Экспрессия гена CTR1 у млекопитающих при разных состояниях метаболизма меди и IN SILICO анализ его белкового продукта тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.04, кандидат биологических наук Самсонов, Сергей Алексеевич

• Самсонов, Сергей Алексеевич
• кандидат биологических наук
• 2010

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Самсонов, Сергей Алексеевич

Введение

1. Обзор литературы.

1.1. Физико-химические свойства и биологическая роль ионов меди.

1.1.1. Медь как химический элемент.

1.1.2. Ионы меди Си+ и Си2т.

1.1.3. Биохимические процессы, протекающие с участием ионов меди.

1.1.4. Метаболическая система меди

1.2. Роль CTR1 в метаболизме меди.

1.2.1. Импорт ионов меди через плазматическую мембрану клетки.

1.2.2. Семейство белков CTR

1.2.3. Экспрессия гена CTR1 млекопитающих в клеточных культурах

1.2.4. Биохимическая характеристика и внутриклеточная локализация белка CTR1 млекопитающих.

1.2.5. Функция и экспрессия гена CTR1 позвоночных.

1.2.6. Регуляция экспрессии гена CTR1.

1.2.7. Изучение связывания ионов меди с доменами CTR1.

1.2.8. Участие CTR1 в транспорте платиносодержащих противоопухолевых препаратов (ППП).

2. Материалы и методы.;.

2.1. Оборудование.

2.2. Материалы.

2.3. Компьютерные методы.

2.4. Экспериментальные методы

2.4.1. Получение материала для выделения тотальной РНК.

2.4.2. Выделение тотальной РНК.

2.4.3. Обратная транскрипция, сопряжённая с полимеразной цепной реакцией.

2.4.4. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот.

2.4.5. Полуколичественный метод определения квазистационарного уровня мРНК.

2.4.6. Иммуноблотинг.

2.4.7. Измерение концентрации меди.

2.4.8. Измерение концентрации церулоплазмина.

3. Результаты и их обсуждение.

3.1. Связь экспрессии гена CTR1 с метаболизмом меди в различных органах крысы и статусом меди в крови.

3.1.1. Экспрессия гена CTRI и статус меди в печени.

3.1.2. Экспрессия гена CTR1 и статус меди в отделах мозга.

3.1.3. Экспрессия гена CTR1 и статус меди в лактирующей молочной железе.

3.1.4. Экспрессия гена CTR1 и статус меди в сердце.

3.1.5. Экспрессии гена CTR1 в печени и мозгу новорожденных и взрослых крыс при дефиците оксидазного ЦП в крови.

3.1.6. Возможная роль меди в импорте цисплатина с участием CTR1.

3.1.7. Экспрессии гена CTR1 в опухолях и в печени животных с растущими опухолями 73 3.2. In silico анализ продуктов гена CTR1 разных видов.

3.2.1. Экзон-интронная организация генов семейства CTR1.

3.2.2. Филогенетический анализ белков семейства CTR1.

3.2.3. Анализ аминокислотных последовательностей белков семейства CTR1.

3.2.4. Анализ аминокислотной последовательности CTR1 человека.

3.2.5 Анализ N-концевого экстрацеллюлярного домена CTR1 человека и дрожжей.

3.2.6. Модель олигомерного комплекса CTR1 в мембране.

3.2.7. Связывание меди НСН С-концевым мотивом CTR1 млекопитающих

3.2.8. Сравнение способностей С-концевого мотива CTR1 НСН связывать ионы Cu(I) и Ag(I)

3.2.9. Докинг N- и С-концевых медьевязывающих мотивов CTR1 млекопитающих с их предполагаемыми донорами и акцепторами меди.

3.2.10. Анализ регуляторных г/мс-элементов гена CTR1.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экспрессия гена CTR1 у млекопитающих при разных состояниях метаболизма меди и IN SILICO анализ его белкового продукта»

Актуальность исследования. В живых системах медь в составе активных центров ряда ферментов участвует в реализации жизненно важных функций в клетках всех типов (Karlin, 1993; Turnlund et al., 1998). В то же время вследствие изменения степени окисления Cu(I)<-»Cu(II) ионы меди могут вызывать образование гидроксильных радикалов (binder, 2001). Безопасное поступление меди в клетки, ее перенос к местам образования купроэнзимов и выведение из клеток обеспечивает специальная система белков, метаболическая система меди (МСМ). Некоторые гены этой системы клонированы и изучены основные принципы ее работы. МСМ всех эукариотов сходны, они включают интегральные мембранные и растворимые цитозольные белки, кодируемые ортологичными генами, их структуры и функции характеризуются высокой консервативностью. Перенос ионов меди белками этой системы к местам образования купроэнзимов происходит однонаправленно и последовательно при прямых белок-белковых взаимодействиях (Репа et al., 1999; Пучкова, Платонова, 2004; Kim et al, 2008). Благодаря этому в клетках нет свободных ионов меди (Rae et al., 1999). Мутации в генах МСМ, экологический избыток или недостаток меди, приводят к развитию тяжелых заболеваний (анемия, сердечно-сосудистые болезни, остеопороз, рак, нейродегенеративные заболевания) (Gaggelli et al., 2006). Медь также участвует и в регуляции апоптоза. Так, ионы меди специфически связываются с Х-сцепленным ингибитором апоптоза (XIAP) и вызывают освобождение из комплекса с ним каспазу 3, которая инициирует апоптоз (Mufti, et al., 2007).

В реализации всех этих биологических ролей меди, ключевым событием является перенос меди в клетку. Он осуществляется белком семейства CTR1 (copper transporter 1) высокоаффинных импортеров меди (Sharp, 2003). Нокаут гена CTR1 у мышей приводит к ранней гибели эмбрионов-гомозигот, а у гетерозигот содержание меди изменяется тканеспецифично (Lee, 2000). На ранних этапах эмбрионального развития амфибий и млекопитающих белок CTR1 участвует также в морфогенезе и дифференцировке клеток (Haremaki et al., 2007; Haremaki et al, 2009). К тому же белок CTR1 участвует в импорте цисплатина, противоопухолевого платинового препарата (Safaei, 2006). Несмотря на интенсивные исследования, многие аспекты функционирования гена CTR1 и его белкового продукта остаются невыясненными. В частности, неясно, связана ли экспрессия гена CTR1 с изменением метаболизма меди в клетках и статусом меди у млекопитающих, как устроена купрофильная пора белка CTR1, какой внеклеточный переносчик транспортирует медь к N-концевому домену CTR1, локализованному на поверхности клетки у млекопитающих. Внутриклеточный акцептор ионов меди от CTR1 также пока не установлен. Ответы на эти вопросы важны для понимания общего механизма транспорта меди в клетке.

Представленная диссертация выполнена с учетом актуальности изложенных проблем. Ее цель состоит в сравнительном анализе тканеспецифической активности гена CTR1 у млекопитающих и in silico анализе белковых продуктов генов CTR1.

Для достижения заявленной цели были поставлены следующие задачи:

1. Сопоставить уровень CTRl-мРНК, определенный методом полуколичественного ОТ-ПЦР анализа, в органах, отличающихся типами метаболизма меди.

2. Проанализировать тканеспецифическую экспрессию гена CTR1 при различных статусах меди: при сниженной и повышенной оксидазной активности церулоплазмина (ЦП) и концентрации меди в сыворотке.

3. Сравнить аминокислотные (а.к.) последовательности CTR1 разных видов,. оценить потенциальную функциональную роль доменов и аминокислотных остатков (а.о.) в формировании купрофильной поры, образования функционирующего гомотримера CTR1 и участков взаимодействия с потенциальными донорами меди.

4. Оценить металлосвязывающую способность консервативного С-концевого мотива His-Cys-His позвоночных.

Научная новизна полученных результатов. Все представленные в работе результаты являются новыми. Показано, что экспрессия гена CTR1 в онтогенезе изменяется органоспецифически, зависит от уровня меди в клетке и ее статуса во внеклеточной среде. На основе полученных экспериментальных данных предложены модели регуляции тканеспецифической экспрессии гена CTR1, которые дополнены анализом цис-регуляторной области гена CTR1. Охарактеризована экспрессия гена CTR1 в опухолевых тканях, а также при недостатке оксидазного ЦП, предполагаемого донора меди для CTR1, дефицит которого был искусственно вызван добавлением в пищу ионов серебра. Эти данные дополнены анализом докинг-взаимодействия между ЦП и CTR1. В результате этого анализа выявлены участки этих белков, вероятно, участвующих в осуществлении белок-белковых взаимодействий. Теоретический анализ аминокислотной последовательности белка CTR1 позволил создать одну из первых моделей тримерного комплексе CTR1 в мембране, принципиальная верность которой позже была подтверждена экспериментальными методами (Unger et al, 2009). Медьсвязывающая способность мотивов CTR1, предположительно участвующих в осуществлении транспорта меди через плазматическую мембрану и в клетке, проанализированы на уровне квантово-химической теории и молекулярной механики и рассмотрены в контексте белок-белковых взаимодействий, лежащих в основе МСМ.

Научно-нрактическое значение полученных результатов состоит в том, что они углубляют знания о механизмах, лежащих в основе нарушения метаболизма меди, ведущих к развитию нейродегенеративных болезней, а также расширяют общие представления о метаболизме металлов в организме млекопитающих. В практическом плане, использование данных о тканеспецифическом изменении статуса меди в онтогенезе млекопитающих и экспрессии генов, участвующих в метаболизме меди, в частности, CTR1, способствует как более эффективному лечению, так и предотвращению заболеваний, связанных с повреждением путей гомеостаза меди. Выявление связи между статусом меди во внеклеточной среде и токсическим эффектом цисплатина на рост клеток открывает путь для оптимизации протоколов применения этого противоопухолевого препарата в клинике. Основные положения, выносимые на защиту:

1. Активность гена CTR1 связана с метаболизмом меди.

2. Транскрипционная активность гена CTR1 млекопитающих регулируется, по крайней мере, двумя различными механизмами: репрессируется при высоком содержании меди в ядре и активируется/инактивируется при низком содержании меди в зависимости от требуемого физиологическими условиями уровня синтеза купроэнзимов.

3. Активность гена CTR1 связана с уровнем меди и оксидазного ЦП, основного источника меди для клеток негепатоцитарных рядов. Точно также уровень оксидазного ЦП во внеклеточных жидкостях (кровь, ликвор, молоко) пропорционален активности гена CTR1.

4. По данным моделирования на основе анализа а.к. последовательностей филогенетически консервативные ТМД2 и ТМДЗ белка CTR1, содержащие 21 а.о., способный координировать медь, образуют амфипатичную поверхность. На основе этого предложена модель гомотримера CTR1, в которой ТМД2 и ТМДЗ образуют купрофильный канал, а ТМД1 не участвует в образовании медьпроводящей поры. Теоретически рассчитанный максимальный радиус поры равен 4.4 А.

5. Медь, связанная мотивами His-Cys-His в цитозольном домене гомотримера CTR1, может быть передана. Си(1)-шаперонам, имеющим медьсвязывающий мотив Cys-X-X-Cys. Количество атомов меди, связанных с цитозольным доменом, влияет на возможность их передачи цитозольным шаперонам.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Самсонов, Сергей Алексеевич

ВЫВОДЫ

1. При повышении продукции секреторной формы церулоплазмина (высокий статус меди в сыворотке крови при взрослом типе метаболизма меди, опухолевый рост, высокая концентрация церулоплазмина в молоке в первые дни лактации) экспрессия гена CTR1 положительно коррелирует с затратами меди на формирование холо-церулоплазмина. Увеличение клеточной массы (рост сердечной мышцы и рост опухолей) сопровождается повышением активности гена CTR1.

2. В отделах развивающегося мозга синтез секреторной формы церулоплазмина сменяется на синтез ГФИ-заякоренной изоформы, при этом уровень экспрессии CTR1 не меняется.

3. Снижение статуса меди, вызванное Ag(I), которое координируется медьсвязывающими мотивами CTR1 и переносится в клетки по тому же пути, что и медь, не влияет на уровень экспрессии гена CTRL

4. N-концевые медьсвязывающие мотивы, амфипатичные купрофильные поверхности спиралей трансмембранных доменов 2 и 3, а также с-концевые НСН-мотивы в гомотримере белка CTR1 образуют единую медьпроводящую систему. Купрофильный канал имеет симметрию Сз и диаметр 8.8 А. Трансмембранный домен 1 непосредственно не участвует в образовании медьпроводящей поры, но за счет длинной консервативной цитозольной петли может обеспечивать подвижность структуры.

5. Медь, связанная мотивами His-Cys-His в цитозольном домене гомотримера CTR1, может быть передана непосредственно Си(1)-шаперонам, имеющим медь связывающий мотив Cys-X-X-Cys. Докинг пептидных медьсвязывающих мотивов N- и С-концевых доменов CTR1 выявляет участки взаимодействия CTR1 с предполагаемыми донорами (ЦП, альбумин) и акцепторами (медьсвязывающий сайт АТФазы Менкеса) меди. Комплекс CTR1 может переносить медь от внеклеточного донора к Си(1)-шаперонам по градиенту свободной энергии без дополнительных посредников.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Белки семейства высокоаффинных транспортеров Cu(I) через плазматическую мембрану клетки — CTR1 — занимают центральное место в метаболизме меди для организмов всех типов. Помимо своей основной функции в импорте меди, привлекательным для исследователей является и тот факт, что белки семейства CTR1 могут участвовать в импорте серебра и платино содержащих противоопухолевых препаратов у млекопитающих. Несмотря на большой интерес к CTR1 на уровне гена и белка, детальная информация об экспрессии гена CTR1, а также о механизмах функционирования кодируемого им белка по-прежнему остается неизвестной. В частности, не определена структура мембранного белка, предположительно являющегося гомотримером. Существует несколько моделей организации трансмембранных доменов белка, в том числе и представленная в нашей работе. Также отсутствует информация о структуре N-концевого внеклеточного домена, который предположительно первым связывает ионы меди в процессе их переноса через мембрану. Другим важным вопросом, стоящим перед исследователями, является сам механизм работы белка-импортера. Ни точная стехиометрия процесса, ни кинетика связывания и передачи ионов меди через мембрану на молекулярном уровне неизвестны. И, наконец, высокая тканеспецифичность активности гена CTR1 создает трудности для понимания процессов, управляющих регуляцией его экспрессии. Представленная диссертация посвящена рассмотрению всех этих аспектов в изучении гена CTR1 и кодируемого им белка.

Анализ экспрессии гена CTR1 и статуса меди в печени, отделах мозга, лактирующей молочной железе и в сердце в онтогенезе крыс полностью подтверждает ключевую роль, CTR1 как универсального импортера меди в клетках млекопитающих. Мы обнаружили регуляторные механизмы активности гена CTR1, которые несмотря на тканеспецифичность можно обобщить в две группы:

1. Активность репрессируется при высоком содержании меди в ядре

2. Активность активируется/инактивируется при низком содержании меди в зависимости от требуемого физиологическими условиями уровня синтеза купроэнзимов (в частности, изоформ ЦП). Первый тип регуляции характерен для печени и сосудистого сплетения, второй- для мозга и молочной железы. Также в мозгу был обнаружен пониженный уровень экспрессии гена CTR1 при искусственном дефиците его предполагаемого донора меди- ЦП.

Важная роль CTR1 также была проанализирована в модельных организмах для изучения болезни Альцгеймера (БА) и при образовании опухолей. Было показано, что экспрессия гена существенно снижается при фибриллогенезе клеток мозга, что создает возможность использовать ген CTR1 в качестве одного из маркеров БА. В клетах печени и стенки кишечника экспрессии гена CTR1 существенно повышалась при опухолеобразующих процессах, что делает ген также подходящим биомаркером для опухолей. С другой стороны, в промотерной области гена были обнаружены нуклеотидные последовательности, соответствующие сайтам связывания транскрипционных факторов, секвестрируемых цисплатином. Таким образом, наши данные подчеркивают важность изучения гена CTR1 в рамках исследований процессов, связанных с опухолеобразованием.

У позвоночных наблюдается высокая консервативность в аминокислотной последовательности CTR1, которая предполагает сходную структуру для всех соотвествующих белков семейства. N-концевой внеклеточный домен- самый вариабельный из топологических доменов при сравнении позвоночных и одноклеточных эукариот. Это, по-видимому, объясняется тем, что низшие эукариоты потребляют ионы меди в свободном виде из окружающей среды, тогда как позвоночные (в частности, млекопитающие) не имеют в своих клетках свободных ионов меди, и CTR1 должен принимать медь от внеклеточных переносчиков, причем этот процесс тканеспецифичен. Мы считаем церулоплазмин (ЦП) основным кандидатом на роль донора ионов меди для CTR1 на поверхности мембраны клетки. Интересно, что несмотря на факт, что ЦП связывает Cu(II), он может сам выполнять роль редуктазы для меди, восстанавливая ее до Cu(I), которая далее может быть высокоспецифично связана с Met-богатыми мотивами N-концевого домена CTR1. Методом молекулярного докинга мы проанализировали предположительные сайты связывания этих мотивов с ЦП. Для этого использовалось несколько конформаций мотивов и структура ЦП, определенная по данным рентгеноструктурного анализа. В работе было показано, что Met-богатые мотивы энергетически наиболее выгодно взаимодействуют с участками, соответствующими сайтам связывания лабильной меди в ЦП. Аналогичные расчеты были проведены и для альбумина- другого предположительного донора меди для CTR1. В этом случае также были выявлены участки взаимодействия на поверхности альбумина, в состав которых входят способные к координации меди аминокислотные мотивы.

На основе гидропатического профиля, основываясь на предположении, что трансмембранные домены (ТМД) находятся в мембране в конформации а-спирали, была построена модель расположения ТМД, при котором гомотримерный канал образуется 6 ТМД (ТМД2 и ТМДЗ), тогда как оставшиеся ТМД1, будучи существенно более гидрофобными, не участвуют в образовании медьпроводящей поры. Рассчитанные размеры поры совпадают с данными по 2Б-кристаллографии (Aller and Unger, 2006) и также не противоречат данным по структуре расположения ТМД для внеклеточной и части трансмембранных доменов белка, полученным методом электронной микроскопии, (.De Feo et al., 2009). В последней работе, однако, предполагают отличающуюся от нашей модель белкового комплекса, при которой форма тримера в мембране-коническая, а-спирали пронизывают мембрану под углом, и с разных сторон мембраны канал имеет различную ширину за счет участия именно гидрофобного ТМД1 в формировании поры с цитозольной стороны.

С-концевой домен CTR1 участвует в дальнейшей передаче меди в клетку, после связывания ее с внеклеточной стороны N-концом и транспорта через мембрану ТМД. Механизм передачи, а также способ координирования меди для белка млекопитающих неизвестен. В работе с помощью методов молекулярной механики и квантовой химии были проанализированы способности С-концевого медьсвязывающего мотива НСН координировать один и несколько ионов меди, а также передавать его на цитозольные медные шапероны. Докинг мотива НСН позволил проанализировать возможное связывание С-конца CTR1 с медьсвязывающим сайтом его предположительного акцептора меди - в АТФазе Менкеса. Таким образом, теоретическая часть работа помогает частично промоделировать механизм связывания и передачи меди через канал, образованный CTR1.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Самсонов, Сергей Алексеевич, 2010 год

1. Aller S., Eng Е., De Feo С., Unger V. Eukaryotic CTR copper uptake transporters require two faces of the third transmembrane domain for helix packing, oligomerization, and function // J Biol Chem, 279(51): 53435-53441, 2004.

2. Aller S., Unger V. Projection structure of the human copper transporter CTR1 at 6-A resolution reveals a compact trimer with a novel channel-like architecture // Proc Nat Acad Sci USA, 103(10): 3627-3632, 2006.

3. Arredondo M., Munoz P., Мига С. V., Nunez M.T. DMT1, a physiologically relevant apical Cul+ transporter of intestinal cells // Am Journal Physiol. Cell physiology, 284(6): C1525-C1530 ,2003.

4. Bauerly K.A., Kelleher S.L., Lonnerdal B. Functional and molecular responses of suckling rat pups and human intestinal Caco-2 cells to copper treatment // Journal Nutr Biochem, 15(3): 155-162,2004.

5. Burstein E., Ganesh L., Dick R.D., van De Sluis В., Wilkinson J.S. Klomp L.W.J. Wijmenga C., Brewer G.J.3, Nabel G.J., Duckett C.S. A novel role for XIAP in copper homeostasis through regulation of MURR1 // EMBO J, 23(1): 244-254, 2004.

6. Bertinato J., Swisl E„ Plouffe L.J., Brooks S.P., L'abbe M.R. Ctr2 is partially localized to the plasma membrane and stimulates copper uptake in COS-7 cells // Biochem J, 409(3): 731-740, 2008.

7. Binks S., Dobrota M. Kinetics and mechanism of uptake of platinum-based pharmaceuticals by the rat small intestine // Biochem Pharm, 40(6): 1329-1336, 1990.

8. Cooper E.H. Plasma protein profile in neoplastic diseases. Ric Clin Lab, 13:57-69, 1983.

9. Crisp R.J., Adkins E.M., Kimmel E., Kaplan J. Recruitment of Tuplp and Cti6p regulates heme-deficient expression of Aftlp target genes // EMBO J, 25, 512-521,2006.

10. Dancis A., Haile D., Yuan D.S., Klausner R.D. The Saccharomyces cerevisiae copper transport protein (Ctrlp). Biochemical characterization, regulation by copper, and physiologic role in copper uptake // J Biol Chem, 269(41): 25660-25667, 1994.

11. De Feo C., Aller S., Unger V. A structural perspective on copper uptake in eukaryotes // BioMetals, 20(3-4): 716, 705, 2007.

12. De Feo C., Aller S., Sulivae G., Blackburn N., Unger V. Three-dimensional structure of the human copper transporter hCTRl // Proc Nat Acad Sci USA, 106(11): 4237-4242, 2009.

13. Deschamps P., Kulkarni P.P., Sarkar B. X-ray Structure of Physiological Copper(II)-Bis(l-histidinato) Complex // Inorg Chem, 43(11): 3338-3340, 2004.

14. Edwards M.D., Li Y, Kim S., Miller S., Bartlett W., Black S., Dennison S., Iscla L, Blount P., Bowie J. U., Booth I.R. Pivotal role of the glycine-rich TM3 helix in gating the MscS mechanosensitive channel // Nat Struct Mol Biol, 12(2): 113-119, 2005.

15. Eisses J.F., Kaplan J.H. Molecular characterization of hCTRl, the human copper uptake protein // J Biol Chem, 277(32): 29162-29171, 2002.

16. Eisses J.F., Kaplan J.H. The mechanism of copper uptake mediated by human CTR1: a mutational analysis // J Biol Chem, 280(44): 37159-37168, 2005.

17. Ettinger M.J., Darwish H.M., Schmitt R.C. Mechanism of copper transport from plasma to hepatocytes // Fed. Proc., 45(12): 2800-2804, 1986.

18. Fifkova E., Marsala J. Stereotaxic atlas for the cat, rabbit and rat // Praga, St. zdravnicke nakald. 105,1960.

19. Frezza C., Gottlieb E. Mitochondria in cancer: Not just innocent bystanders // Seminars in Cancer Biology, 19(1): 4-11, 2009.

20. Furukawa Т., Komatsu M., Lkeda R., Tsujikawa K., Akiyama S. Copper transport systems are involved in multidrug resistance and drug transport // Curr Med Chem, 15(30): 3268-3278, 2008.

21. Gaggelli E. Kozlowski H., Valensin D., Valensin G. Copper homeostasis and neurodegenerative disorders (Alzheimer's, Prion, and Parkinson's diseases and amyotrophic lateral sclerosis) // Chem Rev, 106: 1995-2044, 2006.

22. Gogvadze V., Orrenius S., Zhivotovsky B. Mitochondria in cancer cells: what is so special about them? // Tren. Cell Biol. 18(4): 165-173, 2008.

23. Gunshin H., Mackenzie В., Berger U.V., Gunshin Y., Romero M.F., Boron W.F., Nussberger S., Gollan J.L., Hediger M.A. Cloning and characterization of a mammalian proton-coupled metal-ion transporter // Nature, 388(6641): 482488, 1997.

24. Guo Y., Smith K., Lee J., Thiele D.J., Petris M.J. Identification of Methionine-rich Clusters That Regulate Copper-stimulated Endocytosis of the Human Ctrl Copper Transporter// J Biol Chem, 279(17): 17428-17433, 2004a.

25. Guo Y., Smith K., Petris M.J. Cisplatin Stabilizes a Multimeric Complex of the Human Ctrl Copper Transporter: requirement for the extracellular methionine-rich clusters // J Biol Chem, 279(45): 46393-46399, 2004b.

26. Han H., Archibeque S., Engle T. Characterization and Identification of Hepatic mRNA Related to Copper Metabolism and Homeostasis in Cattle // Biol Trace Elem Res, 129(1-3): 130-6, 2009.

27. Haremaki Т., Fraser S.T., Kuo Y.M., Baron M.H., Weinstein D.C. Vertebrate Ctrl coordinates morphogenesis and progenitor cell fate and regulates embryonic stem cell differentiation // Proc Nat Acad Sci USA, 104(29): 12029-12034, 2007.

28. Haremaki N., Weinstein D.C. Xmc mediates Xctrl-independent morphogenesis inXenopus laevis // Dev Dyn, 238(9): 2382-2387, 2009.

29. Hassett R., Dix D.R., Eide D.J., Kosman D.J. The Fe(II) permease Fet4p functions as a low affinity copper transporter and supports normal copper trafficking in Saccharomyces cerevisiae // Biochem J, 351(2): 477-484, 2000.

30. Hilton M., Spenser D.C., Ross P., Ramsey A., McArdle H.J. Characterisation of the copper uptake mechanism and isolation of the ceruloplasmin receptor/coppertransporter in human placental vesicles // Biochim Biophys Acta, 1245(2): 153-160, 1995.

31. Holzer A.K, Manorek G.H., Howell S.B. Contribution of the major copper influx transporter CTR1 to the cellular accumulation of cisplatin, carboplatin, and oxaliplatin // Mol Pharmacol, 70(4): 1390-1394, 2006.

32. Hurley L., Keen C., Lonnerdal B. Copper in fetal and neonatal development // Ciba Foundation symposium, 79: 227-245, 1980.

33. Jiang J., Nadas I.A., Kim A.M., Franz K.J. A Mets Motif Peptide Found in Copper Transport Proteins Selectively Binds Cu(I) with Methionine-Only Coordination // Inorg Chem, 44(26): 9787-9794, 2005.

34. Karl in K.D. Metalloenzymes, structural motifs, and inorganic models // Science, 261(5122): 701-708, 1993.

35. Kataoka M., Tavassoli M., Ceruloplasmin receptors in liver cell suspensions are limited to the endothelium // Exper Gell Res, 155(2): 232-240, 1984.

36. Kelleher S.L., Lonnerdal B. Mammary gland copper transport is stimulated by prolactin through alterations in Ctrl and Atp7A localization // American journal of physiology. Regulatory, integrative and comparative physiology, 291(4): R1181-R1191, 2006.

37. Kim B.-E., Nevitt Т., Thiele D.J. Mechanisms for copper acquisition, distribution and regulation // Nat Chem Biol, 4(3): 176-185, 2008.

38. Kim H., Son H.Y., Bailey S.M., Lee J. Deletion of hepatic Ctrl reveals its function in copper acquisition and compensatory mechanisms for copper homeostasis // Am J Physiol. Gastrointestinal and liver physiology, 296(2): E-pub, 2009.

39. Kim S., Jeon Т., Oberai A., Yang D., Schmidt J.J., Bowie J.U. Transmembrane glycine zippers: Physiological and pathological roles in membrane proteins // Proc Nat Acad Sci. USA, 102(40): 14278-14283, 2005.

40. Kirchman P.A., Botta G. Copper supplementation increases yeast life span under conditions requiring respiratory metabolism // Mech Ageing Dev, 128(2): 187-195, 2007.

41. Klomp A.E., Juijn J.A., van der Gun L. Т., van den Berg I.E., Berger R., Klomp L.W. The N-terminus of the human copper transporter 1 (hCTRl) is localized extracellularly, and interacts with itself// Biochem J, 370(Pt 3): 881-889, 2003.

42. Klomp A.E., Tops B.B., Van Denberg I.E., Berger R., Klomp L. W. Biochemical characterization and subcellular localization of human copper transporter 1 (hCTRl) // Biochem J, 364(Pt 2): 497-505, 2002.

43. Klomp L.W., Farhangrazi Z.S., Dugan L.L., Gitlin J.D. Ceruloplasmin gene expression in the murine central nervous system // J Clin Invest, 98(1): 207-215, 1996.

44. Knutson M.D. Steap Proteins: Implications for Iron and Copper Metabolism // NutrRev, 65(7): 335-340, 2007.

45. Kozma M., Ferke A. Trace element localization and changes in zinc and copper concentrations during postnatal development of the rat CNS // Acta Histochem, 65(2): 219-227, 1979.

46. Kroll I. A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis Methods and Applications. 157pp, 1973.

47. Kulawiec M., Ayyasamy V., Singh K.K. p53 regulates mtDNA copy number and mitocheckpoint pathway//J.Carcinogen. 8: 1-9,2009.

48. К no M., Chen H., Song I., Savaraj N. Ishikawa T.The roles of copper transporters in cisplatin resistance // Cancer Metastasis Rev, 26(1): 71-83, 2007.

49. Kuo Y.M., Gybina A.A., Pyatskowit J. W., Gitschier J., Prohaska J.R. Copper transport protein (Ctrl) levels in mice are tissue specific and dependent on copper status // J Nutr, 136(1): 21-26, 2006.

50. Kuo Y., Zhou В., Cosco D., Gitschier J. The copper transporter CTR1 provides an essential function in mammalian embryonic development // Proc Nat Acad Sci USA, 98(12): 6836-6841, 2001.

51. Larson C.A., Blair B.G., Safaei R., Howell S.B. The role of the mammalian copper transporter 1 in the cellular accumulation of platinum-based drugs // Mol Pharmacol, 75(2): 324-330, 2009.

52. Lee J. Isolation of a murine copper transporter gene, tissue specific expression and functional complementation of a yeast copper transport mutant // Gene, 254(1-2): 87-96, 2000.

53. Lee J., Pe\ па M.M., Nose Y., Thiele D.J. Biochemical characterization of the human copper transporter Ctrl // J Biol Chem, 277(6): 4380^387, 2002.

54. Lin X., Okuda Т., Holzer A., Howell S.B. The Copper Transporter CTR1 Regulates Cisplatin Uptake in Saccharomyces cerevisiae // Mol Pharmacol, 62(5): 1154-1159,2002.

55. Linder M.C. Copper and genomic stability in mammals // Mutat Res, 475(1-2): 141-152,2001.

56. Linder M.C., Hazegh-Azam M. Copper biochemistry and molecular biology // Am J Clin Nutr, 63(5): 797S-811S, 1996.

57. Linder M., Bryant R., Lim S., Scott L., Moor J. Ceruloplasmin elevation and synthesis in rats with transplantable tumors // Enzyme, 24(2): 85-95, 1979.

58. Liu, Jingxuan, Sitaram, Anand, Burd, Christopher G. Regulation of Copper-Dependent Endocytosis and Vacuolar Degradation of the Yeast Copper Transporter, Ctrlp, by the Rsp5 Ubiquitin Ligase // Traffic, 8(10): 1375-1384, 2007.

59. Llanos R.M., Michalczyk A.A., Freestone D.J., Currie S., Linder M.C., Ackland M.L., Mercer J.F. Copper transport during lactation in transgenic mice expressing the human ATP7A protein // Biochem Biophys Research Commun, 372(4): 613-617, 2008.

60. Llanos R.M., Mercer J.F.B. The Molecular Basis of Copper Homeostasis Copper-Related Disorders // DNA Cell Biol, 21(4): 259-270, 2002.

61. Lonnerdal B. Copper nutrition during infancy and childhood // Am J Clin Nutr, 67(5 SuppI): 1046S-1053S, 1998.

62. Lonnerdal B. Intestinal regulation of copper homeostasis: a developmental perspective I I Am J Clin Nutr, 88(3): 846S-50S, 2008.

63. Lonnerdal В., Bell J.G., Keen C.L. Copper absorption from human milk, cow's milk, and infant formulas using a suckling rat model // Am J Clin Nutr, 42(5): 836-844, 1985.

64. Lowe J., Vieyra A., Catty P., Guillain F., Mintz E., Cuillel M. A Mutational Study in the Transmembrane Domain of Ccc2p, the Yeast Cu(I)-ATPase, Shows Different Roles for Each Cys-Pro-Cys Cysteine // J Biol Chem, 279(25): 2598625994, 2004.

65. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Fair A.L., Randall R.J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J Biol Chem, 193(1): 265-275, 1951.

66. Mackenzie N. Cloning, expression pattern and essentiality of the high-affinity copper transporter 1 (ctrl) gene in zebrafish // Gene, 328: 113-120, 2004.

67. Madsen E., Gitlin J.D. Copper deficiency // Curr Opin Gastroenterol, 23(2): 187-192, 2007.

68. Maltais D., Desroches D., Aouffen M., Mateescu M., Wang R., Paquin J. The blue copper ceruloplasmin induces aggregation of newly differentiated neurons: a potential modulator of nervous system organization // Neurosci, 121(1): 73-82,2003.

69. Mani K, Cheng F., Havsmark В., David S., Fransson L. Involvement of GPI-linked ceruloplasmin in the Cu/Zn-NO-dependent degradation of glypican-1 heparan sulfate in Rat C6 glioma cells // J Biol Chem, 279(13): 12918-12923,2004.

70. Manolis A, Cox D. W. Purification of rat ceruloplasmin. characterization and comparison with human ceruloplasmin. Prep Biochem, 10(2):121-132, 1980.

71. Marabese M, Mazzoletti M., Vikhanskaya F., Broggini M. HtrA2 enhances the apoptotic functions of p73 on bax // Cell Death Differ, 15(3): 849-858, 2008.

72. Marone M, Mozzetti S., De Ritis D., Pierelli L., Scambia G. Semiquantitative RT-PCR analysis to assess the expression levels of multiple transcripts from the same sample // Biol Proced Online, 3: 19-25, 2001.

73. Mason K. A conspectus of research on copper metabolism and requirements of man//JNutr, 109(11): 2066, 1979.

74. Matsumoto S., Tanaka Т., Kurokawa H., Matsuno K., Hayashida Y., Takahashi T. Effect of copper and role of the copper transporters ATP7A and CTR1 in intracellular accumulation of cisplatin // Anticancer Res, 27(4B): 2209-2216, 2007.

75. McArdle H.J. The transport of iron and copper across the cell membrane: different mechanisms for different metals? // Proc Nutr Soc, 51(2): 199-209, 1992.

76. Merchant S.S., Allen M.D., Kropat J., Moseley J.L., Long J.C., Tottey S., ТегансЫ A.M. Between a rock and a hard place: trace element nutrition in Chlamydomonas // Biochim Biophys Acta, 1763(7): 578-594, 2006.

77. Mitro A., Palkovits M. Morphology of the rat brain ventricles, ependyma, and periventricular structures // Bibliotheca anatomica, 21: llOpp, 1981.

78. Mufti A.R., Burstein E., Duckett C.S. XIAP: Cell death regulation meets copper homeostasis // Arch Biochem Biophys, 463: 168-74, 2007.

79. Murata K., Mitsuoka K., Hirai Т., Walz Т., Agre P., Heymann J.В., Engel A., Fujiyoshi Y. Structural determinants of water permeation through aquaporin-1 // Nature, 407(6804): 599-605, 2000.

80. Musci G., Fraterrigo T.Z., Calabrese L., McMillin D.R. On the lability and functional significance of the type 1 copper pool in ceruloplasmin // J Biol Inorg Chem, 4(4): 441^146, 1999.

81. Nadella, Sunita, Grosell, Martin, Wood, Chris Mechanisms of dietary Cu uptake in freshwater rainbow trout: evidence for Na-assisted Cu transport and a specific metal carrier in the intestine // J Comp Physiol B, 177(4): 433^146, 2007.

82. Nose Y., Kim B.E., Thiele D.J. Ctrl drives intestinal copper absorption and is essential for growth, iron metabolism, and neonatal cardiac function // Cell Metab, 4(3): 235-244, 2006a.

83. Nose V., Rees E.M., Thiele D.J. Structure of the Ctrl copper trans'PORE'ter reveals novel architecture // Trends Biochem Sci, 31(11): 604-607, 2006b.

84. Ohgami R.S., Campagna D.R., McDonald A., Fleming M.D. The Steap proteins are metalloreductases // Blood, 108(4): 1388-1394, 2006.

85. Olivares M., Lonnerdal В., Abrams S.A., Pizarro F., Uauy R. Age and copper intake do not affect copper absorption, measured with the use of 65Cu as a tracer, in young infants // Am J Clin Nutr, 76(3): 641-645, 2002.

86. Osman D., Cavet J. Chapter 8 Copper Homeostasis in Bacteria // Adv Appl Microbiol, 65: 217-247, 2008.

87. Pabla N., Murphy R.F.F., Liu K., Dong Z. The copper transporter Ctrl contributes to cisplatin uptake by renal tubular cells during cisplatin nephrotoxicity // Am J Physiol Renal physiology, 296(3): F505-F511, 2009.

88. Patel B.N., Dunn R.J., David S. Alternative RNA Splicing Generates a Glycosylphosphatidylinositol-anchored Form of Ceruloplasmin in Mammalian Brain // J Biol Chem, 275(6): 4305^1310, 2000.

89. Репа M.M.O., Lee J., Thiele D.J. A Delicate Balance: Homeostatic Control of Copper Uptake and Distribution // J Nutr, 129(6): 1251-1260, 1999.

90. Petris M.J., Smith К., Lee J., Thiele D.J. Copper-stimulated Endocytosis and Degradation of the Human Copper Transporter, hCtrl // J Biol Chem, 278(11): 9639-9646, 2003.

91. Platonova N., Guolikhandanova N., Tsymbalenko N., Zhiguleva E. Zhivulko T. Vasin A., Evsukova I. Puchkova L. Milk ceruloplasmin is a valuable source of nutrient copper ions for mammalian newborns // J Trace Elem Med Biol, 21(3): 184-193,2007.

92. Portnoy, Portnoy M., Schmidt, Schmidt P., Rogers, Rogers R., Culotta, Culotta V. Metal transporters that contribute copper to metallochaperones in Saccharomyces cerevisiae // Mol Genet Genomics , 265(5): 873-882, 2001.

93. Pribyl T, Schreiber, Jahodovd J Polyphenol oxidase activity in the rat hypothalamus: stimulation after oestrogens and inhibition after the administration of silver // Physiol Bohemoslov , 30(6): 525-530, 1981.

94. Prohaska J.R. Role of copper transporters in copper homeostasis // The Am J Clinical Nutr, 88(3): 826S-829S, 2008.

95. Prohaska JR., Brokate B. The timing of perinatal copper deficiency in mice influences offspring survival // J Nutr, 132(10): 3142-3145, 2002.

96. Puchkova L., Zhivulko Т., Mishenko В., Vasin A., Platonova N. Tsymbalenko N. Copper nutrition and copper metabolism in rat newborns // Metal ions in biology and medicine, 3(3): 441-451, 2002.

97. Puig S., Thiele D.J. Molecular mechanisms of copper uptake and distribution // Curr Opin Chem Biol, 6(2): 171-180, 2002.

98. Puig S., Lee J., Lau M., Thiele D.J. Biochemical and Genetic Analyses of Yeast and Human High Affinity Copper Transporters Suggest a Conserved Mechanism for Copper Uptake // J Biol Chem, 277(29): 26021-26030, 2002.

99. Quintanar L., Stoj C., Taylor A.B., Hart P.J., Kosman D.J., Solomon E.I. Shall we dance? How a multicopper oxidase chooses its electron transfer partner // Acc. Chem Res, 40(6): 445-452, 2007.

100. Rae T.D., Schmidt P., J, Pufahl R.A., Culotta V.C., V, O'Halloran T. Undetectable Intracellular Free Copper: The Requirement of a Copper Chaperone for Superoxide Dismutase // Science, 284(5415): 805-808, 1999.

101. Rees E.M., Thiele D.J. Identification of a vacuole-associated metalloreductase and its role in Ctr2-mediated intracellular copper mobilization // J Biol Chem, 282(30): 21629-21638, 2007.

102. Reyes A., Leiva A., Cambiazo V., Mendez M., Gonzalez M. Cop-like operon: structure and organization in species of the Lactobacillale order // Biol Res, 39(1): 87-93, 2006.

103. Roy C.N., Enns C.A. Iron homeostasis: new tales from the crypt // Blood, 96(13): 4020-4027, 2000.

104. Saeki K., Nakjimi M., Loaghlin Т., Calkins D.C., Baba N., Kiyota M., Tatsukawa R. Accumulation of silver in the liver of three species of pinnipeds // Environ Pollut, 112(1): 19-25, 2001.

105. Safaei R. Role of copper transporters in the uptake and efflux of platinum containing drugs // Cancer Lett, 234(1): 34-39, 2006.

106. Safaei R., Katano K., Samimi G., Naerdemann W., Stevenson J.L., Rochdi M., Howell S.B. Cross-resistance to cisplatin in cells with acquired resistance to copper // Cancer Chemother Pharmacol, 53(3): 239-246, 2004.

107. Samimi G., Howell S.B. Modulation of the cellular pharmacology of JM118, the major metabolite of satraplatin, by copper influx and efflux transporters // Cancer Chemother Pharmacol, 57(6): 781-788, 2006.

108. Sharp P. Ctrl and its role in body copper homeostasis // Int J Biochem Cell Biol, 35(3): 288-291,2003.

109. Sharp P. The molecular basis of copper and iron interactions // Proc Nutr Soc, 63, 563-569, 2004.

110. Shi X., Stoj C., Romeo A., Kosman D.J., Zhu Z. Frelp Cu2+ Reduction and Fet3p Cul+ Oxidation Modulate Copper Toxicity in Saccharomyces cerevisiae // J Biol Chem, 278(50): 50309-50315, 2003.

111. Sinani D., Adle D.J., Kim H., Lee J. Distinct Mechanisms for Ctrl-mediated Copper and Cisplatin Transport // J Biol Chem, 282(37): 26775-26785, 2007.

112. Solioz M., Stoyanov J. Copper homeostasis in Enterococcus hirae // FEMS Microbiol Rev, 27(2-3): 183-195, 2003.

113. Southon A., Burke R., Norgate M., Batterham P., Camakaris J. Copper homoeostasis in Drosophila melanogaster S2 cells // Biochem J, 383(Pt 2): 303309, 2004.

114. Southon A., Farlow A., Norgate M., Burke R., Camakaris J. Malvolio is a copper transporter in Drosophila melanogaster // J Exp Biol, 211(Pt 5): 709-716, 2008.

115. Sfo/ C., Kosman D. Cuprous oxidase activity of yeast Fet3p and human ceruloplasmin: implication for function // FEBS Lett, 554(3): 422^126, 2003.

116. Stoj C.S., Augustine A.J., Solomon E.L., Kosman D.J. Structure-Function Analysis of the Cuprous Oxidase Activity in Fet3p from Saccharomyces cerevisiae // J Biol Chem, 282(11): 7862-7868, 2007.

117. Sze C., Khairallah G., Xiao Z„ Donnelly P., О'hair R., Wedd A. Interaction of cisplatin and analogues with a Met-rich protein site // J Biol Inorg Chem, 14(2): 163-165,2009.

118. Tennant J., Stansfield M., Yamaji S., Srai S.K., Sharp P. Effects of copper on the expression of metal transporters in human intestinal Caco-2 cells // FEBS Lett, 527(1-3): 239-244, 2002.

119. Turnlund J.R., Keyes W.R., Anderson H.L., Acord L.L. Copper absorption and retention in young men at three levels of dietary copper by use of the stable isotope 65Cu // Am J Clin Nutr, 49(5): 870-878, 1989.

120. Turnlund J.R., Keyes W.R., Peiffer G.L., Scott K.C. Copper absorption, excretion, and retention by young men consuming low dietary copper determined by using the stable isotope 65Cu // Am J Clin Nutr, 67(6): 1219-1225, 1998.

121. Turski M.L., Thiele D.J. Drosophila CtrlA functions as a copper transporter essential for development // J Biol Chem, 282(33): 24017-24026, 2007.

122. Uauy R., Olivares M., Gonzalez M. Essentiality of copper in humans // Am J Clin Nutr, 67(5 Suppl): 952S-959S., 1998.

123. Wu X., Sinani D., Kim H., Lee J. Copper transport activity of yeast Ctrl is down regulated via its C-terminus in response to excess copper // J Biol Chem, 284(7): 4112-4122, 2008.

124. Vavilova T.P., Gusarova I.N., Koroleva O.V., Medvedev A.E. The role of ceruloplasmin in neoplastic processes. Biomed Khim, 51(3): 263-275, 2005.

125. Wyman S., Simpson R.J., McKie A.T., Sharp P.A. Dcytb (Cybrdl) functions as both a ferric and a cupric reductase in vitro // FEBS Lett, 582(13): 1901-1906, 2008.

126. Xue Y., Davis A., Balakrishnan G., Stasser J., Staehlin В., Focia P., Spiro Т., Penner-Hahn J., O'Halloran T. Cu(I) recognition via cation-pi and methionine interactions in CusF // Nat Chem Biol, 4(2): 107-109, 2008.

127. Yonkovich J., Mckenndry R., Shi X., Zhu Z. Copper Ion-sensing Transcription Factor Maclp Post-translationally Controls the Degradation of Its Target Gene Product Ctrlp // J Biol Chem, 277(27): 23981-23984, 2002.

128. Yoshimura S, Tamaoki N, Ueyama Y, Hata J. Plasma protein production by human tumors xenotransplanted in nude mice // Cancer Res, 38(10): 3474-3478, 1978

129. Zhou В., Gitschier J. hCTRl: a human gene for copper uptake identified by complementation in yeast// Proc Nat Acad Sci USA, 94(14): 7481-7486, 1997.

130. Zhou H., Cadigan K.M., Thiele DJ. A Copper-regulated Transporter Required for Copper Acquisition, Pigmentation, and Specific Stages of Development in Drosophila melanogaster // J Biol Chem, 278(48): 48210-48218, 2003.

131. Zimniclca A.M., Maryon E.B., Kaplan J.H. Human copper transporter hCTRl mediates basolateral uptake of copper into enterocytes: implications for copper homeostasis // J Biol Chem, 282(36): 26471-26480, 2007.

132. Zhu Z., Labbe S., Репа M., Thiele D.J. Copper Differentially Regulates the Activity and Degradation of Yeast Macl Transcription Factor // J Biol Chem, 273(3): 1277-1280, 1998.

133. Zisowsky J., Koegel S., Leyers S., Devarakonda K, Kassack M.U., Osmak M., Jaehde U. Relevance of drug uptake and efflux for cisplatin sensitivity of tumor cells // Biochem Pharmacol, 73(2): 298-307, 2007.

134. Бабич 77. Метаболизм меди в мозгу крыс при различных состояниях организма. Кан. Дис. // НИИЭМ РАМН, СПб, 2008.

135. Васин А., Платонова Н., Повалихин Р., Клотченко С., Самсонов С., Цымбаленко И., Пучкова Л. Митохондриальный церулоплазмин млекопитающих // Мол Биол, 39(1): 42-52, 2005.

136. Клотченко С. Анализ структуры и экспрессии псевдогена церулоплазмина человека. Диссертация на соискание учёной степеникандидата биологических наук // ГУ НИИЭМ РАМН, Санкт-Петербург, 139 е., 2008.

137. Коттон Ф., Уилкинсон Дж. Современная неорганическая химия. М.: Мир, 1969. т. 3.592 с.

138. Платонова И.А., Жигулева Э.А., Цымбсшенко Н.В., Мищенко Б.С., Васин А.В., Живулько Т. В., Пучкова Л.В. Возрастные особенности биосинтеза и распределения церулоплазмина в организме крыс // Онтогенез. 2004, 35, 3: 171-182. •

139. Пучкова Л., Алейникова Т., Цымбаленко Н., Захарова Е., Конописцева Л., Чеботарь И., Гайтцхоки В. Биосинтез и секреция церулоплазмина клетками молочной железы в период лактации // Биохимия, 59(2): 341-348, 1994.

140. Пучкова Л., Платонова Н. Механизм, обеспечивающий гомеостаз меди у эукариотов, и его связь с транспортом железа // Усп совр биол, 123(1): 41— 58, 2003.

141. Слесарев В.И. Химия: Основы химии живого. СПб: Химиздат, 2000. 768 с.