Молекулярно-биологическая характеристика плазмиды пестициногенности чумного микроба тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.07, кандидат биологических наук Можаров, Олег Тихонович

• Можаров, Олег Тихонович
• кандидат биологических наук
• 1983

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Можаров, Олег Тихонович

ВВЕДЕНИЕ.4

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.9

ГЛАВА I. МЕТОДЫ ВЫДЕЛЕНИЯ ПЛАЗМВДНОЙ ДНК.9

ГЛАВА П. АНАЛИЗ ПЛАЗМВДНЫХ ДНК С ПОМОЩЬЮ СПЕЦИФИЧЕСКИХ ЭНДОНУКЛЕАЗ, КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ МОЛЕКУЛ ДНК.35

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ГЛАВА Ш. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.47

ГЛАВА 1У. ВЫДЕЛЕНИЕ ПЛАЗМВДНОЙ ДНК, ДЕТЕРМИНИРУЮЩЕЙ

СИНТЕЗ ПЕСГИЦИНА I .74

1. Сравнительная эффективность некоторых методов выделения плазмидной ДНК .74

2. Биологическая идентификация препаратов плазмидной ДНК.85

ГЛАВА У. МОЛЕКУЛЯРНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ДНК ПЛАЗМВДЫ

ПЕСТИЦИНОГЕННОСТИ.89

1. Определение молекулярной массы плазмиды пестициногенности .89

2. Изучение нуклеотидного состава плазмидной ДНК 96

3. Определение числа копий плазмиды пестициногенности на один хромосомный эквивалент

Y.peetis .97

4. Изучение чувствительности ДНК плазмиды пестициногенности к специфическим эндо-нуклеазам .99

5. Некоторые характеристики мини-плазмид чумного микроба .103

ГЛАВА У1. КОНСТРУИРОВАНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ МОЛЕКУЛ ДНК НА ОСНОВЕ РЕПЛИКОНА ПЛАЗМИДЫ ПЕСТИЦИНОГЕННОСТИ, ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ИХ ДЛЯ КАРТИРОВАНИЯ . . 106

1. Использование в качестве клонируемой ДНК плазмиды pBR 322 . . 106

2. Картирование плазмиды пестициногенности с использованием гибридной плазмиды . II4-I

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Молекулярно-биологическая характеристика плазмиды пестициногенности чумного микроба»

Актуальность проблемы. Сразу же вслед за открытием явления бактериоциногении у чумного микроба ( Ben-Gu-rion, Hertman, 1958) стали предприниматься попытки установить генетическую природу этого явления. По аналогии с колициногени-ей многие исследователи склонны были считать, что синтез пести-цина I контролируется внехромосомным элементом наследственности (см.например, Hertman, Ben-Gurion, 1959; Brubaker, Surgalla, 1961; Пак, 1969; Hu et al., 1972; Brubaker, 1972; Brubaker, 1974). Несмотря на отсутствие прямых доказательств справедливости этого предположения, Hardy K.G. (1975) в своем обзоре пишет о плазмиде пестициногенности чумного микроба, как о само собой разумеющемся.

Отнесение пестициногенности к числу признаков, ассоциированных с вирулентностью чумного микроба (см., например, Brubaker, 1972), повысило интерес исследователей к выявлению генетической природы этого детерминанта, что способствовало переходу от этапа предположений и аналогий к поискам экспериментальных доказательств, способных установить истину. К началу семидесятых годов Кольцовой Е.Г. с соавт. (1971; 1971; 1973) и Проценко О.А. (1973) удалось показать, что детерминант пестициногенности мобилизуется к конъюгационному переносу некоторыми трансмиссивными R-факторами с частотами, значительно превышающими таковые для известных хромосомных маркеров. Кутырев В.В. (1979) затем не только подтвердил эти данные, но и показал "ограниченную" несовместимость детерминанта пестициногенности с плазмидой Col EI, а также способность плазмиды Col EI комплементировать мобилизацию детерминанта пестициногенности плазмидой RP4.

Таким образом, были получены достаточно весомые свидетельства в пользу плазмидной природы пестициногенности. Однако, первая из известных попыток выделить из Y.pestis препарат плазмидной ДНК оказалась безуспешной ( Little, Brubaker, 1972). Только в 80-х годах опубликованы первые сообщения о результатах исследования, проведенных в нашей лаборатории (Попов и др., 1980) и зарубежными исследователями ( Ferber, Brubaker, 1981), по выявлению методами электрофоретического анализа плазмид чумного микроба, в том числе и плазмиды пестициногенности. Очевидно, что изучение молекулярных характеристик и биологических свойств плазмиды, ответственной за синтез пестицина I у возбудителя чумы, является весьма актуальной проблемой.

Целью настоящего исследования было изучение основных молекулярно-биологических характеристик плазмиды пестициногенности чумного микроба и возможности использования ее в качестве векторной молекулы в молекулярно-генети-ческих исследованиях возбудителя чумы.

Задачи настоящей работы состояли в следующем:

- адаптировать известные методы выявления плазмид в бактериях и получения плазмидной ДНК в препаративных количествах для работы с клетками Y.pestis и оптимизировать их таким образом, чтобы получать устойчиво воспроизводимые результаты;

- провести биологическую идентификацию плазмидной ДНК, выделенной методами трансформации бесплазмидных штаммов Y.pestis и E.coli с последующим изучением фенотипа трансформантов. При этом необходимо было решить и задачу селекции трансформированных клеток в связи с отсутствием у плазмиды пестициногенности селективных маркеров;

- определить молекулярную массу плазмиды пестициногенности

- б независимыми методами - электронно-микроскопическим, электрофо-ретическим и методом аналитического ультрацентрифугирования; определить плавучую плотность плазмидной ДНК в растворах солей цезия и установить мольную долю нуклеотидов Г+ Ц;

- определить число копий плазмиды пестициногенности на один хромосомный эквивалент, что могло бы осветить два вопроса: способ контроля репликации этой плазмиды, а также потенциальную возможность использования ее в качестве векторной молекулы;

- изучить чувствительность ДНК плазмиды пестициногенности, выделенной из различных по происхождению штаммов Y.pestis к специфическим эндонуклеазам (рестриктазам), наиболее популярным в экспериментах по молекулярному клонированию; определить локализацию сайтов рестрикции для некоторых рестриктаз на молекуле плазмиды пестициногенности. Такая рестрикционная карта могла бы быть основой для последующего генетического картирования этой плазмиды;

- методами генной инженерии сконструировать гибридную плазми-ду на основе плазмиды пестициногенности, введя в нее ген устойчивости к какому-либо из лекарственных средств в качестве удобного селективного маркера; кроме того, это была бы реальная проверка плазмиды на возможность использования ее в качестве векторной молекулы.

Научно-практическая значимость работы и положения, выдвигаемые для защиты:

- разработан метод электрофоретического выявления плазмидной ДНК в бактериальных клетках, позволяющий воспроизводимо выявлять плазмиды с широким спектром молекулярных масс из большого круга бактерий как рода Yersenia, так и других родов микроорганизмов. Метод может быть использован для исследования штаммов чумного микроба, выделяемых в природных очагах, по набору плазмид, который у возбудителя чумы является относительно устойчивой характеристикой; оптимизирован метод препаративного выделения ДНК плазмид чумного микроба, который без дополнительных модификаций позволяет выделять плазмиды различной молекулярной массы из широкого круга хозяев бактериальной природы;

- совместно с сотрудниками отдела генетики ВНИПЧИ "Микроб" разработан способ котрансформации клеток Y.pestis, существенно упрощающий биологическую идентификацию препаратов плазмидной ДНК, выделенной из чумного микроба и не обладающей селективными маркерами;

- определены такие молекулярные характеристики ДНК плазмиды пестициногенности, как масса, процентное содержание ГЦ-пар и плавучая плотность в растворе хлористого цезия. Определение числа копий плазмиды на один хромосомный эквивалент клетки Y.pestis свидетельствует об "ослабленном" контроле репликации этой плазмиды со стороны хромосомальных генов;

- определена чувствительность ДНК плазмиды пестициногенности к ряду специфических эндонуклеаз (рестриктаз). Показано наличие уникальных сайтов для некоторых из них, что является благоприятным фактором при использовании этой плазмиды в качестве векторной молекулы; составлена рестрикционная карта плазмиды пестициногенности чумного микроба, которая может служить основой картирования плазмиды; определена примерная локализация гена, детерминирующего синтез пестицина I;

- выявлены и частично охарактеризованы две мини-плазмиды чумного микроба, образованные de novo в одном из штаммов чумного микроба, которые могут стать основой для конструирования плазмидного вектора;

- сконструирована рекомбинантная плазмида pGM6, наделяющая трансформированные ею клетки Y.pestis и E.coli способностью синтезировать пестицин I, фибринолизин, плазмокоагулазу и устойчивостью к тетрациклину, построена рестрикционная карта этой плазмиды.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Можаров, Олег Тихонович

выводы

1. На основе известных принципов разработаны и внедрены в практику исследований внехромосомной наследственности возбудителя чумы методы электрофоретического выявления и препаративного выделения плазмидной ДНК, позволяющие выявлять и получать плаз-мидную ДНК в широком диапазоне молекулярных масс из бактерий различных видов и родов.

2. Предложенный способ котрансформации клеток чумного микроба смесью плазмидных ДНК позволяет проводить надежную биологическую идентификацию препаратов плазмидной ДНК, выделенной из разных штаммов возбудителя чумы и не обладающие селективными маркерами.

3. Показано, что молекулярная масса плазмиды пестициногенности, определенная независимыми методами составляет около 6Md ; плавучая плотность плазмидной ДНК в растворах хлористого цезия о равна 1,7085-1,7095 г/см , суммарное содержание гуанина и цито-зина составляет 49-50%.

4. Количество копий плазмиды пестициногенности в расчете на один хромосомный эквивалент составляет 13-16 без амплификации и 200-230 в присутствии ингибитора белкового синтеза хлорамфеникола. Для рекомбинантной плазмиды pGM6 эти числа составляют, соответственно, 8-11 и II5-I40.

5. ДНК плазмиды пестициногенности из штаммов Y.pestis EV 5/1, 358/12 и 231 не обладает полинуклеотидными последовательностями, чувствительными к действию специфических эндонуклеаз (рестриктаз) R*PvuII, R*SalGI, R*XhoI; эта же ДНК чувствительна к эн-донуклеазам R'BamHI, R'Bglll, R'EcoRI, R-Hindlll, R*PstI,R*SmaI. Последовательности, узнаваемые ферментами R*BamHl, R»Hindlll и R*Pstl являются уникальными.

6. Показана изменчивость плазмиды пестициногенности в штаммах Y.pestis PKR 133 и 358/12; выявлены и охарактеризованы две мини-плазмиды, pGMml и pGMm2 с м.м., соответственно, 1,9 и

1,5 Md, образованные de novo в Y.pestis 358/12.

7. На основе репликона плазмиды пестициногенности сконструирована серия рекомбинантных плазмид pGM, одна из которых, pGM6, обеспечивает трансформированным ею клеткам чумного микроба и кишечной палочки устойчивость к тетрациклину и способность синтезировать и выделять в культурную среду пестицин- I, фибринолизин и плазмокоагулазу.

8. Построена рестрикционная карта плазмиды пестициногенности чумного микроба и рекомбинантной плазмиды pGM6; установлено положение на этих плазмидах гена, детерминирующего синтез пестици-на I. Основная часть этого гена находится в пределах фрагментов ДНК, образуемых эндонуклеазами R*EcoRI, R*Hindlll, R»BglII,

R-BamHI.

- 138

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Выявление у различных штаммов рода Yersinia собственных плазмид и экспериментальные данные, устанавливающие связь некоторых детерминантов вирулентности чумного микроба с этими плаз-мидами благоприятствуют переходу к качественно новому этапу исследований механизмов патогенности этого возбудителя. На наш взгляд, этот этап будут отличать следующие особенности:

- изучение экспрессии отдельных плазмидных детерминантов вирулентности и различных их сочетаний в разном штаммовом окружении;

- изучение взаимовлияния плазмидных и известных хромосомных детерминантов вирулентности;

- изучение продуктов отдельных генов плазмид и их взаимодействия между собой и продуктами хромосомных генов;

- возможно, что эти исследования будут способствовать выявлению неизвестных еще детерминантов вирулентности чумного микроба;

- очевидно, что эти исследования будут достаточно эффективны лишь при условии привлечения редукционистских методов, наиболее приемлемым из которых в настоящее время является генноинженер-ная технология;

- редукционистский подход позволит перейти к изучению экспрессии отдельных генов, ответственных за вирулентность иерсиний, и их различных сочетаний в культурах клеток млекопитающих, а также влияния продуктов этих генов на клеточные культуры;

- эти особенности исследований предоставят реальную возможность для изучения механизмов взаимодействия такого патогена, как чумной микроб, с макроорганизмом;

- и, наконец, редукционистский подход в этих исследованиях открывает вполне реальную перспективу конструирования штаммовпродуцентов и супер-продуцентов отдельных антигенов иерсиний, а также штаммов, наиболее эффективных в производстве вакцин.

Понятно, что переход к этому новому этапу исследований возможен лишь при наличии в лаборатории комплекса методов, позволяющих достаточно эффективно обнаруживать и выделять ДНК различных плазмид, исследовать их физико-химическую структуру и биологическую активность. Мы и предприняли попытку, хотя бы частично, рассмотреть эти возможности на примере изучения плазмиды пестициногенности чумного микроба.

Ни один из этапов метода препаративного выделения плазмидной ДНК, использованного в настоящей работе, не является оригинальным. Так, лизис бактериальной массы и "осветление" бактериолиза-тов проводили по Clewell D.B. и Helinski D.R. (1970), увеличив лишь скорость центрифугирования при "осветлении" лизатов и добавив этанол в лизирующую смесь; отделение плазмидной ДНК от обрывков хромосомы проводили в градиенте плотности CsCl в присутствии красителя по Radloff R. с соавт. (1967); осавдение ДНК из "осветленных" лизатов с помощью NaCl и этанола используется в лабораториях Дебабова В.Г. и Газаряна К.Г.; способ удаления примесей белка из препаратов ДНК с помощью хлорида цезия применяли Алиханян С.И. с соавт. (1975). То же можно сказать и о других этапах метода. Мы использовали компилляцию из методов, предложенных разными группами исследователей, и эта компилляция оказалась эффективной в нашей лаборатории. По замечанию Брода П. (1982) "метод, разработанный для одной плазмиды, дает небольшой выход в случае другой плазмиды или штамма, и при исследовании новой системы следует проверить несколько методов и подобрать тот, который дает удовлетворительный результат". Указанный ком-пиллятивный метод эффективен без каких-либо изменений при исследовании различных бактериальных систем в достаточно широком диапазоне молекулярных масс исследуемых плазмид. Так, мы выделяли плазмидную ДНК с молекулярными массами от I,5Md до 70Md из разных штаммов Y.pestis, Y.pseudotuberculosis, E.eoli, V.chole-rae, а так же из различных штаммов родов Shigella, Salmonella, Bacillus. Дополнительная очистка препаратов плазмидной ДНК на колонке с биогелями (что позволило отказаться от малоэффективной обработки бактериолизатов РНК-азой, а также от диализа ДНК, в результате которого неизбежны значительные потери плазмидной ДНК) обеспечила высокую степень чистоты получаемых плазмид, что подтверждено электронно-микроскопическим и электрофоретическим анализом. Высокая чистота препаратов плазмидной ДНК является, в свою очередь, надежным гарантом для однозначной интерпретации результатов исследований с привлечением методов трансформации, рестрикционного анализа и конструирования рекомбинантных молекул ДНК.

Экономически нецелесообразно предпринимать попытки препаративного выделения плазмидной ДНК из штаммов микроорганизмов, не убедившись предварительно в наличии у них плазмид. Следует при этом заметить, что отбор штаммов по их фенотипу не всегда является достаточным критерием правильности выбора. Для иллюстрации этого положения приведем пример исследования штамма Y.pestis EV5/I, фенотип которого Pstl+ Pral" Тох" Cad* (позднее Процен-ко О.А., используя систему ацетоновысушенных клеток, показала наличие у этого штамма незначительного количества поверхностного антигена фракция I). Полагаясь на данные изучения фенотипа этого штамма, мы использовали его в качестве продуцента ДНК плазмиды пестициногенности. Однако электрофоретический и электронно-микроскопический анализ чистоты полученного препарата ДНК показал наличие в нем примеси плазмид pFral/Tox и pCad. Отсюда становится очевидной необходимость поисков быстрых и достаточно воспроизводимых методов обнаружения плазмид в клетках микроорганизмов. В течение последних лет разработано значительное количество таких методов, некоторые из них стали общепринятыми (Meyers et al., 1976; Barnes, 1977; Telford et al., 1977; Козлов и др., 1978; Eckhardt, 1978; Kado, Liu, 1981). В главе 1У отмечены, наряду с достоинствами, и некоторые недостатки этих методов. Не перечисляя их вновь, следует, тем не менее, сделать акцент на наиболее существенном, на наш взгляд, недостатке. Технология приготовления препаратов ДНК для электрофорети-ческого анализа такова, что трудно сделать однозначную интерпретацию о количестве плазмид, выявляемых в ходе одного эксперимента, что обусловлено переходом части (иногда значительной) молекул из суперскрученной кольцевой формы в открытую кольцевую и даже линейную. Предложенный нами метод электрофоретического выявления плазмид относится к числу щадящих: лизис бактериальных клеток проводится с помощью неионного детергента Brij-58,a де-протеинизация полученных лизатов - с помощью нейтральной соли CsCl. Результаты электрофореза хорошо воспроизводимы и вполне однозначны в своей интерпретации, так как плазмидная ДНК выявляется в той форме, в которой она существует внутриклеточно. Это приобретает особую важность при исследовании штаммов чумного микроба (и других микроорганизмов), обладающих высокой рекомбина-ционной способностью, таких, например, как Y.pestis PKR 133. Использование в качестве положительного контроля штаммов Y.pestis EV, EV 5/1 или 231, стойко сохраняющих набор плазмид чумного микроба, а в качестве отрицательного контроля - Y.pestis Java или PKR 133, не содержащих плазмид, позволяет исключить при интерпретации электрофореграмм возможные погрешности, допущенные в работе. С помощью этого метода выявлены плазмиды в целом ряде штаммов чумного микроба, псевдотуберкулеза, кишечной палочки, холерного вибриона, некоторые из которых были затем вдет-тифицированы с помощью биологических методов. Препараты плазмидной ДНК, подготовленные для электрофоретического анализа, не проявляют признаков релаксации плазмид в условиях хранения их в холодильнике в течение, по крайней мере, 25 дней (срок наблюдения) , пригодны в экспериментах по трансформации бактерий и для рестрикционного анализа. По продолжительности выполнения этот метод значительно уступает методу Eckhardt Th. (1978) и методу Козлова Ю.И. с соавт. (1978), но вполне сопоставим с методом Meyers J.А. с соавт. (1976).

Следует, однако, отметить два существенных недостатка этого метода: а) в препаратах плазмидной ДНК содержится значительная примесь хромосомальной ДНК с молекулярной массой около 23Md (этим недостатком, впрочем, обладает большинство известных методов выявления плазмид). Это обстоятельство затрудняет выявление плазмид, обладающих электрофоретической подвижностью, сравнимой с подвижностью этих фрагментов хромосомы. Указанное затруднение может быть преодолено путем варьирования условий электрофореза (разные буферные системы, концентрация агарозного геля, напряженность электрического поля и т.д.), что требует дополнительных затрат труда и времени; б) достаточно высокая скорость "осветления" бактериолизатов требует наличия в лаборатории высокоскоростных центрифуг. Это препятствие, однако, становится несущественным по мере развития материальной базы заинтересованных лабораторий.

Впервые полученная возможность однозначной интерпретации электрофореграмм и высокая воспроизводимость делают этот метод пригодным для исследования штаммов чумного микроба, выделяемых в природных очагах чумы.

В процессе исследования были изучены такие молекулярно-биоло-гические характеристики плазмиды пестициногенности чумного микроба, как молекулярная масса, процентное содержание гуанина и цитозина, которое может характеризовать плавучую плотность ДНК в растворах хлористого цезия, а так же количество копий плазмидной ДНК в расчете на один хромосомный эквивалент. Молекулярная масса плазмиды пестициногенности, определенная тремя независимыми методами - электронномикроскопическим, электрофоретическим и аналитическим центрифугированием - оказалась близкой к б Md. Это соответствует данным, опубликованным РегЪег D.M.,Brubaker R.R. (1981) и Portnoy D.A., Palkow S. (1981). Мы, однако, не обнаружили в исследованных штаммах Y.pestis плазмиды пестициногенности с размерами около 20Md,o которой сообщают РегЪег D.M., Brubaker R.R. (1981).

Содержание гуанина и цитозина в ДНК плазмиды пестициногенности мало отличается от ДНК хромосомы чумного микроба (Стейниер и др., 1979). Так как плавучая плотность ДНК в солях цезия является функцией от нуклеотидного состава, то из приведенных данных очевидно, что попытки препаративного выделения ДНК плазмиды пестициногенности из штаммов Y.pestis в градиенте плотности CsCi без интеркалирующих красителей оказались бы безуспешными.

Определение "копийности" плазмиды пестициногенности в наших экспериментах показало, что в клетках штамма Y.pestis 358/12 содержится 13-16 копий плазмиды на один хромосомный эквивалент. Следует, однако, подчеркнуть, что размеры хромосомы чумного мико роба мы принимали равными таковым для E.coli - 2,8x10 d. Трудно пока ответить на вопрос о том, насколько допустима такая экстраполяция. Полученные результаты близки тем, которые получены для плазмиды ColEI в E.coli ( Clewell, 1972). Очевидно, что представленные данные являются нижним пределом "копийности" плазмиды пестициногенности в связи с возможным повреждением плазмид в процессе анализа. Следует также считать, что эта плазмида, подобно ColEI, реплицируется под "ослабленным" контролем хромосомных генов: в присутствии хлорамфеникола репликация плазмиды продолжает осуществляться и количество копий ее в штамме Y.pestis 358/12 возрастает более, чем до двухсот на один хромосомный эквивалент. Однако преимущество для препаративного выделения плазмиды это явление не дает, так как клетки целого ряда штаммов чумного микроба в присутствии хлорамфеникола становятся хрупкими и, в значительной степени, лизируются в процессе получения биомассы. Можно предположить, что выгоды амплификации плазмиды пестициногенности будут реальны при переносе ее в подходящие штаммы кишечной палочки.

Для доказательства того, что тот или иной фенотип бактериальной клетки определяется плазмидой, часто используют метод конъюгации или трансдукции. Эти методы, однако, не дают строгих доказательств плазмидной природы данного фенотипа (Брода, 1982),так как возможен совместный перенос или мобилизация к переносу более, чем одной плазмиды, либо совместный перенос плазмидных и хромосомных генов ( Anderson, 1969; Iordaneseu, 1977). Единственным пока методом строгого доказательства является выделение ДНК определенной плазмиды и трансформирование ею клеток подходящего реципиентного штамма с последующим изучением фенотипа клонов-трансформантов. В задачу нашего исследования также входила биологическая идентификация полученных препаратов плазмидной ДНК. Эту работу затрудняло то обстоятельство, что способность клеток продуцировать пестицин I, фибринолизин и плазмокоагулазу является признаками, плохо поддающимися прямой селекции. Мы (совместно с Кокушкиным A.M., Проценко О.А., Анисимовым П.И., Поповым Ю.А.) разработали способ, позволяющий обойти это затруднение - совместной трансформации изучаемой плазмидной ДНК с ДНК плазмиды СКдП, детерминирующей устойчивость к канамицину. После трансформации клоны, устойчивые к антибиотику, проверяли на их способность к пестициногении. В литературе известны аналоги этого метода, первый из которых предложил Kretschmer P.J. с соавторами (1975) для идентификации криптических плазмид кишечной палочки. Однако, ряд особенностей - независимость разработки, целенаправленная разработка для использования на модели чумного микроба, не способного расти при температурах выше 40°С, спонтанная элиминация из котрансформантов индикаторной плазмиды с высокой частотой (Кокушкин, 1982; 1983) - позволяют считать предложенный нами метод вполне самостоятельным. Высокая частота элиминации индикаторной плазмиды СКлII позволила получать клоны, содержащие только плазмиду пестициногенности. При изучении таких клонов установлено, что они приобрели, в результате трансформации, устойчивую способность продуцировать пестицин I, фибринолизин и плазмокоагулазу. Эксперименты по ретрансформации подтвердили эти результаты. Таким образом, получена возможность однозначных выводов в процессе биологической идентификации выделенных препаратов плазмидной ДНК чумного микроба, не обладающей селективными маркерами.

Исследование чувствительности ДНК плазмиды пестициногенности к действию некоторых специфических эндонуклеаз (рестриктаз) выявило, что эта ДНК не несет в себе последовательностей нуклеоти-дов, узнаваемых рестриктазами SalGl, Pvull и Xhoi, имеет по одному участку узнавания для рестриктаз BamHl, Hindlil и Psti, по два участка для рестриктаз Bglii и Smai и четыре участка узнавания для рестриктазы EcoRI. Интересно отметить при этом, что три малых EcoRI -фрагмента обладают почти сходной молекулярной массой и, в условиях наших экспериментов, несмотря на варьирование их, эти фрагменты не отделялись друг от друга при электрофорезе в агарозном геле.

Результаты, полученные в рестрикционном анализе, оказались сходными для плазмиды пестициногенности, выделенной из трех разных штаммов: Y.pestis Java 19/36 (плазмида пестициногенности перенесена в этот штамм из Y.peetis 231) Y.pestie EV 5/1, Y.pestis 358/12. Эти штаммы имеют различное происхождение и, по мнению специалистов, очаги их выделения не имели естественного сообщения в обозримом прошлом. Так, штамм Y.pestis EV выделен на о.Мадагаскар, штамм 231 - в тяныпаньском природном очаге, а штамм 358(927) - в средне-азиатском пустынном очаге. Это обстоятельство, а так же сходство молекулярных масс и фенотипического проявления плазмиды пестициногенности из ряда других штаммов

Y.pestis, позволяет предположить, что эта плазмида имеет общего предшественника и распространение ее в разные штаммы произошло сравнительно недавно, так как не наблюдается эволюционного изменения участков узнавания для указанных выше рестриктаз. Правда, можно допустить, что изменение этих участков "летально" для плазмиды, однако эксперименты по "вшиванию" чужеродных фрагментов ДНК в эти участки не подтверждают такой возможности. Обнаруженное явление "нестабильности" плазмиды пестициногенности (образование de novo двух мини-плазмид в одном из субклонов Y.pestis

358/12 и появление дополнительных сайтов рестрикции на pPstl в трансформированных клетках Y.pestis PKR 133) является, вероятно, следствием особенностей систем рекомбинации - "законной" или "незаконной" - этих штаммов, и исследование этих систем могло бы в значительной мере прояснить вопрос о механизмах изменчивости чумного микроба.

Рестрикционное картирование плазмиды позволяет несколько уточнить наше предположение о происхождении ее. Вероятно, репликон, составляющий основу плазмиды пестициногенности, образовался на сравнительно ранних этапах существования чумного микроба, а значительно позже в этот репликон были включены некоторые гены, отсутствовавшие в нем ранее. К их числу относится и ген определяющий синтез пестицина I. Такой подход к трактованию рестрикцион-ной карты плазмиды не является новым - он был применен Полянов-ским О.Л. и Носиковым В.В. в 1978 г.

Плазмида пестициногенности отсутствует в штаммах чумного микроба, длительно хранящихся в условиях лаборатории, - Y.pestis Java, PKR 133, 465, AII22, в селекционированном (Шведун, 1983) штамме 358/12 Ш, в природном апестициногенном штамме А579, в штамме 1146, выделенном в Закавказском высокогорном очаге. Сведения о штамме 1146 совпадают с результатами, полученными другими исследователями в нашей лаборатории (Проценко О.А., Фурсов В.В., Попов Ю.А.), которые показали, что штаммы из этого очага не содержат плазмиду пестициногенности. Это кажется необычным, тем более, что штамм Y.pestis П46 - представитель штаммов Закавказского высокогорного очага, устойчиво сохранял плазмиду, полученную им в результате трансформации, и экспрессия детерминантов этой плазмиды была вполне удовлетворительной.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Можаров, Олег Тихонович, 1983 год

1. АЛИХАНЯН С.И., ХЛЕБАЛИНА О.И., СТЕПАНОВ А.И., БЕБУРОВ М.Ю., КАЛИНИНА Н.В., ДЕБАБОВ В.Г., КРИВЦОВ Г.Г., ГАЛУШКО ш.П. Получение функционирующих рекомбинантных (гибридных) молекул ДНК in vitro. Генетика, 1975, т.2, № IX, с.34-36.

2. АНИСИМОВА А.А., ВОРОНИН A.M. Характеристика плазмид резистентности Pseudomonas aeruginosa. Антибиотики, 1981, т.26, № 6, с.450-456.

3. БАЕВ А.А. Современная биология как социальное явление. Вопр. философии, 1981, № 3, с.17-26.

4. БИЛ Дж., НОУЛЗ Дж., Внеядерная наследственность. М.: Мир, 1981.

5. ВОРОНИН A.M. Биология плазмид. Пущино, 1982.

6. БРОДА Р., Плазмиды. М.: Мир, 1982.

7. БУРГАСОВ П.Н. Молекулярная биология и профилактика инфекционных болезней. В кн.: фундаментальные науки - медицине. М., 1981, с.167-169.

8. ВАСИН М. Генная инженерия. Правда. 1982, II января.

9. ВАТАНАБЕ Ц. Устойчивость бактерий к лекарственным препаратам.-В кн.: Молекулы и клетки. М., 1969, вып.4, с.119-135.

10. ГЕНИНГ Л.В. Клонирование бактериальных генов с помощью плазмид. Дис. . канд.биол.наук. - М., 1978.

11. ГНЕДОЙ С.Н., БАБУШКИН Л.М., ФРОЛОВ В.Н., ЛЕВАШЕВ B.C. Трансформация энтеробактерий ДНК плазмиды R6K. ЖМЭИ, 1977, № I, с.99-104.

12. ГОНЧАРОВ Е.К., МИШАНЬКИН Б.М. Транслокация ТпА в плазмиду, детерминирующую образование пестицина I, штамма EV чумного микроба. В кн.: Молекул.биол. и генетика возбудителей особо опасных инфекций. Саратов, 1982, ч.2, с.22-23.

13. ДЕБАБОВ В.Г. Клонирование генов бактерий на плазмидах. В кн.: Молекулярные основы генетических процессов. М., 1981, с.234-239.

14. ДИГЯТКИН С.Я. Система интактного реципиента в трансфекции и трансформации энтеробактерий. Автореф.дис. . д-ра мед.наук.-М., 1979.

15. ДЭВИДСОН Дж. Биохимия нуклеиновых кислот. М.: Мир, 1968.

16. ИНСТРУКЦИЯ о противоэпидемическом режиме работы с материалом, зараженным или подозрительным на зараженность возбудителями инфекционных заболеваний 1-П групп. Саратов, 1979.

17. КАРАМОВ Э.В., НАРОДИЦКИЙ Б.С., ЗАВИЗИОН Б.А., ТИХОНЕНКО Т.И. Трансформация субстратной специфичности рестриктазы EcoRI под действием глицерина. Бюл.экспер.биол., 1977, т.84, № 7, с.46-48.

18. КЕРНС Д. Хромосома E.coli В кн.: Синтез и структура нуклеиновых кислот. М., 1966, с.23-29.

19. КИРБИ К. Выделение и фракционирование нуклеиновых кислот. -В кн.: Нуклеиновые кислоты. М., 1966, с.10-43.

20. КОЗЛОВ Ю.И., КАЛИНИНА Н.А., СГРОНГИН А.Я., ГЕНИНГ Л.В., РЕ-БЕНТИШ Б.А., Д0ЛГАН0В Г.И., ШЕМЯКИН М.Ф., ДЕБАБОВ В.Г. Выделение и амплификация хромосомных генов Escherichia coli на гибридных плазмидах. Докл. АН СССР 1976, т.230, № 4, с.961-964.

21. КОЗЛОВ Ю.И., К0ЧЕГ0ВА Л.П., ЛИВШИЦ В.А., МАШКО С.В., МОШЕНЦЕ-ВА В.Н., РЕБЕНТИШ Б.А., Р03ИН0В М.Н., ХУРГЕС Е.М., ЯНКОВСКИИ Н.К., ДЕБАБОВ В.Г. Клонирование генов треонинового оперона в клетках Escherichia coli. Генетика, 1980, т.16, № I, с.66-67.

22. КОЗЛОВ Ю.И., МАШКО С.В., Р03ИН0В М.Н., БЗАТУСЬ А.С., МИРОНОВ А.А., ЯНКОВСКИЙ Н.К., РЕБЕНТИШ Б.А., ДЕБАБОВ В.Г. Воссоединениефрагментов ДНК под действием полинуклеотидлигазы и оптимизация реакции. Докл. АН СССР, 1979, т.244, № 4, с.1025-1029.

23. КОКУШКИН A.M. Трансформация чумного микроба ДНК собственных плазмид. В кн.: Молекул.биол.и генетика возбудителей особо опасных инфекций. Саратов, 1982, ч.2, с.34-40.

24. КОКУШКИН A.M. Трансформирующая активность плазмид чумного микроба: Автореф.дис. . канд.мед.наук. Саратов, 1983.

25. КОЛЬЦОВА Е.Г. Некоторые свойства пестицина I и передача пестициногенности чумному микробу: Автореф.дис. . канд.мед.наук.-Ростов н/Д, 1971.

26. КОЛЬЦОВА Е.Г. Изучение возможности передачи колициногенности и пестициногенности чумному микробу. В кн.: Вопр.теор.и прикл. микробиологии. Ростов н/Д, 1973, с.15-17.

27. КОЛЬЦОВА Е.Г., СУЧКОВ Ю.Г., ЛЕБЕДЕВА С.А. Передача фактора бактериоциногенности у чумного микроба. Генетика, 197I, т.7, № 4, с.118-122.

28. КОЧЕТКОВ Н.К., ЕУДОВСКИЙ Э.И., СВЕРДЛОВ Е.Д., СИМУКОВА Н.А., ТУРЧИНСКИЙ М.Ф., ШИБАЕВ В.Н. Органическая химия нуклеиновых кислот. М., Химия, 1970.

29. КОЭН С. Манипулирование генами. В кн.: Молекулы и клетки. 1977, вып.6, с.26-44.

30. КОЭН С., КАЕЕЛЛО Ф., ЧАНГ А., ТИММИС К. Клонирование ДНК как средство изучения биологии плазмид. В кн.: Рекомбинантные молекулы: значение для науки и практики. М., 1980, с.116-132,

31. КУТЫРЕВ В.В. Мобилизующая активность конъюгативных плазмид R в отношении фактора пестициногенности чумного микроба: Дис. . канд.мед.наук. Саратов, 1979.

32. КЭМПБЕЛ А., Генетическая структура фага X В кн.: шаг лямбда. М., 1975, с.21-64.

33. ЛАРИОНОВ В.Л., АВЕРЬЯНОВ А.В., ГАУЗЕ Г.Г. Выделение 25 мк кольцевой митохондриальной ДНК из дрожжей S.cerevisae. В кн.: Плазмиды как векторные молекулы при передаче генетической информации. Тарту, 1979, с.91-94.

34. МАНДЕЛЬ М., ШИЛЬКРАУТ К., МАРМУР Дж. Определение содержания гуанина и цитозина в ДНК с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности CsCl.- В кн.: Методы исслед.нуклеиновых кислот. М., 1970, с.175-183.

35. МАТВИЕНКО Н.И. Методы генной инженерии. В кн.: Итоги науки и техники. Сер.микробиология. М., 1979, т.10, с.5-98.

36. МАШКО С.В. Оптимизация условий воссоединения фрагментов ДНК с помощью ДНК-лигазы: Автореф.дис. . канд.биол.наук. М., 1979,

37. МЕЙНЕЛЛ Г. Бактериальные плазмиды. М., Мир, 1976.

38. МЕЛЬНИКОВ А.А., КУЗЬМИН Н.П., К0ПЫЛ0ВА-СВИРВД0ВА Т.Н., БАЕВ А.А. Конструирование рекомбинантных молекул ДНК in vitro и клонирование с использованием EcoRO* активности рестрикционной эндонуклеазы EcoRl. Докл. АН СССР, 1977, т.232, № 3, с.687-690.

39. МЕЧИ НА ОРАЛА (из доклада Генерального секретаря ООН). -Курьер ЮНЕСКО, 1982, апрель, с.26-33.

40. МИКЕЛЬСОН А. Химия нуклеозидов и нуклеотидов. М.: Мир, 1966.

41. МИЛЛЕР Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. М., Мир, 1976.

42. НЕКОТОРЫЕ плазмидные векторы. В кн.: Итоги науки и техники. Сер.молекул.биол. М., 1980, т.12, ч.2, с.213-227.

43. ОГАРКОВ В.И. Современная генетика промышленных микроорганизмов для медицины. В кн.: Фундаментальные науки - медицине. М.,1981, с.203-209.

44. ДАЛЬНЕЙШЕМ развитии фундаментальных исследований для медицины. В кн.: Фундаментальные науки - медицине. М., 1981, с.266-276.

45. ОСГЕРМАН Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. М., Наука, 1981.

46. ПАК Г.Ю. Некоторые свойства индуцированных непестициногенных мутантов чумного микроба. Пробл.особо опасных инф. Саратов, 1969, № I, с.75-79.

47. П0ЛЯН0ВСКИЙ О.Л., НОСИКОВ В.В. Рестрикционные эндонуклеазы в генетической инженерии. В кн.: Итоги науки и техники. Сер. Биол.химия, М., 1978, т.14, с.5-189.

48. ПОПОВ Ю.А., КИРИЛЛИНА О.А. Структурное подобие чумных бактериофагов 46 и диагностического Покровской. В кн.: Молекул, биол.и генетика возбудителей особо опасных инфекций. Саратов,1982, чЛ, с.58-62.

49. ПОПОВ Ю.А., ПР0ЦЕНК0 О.А., АНИСИМОВ П.И., НШУШКИН A.M., МО-ЖАРОВ О.Т. Обнаружение плазмиды пестициногенности чумного микроба методом электрофореза в агарозном геле. В кн.: Профилакт. особо опасных инфекций. Саратов, 1980, с.20-25.

50. ПР0ЦЕНК0 О.А. Значение R -эписомы в мобилизации переноса хромосомных и эписомных признаков у чумного микроба. В кн.: Химиотерапия инф.и лекарственная устойчивость патогенных микроорганизмов. М., 1973, с.287-288.

51. РУКОВОДСТВО по профилактике чумы под ред. Н.И.Николаева. -Саратов, 1972. 199 с.

52. САКАНЯН В.А., ЯКУБОВ Л.З., АЛИХАНЯН С.И., СТЕПАНОВ А.И. Генетический и гетеродуплексный анализ делеционных мутантов плазмиды PAS8. Генетика, 1978, т.14, № 5, с.853-856.

53. САКАГУЧИ К., ТАНАКА Т., НАГАХАРИ К., ХИШИНУМА Ф., КАНЕКО X. Молекулярные скрещивания между E.coli, Ps.aeruginosa, B.subtilis и аргументы в пользу их безопасности. В кн.: Молекул.основы генетических процессов, М., 1981, с.201-204.

54. СЕРМОНГИ Дж. Генетика промышленных микроорганизмов. В кн.: Молекул.основы генетических процессов. М., 1981, с.312-318.

55. СО М., ФОЛКОУ С. Молекулярное клонирование как способ исследования патогенных культур Escherichia coli. В кн.: Рекомби-нантные молекулы: значение для науки и практики. М., 1980, с.133-152.

56. СГЕЙЖРР., ЭДЕЛЬБЕРГ Э., ИНГРЭМ Дж. Мир микробов. М.,Мир, 1979.

57. СТЕПАНОВ А.И., ЗИМИНА М.С., ХЛЕБАЛИНА О.И., РАБИНОВИЧ П.М., БЕЕУРОВ М.Ю., ДЕБАБОВ В.Г. Трансмиссибельная гибридная плазмида RP4-ColEl. Генетика. 1976, т.14, № I, с.162-166.

58. ТОМАРЕВ С.И., ГАУЗЕ Г.Г., Простая методика выделения митохонд-риальной ДНК из животных тканей. Молекул.биология. 1977, т.II, вып.2, с.440-448.

59. ФРАЙфЕЛДЕР Д. Физическая биохимия. М.: Мир, 1980.

60. ХИМИЯ и биохимия нуклеиновых кислот /Под ред.И.Б.Збарского,

61. С.С.Дебова. Л.: Медицина, 1968.

62. ШВЕЩУН Г.П. Изучение некоторых физических свойств и биологир,ческой активности Са -зависимости у возбудителей чумы и псевдотуберкулеза: Дис. . канд.мед.наук. Саратов, 1983.

63. ЯНГ у>. Технологические успехи. Введение. В кн.: Рекомби-нантше молекулы: значение для науки и практики. М., 1980, с .1519.

64. AAY С., BORST P. The gel electrophoresis of DM. Biochim. Biophys. Acta, 1972, v.269, p.197-200.

65. ADLER H.I., PISHER W.D., COHEN A., HARDIGREE A.A. Miniature Escherichia coli cells deficient in DNA. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1967, v.57, N 1, p.321-326.

66. AKIBA Т., KOYAMA K., ISHIKI Y., KIMURA S., PUKUSHIMA T. On the mechanism of the development of multiple-drug-resistant clones of Shigella. Gap.G.Microbiol., 1960, v.4, p.219-224.

67. ANDERSON E.S. Ecology and epidemiology of tranferable drug resistance. Ann.Rev.Microbiol., 1969, v.22, p.131-180.

68. ANDERSON E.S., THRELFALL E.I. The characterization of plas-mids in the enterobacteria. J.Hyg., 1974, v.72, N 3, p.471-478.

69. AP0SHIAN H.V. The use of DNA for gene therapy the need, experimental approach and implications. - Perspect.Biol.Med., 1970, v.14, p.98-108.

70. ARSATIANS R.A., DEBABOV B.T., KOZLOV Yu.J., STRONGBT A.Ya. Large-scale analytical agarose-gel electrophoretic separation of DNA. Sci.Tools, the LKB Instrument.J., 1977, v.24, N 4, p.49-53.

71. AVtfl H., BERG P.E., MARKOVITZ A. Hew mini-ColE1 as a molecular cloning vehicle. J.Bacterid., 1977, v.129, Ж 1, p.358-366.

72. BARUES W.M. Plasmid defection and sizing in single colony lysatee. Science, 1977, v. 195, IT 4276, p.393-394.

73. BASTUT M. Molecular cloning in plasmid pBR 322 giving altered expression of the tetracycline resistance gene. J.Gen.Microbiol., 1981, v.123, part 1, p.187-191.

74. BAUER W., VINOGRAD J. The interaction of closed circular ША with intercalative dyes. I The superhelix density of SV 40 DM in the presence and absence of dye. J.Mol.Biol. 1968, v.33» IT 1, p.141-171.

75. BAZARAL M., HELDTSKI D.R. Circular DM fonns of colicinogenic factors E1, E2 and E3 from Escherichia coli. J.Mol.Biol.,1968, v.36, IT 1, p. 185-194.

76. BEARD P., BERG P. A convenient micro method for the quantitation of closed circular deoxyribonucleic acid. Biochemistry, 1974, v.13, Я 11, p.2410-2413.

77. BETT-GURIOU R., HERTMAN I. Bactericine-Like material produced by Pasteurella pestis. J.Gen.Microbiol., 1958, v.19, p.289-297.

78. BM-GURION R., SHAFFERMAN A. Essential virulence determinants of different Yersinia species are carried on a common plasmid.-Plasmid, 1981, v.5, Я 2, p.183-187.

79. BERG P. Biochemical pastimes. and future times. In: Molecular cloning of recombinant DM, Hew York-San Francisco-London, Acad.Press. 1977, p.1-34.

80. BETZ J.L., SADLER J.R. Variants of a cloned synthetic lactose operator. Gene, 1981, v.13, Я 1, p.1-12.

81. BIBB M.J., FREEMAN R.F., H0PW00D D.A. Physical and genetical characterization of a second sex factor, SGP2, for Streptomyces coclicolor A3(2). Mol.Gen.Genet., 1977, v.154, Л 2, p.155-166.

82. BIRNBOIM H.C., BUYARD H. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid ША. TTucl.Acids Res., 1979, v.7, БГ 4, p.1513-1523.

83. BLAIR D.G., CLEWELL D.B., SHERAT.T D.J., HELIHSKI D.R. Strand-specific supercoiled DNA-protein relaxation complex: comparison of the complexes of bacterial plasmids ColE1 and ColE2. 3?roc. Uatl.Acad.Sci.USA, 1971, v.68, TT 1, p.210-214.

84. BLAIR D.G., SHERRATT D. J., CLEWELL D.B., HELIHSKI D.R. Isolation of supercoiled colicinogenic factor E1 DEA sensitive to ribonuclease and alcali. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1972, v.69, U 9, p.2518-2522.

85. BOLIVAR P., BACKMAIT K. Plasmids of Escherichia coli as cloning vector. Methods Enzymol., 1979, v.68, p.245-267.

86. BOLIVAR P., RODRIGUEZ R.L., GREEF P.J., BETLACH M.C., HEYHE-KER H.L., BOYER H.W. Construction and characterization of new cloning vehicles. II» A multipurpose cloning system. Gene, 1977, v.2, Я 1, p.95-113.

87. BOYCE R.P., SETLOW R.B. A simple method of increasing the incorporation of thymidine into the deoxyribonucleic acid of Escherichia coli. Biochem.Biophys.Acta, 1962, v.61, p.618-620.

88. BRAMUCCI M.G., TWIDDY E.M., ВАШЕ W.B., HOLMES R.K. Isolation and characterization of hypertoxigenic (htx) mutants of Escherichia coli KL 320(pCG 86). Inf ect. Immun., 1981, v.32, TT 3, p.1034-1044.

89. BRL 81/82 CATALOG. Bethesda Research Laboratories, Inc. -USA-FRG, 1981.

90. BRUBAKER R.R., SURGALLA M.J. Pesticin I. Pesticin-bacterium interrelationships and environmental factors influencing activity. J.Bacterid., 1961, v.82, IT 2, p.940-949.

91. BRUBAKER R.R. The genus Yersinia: biochemistry and genetics of virulence. Curr.Topics Microbiol.Immunol., 1972, v.57, p.111-158.

92. CAMPBELL A.M., Episomes. Adv.Genet., 1962, v.11, N 1, p.101-145.

93. CANNON M.C., DUNICAN L.K. The separation of plasmid and chromosomal DNA from Staphilococcus aureus using poly-L-lysine kie-selguhr columns. Biochem.Biophys.Res.Comm. 1970, v.39, IT 3, p.423-428.

94. CASSE P., BOUCHER C., JULLIOT J.S., MICHEL M., DENARIE J. Identification and characterization of large plasmids in Rhizo-bium meliloti using agarose gel electrophoresis. J.Gen.Microbiol., 1979» v.113, part 2, p.229-242.

95. CHAKRABARTY A.M. Dissociation of a degradative plasmid aggregate in Pseudomonas. J.Bacteriol. 1974, v. 118, IT 2, p.815-824.

96. CHAKRABARTY A.M., FRIELLO D.A. Dissociation and interaction of individual components of a degradative plasmid aggregated in Pseudomonas. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1974, v.71» N 7, p.3410-3419.

97. CHASSY B.M. A gentle method for the lysis of oral streptococci* Biochem.Biophys.Res.Commun., 1976, v.68, N 4, p.603-608.

98. CHASSY B.M., GIBSON E., GUIFFRIDA A. Evidence for extrachro-mosomal elements in Lactobacillus. J.Bacteriol. 1976, v.127, N 3i p.1576-1578.

99. CHANG A.C.Y., COHEN S.N. Genome construction between bacterial species in vitro: replication and expression of staphilococcus plasmid genes in Escherichia coli. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1974, v.71, N 2, p.1030-1034.

100. CHANG A.C.Y., COHEN S.N. Construction and characterization ofamplifiable multicopy DNA cloning vehicles derived from the P-j^A cryptic miniplasmid. J.Bacteriol. 1978, v.134, IT 3, p. 11411156.

101. CHEN C.W., THOMAS C.A. Recovery of ША segments from agarose gels. Anal.Biochem. 1980, v.101, p.339-341.

102. CHERVEMA C.H. A manual of methods for the analytical ultra-centrifuge. Beckman Instruments Inc., Palo Alto, California, 1973.

103. CLEWELL D.B. Nature of ColE1 plasmid replication in the presence of chloramphenicol. J.Bacteriol., 1972, v.110, IT 2, p.667-676.

104. CLEWELL D.B. , HELINSKI D.R. Supercoiled circular DTTA-protein relaxation complex in E.eoli: purification and induced conversion to an open circular ША form. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1969, v.62, IT 7, p.1159-1166.

105. CLEWELL D.B., HELINSKI D.R. Properties of supercoiled deoxyribonucleic acid-protein relaxation complex and strand specificity of the relaxation event. Biochemistry, 1970, v.9, p.4428-4440.

106. CLEWELL D.B., HELITTSKI D.R. Evidence of the existence of the colicinogenic factors E2 and E^ assupercoiled DUA-protein relaxation complexis. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1970, v.10,TT 4, p.608-613.

107. CLEWELL D.B., HELINSKI D.R. Existence of the colicinogenic factorsex factor Col IB-P9 as a supercoiled circular DNA-pro-tein relaxation complex. Biochem.Biophys.Res.Commun., 1976, v.11, IT 2, p. 150-155.

108. CLEWELL D.B., YAGI Y., BAUER B. Plasmid-detexmined tetracycline resistance in Streptococcus faecalis: evidence for geneamplification during growth in the presence of tetracycline. -Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1975, v.72, N 3, p.1720-1726.

109. CLOWES R.C. Molecular structure of bacterial plasmids. Bacterid. Rev.§ 1972, v.36, p.361-404.

110. COHEN S.N. Non-chromosomal antibiotic resistance in bacteria. Isolation of the transfer unit of R-factor R1. Proc.Natl.Acad. Sci. USA, 1970, v.67, N 2, p.510-518.

111. COHEN S.N. The manipulation genes. Sci.Am., 1975, v.233, N 1, p.11-19.

112. COHEN S.N., CHANG A.C.Y., HSU L. Nonchromosomal antibiotic resistance in bacteria: genetic transformation of Escherichia coli by R-factor DNA. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1972, v.69,N 4, p.2110-2114.

113. COHEN S.N., CHANG A.C.Y., BOYER H.W., HELLING R.B. Construction of biologically functional bacterial plasmids in vitro. Proc. Natl.Acad.Sci.USA, 1973, v.70, N 7, p.3240-3244.

114. COHEN S.N., MILLER C.A. Non-chromosomal antibiotic resistance in bacteria. Molecular nature of R-factors isolated from Proteus mirabilis arid E.coli. J.Mol.Biol., 1970, v.50, N 4, p.671-683.

115. COHEN A., FISHER W.D., CURTISS R., III, ADLER H.I. The properties of DNA transferred to minicells during conjugation. In: Cold Spring Harbor Symp.Quant.Biol., 1968, v.33, p.635-641.

116. COHEN S.N., SILVER R.P., SHARP P.A., Mc COUBREY A.E., Studies on the molecular nature of R-factors. Ann.N.Y.Acad.Sci. 1971, v.182, N 1, p.172-187.

117. COLLINS J., VOLCKAERT G., NEVERS P. Precise and nearly-precise excision of the symmetrical inverted repeats of Tn5; common features of recA-independent deletion events in Escherichia coli. -Gene, 1982, v.19, N 1, p.139-146.

118. COLMAIT A., BYER M.J., PRIMROSE S.B., LYONS A. Rapid purification of plasmid DNAs by hydroxyapatite chromatography. Eur.J. Biochem., 1978, v.91, N 1, p.303-310.

119. CONTENTE S., DUBNAU D. Marker rescue transformation bylinear plasmid DM in B.subtilis. Plasmid 1979, v. 2, IT 4, p.555-561.

120. CONTENTE S., DUBMU D. Characterization of plasmid transformation in B.subtilis. Mol.Gen.Genet. 1979, v.167, p.251-258.

121. CORNELIS G., BENNET P.M. , GR UTS TED J. Properties of pGC1, a lac plasmid originating in Yersinia enterocolitica 842. J. Bacteriol., 1971, v.127, IT 3, p.1058-1062.

122. CORITELIS P., DIGNEFFE C. , WILLEMOT K., COLSON C. Purification of Escherichia coli amplifiable plasmid by high-salt sepharose chromatography. Plasmid. 1981, v.5, N 2, p.221-223.

123. CRAMER J.H., FARRELLY F.W., BARNETT J.T., ROWND R.H. Construction and restriction endonuclease mapping of hybrid plasmidsсcontaining Saccharomyces cerevisae ribosomal DM. Mol.Gen.Genet., 1977, v.151, IT 2, p.229-244.

124. CROSA J.H., HODGES L.L., SCHIEWE M.H. Curing of a plasmid IS correlated with an attenuation of virulence in the marine fish pathogen Vibrio anguillarum. Infect.Immun., 1980, v.27, IT 3, p.897-902.

125. CROSA J.H., LUTTROP L.K., FALKOW S. Nature of R-factor replication in the presence of chloramphenicol. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1975, v.72, N 2, p.654-658.

126. CROSA J.H., SCHIEWE M.H., FALKOW S. Evidence for plasmid contribution to the virulence of the fish pathogen Vibrio anguillarum. Infect.Immun., 1977, v.18, N 2, p.509-513.

127. CURRIER T.C., NESTER E.W. Isolation of covalently closed circular DM of high molecular weight from bacteria. Anal.Biochem., 1976, v.76, p.431-441.

128. DATTA A., PARKER Ch.D., WOHLHIETER J.A., BARON L.S. Isolation and characterization of the fertility factor P of Vibrio cholerae.-J.Bacterid., 1973, v. 113, N 2, p.763-771.

129. DAVIS R.W., BOTSTEIN D., ROTH J.R. A manual for genetic engineering. New York: Cold spring Harbor Laboratory, 1980.

130. DeLAP R.J., RUSH M.G., ZOUZIAS D., KHAN S. Isolation and preliminary characterization of the small circular DNA present in african Green Monkey kidney (BSC-1) cells. Plasmid, 1978, v.1, N 4, p.508-521.

131. DEVIS R.M., SIMON M., DAVIDSON P. Electron microscope hetero-duplex methods for mapping of base sequence homology in nucleic acids. Methods Enzymol., 1971, v.21D, p.413-428.

132. DNA INSERTION elements, plasmids, and episomes /Bukhari, Shapiro, Adhya eds. Cold Spring Harbor Laboratory, 1977.

133. DRETZEN G., BELLARD M., SASSOTT-CORSI P., CHAMBON P. A reliable method for the recovery of DNA fragments from agarose and acryla-mide gels. Anal.Biochem., 1981, v.112, N 1, p.295-298.

134. DURKACZ B.W., KENNEDY C.K., SHERRATT D.J. Plasmid replication and the induced synthesis of colicins E1 and E2 in E.coli. J. Bacterid., 1974, v.117, N 2, p.940-946.

135. EBERHARD M.D., VASQUEZ C., VALENZUELA P., VICUNA R., YUDELE-VICH A. Physical characterization of a plasmid (pTT1) isolated from Thermus thermophylus. Plasmid, 1981, v.6, N 1, p.1-6.

136. ECKHARDT Th. A rapid method for identification of Plasmid deoxyribonucleic acid in bacteria. Plasmid, 1978, v.1, N 4, p.584-588.

137. EL-GEWELY M.R., HELLING R.B. Preparative separation of DNA-ethydium bromide complexes by zonal density gradient centrifuga-tion. Anal.Biochem. 1980, v.102, N 2, p.423-428.

138. ENGER-VALK B.E., HEYNEKER H.L., OOSTERBAAN R.A., POUWELS P.H. Construction of new cloning vehicles with genes of the tryptophan operon of Escherichia coli as genetic markers. Gene, 1980, v.9, N 1-2, p.69-85.

139. FALKOW S. Infectious multiple drug resistance. London, Pion Limited Co., 1975.

140. FALKOW S., CITARELLA R.V. Molecular homology of F-merogenote DNA. J.Mol.Biol., 1965, v.12, N 1, p.138-151.

141. FALKOW S., CITARELLA R.V., WOHLHEITER J.A., WATANABE T. The molecular nature of R-factors. J.Mol.Biol., 1966, v.17, N 1, p.102-116.

142. FALKOW S., WOHLHEITER J.A., CITARELLA R.V., BARON L.S. Transfer of episomic elements to Proteus. I Transfer of F-linked chromosomal determinants. J.Bacteriol., 1964, v.87, N 1, p.209-219.

143. FANGMAN W.L. Separation of very large DNA molecules by gel electrophoresis. Nucl.Acid Res. 1978, v.5, N 2, p.653-666.

144. FERBER D.M., BRUBAKER R.R. Mode of action of pesticin: N-ace-tylglucosaminidase activity. J.Bacteriol., 1979, v.139, N 2, p.495-501.

145. FERBER D.M., BRUBAKER R.R. Plasmids in Yersinia pestis. Infect. Immun., 1981, v.31, N 2, p.839-841.

146. FIETTA A., GRAITDI G., MALCOVATI M., VALEHTITTI G., SGAMARELLA V., SICCARDI A.G. R-factor-mediated suppression of the galactose-sensitive phenotype of Escherichia coli K-12 gal E mutants. -Plasmid, 1981, v.6, IT 1, p.78-85.

147. РШКЕЬБТЕШ M., ROWHD R.H. A rapid method for extracting ША from agarose gels. Plasmid, 1978, v.1, TT 4, p.557-562.

148. FREIFELDER D. Studies on Escherichia coli sex factors. III. Covalently closed F'lac ША molecules. J.Mol.Biol., 1968, v.34, Я 1, p.31-38.

149. FREIPELDER D. Isolation of extrachromosomal ША from bacteria* Methods Enzymol., 1970, v.21, p.153-168.

150. FREIFELDER D., FOLKMANIS A., KIRSHNER I. Studies on Escherichia coli sex factors: evidence that covalent circles exist within cells and the general problem of isolation of covalent circles.-J.Bacterid., 1971, v. 105, IT 2, p.722-727.

151. FREIFELDER D.R., FREIFELDER D. Studies on Escherichia coli sex factor. I. Specific labeling of F'lac DITA. J.Mol.Biol., 1968, v.32, N 1, p.15-24.

152. FREIFELDER D.R., FREIFELDER D. Studies on Escherichia coli sex factor. II. Some physical properties of F'lac DITA and F DTTA.-J.Mol.Biol., 1968, v.32, IT 1, p.25-35.

153. GALIBERTF., SEDAT S., LIFF E. Direct determination of DITA nucleotide sequences: structure of a fragment of bacteriophage ф x 174 DTI A. J.Mol.Biol., 1974, v.87, Я 1, p. 377-407.

154. GAUTIER F., MAYER H., GOEBEL W. Cloning of calf thymus satellite I DITA in Escherichia coli. Mol.Gen.Genet., 1976, v. 149, IT 1, p. 23-31.

155. GEMSKI P., LAZERE J.R., CASEY T.A plasmid associated with pathogenicity and calcium dependency of Yersinia enterocolitica. -Infect.Immun. 1980, v.27, IT 2, p.682-685.

156. GEMSKI P., LAZERE J.R., CASEY Т., WOHLHIETER J.A. Presence of a virulence-associated plasmid in Yersinia pseudotuberculosis.-Infect.Immun. 1980, v.28, N 3, p.1044-1047.

157. GENNARO M.L., GREENAWAY P.J., BROADBENT D.A. The expression of biologically active cholera toxin in Escherichia coli. -Nucl.Acids Res., 1982, v.10, IT 16, p.4883-4890.

158. GLASSMAN D.L., Mc NICOL L.A. Plasmid frequency in natural populations of estuarine microorganisms. Plasmid, 1981, v.5,N 2, p.224-231.

159. GOEDDEL D.V., KLEID D.G., BOLIVAR P., HEYTTEKER H.L., YANSURA

160. D.G., CREA R., HIROSE Т., KBASZEWSKI A., ITAKURA K., RIGGS A.D. Expression in Escherichia coli of chemically synthesized genes for human insulin. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1979, v.76, N 1, p.106-110.

161. GOEDDEL D.V., SHEPARD H.M., YELVERTON E., LEUNG D., CREA R., SLOMA A., PESTKA S. Synthesis of human fibroblast interferon by

162. GODSON G.1T., SINSHEIMER R.L. Lysis of Escherichia coli witha neutral detergent. Biochim.Biophys.Acta, 1967, v.149, p.476-489.

163. GONZALEZ J.M., Jr., CARLTON B.C. Patterns of plasmid DNA in crystalliferous and acrystalliferous strains of Bacillus thurin-giensis. Plasmid, 1980, v.3, N 1, p.92-98.

164. GRANDI G., MOTTES M., SGAMARELLA V. Specific pattern of instability of E.coli His G gene cloned in Bacillus subtilis via the Staphylococcus aureus plasmid pCS 194. Plasmid, 1981, v.6, N 1, p. 99-111.

165. GREEN P.J., BETLACH M.C., BOYER W.H., CHARTER Y. The EcoRl restriction endonuclease. Methods Mol.Biol., 1974, v.7, N 1, p.87-94.

166. GRINSTED J., SAUNDERS J.R., INGRAM L.C., SYKES R.B., RICHMOND M.H. Properties of an R-factor which originated in Pseudomonas aeruginosa 1882. J.Bacterid., 1972, v.110, N 2, p.529-537.

167. GUERRY P., Le BLANC D.J., FALKOW S. General method for the isolation of plasmid deoxyribonucleic acid. J.Bacterid., 1973, v.116, N 2, p.1064-1066.

168. GUNGE N., TAMARU A., OZAWA F., SAKAGUCHI K. Isolation and characterization of linear deoxyribonucleic acid plasmids from Kluy-veromyces lactis and the plasmid-associated killer character. -J.Bacterid., 1981, v. 145, N 1, p.382-390.

169. HAMER D.H., THOMAS Ch.A. Molecular cloning of DNA fragments produced by restriction endonucleases Sail and BamHl. Proc. Natl.Acad.Sci. USA, 1976, v.73, N 5, p.1537-1541.

170. HANGGI U.J., ZACHAU H.G. Isolation and characterization of DNA fragments containing the dihydrofolateceductase gene of coliphage T4. Gene, 1980, v.9, N 3-4, p.271-285.

171. HANSEN J.В., OLSEN R.H. Isolation of large bacterial plasmids and characterization of the P2 incompatibility group plasmidspMG1 and pMG5. J.Bacterid., 1978, v.135, N 1, p.227-238.

172. HARDY K.G. Colicinogeny and related phenomena. Bacterid.Rev., 1975, v.39, N 4, p.464-515.

173. HELLING R.B., GOODMAN H.M., BOYER H.W. Analysis of endonucle-ase R.EcoRI fragments of DNA from lambdoid bacteriophages and other viruses by agarose gel electrophoresis. J.Virol., 1974, v.14, N 3, p.1235-1244.

174. HERSHFIELD V., BOYER H.W., YANOFSKY Ch., LOVETT M.A., HELITTSKI D.R. Plasmid ColE1 as a molecular vehicle for cloning and amplification of DNA. Proc.Nat1.Acad.Sci. USA, 1974, v.71, N 9, p.3455-3459.

175. HERTMAN I., BEN-GURION R. A study on pesticin biosynthesis. -J.Gen.Microbiol., 1959, v.21, N 1, p.135-143.

176. HICKSON F.T., ROTH Т.Е., HELINSKI D.R. Circular foiras of a bacterial sex factor. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1967, tf. 58, N 4, p.1731-1738.

177. HIRT B. Selective extraction of polyoma DNA from infected mouse cell cultures. J.Mol.Biol., 1967, v.26, N 3, p.365-369.

178. HU P.С., BRUBAKER R.R. Characterization of pesticin. Separation of antibacterial activities. J.Biol.Chem., 1974, v.249, N 15, p.4749-4753.

179. HU P.O., YANG G.C.H., BRUBAKER R.R. Specifity, induction and absorbtion of pesticin. J.Bacterid., 1972, v. 112, TT 1, p.212-219.

180. HUGHES C., MEYNELL G.G. Rapid screening for plasmid DNA. Mol. Gen.Genet., 1977, v.151, N 1, p.175-179.

181. HUMPHREYS G.O., WILLSHAW G.A., ANDERSON E.S. A sinple method for the preparation of large quantities of pure plasmid DNA. -Biochim.Biophys.Acta, 1975, v.383, p.457-463.

182. GRAM L., SYKES R.B., GRINSTED J., SAUNDERS J.R., RICHMOND M.H. A transmissible resistant element from a strain of Pseudomonas aeruginosa containing no detectable extrachromosomal DNA.-J.Gen.Microbiol., 1972, v.72, N 2, p.269-279.

183. SELBURG J. Segregation into and replication of plasmid deoxyribonucleic acid in chromosomeless segregants of Escherichia coli. J.Bacteriol., 1970, v.102, N 2, p.642-647.

184. SELBURG J. R factor deoxyribonucleic acid in chromosomeless progeny of E.coli. J.Bacteriol., 1971, v.105, N 2, p.620-628.

185. SELBURG J., PUKE M. Replicating DNA: structure of colicin factor E1. Science, 1970, v.169, p.590-592.

186. RDANESCU S. Relationships between cotransducible plasmids in Staphylococcus aureus. J.Bacteriol., 1977, v.129, N 1, p.71-75.

187. AKURA R., HIROSE Т., CREA R., RIGGS A.D., HEYNEKER H.L., BOLIVAR P., BOYER H.W. Expression in Escherichia coli of a che-micall synthesised gene for hormone somatostatin. Science, 1977, v.198, p.1056-1063.

188. JACOB A.E., GRINTER N.J. Plasmid RP4 as a vector replicon in genetic engineering. -Nature (Lond.), 1975, v.255, p.504-505.

189. JAY G., CHIRIKJAN J.G. Sequence-specific endonuclease BaraHI: relaxation of sequence recognition. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1982, v.79, N 8, p.2432-2436.

190. JOHNSON P.H., MILLER M.J., GROSSMAN L.J. Electrophoresis of DNA in agarose gels. II. Effect of loading mass and electroendo-osmos on electrophoretic mobilities. Anal.Biochem., 1980, v.102, N 1, p.159-162.

191. JORGENSEN R.A., ROTHSTEIN S.J., RESNIKOFF W.S. A restriction enzyme cleavage map of Tn5 and location of a region encoding neomycin resistance. Mol.Gen.Genet., 1979, v.177, N 1, p.65-72.

192. KADO C.I., LIU S.-T. Rapid procedure for detection and isolation of large and small plasmids. J.Bacterid., 1981, v.145, v.3, p.1365-1373.

193. КАЮТ M., COLTER R., THOMAS Ch., FIGURSKI D., MEYER R., REMAUT E., HELINSKI D.R. Plasmid cloning vehicles derived from plasmids ColE1, F, R6K and RK2. Methods Enzymol. 1979, v.68, p.268-280.

194. KAISER A.D., 1ШАЗТ R.B. Cohesion and the biological activity of bacteriophage ША. J.Mol.Biol., 1965, v.13, N 1, p.78-91.

195. KAPER J.В., MOSELEY S., FALKOW S. Molecular characterization of environmental and nontoxigenic strains of V.cholerae. Infect.Immun. , 1981, v.32, IT 2, p.661-667.

196. KASS L.R., YARMOLINSKY M.B. Segregation of a functional sex factor into minicells. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1970, v.66, IT 2, p.815-822.

197. KAY B.A., WACHSMUTH K., GEMSKI P. New virulence-associated plasmid in Yersinia enterocolitica. J.Clin.Microbiol., 1982, v.15, N 6, p.1161-1163.

198. KELLY T.J., SMITH H.O. A restriction enzyme from Haemophylus influenzae. II. Base sequence of the recognition site. J.Mol. Biol., 1970, v.51, p.393-409.

199. KINGSBURY D.T., HELINSKI D.R. Temperature-sensitive mutants for the replication of plasmids in E.coli: requirement for deoxyribonucleic acid polymerase I in the replication of the plasmid Col E1. J.Bacteriol., 1973, v.114, IT 3, p.1116-1124.

200. KIRBY K.S. Isolation of deoxyribonucleic acid. Biochem.J. 1957, v.66, IT 2, p.495-503.

201. KLINE B.C., MILLER J.R. Detection of nonintegrated plasmid deoxyribonucleic acid in the folded chromosome of E.coli: phy-sicochemical approach to studying the unit of segregation. J. Bacteriol., 1975, v.121, N 1, p.165-172.

202. KLINE B.C., MILLER J.R., CRESS D.E., WLODARCZYK M., MANIS J.J., OTTEN M.R. NOnintegrated plasmid-chromosome complexes in Escherichia coli. J.Bacteriol., 1976, v.127, N 2, p.881-889.

203. KLEIN R.D., SELSING E., WELLS R.D. A rapid microscale technique for isolation of recombinant plasmid DNA suitable for restriction enzyme analysis. Plasmid, 1980, v.3, N 1, p.88-91.

204. KONTOMICHAILOU P., MITANI M., CLOWES R.C. Circular R-factor molecules controlling penicillinase synthesis, replicating in Escherichia coli under either relaxed or stringent control. -J.Bacteriol., 1970, v.104, v.1, p.34-44.

205. KOZLOV Yu.I., GENING L.B., STRONGIN A.Ya., DEBABOV B.G. A simple method for phage or plasmid DNA's isolation suitable as a "screening test" after molecular cloning. Anal.Biochem., 1978,v.86, N 1, p.316-319.

206. KOZLOV Yu.I., KALININA N.A., GENING L.V., REBENTISH B.A., STRONGIN A.Y., BOGUSH V.G., DEBABOV V.G. A suitable method for construction and cloning hybrid plasmids containing EcoRI-frag-ments of E.coli genome. Mol.Gen.Genet., 1977, v.150, N 2, p.211-219.

207. KRETSCHMER P.J., CHANG A.C.Y., COHEN S.N. Indirect selection of bacterial plasmids lacking identifiable phenotypic properties.-J.Bacteriol., 1975, v.124, N 1, p.225-231.

208. MPROM H., SARABHAI A., ABELSОЯ J. Cloning of Beneckea genes in Escherichia coli. J.Bacterid., 1978, v.133, Я 1, p.354-363.

209. NGRIDGE J., LAFTGRIDGE P., BERQUIST P.L. Extraction of nucleic acids from agarose gels. Anal.Biochem., 1980, v.103, Я 1, p.264-271.

210. VY S.B. Resistance of minicells to penicillin lysis: a method for obtaining large quantities of purified minicells. J. Bacterid., 1970, v.103, Я 2, p.836-839.

211. VY S.B. Physical and functional characteristics of R-factor deoxyribonucleic acid segregated into E.coli minicells. J.Bacterid. , 1971, v.108, Я 1, p.300-308.

212. VY S.B. Studies on R-factors segregated into E.coli mini-cells. Ann.N.Y.Acad.Sci., 1971, v.182, Я 1, p.217-225.

213. VY S.B., ЯОНМАЯ P. Segregation of transferable R-factors into E.coli minicells. Яа^ге (London), 1970, v.227, p.606-607.

214. EBSCHER D.-H., COUTELLE Ch., RAPOPORT T.A., НАНЯ V., ROSEtt-TAL S., PREfflT S., WILLIAMSON R. Cloning of carp preproinsulin с-ША in the bacterial plasmid pBR 322. Gene, 1980, v.9,Я 3-4, p.233-246.

215. S J.Т., SCHLEIF R. Size fractionation of double-stranded БЯА by precipitation with polyethylene glycol. Яис1.Acids Res., 1975, v.2, Я 1, p.383-389.

216. TTLE R.V., BRUBAKER R.R. Characterization of deoxyribonucleic acid from Yersinia pestis by ethidium bromidcesiumchloride density gradient centrifugation. Infect.Immun., 1972, v.5, Я 4, p.630-632.

217. VETT M.A., HELmSKI D.R. Method for the isolation of the replication region of a bacterial replicon: construction of a mini-F'km plasmid. J.Bacterid., 1976, v.127, Я 2, p.982-987.

218. VETT P.S., KEGGITTS K.M. Bacillus subtilis as a host for molecular cloning. Methods Enzymol., 1979, v.68, p.342-357.

219. RIA S.E., HUMAN M.L. A non-hereditary, host-induced variation of bacterial viruses. J.Bacteriol., 1952, v.64, N 2,p.557-569.

220. RQUIN P.P., KADO C.I. Escherichia coli plasmid pKR 313 insertion into plant protoplasts and into their nuclei. Mol.Gen. Genet., 1977, v.154, IT 1, p.113-121.

221. MALYGUINE E., VANNIER P., YOT P. Alteration of the specificity of restriction endonucleases in the presence of organic solvents.-Gene, 1980, v.8, IT 2, p. 163-177.

222. MAITDEL M., HIGA A. Calcium dependent bacteriophage ША infection. J.Mol.Biol., 1970, v. 53, IT 1, p.159-162.

223. MANDEL M., MARMUR J., Use of ultraviolet absorbancetemperature profile for determining the guanine plus cytosine content of ШАт Methods Enzymol., 1967, v.12B, p.195-206.

224. MAUTS J.J., КЫТТЕ B.C. Restriction endonuclease mapping and mutagenesis of the P sex factor replication region. Mol.Gen. Genet., 1977, v.152, IT 2, p.175-182.

225. MARMUR J. A procedure for the isolation of deoxyribonucleic acid from micro-organism. J.Mol.Biol., 1961, v.3, IT 1, p.208-218.

226. MARTIAL J.A., HALLEWELL R.A., BAXTER J.D., GOODMAN H.M.Human growth hormone: cloning and expression in bacteria. Science, 1979, v.205, p.602-607.

227. MATTHYSSE A.G., STUMP A.J. The presence of Agrobacterium tu-mefaciens plasmid DNA in crown gall tumour cells. J.Gen.Microbiol., 1976, v.95, N 1, p.9-16.

228. MEKALANOS J.J., MOSELEY S.L., MURPHY J.R., FALKOW S. Isolationof enterotoxin structural gene deletion mutations in Vibrio cho-lerae induced by two mutagenic vibriophages. Proc.Hat1.Acad. Sci. USA, 1982, v.79, N 1, p.151-155.

229. MESSING J., Protocol for the application of the single-stranded DNA phage И13 mp2 as a cloning vehicle. Davis, California, 1980.

230. MEYER R., PIGURSKI D., HELINSKI D.R. Physical and genetic studies with restriction endonucleases on the broad host-range plasmid RK2. Mol.Gen.Genet., 1977, v.152, N 1, p.129-135.

231. MEYERS J.A., SANCHEZ D., ELWELL L.P., FALKOW S. Simple agarose gel electrophoretic method for the identification and characterization of plasmid deoxyribonucleic acid. J.Bacterid., 1976, v.127, N 3, p.1529-1537.

232. MICKEL S., ARENA V., BAUER W. Physical properties and gel electrophoresis behavior of R-derived plasmid DNAs. TTucl.Acid Res., 1977, v.4, N 3, p.1465-1482.

233. MILLER J.R., KLINE B.C. Biochemical characterization of no-nintegrated plasmid-folded chromosome complexes: sex factor P and the Escherichia coli nucleoid. J.Bacterid., v.137, 1979, N 2, p.885-890.

234. MORROW J.P. Recombinant DNA techniques. Methods Enzymol., 1979, v.68, p.3-24.

235. MORROW J.P., COHEN S.N., CHANG A.C.Y., BOYER H.W., GOODMAN H.M., HELLING R.B. Replication and transcription of eucaryotic DNA in Escherichia coli. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1974, v.71, N 4, p.1743-1747.

236. MOSELEY S.L., HUG I., ALIM A.R.M.A. SO M., SAMADPOUR-MOTALEBI, FALKOW S. Detection of enterotoxigenic E.coli by DNA colony gib-ridization. J.Infect.Dis., 1980, v.142, N 6, p.892-898.

237. NAYUDU M., HOLbOWAY B.W. Isolation and characterization of R-plasmid variants with enhanced chromosomal mobilization ability in Escherichia coli K-12. Plasmid, 1981, v.6, N 1, p.53-66.

238. NEGORO S., SHINAGAWA H., NACATA A., KINOSHITA Sh., HATOZAKI Т., OKADA H. Plasmid control of 6-aminohexanoic acid cyclic dimer degradation enzymes of Plavobacterium sp.K 172. J.Bacteriol.,1980, v. 143» N 1, p.238-245.

239. NORGARD M.V. Rapid and simple remuval of contaminaiting ЮГА from plasmid ША without the use of RNA-ase. Anal.Biochem.,1981, v.113, p.34-42.

240. NOVICK R.P., BOUANCHAUD D. Ext rachromo somal nature of drug resistance in Staphylococcus aureus. Ann.N.Y.Acad.Sci., 1971, v.182, p.279-294.

241. NOVICK R., MAAS W.K., Control by endogenously synthesised arginin of the formation of ornithine transcarbomylase in Escherichia coli. J.Bacteriol., 1961, v.81, IT 2, p.236-240.

242. OLSSOTT R., HENTSCHEb C.C., WlbLIAMS J.G. A rapid method for the isolation of circular DNA using an aqueous two-phase partition system. Nucl.Acids Res., 1978, v.5, IT 2, p.583-590.

243. PALCHAUDHURI S., CHAKRABARTY A. Isolation of plasmid deoxyribonucleic acid from Pseudomonas putida. J.Bacteriol., 1976, v.126, IT 1, p.410-416.

244. PEARSON G.D.N., MEKALANOS J.J. Molecular cloning of Vibrio cholerae enterotoxin genes in Escherichia coli. Proc.Natl.

245. Acad.Sci.USA, 1982, v.79, IT 9, p.2976-2980.

246. PEMBERTON J.M., CLARK A.J. Detection and characterization of plasmid in Pseudomonas strain РАО. J.Bacterid., 1973, v.114, IT 1, p.424-433.

247. PETTIJOHIT D.E., PFENNINGER 0. Supercoils in procaryotic DNA restrained in vivo. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1980, v.77, N 3, p.1331-1335.

248. PLASMIDS. Medical and theoretical aspects /Mitsuhashi, Rosival, Krcmery eds. Prague: Avicenum Medical Press. Berlin, Heidelberg, New-Jork: Springer Verlag, 1977.

249. PORTNOY D.A., FALKOW S. Virulence-associated plasmid from Yersinia enterocolitica and Yersinia pestis. J.Bacterid.,1981, v. 148, IT 3, p.877-883.

250. PRIMROSE S.B., EHRLICH S.D. Isolation of plasmid deletion mutants and study of their instability. Plasmid, 1981, v.6, N 2, p.193-201.

251. PR0UDF00T N.J., BaRALLE F.E. Molecular cloning of human -globin gene. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1979, v.76, N 11, p.5435-5439.

252. PURCHIO A.F., FAREED G.C. Methods for molecular cloning in eukaryotic cells. Methods Enzymol. 1979, v.68, p.357-375.

253. RADLOFF R., BAUER W., VINOGRAD J. A dye-buoyant density method for the detection and isolation of closed circular duplex DNa: the closed circular DNA in HeLa cells. Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 1967, v.57, N 3, p.1514-1521.

254. RANHAND J.M. A simple method for the qualitative determination of large and small plasmid deoxyribonucleic acids in gram-negative and gram-positive bacteria. Anal.Biochem., 1982, v.122, p.426-432.

255. RAO R.N., ROGERS S.G. Plasmid pKC7: a vector containing ten restriction endonuclease sites suitable for cloning ША segments. Gene, 1979, v.7, N 1, p.79-82.

256. ROBERTS R.J. Restriction endonucleases. CRC Crit.Rev.Biochem., 1976, v.4, p.123-164.

257. ROBERTS R.J. Restriction and modification enzymes and their recognition sequences. Nucl.Acids, Res., 1982, v.10, IT 5, p.117-144.

258. ROBINSON J.H., LANDY A., Hind II, Hind III, and Hpa restriction fragment maps of bacteriophage Л DNA. Gene, 1977, v.2, N 1, p.1-31.

259. ROOZEN K.J., FENWICK R.G., Jr., CURTISS R., III. Sinthesis of ribonucleic acid and protein in plasmid-containing minicells of E.coli. J.Bacteriol., 1971, v.107, N 1, p.21-33.

260. ROOZEN K.J., FENWICK R.G., Jr., CURTISS R., III. Isolation of plasmids and specific chromosomal segments from Escherichia coli K-12. In: Informative molecules in biological systems. Amsterdam, North-Holland publishing Co., 1971, p.249-264.

261. ROTH Т.Е., HELINSKI D.R. Evidence for circular forms of a bacterial plasmids. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1967, v.58, N 2, p.650-657.

262. ROWND R.H. Plasmid replication. In: DNA synthesis: present and future. New York, Plenum Publ. Co., 1978, p.751-771.

263. ROWND R., NAKAYA R., NAKAMURA A. Molecular nature of thedrug-resistance factors of the Enterobacteriaceae. J.Mol.Biol., 1966, v.17, N 2, p.376-393.

264. RUBENS C.E., FARRAR W.E., Mc GEE Z.A., SCHAFFNER W. Evolution of a plasmid mediating resistance to multiple antimicrobal agents during a prolonged epidemic of nosocomial infections. J.Infect. Dis., 1981, v.143, N 2, p.170-181.

265. RUSH M.G., WARNER R.C. Alkali denaturation of covalently-closed circular duplex DNA. J.Biol.Chem., 1970, v.245, p.2704-2708.

266. SADLER J.R., TECKLENBURG M. Cloning and characterization of the natural lactose operator. Gene, 1981, v.13, N 1, p.13-23.

267. SCAIFE I. Episomes. Ann.Rev.Microbiol. 1967, v.21, p.601-638.

268. SCHEER-ABRAMOWITZ J., GRYCZAN T.J., DUBNAU D. Origin and mode of replication of plasmids pE 194 and pUB 110. Plasmid, 1981, v.6, N 1, p.67-77.

269. SCIAKY D., MONTOYA A.L., CHILTON M.D. Fingerprint of Agrobac-terium Ti plasmids. Plasmid, 1978, v.1, N 2, p.238-253.

270. SHAFFERMAN A., COHEN S., FLASHNER Y. A DNA segment within the colicin E1 structural gene on Col E1 affecting immunity to coli-cin. Mol.Gen.Genet., 1978, v.164, N 2, p.259-264.

271. SHOYAB M., SEN A. The isolation of extrachromosomal DNA by hydroxyapatite chromatography. -Methods Enzymol., 1979, v.68, p.199-206.

272. SHARP P.A., HSU M.J., OHTSUBO E., DAVIDSON N. Electron microscope heteroduplex studies of sequence relations among plasmids of E.coli. J.Mol.Biol., 1972, v.71, N 3, p.471-497.

273. SHARP P.A., SUGDEN B., SAMBROOK J. Detection of two restriction endonuclease activities in Haemophylus parainfluenza usinganalytical agarose-ethidium bromide electrophoresis. Biochem., 1973, v.12, p.3055-3063.

274. SMITH H.O., WILCOX K.W. A restriction enzyme from Haemophylus influenzae. I. Purification and general properties. J.Mol.Biol., 1970, v.51, IT 3, p.379-391.

275. SO M., BOYER H.W., BETLACH M., FALKOW S. Molecular cloning of an Escherichia coli plasmid determinant that encodes for the production of heat-stabile enterotoxin. J.Bacterid., 1978, v.133, N 1, p.172-177.

276. SO M., CROSA J.H., FALKOW S. Polynucleotide sequence relationships among Ent plasmids and the relationship between Ent and other plasmids. J.Bacteriol., 1975, v.121, N 1, p.234-238.

277. SO M., DALLAS W.S., FALKOW S. Characterization of an Escherichia coli plasmid encoding for synthesis of heatlabile toxin: molecular cloning of the toxin determinant. Infect.Immun., 1978, v.21, N 2, p.405-411.

278. SOUTHERN E. Gel electrophoresis of restriction fragments. -Methods Enzymol., 1979, v.68, p.152-176.

279. STINCHCOMB D.T., THOMAS M., KELLY J., SELKER E., DAVIS R.W. Eucaryotic DNA segments capable of autonomous replication in yeast. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1980, v.77, N 8, p.4559-4563.

280. STONINGTON O.G., PETTIJOHN D.E. The folded genome of E.coli isolated in a protein-DNA-RJTA complex. Proc.Natl.Acad.Sci., USA, 1971, v.68, N 1, p.6-9.

281. STRONGIN A.Ya., KOZLOV Yu.I., DEBABOV B.G., ARSATIANS R.A., ZLOCHEVSKY M.L. A reliable technique for large-scale DNA separation. Anal.Biochem., 1977, v.79, p.1-10.

282. SUTCLIFFE J.G. pBR -322 restriction map derived from the DNA sequence: accurate DNA size markers up to 4361 nucleotide pairslong. Nucl.Acids.Res., 1978, v.5, p.2721-2728.

283. SUTCLIFFE J.G., Complete nucleotide sequence of the Escherichia coli plasmid pBR 322. In: Cold Spring Harb.Symp.Quant. Biol. 1979, v.43, p.77-90.

284. SUTCLIFFE J.G., AUSUBEL P.M. Plasmid cloning vectors. In: Genetic Engineering, Boca Raton, Fla, 1979, p.83-111.

285. TABAK H.P., FLAVELIi R.A. Method for recovery of DM from agarose gels. Nucl.Acids Res., 1978, v.5, p.2321-2322.

286. TEATHER R.M., MULLER-HILL B., ALBRUTSCH U., AICHELE G., 0VE-RATH P. Amplification of the lactose carrier protein in E.eoli using a plasmid vector Mol.Gen.Genet. 1978, v.159, N 2, p.239-248.

287. TELPORD J., BOSELEY P., SCHAFFNER W., BIRSTIEL M. Novel screening procedure for recombinant plasmids. Science, 1977, v.195, p.391-395.

288. TIMMIS K., CABELLO F., COHEN S.N., Cloning isolation and characterization of replication regions of complex. Proc.Natl. Acad.Sci. USA, 1975, v.72, N 6, p.2242-2246.

289. THOMAS M., DAVIS R.W. Studies on the cleavage of bacteriophage lambda DNA with EcoRl restriction endonuclease. J.Mol.Biol., 1975, v.91, N 2, p.315-328.

290. THOMPSON R., HUGHES S.G., BRODA P. Plasmid identification using specific endonucleases. Mol.Gen.Genet., 1974, v.133, N 1, p.141-149.

291. THURING R.W.L., SANDERS J.P.M., BORST P. A freeze-squeeze method for recovering long DNA from agarose gels. Anal.Biochem., 1975, v.66, p.213-220.

292. ULRICH A., SHIN J., CHIRGUIN J., PICTET R., TISCHER E., RUTTER W.J., GOODMAN H.M. Rat insulin genes: construction of plasmidscontaining the coding sequences. Science, 1977, v.196, p.1313-1319.

293. VAN EMBDEN J.D.A., VAN LEEUVEN W.J., GUINEE P.A.M. Interference with propagation of typing bacteriophages by extrachromo-somal elements in Salmonella typhimurium: bacteriophage type 505.-J.Bacterid., 1976, v.127, N 3, p.1414-1426.

294. VILLA-KOMAROFF L., EFSTRATIADIS A., BROOM S., LOMEDICO P., TIZARD R., NABER S.P., CHICK W.L., GILBERT W.A. A bacterial clone synthesizing proinsulin. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1978, v.75, N 8, p.3727-3731.

295. VINOGRAD J., LEBOVITZ J., RADLOFF R., WATSON R., LAIPIS P. The twisted circular form of polyoma viral DNA. Proc.Natl.Acad. Sci. USA, 1965, v.53, N 3, p.1104-1111.

296. VOGELSTEIN В., GILLESPIE D. Preparative and analytical purification of DNA from agarose. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1979, v.76, N 2, p.615-619.

297. WATANABE T. The origin of R factors. Ann.N.Y.Acad. Sci., 1971, v.182, N 1, p.126-141.

298. WATSON В., CURRIER T.C., GORDON M.P., CHILTON M., NESTER E.W. Plasmid required for virulence of Agrobacterium tumefaciens. -J.Bacteriol., 1975, v.123, N 1, p.255-264.

299. WATSON R., VISENTIN L.P. Restriction endonuclease mapping of ColE2-P9 and ColE3-CA38 plasmids. Gene, 1980, v.10, N 4, p.307-318.

300. WEIL R., VINOGRAD J. The cyclic helix and cyclic coil forms of polyoma viral DNA. Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 1963, v.50, N 2, p.730-738.

301. WEISSMAN C., BOLL W. Reduction of possible hazards in the preparation of recombinant plasmid DNA. Nature (London), 1976, v.261, p.428-429.

302. WELCH R.A., MACRINA F.L. Physical characterization of Bacte-roides fragilis R plasmid pBF4. J.Bacterid., 1981, v.145,IT 2, p.867-872.

303. WETZEL R., PERRY L.J., ESTELL D.A., LUT ТТ., LEVIITE H.L., SLI1TKER В., FIELDS F., ROSS M.J., SHIVELY J. Properties of a human alpha-interferon purified from E.coli extracts. J.Interferon Res., 1981, v.1, p.381-390.

304. WIESLA3TDER L. A simple method to recovery intact high molecular weight RITA and DTTA after electrophoretic separation in low gelling temperature agarose gels. Anal.Biochem. 1979, v.98, p.305-309.

305. WILLSHAW G.A., BARGLAY E.A., SMITH H.R., Mc COUTTELL M.M., ROME B. Molecular comparison of plasmids encoding heat-labile enterotoxin isolated from E.coli strains of human origin. J. Bacteriol., 1980, v.143, IT 1, p.168-175.

306. WOMBLE D.D., ROWND R.H. Effects of chloramphenicol and rifam-picin on the replication of R plasmid 1TR1 deoxyribonucleic acid in Escherichia coli. Plasmid., 1979, v.2, IT 1, p.79-94.

307. WOMBLE D.D., ROWTTD R.H., Replication of plasmids in mutantB of Escherichia coli temperature-sensitive for initiation of deoxyribonucleic acid synthesis. Plasmid. 1979, v.2, TI 1, p.95-108.

308. WORCEL A., BURGI E. On the structure of the folded chromosome of Escherichia coli. J.Mol.Biol., 1972, v.71, IT 1, p.127-147.

309. YA1TG R.C.-A., LIS J., WU R. Elution of DTTA from agarose gelsafter electrophoresis. Methods Enzymol., 1979, v.68, p.176-182.

310. ZAENEN I., VAN LAREBEKE N., TEUCHY H., VAN MONTOGU M., SCHELL J. Supercoiled circular DNA in crown gall inducing Agrobacterium strains. J.Mol.Biol., 1974, v.86, N 1, p.109-127.

311. ZADRAZIL S., SATAVA J., SORMOVA Z. Isolation procedure for bacterial DNA based on gel permeation chromatography on a sepha-rose column. J.Chromatogr., 1973, v.91, p.451-458.

312. ZASLOFF M., GINDER G.D., FELSENFELD G. A new method for the purification and identification of covalently closed circular DNA molecules. Nucl.Acids.Res., 1978, v.5, N 4, p.1139-1151.