MOB(TMEM 23)-новый ген человека: особенности строения и функционирования тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.03, кандидат биологических наук Владыченская, Ирина Петровна

• Владыченская, Ирина Петровна
• кандидат биологических наук
• 2004

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Владыченская, Ирина Петровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность проблемы б

1.2. Цель и задачи исследования

1.3. Научная новизна

1.4. Практическая значимость работы ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Поиск новых генов

2.1. Биохимические методы

2.1.1. Традиционный подход к выявлению новых генов

2.1.2. Обратная генетика - еще один подход к поиску новых генов

2.1.2.1. Позиционное клонирование

2.1.2.2. Анализ клонотек кДНК и поиск генов тканеспецифических белков

2.1.2.3. Глобальные методы исследования экспрессии и их вклад в обнаружение новых генов

2.1.2.3.1. Поиск новых генов с помощью метода дифференциального дисплея мРНК

2.1.2.3.2. Поиск новых генов при помощи экспрессионных ДНК-микрочипов

2.2. Компьютерные методы

2.2.1. Секвенирование генома человека и совершенствование методов биоинформатики - возможность принципиально нового подхода к поискам генов

2.2.2. Использование базы данных экспрессирующихся последовательностей (EST) для поиска новых генов

2.2.2.1. Глобальные стратегии поиска новых генов in silico, или "количественный поиск"

2.2.2.1.1. Использование последовательностей клонотек кДНК для клонирования in silico

2.2.2.1.2. Клонирование in silico путем сопоставления протяженных геномных последовательностей с последовательностями EST

2.2.2.2. Направленный поиск генов, или "качественный поиск"

2.2.3. Уточнение структуры генов компьютерными методами

2.2.3.1. Определение экзон-интронной структуры генов

2.2.3.2. Поиск альтернативных продуктов транскрипции генов, клонированных in silico

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. Клонирование последовательности кДНК НшоЬЗЗ

3.1.1. Бактериальные штаммы, плазмиды и векторы для клонирования

3.1.2. Среды и растворы

3.1.3. Выделение однонитевой формы ДНК бактериофагов

М13 тр18 и М13 тр

3.1.4. Выделение двунитевой формы ДНК бактериофагов М13 шр18 и М13 тр

3.1.5. Выделение ДНК рекомбинантной плазмиды pUC со вставкой клона НшоЬЗЗ

3.1.6. Рестрикция плазмидной и фаговой ДНК

3.1.7. Клонирование фрагментов последовательности

НтоЬЗЗ в ДНК бактериофага М

3.1.7.1. Препаративное разделение фрагментов ДНК в агарозном геле

3.1.7.2. Элюция фрагментов ДНК из агарозного геля и их последующая очистка

3.1.7.3. Обработка препаратов векторной ДНК бактериальной щелочной фосфатазой

3.1.7.4. Получение рекомбинантных молекул фага М

3.1.7.5. Получение компететных клеток

3.1.7.6. Трансформация компетентных клеток

3.2. Определение первичной структуры клона НтоЬЗЗ методом секвенирования по Сэнгеру

3.3. Электрофоретическое фракционирование продуктов реакции секвенирования ДНК

3.4. Локализация последовательности клона НтоЬЗЗ на хромосомах человека

3.4.1. Олигонуклеотидные праймеры

3.4.2. Условия амплификации

3.4.3. Электрофоретическое разделение продуктов ПЦР

3.5. Выделение РНК из тканей человека

3.5.1. Выделение тотальной РНК

3.5.2. Получение полиаденилированной фракции мРНК хроматографией на микроколонках с олиго(dT)-целлюлозой

3.6. Нозерн-блот гибридизация

3.6.1. Фракционирование образцов в агарозном геле и перенос РНК на гибридизационный фильтр

3.6.2. Получение 32Р-меченого зонда

3.6.3. Гибридизация мРНК, иммобилизованной на фильтрах, с меченым зондом

3.7. ОТ-ПЦР

3.7.1. Обработка препаратов тотальной РНК ДНКазой I

3.7.2. Синтез одноцепочечной кДНК

3.7.3. Условия амплификации

3.7.4. Электрофорез продуктов ОТ-ПЦР в ПААГ

3.8. Саузерн-блот гибридизация

3.8.1. Фракционирование продуктов ОТ-ПЦР в агарозном геле

3.8.2. Перенос ДНК на нейлоновый фильтр

3.9. Секвенирование продуктов ОТ-ПЦР

3.9.1. Элюция продуктов ОТ-ПЦР из ПААГ

3.9.2. Автоматическое секвенирование

3.10. Удлинение праймера (Primer extension)

3.10.1. Получение 32Р-меченого маркера и олигонуклеотидных праймеров

3.10.2. Гибридизация меченых праймеров с поли(А)+ фракцией мРНК

3.10.3. Реакция удлинения праймера

3.10.4. Электрофоретическое фракционирование продуктов реакции удлинения праймера

3 .11 .Компьютерные методы анализа

3.11.1. BLAST-анализ нуклеотидных и аминокислотных последовательностей

3.11.1.1. Удлинение последовательности НтоЬЗЗ

3.11.1.2. Поиск белковых последовательностей, гомологичных гипотетическому белку Mob

3.11.2. Поиск и анализ предполагаемых промоторных областей

3.11.3. Поиск открытых рамок считывания и компьютерная трансляция нуклеотидных последовательностей

3.11.4. Анализ структуры предполагаемых белковых продуктов

3.11.4.1. Поиск трансмембранных доменов

3.11.4.2. Выявление известных функциональных мотивов, присутвующих в послеовательности белка Mob

3.11.5. Выравнивание последовательнотей белков-гомологов Mob

4. РЕЗУЛЬТАТЫ

4.1. Определение нуклеотидной последовательности клона НшоЬЗЗ

4.2. Локализация последовательности клона НшоЬЗЗ на хромосомах человека

4.3. In silico анализ последовательности клона НшоЬЗЗ и участка геномной последовательности, фланкирующего его с 3'-конца

4.4. In silico конструирование контига НМОВЗЗ гипотетического транскрипта гена MOB)

4.5. In silico определение экзон-интронной структуры предполагаемого гена MOB

4.6. Анализ гипотетического транскрипта гена MOB (последовательности BN000143)

4.7. Выявление транскриптов, соответствующих предсказанному in silico гену MOB, в тканях человека

4.8. Идентификация обнаруженных транскриптов гена MOB

4.9. Определение первичной структуры двух транскриптов гена MOB

4.10.Определение точек инициации транскрипции гена MOB

4.11.1л silico анализ участка геномной последовательности, фланкирующего 5'- конец гена MOB

4.12.Анализ экспрессии гена MOB в тканях человека

4.13.1л silico определение и анализ предполагаемых белковых продуктов, кодируемых транскриптами гена MOB

4.14.Идентификация белка Mob. Поиск и анализ последовательностей белков, паралогичных Mob

4.15.Выявление групп предполагаемых ортологов белков Mob, parlMob и par2Mob

4.16.Оценка степени эволюционного консерватизма белков

Mob,parlMob и par2Mob

4.17.Выявление функциональных мотивов, характеризующих семейство белков Mob

4.18.Таблицы и рисунки

5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «MOB(TMEM 23)-новый ген человека: особенности строения и функционирования»

По предварительным оценкам, геном человека включает не менее 30 тысяч генов, из которых в настоящее время изучено менее половины. Поиск и идентификация неизвестных генов человека и исследование их структурно-функциональных особенностей, а также характеристика кодируемых ими белковых продуктов является одним из наиболее актуальных направлений современной молекулярной биологии. Выявление всех генов человека, установление карты тканеспецифичности их экспрессии, построение картины их взаимодействия будут являться факторами, которые предопределят переход молекулярной биологии на новый, более высокий уровень -уровень интегративного анализа (Свердлов, 1999), а также дадут более глубокое понимание природы физического и психического здоровья человека и откроют новые пути для развития медицины.

Широкомасштабные исследования, в результате которых стали известны полные последовательности геномов многих организмов, в том числе человека (Venter et al., 2001; Lander, 2001), предоставляют возможность быстро и эффективно решать проблему поиска новых, еще не описанных генов, и кодируемых ими белковых продуктов (Strausberg and Austin, 1999). В частности, анализ баз данных геномных и экспрессирующихся последовательностей человека, проводимый методами современной биоинформатики, позволяет вычленять последовательности, соответствующие отдельным генам, в их числе неизвестным ранее, а также получать информацию, касающуюся структуры и локализации этих генов.

Особый интерес представляет идентификация и анализ генов, специфически экспрессирующихся в различных тканях и определяющих особенности их функционирования. Уникальным объектом исследования является головной мозг человека. Отличительным свойством этого органа является то, что в нем, по сравнению с другими органами, имеется наибольшее количество морфологически и функционально различающихся клеточных популяций. Они осуществляют разнообразные функции, для реализации которых требуется множество белковых продуктов, и, следовательно, экспрессия очень большого числа генов. Таким образом, поиск новых генов и генных семейств, определяющих специфичность функционирования биохимических систем мозга и их регуляции, является актуальным направлением современной молекулярной биологии.

1.2. Цель и задачи исследования

Ранее в целях выявления генов, специфически экспрессируюгцихся в мозге человека, на основе полиаденилированной фракции РНК некоторых отделов головного мозга человека в нашей лаборатории были получены клонотеки кДНК. Дифференциальный скрининг клонотек позволил отобрать несколько клонов, в том числе НшоЬЗЗ (клон № 33 из клонотеки кДНК продолговатого мозга человека, human medulla oblongata), последовательности которых экспрессировались преимущественно в головном мозге человека (Буякова и соавт., 1992).

В целях выявления и идентификации гена, активного преимущественно в тканях головного мозга человека и включающего в себя последовательность НтоЬЗЗ, а также для изучения его структурной организации и особенностей функционирования были поставлены следующие задачи:

• Определить первичную структуру экспрессирующейся последовательности НтоЬЗЗ и сравнить ее с последовательностями ранее изученных генов;

• Установить нуклеотидную последовательность транскрипта, включающего последовательность НтоЬЗЗ, и охарактеризовать структурную организацию соответствующего гена;

• Провести анализ экспрессии гена, включающего последовательность НтоЬЗЗ, в разных тканях человека;

• Определить in silico предполагаемую структурную организацию белковых продуктов, кодируемых исследуемым геном;

• Провести филогенетический анализ обнаруженного гена.

1.3. Научная новизна

Обнаружен неизвестный ранее ген человека MOB {ТМЕМ 23), гипотетический белковый продукт которого совпадает с недавно идентифицированной последовательностью фермента фосфатидилхолин-церамид холинфосфотрансферазы 1 (сфингомиелинсинтетазы 1). Впервые описана хромосомная локализация и геномная структура данного гена, а также охарактеризованы особенности организации транскрипта. Впервые исследована транскрипционная активность гена MOB {ТМЕМ 23) и показано, что изучаемый ген экспрессируется в широком спектре тканей человека. Обнаружено участие процессов альтернативного сплайсинга в регуляции функционирования изучаемого гена; идентифицированы и охарактеризованы два альтернативно сплайсируемых транскрипционных варианта мРНК. Высказаны предположения о механизмах, регулирующих уровень активности гена MOB {ТМЕМ 23) в организме. Выявлено неизвестное ранее древнее семейство генов, включающее в свой состав MOB (ТМЕМ 23), а также показана эволюционная консервативность белковых продуктов, кодируемых генами этого семейства.

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Владыченская, Ирина Петровна

выводы

1. В результате in vitro и in silico исследования клона НшоЬЗЗ, полученного ранее из клонотеки кДНК продолговатого мозга человека, обнаружен новый ген. В структуре идентифицированного гена, названного MOB (номенклатурное название - ТМЕМ 23), НшоЬЗЗ представляет З'-некодирующую область. Ген MOB {ТМЕМ23) протяженностью 320 т.п.н. располагается на десятой хромосоме человека, в области 10ql 1.2, и состоит, по меньшей мере, из одиннадцати экзонов.

2. MOB (ТМЕМ 23) является представителем неизвестного ранее эволюционно древнего генного семейства, включающего три паралогичных гена. Экзон-интронная организация кодирующих областей всех трех генов консервативна у представителей теплокровных.

3. Транскрипционная активность MOB (ТМЕМ 23) характеризуется использованием механизмов альтернативного сплайсинга для синтеза мРНК, различающихся строением как кодирующей, так и 5'-нетранслируемой областей. Идентифицированы два альтернативных транскрипта MOB (ТМЕМ 23); последовательность одного из этих транскриптов включает в себя экзоны I-XI, последовательность второго отличается отсутствием экзона VII.

4. Регуляция функционирования гена MOB (ТМЕМ 23) предположительно осуществляется на нескольких уровнях. Транскрипционный уровень контроля представлен использованием альтернативных промоторов, пост-транскрипционный -синтезом альтернативно сплайсируемых форм транскриптов гена.

5. Ген MOB (ТМЕМ23) экспрессируется в широком спектре тканей человека. Наиболее высокая представленность изученных транскриптов гена показана в тканях головного мозга.

6. MOB (ТМЕМ 23) является геном, кодирующим эволюционно консервативные интегральные мембранные белки. Гипотетическая последовательность белка, кодируемого основным транскриптом, совпадает с недавно идентифицированной последовательностью фермента фосфатидилхолин-церамид холинфосфотрансферазы

1 (сфингомиелинсинтетазы 1). Эти данные позволяют заключить, что нами обнаружен и охарактеризован не изученный ранее ген сфингомиелинсинтетазы 1.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Владыченская, Ирина Петровна, 2004 год

1. Буякова О.И., Баринова Е.И., Дергунова Л.В., Хаспеков ГЛ., Чивилев И.В., Лимборская С.А., Выделение и анализ мозгоспецифических последовательностей из библиотек кДНК разных отделов мозга человека, // Генетика, 1992, т. 28, с. 4046.

2. Киселев Л. Л., Молекулярная биология от 1970 до 2000 и дальше // Биоорганическая химия, 2000, т. 26, №10, с.767-771.

3. Свердлов Е. Д., Микрокосм генома // Молекулярная биология, 1999, т. 33, №6, с. 917-940.

4. Копанцев Е. П., Нестерова Т. Д., Бородин А. М., Закиян С. М. Создание картипующей панели гибридных клеток человек-грызун // Генетика, т.29, №9:14401451.

5. Фролов А.Е., Годвин Э.К., Фаворова О.О. Анализ дифференциальной экспрессии генов на ДНК-микрочипах и его применение в молекулярной онкологии. // Молекулярная биология, 2003, т. 37, №4, с. 573-584.

6. Adams MD, Celniker SE, Holt RA, Evans С A et. al. The genome sequence of Drosophila melanogaster // Science 2000 Mar 24;287(5461):2185-95.

7. Adams MD, Dubnick M, Kerlavage AR, Moreno R, Kelley JM et. al. Sequence identification of 2,375 human brain genes // Nature 1992 Feb 13;355(6361):632-4.

8. Adams MD, Kelley JM, Gocayne JD, Dubnick M et. al. Complementary DNA sequencing: expressed sequence tags and human genome project // Science 1991 Jun 21 ;252(5 013): 1651 -6.12