Структурная организация нуклеопротаминового хроматина в сперматозоидах человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.04, кандидат биологических наук Арифулин, Евгений Альбертович

• Арифулин, Евгений Альбертович
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Арифулин, Евгений Альбертович

Оглавление

Оглавление

Введение

Обзор литературы

1. Молекулярные основы ремоделирования хроматина в спермиогенезе

2. Структурная организация ядер зрелых сперматозоидов человека

Организация хромосомных территорий

Уровни компактизации нуклеопротаминового хроматина

3. Патологии ремоделирования хроматина зрелых сперматозоидов

4. «Обратное» ремоделирование хроматина сперматозоидов

Реактивация сперматозоидов после оплодотворения

Реактивация сперматозоидов в экстрактах ооцитов Хепорж 1аеУ1$ и в культивируемых клетках

5. Заключение

Материалы и методы

Результаты

1. Структурная организация хроматина в дифференцирующихся сперматидах

1.1. Исследование эякулята инфертильных пациентов

1.2. Исследование хроматина сперматид в ткани семенников

2. Искусственная декомпактизация хроматина сперматозоидов

2.1. Деконденсация в буфере, не содержащем двухвалентных катионов

2.2. Деконденсация хроматина под действием гепарина и дитиотрейтола

3. Декомпактизация хроматина сперматозоидов, слитых с культивируемыми клетками

3.1. Морфологические и функциональные особенности гетерокариотической системы: сперматозоиды - соматические клетки

3.2. Разрывы ДНК в хроматине сперматозоидов в контроле и после слияния с культивируемыми клетками

3.3. Электронно-микроскопический анализ ядер сперматозоидов, внедренных в культивируемые клетки

Обсуждение

Выводы

Список цитируемой литературы

Благодарности

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Структурная организация нуклеопротаминового хроматина в сперматозоидах человека»

Введение

Известно, что геном эукариот имеет сложную иерархическую организацию, которая обеспечивается специфическим взаимодействием ДНК с различными классами белков.

В соматических клетках «низший» уровень компактизации создается за счет взаимодействия ДНК с тетрамером гистонов (Н2А, Н2В, НЗ и Н4), в результате формируются «элементарные» ДНП фибриллы, состоящие из дискретных нуклеопротеиновых частиц - нуклеосом (Demeret et al., 2001). Другой представитель гистонов - белок HI компактизует «элементарные» нуклеосомные фибриллы в ДНП фибриллы толщиной около 30 нм (Butler, 1984). В ряде работ описаны более сложные уровни организации хроматина соматических клеток эукариот (Zatsepina et al., 1983; Prusov et al.,1983; Belmont et al., 1989), однако молекулярные механизмы, обеспечивающие их формирование, остаются мало изученными.

В процессе формирования мужских гамет у многих представителей эукариот каноническая нуклеогистоновая организация хроматина соматических клеток практически полностью перестраивается на молекулярном и структурном уровне.

Ремоделирование хроматина - многоступенчатый процесс, который

инициируется на ранних стадиях дифференцировки сперматид и завершается

после прохождения сперматозоидов через эпидидимус (Oliva, 2006). На

начальных этапах дифференцировки соматический тип гистонов или их

з

тестис-специфических вариантов замещается транзиторными белками (ТР1 и ТР2), которые, затем заменяются протаминами. В геноме человека в эквивалентных количествах экспрессируется 2 протамина - PI и Р2 (Balhorn et al., 1988). Протамины представляют собой базовые и строго специфические для спермиогенеза белки, они имеют домены, богатые аргинином и цестеином (Balhorn et al., 1992; Rooney et al., 2000). Высокий уровень аргинина создает положительный заряд молекул белков, что обеспечивает эффективное связывание протаминов с ДНК. Остатки цистеина участвуют в формировании многочисленных внутренних и внешних дисульфидных связей, необходимых для компактной упаковки ДНК в хроматине сперматозоидов.

В настоящее время в области изучения ремоделирования хроматина достигнут существенный прогресс, однако представления о макромолекулярной организации нуклеопротаминовых комплексов в хроматине сперматозоидов остаются во многом гипотетическими. По одной из гипотез фундаментальными структурными единицами нуклеопротаминового хроматина являются тороиды - кольцевые структуры толщиной около 20 нм, с внешним диаметром около 90 нм и внутренним диаметром около 15 нм (Ward, 1993; 2010). Основу тороидов составляют петлевые домены ДНК (средний размер около 46 kb), линкеры между индивидуальными тороидами ассоциированы с белками ядерного матрикса. Главный недостаток этой модели состоит в том, что формирование

4

тороидальных структур наиболее убедительно продемонстрировано в системе in vitro. Существование тороидов в «нативном» или искусственно декомпактизованном хроматине сперматозоидов не документировано. Кроме того, в некоторых работах показано, что нуклеопротаминовый хроматин имеет не тороидальную, а, скорее, иерархическую фибриллярно-глобулярную организацию (Табл. 1). Имеются также данные о наличии в хроматине сперматозоидов крупных ДНК-содержащих сферических комплексов диаметром около 300 нм и 500 нм (Табл. 1).

Отсутствие хорошо обоснованной и общепринятой модели

структурной организации нуклеопротаминовых комплексов означает, что

многочисленные данные по анализу молекулярных преобразований генома в

условиях его ремоделирования трудно сопоставимы с представлениями о

структурной реорганизации хроматина, сопровождающей этот процесс.

Исследования в этой области представляют большой интерес не только в

теоретическом плане. Проблема целостности генома и структуры хроматина

сперматозоидов имеет большое практическое значение для диагностики и

лечения мужского бесплодия, повышения эффективности методов

вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) и предотвращения

передачи генетических дефектов при их использовании, особенно при

инъекции сперматозоида в яйцеклетку (ИКСИ). В ряде работ показано, что

нарушения в компактизации хроматина в сперматозоидах человека могут

приводить к существенным нарушениям в нормальном развитии

беременности, вплоть до ее преждевременного прерывания (Брагина и др., 2009).

Цель настоящей работы - изучение уровней организации нуклеопротаминового хроматина в сперматозоидах человека.

Таблица 1. Уровни компактизации ДНК в сперматозоидах человека и некоторых млекопитающих.

Автор Структуры хроматина Метод исследования Модельный объект

\Vagner, Уип, 1979 глобулярные структуры диаметром около 40 и 15 нм искусственная деконденсация, электронная микроскопия человек

БоЫюп ег а1., 1981 палочковидные структуры толщиной 45 - 100 нм и соединяющие их фибриллы, толщиной около 25 - 29 нм деконденсация мочевиной и диотрейтолом и микрококковой нуклеазой крыса

БоЬЬоп ег а1., 1982а глобулярные фибриллы толщиной 90 - 120 нм и 38 -52нм, фибриллы толщиной 18 - 21 нм и 12 - 15 нм деконденсация саркозилом и дитиотрейтолом трансмиссионная электронная микроскопия человек

ЗоЬЬоп ег а1, 19826 глобулярные фибриллы толщинй 33 - 42 и 65 - 120 нм и соединяющие их фибриллы толщиной 6 - 8 нм деконденсация микрокковой нуклеазой и 2М №С 1, трансмиссионная и сканирующая электронная микроскопия человек

АПеп й а1., 1993 глобулярные структуры диаметром 50 и 100 нм искусственная деконденсация, атомный силовой микроскоп бык, мышь, крыса

Нис1 Й а!., 1993 тороид, внешний диаметр 90нм, внутренний - 15 нм, толщина 20 нм деконденсация дитиотрейтолом атомный силовой микроскоп, трансмиссионный электронный микроскоп бык

НааГ, Ward, 1995 глобулярные структуры диаметром около 300 нм спридинг ДНК, световая микроскопия, окраска Б АР1 человек

Миёгак ег а1., 2006 хромосома толщиной 1000 нм, состоящая из глобул 500 нм гибридизация ДНК, световая микроскопия человек

Worawittay ашопд е1 а1„ 2008 Ранние сперматиды -фибриллы толщиной 10-30 нм, на последующих этапах дифференцировки -утолщение до 50, 70 и 90 нм Электронная микроскопия семенных канальцев Сумчатый барсук

Обзор литературы

В сперматогенезе человека, как и у большинства других млекопитающих, принято выделять четыре периода, или, фазы: период размножения (митотические деления сперматогоний), периоды роста и созревания (подготовка к редукционному делению и собственно, мейоз) и период формирования, или, дифференцировки, когда образуются характерные для зрелого сперматозоида структуры.

Динамика сперматогенеза у млекопитающих и человека детально описана во многих работах и руководствах по эмбриологии (Белоусов Л. В., 2005; Голиченков В. А., 2006). Этот процесс начинается с митотических делений стволовых сперматогенных клеток, которые у млекопитающих называются сперматогониями типа А.

Часть разделившихся клеток перемещается по направлению к центру семенного канальца, где после нескольких циклов делений изменяют величину и форму, превращаясь в сперматогониальные клетки, или сперматогонии типа В.

Сперматогонии, вступившие в редукционное деление принято называть сперматоцитами 1-го порядка, после первого деления созревания -сперматоцитами П-го порядка, а после второго деления созревания -сперматидами.

Дифференцировка сперматид - процесс непрерывный, однако некоторые авторы, условно подразделяют его на стадии, основываясь на структурных преобразованиях различных цитоплазматических органелл (Gergely et al., 1999). По данным различных источников у человека выделяют от 4 (Morales, лекции) до 8 (Hermo, Clermont, 1995) стадий.

На начальном этапе, называемом фазой Гольджи, происходит удлинение круглых сперматид. При этом акросомные везикулы, сформированные аппаратом Гольджи, мигрируют к одному из полюсов сперматиды (головной полюс). Позже происходит перемещение центриолей к противоположному (хвостовому) полюсу, где инициируется формирование аксонемы будущего жгутика.

На следующем этапе происходит слияние акросомных везикул в единую структуру (акробласт), охватывающую головной полюс ядра. На противоположном полюсе сперматиды начинается формирование жгутика вокруг аксонемы. Ядро становится более конденсированным.

Далее, во время акросомной фазы, сперматиды переориентируются так, что жгутик высвобождается в просвет семенного канальца, а акросома оказывается сближенной с базальной мембраной клетки. Ядро сперматиды претерпевает дальнейшее сжатие и удлинение. В то же время цитоплазма сдвигается к хвостовому полюсу, а митохондрии концентрируются вокруг жгутика. Центриоли смещаются ближе к ядру.

На заключительном этапе созревания происходит редукция остатков цитоплазмы и отделение сперматиды от клетки Сертоли (Morales, лекции). Структура акросомного комплекса, изменяющаяся с течением

t

спермиогенеза, является удобным маркёром, позволяющим классифицировать сперматиды по различным стадиям созревания при анализе ультратонких срезов.

Фаза акросомы фаза созревания

Центриоли

Рис. I Стадии спермиогенеза (Ь пр ://а 1вха тЫа. ИеаШ Но гагу. са/Иос ит сшб/по 1е$/Ъ от/ип 3/1 - 0 7%208регт а^ёШШ ж хт I)

1. Молекулярные основы ремоделирования хроматина в

спермиогенезе

По своему составу и функциональному статусу нуклеогистоновый хроматин сперматид на начальных этапах созревания близок к хроматину соматических клеток, и характеризуется высоким уровнем транскрипции (Oliva, 2006). На начальном этапе перехода нуклеогистонового хроматина в нуклеопротаминовый, происходит встраивание как характерных для соматических клеток (Н2А.Х, H2.Z, macroH2A, НЗ.З), так и тестис-специфичных (Hit, HILS1, ТН2А, ТН2В, hTSH2B, H3t) гистоновых вариантов (Govin et al., 2004). В отличие от канонических гистонов, встраиваемых в хроматин во время S-фазы, варианты гистонов могут замещать свои аналоги уже в сформированых нуклеосомах, при этом существенно изменяя структуру отдельных участков хроматина. Так, тестис-специфический гистон Hit, который выявляется на стадии круглых и удлиняющихся сперматид, взаимодействуя с нуклеосомами, формирует менее компактную структуру, чем другие варианты Hl (Khadake, Rao, 1995). На более поздних стадиях спермиогенеза, вплоть до начала конденсации хроматина, в сперматидах присутствует другой HI-подобный линкерный белок - HILS1 (Yan et al., 2003) и гистон Н2А.Х, который в соматических клетках принимает участие в процессе репарации двунитевых разрывов ДНК (Rogakou et al., 1998). Гистон hTSH2B был обнаружен в зрелых

сперматозоидах человека, но только в 20% популяции гамет (Zalensky et al., 2002). Наконец, гистон НЗ.З включается в участки ДНК с высоким уровнем транскрипции (McKittrick et al., 2004).

На этапе круглых и удлиняющихся сперматид происходят репликационно- и транскрипционно-независимые посттрансляционные модификации гистонов, такие как гиперацетилирование, фосфорилирование, убиквитилирование, АДФ-рибозилирование и др. (Marcon, Boissonneault, 2004; Govin et al., 2004). По всей видимости, подобные модификации в сперматидах позволяют быстро и обратимо «расслабить» структуру нуклеосом, увеличив доступность сайтов взаимодействия для белков, участвующих в дальнейшем преобразовании хроматина (Oliva, Mezquita, 1982). Так, например, в системе in vitro было показано, что гиперацетилирование облегчает замещение гистонов протаминами (Oliva, Mezquita, 1986; Oliva et al., 1987).

Впоследствии было установлено, что гиперацетилированный гистон Н4 связывается с тестис-специфичным белком BRDT, содержащим два бромодомена (Pivot-Pajot et al,, 2003). При этом BRDT в комплексе с белком CIA-II способен вызывать конденсацию участков гиперацетилированного хроматина, тем самым контролируя удаление гистонов из этих областей (Umehara, Horikoshi, 2003).

Следующим этапом ремоделирования хроматина является «разборка»

нуклеосом. Следует отметить, что удаление гистонов и, как следствие,

13

исчезновение первичного уровня упаковки хроматина, неизбежно приводит к нарастанию общего напряжения всей системы. Это происходит вследствие гиперспирализации или, наоборот, чрезмерного релаксирования двойной спирали ДНК. Предположительно, именно гиперацетилирование гистонов индуцирует активацию топоизомераз первого и второго типов, которые принимают активное участие в процессе ремоделирования хроматина (Akama et al., 1999; Kierszenbaum, 2001; Carrell et al., 2007).

Одновременно с разборкой нуклеосом происходит встраивание транзиторных белков ТР1 и ТР2, которые на данном этапе составляют 90% основных белков хроматина (Meistrichet al., 2003). Эти белки присутствуют в ядре уже в самом начале спермиогенеза, на этапе круглых сперматид, но перестают выявляться в длинных сперматидах (Aoki et al., 2006). По данным, полученным in vitro, транзиторные белки, характерные только для спермиогенеза млекопитающих, влияют на физико-химические свойства молекулы ДНК, облегчая ремоделирование хроматина. Так, показано, что ТР1 уменьшает температуру плавления ДНК (Akama et al., 1998), релаксирует структуру нуклеосом (Singh, Rao, 1988) и стимулирует активность топоизомеразы I (Akama et al., 1999). В то же время, белок ТР2 выступает как антагонист ТР1, повышая температуру плавления ДНК и компактизируя нуклеосомы (Baskaran, Rao, 1990). Было высказано предположение, что, действуя совместно, транзиторные белки оказывают конденсирующее воздействие на хроматин, позволяя молекуле ДНК, принять

14

более компактное состояние (Levesque et al., 1998). Кроме того, предполагают, что транзиторные белки играют важную роль на стадии репарирования разрывов ДНК, возникающих в процессе ремоделирования хроматина (McPherson, Longo, 1993; Caron et al., 2001). Данные, полученные in vivo на мышах с нокаутом по одному или обоим генам Tnpl и Тпр2 (отвечающим за продукцию белков ТР1 и ТР2, соответственно) лишь частично подтверждают результаты полученные in vitro. Так мыши, у которых отсутствовали оба транзиторных белка, были абсолютно стерильными. В то же время, мыши, продуцирующие один из белков, несмотря на некоторые дефекты спермиогенеза, весьма сходные в обоих случаях, полностью стерильными не являлись. При этом степень выраженности дефектов была тем выше, чем меньше общее количество транзиторных белков. Эти наблюдения свидетельствуют о частичном дублировании функций транзиторными белками, что не полностью соответствует их характеристике, полученной in vitro (Meistrich et al., 2003).

Дальнейшее созревание сперматид заключается в удалении транзиторных белков и связывании протаминов с ДНК. Для многих видов протамины являются самими многочисленными белками ядер сперматозоидов (Aoki, Carrell, 2003; Lewis et al., 2003). В сперматозоидах человека встречается два типа протаминов, PI и Р2, экспрессирующихся примерно в равных количествах (Balhorn et al., 1988). Белок PI присутствует во всех изученных видах позвоночных (Oliva, Dixon, 1991; Chauvière et al.,

15

1992; Yoshii et al., 2005). Белки семейства Р2 (Р2, РЗ, Р4) встречаются только в некоторых видах млекопитающих, включая мышь и человека (Oliva, Dixon, 1991; Yoshiiet al., 2005). По различным данным 85-98% всех гистонов сперматид замещены протаминами в зрелом сперматозоиде (Bench et al., 1996; Pittoggi et al., 1999; Gineitis et al., 2000; Churikov et al.,2004; Hammoud et al., 2009; Ward, 2010). В отличие от протамина PI, который синтезируется в зрелом состоянии, Р2 синтезируется в виде предшественника, содержащего примерно в два раза больше аминокислот (Aoki, Carrell, 2003). Сразу после трансляции PI и Р2 фосфорилируются под контролем киназ SRPK1 и САМК4 (Green et al., 1994; Papoutsopoulou et al., 1999). Фосфорилирование необходимо для правильного связывания белков с ДНК, а так же для окончательного процессинга Р2. Посадка протаминов может осуществляться как на малую/большую бороздку, так и просто на случайное место молекулы ДНК, обладающее нужными электростатическими свойствами (Corzette et al., 1999; Fuentes-Mascorro et al., 2000). Высокий положительный заряд этих белков обусловлен многочисленными аргининовыми остатками, содержание которых в протаминах зрелых сперматозоидов человека достигает 48% (Oliva, 2006). Такая структура обеспечивает не только сильное связывание с отрицательно заряженной молекулой ДНК, но и обоюдную компенсацию зарядов в результирующем комплексе. Выделяют четыре основных функции протаминов (Carrell et al., 2007):

конденсирование хроматина сперматозоида с целью получения максимально компактного и гидродинамически выгодного ядра;

- защита генетического материала от ферментов, мутагенов, свободных радикалов и других повреждающих агентов;

- эпигенетическая модификация хроматина во время спермиогенеза;

- удаление транскрипционных факторов и белков, несущих эпигенетическую информацию родителя.

Заключительным этапом формирования нуклеопротаминового хроматина является образование дисульфидных связей между многочисленными цистеиновыми остатками и дефосфорилирование протаминов (Singh, Rao, 1988; Le Lannic et al, 1993; Szczygiel, Ward, 2002).

Изложенные данные суммированы на рисунке 2, (Oliva, 2006). Как видно из представленной схемы, вопрос о том, какова структурная организация хроматина в ходе ремоделирования, остается открытым. Это хорошо подтверждается данными не только ранних работ, но и современной литературой.

[Транскрипция генов, кодирующих транши торные белки, протамины. а так же прочие белки и РМК задействованные в . процессе епермиогенеза

ВВсграивание гистоновых вариантов: Модификация гистонов (гиперацетил и ровапие, убиквнтнлирован ие. АДФ-р и бо з илоро ван и е и т. д.)

Зрелый сперматозоид

Разборка нуклеосом;

Массовое связывание транзигорных белков с ДНК; Затухание транскрипции; Лигирование разрывов ДНК;

Начало связывания фос фори л и ро ван н ы х и рогам и нов

Транзиторные белки

Протамины

Массовое связывание фосфоршшрованчых протаминов с ДНК; Удаление транзиторных белков

Протамины

Образование дисульфидных связей между молекулами протаминов! Дефосфорилирование протаминов

5% ДНК сперматозоидов -85% ДНК сперматозоидов находится в форме сохраняют куклеосомную компактного нуклеопрртаминовогр комплекса структуру

Рис, 2 Ремоделирование хроматина в процессе епермиогенеза (ОНуа. 2006).

2. Структурная организация ядер зрелых сперматозоидов

человека

Организация хромосомных территорий

Одним из наиболее распространённых методов исследования характера

расположения хромосом в ядре сперматозоида является флуоресцентная гибридизация in situ (FISH). Однако из-за высокой плотности хроматина зрелого сперматозоида зонд не может проникнуть внутрь ядра и гибридизоваться с мишенью без предварительной обработки деконденсирующими агентами. Другим способом решения данной проблемы является изучение менее плотного хроматина поздних сперматид (Haaf, Ward, 1995).

В работе (Zalensky et al., 1994) было установлено, что в зрелых сперматозоидах человека, хроматин которых был подвергнут слабому деконденсирующему воздействию смеси Heparin/DTT для облегчения проникновения ДНК-зонда, центромеры хромосом формируют компактный хромоцентр, расположенный в центральной области ядра. При увеличении интенсивности деконденсирующего воздействия, помимо одного крупного хромоцентра в ядре выявляются несколько более мелких структур. Теломерные области хромосом, преимущественно располагаются на периферии ядра, при этом концевые участки р- и q-плеч одной хромосомы попарно взаимодействуют, образуя теломерные димеры. По-видимому, на

расположение теломерных участков влияет целостность ядерной оболочки. Это подтверждается тем, что при относительно слабой обработке детергентом, существенная часть теломерных последовательностей выявляется на периферии ядра, в области относительно низкой плотности хроматина, а при увеличении интенсивности обработки, периферические теломерные участки не выявляются. Наличие теломерных повторов на периферии ядра в области низкой плотности хроматина подтверждено не только методом FISH, но и при помощи иммунопреципитации на ультраструктурном уровне. Предполагается, что такое расположение теломер и наличие в них участков нуклеогистонового хроматина обеспечивает их раннюю активацию после оплодотворения. Так, эмбриональные s- и у-глобиновые гены, находятся в гистоновой области, а постнатальный ß-глобиновый ген - в протаминовой (Wykes, Krawetz, 2003).

Было высказано предположение, что каждая хромосома в сперматозоиде имеет предпочтительное для неё расположение вдоль длинной оси ядра (Mudrak et al., 2005). Так хромосомы 1, X и 6 в 90% случаев выявляется в апикальной части головки сперматозоида, а хромосомы 2, 5 и 18 в 80-85% случаев тяготеют к базальной части. Расположение хромосом по короткой оси ядра носит случайный характер.

При дальнейшей деконденсации тела хромосом растягиваются,

располагаясь параллельно длинной оси ядра. На протяжении большей части

тела хромосомы, её плечи располагаются близко друг к другу, иногда

20

вытягиваясь параллельно, иногда закручиваясь в подобие спирали. В то же время в прицентромерных областях плечи хромосом расходятся под углом близким к 180. Это подтверждает теорию «шпильковидной» организации хромосом и попарного взаимодействия теломер плеч одной хромосомы (Mudrak et al., 2005).

Сходные данные были получены при исследовании поздних сперматид мыши (Haaf, Ward, 1995). Теломерные участки акроцентрических хромосом располагаются на периферии ядра и в центральной области, около гетерохроматина. Так же, в центре ядра расположены центромерные участки хромосом и гены, кодирующие рРНК. Отдельные хромосомы, выявленные при помощи гибридизации с библиотеками последовательной ДНК, имеют удлинённую палочкообразную форму, напоминающую митотические хромосомы, но характеризуются в шесть раз большей плотностью упаковки. Тела хромосом располагаются либо параллельно гетерохроматиновому участку, либо вокруг него (Haaf, Ward, 1995).

Для анализа структуры хромосом в работе Mudrak et al., 2005 были

использованы деконденсирующие агенты гепарин и дитиотрейтол (DTT),

которые являются аналогами компонентов ооцита, таких как гепаран сульфат

(Romanato et al., 2003) и глютатион (Sutovsky et al., 1997). Гепарин ослабляет

взаимодействие протаминов с ДНК, а дитиотрейтол восстанавливает

дисульфидные связи. При минимальной степени деконденсации,

необходимой для применения FISH, хромосомы в сперматозоиде имеют в

21

четыре раза большую плотность, чем в митозе (Миёгак еХ а1., 2005). Толщина хромосом достигает 2 мкм. При дальнейшем увеличении степени декомпактизации плечи хромосом, толщина которых составляет 1 мкм, разъединяются, при этом оставаясь скрученными в спирали. Каждое плечо состоит из двух нитей, сформированных блоками диаметром 500 нм, соединённых более тонкими фибриллами. Прицентромерные и прителомерные участки гетерохроматина в меньшей степени подвергаются декомпактизации, чем остальное тело хромосомы. Из них наиболее стабилен прицентромерный гетерохроматин, что может быть связано с особенностями первичной структуры ДНК или с белковым составом этой области хроматина, в частности с наличием НР1 (Миёгак е1 а1., 2005). Это свойство прицентромерного района не является уникальным для хроматина сперматозоидов. Устойчивость к деконденсации прицентромерного гетерохроматина была показана ранее в соматических клетках на ультраструктурном уровне (Вигакоу е1 а1., 1976; 1980; Рго1оуа е! а1., 1989). При деконденсации, расстояние между теломерной и центромерной областью увеличивается пропорционально увеличению длинной оси ядра, что может указывать на привязку определённых участков хромосомы к другим структурам, таким как ядерная мембрана или ядерный матрикс (Мис1гак ег а1., 2005).

Уровни компактизации нуклеопротаминового хроматина

В составе митотических хромосом соматических клеток млекопитающих

и человека описано несколько уровней организации хроматина. Для их визуализации разработаны многочисленные приемы искусственной декомпактизации (Zatsepina et al., 1983). По одной из наиболее общепринятых гипотез митотические хромосомы состоят из нитей диаметром 100 нм, составленных из хромомеров. При декомпактизации посредством поэтапного удаления ионов Mg++ и Са++ хромомеры преобразуются в «розеточные» структуры с плотной сердцевиной и радиально расходящимися ДНП-фибриллами толщиной 25 нм, которые, в свою очередь, могут быть деконденсированы до нуклеосомной фибриллы толщиной 10 нм. (Zatsepina et al., 1983).

Сходный, но более радикальный подход искусственно декомпактизации применяется при анализе хроматина сперматозоидов. В литературе описано несколько способов искусственной декомпактизации структуры хроматина сперматозоидов под действием различных химических агентов. Так ещё в 1979 году методом электронной микроскопии было показано, что деконденсированный протаминовый хроматин состоит из фибриллярных структур, которые в свою очередь сформированы сферическими элементами диаметром 40 и 15 нм (Wagner, Yun 1979). По результатам других исследований были получены данные о структуре, состоящей из сферических элементов диаметром -12,6 нм, связанных более тонкими фибриллами,

являющейся результатом жесткой обработки хроматина, включающей восстановление атомов серы и, как следствие, разрыв дисульфидных связей между цистеиновыми остатками протаминов, алкилирование йодацетамидом и использование саркозила (Gusse, Chevallier, 1980).

Следующим шагом на пути исследования ультраструктуры стало более аккуратное поэтапное разворачивание хроматина сперматозоидов. Было показано, что под действием саркозила нуклеопротаминовый хроматин разворачивается до двух типов узловатых (knobby) фибрилл переменной толщины, различающихся по диаметру: 90-120 нм и 38-52 нм. При последующей обработке DTT тонкие фибриллы претерпевают дальнейшую деконденсацию до клубков фибрилл толщиной 18-21 нм. В свою очередь, клубки разворачиваются в структуру, состоящую из гранул диаметром 12-15 нм, связанных более тонкими фибриллами (Sobhon et al., 1982а).

Параллельно был использован принципиально другой способ деконденсации, основанный на поэтапной обработке сперматозоидов микрококковой нуклеазой и 2М NaCl. В этом случае, авторами была отмечена полная экстракция гистонов, а так же небольшого количества протаминов и около 10% ДНК. Следствием такой обработки стало появление двух типов узловатых зигзагообразных фибриллярных структур диаметром 33-42 нм и 65-120 нм, соединённых между собой 6-8 нм фибриллами. Авторами было выделено два типа сперматозоидов: в головках одних преобладали толстые фибриллы, а в других - тонкие. Количество

24

сперматозоидов обоих типов было примерно одинаковым. Далее в работе обработку сперматозоидов проводили двумя способами: мочевиной/меркаптоэтанолом и днказой 1. В первом случае наблюдалась дальнейшая деконденсация как толстых, так и тонких фибрилл. Во втором случай было отмечено только исчезновение 6-8 нм фибрилл (Sobhon et al., 19826). Совмещение ранее использовавшихся методов с атомно-силовой микроскопией позволило выявить в сперматозоидах быка структуры, имеющие вид тороидов с внешним диаметром 90 нм и внутренним - 15 нм (Hudetal., 1993).

При обработке сперматозоидов человека SDS, 2м NaCl/DTT, на световом уровне удаётся визуализировать ДНК-содержащее гало, предположительно, сформированное петлевыми доменами длиной около 27kb, прикреплённых к ядерному матриксу (Barone, Lara, 1994). Размер петлевых доменов примерно в два раза меньше, чем у соматических клеток и по данным некоторых исследований коррелирует в различных видах со средним размером репликонов (Boungiorno-Nardelli et al., 1982). Следует отметить, что размер репликонов в клетках эмбриона также меньше, чем в соматических. Показано так же, что при полной деконденсации (с разрушением ядерного матрикса) ДНК сперматозоида остаётся соединённой с основанием хвоста (Barone, Lara, 1994).

В дополнение к деконденсирующей обработке Haaf и Ward (1995)

применили метод растягивания на стекле хроматина лизированных,

префиксированных 50% этанолом сперматозоидов. В результате было получено два типа растянутых хроматиновых фибрилл: гладкие и узловатые. Первые, по видимому, являются участками хроматина с максимальной степенью растяжения, в то время как вторые представляют собой цепи узелков диаметром около 179 нм, расположенных вплотную друг к другу или соединённых участками гладких фибрилл. Дополнительные измерения, осуществлённые при помощи гибридизации растянутого хроматина, позволили измерить плотность упаковки узелков, которые оказались, как минимум, в три раза плотнее гладких фибрилл. Так как предел разрешающей способности оптического микроскопа составляет около 300 нм, реальный размер узелков может быть значительно меньше. По мнению авторов такой узелок может быть базовым уровнем упаковки протаминового хроматина, содержать от нескольких сотен до миллиона пар оснований и соответствовать 50-100 нм, бусинам, визуализированным при помощи электронного (Evenson et al., 1978; Sobhon et al., 1981) и атомно-силового микроскопа (Allen et al., 1993) при использовании различных методик химической и энзиматической деконденсации. Помимо уже перечисленных структур в составе растянутого нуклеопротаминового хроматина встречаются элементы упаковки более высокого порядка - утолщения двух типов с диаметром около 361 нм и 600 нм (Haaf, Ward, 1995).

В настоящее время наиболее распространённой моделью организации

хроматина сперматозоидов является тороидная модель (Рис. 3). Эта модель,

26

предложенная Ward (1993), предполагает наличие двух видов базовых элементов упаковки ДНК: тороиды, содержащие около 50 кб и петлевые домены длиной в 20-50 кб, что, примерно, в два раза меньше петлевых доменов, обнаруженных в ядрах соматических клеток. Толщина тороидов составляет около 20 нм, а внешний и внутренний диаметр, 90 и 15 нм соответственно. Петлевые домены, предположительно имеющие нуклеосомное строение, характеризуются гиперчувствительностью к нуклеазе, соединяют между собой тороиды и прикрепляются к MAR (matrix attaching regions) посредством белка ТОР2В. Такая упаковка хроматина не предполагает наличия суперспирализации ДНК, что хорошо соотносится с экспериментальными данными (Risley et al., 1986; Ward et al., 1989). По мнению авторов, суперспирализация должна быть присуща активно функционирующему хроматину соматических клеток, в то время как тороидная модель упаковки предполагает максимальную степень конденсации и защиты хроматина сперматозоидов (Ward, 1993).

Несмотря на распространённость тороидной модели, к ней имеется ряд серьёзных вопросов. Во-первых, до настоящего времени в литературе не имеется убедительных экспериментальных подтверждений существования тороидов, как основного элемента упаковки нуклеопротаминового хроматина. Во-вторых, так как одной из основных функций нуклеопротаминового хроматина считается защита генетического материала от повреждающих воздействий, неясны мотивы существования линкерных

27

петлевых доменов, гиперчувствительных к действию нуклеазы. В-третьих, данная модель, объясняя первичный уровень упаковки ДНК, не затрагивает более высокие уровни упаковки, которых, впрочем, может и не

существовать.

Протамины

ДНК

ДНК-протаминовый тороид ^

Ядерный матрикс

Линкерные участки, чувствиетльные к действию ДНКазы

Рис. 3 Тороидная модель строения нуклеопротаминового хроматина (Shaman et al., 2007).

3. Патологии ремоделирования хроматина зрелых

сперматозоидов.

Одна из важнейших проблем, с которой сталкивается современная

медицина, занимающаяся вопросами репродукции человека, это «скрытые» дефекты сперматозоидов, не выявляемые на световом уровне анализа. Современные методы искусственного оплодотворения (ЭКО и ИКСИ) позволяют более или менее успешно преодолевать такие причины бесплодия, как отсутствие или снижение подвижности сперматозоидов из-за дефектов жгутика, дефекты формирования акросомы, высокий процент клеток с аномальной морфологией в эякуляте. Также зачастую удаётся лечить бесплодие у пациентов с вирусным инфицированием сперматозоидов. Иначе обстоит дело, если дефект сперматозоида нельзя увидеть в световой микроскоп без специальной обработки, включающей этап фиксации материала, а, следовательно, и отобрать заведомо здоровый сперматозоид для искусственного оплодотворения (Benchaib et al., 2003).

Ярким примером подобных дефектов являются разрывы ДНК в зрелых

сперматозоидах, выявляемые на световом уровне методом TUNEL (Terminal

deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling). По не строгому правилу,

основанному на статистическом анализе результатов оплодотворения,

нормой считается, когда в эякуляте содержится менее 4% сперматозоидов с

чётко, выявляемыми разрывами ДНК (Host et al., 2000). Тем же способом

была установлена пороговая для удачной беременности доля TUNEL-позитивных клеток, равная 36.5% (Henkel et al., 2003). Окрашиваемые по методу TUNEL сперматозоиды могут различаться, как интенсивностью окрашивания, так и по внешнему виду. Более того, сперматозоид с разрывами ДНК не обязательно будет иметь аномальную морфологию и наоборот (Benchaib et al., 2003). Однако отмечена обратная зависимость доли сперматозиодов с повреждённой ДНК и доли внешне нормальных клеток в эякуляте (Zini et al., 2001). Процент TUNEL-положительных клеток, по-видимому, не связан с концентрацией сперматозоидов в эякуляте и их общим уровнем подвижности (Piasecka et al., 2006).

Было высказано предположение, что разрывы ДНК в сперматозоидов

могут быть следствием протекания процесса апоптотической гибели

(Gorczyca et al., 1993), однако фактов, однозначно доказывающих это

предположение не получено (Muratoiet al., 2000). С другой стороны,

некоторые исследователи отмечают корреляцию между высокой долей

TUNEL-позитивных сперматозоидов и нахождением в эякуляте

сперматозоидов с так называемым «незрелым хроматином» (Piasecka et al.,

2006), сходным по структуре с хроматином поздних сперматид. Как было

отмечено выше, в процессе созревания сперматид топоизомеразы вносят

одно- и двунитевые разрывы в структуру ДНК, которые позже репарируются

(Carrell et al., 2007). Таким образом, нарушенная целостность хроматина

сперматозоидов может быть следствием не полного лигирования разрывов

зо

ДНК. В пользу этого предположения свидетельствует наблюдение о прямой корреляции между количеством сперматозоидов с разрывами ДНК и количеством сперматозоидов с хроматином, обеднённом протаминами (Manicardi et al., 1998), а так же наблюдение о повышенной чувствительности повреждённой ДНК сперматозоидов к денатурации (Aravindan et al., 1997).

4. «Обратное» ремоделирование хроматина сперматозоидов

Реактивация сперматозоидов после оплодотворения

После оплодотворения переход хроматина сперматозоида в

функциональное состояние осуществляется при участии цитоплазмы ооцита (McLay, Clarke, 2003). В процессе «обратного» ремоделирования выделяют три фазы (Wright, Longo, 1988; Adenot et al., 1991).

Первая фаза протекает одновременно с анафазой второго мейотического деления ооцита. На этой стадии хроматин сперматозоида деконденсируется настолько, что его объём увеличивается, примерно в три раза. По данным авторадиографии и иммуноголдинга в этот момент происходит восстановление дисульфидных связей и депротаминизация хроматина (Ecklund, Levine, 1975; Kopecny, Pavlok, 1975; Rodman et al., 1981).

Когда ооцит завершает телофазу второго мейотического деления,

наступает вторая фаза ремоделирования, в которой хроматин сперматозоида

временно реконденсируется в плотный сгусток. Его объём при этом

сокращается приблизительно в два раза. В литературе имеются косвенные

31

данные, указывающие на то, что реконденсация происходит в результате сборки нуклеосом (McLay, Clarke, 1997). Тем не менее, нет точных сведений о том, когда гистоны встраиваются в хроматин сперматозоида, известно лишь, что это происходит перед первым раундом репликации (Nonchev, Tsanev, 1990; Adenot et al., 1997)

Наконец, в третьей фазе одновременно индуцируется быстрая деконденсация хроматина мужского и женского пронуклеусов. При этом наблюдается десятикратное увеличение объёма мужского пронуклеуса. Если встраивание гистонов относят ко второй фазе реактивации хроматина, то увеличение объёма пронуклеуса на третьей стадии связывают с поступлением из цитоплазмы яйцеклетки всех прочих белков, характерных для ядра соматической клетки (Schatten et al., 1988).

Известно, как минимум, три существенных различия между хроматином мужского и женского пронуклеуса. Во-первых, гистон Н4 мужского пронуклеуса находится в гиперацетилированном состоянии до начала S-фазы, что, вероятно, является следствием сборки нуклеосом на депротаминизированном хроматине (Verreault, 2000). Во-вторых, уровень транскрипции как собственных, так и искусственно инъецированных, генов в мужском пронуклеусе выше, чем в женском (Aoki et al., 1997; Rastelli et al., 2001). И, наконец, в-третьих, спустя несколько часов после оплодотворения, до репликации ДНК, происходит деметилирование отцовской, но не

материнской ДНК, сохраняющееся на протяжении нескольких клеточных циклов (Santos et al., 2002).

Несмотря на обширные данные о молекулярных механизмах реактивации ядра сперматозоида при оплодотворении, практически отсутствуют данные об ультраструктурных аспектах этого процесса.

Реактивация сперматозоидов в экстрактах ооцитов Xenopus laevis и в

культивируемых клетках.

Хотя основным индуктором реактивации хроматина сперматозоида

после оплодотворения является цитоплазма ооцита, данные ряда исследований свидетельствуют о том, что образование функционального мужского пронуклеуса может происходить в системе in vitro, в том числе, в экстракте яйцеклеток Xenopus laevis.

Ключевыми особенностями данного метода является предварительная пермеабилизация сперматозоидов лизолецитином, восстановление дисульфидных групп при помощи дитиотрейтола (DTT) и последующее помещение клеток в экстракт (Neuber et al., 1999). При такой обработке наблюдается не только деконденсация хроматина сперматозоида, но и полная репликация его генома. В аналогичных условиях реактивации репликация в сперматозоидах Xenopus laevis проходит за 4 часа, в то время как репликация в сперматозоидах человека - за 9 часов (Yong-Sheng Xu et al., 1998). Известно, так же, что репликация в сперматозоидах не начинается, пока не

будет полностью сформирована мембрана пронуклеуса (Сох, 1992). Было так же установлено несколько ключевых моментов протамин-гистонового обмена, а именно: необходимость фосфорилирования протаминов для их удаления (Poccia, 1986) с последующей протеолитической деградацией, а так же участие нуклеоплазмина в регулировании процесса замены структурных белков хроматина сперматозоидов (Philpottet al., 1991).

Принципиально другая модельная система, позволяющая изучать реактивацию генома сперматозоидов, основана на получении гетерокарионов сперматозоидов с соматическими клетками. Для осуществления слияния преимущественно использовали инактивированный вирус Sendai (Meel, Pearson, 1979) или полиэтиленгликоль (ПЭГ) (Elsevier, Ruddle, 1976). Большая часть сперматозоидов, попавших в клетки, деградирует, однако около 20% демонстрирует первичные признаки реактивации: увеличение размеров ядер, деконденсацию хроматина и замещение протаминов на гистоны (Meel, Pearson, 1979). При слиянии клеток сперматозоид лишается плазматической мембраны, в результате чего его органеллы напрямую контактирует с цитозолем клетки-реципиента, как и в случае нормального оплодотворения (Longo, Schuel, 1973). Более того, по мнению авторов, при слиянии может происходить так же удаление ядерной оболочки сперматозоида (Meel, Pearson, 1979). В 2% проникших сперматозоидов, помимо описанных выше изменений, выявляется синтез ДНК и РНК (Meel, Pearson, 1979).

Подробных данных об ультраструктуре гетерокариотических систем, состоящих из сперматозоидов человека и соматической клетки нет.

5. Заключение

1. В литературе имеется достаточно много данных о молекулярной организации хроматина в дифференцирующихся сперматозоидах человека. Конечным результатом дифференцировки сперматид в семенных канальцах является замещение 85-98% гистонов на протамины. Нуклеосомы остаются в промоторах некоторых генов, экспрессирующихся на ранних этапах развития. В эпидидимусе завершатся формирование дисульфидных связей между протаминами, в результате чего хроматин сперматозоида преобразуется в компактный блок.

2. Методом гибридизации ДНК изучена топология хромосом в ядрах зрелых сперматозоидов. Показано, что в сперматозоидах человека центромерные участки хромосом располагаются в центре ядра, формируя крупный гетерохроматиновый агломерат. Теломерные участки располагаются на периферии ядра и взаимодействуют попарно, так что хромосомы имеют вид шпилек.

3. В наиболее распространенной модели организации нуклеопротаминового хроматина млекопитающих «элементарной»

структурной единицей являются тороиды, однако эта модель не имеет однозначных экспериментальных подтверждений.

4. Динамика структурных преобразований хроматина в ходе спермиогенеза человека, практически, не изучена.

5. Показано, что нарушения структурной организации хроматина в процессе ремоделирования, не зависимо от причин, их вызывающих, приводят к мужской инфертильности.

Суммируя изложенные выше данные, можно придти к выводу, что, несмотря на большое теоретическое и практическое значение, проблема структурной организации нуклеопротаминового хроматина в сперматозоидах человека до настоящего времени остается не решенной.

В связи с этим, в работе были поставлены следующие задачи:

1. Детально изучить структурную организацию ремоделлирующегося хроматина на всех этапах спермиогенеза;

2. Изучить нуклеопротаминовые комплексы, полученные в результате искусственой деконденсации хроматина зрелых сперматозоидов;

3. Исследовать динамику декомпактизации нуклеопротаминового хроматина на модели гетерокарионов сперматозоид/соматическая клетка.

Материалы и методы

Используемые сокращения

DMEM (ДМЕМ) - Dulbecco's Modified Eagle's Medium; BSA (БСА) -Bovine serum albumin; PEG (ПЭГ) 1500 - polyethylene glycol с молекулярной массой 1500 Да; DTT (ДТТ) - Dithiothreitol; FA (ФА) - formaldehyde; GA (ГА) - glutaraldehyde; PBS - Phosphate buffered saline; PBST - PBS с добавлением 0,05% Tween; SSC - saline-sodium citrate; Tris (ТРИС) -tris(hydroxymethyl)aminomethane; BrdU (БрдУ) - 5-bromo-2'-deoxyuridine; EdU

5-ethynyl-2'-deoxyuridine; FU - 5-Fluorouridine; DABCO -Diazobicyclooctane; DAPI - 4';6-Diamidino-2-phenylindole.

Образцы эякулята человека

Суспензии сперматозоидов здоровых доноров предоставлены для исследования клиникой ЭКО АльтраВита, г. Москва. После забора образцы спермы подвергали очистке от неклеточных компонентов, соматических клеток и неподвижных сперматозоидов с использованием препарата PureCeption Sperm Separation Media (SAGE Media, США) по методике, рекомендованной производителем. Для экспериментов использовали криоконсервированные образцы эякулята, замороженные с использованием криопротектора SpermFreez (FertiPro N. V., Бельгия).

Биопсии семенников человека

Материал биопсий предоставлен для электронно-микроскопического исследования ФГУ «Эндокринологический научный центр», г. Москва. Для экспериментов использовали тестикулярные биопсии пациентов с азооспермией (отсутствие сперматозоидов в эякуляте).

Культура клеток

Клетки линии VERO (эпителий почки африканской зелёной мартышки) культивировали в культуральных флаконах емкостью 50 мл на среде DMEM (ПанЭко, Россия) с добавлением 1% по объему смеси антибиотиков и антимикотиков (Sigma) и 10% эмбриональной телячьей сыворотки (HyClone, США), в атмосфере с 5%-ным содержанием С02 при температуре 37°С. Для проведения экспериментов клетки высаживали на квадратные 12x12 или круглые диаметром 24 мм покровные стёкла, а так же пластиковые чашки с адгезивным покрытием (Costar Corning, США) диаметром 3,5 см и культивировали до достижения необходимой плотности.

Получение клеточных гетерокарионов

Для обеспечения проникновения сперматозоидов внутрь соматических

клеток была модифицирована процедура, описанная в работе Elsevier,

Ruddle, 1976. Предварительно, с помощью камеры Горяева, проводили

оценку концентрации сперматозоидов в суспензии и процент подвижных

38

клеток. В эксперименте использовали суспензию с концентрацией сперматозоидов 2-20 млн/мл. Далее суспензию наслаивали на выращенные на покровных стёклах клетки и осаждали сперматозоиды центрифугированием 10 минут при 1000g. Для удаления не осаждённых сперматозоидов клетки промывали в двух сменах PBS.

Слияние индуцировали, инкубируя клетки 1 минуту в 50%-ном р-ре PEG на PBS. Отмывали PEG тремя сменами PBS и инкубировали клетки в среде культивирования при 37 °С от 3 до 6 часов. Для удаления большей части не проникших сперматозоидов клетки отделяли от субстрата раствором Версена (ПанЭко, Россия) и центрифугировали суспензию при 200g в течение 1 минуты. Осадок ресуспендировали в минимальном объёме среды культивирования. Далее суспензию разбавляли средой культивирования в 4 -100 раз и высаживали клетки в чашки Петри со стеклами для дальнейшего культивирования.

Фиксация препаратов для свето-микроскопического анализа

Для выявления функционирующих митохондрий клетки до фиксации инкубировали 30 минут в среде культивирования содержащей 0,01М MitoTracker Red (Molecular Probes, США).

Клетки фиксировали при помощи 3,7%-ного р-ра FA (Sigma) на PBS 15 минут при 37 °С, затем отмывали двумя сменами PB S по 5 минут. Пермеабилизировали клетки в 0,5%-ном р-ре Triton Х-100 на PBS 10 мин при

39

комнатной температуре и отмывали тремя сменами PB S по 5 минут. Ядра клеток окрашивали р-ром DAPI (Sigma) на PBS в концентрации 0,1 мкг/мл в течение 10 минут и отмывали двумя сменами PBS по 5 минут. Препараты заключали в MOVIOL (Calbiochem) с добавлением DABCO (Sigma) в концентрации 50 мг/мл.

Функциональный анализ хроматина сперматозоидов в гетерокариоических системах

Репликацию ДНК в клетках выявляли при помощи набора Click-iT EdU Alexa Fluor 555 (Invitrogen, США). Для одновременного мечения новосинтезированной ДНК и РНК клетки инкубировали в среде культивирования, содержащей 20 мкМ EdU и 100 мкМ FU, в течение 10 мин при 37°С. Затем препараты пермеабилизировали 0,005% Triton Х-100 на PBS в течение 5 мин при комнатной температуре и сразу фиксировали в 3,7% F А на PBS 10 мин, так же при комнатной температуре. После отмывки от фиксатора клетки инкубировали 30 минут в PB S с 1% BSA.

Реакцию выявление меченой ДНК проводили согласно протоколу производителя набора. Для последующего выявления меченой РНК клетки помещали в раствор антител против BrdU (Sigma, клон BU-33, разведение 1:100) на PBST с добавлением 0,1% BSA. Клетки инкубировали в растворе антител 60 минут при комнатной температуре, а затем отмывали в трёх сменах PBST с 0,1% BSA по 5 минут каждая. Далее препарат инкубировали

F!. 2 ___1

60 минут при комнатной температуре в растворе поликлональных антител против иммуноглобулинов мыши (Sigma, разведение 1:200 на PBST с 0,1% BSA), конъюгированных с флуорохромом Alexa 488. После повторения процедуры отмывки от антител, препараты дополнительно контрастировали DAPI в течение 10 минут и заключали в МО VIOL.

При выявлении ламинов использовали стандарную фиксацию для световой микроскопии. Далее клетки инкубировали 60 мин при комнатной температуре в растворе антител против ламинов А, С (клон Jol 2, Hutchison, разведение 1:20 на PBST с 0,1% BSA). Дальнейшая процедура окраски вторыми антителами и последующей обработки препарата аналогична описанной выше.

Детектирование разрывов ДНК в хроматине сперматозоидов

Для выявления разрывов ДНК в хроматине сперматозоидов использовали набор DeadEnd Fluorimetric TUNEL system (Promega). Согласно протоколу производителя клетки фиксировали 3,7% F А на PBS 20 минут при +4 "С, отмывали от фиксатора двумя сменами PBS по 5 минут и пермеабилизировали в 0,2% Triton Х-100 на PBS 5 минут. Далее клетки тщательно отмывали в трёх сменах PB S по 5 минут и проводили реакцию мечения разрывов ДНК в течение часа при 37°С. Для ингибирования реакции мечения клетки инкубировали в 2xSSC 20 минут. После трёхкратной

отмывки в PBS по 5 минут препараты окрашивали DAPI и заключали в MOVIOL по стандартной методике.

Искусственная деконденсация хроматина сперматозоидов

Суспензию сперматозоидов наносили на стёкла, покрытые полилизином и осаждали центрифугированиемм 10 минут при 1000g. После осаждения пермеабилизировали мембраны клеток 0,5% раствором Triton Х-100 на 50 мМ ТРИС-НС1 (pH 7,6) 5 минут. Далее препараты промывали 50 мМ ТРИС-НС1 и либо фиксировали, либо обрабатывали деконденсирующим раствором, содержащим 0,05 мг/мл гепарина и 5 мМ DTT в течение 10-25 минут. Отмывку от деконденсирующего раствора и фиксацию проводили на 50 мМ ТРИС. Для световой микроскопии препараты фиксировали 3,7%) FA 15 минут, а для электронной - 2,5% GA в течение 2 часов.

Препараты для свето-микроскопического исследования окрашивали DAPI и заключали в MOVIOL, а для электронно-микроскопического -обрабатывали по стандартной методике заключения в эпоксидную смолу и приготовления ультратонких срезов.

Изучение препаратов и регистрация результатов

Полученные препараты изучали и фотографировали на оптическом микроскопе Carl Zeiss Axiovert 200М, оборудованном объективом Plan-Neofluar ЮОх с числовой апертурой 1,3 и цифровой камерой Hamamatsu

Orca-II ERG-2 (размер пиксела 6,45x6,45 мкм), управляемом программным комплексом AxioVision v4.3.

Полученные изображения обрабатывали в программах ImageJ vl.44p и Adobe Photoshop v7.0 LE (Adobe Inc, США). Трехмерную деконволюцию серий оптических срезов осуществляли по алгоритму Constrained Iterative Filter с помощью соответствующего модуля из комплекта поставки демонстрационной версии программы AxioVision v3.1 (Carl Zeiss, Германия).

Электронно-микроскопические исследования

Для электронно-микроскопического исследования клетки фиксировали 2,5% р-ром GA на буфере Зеренсена или какодилатном буфере (в случае биопсий) в течение минимум 60 минут (минимум сутки для бипсий). Далее клетки заключали в эпон согласно процедуре, включающей, обезвоживание в серии спиртов повышающейся концентрации, обезвоживание ацетоном, пропитку в трех сменах смеси эпон-ацетон с повышающейся долей эпона и полимеризацию при 60°С в течение минимум 48 часов.

Ультратонкие срезы толщиной 60-100 нм получали на ультрамикротоме Reichert Jung Ultracut Е с использованием стеклянных ножей. Материал на срезах контрастировали водным 1% р-ром ацетата урана 30 минут и реактивом Рейнольдса 10 минут.

Изучение и обработка электронно-микроскопических данных

Изучали и фотографировали полученные препараты на электронных микроскопах Hitachi HU-11B, HU-12B и 700Н (Япония). Для дальнейшей обработки негативы сканировали в монохромном режиме с разрешением 1200 точек на дюйм (472 точки на сантиметр) и глубиной представления цвета 16 бит. Сканирование осуществляли с помощью слайд-сканнера (Epson Perfection 4990 PHOTO). Сканированные изображения обрабатывали и монтировали в программе Adobe Photoshop v7.0.

Точное увеличение микроскопов определяли с помощью препарата частиц латекса диаметром 262 нм.

Результаты

1. Структурная организация хроматина в дифференцирующихся сперматидах

1.1. Исследование эякулята инфертильных пациентов

Для исследования структуры ремоделирующегося

нуклеопротаминового хроматина были отобраны доноры, в эякуляте которых присутствовали сперматиды, выявленные в предварительных экспериментах методом электронно-микроскопического анализа. Помимо морфологически нормальных сперматид в образцах, полученных от этих доноров, присутствовало незначительное количество клеток с признаками некротических изменений: с выраженной деградацией ядер, частичным лизисом плазматических мембран и набуханием митохондрий (Рис. 4). Для изучения структуры хроматина использовали только те клетки, которые не имели ярко выраженных признаков некротической деградации. По характерной структуре ядерного компартмента в отобранных образцах было идентифицировано 3 основных типа сперматид (Рис. 5).

Рис. 4 Сперматиды на различных стадиях некротической гибели в эякуляте инфертильных пациентов.

Хроматин сперматид первого типа, состоит из фибрилл толщиной от 12 до 24 нм, гомогенно распределенных в кариоплазме (Рис. 5а).

Для хроматина сперматид второго типа наиболее характерными структурными элементами являются фибриллы толщиной от 4 до 31 нм и глобулы диаметром от 53 до 87 нм (Рис. 56). Количественное соотношение фибрилл и глобул в клетках этого типа значительно варьирует. В некоторых сперматидах преобладают тонкие фибриллы, но в большинстве клеток глобулы заполняют практически весь объем ядер. Во всех типах клеток глобулы имеют одинаковое строение, они представляют собой скопления электронно-плотного материала, который является центром ассоциации фибрилл толщиной около 8 нм. В некоторых случаях между индивидуальными глобулами удается наблюдать тонкие линкерные фибриллы. Визуально и по данным денситометрического анализа плотность 8 нм фибрилл вблизи глобул выше по сравнению с их плотностью в кариоплазме.

В ядрах сперматид третьего типа хроматин имеет преимущественно фибриллярную организацию, с толщиной фибрилл от 33 до 53 нм (Рис. 5г, 6). Периферический материал фибрилл, на поперечных сечениях, визуально имеет большую плотность, чем центральная область, что указывает на возможную спиральную организацию.

90 -

д

80 -

70 -

60 "

5

Заключение диссертации по теме «Клеточная биология, цитология, гистология», Арифулин, Евгений Альбертович

Выводы

1. Полученные данные позволяют описать ремоделлирование хроматина в ядрах формирующихся сперматозоидов человека как процесс последовательного замещения «элементарных» нуклеосомных ДНП-фибрилл на фибриллярные нуклеопротаминовые структуры более высокого порядка организации.

2. Электронномикроскопический анализ сперматид на поздних стадиях дифференцировки и эксперименты по декомпактизации ядер зрелых сперматозоидов в гибридных клетках показали, что «элементарной» структурной единицей нуклеопротаминого хроматина являются фибриллы толщиной около 8 нм.

3. Формирование глобулярных структур на этапе замещения гистонов промежуточными белками и протаминами свидетельствует в пользу существования в хроматине ранних и средних сперматид субкомпартментов «высшего» порядка, предположительно, соответствующих ранее описаным розеточным структурам.

4. Конечным этапом ремоделлирования хроматина является формирование фибриллярных макрокомплексов толщиной 40-60 нм -нуклеопротаминовых хромонем с элементами спиральной организации;

5. Искусственная декомпактизациях зрелых сперматозоидов в буфере с низкой ионной силой, лишённом двухвалентных катионов, позволяет реконструировать» уровень нуклеопротаминовых хромонем, но не дискретных глобулярных структур средних сперматид.

6. Удаление из нуклеопротаминового хроматина части белков и восстановление дисульфидных связей приводит к выявлению элементов спиральной упаковки «элементарных» нуклеопротаминовых фибрилл в фибриллярных макрокомплексах (нуклеопртаминовых хромонемах). Этот факт косвенно свидетельствует о возможной кардинальной «переупаковке» хроматина на последних стадиях ремоделлирования;

7. На основании полученных данных предложена динамическая модель организации нуклеопротаминовго хроматина в сперматозоидах человека.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Арифулин, Евгений Альбертович, 2012 год

Список цитируемой литературы

1. Голиченков В А, Иванов ЕА, Никерясова ЕН. Эмбриология. - М.: Академия, 2-е изд.,

испр., (2006). - 224 с. [8] с. цв. ил. : ил.

2. Белоусов JI.B. Основы общей эмбриологии. - М.: МГУ, (2005) - 368 с.

3. Брагина Е.Е., Замятнина В.А., Бочарова Е.Н., Шилейко Л.В., Курило Л.Ф., Гусак

Ю.К., Поляков В.Ю. Количественное ультраструктурное исследование хроматина сперматозоидов при нарушении фертильности. Андрол.и генит.хирургия, 2009.

4. Goldman L, Ausiello DA. Cecil medicine.

5. С. Morales. Lecture 7. Spermatogenesis. McGill Faculty of Medicine e-curriculum.

6. Adenot PG, Szollosi MS, Geze M, Renard JP, Debey P. Dynamics of paternal chromatin

changes in live one-cell mouse embryo after natural fertilization. Mol Reprod Dev. 1991 Jan;28(l):23-34.

7. Adenot PG, Mercier Y, Renard JP, Thompson EM. Differential H4 acetylation of paternal

and maternal chromatin precedes DNA replication and differential transcriptional activity in pronuclei of 1-cell mouse embryos. Development. 1997 Nov; 124(22):4615-25.

8. Akama K, Sato H, Hasegawa S, Shimada I, Nakano M. Transition protein 1 from boar late

spermatid nuclei having DNA-melting activity is a dimeric protein. Biochem Mol Biol Int. 1998 Feb;44(2):315-23.

9. Akama K, Kondo M, Sato H, Nakano M. Transition protein 4 from boar late spermatid

nuclei is a topological factor that stimulates DNA-relaxing activity of topoisomerase I. FEBS Lett. 1999 Jan 15;442(2-3):189-92.

10. Allen MJ, Lee C, Lee JD 4th, Pogany GC, Balooch M, Siekhaus WJ, Balhorn R. Atomic

force microscopy of mammalian sperm chromatin. Chromosoma. 1993 Nov;102(9):623-30.

11. Aoki F, Worrad DM, Schultz RM. Regulation of transcriptional activity during the first and

second cell cycles in the preimplantation mouse embryo. Dev Biol. 1997 Jan 15;181(2):296-307.

12. Aoki VW, Carrell DT. Human protamines and the developing spermatid: their structure,

function, expression and relationship with male infertility. Asian J Androl. 2003 Dec;5(4):315-24. Review.

13. Aoki VW, Christensen GL, Atkins JF, Carrell DT. Identification of novel polymorphisms in

the nuclear protein genes and their relationship with human sperm protamine deficiency and severe male infertility. Fértil Steril. 2006 Nov;86(5):1416-22. Epub 2006 Sep 20.

14. Aravindan GR, Bjordahl J, Jost LK, Evenson DP. Susceptibility of human sperm to in situ

DNA denaturation is strongly correlated with DNA strand breaks identified by single-cell electrophoresis. Exp Cell Res. 1997 Oct 10;236(1):231-7.

15. Balhorn R, Reed S, Tanphaichitr N. Aberrant protamine 1/protamine 2 ratios in sperm of

infertile human males. Experientia. 1988 Jan 15;44(l):52-5.

16. Balhorn R, Corzett M, Mazrimas JA. Formation of intraprotamine disulfides in vitro. Arch

Biochem Biophys. 1992 Aug 1;296(2):384-93.

17. Balhorn R, Brewer L, Corzett M. DNA condensation by protamine and arginine-rich

peptides: analysis of toroid stability using single DNA molecules. Mol Reprod Dev. 2000 Jun;56(2 Suppl):230-4. Barone JG, De Lara J, Cummings KB, Ward WS. DNA organization in human spermatozoa. J Androl. 1994 Mar-Apr; 15(2): 139-44.

18. Baskaran R, Rao MR. Interaction of spermatid-specific protein TP2 with nucleic acids, in

vitro. A comparative study with TP1. J Biol Chem. 1990 Dec 5;265(34):21039-47.

19. Belmont AS, Braunfeld MB, Sedat JW, Agard DA. Large-scale chromatin structural

domains within mitotic and interphase chromosomes in vivo and in vitro. Chromosoma. 1989 Aug;98(2): 129-43.

20. Bench GS, Friz AM, Corzett MH, Morse DH, Balhorn R. DNA and total protamine masses

in individual sperm from fertile mammalian subjects. Cytometry. 1996 Apr 1;23(4):263-71.

21. Benchaib M, Braun Y, Lornage J, Hadj S, Salle B, Lejeune H, Guerin JF. Sperm DNA

fragmentation decreases the pregnancy rate in an assisted reproductive technique. Hum Reprod. 2003 May;18(5):1023-8. Buongiorno-Nardelli M, Micheli G, Carri MT, Marilley M. A relationship between replicon size and supercoiled loop domains in the eukaryotic genome. Nature. 1982 Jul l;298(5869):100-2.

22. Burakov VV, Onishchenko GE, Chentsov IuS. [Ultrastructure of the centrometric regions of

mouse chromosomes in metaphase chromosomes and interphase nuclei], Tsitologiia. 1976 Dec; 18(12): 1428-32. Russian.

23. Burakov VV, Onishchenko GE, Chentsov IuS. [Structural characteristics of the centromeric

heterochromatin of mice]. Tsitologiia. 1980 May;22(5):514-20. Russian.

24. Butler PJ. A defined structure of the 30 nm chromatin fibre which accommodates different

nucleosomal repeat lengths. EMBO J. 1984 Nov;3(l l):2599-604.

25. Caron N, Veilleux S, Boissonneault G. Stimulation of DNA repair by the spermatidal TP1

protein. Mol Reprod Dev. 2001 Apr;58(4):437-43.

26. Carrell DT, Emery BR, Hammoud S. Altered protamine expression and diminished

spermatogenesis: what is the link? Hum Reprod Update. 2007 May-Jun;13(3):313-27. Epub 2007 Jan 5. Review.

27. Carrell DT, Emery BR, Hammoud S. Altered protamine expression and diminished

spermatogenesis: what is the link? Hum Reprod Update. 2007 May-Jun;13(3):313-27. Epub 2007 Jan 5. Review.

28. Chauviere M, Martinage A, Debarle M, Sautiere P, Chevaillier P. Molecular

characterization of six intermediate proteins in the processing of mouse protamine P2 precursor. Eur J Biochem. 1992 Mar l;204(2):759-65.

29. Churikov D, Zalenskaya IA, Zalensky AO. Male germline-specific histones in mouse and

man. Cytogenet Genome Res. 2004;105(2-4):203-14. Review.

30. Corzett M, Kramer C, Blacher R, Mazrimas J, Balhorn R. Analysis of hamster protamines:

primary sequence and species distribution. Mol Reprod Dev. 1999 Nov;54(3):273-82.

31. Cox LS. DNA replication in cell-free extracts from Xenopus eggs is prevented by disrupting

nuclear envelope function. J Cell Sci. 1992 Jan;101 ( Pt l):43-53.

32. Demeret C, Vassetzky Y, Mechali M. Chromatin remodelling and DNA replication: from

nucleosomes to loop domains. Oncogene. 2001 May 28;20(24):3086-93. Review.

33. Ecklund PS, Levine L. Mouse sperm basic nuclear protein. Electrophoretic characterization

and fate after fertilization. J Cell Biol. 1975 Aug;66(2):251-62.

34. Evenson DP, Witkin SS, de Harven E, Bendich A. Ultrastructure of partially decondensed

human spermatozoal chromatin. J Ultrastruct Res. 1978 May;63(2): 178-87.

35. Elsevier SM, Ruddle FH. Haploid genome reactivation and recovery by cell hybridization.

Induction of DNA synthesis in spermatid nuclei. Chromosoma. 1976 Jul 8;56(3):227-41.

36. Frolova EI, Zatsepina OV, Poliakov VIu, Chentsov IuS. [Features of structural organization

of mouse centrometric heterochromatin, detected during differential decondensation of chromosomes], Tsitologiia. 1989 Apr;31(4):380-5. Russian.

37. Fuentes-Mascorro G, Serrano H, Rosado A. Sperm chromatin. Arch Androl. 2000 Nov-

Dec;45(3):215-25. Review.

38. Gergely A, Kovanci E, Senturk L, Cosmi E, Vigue L, Huszar G. Morphometric assessment

of mature and diminished-maturity human spermatozoa: sperm regions that reflect differences in maturity. Hum Reprod. 1999 Aug;14(8):2007-14.

39. Gineitis AA, Zalenskaya IA, Yau PM, Bradbury EM, Zalensky AO. Human sperm telomere-

binding complex involves histone H2B and secures telomere membrane attachment. J Cell Biol. 2000 Dec 25;151(7):1591-8.

40. Gorczyca W, Traganos F, Jesionowska H, Darzynkiewicz Z. Presence of DNA strand breaks

and increased sensitivity of DNA in situ to denaturation in abnormal human sperm cells: analogy to apoptosis of somatic cells. Exp Cell Res. 1993 Jul;207(l):202-5.

41. Govin J, Caron C, Lestrat C, Rousseaux S, Khochbin S. The role of histones in chromatin

remodelling during mammalian spermiogenesis. Eur J Biochem. 2004 Sep;271(17):3459-69. Review.

42. Green GR, Balhorn R, Poccia DL, Hecht NB. Synthesis and processing of mammalian

protamines and transition proteins. Mol Reprod Dev. 1994 Mar;37(3):255-63.

43. Gusse M, Chevaillier P. Electron microscope evidence for the presence of globular

structures in different sperm chromatins. J Cell Biol. 1980 Oct;87(l):280-4. PubMed PMID: 7419596;

44. Haaf T, Ward DC. Higher order nuclear structure in mammalian sperm revealed by in situ

hybridization and extended chromatin fibers. Exp Cell Res. 1995 Aug;219(2):604-11.

45. Hammoud S, Liu L, Carrell DT. Protamine ratio and the level of histone retention in sperm

selected from a density gradient preparation. Andrologia. 2009 Apr;41(2):88-94.

46. Henkel R, Kierspel E, Hajimohammad M, Stalf T, Hoogendijk C, Mehnert C, Menkveld R,

Schill WB, Kruger TF. DNA fragmentation of spermatozoa and assisted reproduction technology. Reprod Biomed Online. 2003 Oct-Nov;7(4):477-84.

47. H0st E, Lindenberg S, Smidt-Jensen S. DNA strand breaks in human spermatozoa:

correlation with fertilization in vitro in Oligozoospermie men and in men with unexplained infertility. Acta Obstet Gynecol Scand. 2000 Mar;79(3): 189-93.

48. Hud NV, Allen MJ, Downing KH, Lee J, Balhorn R. Identification of the elemental packing

unit of DNA in mammalian sperm cells by atomic force microscopy. Biochem Biophys Res Commun. 1993 Jun 30;193(3):1347-54.

49. Khadake JR, Rao MR. DNA- and chromatin-condensing properties of rat testes HI a and Hit

compared to those of rat liver Hlbdec; Hit is a poor condenser of chromatin. Biochemistry. 1995 Dec 5;34(48): 15792-801.

50. Kierszenbaum AL. Transition nuclear proteins during spermiogenesis: unrepaired DNA

breaks not allowed. Mol Reprod Dev. 2001 Apr;58(4):357-8.

51. Kopecny V, Pavlok A. Incorporation of Arginine-3H into chromatin of mouse eggs shortly

after sperm penetration. Histochemistry. 1975 Dec 19;45(4):341-5.

52. Le Lannic G, Arkhis A, Vendrely E, Chevaillier P, Dadoune JP. Production,

characterization, and immunocytochemical applications of monoclonal antibodies to human sperm protamines. Mol Reprod Dev. 1993 Sep;36(l):106-12.

53. Levesque D, Veilleux S, Caron N, Boissonneault G. Architectural DNA-binding properties

of the spermatidal transition proteins 1 and 2. Biochem Biophys Res Commun. 1998 Nov 27;252(3):602-9.

54. Lewis JD, Song Y, de Jong ME, Bagha SM, Ausio J. A walk though vertebrate and

invertebrate protamines. Chromosoma. 2003 May;l 11(8):473-82. Epub 2003 Feb 22. Review.

55. Longo FJ, Schuel H. An ultrastructural examination of polyspermy induced by soybean

trypsin inhibitor in the sea urchin Arbacia punctulata. Dev Biol. 1973 Oct;34(2): 187-99.

56. Manicardi GC, Tombacco A, Bizzaro D, Bianchi U, Bianchi PG, Sakkas D. DNA strand

breaks in ejaculated human spermatozoa: comparison of susceptibility to the nick translation and terminal transferase assays. Histochem J. 1998 Jan;30(l):33-9.

57. Marcon L, Boissonneault G. Transient DNA strand breaks during mouse and human

spermiogenesis new insights in stage specificity and link to chromatin remodeling. Biol Reprod. 2004 Apr;70(4):910-8. Epub 2003 Nov 26.

58. McKittrick E, Gafken PR, Ahmad K, Henikoff S. Histone H3.3 is enriched in covalent

modifications associated with active chromatin. Proc Natl Acad Sci USA. 2004 Feb 10;101(6):1525-30. Epub 2004 Jan 19.

59. McLay DW, Clarke HJ. The ability to organize sperm DNA into functional chromatin is

acquired during meiotic maturation in murine oocytes. Dev Biol. 1997 Jun 1;186(1):73-84.

60. McLay DW, Clarke HJ. Remodelling the paternal chromatin at fertilization in mammals.

Reproduction. 2003 May;125(5):625-33. Review.

61. McPherson S, Longo FJ. Chromatin structure-function alterations during mammalian

spermatogenesis: DNA nicking and repair in elongating spermatids. Eur J Histochem. 1993;37(2):109-28. Review.

62. Meistrich ML, Mohapatra B, Shirley CR, Zhao M. Roles of transition nuclear proteins in

spermiogenesis. Chromosoma. 2003 May;lll(8):483-8. Epub 2003 Feb 6. Review.

63. Meel FC, Pearson PL. Do human spermatozoa reactivate in the cytoplasm of somatic cells?

J Cell Sci. 1979 Feb;35:105-22.

64. Mudrak O, Tomilin N, Zalensky A. Chromosome architecture in the decondensing human

sperm nucleus. J Cell Sci. 2005 Oct l;118(Pt 19):4541-50.

65. Muratori M, Piomboni P, Baldi E, Filimberti E, Pecchioli P, Moretti E, Gambera L, Baccetti

B, Biagiotti R, Forti G, Maggi M. Functional and ultrastructural features of DNA-fragmented human sperm. J Androl. 2000 Nov-Dec;21(6):903-12.

66. Neuber E, Havari E, Aquiles Sanchez J, Powers RD, Wangh LJ. Efficient human sperm

pronucleus formation and replication in Xenopus egg extracts. Biol Reprod. 1999 0ct;61(4):912-20.

67. Nonchev S, Tsanev R. Protamine-histone replacement and DNA replication in the male

mouse pronucleus. Mol Reprod Dev. 1990 Jan;25(l):72-6.

68. Oku M, Sakai Y. Assessment of physiological redox state with novel FRETprotein probes.

Antioxid Redox Signal. 2011 Sep 2.

69. Oliva R, Mezquita C. Histone H4 hyperacetylation and rapid turnover of its acetyl groups in

transcriptionally inactive rooster testis spermatids. Nucleic Acids Res. 1982 Dec 20;10(24):8049-59.

70. Oliva R, Bazett-Jones D, Mezquita C, Dixon GH. Factors affecting nucleosome disassembly

by protamines in vitro. Histone hyperacetylation and chromatin structure, time dependence, and the size of the sperm nuclear proteins. J Biol Chem. 1987 Dec 15;262(35): 17016-25.

71. Oliva R, Dixon GH. Vertebrate protamine genes and the histone-to-protamine replacement

reaction. Prog Nucleic Acid Res Mol Biol. 1991;40:25-94. Review.

72. Oliva R. Protamines and male infertility. Hum Reprod Update. 2006 Jul-Aug;12(4):417-35.

Epub 2006 Mar 31. Review.

73. Papoutsopoulou S, Nikolakaki E, Chalepakis G, Kruft V, Chevaillier P, Giannakouros T. SR

protein-specific kinase 1 is highly expressed in testis and phosphorylates protamine 1. Nucleic Acids Res. 1999 Jul 15;27(14):2972-80.

74. Piasecka M, Gaczarzewicz D, Laszczynska M. Evaluation of sperm genomic integrity of

normozoospermic men: a prospective study. Folia Histochem Cytobiol. 2006;44(2):117-22.

75. Philpott A, Leno GH, Laskey RA. Sperm decondensation in Xenopus egg cytoplasm is

mediated by nucleoplasmin. Cell. 1991 May 17;65(4):569-78.

76. Pittoggi C, Renzi L, Zaccagnini G, Cimini D, Degrassi F, Giordano R, Magnano AR,

Lorenzini R, Lavia P, Spadafora C. A fraction of mouse sperm chromatin is organized in nucleosomal hypersensitive domains enriched in retroposon DNA. J Cell Sci. 1999 Oct;l 12 ( Pt 20):3537-48.

77. Pivot-Pajot C, Caron C, Govin J, Vion A, Rousseaux S, Khochbin S. Acetylation-dependent

chromatin reorganization by BRDT, a testis-specific bromodomain-containing protein. Mol Cell Biol. 2003 Aug;23(15):5354-65.

78. Poccia D. Remodeling of nucleoproteins during gametogenesis, fertilization, and early

development. Int Rev Cytol. 1986;105:1-65. Review.

79. Poliakov VIu, Kir'ianov GI, Manamsh'ian TA, Fais D, Chentsov IuS. [Ultrastructure of the

DNP fibrils and of the interchromatin granules in isolatednuclei of the rat liver], Tsitologiia. 1979 May;21(5):514-9. Russian.

80. Prigent Y, Muller S, Dadoune JP. Immunoelectron microscopical distribution of histones

H2B and H3 and protamines during human spermiogenesis. Mol Hum Reprod. 1996 Dec;2(12):929-35.

81. Prigent Y, Troalen F, Dadoune JP. Immunoelectron microscopic visualization of

intermediate basic proteins HPI1 and HPI2 in human spermatids and spermatozoa. Reprod Nutr Dev. 1998 Jul-Aug;38(4):417-27.

82. Prusov AN, Polyakov VYu, Zatsepina OV, Chentsov YuS, Fais D. Rosette-like structures

from nuclei with condensed (chromomeric) chromatin but not from nuclei with diffuse (nucleomeric or nucleosomic) chromatin. Cell Biol Int Rep. 1983 C)ct;7(10):849-58.

83. Rastelli L, Robinson K, Xu Y, Majumder S. Reconstitution of enhancer function in paternal

pronuclei of one-cell mouse embryos. Mol Cell Biol. 2001 Aug;21(16):5531-40.

84. Risley MS, Einheber S, Bumcrot DA. Changes in DNA topology during spermatogenesis.

Chromosoma. 1986;94(3):217-27.

85. Razin SV, Iarovaia OV, Sjakste N, Sjakste T, Bagdoniene L, Rynditch AV, Eivazova ER,

Lipinski M, Vassetzky YS. Chromatin domains and regulation of transcription. J Mol Biol. 2007 Jun 8;369(3):597-607. Epub 2007 Apr 5. Review.

86. Rodman TC, Pruslin FH, Hoffmann HP, Allfrey VG. Turnover of basic chromosomal

proteins in fertilized eggs: a cytoimmunochemical study of events in vivo. J Cell Biol. 1981 Aug;90(2):351-61.

87. Rogakou EP, Pilch DR, Orr AH, Ivanova VS, Bonner WM. DNA double-stranded breaks

induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 1998 Mar 6;273(10):5858-68.

88. Romanato M, Cameo MS, Bertolesi G, Baldini C, Calvo JC, Calvo L. Heparan sulphate: a

putative decondensing agent for human spermatozoa in vivo. Hum Reprod. 2003 Sep; 18(9): 1868-73.

89. Rooney AP, Zhang J, Nei M. An unusual form of purifying selection in a sperm protein.

Mol Biol Evol. 2000 Feb;17(2):278-83.

90. Santos F, Hendrich B, Reik W, Dean W. Dynamic reprogramming of DNA methylation in

the early mouse embryo. Dev Biol. 2002 Jan 1;241(1): 172-82.

91. Schatten G, Simerly C, Palmer DK, Margolis RL, Maul G, Andrews BS, Schatten H.

Kinetochore appearance during meiosis, fertilization and mitosis in mouse oocytes and zygotes. Chromosoma. 1988;96(5):341-52.

92. Shaman JA, Yamauchi Y, Ward WS. Function of the sperm nuclear matrix. Arch Androl.

2007 May-Jun;53(3):135-40. Review.

93. Singh J, Rao MR. Interaction of rat testis protein, TP, with nucleosome core particle.

Biochem Int. 1988 0ct;17(4):701-10.

94. Sobhon P, Thungkasemvathana P, Tanphaichitr N. Electron microscopic studies of rat sperm

heads treated with urea, dithiothreitol, and micrococcal nuclease. Anat Rec. 1981 Oct;201(2):225-35.

95. Sobhon P, Chutatape C, Chalermisarachai P, Vongpayabal P, Tanphaichitr N. Transmission

and scanning electron microscopic studies of the human sperm chromatin decondensed by micrococcal nuclease and salt. J Exp Zool. 1982 May 20;221(l):61-79.

96. Sobhon P, Tanphaichitr N, Chutatape C, Vongpayabal P, Panuwatsuk W. Electron

microscopic and biochemical analyses of the organization of human sperm chromatin decondensed with sarkosyl and dithiothreitol. J Exp Zool. 1982 Nov l;223(3):277-90.

97. Sutovsky P, Schatten G. Depletion of glutathione during bovine oocyte maturation

reversibly blocks the decondensation of the male pronucleus and pronuclear apposition during fertilization. Biol Reprod. 1997 Jun;56(6):1503-12.

98. Szczygiel MA, Ward WS. Combination of dithiothreitol and detergent treatment of

spermatozoa causes paternal chromosomal damage. Biol Reprod. 2002 Nov;67(5):1532-7.

99. Umehara T, Horikoshi M. Transcription initiation factor IID-interactive histone chaperone

CIA-II implicated in mammalian spermatogenesis. J Biol Chem. 2003 Sep 12;278(37):35660-7. Epub 2003 Jul 2.

100.Verreault A. De novo nucleosome assembly: new pieces in an old puzzle. Genes Dev. 2000 Jun 15;14(12): 1430-8. Review.

101. Wagner TE, Yun JS. Fine structure of human sperm chromatin. Arch Androl. 1979

Jun;2(4):291-4.

102. Ward WS, Partin AW, Coffey DS. DNA loop domains in mammalian spermatozoa.

Chromosoma. 1989 Sep;98(3):153-9.

103.Ward WS. Deoxyribonucleic acid loop domain tertiary structure in mammalian spermatozoa. Biol Reprod. 1993 Jun;48(6):l 193-201. Review.

104. Ward WS. Function of sperm chromatin structural elements in fertilization and

development. Mol Hum Reprod. 2010 Jan;16(l):30-6. Epub 2009 Sep 11. Review.

105.Worawittayawong P, Leigh C, Weerachatyanukul W, Manochantr S, Sobhon P, Breed WG, Sretarugsa P. Changes in distribution of basic nuclear proteins and chromatin organization during spermiogenesis in the greater bandicoot rat, Bandicota indica. Cell Tissue Res. 2008 Oct;334(l):135-44. Epub 2008 Aug 23.

106.Wright SJ, Longo FJ. Sperm nuclear enlargement in fertilized hamster eggs is related to meiotic maturation of the maternal chromatin. J Exp Zool. 1988 Aug;247(2):l 55-65.

107.Wykes SM, Krawetz SA. The structural organization of sperm chromatin. J Biol Chem. 2003 Aug 8;278(32):29471-7. Epub 2003 May 29.

108.Xu YS, Overton WR, Marmar JL, Leonard JC, McCoy JP Jr, Butler GH, Li H. Complete replication of human sperm genome in egg extracts from Xenopus laevis. Biol Reprod. 1998 Mar;58(3):641-7.

109.Yan W, Ma L, Burns KH, Matzuk MM. HILS1 is a spermatid-specific linker histone Hl-like protein implicated in chromatin remodeling during mammalian spermiogenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 2003 Sep 2; 100(18): 10546-51. Epub 2003 Aug 14.

110.Yoshii T, Kuji N, Komatsu S, Iwahashi K, Tanaka Y, Yoshida H, Wada A, Yoshimura Y. Fine resolution of human sperm nucleoproteins by two-dimensional electrophoresis. Mol Hum Reprod. 2005 Sep;l 1(9):677-81. Epub 2005 Sep 28.

111.Zalensky AO, Breneman JW, Zalenskaya IA, Brinkley BR, Bradbury EM. Organization of centromeres in the decondensed nuclei of mature human sperm. Chromosoma. 1993 Sep;102(8):509-18.

112.Zalensky AO, Siino JS, Gineitis AA, Zalenskaya IA, Tomilin NV, Yau P, Bradbury EM. Human testis/sperm-specific histone H2B (hTSH2B). Molecular cloning and characterization. J Biol Chem. 2002 Nov 8;277(45):43474-80. Epub 2002 Sep 3.

113.Zalensky AO, Tomilin NV, Zalenskaya IA, Teplitz RL, Bradbury EM. Telomere-telomere interactions and candidate telomere binding protein(s) in mammalian sperm cells. Exp Cell Res. 1997 Apr 10;232(1):29-41

1 M.Zatsepina OV, Poliakov VIu, Chentsov IuS. [Electron microscopic study of the chromonema and chromomeres in mitotic and interphase chromosomes], Tsitologiia. 1983 Feb;25(2): 123-9. Russian.

115.Zini A, Bielecki R, Phang D, Zenzes MT. Correlations between two markers of sperm DNA integrity, DNA denaturation and DNA fragmentation, in fertile and infertile men. Fertil Steril. 2001 Apr;75(4):674-7.

Благодарности

Автор выражает благодарность всем сотрудникам отдела электронной микроскопии НИИ ФХБ им А. Н. Белозерского за участие и поддержку, оказанную в ходе выполнения работы. Отдельная благодарность Голышеву Сергею Александровичу за руководство, обучение методам и содействие в получении результатов, Брагиной Елизавете Ефимовне за оказанную помощь в получении материала для исследования, Кирееву Игорю Игоревичу за продуктивные обсуждения, смелые гипотезы и новые методики, Глебу Ивановичу Кирьянову за своевременно поданные идеи, Шевалю Евгению Валерьевичу за деятельную помощь и конструктивную критику.

За предоставленные для исследования образцы эякулята и биопсий, автор выражает благодарность Витязевой Ирине Ивановне, заведующей отделением ВРТ ФГУ «Эндокринологический научный центр» и Яковенко Сергею Александровичу, генеральному директору клиники ЭКО АльтраВита.

Особая благодарность выражается Лазареву Алексею Викторовичу и Сенченкову Евгению Павловичу за поддержание в рабочем состоянии электронных микроскопов.