Морфо-функциональный анализ нового гена в раннем развитии шпорцевой лягушки Xenopus laevis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.30, кандидат биологических наук Берекеля, Любовь Александровна

• Берекеля, Любовь Александровна
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Берекеля, Любовь Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6 Детерминанты вегетативного полушария Xenopus laevis: локализация и функции

Перемещение детерминант на вегетативный кортекс ооцита

Половая плазма и митохондриальное облако

Детерминанты осевого комплекса

Вегетативно локализованные мРНК

Связь детерминант с кортексом ооцита после созревания

Кортикальный поворот

Волны поверхностного сокращения

Формирование первичных половых клеток

Индукция de novo

Половая плазма и закладка ППК

Насекомые

Бесхвостые амфибии

Рыбы и птицы

Гены, задействованные в формировании половых клеток

Drosophila

С. elegans

Xenopus laevis

Птицы и млекопитающие

Миграция первичных половых клеток

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Получение зародышевого материала

Клонирование гена Germes

Быстрая амплификация 5 '-конца кДНК (5 '-RACE)

Получение полноразмерной кДНК

Секвенирование, анализ последовательностей кДНК и белков

Нозерн-блот анализ

Гибридизация in situ

Подготовка матрицы

Синтез зонда

Гибридизация

Микроинъекции мРНК Germes, его мутантных форм или его партнеров в эмбрионы и ооциты шпорцевой лягушки

Гистологический анализ

Манипуляции с ДНК, клонирование ДНК

Электрофорез в агарозном геле

Рестрикция

Зачистка концов фрагментом Кленова

Дефосфорилирование

Лигирование

Трансформация компетентных клеток

Получение мутантных форм Germes

Создание генетических конструктов в экспрессионных плазмидных векторах

Дрожжевая двугибридная система

Описание системы

Среды и растворы

Трансформация дрожжей

Трансформация библиотеки

Выделение плазмид из дрожжей

Колокализация белков в клетках млекопитающих

Культивирование клеток млекопитающих

Иммуноокрашивание клеток на покровных стеклах

Коиммунопреципитация

Иммуноблоттинг

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Клонирование нового гена Xenopus laevis

Анализ временной и пространственной экспрессии гена

Анализ влияния оверэкспрессии Germes дикого типа и его мутантных форм на формирование и миграцию ППК

Получение мутантных форм Germes

Анализ влияния оверэкспрессии различных форм Germes на развитие ППК

Гистологический анализ зародышей, инъецированных мРНК GermesЛ LZ

Germes - часть белкового комплекса, образование которого необходимо для нормального развития ППК

Поиск белковых партнеров Germes

Поиск партнеров с помощью дрожжевой двугибридной системы

Подтверждение взаимодействий 81 Анализ взаимодействия Germes с легкими цепями динеина с помощью ДДС

Возможная роль Germes в развитии ППК

ВЫВОДЫ

Заключение диссертации по теме «Биология развития, эмбриология», Берекеля, Любовь Александровна

выводы

1. Определена длина вегетативно локализованной мРНК нового гена шпорцевой лягушки. Детальный анализ экспрессии гена, названного нами Germes, показал, что его транскрипт является компонентом половой плазмы шпорцевой лягушки с начальных этапов оогенеза (ст.Н) до стадии нейрулы.

2. Получены мутантные формы Germes. С помощью мутационного анализа показано, что инъекция мРНК Germes с делецией лейциновых застежек-молний вызывает нарушения в количестве ППК, их способности к миграции, а также в морфологии половой плазмы на стадиях миграции.

3. С помощью дрожжевой двугибридной системы обнаружено 3 вероятных белковых партнера Germes. Анализ первичных последовательностей их кДНК показал, что они являются ранее неописанными для Xenopus laevis гомологами легких цепей динеина (Dlc8a, Dlc8b) и гистона НЗ.З млекопитающих.

4. Дополнительный анализ с помощью коиммунопреципитации и колокализации белков показал, что с Germes действительно взаимодействуют только 2 из 3 обнаруженных претендентов - легкие цепи динеина dlc8a и dlc8b, являющиеся составными частями крупных моторных комплексов в клетке - динеина и миозина V.

5. С помощью делеционного анализа показано, что dlc8 взаимодействуют с участком в С-концевой половине Germes, не входящим в состав лейциновых застежек-молний и EF-hand домена.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Берекеля, Любовь Александровна, 2004 год

1. Айзенштадт Т.Б. Современные представления о детерминантах клеток зародышевого пути // Онтогенез 1975. Т. 6. №5. С. 427-441.

2. Белоусов JI.B. Основы общей эмбриологии // М.: Изд-во МГУ. 1993. Гилберт С. Биология развития // М.: Мир. 1993.

3. Иванова Н.Б., Лучинская Н.Н., Попсуева А.Э., Пономарев Е.Д., Белявский А.В.

4. Blackler A.W. Contribution to the study of germ-cells in the Anura II J. Embryol. Exp. Morphol. 1958. V. 6. P. 491-503.

5. Braat A.K., Zandbergen Т., van de Water S., Goos H.J., Zivkovic D. Characterization of zebrafish primordial germ cells: morphology and early distribution of vasa RNA // Dev. Dyn. 1999. V. 216. P. 153-167.

6. Brent R., Ptashne M. A eukaryotic transcriptional activator bearing the DNA specificity of a prokaryotic repressor // Cell 1985. V. 43. P. 729-736.

7. Bounoure L. Recherches sur la lignee germinale chez la grenouille fousse aux premiers stades du developpement//Ann. sci. natur. 1934. V. 17. P. 67-248.

8. Bounoure L., Aubry R., Huck M.L. Nouvelles recherches experimentales sur les origins de la lignee reproductice chez la grenouille rousse // J. Embryol. and Exp. Morphol., 1954. V. 2. P. 245263.

9. Bovery T. On multipolar mitosis as a means of analysis of the cell nucleus // Quoted in Foundations of Experimental Embryology. 1902.

10. Chan A.P., Kloc M., Bilinski S., Etkin L.D. The vegetally localized mRNA fatvg is associated with the germ plasm in the early embryo and is later expressed in the fat body // Mech. Dev. 2001. V. 100. P. 137-140.

11. Chan A.P., Kloc M., Etkin L.D. Fatvg encodes a new localized RNA that uses a 25-nucleotide element (FVLE1) to localize to the vegetal cortex of Xenopus oocytes // Development 1999. V. 126. P. 4943-4953.

12. Chang P., LeGuellec K., Houliston E. Immunodetection of cytoskeletal structures and the Eg5 motor protein on deep-etch replicas of Xenopus egg cortices isolated during the cortical rotation // Biol. Cell 1996. V. 88. P. 89-98.

13. Chang H., Matzuk M.M. Smad5 is required for mouse primordial germ cell development // Mech. Dev. 2001. V. 104. P. 61-67.

14. Chang P., Perez-Mongiovi D., Houliston E. Organisation of Xenopus oocyte and egg cortices // Micr. Res. Tech. 1999. V. 44. P. 415-429.

15. Cleine J. Replacement of posterior by anterior endoderm reduces sterility in embryos from inverted eggs of Xenopus laevis II J. Embryol. Exp. Morphol. 1986. V. 94. P. 83-93.

16. Cleine J.H., Dixon K.E. The effect of egg rotation on the differentiation of primordial germ cells in Xenopus laevis II J. Embryol. Exp. Morphol. 1985. V. 90. P. 79-99.

17. Czolowska R. Observations on the origin of the "germinal cytoplasm" in Xenopus laevis II J. Embryol. Exp. Morphol. 1969. V. 22. P. 229-251.

18. Dale L., Matthews G., Colman A. Secretion and mesoderm-inducing activity of theTGFP-related domain of Xenopus Vgl // EMBO J. 1993. V. 12. P. 4471-4480.

19. Darras S., Marikawa Y., Elinson R.P., Lemaire P. Animal and vegetal pole cells of early Xenopus embryos respond differently to maternal dorsal determinants: implications for the patterning of the organizer // Development 1997. V. 124. P. 4275-4286.

20. Day C.L., Puthalakath H., Skea G., Strasser A., Barsukov I., Lian L.Y., Huang D.C.S., Hinds M.G. Localization of dynein light chains 1 and 2 and their pro-apoptotic ligands // Biochem. J. 2004. V. 377. P. 597-605.

21. Denis H. Cytosquelette et polarite ovulaire // Med. Sci. 1996. V.12. P. 1145-1158.

22. Deshler J., Highett M., Schnapp B. Localization of Xenopus Vgl mRNA by Vera protein and theendoplasmic reticulum // Science 1997. V. 276. P. 1128-1131.

23. Elinson R.P., Rowning B. A transient array of parallel microtubules in frog eggs: potential tracks for a cytoplasmic rotation that specifies the dorso-ventral axis // Dev. Biol. 1988. V. 128. P. 185197.

24. Ephrussy A., Lehmann R. Induction of germ cell formation by oskar // Nature 1992. V. 358. P. 387-392.

25. Fujisue M., Kobayakawa Y., Yamana K. Occurrence of dorsal axis-inducing activity around the vegetal pole of an uncleaved Xenopus egg and displacement to the equatorial region by cortical rotation II Development 1993. V. 118. P. 163-170.

26. Gerhart J., Danilchik M., Doniach T., Roberts S., Rowning B., Stewart R. Cortical rotation of the Xenopus egg: consequences for the anteroposterior pattern of embryonic dorsal development // Development 1989. V. 107. P. 37-51.

27. Havin L., Git A., Elisha Z., Oberman F., Yaniv K., Pressmen Schwartz S., Standart N., Yisraeli J.K. RNA-binding protein conserved in both microtubule- and microfilament-based RNA localization // Genes Dev. 1998. V. 12. P. 1593-1598.

28. Hay B., Jan L.Y., Jan Y.N. A protein component of Drosophila polar granules is encoded by vasa and has extensive sequence similarity to ATP-dependent helicases // Cell 1988. V. 55(4). P. 577587.

29. Hegner R.W. Experiments with chrysomelid beetles. 3. The effects of killing parts of the eggs of Leptinotarsa decemlineata II Biol. Bull. 1911. V. 20. P. 237-251.

30. Heldin C.H., Miyazono K., ten Dijke P. TGF-p signaling from cell membrane to nucleus through SMAD proteins // Nature 1997. V. 390. P. 465-471.

31. Henikoff S., Furuyama T., Ahmad K. Histone variants, nucleosome assembly and epigenetic inheritance // Trends Genet. 2004. V. 20. P. 320-326.

32. Hogan B.L. Bone morphogenetic proteins: multifunctional regulators of vertebrate development // Genes Dev. 1996. V. 10. P. 1580-1594.

33. Horb M.E., Thomsen G.H. A vegetally localized T-box transcription factor in Xenopus eggs specifies mesoderm and endoderm and is essential for embryonic mesoderm formation // Development 1997. V. 124. P. 1689-1698.

34. Houliston E., Elinson R.P. Patterns of microtubule polymerization relating to cortical rotation in Xenopus laevis eggs // Development 1991. V. 112. P. 107-117.

35. Houston D.W., Zhang J., Maines J.S., Wasserman S.A., King M.L. A Xenopus DAZ-like gene encodes an RNA component of germ plasm and is a functional homologue of Drosophila boule // Development 1998. V. 125. P. 171-180.

36. Joseph E.M., Melton D.A. Mutant Vgl ligands disrupt endoderm and mesoderm formation in Xenopus embryos // Development 1998. V. 125. P. 2677-2685.

37. Kageura H. Activation of dorsal development by contact between the cortical dorsal determinant and the equatorial core cytoplasm in eggs of Xenopus laevis II Development 1998. V. 124. P. 15431551.

38. Kamimura M., Kotani M., Yamagata K. The migration of presumptive primordial germ cells throygh the endodermal cell mass in Xenopus laevis: a light and electron microscopic study // J. Embryol. Exp. Morph. 1980. V. 59. P. 1-17.

39. Karashima T., Sugimoto A., Yamamoto M. Caenorhabditis elegans homologue of the human azoospermia factor DAZ is required for oogenesis but not for spermatogenesis // Development 2000. V. 127. P. 1069-1079.

40. Kashikawa M., Amikura R. Kobayashi S. Mitochondrial small ribosomal RNA is a component ofgerminal granules in Xenopus embryos // Mech. Dev. 2001. V. 101. P. 71-77.

41. Keshet E., Lyman S.D., Williams D.E., Anderson D.M., Jenkins N.A., Copeland N.G., Parada

42. F. Embryonic RNA expression patterns of the c-kit receptor and its cognate ligand suggestmultiple functional roles in mouse development//EMBO J. 1991. V. 10. P. 2425-2435.

43. Kikkawa M., Takano K., Shinagawa A. Location and behavior of dorsal determinants during firstcell cycle in Xenopus eggs // Development 1996. V. 122. P. 3687-3696.

44. King S.M. The dynein microtubule motor // Biochim. Biophys. Acta 2000. V. 1496. P. 60-75.

45. Kloc M., Dougherty M.T., Bilinsky S., Chan A.P., Brey E., King M.L., Patrick C.W. Jr., Etkin

46. D. Three-dimensional ultrastructural analysis of RNA distribution within gernimal granules of

47. Xenopus II Dev. Biol. 2002. V. 241. P. 79-93.

48. Kloc M., Etkin L.D. Derealization of Vgl mRNA from the vegetal cortex in Xenopus oocytes after destruction of Xlsirt RNA // Science 1994. V. 265. P. 1101-1103.

49. Kloc M., Etkin L.D. Two distinct pathways for the localization of RNAs at the vegetal cortex in Xenopus oocytes // Development 1995. V. 121(2). P. 287-297.

50. Kloc M., Etkin L.D. Apparent continuity between the messenger transport organizer and late RNA localization pathways during oogenesis in Xenopus //Mech. Dev. 1998. V. 73. P. 95-106.

51. KIoc M., Larabell C., Etkin L.D. Elaboration of the messenger transport organizer pathway for localization of RNA to the vegetal cortex of Xenopus oocytes // Dev. Biol. 1996. V. 180. P. 119130.

52. Mahowald A.P. Polar granules of Drosophila: 3. The continuity of polar granules during the life cycle of Drosophila II J. Exp. Zool. 1971. V. 176(3). P. 329-343.

53. Mahowald A.P., Hennen S. Ultrastructure of the "germ plasm" in eggs and embryos of Rana pipiens II Dev. Biol. 1971. V. 24(1). P. 37-53.

54. Marikawa Y., Li Y., Elinson R.P. Dorsal determinants in the Xenopus egg are firmly associated with the vegetal cortex and behave like activators of the Wnt pathway // Dev. Biol. 1997. V. 191. P. 69-79.

55. Massague J., Chen Y.G. Controlling TGF-p signaling II Genes Dev. 2000. V. 14. P. 627-644. Matova N., Cooley L. Comparative aspects of animal oogenesis // Developmental Biology 2001. V. 231(2). P. 291-320.

56. Molyneaux K.A., Zinszner H., Kunwar P.S., Schaible K., Stebler J., Sunshine M.J., O'Brien

57. W., Raz E., Littman D., Wylie C., Lehman 11 R. The chemokine SDF1/CXCL12 and its receptor CXCR4 regulate mouse germ cell migration and survival // Development 2003. V. 130. P. 42794286.

58. Mosquera L., Forristall C., Zhou Y., King M.L. A mRNA localized to the vegetal cortex of Xenopus oocytes encodes a protein with a nanos-like zinc finger domain // Development 1993. V. 117. P. 377-386.

59. Okada M., Kleinman I.A., Schneiderman H.A. Chimeric Drosophila adults produced by transplantation of nuclei into specific regions of fertilized eggs // Dev. Biol. 1974. V. 39(2). P. 286294.

60. Reek-Peterson S. L., Provance D.W. Jr., Mooseker M.S., Mercer J.A. Class V myosins // Biochim. Biophys. Acta 2000. V. 1496. P. 36-51.

61. Ressom R.E., Dixon K.E. Relocation and reorganization of germ plasm in Xenopus embryos after fertilization // Development 1988. V. 103. P. 507-518.

62. Robb D.L., Heasman J., Raats J., Wylie C. A kinesin-like protein is required for germ plasm aggregation in Xenopus II Cell 1996. V. 87. P. 823-831.

63. Robin C. Memoire sur la production des cellules du blastoderme sans segmentation du vitellus chez quelques articules // C. r. Acad. Sci. 1862. V. 54. P. 150-153.

64. Rowning B.A., Wells J., Wu M., Gerhart J.C., Moon R.T., Larabell C.A. Microtubule-mediated transport of organelles and location of beta-catenin to the future dorsal side of Xenopus eggs // Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997. V. 94. P. 1224-1229.

65. Ruggiu M., Speed R., Taggart M., McKay S.J., Kilanowski F., Saunders P., Dorin J., Cooke

66. H. J. The mouse Dazla gene encodes a cytoplasmic protein essential for gametogenesis // Nature 1997. V. 389. P. 73-77.

67. Saitou M., Barton S.C., Surani M.A. A molecular programme for the specification of germ cell fate in mice // Nature 2002. V. 418. P. 282-283.

68. Sakai M. The vegetal determinants required for the Spemann organiser move equatorially during the first cell cycle //Development 1996. V.122. P. 2207-2214.

69. Sam brook J., Russell D. Molecular cloning: a laboratory manual // Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY 2001.

70. Schroeder M.M., Gard D.L. Organization and regulation of cortical microtubules during the first cell cycle of Xenopus eggs II Development 1992. V. 114. P. 699-709.

71. Seydoux G., Dunn M. Transcriptionally repressed germ cells lack a subpopulation of phosphorilated RNA polymerase II in early embryos of C.elegans and Drosophila // Development 1997. V. 124. P. 2191-2201.

72. Smith L.D. The role of a "germinal plasm" in the formation of primordial germ cells in Rana pipiens II Dev. Biol. 1966. V. 14(2). P. 330-347.

73. Stennard F., Carnac G., Gurdon J.B. A Xenopus T-box gene, antipodean, encodes a vegetal ly localized maternal mRNA that can trigger mesoderm formation // Development 1996. V. 122. P. 2359-2366.

74. Tam P.P., Zhou S.X. The allocation of epiblast cells to ectodermal and germ-line lineages is influenced by the position of the cells in the gastrulating mouse embryo // Dev. Biol. 1996. V. 178. P. 124-134.

75. Thomsen G.H., Melton D.A. Processed Vgl protein is an axial mesoderm inducer in Xenopus II Cell 1993. V. 74. P. 433-441.

76. Van Doren M., Broiher H., Moore L., Lehmann R. HMG-CoA reductase guides migrating primordial germ cells // Nature 1997. V. 396. P. 466-469.

77. Wilson M.J., Salata M.W., Susalka S.J., Pfister K.K. Light chains of mammalian cytoplasmic dynein: identification and characterization of a family of LC8 light chains // Cell Motil. Cytoskeleton 2001. V. 49. P. 229-240.

78. Wu H., King S.M. Backbone dynamics of dynein light chains // Cell Motil. Cytoskeleton 2003. V. 54. P. 267-273.

79. Wylie C.C., Heasman J., Snape A., O'Driscoll M., Holwill S. Primordial germ cells of Xenopus laevis are not ineversibly determined early in development // Developmental Biology 1985. V. 112. P. 66-72.

80. Ying Y., Zhao G.Q. Cooperation of endoderm-derived Bmp2 and extraembryonic ectoderm-derived Bmp4 in primordial germ cell generation in the mouse // Dev. Biol. 2001. V. 232. P. 484492.

81. Yisraeli J.K., Sokol S., Melton D.A. The process of localizing of maternal messenger RNA in Xenopus oocytes // Development 1989. V. 107. P. 31-36.

82. Yisraeli J.K., Sokol S., Melton D.A. A two-step model for the localization of maternal mRNA in Xenopus oocytes: involvement of microtubules and microfilaments in the translocation and anchoring of Vgl mRNA // Development 1990. V. 108. P. 289-298.

83. Yoneda M., Kobayakawa Y., Kubota H., Sakai M. Surface contraction waves in amphibian eggs // J. Cell Sci. 1982. V. 54. P. 35-46.

84. Zalokar M. Transplantation of nuclei into the polar plasm of Drosophila eggs // Dev. Biol. 1973. V. 32(1). P. 189-193.

85. Zernicka-Goetz M. Fertile offspring derived from mammalian eggs lacking either animal or vegetal poles // Development 1998. V. 125. P. 4803-4808.

86. Zhang J., King M.L. Xenopus VegT RNA is localized to the vegetal cortex during oogenesis and encodes a novel T-box transcription factor involved in mesodermal patterning // Development 1996. V. 122. P. 4119-4129.

87. Zhao G.Q., Garbers D.L. Male germ cell specification and differentiation // Developmental Cell 2002. V. 2. P. 537-547.

88. Zhou Y., King M.L. RNA transport to the vegetal cortex of Xenopus oocytes // Dev. Biol. 1996. V. 179. P. 173-183.