Механизм локализации мРНК нового гена Germes в оогенезе шпорцевой лягушки Xenopus laevis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Пономарев, Максим Борисович

• Пономарев, Максим Борисович
• кандидат биологических наук
• 2006

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Пономарев, Максим Борисович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Биологическая роль локализованных РНК

Локализующиеся РНК как детерминанты развития

Drosophila

Xenopus

Асцидии

Daniorerio 10 Роль локализующихся РНК в специализации клеток половой линии

Формирование зародышевой плазмы у Drosophila

Формирование зародышевой плазмы у Xenopus

Зародышевая плазма у других организмов

Механизмы локализации РНК в клетке

Свободная диффузия и локальное заякоривание

Локализация РНК с помощью деградации

Активный транспорт

Drosophila

Xenopus

Активный транспорт в соматических клетках

Регуляция транспорта и локализации РНК

Цис-действующие последовательности

Транс-действующие факторы

Staufen hnRNP

Регуляция трансляции локализующихся мРНК

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение зародышевого материала лягушки 35 Анализ пространственной и временной экспрессии транскриптов, соответствующих кДНК фрагментам, с помощью метода обратной транскрипции РНК и

ПЦР амплификации (RT-PCR)

Клонирование полноразмерной кДНК Germes

Получение 3 '- области кДНК Germes с помощью 3 '-RACE

Получение 5 '- области кДНК Germes с помощью 5 '-RACE 38 Клонирование полноразмерной кДНК Germes с помощью RT-PCR

Приготовление ДНК конструктов для синтеза РНК

Микроинъекции

Получение ооцитов для микроинъекций

Синтез флуоресцентной РНК 42 Получение конфокального изображения живых ооцитов инъецированных флуоресцентной РНК

Метод сшивки с помощью ультрафиолета

Получение белкового экстракта из ооцитов

Синтез радиоактивно меченой РНК

Связывание белковых факторов с РНК

Манипуляции с ДНК, клонирование ДНК

Электрофорез в агарозном геле

Рестрикция

Зачистка концов фрагментом Кленова

Дефосфорилирование

Лигирование

Трансформация компетентных клеток

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 49 Идентификация и клонирование кДНК нового гена, транскрипт которого локализован на вегетативном полюсе ооцитов и ранних эмбрионов Xenopus laevis 49 Исследование механизма локализации мРНК Germes на вегетативный полюс ооцита

Поиск цис-действующих последовательностей мРНК Germes 54 Исследование белковых факторов, взаимодействующих с З'НТО мРНК Germes

ВЫВОДЫ

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Пономарев, Максим Борисович

1) Клонирована нолноразмерная кДНК нового гена, Germes, транскринт которого

локализован на вегетативном нолюсе зрелых ооцитов и ранних эмбрионов шпорцевой

лягушки Xenopus laevis. Определена нуклеотидная последовательность кДНК гена. Предсказана структура кодируемого белка. 2) мРНК Germes локализуется на вегетативный полюс яйца во время оогенеза за

счет раннего механизма транспорта РНК. Предсказаны цис-действующие

последовательности, ответственные за локализацию транскрипта, находящиеся в его

З'НТО, и представляющие собой три кластера из САС-повторов. Все три кластера

являются необходимыми, но недостаточными для локализации мРНК Germes в МО и на

вегетативный нолюс ооцита. 3) Предсказаны вторичные структуры, образующиеся в З'НТО мРНК Germes и ее

цис-действующих последовательностях. Изучен характер поведения РНК, содержащих

кластеры из САС-повторов, и потенциальные вторичные структуры, являющиеся

претендентами на роль сигналов локализации в ооцитах Xenopus laevis. РНК,

соответствующая последовательности, обозначенной нами как Lbc', показала нетипичное

новедение при инъекциях в ооциты - образование крупных агрегатов в цитоплазме, их

локализацию в кортикальном слое и околоядерной области ооцитов ранних стадий. Предноложительно, Lbc' является цис-действующей последовательностью мРНК Germes,

ответственной за локализацию по позднему пути. 4) Исследованы белковые факторы, специфично взаимодействующие с З'НТО

мРНК Germes и ее цис-действующими последовательностями. Установлено, что Lbc'

является минимальной цис-действующей последовательностью, с которой связывается

набор белков, идентичный набору белков связываемых с З'НТО мРНК Germes. Разные

части последовательности Lbc' — Lb и с', образующие предсказанные вторичные

структуры, связывают разные наборы белков, предполагая участие этих структур в роли

сигналов локализации. Среди белков, связывающихся с З'НТО мРНК Germes, обнаружены

ранее не онисанные белки с молекулярными весами 30,45, 57 и 65 кДа, обозначенные

нами как рЗО, р45, р57 и р65, соответственно. За связывание с белком р45 отвечает Lb, а с

рЗО - носледовательность с'. Белки р57 и р65 связываются с обеими частями Lbc'. 5) Сравнительный анализ белковых факторов, связывающихся с З'НТО мРНК

Germes и с цис-носледовательностями Xcat2 и Vgl мРНК показал, что белки рЗО, р45, р57

и р65 являются, предположительно новыми транс-факторами, припимающие участие в

раннем механизме локализации мРНК Germes и Xcat2.