Линкерные гистоны семейства Н1 суперкомпактного хроматина спермиев: Конформационные особенности и взаимодействие с ДНК тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.25, кандидат биологических наук Чихиржина, Елена Всеволодовна

• Чихиржина, Елена Всеволодовна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Чихиржина, Елена Всеволодовна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Цели и задачи исследования

Научная новизна и научно-практическая ценность

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ

О СТРУКТУРЕ ХРОМАТИНА

1.1.1. Первый уровень организации хроматина

1.1.2.30-нм фибрилла. /

1.1.3. Модели 30-нм фибриллы. ^-Ч'"''

1.1.4. Петельный уровень организации хроматина

1.1.5. Метафазная хромосома

1.2. ГИСТОНЫ

1.2.1. Гистоны семейства Н1

1.2.2. Постсинтетические модификации гистонов

семейства Н1

1.2.3. Взаимодействие гистонов семейства Н1 с ДНК

1.3. НЕГИСТОНОВЫЕ БЕЛКИ ХРОМАТИНА

1.3.1. ЬНУЮ белки

1.3.2. Белки семейства НМ01/2

1.3.3. Взаимодействие белков НМ01 и 2 с ДНК и

хроматином

1.4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. 2.1. Выделение спермий-специфических белков и негистоновых белков НМ01 и 2.

2.2. Выделение глобулярных фрагментов белков

2.3. Анализ белков

2.5. ДНК

2.6. Искусственные комплексы ДНК с гистонами

семейства Н1

2.7. Метод кругового дихроизма

2.7.1. Применение метода кругового дихроизма в исследовании структуры нуклеиновых кислот

2.6.2. Применение метода кругового дихроизма в исследовании структуры белков

2.6.3. Регистрация спектров кругового дихроизма. 55 2.7.2. Компьютерный анализ спектров кругового

дихроизма

2.8. Спектрофотометрическое плавление

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Электрофоретический анализ белков

3.2. Особенности вторичной и третичной структуры

гистонов семейства Н1

3.2. Конформационные особенности вторичной

структуры негистоновых белков НМХ}1 и 2

3.3. Компактизация хроматина на модельной системе ДНК-белковых комплексов

3.4. Термостабильность ДНК при взаимодействии с

гистонами семейства Н1

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.

113

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Линкерные гистоны семейства Н1 суперкомпактного хроматина спермиев: Конформационные особенности и взаимодействие с ДНК»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Исследование структуры хроматина находится в центре проблем современной молекулярной биологии и биофизики. Белки хроматина обеспечивают компактную упаковку ДНК в ядре и принимают участие в процессе управления дифференциальной экспрессией генов [РекепГеМ в., 1992]. В настоящее время важная роль в организации структуры хроматина приписывается гистонам семейства Н1. Эта фракция, связанная с линкерным участком ДНК, отвечает за поддержание высших уровней его структурной организации и, таким образом, по-видимому, участвует в процессах компактизации-декомпактизации хроматина при его функционировании.

Удобной моделью для исследования влияния структуры хроматина на экспрессию генов являются клетки спермиев, в которых хроматин находится в транскрипционно неактивном состоянии. В таких клетках ДНК упакована более плотно, чем в соматических клетках.

В процессе сперматогенеза типичные соматические клетки претерпевают биохимические и морфологические изменения: элиминируется цитоплазма и образуются жгутики, прекращается репликация ДНК, осуществляется высокая степень компактизации ядерной ДНК, достигается полная репрессия активности генов. Ядро спермия в отличие от ядер терминально дифференцированных клеток после оплодотворения должно быть реактивировано. Поэтому эти структурные изменения ДНК в сперматозоидах должны быть обратимыми.

В упаковке ДНК спермиев принимают участие различные типы белков. В противоположность относительно постоянному набору из четырех гистонов нуклеосомного кора (Н2А, Н2В, НЗ и Н4) и линкерного гистона Н1, образующих комплекс с ДНК в хроматине соматических

клеток [Kornberg, 1977; Laybourn and Kadonaga, 1991; Fedor, 1992; Felsenfeld, 1992; Travers, 1992; Widom, 1998], в ядрах спермиев многих животных обнаружены различные основные белки. Все разнообразие смены белкового состава в процессе сперматогенеза можно свести к трем основным вариантам: гистоны замещаются на спермий-специфические варианты, тиопротамины или протамины, помимо гистонов появляются дополнительные S-белки.

В случае замены гистонов на протамины или промежуточные белки происходит исчезновение нуклеосомной структуры хроматина [Kierszenbaum and Très, 1978; Ausio and Subirana, 1982], в то время как наличие гистонов в хроматине спермиев некоторых видов морских беспозвоночных и рыб сохраняет нуклеосомную организацию этого хроматина [Keishline and Wasserman, 1979; Kadura et al., 1983; Poccia, 1986; 1992]. Таким образом, существует несколько механизмов структурных перестроек хроматина, сопровождающих репрессию генома сперматозоидов.

Наиболее интересной является замена гистонов семейства HI на их спермий-специфические варианты [Zalenskaya et al., 1981; Misselwitz et al., 1986; Poccia, 1986; Рамм и др, 1987]. В этом случае в линкерных гистонах увеличивается содержание аргинина до 10-16%, в то время как в соматических клетках эта величина составляет 1-2% [Jenson et al., 1980; Zalenskaya et al., 1981; Misselwitz et al., 1986]. Аргинин способен к более сильным взаимодействиям с ДНК за счет образования водородных связей с остатками фосфорной кислоты, чем лизин, который взаимодействует с ДНК в основном электростатически. Имеются предположения, что увеличение количества аргинина в линкерных белках приводит в процессе сперматогенеза к увеличению плотности упаковки ДНК в ядре и коррелирует с увеличением длины линкерного участка ДНК в нуклеосоме [Костылева и др., 1989], и уменьшением транскрипционной активности ядра [Villeponteau et al., 1992]. Кроме того, спермий-специфические белки

характеризуются более длинной по сравнению с соматическими гистонами полипептидной цепью и более высокой степенью а-спиральности [Crane-Robinson et al., 1984; Misselwitz et al., 1986; Puigdomenech et al., 1987; Рамм и др., 1995; Чихиржина и др., 1998]. Удлинение цепи происходит за счет повторяющихся протаминоподобных вставок Ser-Pro-Lys(Arg)-Lys(Arg) в концевых доменах спермий-специфических гистонов [Von Holt et al., 1979].

Цели и задачи исследования.

Цель предлагаемой работы состояла в том, чтобы выявить связь между физико-химическими свойствами ядерных белков, их конформационными особенностями, и уровнем транскрипционной активности ядер, из которых они выделены, а также исследование процесса компактизции-декомпактизации хроматина на модельных системах ДНК-белковых комплексов. Адекватным методом решения поставленных задач является метод кругового дихроизма. В соответствии с целью исследования были поставлены следующие задачи:

1. Методом кругового дихроизма выявить конформационные особенности вторичной и третичной структуры спермий-специфических белков хроматина морского ежа, морской звезды, двустворчатого моллюска и соматического гистона из тимуса крыс в различных ионных условиях.

2. Исследовать термостабильность вторичной и третичной структуры спермий-специфических белков семейства HI.

3. Выделить и охарактеризовать глобулярные фрагменты соматического гистона HI тимуса крыс и гистона HI хроматина спермиев морского ежа.

4. Методами кругового дихроизма и спектрофотометрического плавления исследовать процессы компактизации-декомпактизации хроматина спермиев на модельных системах ДНК-белковых комплексов.

Научная новизна и научно-практическая ценность работы.

В предлагаемой работе методом кругового дихроизма (КД) было проведено исследование конформационных особенностей спермий-специфических гистонов семейства Н1 некоторых морских беспозвоночных. Выявление особенностей структурного состояния белков хроматина спермиев позволило нам высказать предположение о существовании по крайней мере двух различных механизмов, приводящих к суперкомпактной укладке хроматина зрелых сперматозоидов морских беспозвоночных. Исследование термостабильности интактных молекул гистонов Н1 тимуса крыс и спермиев морского ежа и выделенных из них глобулярных фрагментов показало, что структура глобулярной части молекул стабилизируется их концевыми участками.

Впервые в этой работе были охарактеризованы конформационные особенности спермий-специфического гистона Н1, выделенного из хроматина морской звезды Aphelasterias japónica и его искусственных комплексов с ДНК. Было показано, что по своим структурным характеристикам этот белок близок к линкерному гистону Н1 хроматина спермиев морского ежа.

Кроме того, в этой работе были охарактеризованы структурные перестройки ДНК и гистонов при их взаимодействии и изучены образующиеся при этом надмолекулярные ассоциаты. Было показано, что гистон Н1 спермиев моллюска, обладая наибольшей способностью образовывать левоспиральные структуры и наименьшей - а-спиральные участки, при взаимодействии с ДНК формирует комплексы, которые не образуют высокоупорядоченные специфические структуры. Возможно, для образования таких структур существенным является взаимодействие кластеров на поверхности a-спиральных участков, способствующее регулярной организации таких ассоциатов. В гистонах Н1 хроматина спермиев морской звезды и морского ежа таких структур больше, и это может объяснить более ярко выраженную способность их комплексов с

ДНК образовывать конденсированные структуры. Мы предполагаем, что взаимодействие спермий-специфических гистонов с ДНК происходит одновременно и в большом и в малом желобке двойной спирали ДНК, в то время как соматический гистон Н1 связывается с ДНК только в большом желобке.

Методом спектрофотометрического плавления было показано, что при образовании комплексов ДНК с гистонами Н1 участки ДНК, связанные с белком, стабилизированы по отношению к тепловой денатурации.

Полученные в работе результаты важны для понимания связи между структурой хроматина и его функционированием. Выявление структурных особенностей гистонов семейства Н1, входящих в состав суперкомпактного хроматина спермиев, а также изучение влияния этих гистонов на структуру ДНК при их взаимодействии и на физико-химические особенности полученных комплексов являются важными условиями понимания механизмов, обусловливающих стабильность структуры супер компактного хроматина спермиев.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О СТРУКТУРЕ

ХРОМАТИНА

Генетический материал клеток высших организмов - хроматин -представляет собой иерархически организованную структуру. Длина ДНК, входящей в состав хромосомы, - больше метра, в то время как размер клеточного ядра - всего несколько микрон. До сих пор непонятно, как происходит упаковка ДНК в хромосомах. Этот вопрос играет важную роль в биологии, так как он является не только структурным, а тесно связан с проблемой функционирования генетического аппарата клетки.

1.1.1. Первый уровень организации хроматина.

Хроматин - это цепь плотно прилегающих друг к другу нуклеосом. Фундаментальным элементом этой структуры традиционно считается нуклеосома. Компактная структура нуклеосомы поддерживается межмолекулярными взаимодействиями между ДНК и гистонами. В состав нуклеосомной коровой частицы - октамера - входит гистоновый белковый кор [Mirzabekov, 1980; Воробьев, 1986; Straka and Horz, 1991; Fedor, 1992; Felsenfeld, 1992; Svaren and Horz, 1993; Luger et al., 1997; Ramakrishnan, 1997; Widom, 1998], содержащий по две молекулы гистонов H2A, H2B, НЗ и Н4, и фрагмент ДНК длиной 147 пар оснований, обвивающий октамер гистонов. Каждая нуклеосомная коровая частица ассоциирована с дополнительной молекулой линкерного гистона HI или Н5 (вариант HI, обнаруженный в хроматине птиц). Комплекс коровой частицы, линкерного гистона и участка линкерной ДНК между соседними частицами называется нуклеосомой.

Структура гистонового октамера в отсутствии ДНК была получена с помощью метода рентгеноструктурного анализа с разрешением 3.1 A [Arents et al., 1991], а недавно при разрешении 2.8 А была получена кристаллическая структура целой нуклеосомной коровой частицы [Luger et al., 1997].

Октамер гистонов состоит из (Н3-Н4)2 тетрамера и двух Н2А-Н2В димеров. Эта частица - нуклеосомный кор или минимальная нуклеосома -имеет форму плоского диска размером 11x11x5,7 нм и разделена на два слоя.

Структура коровых гистонов очень близка: каждый из них состоит из структурированного глобулярного домена и неструктурированных NH2- и СООН-хвостов [Luger et al., 1997]. Глобулярный домен состоит из трех а-спиралей, которые образуют две петли. Этот мотив отвечает за образование Н2А-Н2В и НЗ-Н4 гетеродимеров, которые соединяются в октамер. Этот участок гистонов консервативен и идентифицирован во многих активаторах и репрессорах транскрипции. [Luger et al., 1997]. Глобулярные фрагменты коровых гистонов вовлечены в гистон-гистоновые и ДНК-гистоновые взаимодействия, которые важны для структурного единства нуклеосомы. N-концевые участки гистонов принимают участие во взаимодействии между нуклеосомами. Кроме того, важной функцией N-концевых фрагментов коровых гистонов является их взаимодействие с негистоновыми регуляторными белками и мультибелковыми комплексами [Hansen et al., 1998]. Каждая пара histone-fold (половина тетрамера НЗ-Н4 или димера Н2А-Н2В) связана с 27-28 п.н. ДНК, оставляя свободным линкерный участок в 4 п.н.

Анализ данных рентгеноструктурного анализа нуклеосомы позволяет сделать предположение, что N-концевые домены гистонов нуклеосомного кора вовлечены в нуклеосом-нуклеосомные взаимодействия [Rhodes, 1997]. N-концевые участки гистонов НЗ и Н2В располагаются в минорной бороздке

ДНК и пронизывают ее через каждые 20 п.н. Концевые участки гистонов Н4 контактируют с поверхностью димера Н2А-Н2В соседних нуклеосом.

Многочисленные исследования подтвердили присутствие нуклеосомной структуры в хроматине всех эукариот. Данные рентгеноструктурного анализа и спектроскопии комбинационного рассеяния показали, что в составе нуклеосомной частицы конформация двойной спирали ДНК находится в пределах семейства В-формы [Goodwin et al., 1978; Finch etal., 1981].

Участок ДНК, приходящийся на одну нуклеосому, принято называть нуклеосомным повтором. Эта величина является характеристикой данного типа хроматина. Например, для соматических тканей эукариот эта величина составляет 195+5 пар оснований, для транскрипционно неактивного хроматина спермиев морского ежа - 237±5 п.н. [Zalenskaya, Zalensky, 1980], а морской звезды - 224+6 [Zalenskaya et al., 1980].

При исследовании структуры хромосом основная информация была получена из анализа продуктов постепенного гидролиза хроматина различными нуклеазами. Микроккоковая нуклеаза сначала расщепляют хроматин на олигонуклеосомные олигомеры из восьми субъединиц, после этого освобождаются отдельные нуклеосомы, у которых длина ДНК составляет 200 пар оснований. При дальнейшем гидролизе длина ДНК укорачивается до 165 пар оснований. Эта полустабильная частица содержит гистон HI. При продолжении гидролиза гистон HI теряется, и ДНК укорачивается до 146 пар оснований. Недавно было показано, что этот отрезок ДНК образует 1,65 витка левой суперспирали вокруг октамера гистонов [Luger et al., 1997]. В зависимости от типа клеток минимальные нуклеосомы соединены линкерной ДНК разной длины (от 20 до 105 пар оснований) [Osipova et al., 1980; Zalenskya et al., 1981; McGhee et al., 1983;

Рамм и др., 1986; Осипова и др., 1990; Рамм Е.И. и др., 1993а]. При обработке ядер эритроцитов голубя ДНКазой I и ДНКазой II было обнаружено существование фрагментов ДНК, длина которых кратна двойной длине нуклеосомной ДНК [Воробьев, 1986]. Эти эксперименты показали наличие в хроматине эритроцитов особой структурной единицы, состоящей из двух нуклеосом - нуклеодисома. Такая повторяющаяся единица была обнаружена в хроматине спермиев морского ежа и ряда других морских беспозвоночных, т.е. в хроматине транскрипционно неактивных клеток.

С линкерным участком ДНК связаны гистоны семейства HI или Н5 в хроматине птиц (гистон Н5 - вариант гистона HI, в котором многие остатки лизина замещены на аргинин) и негистоновые белки хроматина. Среди негистоновых белков наиболее изучены белки с высокой электрофоретической подвижностью - HMG-белки [EcKner and Birnstiel, 1989]. Это относительно низкомолекулярные белки с высоким содержанием диамино-дикарбоновых аминокислот.

Эксперименты по разрушению хроматина микроккоковой нуклеазой показали, что гистон HI образует комплекс с участком ДНК длиной в 20 пар оснований [Noll and Kornberg, 1977]. Гистон HI связывает вместе нуклеосомы и принимает участие в организации высших структур хроматина [Finch and Klug, 1976; Thoma et al., 1979; Widom, 1998]. С нуклеосомными гистонами он связан через СООН-концевой участок гистона Н2А и, вероятно, через NH2 -конец гистона Н4 [Baneres et al., 1994].

Эксперименты по исследованию влияния гистона HI на процесс энерго-зависимой доступноности ДНК показали, что в зависимости от количества гистона HI изменяется длина нуклеосомного повтора [Varga-Weisz et al., 1995]. При реконструкции хроматина в присутствии экстрактов ранних эмбрионов дрозофиллы добавление гистона HI до одной молекулы на

нуклеосому приводит к увеличению длины нуклеосомного повтора и к уменьшению доступности ДНК факторам транскрипции. Предполагается, что нуклеосомный повтор увеличивается на 20 п.н. Увеличение количества HI до двух молекул на нуклеосому (такое количество HI обнаружено в хроматине спермиев) приводит к увеличению длины нуклеосомного повтора с 185 (при ионной силе 120 мМ NaCl) до 225 п.н. и доступность ДНК уменьшается в большей степени. Вероятно, гистон HI в транскрипционно неактивном хроматине защищает ДНК от атаки транскрипционных факторов. Это может быть механизмом, от которого зависит степень доступности ДНК и который контролируется гистоном HI.

1.1.2. 30-нм фибрилла.

Следующим после нуклеосом уровнем компактизации ДНК в хроматине является образование фибрилл диаметром около 30-нм. Сворачивание ДНК в такую структуру сокращает ее размеры в 40-50 раз. При образовании 30-нм фибриллы необходимо учитывать ионные условия. В растворе низкой ионной силы (1-10 мМ) нуклеосомные фибриллы находятся в релаксированном состоянии и выглядят как структуры типа "зиг-заг" [Thoma et al., 1979]. При увеличении ионной силы раствора от 10 до 100 мМ или при добавлении в раствор ионов Mg или Са наблюдается компактизация нуклеосом с образованием фибрилл, имеющих суперспиральную структуру, с шагом примерно 10 нм и диаметром 30-нм [Crane-Robinson et al., 1984]. Фундаментальной структурной единицей 30-нм фибриллы является хроматосома, которая содержит гистоновый октамер и одну молекулу гистона HI, которые связаны с 168 п.н. ДНК.

Обязательным условием образования 30-нм фибриллы является наличие гистона HI. Лишенные гистона HI фрагменты хроматина не способны образовывать полноценную 30-нм фибриллу, хотя при увеличении ионной силы раствора эти фрагменты могут в некоторой степени компактизоваться [Thoma et al., 1979; Osipova et al., 1980]. При добавлении к таким фрагментам некоторого количества гистона HI их способность конденсироваться полностью восстанавливается. Если в случае образования первого уровня организации хроматина гистон HI участвует в стабилизации уже созданной другими гистонами третичной структуры ДНК, то в случае возникновения 30-нм фибриллы важную роль, по-видимому, играют HI-HI взаимодействия. Аллан и др. [Allan et al., 1984] показали, что гистон HI, не содержащий N-концевой фрагмент, конденсирует хроматин также эффективно, как интактная молекула. Следовательно, за конденсацию хроматина отвечает С-концевой фрагмент гистона HI. N-концевой фрагмент используется в качестве "якоря", взаимодействуя с нуклеосомным кором, и отвечает за расположение гистона HI по отношению к нему.

В последние годы возобновился интерес к гистону HI. Новые данные по электронной и атомной микроскопии подтвердили точку зрения, что HI влияет на угол входа-выхода линкерной ДНК из нуклеосомы [Bednar et al., 1995; Hamiche et al., 1996; Bednar et al., 1998; Widom, 1998], а, следовательно, и на пространственное расположение нуклеосом. Исследования хроматина, обедненного HI, показали, что возможна компактизация хроматина и без HI [Widom, 1998]. Олигонуклеосомы, обедненные HI, могут сгибаться приблизительно так же, как и частицы, содержащие HI.

Помимо гистона HI важным фактором при создании наднуклеосомной структуры является целостность N-концевых участков коровых гистонов [Jordano et al., 1984]. Удаление при обработке трипсином N-концевых частей

коровых гистонов приводит к тому, что даже в присутствии HI в экспериментальных условиях структуру 30-нм фибриллы создать невозможно. Вероятно, N-концы гистонов кора могут либо непосредственно стабилизировать 30-нм структуру, либо корректировать места посадки гистона HI при образовании суперструктуры. Основные ЫН2-концы коровых гистонов, вероятно, стабилизируют взаимодействие между отдельными фибриллами [Woodcock and Horowitz, 1995].

1.1.3. Модели 30-нм фибриллы.

Для описания структуры 30-нм фибриллы предложено несколько моделей. Их можно разбить на несколько категорий: к одной категории относятся модели, которые рассматривают фибриллу как соленоид (модели непрерывной 30-нм фибриллы) [Finch and Klug, 1976; Butler, 1984; Widom and Klug, 1985; Widom et al., 1985]; к другой - те, которые описывают ее как супербид или нуклеомер (модели дискретной 30-нм фибриллы) [Renz et al., 1977].

Модели дискретной 30-нм фибриллы.

В основу этой модели положена упаковка нуклеосомы в супергранулы или супербиды [Renz et al., 1977]. Каждая гранула состоит из 6-10 нуклеосом. Плотно прилегающие друг к другу нуклеомеры образуют фибриллу, диаметр которой колеблется от 25 до 30 нм.

Идея такой организации хроматина основывается на двух типах данных. На электронномикроскопических фотографиях 30-нм фибрилла при определенных условиях состоит из нерегулярных уплотнений [Renz et al., 1977]. Модель дискретной 30-нм фибриллы не пользуется популярностью, так как такие структуры можно наблюдать только в растворах с ионной силой 40-

100 мМ. Многие считают, что эти структуры отражают наличие переходных форм при конденсации 30-нм фибриллы, которая продолжается вплоть до ионной силы в 150 мМ [Woodcock et al., 1984]. Модели непрерывной 30-нм фибриллы.

На основании изучения электронномикроскопических картин выделенного хроматина Финч и Клуг [Finch and Klug, 1976] предложили модель соленоидной укладки нуклеосомной фибриллы. Согласно этой модели нить плотно упакованных нуклеосом диаметром 10 нм, в свою очередь, образует суперспираль, шаг которой равен размеру нуклеосомы - 10 нм. На один виток спирали приходится 6-7 нуклеосом. Линкерная ДНК свернута или изогнута внутри такого соленоида [Butler, 1984].

В настоящее время все известные модели непрерывной 30-нм фибриллы по способу укладки в них межнуклеосомной ДНК можно разбить на три группы.

1. Линкерная ДНК свернута в виде суперспирали [Worcel and Benyajati, 1977; McGhee et al, 1980; McGhee et al., 1983].

Уорсел и Бенияти [Worcel and Benyajati, 1977] предложили модель, согласно которой глобулярная часть гистона HI расположена внутри соленоида, a N- и С-концевые домены взаимодействуют с межнуклеосомной ДНК. Таким образом гистон HI образует как бы каркас суперспирали, находясь внутри соленоида. Гистон HI взаимодействует с соседними молекулами гистона HI близлежащих нуклеосом. Модель, предложенная Макги и соавт. [McGhee et al., 1980], исключает возможность образования каркаса из гистона HI. Это соленоид, содержащий 6 нуклеосом на один виток суперспирали, расположенных в нем последовательно вдоль 11-нм нити. Плоские поверхности в основном параллельны оси фибриллы, однако положение нуклеосом в фибрилле не консервативно. Направление оси

второго порядка нуклеосомы и точное значение угла наклона частицы к оси фибриллы зависит от длины нуклеосомного повтора (с увеличением длины нуклеосомного повтора этот угол падает: у образцов с длиной линкерной ДНК в 10-80 н.п. угол колеблется от 33° до 20°). Авторы считают, что структура фибриллы стабилизируется взаимодействиями коровых гистонов с межнуклеосомной ДНК.

2. Линкерная ДНК нерегулярно свернута внутри соленоида.

Межнуклеосомная ДНК образует внутри соленоида петли [Thoma et al., 1979; Butler, 1984; Sen et al., 1986]. Петлеобразное строение линкера делает невозможным построение моделей для хроматина с величиной повторяющегося элемента от 163 до 176 пар нуклеотидов, а для повтора в 175 пар нуклеотидов требуется введение двух изломов-"кинков" в ДНК. Эта трудность преодолевается в моделях, допускающих зигзагообразную укладку линкерной ДНК [Sen et al., 1986].

3. Линкерная ДНК растянута.

Электронная микроскопия показала, что хроматиновые фибриллы в растворах с низкой ионной силой имеют зигзагообразную структуру. Предложенная Уорселом и соавт. [Worcel et al., 1981], Вудкоком и соавт. [Woodcock et al., 1984] модель "спирализованной ленты" (twisted ribbon) представляет собой двуспиральный соленоид, в котором в каждой из спиралей диаметром 11 нм соседними оказываются нуклеосомы через одну

вдоль нити ДНК. Соединены нуклеосомы плоскими поверхностями и связаны

*

между собой вытянутой межнуклеосомной ДНК, которая направлена вдоль оси симметрии 30-нм фибриллы. Линкерная ДНК не пересекает ось фибриллы и таким образом центр фибриллы остается пустым. Структурной единицей в этой модели является динуклеосома.

Одной из моделей, которая пытается совместить уже известные модели в одно целое является "динамичная" модель Бавыкина [Бавыкин, 1988]. В случае этой модели 30-нм фибрилла представляет собой односпиральный соленоид, в котором нуклеосомы упакованы по принципу моделей со спирализованным линкером. Один супервиток содержит шесть нуклеосом. Шаг суперспирали 11 -нм фибриллы эквивалентен периодичности суперспирали ДНК в нуклеосомном коре и составляет 80 пар нуклеотидов. Гистон HI располагается следующим образом. Его глобулярный домен взаимодействует с глобулярной частью гистона Н2А на плоской поверхности нуклеосомы. С-концевой сегмент взаимодействует с ДНК своей и соседней нуклеосомы в своем и, возможно, соседнем супервитке. А N-концевой домен взаимодействует с гистонами нуклеосомного кора и, возможно, слабо - с ДНК.

В 1995 г. Вудкок и Хоровиц [Woodcock and Horowitz, 1995] предложили модель, согласно которой положение соседних нуклеосом определяется длиной линкерной ДНК и углом, под которым линкерная ДНК входит и выходит из нуклеосомы. Гистон HI определяет угол входа-выхода ДНК из нуклеосомы, а N-концы гистонов нуклеосомного кора стабилизируют взаимодействие между фибриллами.

В нашей лаборатории на основе физико-химических исследований компактизации олигонуклеосомных фрагментов хроматина была разработана модель структуры хроматиновой фибриллы [Osipova et al., 1990; Vorob'ev et al., 1994]. Были исследованы гидродинамические свойства олигонуклеосомных фрагментов хроматина, различающихся по длине линкерной ДНК, в зависимости от числа нуклеосом в цепи и от ионной силы раствора. Полученные данные позволили оценить изменения основных структурных параметров нуклеосомной цепи при конденсации. Показано, что

(а)

(b)

Рис.1. Модели, описывающие расположение глобулярного домена линкерного гистона на нуклеосоме [Travers, 1999]. (а) Коровая частица, (Ь) Модель Аллана и соавт. [Allan et al., 1980], (с) Модель Bringing model и (d) Модель Вульфа-Хауеса [Hayes, 1996].

Asymmetric extension

Рис.2. Схематическое изображение коровой частицы (а) и возможного расположения на хроматосоме глобулярного домена гистона Н1 симметрично (Ь) и несимметрично (с) относительно двойной оси нуклеосомы. Участки ДНК, защищенные гистоном показаны темным цветом [Travers, 1999]

поведение олигонуклеосом может быть описано моделью зигзагообразной цепи, плотность упаковки ДНК в которой возрастает с увеличением длины линкерной ДНК. Увеличение ионной силы приводит к конденсации нуклеосомной цепи в двухшаговую двойную суперспираль с плотно упакованными нуклеосомами и линкерной ДНК, уложенной в виде петель внутри суперспирали.

До сих пор неясно точное расположение гистона HI на нуклеосоме. Глобулярный домен гистона HI состоит из трех а-спиралей, которые принимают участие в связывании с ДНК. Кроме того, в состав С-концевого фрагмента входят участки с ß-конформацией (ß-шпилька), которые также связываются с ДНК [Belikov, Karpov, 1998]. Таким образом, в гистоне HI два сайта связывания с ДНК.

Много вопросов возникает в связи с тем, как расположен глобулярный домен HI на нуклеосоме. В литературе рассматриваются три модели, каждая из которых имеет право на существование (рис.1). Аллан и соавт. [Allan et al., 1980] предложили модель, согласно которой глобула HI находится на внешней стороне суперскрученного витка ДНК в центре нуклеосомы и симметрично взаимодействует с нуклеосомной ДНК (рис. lb). В точке входа/выхода из нуклеосомы ДНК защищена N- и С-концевыми участками гистона. Участки ДНК по 10 п.н. защищены от воздействия микрококовой нуклеазы симметрично на каждом конце хроматосомы (рис.2Ь). Другая асимметричная модель была предложена Ламбертом и соавт. [Lambert et al., 1991]. ДНК защищена не только у оси симметрии второго порядка, но и в месте входа/выхода ДНК из нуклеосомы (70 п.н. от оси симметрии) (рис. 1с). Таким образом, глобулярный домен HI соединяет два витка спирали ДНК. Эта модель называется bridging model. На соматическом 5S гене из Xenopus borealis , показано, что защищенными оказываются участки в 15 п.н. с одной

стороны и в 5 п.н. с другой (рис.2с). Согласно третьей модели глобулярный фрагмент HI лежит с внутренней стороны между ДНК и коровой частицей (рис.Id) [Pruss et al., 1996; Hayes, 1996]. Здесь также участки ДНК защищены несимметрично: все 20 п.н. защищены только с одной стороны.

Новые исследования предполагают, что более реальной является асимметричная модель, согласно которой глобулярный фрагмент не может контактировать с диадой, так как он асимметрично расположен с внутренней стороны двойной спирали ДНК [Zhou et al., 1998].

1.1.4. Петельный уровень организации хроматина.

В последнее время в литературе все больше накапливается данных в пользу того, что 30-нм фибрилла организована в петельные домены [Igo-Kemenes et al., 1982; Dworetzky et al., 1992; Gerdes et al., 1994] со средней величиной в 86 kb. Эти структуры представляют собой петлю [Paulson and Laemmli, 1977], концы которой фиксированы. Предполагается, что петли фиксируются ядерным остовом белковой природы.

Впервые петельная организация ДНК была показана для митотических хромосом [Paulson and Laemmli, 1977]. Если удалить большинство белков из митотических хромосом, то можно прямо наблюдать петли ДНК. При удалении большей части белка (остается примерно 8%) митотические хромосомы приобретают характерную структуру в виде центрального белкового остова, окруженного ореолом ДНК. Этот белковый остов называется ядерным матриксом, который представляет собой белковый слой, расположенный под ядерной мембраной (ламина) и внутренний ядерный матрикс. Ламина состоит из трех белков с молекулярной массой в 70 кДа. Нити ДНК, выходящие из остова, выглядят как петли. Белковый остов

митотических хромосом содержит в себе компоненты, которые участвуют в формировании доменного уровня организации хроматина в интерфазном ядре.

Существование доменов в интерфазном ядре предполагается на основании следующих данных:

1. Цитологические и биохимические исследования показали, что ДНК хроматина связана с ядерными структурами [McGhee et al., 1983; Dworetzky et al., 1992].

2. "Нуклеоиды" (ядра, из которых обработкой детергентами удалено большинство белков) при увеличении концентрации бромистого этидия проявляют двухфазный характер изменения констант седиментации [Igo-Kemenes et al., 1982]. Эти данные свидетельствуют о том, что вначале при присоединении бромистого этидия происходит раскручивание комплекса, а затем - его закручивание в противоположную сторону. Это характерно для кольцевых и овально-замкнутых ДНК, но не для линейных.

3. При изучении гистонобедненных ядер также показано существование двух типов структур, отличающихся по седиментации: одна - более компактная, а другая - более развернутая. Их изучение показало, что более скрученная структура переходит в более релаксированную при удалении некоторых белков.

Участки прикрепления ДНК к ядерному матриксу получили название MARs (matrix attachment regions) или SARs (scaffold attachment regions) [Izaurralde et al, 1989; Kas et al, 1989].

Таким образом, домены являются типичной структурно-функциональной единицей хроматина [Igo-Kemenes et al, 1982; Dworetzky et al, 1992]. Домен во многом автономен, независимо реплицируется,

транскрибируется, в своем составе доменные структуры имеют кластер генов, которые каким-то образом связаны функционально.

1.1.5. Метафазная хромосома.

Дальнейшая укладка 30 нм фибриллы приводит к образованию метафазных хромосом [Georgiev G.P. et al., 1978; Pienta K.J. and Coffey D.S., 1984]. Вероятно, этот уровень компактизации хроматина является результатом складывания скелетных нитей, к которым прикреплены петли ДНК. Более вероятной является укладка нитей в спиральные структуры в виде соленоида. С этой точкой зрения хорошо согласуются микрофотографии метафазных хромосом, полученные в сканирующем электронном микроскопе. 30 нм фибриллы складываются с образованием 60-80 нм фибрилл, которые могут скручиваться в 100-130 нм фибриллы. Эти 100-130 нм частицы сворачиваются в хроматиды [Belmont et al., 1994]. Однако, существует и противоположная точка зрения, согласно которой метафазные хромосомы, организованные таким образом, не могут существовать [Widom, 1998]. С определенностью можно сказать только то, что в интерфазном ядре организация хроматина в 30 нм фибриллы не является конечной.

1.2. ГИСТОНЫ

Большую часть белков, входящих в состав хроматина, составляют белки основного характера - гистоны. По молекулярному весу и по аминокислотному составу различают несколько фракций гистонов: Н1, Н2А, Н2В, НЗ и Н4. От других белковых фракций гистоны отличаются высоким содержанием основных (лизин, аргинин, гистидин) и гидрофобных аминокислотных остатков. По содержанию лизина и аргинина все фракции гистонов можно разделить на три группы: богатый лизином гистон Н1 (28% лизина и 1,7% аргинина), умеренно богатые лизином и аргинином Н2А (12% лизина и 6% аргинина) и Н2В (16% лизина и 9% аргинина) и группа богатых аргинином гистонов НЗ (10% лизина и 13% аргинина) и Н4 (9% лизина и 14% аргинина). Кроме того гистоны отличаются отсутствием триптофана и почти полным отсутствием цистеина (только гистон НЗ имеет два цистеиновых аминокислотных остатка). Молекулы всех четырех гистонов содержат большое количество аминокислотных остатков пролина (10% в молекуле Н1, в остальных гистонах - 5-6%).

В целом гистоны содержат много заряженных аминокислотных остатков, которые играют существенную роль в образовании вторичной структуры. Гидрофобные остатки распределены в молекуле неравномерно, что приводит к образованию гидрофобных кластеров [Рамм и др., 1970]. Интересно, что электростатические и гидрофобные взаимодействия сказываются на образовании электростатических а- и р-структур синфазно.

Основная часть гидрофобных аминокислотных остатков располагается на С-конце аргинин-богатых гистонов и в центральной части лизин-богатых гистонов. На этих же участках расположены почти все кислые и примерно равное им число основных аминокислотных остатков. Именно для этих участков характерно образование а-спиралей. Напротив, на 1Ч-концах всех

гистонов и на С-концах лизин-богатых гистонов находится большая часть основных аминокислотных остатков и почти все антиспиральные (пролин, серин, глицин, аланин). Суммарный заряд этих участков большой. В обычных условиях здесь не образуются упорядоченные структуры а- и ß-типа. При увеличении ионной силы раствора растет количество а-спиральных структур и способность гистонов к агрегации. При низкой ионной силе раствора способность к агрегации уменьшается, так как плотность гидрофобных аминокислот на поверхностях молекул уменьшается. Способность к агрегации у гистонов растет в ряду H1<H2<H3<H4. Уже при низких pH для некоторых фракций гистонов обнаружено существование димеров. При увеличении ионной силы раствора образуются высокомолекулярные агрегаты. Предполагается, что в процессе агрегации гистоны слипаются по гидрофобным кластерам, с другой стороны их взаимодействие усиливается в процессе образования межмолекулярной ß-структуры. Кроме взаимодействия идентичных молекул гистонов друг с другом могут образовываться и более прочные перекрестные ассоциаты гистонов [Bonner and Pollard, 1975].

1.2.1. Гистоны семейства Н1.

В настоящее время гистонам семейства Н1 приписывается особо важная роль в организации структуры хроматина [Igo-Kemenes et al., 1982; Глотов, Николаев, 1983; Losa et al., 1984; Thomas, 1984; Ramakrishnan, 1997, Widom, 1998]. Эта фракция, связанная с линкерным участком ДНК, отвечает за поддержание высших уровней его структурной организации и, таким образом, по-видимому, участвует в процессах компактизации-декомпактизации хроматина при его функционировании. Гистоны семейства Н1 обладают наивысшей вариабельностью, им свойственна видо- и

тканеспецифичность, а в некоторых случаях даже внутрипопуляцнонная индивидуальная изменчивость.

Эти гистоны имеют трехдоменную организацию. N-конец (с 1 по 35 аминокислотный остаток) наиболее вариабелен, сильно заряжен и в нем сосредоточены основные места модификации этого гистона. Центральный консервативный участок белка (примерно от 36 по 121 аминокислотный остаток) способен образовывать в растворах высокой ионной силы глобулярную структуру [Crane-Robinson et al., 1984; Allan et al., 1986; Tribel et al., 1989]. Взаимодействуя с ДНК нуклеосомного кора, этот участок скрепляет вместе два полных витка суперспирали ДНК на поверхности нуклеосомы, стабилизируя структуру хроматосомы. Третий домен - длинный высокозаряженный С-концевой фрагмент гистона HI (примерно с 122 по 215 аминокислотный остаток) состоит главным образом из чередующихся остатков лизина, аланина и пролина. Он является самым длинным и его конформационные особенности практически не изучены. Модельные исследования показали, что именно этот участок отвечает за способность белка компактизовать ДНК [Allan et al., 1986], а изменения, которые были обнаружены в таком участке, выделенном из хроматина спермиев морского ежа, могут отвечать за суперкомпактное состояние этого хроматина [Misselwitz et al., 1986].

Эксперименты по защите лизиновых остатков гистона Н5 от химических модификаций показали, что большинство защищенных лизиновых остатков расположены в глобулярном домене [Thomas and Wilson, 1986]. Вероятно, глобулярный домен может рассматриваться, как независимый нуклеосом-связывающий домен, в то время как С-концевой фрагмент связывается с линкерной ДНК между нуклеосомами. Интересно отметить, что домены, очень похожие на глобулярный домен гистона HI,

были обнаружены в нескольких эукариотических и прокариотических транскрипционных факторах [Widom, 1998].

До недавнего времени считалось, что гистон HI локализован на поверхности нуклеосомы, а глобулярный домен - в месте входа-выхода ДНК из коровой частицы [Widom, 1989]. Глобулярные домены гистонов HI и Н5 кооперативно связываются с двумя молекулами ДНК [Thomas et al., 1992]. Это означает, что эти домены должны иметь по крайней мере два ДНК-связывающих участка, которые оба необходимы для функционирования хроматина.

Как указывалось выше, гистоны семейства HI, в отличие от других гистоновых фракций, обладают существенной видовой и тканевой специфичностью [Von Holt С. et al., 1979]. Особенно сильно отличаются гистоны сперматогенных клеток. В процессе сперматогенеза клетки претерпевают биохимические и морфологические изменения, связанные с формированием генетически неактивного ядра с высокой степенью компактизации ДНК. В упаковке ДНК спермиев принимают участие различные типы белков. В противоположность относительно постоянному набору из четырех коровых гистонов (Н2А, Н2В, НЗ и Н4) и линкерного гистона HI, образующих комплекс с ДНК в хроматине соматических клеток [Laybourn and Kadonaga, 1991; Fedor, 1992; Felsenfeld, 1992; Travers, 1992; Ramakrishnan, 1997; Widom, 1998], в ядрах спермиев многих животных обнаружены различные основные белки. Все разнообразие смены белкового состава в процессе сперматогенеза можно свести к нескольким основным вариантам.

1. Гистоны сохраняются, но некоторые фракции, главным образом HI, заменяются на спермий-специфические варианты. В хроматине спермиев морского ежа помимо гистона HI и гистон Н2В заме-щается на его

специфический вариант с удлиненным положительно заряженным N-концевым участком [Zalenskaya et al., 1981].

2. В дополнение к полному набору гистонов появляются высокоосновные спермий-специфические S-белки (совокупность основных хромосомных белков, которым свойственно высокое содержание аргинина, лизина, серина, аланина и высокая плотность положительного заряда). Такие белки были обнаружены в хроматине спермиев голотурий и моллюсков [Воробьев, 1986]. По своей структуре эти белки занимают промежуточное положение между гистонами и протаминами.

3. Происходит замена гистонов на протамины. Эти низкомолекулярные аригнин-богатые белки встречаются у некоторых рыб, головоногих моллюсков, амфибий, птиц и примитивных млекопитающих и характеризуются высокой плотностью положительного заряда вдоль всей полипептидной цепи и поэтому в отличие от гистонов не образуют глобулярных участков в центральной части молекул. Протаминам присуща конформация типа полипролина II, которая играет существенную роль при их взаимодействии с ДНК с образованием более компактного хроматина спермиев.

4. В сперматозоидах млекопитающих, некоторых амфибий и насекомых обнаружены тиопротамины - аргинин-богатые белки, состоящие из 50-60 аминокислотных остатков, среди которых присутствует цистеин - 69 остатков на молекулу. Цистеин образует меж- и внутримолекулярные дисульфидные связи, что приводит к дополнительной компактизации ДНК в ядрах спермиев.

В случае замены гистонов на протамины или промежуточные белки происходит исчезновение нуклеосомной структуры хроматина [Kierszenbaum and Tres, 1978; Ausio and Subirana, 1982], в то время как наличие гистонов в хроматине спермиев некоторых видов морских беспозвоночных и рыб

сохраняет нуклеосомную организацию этого хроматина [Keishline and Wasserman, 1979; Poccia, 1986]. Таким образом, существует несколько механизмов структурных перестроек хроматина, сопровождающих репрессию генома сперматозоидов.

Наиболее интересной является замена гистонов семейства HI на их спермий-специфические варианты [Zalenskaya et al, 1981; Misselwitz et al, 1986; Poccia, 1986; Рамм и др, 1987]. Как указывалось выше, спермий-специфические варианты гистонов морских беспозвоночных характеризуются более длинной по сравнению с соматическими гистонами полипептидной цепью и более высокой степенью а-спиральности [Crane-Robinson et al, 1984; Misselwitz et al, 1986; Puigdomenech et al, 1987]. Удлинение цепи происходит за счет повторяющихся протаминоподобных вставок Ser-Pro-Lys(Arg)-Lys(Arg) в концевых доменах спермий-специфических гистонов [Von Holt et al, 1979].

Особенности спермий-специфических гистонов могут определять конформационные характеристики их полипептидных цепей и, вероятно, лежат в основе структурных превращений хроматина спермиев.

1.2.2. Постсинтетические модификации гистонов семейства HI.

После синтеза все гистоны подвергаются постсинтетическим модификациям: метилирование, ацетилирование, фосфорилирование, убиквитинирование, ADP-рибозилирование. Эти обратимые процессы протекают в различные периоды клеточного цикла. Гистоны семейства HI подвергаются ADP-рибозилированию, ацетилированию и

фосфорилированию.

Ацетилирование. Ацетилирование приводит к уменьшению положительного заряда аминогруппы и, следовательно, к ослаблению силы взаимодействия

белка с ДНК. Синтез гистона HI (это относится и к синтезу гистонов Н2А и Н4) начинается с образования N-ацетилсерина в цитоплазме: ацетилируются два остатка серина. Через пять минут одна из ацетильных групп удаляется. Ацетилирование этого аминокислотного остатка протекает необратимо. ADP-рибозилирование. Гистоны HI и Н2В являются основной мишенью поли-ADP-рибозилирования. В гистоне HI модифицируются остатки Glu, занимающие в полипептидной цепи положения 2, 14 и 116. Такие модифицированные гистоны обнаружены у одноклеточных, беспозвоночных, рыб и млекопитающих [Frechette et al., 1985; Wu et al., 1986]. Эта модификация в хроматине затрагивает только около 1% гистона HI. Наиболее интенсивное ADP-рибозилирование наблюдается в S-фазе клеточного цикла. Фречет и соавт. [Frechette et al., 1985] установили, что поли-АБР-рибозилирование гистона приводит к деконденсации высших структур хроматина.

Фосфорилирование. Фосфорилирование гистонов HI является важным этапом в процессе конденсации хромосом при митозе [Bradbury et al., 1974; Nurse, 1990]. Фосфорилированию подвергаются сериновые и треониновые аминокислотные остатки в концевых доменах гистона HI и в, частности, в составе SPKK-мотива. Этому мотиву приписывается важная роль в осуществлении ДНК-гистоновых взаимодействий и в конкуренции между гистонами и регуляторными белками за возможность связывания с ДНК [Suzuki, 1989а; Poccia and Green, 1992; Bailly et al., 1993].

Сузуки [Suzuki, 1989a] продемонстрировал совершенно новый способ связывания ДНК с гистонами HI и Н2В в спермиях морского ежа. В N-концевом фрагменте этих гистонов, а также в С-конце гистона HI обнаружены повторяющиеся единицы, состоящие из тетрапептидов типа Ser-Pro-Lys-Lys (SPKK-повторы). SPKK-повторы связываются с линкерным участком ДНК. Подобные пептиды SPXX (где X - гидрофобные остатки)

были обнаружены в транскрипционных факторах [Suzuki, 1989Ь]. Так как константы связывания SPXX-повторов меньше, чем SPKK в гистоне HI, связывание HI, вероятно, ингибирует связывание транскрипционных факторов. Таким образом, эти SPKK- и SPXX-повторы могут обеспечивать управление регуляции генов.

Исследование искусственных комплексов ДНК с фосфорилированным гистоном HI привело к следующим заключениям:

1). Фосфорилирование уменьшает кооперативность связывания гистона HI с ДНК [Zlatanova, 1990].

2). Фосфорилированные формы гистона HI сохраняют способность узнавать релаксированную и суперскрученную ДНК [Singer and Singer, 1978].

3). При умеренных ионных силах (0.1-0.3 М NaCl) фосфорилированный HI более эффективно образует ДНК-белковые сшивки, чем не модифицированная форма, независимо от того в каких условиях проходило фосфорилирование in vivo [Corbett et al., 1980] или in vitro [Matthews and Bradbury, 1978]. Следовательно, фосфорилирование Hl может инициировать хромосомную конденсацию.

4). Фосфорилирование HI в положении Ser-37 приводит к частичному или полному освобождению глобулярного фрагмента от ДНК [Glotov et al., 1977]. Фосфорилирование -Ser-Pro-X-Lys/Arg- мотивов в N-концевом домене спермий-специфических HI приводит к ослаблению электростатических взаимодействий этого мотива с ДНК [Hill et al., 1990].

5). Фосфорилированный Hl предпочтительно связывается с АТ-богатыми участками ДНК как при низких (20 мМ), так и при средних (50 мМ) концентрациях NaCl, в то время как немодифицированный HI - только при 50 мМ NaCl [Marekov and Beltchev, 1981].

Таким образом, фосфорилирование гистона HI, по всей видимости, приводит к тонким изменениям во взаимодействии HI с ДНК, оказывая влияние на структуру определенных участков хроматина.

1.2.3. Взаимодействие гистонов семейства HI с ДНК.

Предположение о том, что HI в хроматине главным образом взаимодействует с ДНК и в меньшей степени с остальными белками делает очень значимым изучение искусственных комплексов ДНК-Н1. Ниже приведены положения, которые позволяют использовать искусственные комплексы HI-ДНК как модельные системы при изучении роли гистона HI в хроматине:

1. Известно, что эти гистоны взаимодействуют с линкерным участком ДНК независимо от других гистонов нуклеосомного кора и располагаются на его внешней стороне [Bradbury et al., 1975;. Noll and Kornberg, 1977].

2. Расположение гистонов HI в нуклеосомной фибрилле позволяет с помощью бифункциональных реагентов делать ДНК-белковые сшивки с образованием гомополимеров гистона HI [Thomas and Khabaza, 1980; Ring and Cole, 1983]. Подобные гомополимеры были обнаружены в комплексах HI с двухцепочечной ДНК [Clark and Thomas, 1986].

3. Степень насыщения связи HI-ДНК примерно одинакова для "голой" ДНК и ДНК в хроматине [Diez-Caballero et al., 1981].

4. Средняя плотность упаковки различных тканеспецифических вариантов гистонов HI в их комплексах с ДНК хорошо коррелирует со средней длиной линкерного участка ДНК хроматина, с которым соответствующий гистон ассоциирован [Clark and Thomas, 1988; Осипова и др., 1990].

5. Индуцированная ионной силой конденсация нуклеосомной фибриллы коррелирует с переходом из некооперативного в кооперативное связывание

гистона Hl с ДНК при похожих ионных условиях [Bradbury et al., 1975; Renz and Day, 1976; Triebel et al., 1988].

6. Взаимодействие лизиновых остатков гистона HI и ДНК одинаковое при связывании HI с линейной ДНК и с HI-обедненным хроматином [Giradet and Lawrence, 1983].

Для получения искусственных комплексов ДНК с гистоном HI используют два способа: прямое смешивание двух компонентов в растворах определенной ионной силы и диализ смеси в растворе определенной ионной силы против конечной солевой концентрации. При специфических условиях молекулы гистона HI могут связываться с молекулами ДНК различным образом. При концентрации ионов Na+ ниже 20 мМ взаимодействие является некооперативным [Renz and Day, 1976; Clark and Thomas, 1986]. В растворах с ионной силой от 20 до 50 мМ наблюдается довольно широкий переход к кооперативному связыванию. Комплексы, полученные при кооперативном связывании, могут образовываться и при низких ионных силах, но при достаточно высоком соотношении белок/ДНК [Clark and Thomas, 1986; De Bernardin et al., 1986].

Де Бернардин и др. [De Bernardin et al., 1986] показали, что гистон Hl образует два типа комплексов с суперскрученной ДНК. В первом случае это растворимые комплексы (содержащие различные количества гистона HI в зависимости от соотношения белок/ДНК), в которых молекулы HI связаны с одной молекулой ДНК. Второй тип комплексов - нерастворимые агрегаты. Такие комплексы образуются после превышения критического отношения HI к ДНК в растворе. Эти агрегаты напоминают "канаты" (cable-like) и в растворе сосуществуют вместе со свободной ДНК. Подобные комплексы обнаружили Кларк и Томас [Clark and Thomas, 1986] при исследовании образования комплексов HI с линейными фрагментами ДНК как функции ионной силы и отношения белок/ДНК. При низкой ионной силе молекулы

HI равномерно распределяются по всей ДНК. При увеличении ионной силы раствора образуется другой тип комплексов, которые существуют вместе с ДНК, несвязанной с белком. Кларк и Томас [Clark and Thomas, 1986] предположили, что во взаимодействие HI с ДНК вовлечены гидрофобные взаимодействия глобулярных доменов гистона. Однако Сингер и Сингер [Singer and Singer, 1978] считают, что глобулярные участки HI (гидрофобные домены) не являются необходимыми для кооперативного связывания.

Кооперативность связывания HI с ДНК зависит от размера молекулы ДНК. Ренз и Дэй [Renz and Day, 1976] показали, что гистон HI предпочитает связываться с более длинными фрагментами ДНК. По-видимому, это связано с тем, что кооперативное распределение гистоновых молекул вдоль ДНК энергетически более выгодно для длинных фрагментов ДНК.

До сих пор неясно для какого процесса является важным вопрос кооперативности взаимодействия HI с ДНК: для образования более высоких уровней организации хроматиновой фибриллы или для осуществления регуляции генов посредством гистона HI [Zlatanova, 1990]. Кооперативность связывания может быть важной для гетерогенности участков в структуре и функции хроматина. Если связывание HI с хроматином кооперативно, то кооперативным должен быть механизм инактивации. Это означает, что Н1-связывание приводит к образованию суперструктур и в общепринятом механизме репрессии может выполнять функцию только как "long-range" [Zlatanova and Yaneva, 1991]. Однако в процессе кооперативного связывания могут принимать участие несколько молекул HI, изменяя структуру некоторой ограниченной области ДНК. Например, ряд из шести Н1-содержащих нуклеосом является достаточным для образования структур более высокого порядка [Bates et al., 1981; McGhee et al., 1983]. С другой стороны в кооперативное связывание может быть включено несколько

молекул HI различного подтипа и только некоторые из них могут образовывать структуры более высокого порядка [Lennox, 1984].

Одним из важных вопросов о взаимодействии гистона HI с ДНК является вопрос о предпочтительном связывании HI с суперскрученной ДНК. Сингер и Сингер [Singer and Singer, 1976] показали, что гистон HI обладает большим сродством к суперскрученной ДНК, чем к релаксированной циркулярной и линейной ДНК.

Вопрос является ли функционально значимым такое предпочтительное связывание HI с суперскрученной ДНК до сих пор не выяснен. В эукариотических клетках ДНК, по-видимому, имеет отрицательную суперскрученность в составе петель, прикрепленных к ядерному матриксу [Dworetzky, 1992]. Не известно требуется ли для транскрипции наличие торсионного напряжения или это следствие транскрипции. Если суперспиральность матрицы необходима для транскрипции, то это возможно обеспечивает условия дифференциального связывания регуляторных факторов с ДНК различной суперспиральной плотности. Гистоны HI препятствуют посадке транскрипционных факторов. Таким образом, изменения в суперспиральной плотности ДНК в определенных хроматиновых петлях, возможно, облегчают изменения в белковом связывании, воздействуя таким образом на экспрессию генов.

Долгое время считалось, что связывание гистона HI с ДНК не является селективным. Однако, в работах нескольких групп [Sponar and Sormova, 1972; Renz and Day, 1976; Blumenfeld et al, 1978; Izaurralde et al, 1989; Kas et al, 1989] было показано, что HI предпочитает связываться с АТ-богатыми участками ДНК. Мареков и соавт. [Marekov et al, 1978] предположили, что за предпочтительное связывание HI с АТ-богатыми участками ДНК (при 20 мМ NaCl) отвечает структурированный глобулярный фрагмент гистона. В других работах [Izaurralde et al, 1989; Kas et al, 1989]

отмечается, что гистон HI предпочитает связываться с АТ-обогащенными scaffold-attachment областями (SARs). Предполагается, что SARs можно считать cis-активными сегментами, которые контролируют конформацию хроматиновых доменов. Предпочтительное связывание HI с АТ-богатыми участками ДНК возможно также включено в механизм уплотнения хроматина и, следовательно, транскрипционной инактивации гетерохроматина [Blumenfeld et аЦ 1978].

Возможность сайт-специфических взаимодействий показывает, что если взаимодействия, обнаруженные in vitro, встречаются in vivo, то они могут лежать в основе механизма регуляции генов. Вероятно, эти взаимодействия влияют на экспрессию генов посредством связывания HI с положительными и отрицательными областями [Zlatanova, 1990]. Другая возможность их влияния на активность генов - изгиб некоторых областей ДНК при связывании с HI [Diez-Caballero et al., 1981]. Такое складывание ДНК могло бы контролироваться специфическими нуклеотидными последовательностями в соответствующих областях хроматина.

Исследование комплексов ДНК с различными гистонами показало, что только гистоны семейства HI способны изменять конформацию ДНК таким образом, как это происходит в хроматине. Несмотря на то, что при связывании ДНК с гистоном HI В-форма двойной спирали ДНК сохраняется, взаимодействие с лизин-богатыми гистонами приводит к некоторому нарушению канонической В-формы двойной спирали. Например, появление глубокой отрицательной полосы в спектрах кругового дихроизма (КД) объясняется возникновением так называемой Ч'-формы ДНК (полимер-соль индуцированная форма) [Weiskopt and Li, 1977]. Такое изменение в конформации ДНК происходит в результате компактизации молекул ДНК в высокоупорядоченные агрегаты. В эту структуру вносят вклад как третичная структура макромолекулы, так и ее вторичная структура. Руссо и др. [Russo et

а1., 1983] исследовали взаимодействие ДНК с глобулярным доменом Н1 и с интактными молекулами различных членов этого семейства, которые отличались аминокислотным составом С-концевых фрагментов. Они показали, что глобулярный домен Н1 сам по себе не вызывает никаких изменений в структуре ДНК и только 14- и С-концевые фрагменты гистона способны взаимодействовать с ДНК с образованием Ч'-формы. В С-концевом участке гистона Н1 расположен ДНК-связывающий мотив 8РКК, именно этот мотив индуцирует переход ДНК из В-формы в Ч'-форму [ВаШу & а1., 1993].

Таким образом, взаимодействие гистона Н1 с ДНК может вызывать изменения в конформации ДНК, изменяя структуру хроматина. Гистон Н1 не изменяет гибкость и степень суперспиральности ДНК. Эти параметры могут быть определяющими для предпочтительного Н1-связывания, но не регулируются им.

1.3. НЕГИСТОНОВЫЕ БЕЛКИ ХРОМАТИНА

В клеточном ядре ДНК связана не только с гистонами, но и с другими, негистоновыми белками. Сейчас достоверно известно, что роль хроматиновой фибриллы не ограничивается упаковкой ДНК в ядре. Ей отводится также роль в обеспечении доступности специфических последовательностей к регуляторным факторам и в обеспечении потенциального взаимодействия между расположенными на расстоянии друг от друга регуляторными элементами. Таким образом, большинство клеточных процессов, вовлекающих ДНК, должны рассматриваться в контексте с хроматином. С этой точки зрения негистоновые хромосомные белки, которые являются частью хроматиновой фибриллы, обеспечивают дополнительный уровень структурного и функционального единства. Термин

"негистоновые белки" относится ко всем белкам, которые экстрагируются из хроматина, но не являются гистонами. Традиционно этот термин ассоциируется со "структурными белками" и не описывает такие белки, как ферменты и регуляторные факторы, которые влияют на транскрипцию или репликацию.

1.3.1. HMG-белки.

Белки с высокой электрофоретической подвижностью - High Mobility Group (HMG-белки) - наиболее хорошо описанная группа негистоновых хромосомных белков. Белки этой группы обнаружены во всех клетках высших эукариот. HMG-белки экстрагируются из ядер или хроматина с 0.35 М NaCl, они растворимы в 5% хлорной или трихлоруксусной кислоте, содержат много заряженных аминокислот и имеют молекулярную массу ниже 30 ООО Да [Johns, 1982; Караванов и Афанасьев, 1983]. Общим для всех HMG-белков является высокое содержание дикарбоновых аминокислот (до 30% в HMG1/2) и лизина (19-25%) [Караванов и Афанасьев, 1983].

Различают три семейства HMG-белков: HMG1/2, HMG14/17 и HMGI(Y). Хотя структура этих белков достаточно хорошо изучена, их функциональное значение до сих пор неясно. Большинство исследователей предполагает, что они осуществляют специфическую "архитектурную" функцию в хроматине [Onate et al., 1994; Trieschmann et al., 1995; Bustin and Reeves, 1996]. Белки HMG1/2 облегчают связывание прогестеронового рецептора, индуцируя локальные структурные изменения хроматина [Onate et al., 1994]. Белки HMG14/17, входящие в состав минимальной нуклеосомы, облегчают транскрипцию, но при этом не являются частью транскрипционного комплекса [Trieschmann et al., 1995]. Предполагается, что белки HMGI(Y) модифицируют структуру ДНК таким образом, чтобы

облегчить белок-белковые взаимодействия в преинициаторном комплексе, образованном в АТ-богатых промотор/энхансер последовательностях отдельных генов [John et al., 1995].

1.3.2. Белки семейства HMG1/2.

Семейство белков HMG1/2 представляет самую распространенную группу ДНК-связывающих негистоновых белков хроматина (примерно 1 молекула на 10-15 нуклеосом). Несмотря на высокую гомологичность (>82%), в клетках человека белки HMG1 и HMG2 кодируются разными генами [Bustin and Reeves, 1996]).

Белки HMG1 и HMG2 являются глобулярными белками, содержащими до 50% а-спиральных участков и не содержащими участков с ß-конформацией.

До конца биологическая роль этих белков до сих пор не выяснена. Причина одновременного присутствия в клетке этих двух белков, столь сходных по аминокислотной последовательности, до сих пор остается загадкой. Предполагается, что эти белки выполняют в клетке некоторые основные функции: они выступают как структурные компоненты хроматина и возможно также являются вспомогательными транкскрипционными факторами.

Интерес к белкам этого семейства прежде всего связан с тем, что во многих регуляторных белках обнаружены ДНК-связывающие последовательности, сходные с таковыми в белках семейства HMG1/2. Область приблизительно в 70-80 аминокислотных остатков в этих белках (HMG1-домен) гомологична А и В доменам белка HMG1. Основной характеристикой этого мотива является консервативность положения гидрофобных ароматических аминокислотных остатков - тирозина,

триптофана и фенилаланина. HMG-доменные белки были обнаружены в животных, растительных и дрожжевых клетках. Некоторые из них являются сиквенс-специфическими ДНК-связывающими белками.

С помощью филогенетического анализа аминокислотных последовательностей были выделены две подгруппы белков, содержащих HMG1 домен [Bustin and Reeves, 1996]. Одна подгруппа включает белки HMG1 и 2, а также белки, содержащие два и более HMG-домена (транскрипционный фактор РНК полимеразы I, известный как UBF, митохондриальные транскрипционные факторы mtTF и ABF2). Эти белки не являются сиквенс-специфическими белками: UBF связывается с GC-богатыми участками ДНК в промоторе rRNA генов, а дрожжевой белок ABF2 проявляет только очень слабую сиквенс-специфичность [Read et al.,

1993]. К другой подгруппе относятся фактор определения пола SRY, дрожжевой негистоновый белок NHP6A/B, белок, который связывается с ДНК, модифицированной цис-платиновыми комплексами, и многие другие. Эти белки имеют только один HMG1-домен. SRY и другие белки этой подгруппы связываются с АТ-богатыми последовательностями ДНК, вызывая изгиб ДНК в сегменте 5'-(A/T)(A/T)CAAAG-3' [Read et al., 1993].

1.3.3. Взаимодействие белков HMG1/2 с ДНК и хроматином.

Белки HMG1 и 2 неспецифично связываются как с двунитевой, так и с однонитевой ДНК, причем предпочтительнее с однонитевой. Оба этих белка, а также несиквенс-специфические белки, содержащие HMG1-домен (например, рибосомный транскрипционный фактор UBF [Bazett-Jones et al.,

1994]) в присутствии топоизомеразы I способны не только изгибать ДНК, но и могут вызывать суперскручивание в топологически закрытых участках ДНК. Следовательно, эти белки могут приводить к образованию петель в

линейной ДНК и в циркулярных плазмидах даже в отсутствии других факторов. Таким образом, белки, содержащие HMG1-домен, возможно, служат для того, чтобы облегчить выполнение различных биологических функций ДНК, связанных с транскрипцией, репарацией, рекомбинацией.

Важную роль белки HMG1 и 2 играют в регуляции структуры хроматина. Ранее во многих работах были представлены данные, указывающие на возможность участия in vitro белков HMG1 и 2 в процессе сборки нуклеосомы [Bustin and Reeves,. 1996]. Показано, что эти белки, подобно лизин-богатым гистонам HI и Н5, преимущественно связываются с линкерным участком ДНК между соседними нуклеосомами в хроматине эукариотических клеток. Тем не менее, из субфракции тотального хроматина можно выделить мононуклеосомы, в которых присутствуют в достаточном количестве белки HMG1 и 2, но нет гистона HI. Это дает возможность предположить, что основная роль белков HMG1 и 2 заключается в замещении гистона HI в линкерной области, чтобы облегчить доступность к регуляторным факторам локальных хроматиновых доменов [Bustin and Reeves, 1996]. Вероятно, таким образом эти белки вовлекаются в процесс транскрипции.

Недавние исследования показывают, что в то время как гистон HI является репрессором транскрипции, белки HMG1 и 2 могут быть основными факторами, которые стимулируют [Oñate et al, 1994] или обратимо подавляют гормональную активацию транскрипции РНК полимеразой II в зависимости от условий. Молекулярные механизмы процессов подавления или активации транскрипции in vivo этими ядерными белками пока не ясны. Тем не менее, предполагается, что белки HMG1 и 2 могут конкурировать с гистоном HI за связывание с локальными областями хроматина, воздействуя таким образом на их функциональную активность.

Линкерные гистоны HI и Н5 взаимодействуют с ДНК в точке входа-выхода ее из нуклеосомы [van Holde and Zlatanova, 1994]. Белок HMG1, подобно гистону HI, индуцирует хроматосомную паузу при переваривании реконструированного хроматина микрококковой нуклеазой. Оба белка связываются с ДНК на поверхности нуклеосомной частицы. Предполагаемое замещение гистона HI на HMG1 может играть важную роль в процессе активации транскрипции [Varga-Weisz et al., 1994]. Возможно, функция белков HMG1 и 2 заключается в их способности связываться с изогнутой или нарушенной структурой ДНК и облегчать образование петель в топологически ограниченном участке ДНК.

Таким образом белки HMG1 и 2 ассоциированы с хроматином, вероятно, выполняя роль архитектурных элементов. Наряду с гистоном HI эти белки, возможно, способствуют сохранению целостности и компактности хроматиновой фибриллы.

1.4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Биохимические и физико-химические исследования хроматина, выделенного из клеток с различным уровнем транскрипционной активности, показали корреляцию между биологическими и структурными его характеристиками. Известно, что транскрипционно неактивный хроматин спермиев морских беспозвоночных отличается высокой степенью компактности и характеризуется большей величиной нуклеосомного повтора, т. е. длины ее линкерного участка, по сравнению с хроматином соматических клеток [Костылева Е.И. и др., 1989; Осипова Т.Н. и др., 1990; Рамм Е.И. и др., 1993а; 19936]. Транскрипционно активный хроматин (например, хроматин соматических клеток) характеризуется более низкой величиной нуклеосомного повтора ДНК, т.е. коротким линкером. Таким образом,

литературные данные свидетельствуют о том, что существенную роль в образовании суперкомпактного хроматина играют гистоны семейства Н1, которые взаимодействуют с линкерным участком нуклеосомы. В наиболее компактном состоянии находится функционально неактивный хроматин спермиев. Поэтому выявление конформационных особенностей линкерных гистонов семейства Н1, входящих в состав суперкомпактного хроматина спермиев и изучение их взаимодействия с ДНК при образовании искусственных ДНК-белковых комплексов является важным и необходимым этапом для понимания механизмов образования конденсированного хроматина.

Помимо гистона Н1 с линкерным участком ДНК связаны и негистоновые белки семейства НМ01/2. Несмотря на высокую гомологичность, белки Н1УЮ1 и 2, по всей видимости, имеют различную вторичную структуру. Однако до сих пор до конца не выяснена их роль и, следовательно остается непонятным, зачем необходимо одновременное присутствие в клетке столь близких по своей структуре белков. Как отмечалось выше, существует конкуренция между структурно столь разными белками гистоном Н1 и белком Н1уЮ1 за связывание с ДНК. Оба белка имеют два ДНК-связывающих участка: связывание глобулярного домена линкерного гистона Н1 с ДНК происходит за счет двух участков, локализованных на противоположных сторонах глобулярного домена, а белок НМ01 связывается с ДНК через два НМ01-домена. До сих пор неясно, действительно ли эти белки конкурируют между собой при образовании нуклеосомы и при изменении локальной структуры хроматина.

Заключение диссертации по теме «Гистология, цитология, клеточная биология», Чихиржина, Елена Всеволодовна

выводы

1. Исследованные спермий-специфические гистоны могут быть разделены на два класса по их способности к образованию а-спиральных структур. Гистоны Н1 спермиев иглокожих характеризуются повышенной способностью образовывать дополнительные а-спиральные структуры, расположенные в их С-концевых доменах. Все а-структурные сегменты этих гистонов очень лабильны и плавятся при очень низких температурах. Гистон Н1 спермиев моллюска имеет более жесткую конформацию левой спирали при низких ионных силах, а-спиральные структуры в глобуле этого гистона по своим свойствам не отличаются от таких структур в соматическом гистоне.

2. Структура глобулярных доменов гистонов Н1 стабилизирована их концевыми фрагментами.

3. При взаимодействии ДНК с исследуемыми спермий-специфическими гистонами структура ее двойной спирали изменяется от В- к С-форме. В растворе низкой ионной силы гистоны Н1 спермиев не компактизуют ДНК. В физиологических условиях наибольшей компактизующей способностью обладают гистоны спермиев иглокожих.

4. Спектрофотометрическое плавление показало, что участки ДНК, связанные с белком, стабилизированы по отношению к тепловой денатурации. Наибольшей стабилизирующей способностью обладает соматический гистон Н1 тимуса крыс.

5. Предполагается, что в хроматине спермиев гистоны Н1 взаимодействуют с ДНК и в большом и в малом желобке ее двойной спирали, что способствует поддержанию этого хроматина в суперкомпактном состоянии. л

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Результаты проведенных исследований дают возможность охарактеризовать особенности структуры гистонов семейства Н1, выделенных из спермиев некоторых морских беспозвоночных (морской звезды Aphelasterias japónica, морского ежа Strongylocentrotus intermedius и двустворчатого моллюска Chlamis islandicus), при их взаимодействии с ДНК.

В условиях низких ионных сил все исследуемые гистоны имеют конформацию типа поли-Ь-пролин-И с различной степенью дефектности. Наименьшая степень дефектности характерна для наиболее заряженного из исследуемых гистонов - Н1 спермиев моллюска. Нейтрализация среднего суммарного заряда исследуемых белковых молекул при увеличении ионной силы раствора или понижение его в области щелочных значений рН приводят к образованию некоторого количества a-спиральных или (3-структурных участков, которые формируют при этих условиях в центральной части молекул глобулу. При этом в гистонах Н1, выделенных из спермиев морского ежа и морской звезды, в состоянии полностью сформировавшейся глобулы количество a-спиральных участков значительно выше. Предполагается, что дополнительные а-спиральные участки располагаются в с-концевых доменах этих молекул.

Исследование термостабильности интактных молекул гистонов Н1 тимуса крыс и спермиев морского ежа и выделенных из них глобулярных фрагментов показало, что структура глобулярной части молекул стабилизируется их концевыми участками. Кроме того глобулярный домен в спермий-специфическом гистоне Н1 сам по себе менее стабилен, чем в Н1 тимуса.

Различия в конформационном поведении негистоновых белков НМШ и 2 могут определять и необходимость сосуществования в клетке обоих белков, очень похожих между собой. Несмотря на 80% гомологию по вторичной структуре эти белки отличаются: белок НМШ склонен в большей степени образовывать участки с а-спиральной конформацией, что может определять различия в функциях этих белков.

Исследование конформационных особенностей гистонов Н1 спермиев и ДНК при их взаимодействии показало, что Н1 спермиев моллюска, также как и гистон Н1 тимуса крыс, взаимодействует- с ДНК некооперативным образом и полученные комплексы лишь в незначительной степени проявляют способность к ассоциации при больших значениях г. Остальные спермий-специфические гистоны, характеризующиеся дополнительными а-спиральными участками в С-концевых доменах, уже в условиях низкой ионной силы связываются с ДНК кооперативно, и способность к ассоциации в этих комплексах проявляется в более значительной степени. По-видимому, это можно объяснить способностью этих белков взаимодействовать друг с другом. В основе такого взаимодействия могут лежать гидрофобные взаимодействия поверхностей а-спиральных кластеров. При физиологических ионных силах образование комплексов ДНК со всеми исследованными гистонами идет Кооперативно, однако наибольшей способностью к ассоциации по-прежнему обладают гистоны Н1 спермиев морского ежа и морской звезды, а наименьшей - соматический гистон.

При взаимодействии гистонов Н1 с ДНК проявляются их конформационные особенности. Так спермий-специфический гистон моллюска, взаимодействуя с ДНК спирализуется в меньшей степени, чем Н1 спермиев морского ежа и морской звезды. С другой стороны, все гистоны хроматина спермиев при образовании комплексов ДНК-белок воздействуют и на структуру ДНК - в то время, как при взаимодействии тимусного гистона с ДНК структура ее двойной спирали остается неизменной. По-видимому, на характер взаимодействия этих белков с ДНК и на место их посадки влияют длина полипептидных цепей и степень обогащения аргинином. Мы предполагаем, что взаимодействие гистонов Н1 хроматина спермиев происходит одновременно и в большой и в малой канавке двойной спирали ДНК, в то время как тимусный располагается только в большой. Изменение состояния гидратации в малом желобке ДНК при взаимодействии с гистонами приводит к изменению ее конформационных- параметров от В- к С-форме. Этот эффект является особенностью гистонов Н1 хроматина спермиев и вместе с гистон-гистоновым взаимодействием может обусловливать суперкомпактное состояние ДНК такого хроматина.

В физиологических условиях для комплексов с большим содержанием белка характерны высокоупорядоченные асимметричные ассоциаты, приводящие к конденсации ДНК. Наибольшей конденсирующей способностью обладают гистоны Н1 спермиев морского ежа и морской звезды, а наименьшей - спермий-специфический гистон Н1 моллюска. Присутствие соли необходимо для специфической ассоциации, вероятно в связи с тем, что экранирование нескомпенсированных зарядов гистоновых молекул предотвращает расталкивание С-концевых доменов гистонов Н1 и способствует оптимальному поиску мест их взаимодействия с молекулами ДНК для создания регулярной асимметричной структуры, дающей ЧР-тип спектра КД. Присутствие соли способствует стабилизации а-спиралей в С-концевых доменах гистонов Н1 спермиев морского ежа и морской звезды, наличие которых существенно для ассоциации комплексов, способствующей образованию высших уровней организации структуры хроматина. Образование надмолекулярной структуры хроматина морского гребешка идет по другому механизму, более близкому по компактизации хроматину, в котором гистоны заменены на протамины, обладающие стабильной левоспиральной конформацией.

При образовании комплексов ДНК с гистонами Н1 участки ДНК, связанные с белком, стабилизированы по отношению к тепловой денатурации. При этом наибольшим эффектом обладает гистон Н1 спермиев моллюска, а наименьшим - соматический. Во всех комплексах при г=1,0 около половины ДНК остается свободной от белка. Больше всего таких участков содержат комплексы со спермий-специфическим гистоном моллюска. Возможно, что при этом молекулы гистона, взаимодействуя с другими белковыми молекулами, укладываются на ДНК более компактно.

Выявленные конформационные особенности исследованных в данной работе, образцов спермий-специфических гистонов представляются функционально оправданными и вероятно используются для организации и стабилизации супер компактного хроматина спермиев. Лабильность конформационного состояния спермий-специфических гистонов, вероятно, необходима для осуществления структурных перестроек хроматина в процессе деконденсации отцовского пронуклеуса после оплодотворения. Физико-химические свойства цитоплазмы яйцеклетки (ионная сила среды, рН и др.) неоднородны в разных частях яйца, и это, возможно, влияет на стабильность ДНК-белкового комплекса в ядре. С одной стороны, лабильность спермий-специфических белков обуславливает более легкое снятие их с ДНК в узком интервале ионных сил. С другой стороны, повышенная аффинность к ДНК этих белков вследствие увеличения повышенная аффинность к ДНК этих белков вследствие увеличения суммарного положительного заряда приводит к образованию более прочных ДНК-белковых комплексов. Следовательно, участки ДНК, связанные с различными спермий-специфическими белками, будут деконденсироваться различным образом, что может привести к функционально значимому неравномерному расположению нуклеосом и регуляторных белков в связанных с разными белками участках хроматина.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Чихиржина, Елена Всеволодовна, 1999 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Бавыкин С.Г. (1988) Динамика структуры хроматина. Итоги науки и

техники. Серия: молекулярная биология. Москва. Т.26, С.5-121. Буриченко В.К., Корякина Н.И., Марьяш Л.И., Камилова P.P. (1990) Принципы моделирования при изучении конформации гистонов. Химия природн. соед., Т.З, С.391-398. Веньяминов С.Ю., Долгих Д.А. (1981) Тезисы докл. IV Всесоюзн. конф.

по спектроскопии биополимеров, Харьков, С.34. Воробьев В.И. (1986) Наднуклеосомная организация хроматина. В сб. Молекулярные и клеточные аспекты биотехнологии. Л.: Наука, С.18-38.

Глотов Б.О., Николаев Л.Г. (1983) Структура, химическая модификация и взаимодействие гистона HI с компонентами хроматина. Мол. Биол., Т.17, С.891-914. Есипова Н.Г., Рамм Е.И., Лобачев В.М., Воробьев В.И. (1976) Об особенностях конформационного состояния гистонов. Биофизика, Т.21, С.582-583. Зенгер В. (1987) Принципы структурной организации нуклеиновых

кислот. Москва, "Мир", С.396-398. Камилова P.P., Рамм Е.И., Иванов Г.С., Марьяш Л.И., Буриченко В.К. (1990а) Конформационные особенности пептидных фрагментов С-конца гистона HI. Химия природн. соед., Т.6, С.793-798. Камилова P.P., Рамм Е.И., Иванов Г.С., Марьяш Л.И., Буриченко В.К. (19906) Сравнительное исследование комплексов ДНК с полипептидным фрагментом 152-184 гистона HI и полипептидом (Lys-Ala-Ala)n. Химия природн. соед., Т.6, С.798-805.

Караванов A.A., Афанасьев Б.Н. (1983) Негистоновые белки хроматина. Мол. Биол., Т. 17, В. 2, С. 213-233.

Костылева Е.И., Селиванова Г.В., Заленская И.А. (1989) Особенности структуры хроматина эритроцитов в зависимости от свойств лизинбогатых гистонов. Мол. Биол., Т.23, Вып.1, С.73-79.

Осипова Т.Н., Карпова Е.В., Кондитеров C.B., Воробьев В.И. (1990) Структура хроматина с длинной линкерной ДНК. Мол. Биол., Т.24, С.69-78.

Рамм Е.И., Бирштейн Т.М., Болотина И.А., Волькенштейн М.В., Воробьев В.И., Дмитренко Л.М., Некрасова Т.Н. (1970) Исследование структуры гистонов. Мол. биол., Т.4, С.118.

Рамм Е.И., Иванов Г.С., Воробьев В.И. (1993а) Исследование особенностей организации хроматина из различных источников. Биохимия, Т.58, С.1604-1615.

Рамм Е.И., Иванов Г.С., Воробьев В.И. (19936) Исследование конформационных особенностей хроматина спермиев морского ежа. Мол. биол., Т.27, Вып.5, С.1061-1069.

Рамм Е.И., Иванов Г.С.,Воробьев В.И., Есипова Н.Г., Григолава М.В., Гречишко B.C., Буриченко В.К. (1983) Сравнительное исследование синтетических пептидных фрагментов гистона Н2В. Биофизика, Т.28, Вып.1, С.35-39.

Рамм Е.И., Иванов Г.С., Воробьев В.И., Кадура С.Н., Храпунов С.Н. (1987) Исследование структуры иллексина 12 и его комплексов с ДНК. Мол. Биол., Т.21, Вып.6, С.1590-1599.

Рамм Е.И., Иванов Г.С., Поспелов В.А., Светликова С.Б., Кукушкин А.Н. (1986) Особенности структурного состояния ДНК в хроматине с коротким линкером. Биофизика, Т.31, Вып.З, С.404-408.

Рамм Е.И., Камилова P.P., Полозова O.JL, Воробьев В.И., Буриченко В.К. (1979) Сравнение конформационных возможностей

полипептидов, моделирующих концевые участки различных гистонов. Биофизика, Т.24, Вып.5, С.815-820.

Рамм Е.И., Карпова Е.В., Воробьев В.И., Григолава М.В., Есипова Н.Г. (1983) Конформационные особенности протаминов. Мол. биол., Т. 17, Вып.2, С.293-302.

Рамм Е.И., Осипова Т.Н., Воробьев В.И. (1982) Конформационные особенности гистонов HI из тимуса теленка и спермиев морского ежа. Биофизика, Т.27, С.154-155.

Рамм Е.И., Чихиржина Е.В., Костылева Е.И., Воробьев В.И. (1995) Конформационные особенности линкерных белков суперкомпактного хроматина спермиев морских

беспозвоночных. Биохимия, Т.60, В.1, С.150-158.

Спирин A.C. (1958) Спектрофотометрическое определение суммарного количества нуклеиновых кислот. Биохимия, Т.23, В.5, С. 656-662.

Чихиржина Е.В., Костылева Е.И., Рамм Е.И., Воробьев В.И. (1998) Исследование компактизации хроматина с использованием модельной системы ДНК-белковых комплексов. Цитология, Т. 10, С. 883-888.

Чихиржина Е.В. Исследование процесса компактизации хроматина на модельной системе ДНК-белковых комплексов. Труды победителей конкурса грантов 1998 г. для студентов, аспирантов и молодых ученых Санкт-Петербурга, НИИХ СПбГУ, 1998, С.

, 248-249.

Adler A.J., Moran Е.С., Fasman G.D. (1974) Comple[ of DNA with histones f2a2 and f3. Circular dichroism studies. Biochemistry, V.14, P.4179-4185.

Allan J., Crane-Robinson C., Aviles F. (1980) Nature, V.288, P.675-679.

Allan J., Mitchell T., Harborne N. (1986) Role of HI domains in determening higher chromatin structure and HI location. J. Mol. Biol., V.187, P.591-601.

Allan J., Ram D., Harborne N., Gould H. (1984) Higher order structure in a short repeat length chromatin. J. Cell. Biol., V.98, P.1320-1327.

Arents G., Burlingame R., Wang B., Love W., Moudrianakis E. (1991) The nucleosomal core histone octamer at 3.1° A resolution: a tripartite protein assembly and left-handed superhelix. Proc. Natl. Acad. Sci., V.88, P.10148-10152.

Ausio J., Subirana I. (1982) Nuclear proteins and the organization of chromatin in spermatazoa of Mytilus edulis. Exp. Cell Res., V.141, P.39-45.

Bailly F„ Bailly C., Colson P., Houssier C., Henichart J-P. (1993) A tandem repeat of the SPKK peptide motif induces i|;-type DNA structures at alternating AT sequences. FEBS Lett., V.324, P.181-184.

Baneres J-L., Essalouh L., Jariel-Encontre I., Mesnier D., Garrod S., Parello J. (1994) Evidence indicating proximity in the nucleosome between the histone H4 N termini and the globular domain of histone HI. J. Mol. Biol., V. 243, P. 48-59.

Bates D.L., Butler P.J.G., Pearson E.C., Thomas J.O. (1981) Stability of the higher-order structure of chicken erythrocyte chromatin in solution. Eur. J. Biochem., V.l 19, P.469-476.

Bazett-Jones D.P., Leblanc B., Herfort M., Moss T. (1994) Short-range DNA looping by the Xenopus HMG-box transcription factor, xUBF. Science, V. 264, P. 1134-1137.

Bednar J., Horowitz R., Dubochet J., Woodcock C. (1995) Chromatin conformation and salt-induced compaction: three—dimensional

structural information from cryoelectron microscopy. J. Cell Biol, V.131, P. 1365-1376.

Bednar J, Horowitz R, Grigoryev S, Carruthers L, Hansen J, Koster A, Woodcock C. (1998) Nucleosomes, linker DNA, and linker histone form a unique structural motif that directs the higher-order folding and compaction of chromatin. Proc. Natl. Acad. Sci, V.95, P. 1417314178.

Belikov S, Karpov V. (1998) Linker histones: paradigm lost but questions remain. FEBS Lett, V.441, P.161-164.

Belmont A, Bruce K. (1994) Visialization of G1 chromosomes: folded, twisted, supercoiled chromonema model of interphase chromatid structure. J. Cell Biol, V.127, P.287-302.

Blumenfeld M, Orf J.W, Sina B.J, Kreber R.A, Callahan M.A, Mullins J.I, Snyder L.A. (1978) Correlation between phosphorylated HI histones and satellite DNAs in Drosophila virilis. Proc. Natl. Acad. Sci, V.75, P.866-870.

Bonner W.N, Pollard H.B. (1975) The presence of F3-F2a dimer and F1 oligomers in chromatin. Biochem. Biophys. Res. Comm., V.64, P.282-288.

Bradbury E.M. (1992) Reversible histone modifications and the chromosome cell cycle. BioEssays, V. 14, P. 9-16.

Bradbury E.M, Danby S.D, Rattle H.W.E, Giancotti V. (1975) Studies of the role and mode of operation of the very-lysine-rich histone HI (Fl) in eukaryote chromatin. Histone HI in chromatin and in HI-DNA - complexes. Eur. J. Biochem, V.57, P.97-105.

Bustin M, Reeves R. (1996) High-mobility-group chromosomal proteins: architectural components that facilitate chromatin function. In: Progr.

In Nucl. Acid Res. Mol. Biol. By Cohn W., Moldave K. Acad. Press, London, V. 54, P. 35-100.

Butler P.J.G. (1984) A difmed structure of the 30 nm chromatin fibre which accomodates different nucleosomal repeat length EMBO J., V.3, P.2599-2604.

Clark D.J., Hill C.S., Martin S.R.%, Thomas J.O. (1988) a-Helix in the carboxy-terminal domains of histones HI and H5. EMBO J., V.7, N1, P.69-75.

Clark D.J., Thomas J.O. (1986) Salt-dependent cooperative interaction of histone HI with linear DNA. J. Mol. Biol., V.187, P.569-580.

Clark D.J., Thomas J.O. (1988) Differences in the binding of HI variants to DNA. Cooperativity and linker-length related distribution. Eur. J. Biochem., V.178, P. 225-233.

Corbett S., Bradbury E.M., Matthews H.R. (1980) Histone HI from prophase aggregates DNA better than histone HI from S phase. Exp. Cell Res., V.128, P.127-132.

Crane-Robinson C., Staynov D.Z., Baldvin J.P. (1984) Histones HI and its role in chromatin. Comm. Mol. Cell. Biophys., V.2, P.219-265.

De Bernardin W., Losa R., Koller T. (1986) Formation and characterization of soluble complexes of histone HI with supercoiled DNA. J. Mol. Biol., V.189, P.503-517.

Diez-Caballero T., Aviles F.X., Albert A. (1981) Specific interaction of histone HI with eukaryotic DNA. Nucleic Acids Res., V.9, P. 13831393.

Dworetzky, Wright F.M., Lian, Stein, Penman, Stein G.C. (1992) Sequence-specific DNA-binding proteins are components of a nuclear matrixattachment site. PNAS, V.82, P.4178-4182.

EcKner R., Birnstiel M.L. (1989) Cloning of cDNA-s coding HMG1 for human and HMGY proteins: both are capable of binding to the octamer sequence motif. NAR, V.17, N15, P.5947-5959. Fasman G.D., Schaffhausen B., Goldsmith L., Adler A.J. (1970) Conformational changes associated with f-1 histone-DNA complexes. Circular dichroism studies. Biochemistry, V.9, P.2814-2822. Fasman G.D., Valenzuela M.S., Adler A.L. (1971) Complexes of DNA with fragments of lysine-rich histone (f-1). Circular dichroism studies. Biochemistry, V.10.N20, P.3795-3801. Fedor M.J. (1992) Chromatin structure and gene expression. Curr. Opin. Cell

Biol., V.4, P.436-443. Felsenfeld G. (1992) Chromatin as an essential part of the transcription

mechanism. Nature, V.355, P.219-224. Felsenfeld G. (1996) Chromatin unfolds. Cell, V.86, P.13-19. Finch J., Brow R., Rhodes D., Richmond T., Rushton B., Butter L., Klug A. (1981) X-ray diffraction study of a new crystal form of the nucleosome core showing higher resolution. J. Mol. Biol., V.145, P.757-769.

Finch J., Klug A. (1976) Solenoidal model for superstructure in chromatin.

Proc. Natl. Acad. Sci., V.73, P.1897-1901. Frechette A., Huletsky A., Aubin R.J. (1985) Poly(ADP-ribosyl)ation of chromatin kinetics of relaxation and its effect on chromatin solubility. J. Biochem. Cell. Biol., V.63, P.764-773. Georgiev G.P., Nedospasov S.A., Bakayev V.V. (1978) Supranucleosomal - levels of chromatin organization. The cell nucleus. Ed. H. Busch. N.Y.: Acad, press, V. 6, P. 3-34. Gerdes M.G., Carter K.C., Moen P.T., Jr., Lawrence J.B. (1994) Dynamic changes in the hirher-level chromatin organization of specific

sequences revealed by in situ hybridization to nuclear halos. J. Cell Biol., V. 126, P. 289-304.

Giradet J.L., Lawrence J.J. (1983) Spin-label stady of histone Hl-DNA interaction. Involvement of the central part of the molecule in reconstituted chromatin. Eur. J, Biochem., V.132, P. 195-200.

Glotov B.O., Nikolaev L.G., Kurochkin S.N., Severin E.S. (1977) Histone Hl-DNA interaction. Influence of phosphorylation on the interaction of histone HI with linear fragmented DNA. Nucleic Acids Res., V.4, P.1065-1081.

Goodwin D.C., Brahms J. (1978) Form of DNA and the nature of interactions with proteins in chromatin. Nucl. Acids Res., V.5, P.835-850.

Greenfield N., Fasman G. (1969) Computed circular dichroism spectra for the evaluation of protein conformation. Biochemistry, V. 8, N 10, P. 4108-4115.

Hamiche A., Schultz P., Ramakrishnan V., Oudet P., Prunell A. (1996) Linker histone-dependent DNA structure in linear mononucleosomes. J. Mol. Biol., V.257,P.30-42.

Hansen J., Tse C., Wolffe A. (1998) Structure and function of the core histone N-termini: more than meets the eye. Biochemistry, V.37, P. 1763717641.

Hartree E.F. (1972) Determination of protein: a modification of the Lowry method that gives a linear photometric response. Analyt. Biochem., V.48, P.422-427.

Hayes J. (1996) Site-directed cleavage of DNA by linker histone-Fe(II) EDTA conjugate: localization of a globular domain binding site within a nucleosome. Biochemistry, V.35, P. 11931-11937.

Hill C.S, Martin S.R., Thomas J.O. (1989) A stable a-helical element in the carboxy-terminal domain of free and chromatin-bound histone HI from sea urchin sperm. EMBO J., V.8, N9, P.2591-2599.

Hill C.S., Packman L.C., Thomas J.O. (1990) Phosphorylation at clustered -Ser-Pro-X-Lys/Arg- motifs in sperm-specific histones HI and H2B. EMBO J., V.9,P.805-813.

Igo-Kemenes T., Horz W., Zachau H.G. (1982) Chromatin. Ann. Rev. Biochem., V.51,P. 89-121.

Ivanov V.I., Ninchenkova L.E., Schyolkina A.K., Poletaev A.I. (1973) Different conformations of double stranded nucleic acids in solution as revealed by circular dichroism. Biopolymers, V.12, P.89-100.

Izaurralde E., Kas E., Laemmli U.K. (1989) Highly preferential nucleation of histone HI assembly on scaffold-associated regions. J. MOL. Biol., V.210, P.573-585.

Jenson J.C., Chin-Lin P., Gerber-Jenson B., Litman G. (1980) Structurally unique basic protein coextracted with histones from calf thymus chromatin. Proc. Natl. Acad. Set., V.77, P.1389-1393.

John S., Reeves R., Lin J-X., Child R., Leiden J., Thompson C., Leonard W. (1995) Regulation of cell-type-specific interleukin-2 receptor a-chain gene expression: potential role of physical interactions between Elf-1, HMGI(Y), and NF-kB family proteins. Mol. Cel. Biol., V. 15, P. 1786-1796.

Johns E.W. (1964) Studies on histones. Preparative methods for histone fractions from calf thymus. Biochem. J., V.92, P.55-59.

Jordano J., Montero F., Palacian E. (1984) Rearrangement of nucleosomal components by modification of histone amino groups. Structural role of lysine residues. Biochemistry, V.23, P.4280-4284.

Kamilova R.R, Ramm E.I., Ivanov G.S, Burichenko V.K. (1985) The comparative investigation of DNA complexes with sequential (Ala-Orn-Ala) and (Gly-Orn-Gly) polepeptides. Studia Biophysica, V.106, N3, P.155-170.

Kas E, Izaurralde E, Laemmli U.K. (1989) Specific inhibition of DNA binding to nuclear scaffolds and histone HI by distamycin. The role of oligo(dA)-oligo(dT) tracts. J. Mol. Biol., V.210, P.587-599.

Keishline L.D, Wasserman P.M. (1979) Structure of chromatin in sea urchin embryos sperm, and adult somatic cells. Biochemistry, V.18, P.214-219.

Kierszenbaum A.L, Tres L.L. (1978) RNA transcription and chromatin structure during meiotic and postmeiotic stages of spermatogenesis. Fed. Proc., V.37, P.2512-2521.

Knippers R, Otto B, Bohme R. (1978) Binding of phosphorylated histone HI to DNA. Nucleic Acids Res, V.5, P.2113-2131.

Kohlstaedt LA, King D.S, Cole R.D. (1986) Native state of the mobility group chromosomal proteins 1 and 2 is rapidly lost by oxidation of sulfhydryl groups during storage. Biochemistry, V. 25, P. 4562-4565.

Kohlstaedt LA, Sung E.C, Fujishige, Cole R.D. (1987) Non-histone chromosomal protein HMG1 modulates the histone HI-induced condensation of DNA. J. Biolog. Chem, V.262, P. 524-526.

Kornberg R. (1977) Structure of chromatin. Ann. Rev. Biochem, V.46, P.931-954.

Laemmly U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature (L), V.227, P.680-685.

Lambert S, Muyldermans S, Baldwin J, Kilner J, Ibel K, Wijns L. (1991) Neutron scattering studies of chromatosomes. Biochem. Biophys. Res. Commun. V.179, P.810-816.

Laybourn P.J., Kadonaga J.T. (1991) Role of nucleosomal cores and histone HI in regulation of transcription by RNA polymerase II. Science, V.254, P. 238-245.

Lennox R.W. (1984) Differences in evolutionary stability among mammalian HI subtypes. J. Biol. Chem., V.259, P.669-672.

Losa R., Thoma F., Koller T. (1984) Involvement of globular domain of histone HI in the higher order structures of chromatin. J. Mol. Biol., V.175, P.529-551.

Luger K., Mader A., Richmond R., Sargent D., Richmond T. (1997) Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature, V. 389,P.251-260.

Marecov L.N., Beltchev B. (1981) Preferential binding of phosphorylated histone HI to AT-rich DNA. Int. J. Biol. Macromol., V.3, P.145-147.

Marecov L.N., Angelov G., Beltchev B. (1978) Studies on the preferential binding of histone HI to AT-rich DNA. Biochim., V.60, P.1347-1349.

Matthews H.R., Bradbury E.M. (1978) The role of HI histone phosphorylation in the cell cycle. Turbidity of HI-DNA interaction. Exp. Cell Res., V.l 11, P.343-351.

McGhee J.D, Nickol J.M., Felsenfeld G., Rau D. (1983) Higher order structure of chromatin solenoid is independend of species and spaser length. Cell, V.33, P.831-841.

McGhee J.D., Rau D.C., Charney E„ Felsenfeld G. (1980) Higher order structure of chromatin. Cell, V. 22, P. 87-96.

McGhee J.D., Nickol J.M., Felsenfeld G., Rau D.C. (1983) Higher order structure of chromatin: orientation of nucleosomes within the 30nm chromatin solenoid in independent of species and spacer length. Cell, V.33, P.831-841.

McGhee J.D., Rau D.C., Charney E., Felsenfeld G. (1980) Higher order structure of chromatin. Cell, V.22, P.87-96.

Mirzabekov A.D. (1980) Nucleosomes structure and its dynamic transitions. Quarterly Rev. of Biophys., V.13, N2, P.255-295.

Misselwitz R., Zirwer D., Damaschun H., Damaschun G., Welfle H. Zalenskaya I.A., Ramm E.I., Vorob'ev V.I. (1986) Marine invertebrate sperm-soecific histones and histone-DNA interactions: circular dichroism and ultraviolet spectroscopy studies. Int. J. Biol. Macromol, V.2, P. 194-200.

Moran F., Montero F., Azorin F., Suau P. (1985) Condensation of DNA by the C-terminal domain of histone HI. Biophys. Chemistry, V.22, P. 125129.

Noll M., Kornberg R.D. (1977) Action of micrococcal nuclease on chromatin and the location of histone HI. J. MOL. Biol., V.109, P.393-404.

Nurse P. (1990) Universal control mechanism regulating onset of M-phase. Nature, V. 344, P. 503-507.

Oliva R., Dixon G. (1991) Vertebrate protamine genes and the histone-to-protamine replacement reaction. Prog. NARes. Mol. Biol., V.40, P.25-94.

Onate S.A., Prendergast P., Wagner J.P., Nissen M., Reeves R., Pettijohn D.E., Edwards D.P. (1994) The DNA-bending protein HMG1 enhances progesterone receptor binding to its target DNA sequences. Mol. Cel. Biol., V. 14, N 5, P. 3376-3391.

Osipova T.N., Karpova E.V., Vorob'ev V.I. (1990) Chromatin higher-order structure: two-start double superhelix formed by zig-zag shaped nucleosome chain with folded linker DNA. J. Biomol. Struct, and Dynamics, V.8, P.011-022.

Osipova T.N., Pospelov V.A., Svetlikova S.B., Vorob'ev V.I. (1980) The role of histories HI in compaction of nucleosomes in solution. Sedimentation behaviour of digonucleosomes in solution. Eur. J. Biochem, V.113, P.183-188.

Panyim C., Chalkley R. (1969) The heterogeneity of histones. I. Quantitative analysis of calf histones in very long polyacrylamide geles. Biochemistry, V.8, P.3972-3979.

Paulson J.R., Laemmli U.K. (1977) The structure of histone-depleted metaphase chromosones. Cell, V.12, P.817-828.

Pienta K.J., Coffey D.S. (1984) A structural analysis of the role of the nuclear matrix and DNA loops in the organization of the nucleus and chromosome. J. Cell Sci., P. 123-135.

Poccia D. (1986) Remodeling of nucleoproteins during gametogenesis, fertilization and early development. Int. Rev. Cytol., V.105, P.1-65.

Poccia D., Green G.R. (1992) Packaging and unpackaging the sea urchin sperm genome. Elsevier Science Publishus, P.223-227.

Pogany G., Coisett M., Wiston S., Balhorn R. (1981) DNA and protein content of mouse sperm. Exp. Cell. Res., V.136, P.127-136.

Pruss D., Bartholomew B., Persinger J., Hayes J., Arents G., Moundrianakis E., Wolffe A. (1996) Science, V.274, P.614-617.

Provencher S.W., Glockner J. (1981) Estimation of globular protein secondary structure from circular dichroism. Biochemistry, V.20, P.33-37.

Puigdomenech P., Romero M.C., Allan J., Sautiere P., Guancotti V., Crane-Robinson C. (1987) The chromatin of sea urchin sperm. Biochim. Biophys. Acta, V.908, P.70-75.

Ramakrishnan V. (1997) Histone structure and the organization of the nucleosome. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., V.26, P.83-112.

Ramm E.I., Ivanov G.S., Vorob'ev V.I., Sibilyeva M.A., Gonsales B.B., Korjakina N.I., Grechishko V.S., Burichenko V.K. (1988) Hydrodinamic and optical propeties of DNA complexes with synthetic peptide fragments of histone H2B. Studia Biophysica, V.124, N1, P.69-84.

Ramm E.I., Vorob'ev V.I., Birshtein T.M., Bolotina I.A., Volkenshtein M.V. (1972) Circular dichroism of DNA and histones in the free state and in deoxyribonucleoprotein. Eur. J. Biochem., V.25, P.245-253.

Rauter H„ Domenico R., Menta E., Oliva A., Qu Y., Farrell N. (1997) Selective platination of biologically relevant polyamines. Linear coordinating spermidine and spermine as amplifying linkers in dinucler platinum complexes. Inorg. Chem., V.36, P.3919-3927.

Read C., Cary P., Crane-Robinson C., Driscoll P., Norman D. (1993) Solution structure of a DNA-binding domain from HMG1. Nucl. Acids Res., V. 21, N 15, P. 3427-3436.

Renz M., Day L.A. (1976) Transition from noncooperative and selective binding of histone HI to DNA. Biochemistry, V.15, P.3220-3228.

Renz M., Nehls P., Hozier J. (1977) Involvement of histone HI in the organization of the chromosome fiber. Proc. Nat. Acad. Sci., V.74, P.1879-1883.

Rhodes D. (1997) The nucleosome core all wrapped up. Nature, V.389, P.231-233.

Ring D, Cole R.D. (1983) Close contacts between HI histone molecules in nuclei. J. Biol. Chem., V.258, P.15361-15364.

Russo E., Giancotti V., Crane-Robinson C. (1983) Effects of binding three lysine-rich HI-type histones to DNA and poly(dG-dC). Int. J. Biol. Macromol., V.5, P.366-368.

Sen D., Metra S., Crothers D.M. (1986) Higher order structure of chromatin: evidence from photochemically detected linear dichroism. Biochemistry, V.25, P.3441-3447.

Singer D.S., Singer M.F. (1978) Characterization of complexes of superhelical and relaxed closed circular DNA with HI and phosphorylated HI. histones. Biochemistry, V.17, P.2086-2095.

Straka C., Horz W. (1991) A functional role for nucleosomes in the repression of a yeat promoter. EMBO J., V.10, N2, P.361-368.

Svaren J., Horz W. (1993) Histones, nucleosomes and transcription. Curr. Opin. in Genetics and Develop., V.3, P.219-225.

Subirana J., Colom J. (1987) Comparison of protamines from freshwater and marine bivalve molluscs: evolutionnary implications. FEBS Lett., V.220, P.193-196.

Suzuki M. (1989a) SPKK, a new nucleic acid-binding unit of protein found in histone. EMBO J., V.8, P.797-804.

Suzuki M. (1989b) SPXX, a frequent sequence motif in gene regulatory proteins. J. Mol. Biol., V.207, P.61-84.

Thoma F., Koller Th., Klug A. (1979) Involvement of histone HI in the organization of the nucleosome and of the salt dependent superstructures of chromatin. J. Cell. Biol., V.83, P.403-427.

Thomas J.O. (1984) The higher order structure of chromatin and histone HI. J. Cell Sci. Suppl., V.l, P. 1-20.

Thomas J.O., Khabaza A.J.A. (1980) Cross-linking of histone HI in chromatin. Eur. J. Biochem., V.l 12, P.501-511.

Thomas J., Ress C., Fihch J. (1992) Cooperative binding of the globular domains of histones HI and H5 to DNA. Nucleic Acids Res., V.20, P. 187-194.

Thomas J., Wilson C. (1986) Selective radiolabelling and identification of a strong nucleosome binding site on the globular domain of histone H5. EMBO J., V.5,P.3531-3537.

Travers A. (1992) The reprogramming of transcriptional competence. Cell, V.69, P.573-575.

Travers A. (1999) The location of the linker histone on the nucleosome. TIBS, V.24, P.4-7.

Triebel H., Bar H., Walter A., Osipova T.N., Ramm E.I., Kostyleva E.I., Vorob'ev V.I. (1989) Structural differences between histone HI molecules from sea urchin (Strongylocentrotus intermedius) sperm and calf thymus: hydrodynamic and C.D. studies. Int. J. Biol. Macromol., V.l 1, P.153-158.

Triebel H., Von Mickwitz C.U., Bar H., Burckhardt G. (1988) Mg2+-induced transition to strongly cooperative binding of histone HI to linear DNA. Int. J. Biol. Macromol., V.10, P.322-328.

Trieschmann L., Alfonso P.J., Grippa M.P., Wolfe A.P., Bustin M. (1995) Incorporation of chromosomal proteins HMG14/HMG17 into nascent nucleosomes induces an extended chromatin conformation and enhances the utilization of active transcription complexes. EMBO J., V. 14, P. 1478-1489.

Van Holde K., Zlatanova J. (1994) Unusual DNA structures, chromatin and transcription. BioEssays, V. 16, N 1, P. 59-68.

Varga-Weisz P., Blank T., Becker P. (1995) Energy-dependent chromatin accessibility and nucleosome mobility in a cell-free system. EMBO J., V.14, P.2209-2216.

Varga-Weisz P., van Holde K., Zlatanova J. (1994) Competition between linker histones and HMG1 for binding to four-way junction DNA: implicaions for transcription. BBRC, V. 203, N 3, P. 1904-1911.

Villeponteau B., Brawley J., Martinson H.G. (1992) Nucleosome spacing is compressed in active chromatin domains of chick erythroid cells. Biochemistry, V.31, N5, P. 1554-1563. Von Holt C., Strickland W.N., Brandt W.F., Strickland M.S. (1979) More

histone structure. FEBS Lett., V.100, P.201-216. Vorob'ev V.I., Karpova E.V., Osipova T.N. (1994) Hydrodynamic properties of nucleosomal fibers and chromatin higher-order structure. Biorheology, V.31, P.221-234. Walker J.M., Gooderham K., Hastings J.R., Mayes E., Johns E.W. (1980) The primary structures of non-histone chromosomal proteins HMG1 and 2. FEBS Lett., V. 122, P. 264-270. Weintraub H. (1985) Assembly and propagation of repressed chromosomal

states. Cell, V.42, P.705-711. Weiskopt M., Li H.J. (1977) Poly(L-lysine)-DNA interactions in NaCl

solutions: B-C and B-A transitions. Biopolimers, V.16, P.669-684. Widom J. (1989) Toward a unified model of chromatin folding. Annu. Rev.

Biophys. Chem., V.18, P.365-395. Widom J. (1998) Structure, dynamics and function of chromatin in vitro.

Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct., V.27, P.285-327. Widom J., Finch J.T., Thomas J.O. (1985) Higher-order structure of long

repeat chromatin. EMBO J., V.4, P.3189-3194. Widom J., Klug A. (1985) Structure of the 300A chromatin filament: X-ray

diffraction from oriented samples. Cell, V.43, P.207-213. Woodcock C.L.F, Frado L.L.Y, Rattner J.B. (1984) The higher order structure of chromatin: evidence for helical ribbon arrangement. J. Cell. Biol., V.99, P.42-52. Woodcock C.L., Horowitz R.A. (1995) Chromatin organization re-viewed. Trends in Cell Biol., V. 5, P. 272-277.

Worcel A, Benyajati C. (1977) Higher order coiling of DNA in chromatin. Cell, V.12, P.83-100.

Worsel A, Strogarts\, Riley D. (1981) Structure of chromatin and the linking number of DNA. PNAS, V.78, P.1461-1465.

Wu R.S, Panuasz H.T, Hatch L, Bonner W.M. (1986) Histones and their modifications. CRC Critic. Rev. Biochem, V.20, P.201-263.

Zalenskaya I.A., Pospelov V.A, Zalensky A.O, Vorob'ev V.I. (1981) Nucleosomal structure of sea urchin and starfish sperm chromatin. Histone H2B is possibly involved in determining the length of linker DNA. Nucl. Acids Res, V.9, N3, P.473-487.

Zalenskaya I. A, Zalensky A.O. (1980) Basic chromosomal proteins of marine invertebrates - I. Sperm histones of nine sea urchin species. Comp. Biochem. Physiol, V.65B, P.369-373.

Zalenskaya I.A, Zalenskaya E.O, Zalensky A.O. (1980) Basic chromosomal proteins of marine invertebrates - II. Starfish and holothuria. Comp. Biochem. Physiol, V.65B, P.375-378.

Zalensky A.O, Zalenskaya I.A. (1980) Basic chromosomal proteins of marine invertebrates - III. The proteins from sperm of bivalvia molluscs. Comp. Biochem. Physiol, V.66B, P.415-419.

Zhou Y, Gershman S, Ramakrishnan V, Travers A, Muyldermans S. (1998) Position and orientation of the globular domain of linker histone H5 on the nucleosome. Nature, V.395, P.402-405.

Zlatanova J. (1990) Histone HI and the regulation of transcription of eukaryotic genes. Trends Biochem. Sci, 1990, V.15, P.273-276.

Zlatanova J, Yaneva J. (1991) Histone Hl-DNA interactions and their relation to chromatin structure and function. DNA and Cell Biology, V.10, P.239-248.