Структурная и функциональная характеристика генов человека RFP2, RFP2OS, KCNRG и C13ORF1 тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.15, кандидат биологических наук Иванов, Дмитрий Валерьевич

• Иванов, Дмитрий Валерьевич
• кандидат биологических наук
• 2003

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Иванов, Дмитрий Валерьевич

ОГЛАВЛЕНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Генные сети.

1.2. Структурная геномика.

1.2.1. Методы реконструкции изоформ мРНК любого гена человека.

1.2.2. Методы, позволяющие установить геномную структуру любой изоформы мРНК гена (прошлое и настоящее).

1.2.3. Стратегии построения полной транскрипционной карты генома человека.

1.3. Функциональная геномика.

1.3.1. Как реконструировать генетическую сеть?.

1.3.2. Методы исследования регуляции экспрессии различных изоформ мРНК одного гена.

1.3.3. Способы изучения белок - белковых взаимодействий.

1.3.4. Исследования экспрессии совокупности генов на уровнях транскрипции и трансляции.

1.4. Современное состояние исследований генов района Я 14.3 хромосомы 13 человека, утрачиваемого при многих онкологических заболеваниях.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Материалы.

2.1.1. Оборудование.

2.1.2. Реактивы и расходные материалы.

2.1.3. Фотоматериалы.

2.1.4. Ферментные препараты.

2.1.5. Штаммы клеток, использованные в работе.

2.1.6. Библиотека рекомбинантных космидных клонов 1СЯР С108.

2.1.7. Библиотека рекомбинантных космидных клонов ЬАЫЬ 13КС01.

2.1.8. Экспрессионная кДНК библиотека для дрожжевой двугибридной системы.

2.2. Методы.

2.2.1. Среды, условия хранения и культивирования бактерий.

2.2.2. Выделение плазмидной и космидной ДНК из клеток Е. соП.

2.2.3. Выделение дрожжевой ДНК.

2.2.4. Электрофорез фрагментов ДНК в агарозном геле.

2.2.5. Выделение фрагментов ДНК из агарозных гелей.

2.2.6. Клонирование фрагментов ДНК.

2.2.7. Трансформация в штаммы клеток.

2.2.8. Выделение тотальной РНК из культуры клеток.

2.2.9. Приготовление радиоактивно меченых ДНК-зондов.

2.2.10. Рестрикционный анализ ДНК и Саузерн-блоттинг.

2.2.11. Гибридизация Саузерн- и нозерн-блотов. Гибридизация на колониях.

2.2.12. Процедуры полимеразной цепной реакции (ПЦР).

2.2.13. ОТ-ПЦР.

2.2.14. Эксперимент по достройке праймера.

2.2.15. Определение нуклеотидной последовательности по методу Сэнгера.

2.2.16. Проверка взаимодействия двух белков в дву гибридной системе.

2.2.17. Тест на присутствие в дрожжах белка, кодируемого репортерным геном 1ас2.

2.2.18. Метод "потери плазмид".

2.3. Программное обеспечение, использованное в работе.

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Космидный контиг области, содержащей гены ЯГР2, ЕР7Р2 ОБ, СВОЯПпКСМЯО.

3.2. Экзон-интронная структура и возможная функция гена КРР2.

3.2.1. Картирование гена КРР2.

3.2.2. Изоформы мРНК гена №Р2.

3.2.3. Экзон-интронная структура гена ЯГР2.

3.2.4. Анализ профиля экспрессии гена ЯГР2 в нормальных тканях и опухолевых клеточных линиях человека.

3.2.5. Анализ нуклеотидных последовательностей изоформ мРНК гена ЯРР2.

3.2.6. Ортологи гена№Р2.

3.2.7. Анализ аминокислотной последовательности, кодируемой геном ЯГР2.

3.2.8. Поиск партнеров белка ИРР2 методом дрожжевой двугибридной системы.

3.2.9. Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК клонов, выявленных методом дрожжевой двугибридной системы.

3.2.10. Возможная функция гена. ЯРР2.

3.3. Экзон-интронная структура и возможная функция гена ЯГР208.

3.3.1. Картирование гена ЯРР203.

3.3.2. Структура изоформы РНК гена ЯРР203.

3.3.3. Возможная функция гена ЯРР203.

3.4. Экзон-интронная структура и возможная функция гена КСМ1Ю.

3.4.1. Картирование гена КСЫ1Ю.

3.4.2. Экзон-интронная структура генаКСМ1Ю.

3.4.3. Анализ профиля экспрессии гена КСЫ1Ю в нормальных тканях и опухолевых клеточных линиях человека.

3.4.4. Анализ нуклеотидных последовательностей изоформ мРНК гена KCNRG.

3.4.5. У гена KCNRG, вероятно, присутствует собственная промотерная область.

3.4.6. Ортологи гена KCNRG.

3.4.7. Анализ аминокислотных последовательностей, кодируемых геном KCNRG.

3.4.8. Возможная функция белкового продукта гена KCNRG. .134 3.5. Экзон-интронная структура и возможная функция гена C130RF1.

3.5.1. Картирование гена C130RF1.

3.5.2. Реконструкция изоформ мРНК гена C130RF1.

3.5.3. Экзон-интронная структура гена C130RF1.

3.5.4. Анализ профиля экспрессии гена C130RF1 в нормальных тканях и опухолевых клеточных лигиях человека.

3.5.5. Анализ нуклеотидных последовательностей изоформ мРНК гена C130RF1.

3.5.6. Ортологи гена C130RF1.

3.5.7. Анализ аминокислотной последовательности, кодируемой геном C130RF1.

3.5.8. Поиск партнеров белка C130RF1 методом дрожжевой двугибридной системы.

3.5.9. Анализ нуклеотидных последовательностей ДНК клонов, выявленных методом дрожжевой двугибридной системы.

3.5.10. Возможная функция гена C130RF1.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурная и функциональная характеристика генов человека RFP2, RFP2OS, KCNRG и C13ORF1»

Актуальность темы. Опухолевые заболевания занимают второе место в мире как причина смертности после заболеваний сердечно-сосудистой системы. Для многих типов опухолей пока не выявлены гены, повреждения которых служат "спусковым крючком" активного канцерогенеза. Выявление генов связанных с развитием опухолей создает основу для понимания молекулярных механизмов возникновения и развития онкозаболеваний, а также приводит к появлению новых методов их диагностики и лечения. Поэтому исследования, направленные на поиск и изучение генов, вовлеченных в процесс образования опухолей, остаются высоко актуальными.

Причиной возникновения и прогрессии опухолей являются изменения генома соматических клеток. Этот факт заметно облегчает переход от стадии описания фенотипических проявлений заболевания, в том числе хромосомных перестроек, часто сопровождающих процесс возникновения опухолей, к стадии выяснения молекулярных механизмов его развития. Показано, что перестройки участков генома человека могут приводить к утрате или дефектам генов (так называемых супрессоров опухолевого роста), в норме подавляющих клеточное деление и развитие опухолей. Одним из таких участков генома явлется 13ql4.3, повреждаемый при некоторых онкологических заболеваниях, таких как В-клеточный хронический лимфолейкоз, рак простаты и других. В большинстве работ минимальный утрачиваемый район был ограничен 8Т8- маркерами 0138273 и Э13825. Благодаря результатам, полученным в ходе международного проекта "Геном человека", в настоящий момент у исследователя имеются практически все необходимые данные для выявления точной структуры генов, находящихся в этой области. Нуклеотидная последовательность этого района, размером приблизительно 800 т.п.н., содержит семь генов, лишь три из которых были ранее охарактеризованы.

Данная работа посвящена характеристике структуры и функции четырех генов человека КРР2, КРР208, КСШС и С130ЯР1, один из которых может являться искомым геном-супрессором опухолевого роста, повреждаемым при перестройках области 13ql4.3.

Цель и задачи исследования. Целью исследования является структурная и функциональная характеристика генов человека КРР2, ЯГР203, KCNRG и С130ЯП, являющихся возможными кандидатами на роль супрессора опухолевого роста.

Для реализации поставленной цели при исследовании этих генов решались следующие задачи:

1. Выявить соответствующие генам изоформы мРНК и установить их экзон-интронную структуру;

2. Провести анализ тканеспецифичности экспрессии исследуемых генов;

3. Провести т бШсо функциональную характеристику предсказанных аминокислотных последовательностей кодируемых исследуемыми генами;

4. Методом дрожжевой двугибридной системы выявить гены, продукты которых являются потенциальными партнерами по взаимодействию белков, кодируемых исследуемыми генами.

Научная новизна. Впервые выявлено наличие нескольких изоформ мРНК генов человека ЯРР2, ЯГР208, КСИЯСУ С13(ЖГ1 и экспериментально подтверждено существование этих изоформ методами ОТ-ПЦР и нозерн-гибридизации. Установлен профиль тканеспецифичности экспрессии этих генов. Методом анализа т бШсо выявлены вероятные функциональные домены в аминокислотных последовательностях генов ЯРР2, КСИ1Ю и С/ЗОЛР/. С помощью дрожжевой двугибридной системы для белка КРР2 выявлены десять, а для белка С13СЖР1 - два потенциальных партнера по взаимодействию.

Научно-практическая значимость работы. В области 13ц 14.3 уточнена локализация рекомбинантных космид, которые могут быть использованы в клинической цитогенетике на ДНК пациентов, больных онкологическими заболеваниями, для идентификации хромосомных перестроек. ДНК этих клонов также может быть использована для поиска областей, регулирующих транскрипционную активность генов данной области.

Полученные данные о структуре генов ЯГР2, ЯГР205, КСЫ1Ю и СНОМ?! позволяют приступить к их детальному мутационному анализу на ДНК пациентов больных онкологическими заболеваниями, ассоциированными с исследуемой областью. Подробный структурный анализ этих генов создает базу для последующих функциональных исследований.

Функциональная характеристика исследуемых генов впервые позволила высказать предположения о возможной роли каждого из них в развитии онкологических заболеваний, ассоциированных с исследуемой областью. Полученные результаты по выявлению генов, белковые продукты которых являются потенциальными партнерами ЯРР2 и С13СЖР1, могут быть использованы при построении генных сетей, элементами которых являются исследованные гены.

Заключение диссертации по теме «Генетика», Иванов, Дмитрий Валерьевич

5. ВЫВОДЫ.

1. Впервые проведена структурная и функциональная характеристика четырех генов человека ЯРР2, ЯГР208, КСЫЯС и С130ЯР1. Все определенные нами нуклеотидные последовательности геномной ДНК и кДНК зарегистрированы в вепВапк.

2. Впервые выявлены изформы РНК: четыре для гена ЛРР2; одна для Я/Т^ОЯ; две для КСШв; три для С130ЯР1. Две изоформы мРНК КРР2 (АР241850 и АУ191002) состоят из трех экзонов, транскрибируются в направлении от центромеры к теломере и отличаются длиной 3'-конца первого экзона. Изоформа РНК (АР529010) гена RFP20S состоит, по крайней мере, из пяти экзонов, транскрибируется в направлении от теломеры к центромере. Две изоформы мРНК КСИЯС состоят из двух (АУ129654) и трех (АУ129653) экзонов, транскрибируются в направлении от центромеры к теломере и отличаются длиной второго сплайсируемого экзона. Три изоформы мРНК гена С13СЖП состоят из пяти экзонов, транскрибируются в направлении от теломеры к центромере и отличаются длиной 3'-конца пятого экзона.

3. Показано, что гены ЯГР2, КСЫ1Ю и С130ЯГ1 экспрессируются практически во всех исследованных неопухолевых тканях.

4. Изоформы мРНК содержат эволюционно-консервативные ОРС длиной: 407ак. для КРР2\ 229ак. и 272ак. для КСИЯС-, 196 ак. для аЗОЯП. Предсказанные аминокислотные последовательности содержат: ИГр-подобный трехчастный домен (ЯГР2); домен тетромеризации потенциал-зависимых калиевых каналов Т1 (KCNRG); 8РЯУ-домен (С/ЗО/^/). Изоформа РНК размером не менее 1768 н. не содержит протяженных ОРС. Показано, что первый экзон ЛFP20»S, перекрывается с первым экзоном гена а транскрипция этих генов осуществляется с противоположных цепей ДНК. Выдвинута гипотеза о возможном участии гена РРР20Б в регуляции экспрессии гена РРР2.

5. Выявлены десять белков потенциальных партнеров по взаимодействию с белком ЮТ2, кодируемых генами Ы1РАР1, РЯКСЗН, РМП, МСИИ, УРБ18, САР№1, ЯРЬР1, ССТ5, Ей 10719, МСС5309 и два потенциальных партнера по взаимодействию белка С130ЯР1 (пептид длиной 23 аминокислоты и продукт гипотетического гена НШНРВ2206).

4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Результатом данной работы стало построение уточненного космидного контига района хромосомы 13 человека, часто утрачиваемого при многих онкологических заболеваниях и расположенного между STS маркерами D13S1168 и D13S272, удовлетворяющего требованию идентификации структуры исследуемых генов RFP2, RFP2ÖS, C130RF1 и KCNRG расположенных в этом районе, а также был проведен анализ тонкой структуры и начальные этапы функциональной характеристики этих генов.

Полученные космидные клоны геномной ДНК при построении контига могут быть использованы для идентификации нормальных и аномальных хромосом человека на ДНК пациентов больных онкологическими заболеваниями, ассоциированными с исследуемой областью. ДНК этих клонов также может быть использованы для поиска областей, содержащих регуляторные элементы генов RFP2, RFP20S, C13ÖRF1 и KCNRG.

Ген RFP2 локализуется на космидах клонотеки LANL 67В4 и 116С1. Гену соответствуют по крайней мере четыре изоформы мРНК длиной 1.4 т.н, 2.4 т.н. и 7.5 т.н., которые представлены практически во всех исследованных нормальных тканях и некоторых опухолевых клеточных линиях человека. Количественное соотношение этих изоформ заметно варьирует в зависимости от типа нормальной ткани. Показано, что сигналу на нозерн-блоте в 1.4 т.н. соответствуют две изоформы мРНК, поданные нами в базу данных GenBank под номерами AF241850 и AY191002. Эти изоформы состоят из трех экзонов. Второй и третий экзоны этих изоформ совпадают. Изоформа AY191002 длинее изоформы AF241850 на 85 нуклеотидов за счет области интрона на 3'-конце первого экзона. Ген транскрибируется в направлении от центромеры к теломере. Изоформы, содержат одну и ту же эволюционно-консервативную ОРС, которой соответствует предсказанная последовательность, состоящая из 407 аминокислот. Этот белок содержит цинк-связывающие домены RING и В-ВОХ, а также так называемый «спирально скрученный» домен. Такое сочетание доменов называется Rfpподобным трехчастным доменом, по названию белка Rfp (Ret finger protein). Следует отметить, что многие белки, содержащие цинк-связывающий домен RING типа, являются Е2-зависимыми ЕЗ убиквитин-лигазами. Белковый продукт гена RFP2 является либо цитоплазматическим белком, либо трансмембранным белком эндоплазматического ретикулума. Проведенный поиск партнеров белка RFP2 с использованием дрожжевой двугибридной системы позволил выявить 10 потенциальных белков партнеров по взаимодействию. Анализ аминокислотной последовательности, данные по локализации белка внутри клетки, а также проведенная структурная и функциональная характеристика потенциальных партнеров позволяют высказать гипотезу о возможной вовлеченности белкового продукта гена RFP2 в процессы регуляции клеточного цикла, процессы, связанные с клеточной дифференцировкой, перестройкой цитоскелета, регуляцию раннего развития эмбриона, в неопластическую трансформацию клеток, либо в регуляцию иммунного ответа. Возможно, белок RFP2 участвует в работе системы деградации неправильно свернувшихся белков, ассоциированной с эндоплазматическим ретикулумом. Активность любой системы контроля существенна для нормального функционирования клетки. Возможное участие RFP2 в одной из таких систем с учетом его локализации в области генома, ассоциированной со многими онкологическими заболеваниями выделяет его среди других генов как возможного супрессора опухолевого роста, что указывает на необходимость его дальнейшего детального исследования.

Ген RFP20S локализуется на космидах клонотеки LANL 156Н12 и 116С1. Изоформа РНК гена включает в себя 1768 нуклеотидов и не содержит протяженной открытой рамки считывания. Нуклеотидная последовательность изоформы РНК гена подана в базу данных GenBank под номером AF529010. Ген состоит, по крайней мере, из пяти экзонов и транскрибируется в направлении от теломеры к центромере. Изоформа РНК гена RFP2ÖS, частично перекрывается с первым экзоном гена RFP2 (на 57 нуклеотидов с изоформой AF241850 и на 146 нуклеотидов с изоформой AY191002), являясь, таким образом, антисмысловым транскриптом для этого гена. Выдвинута гипотеза о возможном участие RFP20S в регуляции экспрессии и трансляции гена RFP2.

Ген KCNRG локализован на космиде 67В4. Ген, вероятно, состоит из трех экзонов и транскрибируется от центромеры к теломере. Гену соответствуют, по крайней мере, две изоформы мРНК (зарегестрированы в базе данных GenBank под номерами AY129653 и AY129654), которые представлены практически во всех исследованных нормальных тканях и опухолевых клеточных линиях человека. Изоформы мРНК отличаются внутренней нуклеотидной последовательностью в 95 нуклеотидов. Разница в длине изоформ мРНК появляется в результате использования альтернативных сигналов сплайсинга.

Две изоформы мРНК гена KCNRG содержат эволюционно-консервативные ОРС, которым соответствует предсказанные последовательности, состоящие из 229 и 272 аминокислотных остатков. Сплайсформы кодируют возможные белковые продукты массой около 20кДа, отличающиеся по С-концу. При этом отличия не затрагивают область домена тетрамеризации потенциал-зависимых калиевых каналов Т1. Этот домен имеет отдаленную гомологию с BTB/POZ доменом, который участвует в белок-белковых взаимодействиях и присутствует во многих транскрипционных факторах. Нашими коллегами из университета в г. Лиль (Франция) было показано, что белковый продукт гена KCNRG возможно подавляет активность калиевых каналов. Белковый продукт, вероятно, препятствует сборке каналов, выполняя, таким образом, регуляторную функцию. Конкретизировать калиевые каналы, с которыми взаимодействует белок KCNRG, подавляя их активность, не представляется возможным: библиотека для дрожжевой двугибридной системы, использованная в этом исследовании, не подходит для этой задачи.

Во многих работах продемонстрирована способность ослаблять митотическую активность некоторых типов клеток любым фактором подавляющим активность калиевых каналов. Ген KCNRG, расположенный в области утрачиваемой при многих онкологических заболеваниях, в частности, в образцах карциномы простаты и B-XJIJI, является первостепенным кандидатом на роль супрессора опухолевого роста при этих заболеваниях.

Ген человека C130RF1 локализован на космидах 122F4 и 105F10. Ген экспрессируется в виде трех основных изоформ мРНК, размер которых составляет 1.1 т.н., 1.5 т.н. и 3 т.н., которые представлены практически во всех исследованных нормальных тканях и опухолевых клеточных линиях человека. Ген C130RF1 состоит из пяти экзонов и транскрибируется от теломеры к центромере. При этом разнообразие изоформ мРНК определяется альтернативными сигналами полиаденелирования. Эксперимент по достройке праймера позволил выявить как минимум пять точек инициации транскрипции в промоторной области гена C130RF1.

Все изоформы мРНК содержат одинаковую эволюционно-консервативную ОРС, которой соответствует предсказанная аминокислотная последовательность, состоящая из 196 аминокислот. Белковый продукт гена содержит единственный домен SPRY и, возможно, локализуется на цитоплазматической мембране. Данные по локализации белка, а также компьютерный анализ его аминокислотной последовательности свидетельствуют о его возможной регуляторной активности в отношении белков цитоплазматической мембраны. Однако, белковый продукт гена C130RF1 не причастен к регуляции тока кальция через мембраны клетки, как было показано нашими французскими коллегами. Результаты поиска возможных белков-партнеров белка C130RF1 методом дрожжевой двугибридной системы, не позволили конкретизировать возможное участие продукта гена C130RF1 в регуляции активности белков мембран.

Итак, в ходе данной работы впервые была получена структурная и функциональная характеристика четырех генов человека, расположенных в области ql4.3 хромосомы 13, часто утрачиваемой в образцах различных опухолей человека. В результате проведенного структурного и функционального анализа генов человека ЯГР2, ЯРР20Б, КСИ1Ю и С130КР1, наиболе перспективными кандидатами на роль гена-супрессора опухолевого роста следует признать гены ЯГР2 и КСЫЯС.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Иванов, Дмитрий Валерьевич, 2003 год

1. Громов П.С., Целис Х.Э. От геномики к протеомике. // Молекулярная биология, 2000 Т. 34 - С. 597-611.

2. Кель О.В., Кель А.Э. Межгенные взаимоотношения в регуляции клеточного цикла: ключевая роль транскрипционных факторов семейства E2F. // Молекулярная биология, 1997 Т. 31 - С. 656 - 670.

3. Колчанов H.A., Ананько Е.А., Колпаков Ф.А., Подколодная O.A., Игнатьева Е.В., Горячковская Т.Н., Степаненко И.Л. Генные сети. // Молекулярная биология, 2000 Т. 34 - С. 533-544.

4. Подколодная O.A., Степаненко И.Л. Механизмы транскрипционной регуляции эритроид-специфичных генов. // Молекулярная биология, 1997 -Т. 31-С. 671-683.

5. Ратнер В.А. Генетические управляющие системы. Новосибирск: Наука, 1966 С. 181.

6. Сулимова Г.Е., Компанийцев А. А., Кунижева С. С., Климов Е.А., Рахманалиев Э.Р., Удина И. Г. Картирование в геноме человека EST- и STS-маркеров с использованием панели радиационных гибридов // Генетика, 2000. Т. 36. - С. 900-907.

7. Abdul M., Hoosein N. Expression and activity of potassium ion channels in human prostate cancer. // Cancer Lett, 2002 Vol. 186 - P. 99.

8. Alam J. and Cook J.L. Reporter genes: application to the study of mam-malian gene transcription. // Anal. Biochem, 1990 Vol. 188 - P. 245.

9. Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K., Watson J.D. Molecular Biology of the Cell. // New York and London: Garland Publishing, 1994 3rd ed.

10. Ananko E.A., Podkolodny N.L., Stepanenko I.L., Ignatieva E.V., Podkolodnaya

11. A., Kolchanov N.A. GeneNet: a database on structure and functional organisation of gene networks. // Nucleic Acids Res, 2002 Vol. 30 -P. 398401.

12. Anderson L., Seilhamer J. A comparison of selected mRNA and protein abundances in human liver. // Electrophoresis, 1997 Vol. 18 - P. 533-7.

13. Aparicio S., Chapman J., Stupka E., Putnam N., Chia J.M., Dehal P., Christoffels A., Rash S., Hoon S., Smit A., Gelpke M.D., Roach J., Oh T., Ho

14. Y., Wong M., Detter C., Verhoef F., Predki P., Tay A. et al. Whole-genome1.I