Экспрессия компонентов донервной серотонинергической системы в эмбриогенезе шпорцевых лягушек и морских ежей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.01, кандидат биологических наук Никишин, Денис Александрович

• Никишин, Денис Александрович
• кандидат биологических наук
• 2013

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Никишин, Денис Александрович

Оглавление

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Цель и задачи исследования

Научная новизна

Теоретическое и практическое значение

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Донервные трансмиттеры

Состав серотонинергической системы в нервных клетках

Система синтеза

Система везикулярного транспорта

Рецепторы

Система обратного захвата

Система деградации

Функции серотонина в раннем донервном эмбриогенезе

Оогенез

Деления дробления

Межбластомерные взаимодействия

Функции серотонина в позднем донервном эмбриогенезе

Гаструляция

Лево-правая асимметрия

Ресничная моторика

Механизмы донервных эффектов серотонина

Серотонин в эмбриогенезе

Динамика серотонина в раннем развитии

Локализация серотонина в клетках ранних эмбрионов

Компоненты серотонинергической системы в эмбриогенезе

Рецепторы серотонина

Транспортеры серотонина

Ферменты синтеза и деградации серотонина

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Реактивы, использованные в работе

Лабораторное оборудование

Экспериментальные процедуры

Получение и фиксация проб

Обратная транскрипция и ПЦР

Молекулярное клонирование

Гибридизация in situ

Иммуногистохимическое выявление серотонина

РЕЗУЛЬТАТЫ

Экспрессия и функциональная активность компонентов серотонинергической системы в раннем развитии морских ежей

Экспрессия компонентов серотонинергической системы в нормальном развитии Xenopus

Рецепторы

Транспортеры

Ферменты синтеза и деградации

Уровень и динамика экспрессии компонентов серотонинергической системы в раннем развитии Xenopus

Пространственное распределение мРНК компонентов серотонинергической системы в ранних эмбрионах Xenopus

Экспрессия компонентов серотонинергической системы на уровне трансляции

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Экспрессия компонентов донервной серотонинергической системы в эмбриогенезе шпорцевых лягушек и морских ежей»

Введение

Один из классических нейромедиаторов, серотонин выполняет, помимо нейротрансмиссии, множество ненервных функций, в том числе участвует в важнейших процессах индивидуального развития. Серотонинергическая сигнальная система хорошо изучена на нервных клетках взрослых млекопитающих: для всех ее компонентов известны гены, нуклеотидные и аминокислотные последовательности, достаточно хорошо изучены структура и механизмы их функционирования. Исследованы механизмы некоторых ненервных функций серотонина, в частности его роль в системе свертывания крови и регуляции тонуса сосудов. Однако, несмотря на то, что первые работы, демонстрирующие важную роль серотонина в процессах эмбрионального развития, были опубликованы более 50 лет назад, исследования в этой области до сих пор остаются немногочисленными и разрозненными. На сегодняшний день известно, что серотонин присутствует в эмбрионах, начиная с самых ранних стадий развития, и имеется множество данных о специфических эффектах серотонина и его аналогов, свидетельствующие об участии серотонина в процессах раннего эмбрионального развития. Однако очень мало известно о том, какие компоненты составляют донервную эмбриональную серотонинергическую систему, и каковы механизмы действия серотонина на те или иные процессы раннего развития.

Актуальность проблемы

В настоящее время существует фронт работ по изучению ранних этапов онтогенеза. Это связано как с общим интересом к собственно раннему развитию, так и, в частности, с большим сходством в поведении эмбриональных и опухолевых тканей. В свете современных достижений в этих областях на первый план выходит выяснение молекулярных основ раннего развития. Важное место в этих работах занимает изучение сигнальных путей, контролирующих ранние этапы эмбрионального развития.

7

Учитывая широкий спектр функций серотонина и множество его эмбриональных эффектов, можно полагать, что серотонин является одним из сигнальных веществ, регулирующих раннее развитие. Исследование донервной эмбриональной серотонинергической системы на молекулярном уровне может пролить свет на механизмы серотонинергической регуляции раннего развития.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы заключается в обзорном исследовании экспрессии компонентов донервной серотонинергической системы в раннем эмбриогенезе двух классических объектов биологии развития - шпорцевой лягушки Хепорш и морского ежа. Для ее достижения были поставлены следующие задачи:

• исследовать экспрессию генов, гомологичных компонентам серотонинергической системы, в раннем развитии морских ежей и функциональную активность компонентов, экспрессирующихся на ранних стадиях развития;

• исследовать экспрессию генов компонентов серотонинергической системы в нормальном развитии Хепорш и выявить гены, экспрессирующиеся на ранних стадиях развития, для дальнейшего исследования;

• исследовать количественно уровень и динамику экспрессии этих генов в течение раннего развития Хепорш;

• исследовать пространственное распределение в ранних эмбрионах Хепорш мРНК генов серотонинергической системы;

• исследовать на уровне трансляции экспрессию генов серотонинергической системы, выявленных в раннем эмбриогенезе Хепорш;

• выявить возможные источники материнского серотонина в ооцитах Хепорш путем анализа экспрессии генов ферментов синтеза серотонина.

Научная новизна

На классической экспериментальной модели - эмбрионах Xenopus впервые проведено комплексное исследование донервной эмбриональной серотонинергической системы. Впервые была исследована экспрессия всех компонентов серотонинергической системы на одном экспериментальном объекте. Показано, что на ранних стадиях развития Xenopus, в составе материнской мРНК экспрессируются основные компоненты, необходимые для осуществления сигнальной функции - везикулярный транспортер VMAT2, рецепторы HTR1E, HTR2C, HTR5 и HTR7 и транспортер обратного захвата SERT, а также ферменты синтеза серотонина ТРН2 и AAAD. Впервые получены и опубликованы частичные последовательности мРНК HTR1E, HTR5 и SERT X. laevis (NCBI Nucleotide ID: КС477213, КС477214 и JQ001861). Количественно исследованы уровень, динамика экспрессии и пространственное распределение транскриптов основных компонентов серотонинергической системы в ранних эмбрионах Xenopus, и их экспрессия на уровне трансляции. Показано, что на ранних стадиях эмбриогенеза Xenopus не экспрессируется основной фермент деградации серотонина МАО А. Выявлено, что ферменты синтеза серотонина экспрессируются как в ооцитах на ранних стадиях оогенеза, так и в фолликулярных оболочках.

Впервые проведен анализ экспрессии гомологов генов компонентов

серотонинергической системы в раннем развитии морских ежей, являющихся

классическим объектом исследования донервных функций

нейротрансмиттеров. Показано, что на ранних стадиях развития

экспрессируются гомологи рецепторов серотонина четырех типов,

транспортера серотонина SERT, фермента деградации серотонина МАО А и в

течение донервного развития начинают экспрессироваться гомологи

везикулярного транспортера моноаминов VMAT, и ферментов синтеза

серотонина. Впервые получены и опубликованы частичные

последовательности мРНК SERT, VMAT P. lividus. Функциональная

активность компонентов систем синтеза и обратного захвата подтверждена

9

экспериментально. Полученные результаты являются первыми молекулярно-биологическими свидетельствами экспрессии компонентов серотонинергической системы в раннем развитии морских ежей.

Теоретическое и практическое значение

В работе получены результаты, представляющие фундаментальный научный интерес. В частности, продемонстрировано, что экспрессирующиеся в раннем развитии рецепторы серотонина гомологичны или идентичны дефинитивным рецепторам нервных клеток. Показана экспрессия на ранних донервных стадиях развития нейральной формы фермента синтеза серотонина. Показано, что набор типов рецепторов серотонина, экспрессирующихся в раннем развитии, консервативен, по крайней мере, среди позвоночных. Выполнено исчерпывающее сравнительное обзорное исследование, в результате которого выявлены гены серотонинергической системы, экспрессирующиеся на ранних стадиях развития и, возможно, принимающие участие в реализации донервных функций серотонина. Полученные результаты могут быть использованы как основа для дальнейших практических и теоретических исследований донервных функций серотонина и других нейротрансмиттеров. Разработанный методический подход может быть использован для исследования других нейротрансмиттерных систем в раннем развитии.

Заключение диссертации по теме «Физиология», Никишин, Денис Александрович

Обсуждение результатов

Целью данной работы было обзорное исследование компонентного состава серотонинергической системы в донервном развитии животных на примере двух классических объектов биологии развития - морских ежей и шпорцевых лягушек. Для ранних стадий развития, как морских ежей, так и амфибий характерно отсутствие в клеточном цикле фаз G1 и G2 и процесса транскрипции. При этом все процессы раннего развития происходят за счет материнских мРНК и белков, накопленных в течение оогенеза, которые осуществляют основные биосинтетические процессы в ранних эмбрионах, контролируют деления дробления и определяют первоначальные клеточные судьбы и разметку зародыша (см. Heasman, 2006). В процессе дальнейшего развития происходит так называемый материнско-зиготический переход (maternal-to-zygotic transition, MZT), в процессе которого элиминируются материнские мРНК и одновременно начинается трансляция зиготического генома (см. Tadros, Lipshitz, 2009). В развитии морских ежей MZT приходится на стадию мезенхимной бластулы. У Xenopus основная волна включения зиготического генома происходит на стадии средней бластулы, однако деградация материнской мРНК и транскрипция некоторых генов начинается гораздо раньше - на шестом клеточном цикле (Tadros, Lipshitz, 2009). Проведенное исследование экспрессии компонентов серотонинергической системы на разных стадиях развития Xenopus выявило гены, входящие в состав материнских мРНК, гены, начинающие транслироваться сразу после включения зиготического генома на стадии средней бластулы, и гены, экспрессирующиеся на поздних, нейральных стадиях развития. С точки зрения анализа ранних стадий развития, интерес представляют в первую очередь гены, экспрессирующиеся в составе пула материнской мРНК.

Рецепторы серотонина являются ключевым звеном в серотонинергическом сигнальном механизме. Исследовав весь набор известных рецепторов серотонина у Xenopus, мы показали, что на ранних стадиях эмбриогенеза экспрессируется четыре рецептора - HTR1E, HTR2C, HTR5 и HTR7. То, что мРНК этих рецепторов входит в состав материнской мРНК, позволяет полагать, что они принимают участие в процессах раннего развития. Некоторые рецепторы серотонина, например HTR1A и HTR3A, начинают экспрессироваться вскоре после включения зиготического генома, что по всей вероятности обусловлено их участием в процессах, происходящих в этот период развития, а именно в гаструляции и морфогенетических процессах, регуляция которых тоже входят в число ненервных функций серотонина, а также в процессах, имеющих отношение к нейрогенезу. Экспрессируемые в раннем донервном эмбриогенезе рецепторы серотонина являются метаботропными и сопряжены с G-белками, однако обладают разными механизмами трансдукции сигнала. HTR2C активирует фосфоинозитольную систему вторичных мессенджеров, тогда как HTR7 активирует аденилатциклазу, a HTR1E и HTR5 ингибируют ее. Как можно заметить, рецепторы серотонина, экспрессирующиеся в ранних эмбрионах, не только сопряжены с двумя важнейшими системами вторичных мессенджеров, но и действуют на одну из них противоположным образом.

На ранних стадиях развития морских ежей тоже был выявлен набор генов, которые в международном проекте GNOMON охарактеризованы как гомологи рецепторов серотонина. В состав пула материнской мРНК, как и у Xenopus, входят гомологи HTR1 и HTR2. Наряду с ними в раннем развитии Р. lividus экспрессируется гомолог HTR4, который по взаимодействию с системами вторичных мессенджеров аналогичен HTR7, экспрессирующемуся в раннем развитии Xenopus. Не исключено, что эти рецепторы могут выполнять в раннем эмбриогенезе схожие функции. Также в состав материнской мРНК входит транскрипт гена, являющегося гомологом рецептора серотонина неопределенного типа (HTRX). При более детальном

Таблица 4. Молекулярио-биологические данные об экспрессии рецепторов серотонина в раннем эмбриогенезе разных видов животных

Вид Ген Литературная ссылка

С. elegans HTR2 (Hamdan et al., 1999)

Дрозофила HTR2 (Colas et al., 1999a)

Морской еж P. lividus HTR1A HTR2B HTR4 HTRX (Никишин и др., 2012), настоящая работа

Данио HTR1A (Nikishin et al., 2009)

Xenopus HTR1E HTR2C HTR5 HTR7 (Nikishin et al., 2012), настоящая работа

Мышь HTR1D (Veselá et al., 2003)

HTR5 (Hinckley etat., 2005)

HTR7 (Amireault, Dubé, 20056)

Хомяк HTR2A (Miyazaki et al., 1990)

Человек HTR2A (Neilson et al., 2000)

анализе аминокислотных последовательностей этих генов с помощью электронного онлайн сервиса НММТОР (Tusnädy, Simon, 2001) было выявлено, что все 4 гена действительно кодируют семидоменные GPCR, однако ни один из них не содержит в третьем трансмембранном домене остатка аспартата, консервативного для метаботропных рецепторов серотонина (Shi, Javitch, 2002). С учетом этого факта, пока обсуждаемые рецепторы не охарактеризованы экспериментально, вопрос об экспрессии рецепторов серотонина на в раннем развитии морских ежей остается открытым.

Интересно сопоставить полученные нами данные об экспрессии серотониновых рецепторов, экспрессирующихся в раннем развитии шпорцевых лягушек и морских ежей, с имеющимися литературными данными, полученными на других видах (см. Табл. 4). Наиболее подробно исследована в этом отношении мышь, для доимплантационного развития которой показана экспрессия HTR1D, HTR5 и HTR7 (Veselä et al., 2003; Hinckley et al., 2005; Amireault, Dube, 20056). Как можно заметить, в раннем

развитии мыши тоже одновременно экспрессируются рецепторы, действующие на аденилатциклазу противоположным образом, причем два из них (HTR5 и HTR7) тех же типов, что и рецепторы, экспрессирующиеся в раннем развитии у Xenopus, а третий (HTR1D) - того же типа, но другого подтипа. При этом, в отличие от Xenopus, в раннем развитии мыши не экспрессируется ни один из подтипов HTR2 (Amireault, Dubé, 20056). Однако показано, что HTR2A экспрессируется в ооцитах хомячка и человека (Miyazaki et al, 1990; Neilson et al., 2000). В пределах класса позвоночных подобное исследование проводилось также на данио, для которого показана экспрессия HTR1A (Nikishin et al, 2009). Сопоставив вышеизложенные данные, с учетом их неполноты, и допуская некоторые исключения, можно постулировать, что для раннего развития позвоночных характерна экспрессия рецепторов серотонина 1, 2, 5 и 7 типов. На беспозвоночных животных литературные данные еще более скудные (см. Табл. 4). Тем не менее, в раннем эмбриогенезе С. elegans и дрозофилы выявлена экспрессия гомологов HTR2 (Hamdan et al, 1999; Colas et al, 1999a). Таким образом, у всех исследованных на этот счет животных, кроме мыши, в раннем эмбриогенезе экспрессируется рецептор серотонина 2 типа. Учитывая полученные нами данные о возможной экспрессии гомолога HTR2B в раннем развитии морских ежей, можно полагать, что экспрессия тех или иных подтипов HTR2 является характерной для раннего развития всех животных.

Как мы видим, донервная серотонинергическая система включает

несколько возможных механизмов функционирования, опосредованных

несколькими рецепторами серотонина, одновременно экспрессирующихся в

ранних эмбрионах. Стоит отметить, что на ранних стадиях донервного

развития, наряду с серотонином, присутствуют и функционально активны и

другие нейротрансмиттеры - ацетилхолин, адреналин, норадреналин,

дофамин, гистамин (Бузников, 1967; Шмуклер и др., 1988). Молекулярно-

биологическими методами показано, что на ранних стадиях развития мыши

экспрессируются рецепторы адреналина а2С, ингибирующий

73

аденилатциклазу, |32 и (33, активирующие ее (СЛкоэ е? а1, 2011). В раннем эмбриогенезе Хепорт тоже экспрессируется рецептор адреналина |31 (Беую а!., 1997). В раннем эмбриогенезе морского ежа экспрессируются гомологи никотиновых рецепторов ацетилхолина (субъединицы а! и а 10) (Никишин и др., 2012). Таким образом, для ранних стадий донервного эмбриогенеза характерна не только множественность трансмиттерных систем, но и их комплексность и, по всей вероятности, многофункциональность. Учитывая, что рецепторы разных трансмиттеров сопряжены с одними и теми же системами вторичных мессенджеров, очевидно, что трансмиттеры в раннем эмбриогенезе функционально могут быть в синергических или антагонистических отношениях. Очевидно, что для одновременного функционирования этих рецепторов в одной клетке, необходима сложная регуляция их функционирования, за счет чего эти рецепторы могут экспрессироваться на разном уровне, иметь разную локализацию, по-разному компартментализоваться.

Для того чтобы лучше разобраться в донервной серотонинергической

системе, было проведено количественное исследование экспрессии

рецепторов серотонина, экспрессирующихся в раннем эмбриогенезе Хепорш.

В частности, исследовали динамику экспрессии рецепторов в течение

эмбрионального развития. Даже по результатам ОТ-ПЦР анализа можно

заметить, что динамика экспрессии исследуемых рецепторов в ходе

эмбриогенеза различается: уровень экспрессии НТЯ1Е и НТК2С резко падает

к поздним стадиям развития, а НТЯ5, наоборот, растет, тогда как НТЯ7

экспрессируется примерно на одном уровне в течение всего эмбриогенеза.

Количественное исследование динамики экспрессии этих генов методом

ПЦР в реальном времени подтвердило эту предварительную оценку. Для того

чтобы оценить динамику экспрессии генов с учетом времени, результаты

представили в виде графика (Рис. 21), на котором по оси ординат

откладывали значения относительной экспрессии, а по оси абсцисс - время

наступления соответствующей стадии X. 1аеч1$ при 28°С. На графике видно,

74

что уровень экспрессии НТШЕ стремительно понижается на ранних стадиях и постепенно достигает минимума на стадии нейрулы. Приблизительно та же динамика наблюдается у НТЯ2С. Относительная экспрессия НТЮ до стадии нейрулы находится примерно на одном уровне, после чего медленно уменьшается к вылуплению. Существенно отличается динамика экспрессии НТЯ5, которая минимальна на ранних стадиях развития и начинает

А

Время, ч

—ф— нтше —нтагс -о-тиБ -о-тш

Б

Время, ч

—УМАТ2 —-З-БЕт"

Рисунок 21. Временная динамика экспрессии (А) рецепторов и (Б) транспортеров серотонина в эмбриогенезе Хепорш

постепенно расти после стадии средней бластулы, т. е. после включения зиготического генома.

Исследование пространственной локализации транскриптов в ранних эмбрионах показало, что из четырех рецепторов серотонина, экспрессирующихся на ранних стадиях развития, существенным анимально-вегетативным градиентом обладает только HTR5, в большей степени экспрессирующийся в вегетативной области. Такое распределение мРНК вероятно связано с тем, что функции HTR5 приурочены к вегетативной области ранних зародышей. Следует отметить, что в этой области происходят важнейшие индукционные процессы, определяющие первичную разметку презумптивных частей зародыша, в частности, ньюкуповская мезодермальная индукция (Nieukoop, 1969 - цит. по Gilbert, 2006). Не исключено, что серотонин вовлечен в эти процессы посредством HTR5.

Использование метода ПЦР в реальном времени позволило оценить уровень экспрессии рецепторов в составе пула материнской мРНК. Было выявлено, что на ранних стадиях по сравнению с другими рецепторами больше всего представлен HTR7, количество мРНК которого составляет 5% от ODC, при этом уровень экспрессии HTR1E меньше в 15 раз, HTR5 - в 327 раз, a HTR2C - в 2450 раз (см. Рис. 15). Как мы видим, уровень экспрессии четырех рецепторов очень сильно различается.

Исследование полирибосомальной и информосомной фракций мРНК,

выделенных из гаструл и сопоставление полученных результатов с

динамикой экспрессии этих генов на данной стадии выявило интересную

закономерность. Транскрипты HTR2C присутствуют в полирибосомальной

фракции, т.е. транслируются, тогда как на этой стадии происходит падение

уровня экспрессии этого гена. С другой стороны, на стадии гаструлы уровень

экспрессии HTR7 не изменяется, и транскрипты этого гена не выявляются в

полирибосомальной фракции, т. е. не транслируются. Такая корреляция

между уменьшением экспрессии гена и его трансляцией подтверждается в

случае VMAT2 (см. ниже). Таким образом, мы наблюдаем, что на стадии

76

гаструлы процесс трансляции материнской мРНК сопровождается ее деградацией. Возможно, это связано с тем, что материнские мРНК на ранних стадиях эмбрионального развития маскированы белками, что предотвращает их деградацию и несвоевременную трансляцию (Spirin, 1994). В таком случае, демаскирование материнской мРНК, необходимое для ее трансляции, может привести и к ее деградации. Исходя из этого, можно предполагать, что на догаструляционных стадиях развития транслируются HTR2C и HTR1E, тогда как HTR7 и HTR5 вероятнее всего не транслируются.

С другой стороны, известно, что процесс трансляции мРНК зависит от длины «полиаденильного хвоста», которая регулируется регуляторными цис-элементами в составе 3' нетранслируемой области (3' UTR) мРНК: во время роста ооцита материнские мРНК, которые имеют в 3' UTR последовательность, регулирующую цитоплазматическое

полиаденилирование (cytoplasmic polyadenylation element, CPE), деаденилируются и не транслируются, в отличие от мРНК, не имеющих этой последовательности. Однако после активации созревания ооцита мРНК, имеющие СРЕ в составе 3' UTR, полиаденилируются и начинают транслироваться, тогда как мРНК без СРЕ наоборот, деаденилируются и выводятся из трансляционно активного пула транскриптов (Paynton, Bachvarova, 1994; Radford et al., 2008; Hake, Richter, 1994). Анализ последовательностей мРНК рецепторов серотонина, экспрессирующихся в составе материнской мРНК, с помощью электронного онлайн сервиса RegRNA (Chang et al., 2013) показал, что СРЕ есть в составе 3' UTR мРНК рецепторов HTR1E и HTR2C. Учитывая результаты исследования динамики их экспрессии в раннем развитии, эти рецепторы являются наиболее вероятными кандидатами на роль функциональных посредников серотонина в раннем развитии Xenopus.

Результаты исследования экспрессии везикулярных транспортеров моноаминов показали, что на ранних стадиях развития X. laevis экспрессируется VMAT2, а на ранних стадиях развития^ tropicalis - VMATN.

Исследование пространственной локализации мРНК VMAT2 методом ПЦР в реальном времени показало, что его экспрессия обладает выраженным анимально-вегетативным градиентом. Относительная экспрессия VMAT2 в анимальной шапочке в 6 раз больше, чем в вегетативной шапочке, причем в эпителиальном слое клеток его экспрессия в 1,7 раз больше, чем в субэпителиальном. Локализация серотонина на стадии бластулы повторяет этот паттерн. На стадии бластулы серотонин преимущественно локализован в анимальной шапочке и маргинальной зоне, причем в большей степени - в поверхностном эпителиальном слое клеток (Beyer et al., 2012). Таким образом, пространственное распределение экспрессии VMAT2 совпадает с распределеним серотонина.

Количественное исследование экспрессии VMAT2 в раннем развитии

X. laevis показало, что она максимальна на ранних стадиях развития

(составляя 43,9% от ODC), и падает после средней бластулы. Такая динамика

экспрессии, с учетом присутствия транскриптов во фракции полирибосом на

стадии гаструлы, свидетельствует о том, что VMAT2 транслируется на ранних

стадиях развития X. laevis. Анализ последовательности мРНК VMAT2

X. laevis с помощью электронного онлайн сервиса RegRNA (Chang et al.,

2013) выявил CPE в составе 3' UTR, а это значит, что, по всей вероятности,

VMAT2 транслируется при созревании ооцитов. Такой же результат получен

и для VMATN X. tropicalis. Существуют литературные данные,

свидетельствующие о том, что везикулярный транспортер функционален на

ранних стадиях развития Xenopus: внутри клеток ранних зародышей

серотонин локализован точечно, что может свидетельствовать о его

везикулярном расположении (Beyer et al., 2012). При микроинъекции

серотонина в зиготу, на стадии 16 бластомеров он локализуется

преимущественно в везикулах, расположенных по периферии зародыша

78

(Beyer et al., 2012). Таким образом, можно утверждать, что в клетках ранних эмбрионов осуществляется везикулярный транспорт серотонина, по всей вероятности осуществляемый VMAT2. Этот механизм позволяет устранить серотонин из цитоплазмы, где он может осуществлять внутриклеточные функции и вовлекаться в процесс серотонилирования или же деградировать. С другой стороны, серотонин, упакованный в везикулы, при их экзоцитозе, может осуществлять межклеточную сигнализацию.

Нами было показано, что при иммуноокрашивании серотонина в клетках бластул морского ежа серотонин тоже выявляется точечно (см. Рис. 6А), что свидетельствует об активности системы везикулярного транспорта серотонина в ранних эмбрионах морских ежей. Более того, инкубация эмбрионов в предшественнике серотонина приводит к увеличению количества везикул, которые частично локализованы вдоль латеральных межбластомерных поверхностей (см. Рис. 6В). По всей вероятности, такой характер локализации серотонина связан с выполнением им межклеточной сигнальной функции. Однако ген, гомологичный VMAT, начинает экспрессироваться на стадии гаструлы, и не экспрессируется на ранних стадиях развития P. lividus. Возможно, везикулярный транспорт серотонина у ранних эмбрионов осуществляется с помощью другой изоформы VMAT, кодируемой другим геном, или иным способом.

Проведенное нами исследование показало, что транспортер серотонина

SERT экспрессируется на протяжении всего эмбрионального развития обоих

видов Xenopus, однако до стадии нейрулы его экспрессия находится на очень

низком уровне. Гомолог SERT также экспрессируется в течение всего

эмбриогенеза морского ежа P. lividus. Более того, нами показано, что на

ранних стадиях развития морских ежей функционально активна система

обратного захвата серотонина (см. Рис. 6Б и Д). Экспрессия SERT и

способность захватывать серотонин из окружающей среды показана

экспериментально для ранних эмбрионов млекопитающих (Amireault, Dubé,

79

2005а), можно предполагать, что клетки ранних эмбрионов Xenopus также способны к обратному захвату серотонина, но вероятно на довольно низком уровне. Возможно, что за счет функционирования SERT, ооциты Xenopus накапливают из окружающей среды серотонин, синтезируемый в фолликулярных клетках, тромбоцитах или нервных терминалях. SERT является важным компонентом, вовлеченным в процесс посттрансляционной модификации белков посредством серотонилирования (Brenner et al, 2007; Ziu et al, 2012). То, что SERT экспрессируется и функционально активен на ранних стадиях развития, является указанием на то, что процессы серотонилирования и внутриклеточной серотониновой сигнализации могут играть роль в процессах раннего эмбриогенеза.

Проведенное исследование экспрессии ферментов синтеза серотонина показало, что на ранних стадиях развития Xenopus экспрессируются оба фермента, необходимые для синтеза серотонина из триптофана - ТРН2 и AAAD. В результате BLAST-анализа базы данных EST экспрессия основных ферментов синтеза серотонина выявлена в донервном эмбриогенезе морских ежей только на стадии бластулы. Тем не менее, нами экспериментально показано, что оба фермента синтеза серотонина функционально активны в ранних эмбрионах морского ежа P. lividus (см. Рис. 6В, Г и Д). То, что серотонин может синтезироваться при инкубации в НТР, показано экспериментально также на ранних эмбрионах моллюсков и кольчатых червей (Buznikov et al, 2003; Emanuelsson, 1974). Экспрессия триптофангидроксилазы тоже второго типа продемонстрирована на мыши (Basu et al, 2008). Как мы видим, наличие системы синтеза серотонина характерно для ранних эмбрионов самых разных групп животных. Полученные результаты свидетельствует о том, что ранние эмбрионы, возможно, способны как захватывать серотонин из окружающего пространства с помощью SERT, так и синтезировать его самостоятельно, причем как из НТР, так и непосредственно из триптофана.

Серотонин у Xenopus присутствует уже на стадии яйцеклетки, т.е. накоплен еще в течение оогенеза (Fukumoto et al., 2005а). Материнский серотонин характерен для яйцеклеток множества видов (см. Бузников, 1987). Его источником могут быть как сами ооциты, так и окружающие ооцит фолликулярные оболочки. Мы показали, что ферменты синтеза серотонина экспрессируются и в ооцитах на ранних стадиях оогенеза, и в фолликулярных оболочках. Таким образом, серотонин могут синтезировать сами яйцеклетки в течение оогенеза, либо он синтезируется в окружающих яйцеклетки тканях яичника, и попадает в яйцеклетки путем обратного захвата из окружающей среды или же через щелевые контакты, связывающие во время оогенеза яйцеклетку с фолликулярными клетками (Browne, Werner, 1984). Интересно, что в яйцеклетках и в фолликулярных оболочках экспрессируются разные типы триптофангидроксилазы, причем в яйцеклетках, как и в эмбрионах, это ТРН2, являющаяся нейральным типом фермента, характерным для нервных клеток. Точно такое же распределение экспрессии типов ТРН наблюдается у мыши (Amireault, Dubé, 2005а; Basu et al., 2008). При этом на нокаутных моделях мыши показано, что устранение большинства компонентов серотонинергической системы,

экспрессирующихся в мышиных яичниках, не приводит к инфертильности или ранним эмбриональным аномалиям, то есть несущественны или эффективно компенсируются (Dubé, Amireault, 2007). Единственное исключение - ТРН1, нокаут которой в мышах-матерях приводит к значительному уменьшению размеров эмбрионов и морфогенетическим нарушениям (Côté et al., 2007). То есть, именно материнский серотонин, который синтезируется в фолликулярных клетках, является важным регулятором эмбриогенеза у мышей.

Исследование экспрессии МАО А показало, что этот фермент не

экспрессируется в развитии X. laevis до стадии нейрулы. Таким образом, в

ранних эмбрионах Xenopus серотонин не деградирует и инактивируется

81

каким-либо иным способом, вероятно, накапливаясь в везикулах с помощью везикулярного транспортера (см. выше). При этом, анализ базы данных EST показал, что несколько генов, гомологичных МАОА, экспрессируется на ранних стадиях развития морских ежей. По всей видимости, отсутствие или наличие системы деградации серотонина не является характерным для ранних стадий эмбрионального развития.

Таким образом, получены свидетельства того, что в донервном эмбриогенезе шпорцевых лягушек и морских ежей, в том числе на его ранних стадиях, экспрессируются компоненты серотонинергической системы, составляющие систему синтеза, везикулярного транспорта, рецепции и обратного захвата серотонина. Компоненты системы деградации серотонина экспрессируются в раннем эмбриогенезе морских ежей, но, по всей видимости, отсутствуют на ранних стадиях развития Xenopus. В любом случае, экспрессируемые компоненты способны составить функциональную серотониновую сигнальную систему классического (синаптического) типа. Стоит отметить, что серотонин, являясь сигнальным веществом, обладает всеми свойствами морфогена - это маленькая молекула, способная к диффузии и установлению градиента, имеющая специфические рецепторы. Серотонин и экспрессирующиеся компоненты серотонинергической системы, по всей вероятности, составляют одну из сигнальных систем, регулирующих процессы раннего развития.

Одним из таких процессов является созревание ооцитов, которое у

позвоночных зависит от уровня цАМФ (Conti et al, 2002). Показанная в

данной работе экспрессия рецепторов, модулирующих активность РКА, в

составе пула материнской мРНК, говорит в пользу возможного участия

серотонина в этом процессе. По литературным данным известно, что

серотонин ингибирует прогестерон-зависимое созревание ооцитов Xenopus

(Buznikov et al, 1993; Sheng et al, 2005). В составе материнских мРНК

экспрессируются как HTR7, который активирует аденилатциклазу,

82

следовательно, должен ингибировать созревание, так и HTR1E и HTR5, которые ингибируют ее, что должно активировать созревание. Однако то, что мРНК HTR1E имеет СРЕ в составе 3' UTR и поэтому вероятно не транслируется до индукции созревания, и то, что HTR5 экспрессируется на гораздо более низком уровне, чем HTR7, позволяет полагать, что эффект серотонина на созревание ооцитов, прежде всего, опосредован HTR7, следовательно, является ингибирующим, что согласуется с литературными данными.

На эмбрионах Xenopus также показано, что цАМФ через активность РКА регулирует такие ранние эмбриональные функции как клеточный цикл делений дробления (Grieco et al, 1994). Также известно, что локальная активация РКС приводит к динамическим локальным изменениям кортикального цитоскелета (см. Larsson, 2006). Возможно, что серотонинергическая регуляция клеточного цикла и состояния цитоскелета клеток ранних эмбрионов, в частности жесткости цитокортекса, происходит с участием рецепторов серотонина, экспрессирующихся на ранних стадиях развития Xenopus и модулирующих активность РКА и РКС.

На более поздних донервных стадиях развития Xenopus (после

включения зиготического генома) набор серотониновых рецепторов

пополняется HTR1A и HTR3A, что по всей вероятности может быть связано с

серотонинергической регуляцией на этих стадиях развития. Известно, что

серотонин вовлечен в процесс установления лево-правой асимметрии (ЛПА)

зародышей Xenopus, причем фармакологический скрининг антагонистов

серотониновых рецепторов показал, что в этом отношении активны

антагонисты рецепторов HTR3 и HTR4 (Fukumoto et al., 2005а). Однако HTR4

начинает экспрессироваться на стадии нейрулы, когда ЛПА уже установлена,

a HTR3A - после включения зиготического генома на стадии поздней

бластулы. Рецептор серотонина 3 типа является пентамерным ионным

каналом, причем для его функциональности необходимо наличие

субъединицы HTR3A (Boyd et al., 2002). Экспрессия HTR3A на поздних

83

донервных стадиях развития свидетельствует в пользу того, что серотонинергическая регуляция ЛПА происходит через рецептор 3 типа. В литературе имеется экспериментальный анализ участия HTR3 в ЛПА у Xenopus. Нокдаун HTR3 приводит к нарушению асимметричной экспрессии гена Pitx2c, исчезновению левонаправленного течения, вызванного биением ресничек клеток дна гастроцеля (GRP, gastrocoel roof plate) и нарушению экспрессии генов Foxj 1 и ХпЗ в этой области. В работе продемонстрировано, что в процессе дифференцировки GRP серотонин взаимодействует с каноническим Wnt-сигнальным путем на уровне лигандов и/или рецепторов (Beyer et al, 2012). Кроме того, фармакологические эксперименты показали активность антагонистов VMAT в отношении ЛПА (Fukumoto et al, 20056). Везикулярный транспорт серотонина происходит против протонного градиента, поэтому зависит от работы ЬГ-АТФазы. Известно, что активность ЬГ-АТФазы вовлечена в ЛПА и необходима для активации «сигналосом» в процессе канонической Wnt-сигнализации (Adams et al, 2006). На основе этих данных можно полагать, что везикулярный транспортер VMAT2, экспрессируемый на ранних стадиях развития Xenopus, также является одним из важных звеньев серотонинергической регуляции лево-правой асимметрии у Xenopus.

Таким образом, в данной работе показана экспрессия основных компонентов классического (синаптического) серотонинергического механизма на ранних стадиях развития Xenopus, что дает основание предполагать существование на этом этапе системы, близкой по своим характеристикам к дефинитивной серотонинергической системе. При этом показана сложность донервной серотонинергической системы, имеющей несколько рецепторов, экспрессирующихся в одной клетке, что, в совокупности с множественностью трансмиттерных систем на ранних донервных стадиях эмбрионального развития, существенно отличает

эмбриональную серотонинергическую систему от дефинитивной.

84

Полученные результаты позволяют предполагать, что более общие эмбриональные регуляторные функции серотонина являются филогенетическими предшественниками его более специализированной нейротрансмиттерной функции. Наконец то, что при всех различиях, серотонинергическая система представлена в донервном эмбриогенезе таких эволюционно далеких групп животных, как амфибии и морские ежи, говорит о том, что донервные регуляторные функции серотонина являются фундаментальными и универсальными.

Выводы

• На ранних стадиях эмбрионального развития морских ежей экспрессируются гены, гомологичные компонентам систем синтеза (фенилаланин/триптофан гидроксилаза, AAAD), рецепции (HTR1A, HTR2B, HTR4 и рецептор серотонина неизвестного типа HTRX), обратного захвата (SERT) и деградации {МАОА) серотонина. Функциональная активность систем синтеза и обратного захвата серотонина подтверждена экспериментально.

• На ранних стадиях эмбрионального развития Xenopus экспрессируются гены следующих компонентов серотонинергической системы: ферменты синтеза ТРН2 и AAAD, везикулярный транспортер VMAT2, рецепторы серотонина HTR1E, HTR2C, HTR5 и HTR7, транспортер серотонина SERT.

• Уровень экспрессии мРНК компонентов донервной эмбриональной серотонинергической системы Xenopus в пуле материнской мРНК различается приблизительно на порядок в ряду VMAT2 > HTR7 > HTR1E > HTR5 > HTR2C, SERT. Экспрессия VMAT2, HTR1E и HTR2C уменьшается в процессе раннего развития, тогда как экспрессия HTR5, HTR7 и SERT на ранних стадиях развития держится на одном уровне.

• Экспрессия HTR1E, HTR2C, HTR7 и SERT не имеет выраженных различий вдоль анимально-вегетативной оси, тогда как экспрессия HTR5 и VMAT2 обладает выраженным анимально-вегетативным градиентом, причем HTR5 больше в вегетативной области, a VMAT2 - в анимальной. Экспрессия VMAT2 больше в эпителиальном слое клеток крыши бластоцеля, чем в субэпителиальном, тогда как экспрессия HTR1E, HTR2C, HTR5, HTR7 и SERT не различается между этими группами клеток.

• На стадии гаструлы мРНК НТЯ2С и УМАТ2 транслируются, тогда как мРНК #77? 7 не транслируется и полностью локализована в информосомах. мРНК НТЯ1Е, НТЯ2С и УМАТ2 имеет мотив, необходимый для трансляции во время созревания ооцитов.

• Ферменты синтеза серотонина экспрессируются как в ооцитах на ранних стадиях оогенеза, так и в фолликулярных оболочках, причем в ооцитах экспрессируется ТРН2, а в фолликулярных оболочках -ТРН1.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Никишин, Денис Александрович, 2013 год

Список литературы

Бузников Г.А., Григорьев Н.К. Эффект биогенных моноаминов и их антагонистов на кортикальный цитоплазматический слой у ранних зародышей морских ежей // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 1990. Т. 26. С. 614-622.

Бузников Г.А., Манухин Б.Н. Влияние серотонина на эмбриональную моторику голожаберных моллюсков // Журнал общей биологии. 1960. Т. 21. №5. С. 347-352.

Бузников Г.А., Подмарев В.И. Морские ежи Strongylocentrotus drobachiensis, S. nudus, S. intermedius II Объекты биологии развития. Москва : Наука, 1975.

Бузников Г.А., Шмуклер Ю.Б. Влияние препаратов-антимедиаторов на межклеточные связи у ранних зародышей морских ежей // Онтогенез. 1978. Т. 9. №2. С. 173-178.

Бузников Г.А. Нейротрансмиттеры в эмбриогенезе / Москва : Наука, 1987.

Бузников Г.А. Низкомолекулярные регуляторы зародышевого развития / Москва: Наука, 1967.

Воронина A.C., Пшенникова Е.С. Выделение РНК из фиксированных формальдегидом рибонуклеопротеидов // Прикладная биохимия и микробиология. 2008. Т. 44. № 2. С. 241-245.

Григорьев Н.Г., Шмуклер Ю.Б. Изучение регуляции цитокинеза ранних зародышей морского ежа с помощью электрического пробоя клеточной мембраны // Доклады АН СССР. 1986. Т. 287. № 2. С. 463-466.

Григорьев Н.Г. Кортикальный слой цитоплазмы - возможное место действия донервных трансмиттеров // Журнал эволюционой биохимии и физиологии. 1988. Т. 24. № 5. С. 625-629.

Звездина Н.Д., Мальченко Л.А., Фатеева В.И., Бродский В .Я. Сигнальные факторы самоорганизации ритма синтеза белка в культуре гепатоцитов

- ганглиозиды и катехоламины - функционируют независимо друг от друга // Онтогенез. 2008. Т. 39. № 3. С. 198-207.

Манухин Б.Н., Бузников Г.А. Новый биологический метод количественного определения серотонина // Физиологический журнал СССР. 1960. № 9. С. 1160-1163.

Манухин Б.Н., Бузников Г.А. Серотонин в эмбриогенезе морских беспозвоночных // Журнал общей биологии. 1963. Т. 24. № 1. С. 23-29.

Маркова Л.Н., Волина Е.В., Ковачевич Н. Гистохимическое выявление биогенных моноаминов у развивающихся зародышей морских ежей // Онтогенез. 1983. Т. 14. № 6. С. 641-644.

Мартынова Л.Е. Гаструляция у морского ежа £1гоп%у1осегйШт <1гоеЪасЫет1$ в норме и при обработке различными веществами // Онтогенез. 1981. Т. 12. С. 310-315.

Мартынова Л.Е., Белоусов Л.В. Влияние нейрофармакологических препаратов и колхицина на морфогенетические процессы в эмбриональных клетках амфибий // Онтогенез. 1978. Т. 9. № 4. С. 382388.

Никишин Д.А., Семенова М.Н., Шмуклер Ю.Б. Экспрессия генов трансмиттерных рецепторов в раннем развитии морского ежа РагасеЫгоЫБ 1шсЬаб II Онтогенез. 2012. Т. 43. № 3. С. 212-216.

Ростомян М.А., Абрамян К.С., Бузников Г.А., Гусарева Э.В. Электронно-цитохимическое выявление аденилатциклазы у ранних эмбрионов морского ежа//Цитология. 1985. Т. 27. С. 877-881.

Садокова И.Е. Динамика содержания циклических нуклеотидов в развивающихся зародышах морского ежа 81гоп^у1осеЫгоШ8 ШегтесИт II Онтогенез. 1982. Т. 13. № 6. С. 435-440.

Шмуклер Ю.Б., Бузников Г.А., Григорьев Н.Г., Мальченко Л.А. Влияние циклических нуклеотидов на чувствительность ранних зародышей морских ежей к цитотоксическим нейрофармакологическим

препаратам // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 1984а. Т. 97. № 3. С. 354-355.

Шмуклер Ю.Б., Чайлахян JIM., Карпович А.Л., Харитон В.Ю., Квавилашвили И.Ш. Межклеточные взаимодействия у ранних зародышей морских ежей. I. Существование различных типов делений дробления зародышей половинного размера морских ежей // Онтогенез. 1981а. Т. 12. №2. С. 197-201.

Шмуклер Ю.Б., Чайлахян Л.М., Смолянинов В.В., Блиох Ж.Л., Карпович А.Л., Гусарева Э.В., Найденко Т.Х., Хашаев З.Х.-М., Медведева Т.Д. Межклеточные взаимодействия у ранних зародышей морских ежей. II. Датированное механическое разделение бластомеров // Онтогенез. 19816. Т. 12. №4. С. 398-403.

Шмуклер Ю.Б., Григорьев Н.Г., Бузников Г.А., Турпаев Т.М. Специфическое торможение делений дробления Xenopus laevis при микроинъекции пропранолола // Доклады АН СССР. 19846. Т. 274. № 4. С. 994-997.

Шмуклер Ю.Б. Межклеточные взаимодействия у ранних зародышей морских ежей. III. Влияние нейрофармакологических препаратов на тип дробления половинных зародышей Scaphechinus mirabilis II Онтогенез. 1981. T. 12. №4. С. 404-409.

Шмуклер Ю.Б. Специфическое связывание [H3] 8-OH-DP AT ранними зародышами морского ежа Strongylocentrotus intermedius II Биологические мембраны. 1992. Т. 9. № 10-11. С. 1167-1169.

Шмуклер Ю.Б., Григорьев Н.Г., Московкин Г.Н. Адренорецептивные структуры в ранних зародышах шпорцевой лягушки {Xenopus laevis) II Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 1988. Т. 24. № 5. С. 621-624.

Adams D.S., Robinson K.R., Fukumoto T., Yuan S., Albertson R.C., Yelick P., Kuo L., McSweeney M., Levin M. Early, H^-V-ATPase-dependent proton flux is necessary for consistent left-right patterning of non-mammalian vertebrates // Development. 2006. V. 133. № 9. P. 1657-1671.

Amireault P., Dube F. Serotonin and its antidepressant-sensitive transport in mouse cumulus-oocyte complexes and early embryos // Biology of reproduction. 2005a. V. 73. № 2. P. 358-365.

Amireault P., Dube F. Intracellular cAMP and calcium signaling by serotonin in mouse cumulus-oocyte complexes // Molecular Pharmacology. 20056. V. 68. №6. P. 1678-1687.

An S.S., Laudadio R.E., Lai J., Rogers R.A., Fredberg J.J. Stiffness changes in cultured airway smooth muscle cells // American journal of physiology. Cell physiology. 2002. V. 283. № 3. P. C792-C801.

Barlow L.A. and Truman J.W. Patterns of serotonin and SCP immunoreactivity during metamorphosis of the nervous system of the red abalone, Haliotis rufescens II Journal of neurobiology. 1992. V. 23. № 7. P. 829-844.

Basu B., Desai R., Balaji J., Chaerkady R., Sriram V., Maiti S., Panicker M.M. Serotonin in pre-implantation mouse embryos is localized to the mitochondria and can modulate mitochondrial potential // Reproduction. 2008. V. 135. № 5. P. 657-669.

Beyer T., Danilchik M., Thumberger T., Vick P., Tisler M., Schneider I., Bogusch S., Andre P., Ulmer B., Walentek P., Niesler B., Blum M., Schweickert A. Serotonin signaling is required for Wnt-dependent GRP specification and leftward flow in Xenopus 11 Current Biology. 2012. V. 22. № 1. P. 33-39.

Boadle-Biber M.C. Regulation of serotonin synthesis // Progress in biophysics and molecular biology. 1993. V. 60. № 1. P. 1-15.

Bookout A.L., Cummins C.L., Mangelsdorf D.J. High-throughput real-time quantitative reverse transcription PCR // Current protocols in molecular biology / ed. Ausubel F.A., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A., Struhl K. New York : John Wiley & Sons, 5th Edition: 2002.

Boyd G.W., Low P., Dunlop J.I., Robertson L.A., Vardy A., Lambert J.J., Peters J.A., Connolly C.N. Assembly and cell surface expression of homomeric and

heteromeric 5-HT3 receptors: the role of oligomerization and chaperone proteins // Molecular and cellular neurosciences. 2002. V. 21. № l.P. 38-50. Brenner B., Harney J.T., Ahmed B.A., Jeffus B.C., Unal R., Mehta J.L., Kilic F. Plasma serotonin levels and the platelet serotonin transporter // Journal of Neurochemistry. 2007. V. 102. № 1. P. 206-215. Browne C.L., Werner W. Intercellular junctions between the follicle cells and oocytes of Xenopus laevis II The Journal of experimental zoology. 1984. V. 230. № l.P. 105-113. Burden H.W., Lawrence I.E. Jr. Presence of biogenic amines in early rat development // American Journal of Anatomy. 1973. V. 136. № 2. P. 251257.

Burke R.D., Angerer L.M., Elphick M.R., Humphrey G.W., Yaguchi S., Kiyama T., Liang S., Mu X., Agca C., Klein W.H., Brandhorst B.P., Rowe M., Wilson K., Churcher A.M., Taylor J.S., Chen N., Murray G., Wang D., Mellott D., Olinski R., Hallbook F., Thorndyke M.C. A genomic view of the sea urchin nervous system // Developmental biology. 2006. V. 300. № l.P. 434-460.

Buznikov G.A., Nikitina L.A., Voronezhskaya E.E., Bezuglov V.V., Dennis Willows A.O., Nezlin L.P. Localization of serotonin and its possible role in early embryos of Tritonia diomedea (Mollusca: Nudibranchia) // Cell and tissue research. 2003. V. 311. № 2. P. 259-266. Buznikov G.A., Nikitina L.A., Galanov A.Yu., Malchenko L.A., Trubnikova O.B. The control of oocyte maturation in the starfish and amphibians by serotonin and its antagonists // The International journal of developmental biology. 1993. V. 37. №2. P. 363-364. Buznikov G.A., Kost A.N., Kucherova N.F., Mndzhoyan A.L., Suvorov N.N., Berdysheva L.V. The role of neurohumours in early embryogenesis. III. Pharmacological analysis of the role of neurohumours in cleavage divisions. // Journal of embryology and experimental morphology. 1970. V. 23. № 3. P. 549-569.

Buznikov G.A., Sakharova A.V., Manukhin B.N., Markova L.N. The role of neurohumours in early embryogenesis. IV. Fluorometric and histochemical study of serotonin in cleaving eggs and larvae of sea urchins // Journal of embryology and experimental morphology. 1972. V. 27. № 2. P. 339-351.

Buznikov G.A., Nikitina L.A., Rakic L.M., Milosevic I., Bezuglov V.V., Lauder J.M., Slotkin T.A. The sea urchin embryo, an invertebrate model for mammalian developmental neurotoxicity, reveals multiple neurotransmitter mechanisms for effects of chlorpyrifos: therapeutic interventions and a comparison with the monoamine depleter, reserpine // Brain research bulletin. 2007. V. 74. № 4. p. 221-231.

Buznikov G.A., Shmukler Y.B. Possible role of "prenervous" neurotransmitters in cellular interactions of early embryogenesis: A hypothesis // Neurochemical research. 1981. V. 6. № 1. P. 55-68.

Buznikov G.A. Neurotransmitters in embryogenesis / New York : Chur, Academic Press, 1990.

Buznikov G.A. The biogenic monoamines as regulators of early (pre-nervous) embryogenesis: new data // Advances in experimental medicine and biology. 1991. V. 296. P. 33-48.

Buznikov G.A., Chudakova I.V., Zvezdina N.D. The role of neurohumours in early embryogenesis. I. Serotonin content of developing embryos of sea urchin and loach // Journal of embryology and experimental morphology. 1964. V. 12. №4. P. 563-573.

Buznikov G.A., Lambert H.W., Lauder J.M. Serotonin and serotonin-like substances as regulators of early embryogenesis and morphogenesis // Cell and tissue research. 2001. V. 305. № 2. P. 177-186.

Buznikov G.A., Shmukler Y.B., Lauder J.M. From oocyte to neuron: do neurotransmitters function in the same way throughout development? // Cellular and molecular neurobiology. 1996. V. 16. № 5. P. 533-559.

Castrodad F.A., Renaud F.L., Ortiz J., Phillips D.M. Biogenic amines stimulate regeneration of cilia in Tetrahymena thermophila II The Journal of protozoology. 1988. V. 35. № 2. P. 260-264.

Cerda J., Reich G., Wallace R.A., Selman K. Serotonin inhibition of steroid-induced meiotic maturation in the teleost Fundulus heteroclitus: role of cyclic AMP and protein kinases // Molecular reproduction and development. 1998. V. 49. №3. P. 333-341.

Chang T.H., Huang H.Y., Hsu J.B., Weng S.L., Horng J.T., Huang H.D. An enhanced computational platform for investigating the roles of regulatory RNA and for identifying functional RNA motifs // BMC Bioinformatics. 2013. V. 14(Suppl. 2). S4.

Cikos S., Fabian D., Makarevich A.V., Chrenek P., Koppel J. Biogenic monoamines in preimplantation development // Human reproduction. 2011. V. 26. №9. P. 2296-2305.

Colas J.F., Launay J.M., Vonesch J.L., Hickel P., Maroteaux L. Serotonin synchronises convergent extension of ectoderm with morphogenetic gastrulation movements in Drosophila II Mechanisms of development. 1999a. V. 87. №1-2. P. 77-91.

Colas J.F., Launay J.M., Maroteaux L. Maternal and zygotic control of serotonin biosynthesis are both necessary for Drosophila germband extension // Mechanisms of development. 1999b. V. 87. № 1-2. P. 67-76.

Coleman C.M., Neckameyer W.S. Serotonin synthesis by two distinct enzymes in Drosophila melanogaster II Archives of insect biochemistry and physiology. 2005. V. 59. № l.P. 12-31.

Conti M., Andersen C.B., Richard F., Mehats C., Chun S.Y., Horner K., Jin C., Tsafriri A. Role of cyclic nucleotide signaling in oocyte maturation // Molecular and Cellular Endocrinology. 2002. V. 187. № 1-2. P. 153-159.

Cornea-Hebert V., Watkins K.C., Roth B.L., Kroeze W.K., Gaudreau P., Leclerc N., Descarries L. Similar ultrastructural distribution of the 5-HT(2A)

serotonin receptor and microtubule-associated protein MAPI A in cortical dendrites of adult rat //Neuroscience. 2002. V. 113. № 1. P. 23-35.

Côté F., Fligny C., Bayard E., Launay J.M., Gershon M.D., Mallet J., Vodjdani G. Maternal serotonin is crucial for murine embryonic development // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2007. V. 104. № 1. P. 329-334.

Csaba G., Ubornyäk L. Effects of hormones on the RNA-synthesis of Tetrahymena pyriformis II Comparative biochemistry and physiology. C, Comparative pharmacology and toxicology. 1981. V. 68C. № 2. P. 251-253.

Devic E., Paquereau L., Steinberg R., Caput D., Audigier Y. Early expression of a beta 1-adrenergic receptor and catecholamines in Xenopus oocytes and embryos // FEBS letters. 1997. V. 417. № 2. P. 184-190.

•n I

Doran S.A., Goldberg J.I. Roles of Ca and protein kinase C in the excitatory response to serotonin in embryonic molluscan ciliary cells // Canadian journal of physiology and pharmacology. 2006. V. 84. № 6. P. 635-646.

Driesch H. Entwicklungmechanische Studien. III. Die Vermiderung des Furchungsmaterials und ihre Folgen (Weiteres über Theilbildungen) // Z. wiss. Zool. 1892. V. 55. № 1. P. 1-10.

Dubé F., Amireault P. Local serotonergic signaling in mammalian follicles, oocytes and early embryos // Life sciences. 2007. V. 81. № 25-26. P. 16271637.

Eiden L.E., Schäfer M.K., Weihe E., Schütz B. The vesicular amine transporter family (SLC18): amine/proton antiporters required for vesicular accumulation and regulated exocytotic secretion of monoamines and acetylcholine // Pflügers Archiv : European journal of physiology. 2004. V. 447. № 5. P. 636-640.

Emanuelsson H. Autoradiographic localization in polychaete embryos of tritiated mesulergine, a selective antagonist of serotonin receptors that inhibits early polychaete development // The International journal of developmental biology. 1992. V. 36. № 2. P. 293-302.

Emanuelsson H. Localization of serotonin in cleavage embryos of Ophryotrocha labronica La Greca and Bacci // Development Genes and Evolution. 1974. V. 175. №4. P. 253-271.

Emanuelsson H., Carlberg M., Lowkvist B. Presence of serotonin in early chick embryos // Cell differentiation. 1988. V. 24. № 3. P. 191-199.

Fukumoto T., Kema I.P., Levin M. Serotonin signaling is a very early step in patterning of the left-right axis in chick and frog embryos // Current Biology. 2005a. V. 15. № 9. P. 794-803.

Fukumoto T., Blakely R.D., Levin M. Serotonin transporter function is a novel element of left-right patterning // J Dev Neurosci. 20056. V. 27. P. 349-363.

Gerhardt C.C., van Heerikhuizen H. Functional characteristics of heterologously expressed 5-HT receptors // European journal of pharmacology. 1997. V. 334. № l.P. 1-23.

Gilbert S.F. Developmental Biology / Sinauer Associates, Sunderland, MA. Eighth edition: 2006.

Graveleau C., Paust H.J., Schmidt-Grimminger D., Mukhopadhyay A.K. Presence of a 5-HT7 receptor positively coupled to adenylate cyclase activation in human granulosa-lutein cells // The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism. 2000. V. 85. № 3. P. 1277-1286.

Greenawalt J.W., Schnaitman C. An appraisal of the use of monoamine oxidase as an enzyme marker for the outer membrane of rat liver mitochondria // The Journal of cell biology. 1970. V. 46. № 1. P. 173-179.

Grieco D., Awedimento E.V., Gottesman M.E. A role for cAMP-dependent protein kinase in early embryonic divisions // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 1994. V. 91. № 21. P. 9896-9900.

Grubbs R.D. Chemical Messenger Systems // Neuroscience in Medicine / book auth. Conn P.M. 2008.

Guilluy C., Eddahibi S., Agard C., Guignabert C., Izikki M., Tu L., Savale L.,

Humbert M., Fadel E., Adnot S., Loirand G., Pacaud P. RhoA and Rho

96

kinase activation in human pulmonary hypertension: role of 5-HT signaling // American journal of respiratory and critical care medicine. 2009. V. 179. № 12. P. 1151-1158.

Gustafson T., Toneby M. On the role of serotonin and acetylcholine in sea urchin morphogenesis // Experimental Cell Research. 1970. V. 62. № 1. P. 102117.

Hake, L.E., Richter J.D. CPEB is a specificity factor that mediates cytoplasmic polyadenylation during Xenopus oocyte maturation // Cell. 1994. V. 79. № 4. P. 617-627.

Hamdan F.F., Ungrin M.D., Abramovitz M., Ribeiro P. Characterization of a novel serotonin receptor from Caenorhabditis elegans: cloning and expression of two splice variants // J. Neurochem. 1999. V. 72. № 4. P. 1372-1383.

Harland R.M. In situ hybridization: an improved whole-mount method for Xenopus embryos // Methods in cell biology. 1991. V. 36. P. 685-695.

Heasman J. Patterning the early Xenopus embryo // Development. 2006. V. 133. № 7. P. 1205-1217.

Hinckley M., Vaccari S., Horner K., Chen R., Conti M. The G-protein-coupled receptors GPR3 and GPR12 are involved in cAMP signaling and maintenance of meiotic arrest in rodent oocytes // Developmental Biology. 2005. V. 287. №2. P. 249-261.

Horstadius S. Experimental embryology of echinoderms / Clarendon Press (Oxford Eng), 1973.

Il'kova G., Rehak P., Vesela J., Cikos S., Fabian D., Czikkova S., Koppel J. Serotonin localization and its functional significance during mouse preimplantation embryo development // Zygote. 2004. V. 12. № 3. P. 205213.

Ishida K., Yasumasu I. The periodic change in adenosine 3',5'-monophosphate concentration in sea-urchin eggs // Biochimica et biophysica acta. 1982. V. 720. №3. P. 266-273.

Katow H., Shunsuke Yaguchi S., Kyozuka K. Serotonin stimulates [Ca2+]j elevation in ciliary ectodermal cells of echinoplutei through a serotonin receptor cell network in the blastocoel // The Journal of Experimental Biology. 2007. V. 210. P. 403-412.

Kim M.J., Han J.K. The involvement of cAMP signaling pathway in axis specification in Xenopus embryos // Mechanisms of development. 1999. V. 89. № 1-2. P. 55-64.

König P., Krain B., Krasteva G., Kummer W. Serotonin increases cilia-driven particle transport via an acetylcholine-independent pathway in the mouse trachea // PLoS ONE. 2009. V. 4. № 3. P. e4938.

Krantic S., Dube F., Quirion R., Guerrier P. Pharmacology of the serotonin-induced meiosis reinitiation in Spisula solidissima oocytes // Developmental Biology. 1991. V. 146. № 2. P. 491-449.

Larsson C. Protein kinase C and the regulation of the actin cytoskeleton // Cellular signalling. 2006. V. 18. № 3. P. 276-284.

Levin M., Buznikov G.A., Lauder J.M. Of minds and embryos: left-right asymmetry and the serotonergic controls of pre-neural morphogenesis // Developmental neuroscience. 2006. V. 28. № 3. P. 171-185.

Loewi O. Über humorale Übertragbarkeit der Herznervenwirkung // Pflügers Arch, ges. Physiol. 1921. V. 189. P. 239-242.

Malanga C.J., Poll K.A. Effects of the cilioexcitatory neurohumors dopamine and 5-hydroxytryptamine on cyclic AMP levels in the gill of the mussel mytilus edulis // Life Sciences. 1979. V. 25. № 4. P. 365-373.

McCauley D.W. Serotonin plays an early role in the metamorphosis of the hydrozoan Phialidium gregarium II Developmental biology. 1997. V. 190. № 2. P. 229-240.

McDevitt R.A., Neumaier J.F. Regulation of dorsal raphe nucleus function by serotonin autoreceptors: a behavioral perspective // Journal of chemical neuroanatomy. 2011. V. 41. № 4. P. 234-246.

Mercado C.P., Kilic F. Molecular mechanisms of SERT in platelets: regulation of plasma serotonin levels // Molecular Interventions. 2010. V. 10. № 4. P. 231-241.

Miyazaki S., Katayama Y., Swann K. Synergistic activation by serotonin and GTP analogue and inhibition by phorbol ester of cyclic Ca2+ rises in hamster eggs // The Journal of physiology. 1990. V. 426. P. 209-227.

Neilson L., Andalibi A., Kang D., Coutifaris C., Strauss J.F. 3rd, Stanton J.A., Green D.P. Molecular phenotype of the human oocyte by PCR-SAGE // Genomics. 2000. V. 63. № 1. P. 13-24.

Nieuwkoop P.D. The formation of the mesoderm in the urodelean amphibians. I. Induction by the endoderm // Wilhelm Roux Arch. EntwMech. Org. 1969. V. 162. P. 341-373.

Nikishin D.A., Kremnyov S.V., Konduktorova V.V., Shmukler Y.B. Expression of serotonergic system components during early Xenopus embryogenesis // The International journal of developmental biology. 2012. V. 56. № 5. P. 385391.

Nikishin D.A., Ivashkin E.G., Mikaelyan A.S., Shmukler Yu.B. Expression of serotonin seceptors during early embryogenesis // Simpler Nervous Systems, IX East European Conference of the International Society for Invertebrate Neurobiology. St. Peterburg, 2009. P. 70.

Paulmann N., Grohmann M., Voigt J.P., Bert B., Vowinckel J., Bader M., Skelin M., Jevsek M., Fink H., Rupnik M., Walther D.J. Intracellular serotonin modulates insulin secretion from pancreatic beta-cells by protein serotonylation // PLoS biology. 2009. V. 7. № 10. P. el000229.

Paynton B.V., Bachvarova R. Polyadenylation and deadenylation of maternal mRNAs during oocyte growth and maturation in the mouse // Molecular Reproduction and Development. 1994. V. 37. № 2. P. 172-180.

Peroutka S.J. 5-Hydroxytryptamine receptor subtypes // Serotonin receptors and their ligands / ed. Olivier B., van Wijngaarden I. and Soudijn W. Elsevier Science, 1997.

Pino G.D., Moessner R., Lesch K.P., Lauder J.M., Persico A.M. Roles for serotonin in neurodevelopment: more than just neural transmission // Current neuropharmacology. 2004. V. 2. № 4. P. 403-417.

Poenie M., Alderton J., Tsien R.Y., Steinhardt R.A. Changes of free calcium levels with stages of the cell division cycle // Nature. 1985. V. 315. № 6015. P. 147-149.

Radford H.E., Meijer H.A., de Moor C.H. Translational control by cytoplasmic polyadenylation in Xenopus oocytes // Biochimica et biophysica acta. 2008. V. 1779. №4. P. 217-229.

Raymond J.R., Mukhin Y.V., Gelasco A., Turner J., Collinsworth G., Gettys T.W., Grewal J.S., Garnovskaya M.N. Multiplicity of mechanisms of serotonin receptor signal transduction // Pharmacology & Therapeutics. 2001. V. 92. №2-3. P. 179-212.

Renaud F., Parisi E., Capasso A., De Prisco P. On the role of serotonin and 5-methoxy-tryptamine in the regulation of cell division in sea urchin eggs // Developmental Biology. 1983. V. 98. № 1. P. 37-46.

Riley L.A., Waguespack M.A., Denney R.M. Characterization and quantitation of monoamine oxidases A and B in mitochondria from human placenta // Molecular pharmacology. 1989. V. 36. № 1. P. 54-60.

Rudnick G., Clark J. From synapse to vesicle: the reuptake and storage of biogenic amine neurotransmitters // Biochimica et biophysica acta. 1993. V. 1144. № 3. P. 249-263.

Schaerlinger B., Launay J.M., Vonesch J.L., Maroteaux L. Gain of affinity point mutation in the serotonin receptor gene 5-HT2Dro accelerates germband extension movements during Drosophila gastrulation // Developmental dynamics. 2007. V. 236. № 4. P. 991-999.

Sheng Y., Wang L., Liu X.S., Montplaisir V., Tiberi M., Baltz J.M., Liu X.J. A serotonin receptor antagonist induces oocyte maturation in both frogs and mice: evidence that the same G protein-coupled receptor is responsible for

maintaining meiosis arrest in both species // Journal of cellular physiology. 2005. V. 202. № 3. P. 777-786.

Shi L., Javitch J.A. The binding site of aminergic G protein-coupled receptors: the transmembrane segments and second extracellular loop // Annual review of pharmacology and toxicology. 2002. V. 42. P. 437-467.

Shmukler Yu.B., Buznikov G.A. Functional coupling of neurotransmitters with second messengers during cleavage divisions: facts and hypotheses // Perspectives on developmental neurobiology. 1998. V. 5. № 4. P. 469-480.

Shmukler Yu.B., Tosti E. Serotonergic-induced ion currents in cleaving sea urchin embryos // Invertebrate Reproduction and Development. 2002. V. 42. № 1. P. 43-49.

Shmukler Yu.B. Possibility of membrane reception of neurotransmitter in sea urchin early embryos // Comparative biochemistry and physiology C Comparative pharmacology and toxicology. 1993. V. 106. № 1. P. 269-273.

Shmukler Yu.B., Silvestre F., Tosti E. 5-HT-receptive structures are localized in the interblastomere cleft of Paracentrotus lividus early embryos // Zygote. 2008. V. 16. № l.p. 79-86.

Sindelka R., Ferjentsik Z., Jonak J. Developmental expression profiles of Xenopus laevis reference genes // Developmental dynamics. 2006. V. 235. P. 754758.

Sive H.L., Grainger R.M., Harland R.M. Early Development of Xenopus Laevis: A Laboratory Manual / Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2010

Small D.H., Wurtman R.J. Association of serotonin, dopamine, or noradrenaline with an actin-like component in pheochromocytoma (PC 12) cells // Journal of neurochemistry. 1985a. V. 45. P. 825-831.

Small D.H., Wurtman R.J. Binding of 3H-serotonin to skeletal muscle actin // Journal of neurochemistry. 19856. V. 45. P. 819-824.

Song B.H., Choi S.C., Han J.K. Local activation of protein kinase A inhibits morphogenetic movements during Xenopus gastrulation // Developmental dynamics. 2003. V. 227. № 1. P. 91-103.

Spirin A.S. Storage of messenger RNA in eukaryotes: envelopment with protein, translational barrier at 5' side, or conformational masking by 3' side? // Molecular reproduction and development. 1994. V. 38. № 1. P. 107-117.

Strieker S.A., Smythe T.L. 5-HT causes an increase in cAMP that stimulates, rather than inhibits, oocyte maturation in marine nemertean worms // Development. 2001. V. 128. № 8. P. 1415-1427.

Tadros W., Lipshitz H.D. The maternal-to-zygotic transition: a play in two acts // Development. 2009. V. 136. № 18. P. 3033-3042.

Tsugeno Y., Ito A. A key amino acid responsible for substrate selectivity of monoamine oxidase A and B // The Journal of biological chemistry. 1997. V. 272. № 22. P. 14033-14036.

Turlejski K. Evolutionary ancient roles of serotonin: long-lasting regulation of activity and development // Acta neurobiologiae experimentalis. 1999. V. 56. №2. P. 619-636.

Tusnady G.E., Simon I. The HMMTOP transmembrane topology prediction server // Bioinformatics (Oxford, England). 2001. V. 17. № 9. P. 849-850.

Vacquier V.D., Mazia D. Twinning of sand dollar embryos by means of dithiothreitol. Roles of cell surface interactions and of the hyaline layer. // Experimental cell research. 19686. V. 52. № 2. P. 459-468.

Vacquier V.D., Mazia D. Twinning of sand dollar embryos by means of dithiothreitol. The structural basis of blastomere interactions //Experimental cell research. 1968a. V. 52. № 2. P. 209-219.

Valenstein E.S. The discovery of chemical neurotransmitters // Brain and cognition. 2002. V. 49. № 1. P. 73-95.

Vesela J., Rehak P., Mihalik J., Czikkova S., Pokorny J., Koppel J. Expression of serotonin receptors in mouse oocytes and preimplantation embryos // Physiological research / Academia Scientiarum Bohemoslovaca. 2003. V. 52. № 2. P. 223-228.

Walther D.J., Peter J.U., Winter S., Holtje M., Paulmann N., Grohmann M.,

Vowinckel J., Alamo-Bethencourt V., Wilhelm C.S., Ahnert-Hilger G.,

102

Bader M. Serotonylation of small GTPases is a signal transduction pathway that triggers platelet alpha-granule release // Cell. 20036. V. 115. № 7. P. 851-862.

Walther D.J., Peter J.U., Bashammakh S., Hortnagl H., Voits M., Fink H., Bader M. Synthesis of serotonin by a second tryptophan hydroxylase isoform // Science. 2003a. V. 299. № 5603. P. 76.

Walther D.J., Bader M. A unique central tryptophan hydroxylase isoform // Biochemical pharmacology. 2003. V. 66. № 9. P. 1673-1680.

Wang J., Cao W.L., Liu X.J. Protein kinase A(PKA)-restrictive and PKA-permissive phases of oocyte maturation // Cell Cycle. 2006. V. 5. № 2. P. 213-217.

Watts S.W., Priestley J.R., Thompson J.M. Serotonylation of vascular proteins important to contraction // PLoS One. 2009. V. 4. № 5. P. e5682.

Ziu E., Mercado C.P., Li Y., Singh P., Ahmed B.A., Freyaldenhoven S., Lensing S., Ware J., Kilic F. Down-regulation of the serotonin transporter in hyperreactive platelets counteracts the pro-thrombotic effect of serotonin // Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 2012. V. 52. № 5. P. 11121121.