезе.

2.2. Экспрессия гена СТИЛ и статус меди в отделах мозга.

2.3. Экспрессия гена СТЮ и статус меди в лактирующей молочной железе крыс.

2.4. Экспрессия гена СТЯ1 и статус меди в сердце крыс.

2.5. Экспрессия гена СТШ в органах взрослых мышей и содержание меди этих органах.

Глава 3. Строение и механизмы взаимодействия платиновых комплексов с серосодержащими соединениями. Конкурентное связывание цисплатина с ДНК и S-донорами.

Транс-эффект и изомеризация в смешаннолигандных {S, N)- и (S,

-комплексах платины(П).

Применение спектроскопии УФ-поглощения в сочетании с многомерным разрешением кривых для исследования реакции цисплатина с высокомолекулярной ДНК.

Идентификация сайтов платинирования на альбуминах сыворотки человека и быка.

Связывание цисплатина и транс-ДДП с изолированными гистоновыми белками in vitro.

Взаимодействие L-метионина с комплексами платины.

Конкуренция in vitro между реакциями цисплатина с метионином и с высокомолекулярной ДНК.

Глава 4. Животная модель грызунов с контролируемым статусом меди.

4.1. Изменение статуса меди у грызунов, получающих с кормом хлорид серебра.

4.2. Выделение и анализ церулоплазмина из крови Ag-крыс.

4.3. Распределение серебра в организме Ag-грызунов.

4.4. Внутриклеточное распределение серебра в клетках печени Ag-мышей.

4.5. Влияние Ag-диеты на метаболизм меди в печени грызунов.

4.6. Распределение серебра в отделах мозга Ag-крыс и его влияние на метаболизм меди в мозгу.

4.7. Форсированное восстановление статуса меди у Ag-грызунов с помощью солей меди(П).

Глава 5. Использование модели серебряных грызунов для установления взаимосвязи между статусом меди и транспортом цисплатина in vivo.

5.1. Влияние модуляции статуса меди ионами серебра на рост клеток и цитостатический эффект цисплатина in vitro.

5.2. Влияние статуса меди на распределение цисплатина в организме крыс in vivo.

5.3. Распределение цисплатина в организме мышей и его связь с тканеспецифической экспрессией CTR1 и статусом меди.

5.4. Влияние статуса меди на нефротоксичность и распределение платины у мышей в отдаленные сроки после инъекции цисплатина.

5.5. Анализ корреляции между тканеспецифическим уровнем экспрессии мРНК CTR1 и накоплением меди, серебра и платины в органах мышей.

Глава 6. Использование модели серебряных грызунов для установления взаимосвязи между статусом меди и ростом опухолей in vivo.

6.1. Мета-анализ литературных данных по связи статуса меди и опухолевого роста у человека.

6.2. Изменение статуса меди у мышей, выращивающих опухоли различного происхождения.

6.3. Влияние Ag-диеты на рост опухоли НСТ116 у иммунодефицитных мышей.

6.4. Влияние Ag-диеты на рост меланомы мышей В16.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Механизм поступления цисплатина в клетки с участием системы транспорта меди»

Актуальность исследования. Цисплатин и его аналоги - широко используемая в клинической практике группа противоопухолевых препаратов {Lippert, 1999). Их действие основано на повреждении ДНК, индуцированных им функциональных нарушениях, в конечном итоге, приводящих к апоптозу (Sedletska et al., 2005). Основное ограничение применения платиновых препаратов - высокая токсичность, а также тканеспецифическая и приобретенная устойчивость клеток опухолей. Устойчивость к цисплатину может обуславливаться несколькими механизмами - снижением импорта препарата, увеличением выведения, детоксикацией и повышением емкости репарационных систем. Критическим из этих уровней является поступление препарата в клетку.

Повышение эффективности применения этих препаратов ограничивается отсутствием удовлетворительных объяснений механизма импорта соединений платины в клетки. Цисплатин относится к малым полярным молекулам с большим дипольным моментом. В настоящее время наиболее известны три основных пути поступления этих веществ в клетку: пассивная диффузия, транспорт через транспортер органических катионов ОСТ2 и транспорт через высокоаффинный импортер меди CTR1 {Hall et al., 2008). Пассивная диффузия не может объяснить вариабельность динамики поступления платины в клетки разных тканей. Белок ОСТ2 транспортирует цисплатин, но он экспрессируется в очень ограниченном наборе клеток, что не позволяет считать ОСТ2 универсальным переносчиком цисплатина. В то же время CTR1 экспрессируется во всех клетках на всех этапах онтогенетического развития и исследованные опухоли демонстрируют его повышенную экспрессию (Gupta, Lutsenko, 2009). В 2002 г. впервые показано, что делеция CTR1 приводит к развитию устойчивости клеток к цисплатину (Ishida et al., 2002), а сверхэкспрессия CTR1 - к увеличению импорта платины (Beretta et al., 2004; Guo et al., 2004a). Это было показано в ряде лабораторий на различных объектах и в настоящее время парадигма транспорта цисплатина через CTR1 является общепринятой {Howell et al., 2010). Это обстоятельство привлекает внимание к белку CTR1, как центральному участнику переноса платиновых препаратов.

CTR1 представляет собой небольшой консервативный эукариотический белок, содержащий три трансмембранных домена и функционирующий в виде стабильного гомотримера. Основное место локализации CTR1 -плазматическая мембрана, его гидрофильный iV-конец обращен во внеклеточное пространство и содержит три потенциальных медьсвязывающих мотива {Klomp et al., 2002). Остается неясным, каким образом CTR1, высокоселективный по отношению к Cu(I) транспортный белок, может переносить платиновый комплекс с сильно отличающимися размерами и координационными свойствами. Также неясно, связана ли биологическая функция CTR1 - транспорт меди, с переносом цисплатина, и, если связана, то каким образом? Разработка модели переноса платинового комплекса через CTR1, установление связи между статусом меди и транспортом платины в клетку, а также поиск условий, при которых CTR1 эффективнее импортирует платиновый препарат, могут помочь в разработке новых терапевтических протоколов, характеризующихся меньшей токсичностью, большей эффективностью и специфичностью воздействия. Вышеизложенное определяет актуальность исследования, представленного в данной работе.

Цель работы - разработка и проверка концепции, объясняющей взаимосвязь статуса меди и CTR1-опосредованного транспорта цисплатина. Для достижения поставленной цели было намечено решение следующих задач:

1. Осуществить анализ структуры CTR1 в контексте функционирования купрофильного канала и его селективности по отношению к меди(1) и абиогенным субстратам (серебро и цисплатин).

2. Проверить на модельных системах in vitro взаимодействие координационных соединений платины с нуклеофильными группами белков и ДНК.

3. Оценить корреляцию между тканеспецифической экспрессией CTR1 и квазистационарным уровнем меди, накоплением серебра и поглощением платины.

4. Разработать и охарактеризовать модели млекопитающих с переключаемым статусом меди.

5. Проверить in vivo концепцию ко-транспорта меди и платины через CTR1, разработанную на основе строения медьсвязывающих доменов А^-конца.

6. Исследовать влияние статуса меди на рост опухолей в различных моделях.

Научная новизна полученных результатов. На основе филогенетического и статистического анализа последовательностей белков семейства CTR1, извлеченных из открытых баз данных, молекулярного моделирования и расчета взаимной ориентации доменов создана структурно-функциональная модель гомотримера CTR1 млекопитающих. С учетом результатов анализа медьсвязывающих сайтов с точки зрения концепций координационной химии предложена модель, устанавливающая механизм транспорта цисплатина через CTR1 и его связь с импортом меди. В физико-химических экспериментах, использовавших вновь полученные смешаннолигандные соединения платины и различные классы природных нуклеофилов, подтверждены выводы теоретического анализа и показано, что связывание цисплатина с остатками метионина приводит к быстрому исчезновению его характеристических ДНК-связывающих свойств. На разработанной и охарактеризованной модели лабораторных грызунов с дефицитом церулоплазмин-ассоциированной меди подтверждено, что CTR1 может осуществлять Cu-опосредованный импорт платины, и изменение статуса меди влияет на фармакокинетику цисплатина у грызунов. Продемонстрировано, что снижение показателей статуса меди может подавлять скорость роста ксенотрансплантатных опухолей.

Научно-практическое значение полученных результатов состоит в том, что они открывают перспективу для оптимизации протоколов применения противоопухолевого препарата цисплатина в клинике на основе рационального понимания механизма его транспорта. Полученные результаты расширяют представления о транспорте меди, серебра и платины в организме млекопитающих, а также углубляют знания о механизмах, лежащих в основе нарушения метаболизма меди, ведущих к развитию медь-ассоциипованных болезней. Применение разработанных физико-химических моделей позволит изучить тонкие аспекты механизмов взаимодействия платиновых комплексов с биомолекулами. Использование модели животных с изменяемым статусом меди является перспективным для исследования роли меди в возникновении и развитии опухолей, а также их восприимчивости к терапии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Строение медьсвязывающих сайтов CTR1 обеспечивает селективное связывание и транслокацию меди(1), серебра и платины, что является причиной связи метаболизма меди и чувствительности клеток к цисплатину. Ведущую роль в связывании платины принадлежит метиониновым кластерам внеклеточного ^-концевого домена.

2. Метионин и другие серосодержащие лиганды снижают ДНК-связывающие свойства цисплатина in vitro за счет лабилизации координационной сферы и потери исходных лигандов препарата.

3. Экспрессия гена CTR1 носит тканеспецифический характер, зависит от уровня внутриклеточной меди и коррелирует с текущей потребностью клеток в меди.

4. У лабораторных грызунов снижение показателей статуса меди может быть достигнуто с помощью Ag-диеты, которая вызывает снижение содержания меди, ассоциированной с церулоплазмином в крови. Однократное введение сульфата меди долгосрочно восстанавливает показатели статуса меди.

5. Статус меди, скорость роста опухолей и перенос цисплатина в клетки связаны между собой.

ВВЕДЕНИЕ

Медь в состояниях окисления Cu(I) и Cu(II) обнаруживается в составе всех живых организмов. Сочетание окислительно-восстановительных, координационных и каталитических свойств ионов меди делает их незаменимыми кофакторами купроэнзимов. У всех аэробных организмов купроэнзимы участвуют в дыхании (цитохром-с-оксидаза) и защите от супероксид-анионов (Cu/Zn-супероксиддисмутаза). У млекопитающих купроэнзимы участвуют в транспорте железа, синтезе коллагена, меланина, предшественников нейропептидов и др. (Prohaska, 2008). Однако в неконтролируемом молекулярном окружении ионы меди способны инициировать образование свободных радикалов, которые действуют на клетку наподобие ионизирующей радиации, а также вызывают катализ прочих нежелательных реакций {Harris, Gitlin 1996; Linder, 2001). Связывание ионов меди из окружающей среды, их безопасный перенос к формирующимся купроэнзимам и выведение меди осуществляет метаболическая система меди (МСМ). В результате исследований последних лет сформировалась концепция организации МСМ, принципы построения которой одинаковы у всех живых организмов (Kim, 2008; Kaplan, Lutsenko, 2009). МСМ включает в себя интегральные белки плазматической мембраны, транспортирующие медь в клетку и из клетки; цитозольные и ассоциированные с мембраной шапероны, которые переносят медь в активные центры ферментов, и внеклеточные транспортеры ионов меди (Рис. 1). При этом ионы меди передаются из одного металлсвязывающего сайта в другой сайт при непосредственном контакте белков МСМ (Band et al. 2010). Внутри клетки медь транспортируется в восстановленном состоянии Cu(I), в то время как в межклеточных жидкостях она находится преимущественно в окисленном состоянии Cu(II). У многоклеточных животных существует также развитая внеклеточная система гомеостаза меди, обеспечивающая транспорт и регулирование уровня меди в межклеточных жидкостях (Linder, 1998). Поэтому в клетке и межклеточных жидкостях нет токсичных «свободных» ионов меди, то есть ионов меди со случайным лигандным окружением.

О - ката

Рис. 1. Обобщенная схема метаболической системы меди (МСМ) клеток позвоночных животных. Заштрихованными фигурами изображены медьтранспортные белки (CTR1, CTR2 - высоко- и низкоаффинные транспортеры меди, АТР7А, АТР7В -медьтранспортные АТРазы Менкеса и Вильсона, АТОХ1, CCS, СОХ 17 - Си(1)-шапероны), темно-серыми - купроэнзимы (СОХ - цитохром-с-оксидаза, SOD - Cu/Zn-супероксиддисмутаза), светло-серым - известные медьсвязывающие молекулы, роль которых в МСМ точно не установлена (GSH - глутатион, МТ- металлотионеин, COMMD1 - белок COMMD1/MURR1). Пунктирной линией изображены гипотетические участники и пути МСМ, молекулярная природа которых на данный момент не установлена. Путь обеспечения медью СОХ показан упрощенно.

За последнее время накоплено много фактов, свидетельствующих о том, что медь, помимо каталитической функции, выполняет важную роль в сигналинге (Mufti et al., 2007). Так, внутриклеточный Си(Н)-связывающий белок COMMD1 связан с регуляцией клеточного цискла и апоптоза, через модулирование связывания Х-сцепленного ингибитора апоптоза с каспазами (Burstein et al, 2004). К тому же медь участвует в регуляции активности транскрипционного фактора HIFI, контролирующего гены, ответственные за перепрограммирование энергетического метаболизма (эффект Варбурга) при

- Си(

-Си( опухолевой трансформации (Martin et al., 2005; Zhivotovsky, Orrenius, 2009). Наконец, ионы меди необходимы для неоваскуляризации (Lowndes, Harris, 2005),

У млекопитающих врожденные и приобретенные нарушения метаболизма меди приводят к дефициту или к избытку меди в клетках. При этом дефицит меди может развиться на фоне избытка меди, если она не может быть вовлечена в метаболизм. В результате развиваются тяжелые формы анемии, дефекты сосудов, гипопигментация волос, изменения структуры костной ткани, нарушения деятельности ЦНС, нарушение обмена липидов, синтеза пептидных гормонов, болезни Менкеса и Вильсона; с нарушениями метаболизма меди ассоциированы болезнь Альцгеймера, прионная болезнь, амиотрофический латеральный склероз, рак, остеопороз и др. (Gagelli et al., 2006; Mason, 1979; Menkes et al., 1962; Owen, 1981).

Дополнительный интерес к метаболической системе меди обусловлен тем, что ряд медьтранспортных белков способен связывать противоопухолевые препараты на основе платины, а изменение экспрессии соответствующих генов приводит к изменению чувствительности клеток к препаратам (Ishida et al., 2002; Abada, Howell, 2010). Платиновые препараты -цисплатин и его аналоги - группа высокоэффективных антинеопластических средств, широко используемых в клинической практике, к которым с момента их внедрения сохраняется высокий интерес (Рис. 2).

В естественных оптимальных условиях МСМ высоко селективны по отношению к меди: белки МСМ надежно отличают ионы меди от других сходных по координационным свойствам биогенных ионов - Zn(II), Fe(II). Однако координационные соединения платины - ксенобиотики, не встречающиеся в естественных условиях, и поэтому не могли быть учтены эволюцией. По этой причине клетки не имеют специфических путей транспорта платиновых комплексов и защиты от них.

3000 2500 -2000 -1500 -1000 500

Г^КГ^ООООООООООСПСПа)СГ)СТ)ОООООтcr>cncna)CDaiCT)cna)cna)cna)000 ooo

T-r-T-r-T-T-T-T-T-T-T-T-T-(NCMCMCMCNOJ

Рис. 2. Число публикаций, содержащих термин «cisplatin» (или основные синонимические названия цисплатина) в реферативной базе данных NCBI Medline (www.ncbi.nlm.nih.gov/medline) по состоянию на конец августа 2011 г.

В этом контексте представляет большой интерес установление причин, обуславливающих неожиданную специфичность белков МСМ к цисплатину, и исследование взаимосвязи транспорта меди и платиновых препаратов. Рациональных гипотез, надежно объясняющих соотношения «структура-биологическая активность» для координационных соединений платины до сих пор не предложено: новые платиновые цитостатики получают преимущественно путем комбинаторного синтеза и скрининга (Са1атИ, 2006). Белки МСМ могут быть важным недостающим элементом в моделях метаболизма платины. Поэтому исследование молекулярных механизмов, обуславливающих взаимосвязь транспорта меди и цисплатина, может в перспективе содействовать обнаружению новых препаратов или увеличению эффективности уже существующих препаратов за счет оптимизации протоколов их применения.

При исследовании метаболизма меди и его связи с транспортом цисплатина большую роль может сыграть использование другого неспецифического абиогенного субстрата МСМ - ионов серебра А§(1). Серебро(1) по химическим свойствам схоже с медью(1) (см. главу 1), по этой причине многие медьтранспортные белки не могут надежно различить Си(1) и

Ag(I) (Bertinato et al., 2010; Hanson et al., 2001). В то же время, хотя ионы серебра транспортируются в организме млекопитающих (Sugawara, Sugawara, 2000) и вызывают изменения уровня внеклеточной меди (Pribyl et al., 1980), для млекопитающих серебро малотоксично. Вероятно, механизм обеспечения ключевых медьсодержащих белков ионами меди значительно более специфичен к меди, чем медьтранспортные белки. Это создает возможности селективного воздействия на некоторые пути метаболизма меди, сопровождающегося острыми токсическими нарушениями функционирования организма.

В данной работе были проведены объединенные исследования транспорта абиогенных субстратов медьтранспортной системы - цисплатина и ионов серебра. С помощью молекулярного моделирования и кинетического эксперимента проанализированы предпосылки связывания меди, цисплатина и серебра с белком CTR1, обеспечивающим импорт меди в клетку, и, по-видимому, являющимся узловой точкой взаимодействия транспорта меди и цисплатина. Исследованы изменения в метаболизме меди у лабораторных грызунов, получающих с пищей ионы серебра. Охарактеризованная животная модель была использована для выяснения того, как изменения метаболизма меди, индуцированные серебром, влияют на транспорт цисплатина и опухолевый рост.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Скворцов, Алексей Николаевич

Результаты исследования систем [£-Ме1+ДНК]+цисплатин приведены в табл. 3.4. При высоких, по сравнению с числом потенциальных сайтов взаимодействия с ДНК, концентрациях платины, наличие Met в смеси практически не оказывает влияния на платинирование ДНК (табл. 3.4). В то же время при "низких" концентрациях цисплатина (которые еще очень велики по сравнению с реально действующим in vivo, см., например, рис. 5.5), добавление L-Met ослабляет спектральные изменения в ДНК, как абсолютные (w2/wi), так и соответствующие нарушению двойной спирали (ГК-2 при 275 нм). Обращает внимание то, что эффективная константа скорости спектральных изменений увеличивается в присутствии больших концентраций метионина. Это соответствует имеющимся в литературе сведениям, согласно которым в тройной системе образуются преимущественно смешанные (5'-Met,iV7-G)-KOMnneKCbi (Bamham et al. 1996; Kleine et al.,2003).