Конструирование плазмидных векторов для изучения пренилирования белков возбудителя туляремии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.06, кандидат биологических наук Маракасова, Екатерина Семеновна
Маракасова, Екатерина Семеновна
кандидат биологических наук
2013
- Специальность ВАК РФ03.01.06
- Количество страниц 151
Оглавление диссертации кандидат биологических наук Маракасова, Екатерина Семеновна
Оглавление
Введение
1. Обзор литературы
1.1. Туляремия
1.2. Механизм инфекционного процесса, вызываемого ЕгапсгяеНа
1.3. Липидные посттрансляционные модификации и методы их изучения
1.4. Пренилирование
1.4.1. Механизм ирснилирования
1.4.2. Предсказание пренилирования белков
1.4.3. Пренилирусмые белки эукариот
1.4.4. Белки патогенных микроорганизмов, пренилирусмые в клетках эукариот
1.4.5. Небелковое пренилирование у бактерий
1.5. Ингибиторы пренилирования
1.6. Заключение
2. Материалы и методы исследований
2.1. Бактериальные штаммы, плазмиды и условия культивирования
2.2. ДНК манипуляции и клонирование
2.3. Трансформация бактерий
2.4. Оценка дефективности роста бактерий
2.5. Биоинформатические методы и статистика
2.6. Культура клеток и условия культивирования
2.7. Трансфекция эукариотических клеток
2.8. Подсчет количества клеток
2.9. Инфекция эукариотических клеток, оценка способности бактерий инфицировать и размножаться внутри эукариотических клеток
2.10. Лизис клеток
2.11. Определение концентрации белка
2.12. Электрофорез в ПААГ и иммуноблотинг
2ЛЗ. Окраска ПААГ
2.14. Очистка и концентрирование белковых фракций
2.15. Определение хигиназной активности
2.16. Клик-Ит метод
3. Результаты собственных исследований
3.1 Разработка генетической системы для комплементаций делеционных мутаций генов в РгапЫзеПа и ее тестирование
3.1.1. Разработка и создание вектора с полилинкером для молекулярного клонирования
3.1.2. Клонирование ФТН-0627
3.2. Клонирование генов из генома Т7. /и/агешй 8СН11 84
3.2.1. Биоинформатические исследования
3.2.2. Клонирование генов ФТТ-0482, ФТТ-0502, ФТТ-1693, ФТТ-0900 в вектор для экспрессии в эукариотических клетках
3.2.3. Экспрессия и изучение пренилирования белков в клетках человека
3.3. Изучение пренилирования белков Е. поу1Ыс1а Ш12 методом инфекций культуры клеток
3.4. Клонирование и анализ гена ФТН-0357
4. Обсуждение результатов исследований
Выводы
Список использованной литературы
Список использованных сокращений
Список иллюстративного материала
ПРИЛОЖЕНИЯ
Рекомендованный список диссертаций по специальности «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», 03.01.06 шифр ВАК
Методология и результаты молекулярно-генетического изучения вакцинного штамма Francisella tularensis2011 год, доктор биологических наук Павлов, Виталий Михайлович
Липополисахариды бактерий рода Francisella как иммунодоминантные антигены и их фазовые вариации в условиях in vivo2005 год, кандидат биологических наук Аронова, Надежда Валентиновна
Francisella tularensis: некоторые аспекты экологии и диагностики2008 год, доктор биологических наук Романова, Людмила Васильевна
Формирование иммунного ответа макроорганизма на введение белковолипополисахаридного комплекса Francisella tularensis разных подвидов: экспериментальное исследование2012 год, кандидат биологических наук Войткова, Валентина Владимировна
Характеристика цитотоксических глюкозилтрансфераз Legionella pneumophila2013 год, кандидат биологических наук Совкова, Ирина Владимировна
Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Конструирование плазмидных векторов для изучения пренилирования белков возбудителя туляремии»
Введение
Туляремия - это инфекционное заболевание, характеризующиеся воспалительной модификацией ворот входа инфекции. Человек может заразиться при контакте с больным животным или его трупом, через зараженную воду, еду или укус насекомого (комары, клещи, слепни). Это заболевание относится к природно-очаговым зоонозам разных видов грызунов, зайцеобразных, насекомоядных, сумчатых, хищников, копытных, птиц, амфибий, рыб и беспозвоночных (более 80 видов животных) [1]. Также человек может заразиться при вдыхании аэрозолей, при таком способе инфицирования развивается легочная форма туляремии.
Эндемические очаги туляремии регулярно проявляются на территории Российской Федерации и соседних стран [5]. Возбудителем туляремии является грамотрицателытая неподвижная кокоподобная палочка }7гапсие11а пйагет«ч Бактерии Р. шЬгепьчя считаются очень контагиозными из-за очень малой инфекционной дозы, считается, что 10 бактериальных клеток [46] способны вызвать заболевание человека. Именно из-за такой низкой инфекционной дозы и легкости распространения с аэрозолями Ш1агепз15 причисляют к бактериям, которые потенциально можно использовать в качестве биологического оружия [92]. Отдел Здоровья и Безопасности США внес Г. 1и1агет18 в список особо опасных агентов класса А [69]. В Российской Федерации согласно санитарно-эпидемиологических правил СП 1.3.2322-08 (прил.1) по классификации микроорганизмов - возбудителей инфекционных заболеваний человека Г. Ьйагет'ю отнесен ко II группе патогенности.
В последнее десятилетие накопилось огромное количество данных, полученных в результате секвенирования геномов, на данный момент полностью секвенировано более десятка геномов разных штаммов ЕгапЫзеИа, в том числе /л шШгегтз БСГШ Б4. Для изучения функций генов РгапЫзеИа созданы библиотеки мутантпых штаммов, непатогенных для человека [75]. Вместе с тем, генетические
манипуляции с Francisella осложнены тем, что репликативпые единицы, используемые для E.coli, неприменимы для франчизелл, также бактерии этого рода естественно устойчивые к бета-лактамным антибиотикам, а также низкой эффективностью трансформации. Однако, для генно-инженерной работы с Francisella были разработаны ряд векторов для мутагенеза с помощью транспозонов, гомологичной рекомбинации, «ловушек» промотеров и комплементации делеционных мутантов [168]. IIa сегодняшний день подавляющее большинство плазмидных векторов непригодны для комплементации делеций генов, штаммов из библиотеки мутантов, поскольку несут гены стойкости к канамицину. Актуальным представляется найти решение этой проблеме и создать эффективный вектор.
Патогенез Francisella характеризуется проникновением в клетку хозяина, выход из фагосомы, размножение, выход из клетки и опять заражение. Каждая из стадий пристально изучается учеными по всему миру, но механизм выхода франчизелл из фагосомы все еще остается невыясненным. Известно, что бактерия вступает с клеткой-хозяином в различные взаимодействия, в том числе она секретирует в среду или вводит непосредственно в клетку ряд эффекторных молекул. Бактериальные эффекторы, в свою очередь, могут вступать во взаимодействия с белками клетки-хозяина, а также служить субстратами для посттрансляционных модификаций ее ферментами. Так, бактериальные белки, содержащие мотив СааХ, могут подвергаться пренилированию с помощью эукариотпческой системы пренилирования, что приводит к изменению свойства этих белков. В частности, пренилирование было экспериментально показано для прокариотических белков SifA {Salmonella typhimurium) [129] и AnkB (Legionella pneumophila) [125]. Определена необходимость пренилирования этих белков для установления способности их инфицировать и размножаться внутри клетки хозяина.
Представляется актуальным выяснить, имеет ли место пренилирование белков F. tularensis в процессе инфицирования эукариотпческой клетки.
Цель исследований - сконструировать плазмидные векторы для изучения пренилирования белков возбудителя туляремии.
Задачи исследований:
1. Сконструировать плазмидный вектор для генетической комплементации мутантных штаммов Г. по\пЫс1а Ш12 и доказать эффективность полученной конструкции.
2. Изучить геном /л Ыагетчя с целью поиска возможных мишеней эукариотических пренилтрансфераз.
3. Установить возможные белки-мишени пренилирования при инфицировании клеточных линий человека Т7. поушсЬ Ш 12.
4. Клонировать и экспрессировать выбранные белки, изучить их преиилирование.
Научная новизна работы. Впервые разработан вектор для клонирования генов и экспрессии у Р. novicida, как туляремийный вектор, несущий полилинкерный регион - ген стойкости к тетрациклину, что в полной мере обеспечивает эффективность генпо-инженерных манипуляций с Г. по\чс1с!а, при этом созданный вектор совместим для работы с транспозонными мутантами К ийагетшя.
Проведен детальный анализ белков, кодируемых геномом /Г Ш1агет18 БСНи 84, и предсказаны мишени пренилирования с помощью биоинформатических методов. Впервые в России клонированы гены ФТТ-0482, ФТТ-1693, ФТТ-0900 из генома Е Ийагет'и БСШ 84. Впервые в мире экспериментально установлено, что белки ФТТ-0482, ФТТ-1693, ФТТ-0900 не модифицируются эукариотической системой пренилирования.
Впервые использован метод метаболического введения меченого азидом фарнезила одновременно с трансфекцией клеток. Впервые установлено, что белок ФТН-0357 препилируется, и впервые с помощью моделирования предсказана его пространственная структура.
Практическая значимость работы. Разработан туляремийный вектор для комплементации делеционных мутаций, как первый вектор, в котором
присутствует полшшнкерный регион для эффективного клонирования и экспрессии белков в F. по\пЫс1а, устойчивых к канамицину. Вектор охарактеризован с помощью рестрикционного анализа и секвенирования и депонирован в П1У ВЫИИВВиМ.
Проведен биоипформатический анализ и моделирование пространственной структуры белков ФТТ-0482, ФТТ-1693, ФТТ-0900 и ФТТ-0502. Получены данные о влиянии мутаций аналогичных генов в К по\пс1с1а на рост, способность проникать и размножаться внутри клеток макрофагов мыши, которые используются в научно-исследовательской работе, а также в учебном процессе в ФГБОУ ВГЮ МГАВМ.
Доказано, что ФТТ-0482, ФТТ-1693, ФТТ-0900 не пренилируются в клетках эмбриональной почки человека, несмотря на то, что программа РгеР8 предсказывала, что эги белки содержат возможные мишени для пренилтрансфераз человека. Поскольку функции генов ФТТ-0482, ФТТ-1693, ФТТ-0900 и ФТТ-0502 неизвестны, то полученные в этой работе данные помогают в дальнейшем исследовании функций этих белков.
Результаты проведенных исследований по инфицированию клеточных культур франчизеллой доказали, что пренилирование играет важную роль в инфекционном процессе на молекулярном уровне. Установлено, что белок ФТН-0357 пренилируется, что существенно дополняют картину инфекционного процесса, вызываемого Ггапс1$е11а.
Разработаны «Методические указания по клонированию генов в вектор рКК-полилинкер», утвержденные ректором ФГБОУ ВПО МГАВМиБ в установленном порядке 14 мая 2013 г.
Личный вклад соискателя. Диссертационная работа выполнена автором самосюятельно. Автор лично выполнила весь объем научно-исследовательских работ, проанализировала результаты, сформулировала выводы работы.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены в 2012 году на ежегодном собрании академии наук в штате Виргиния (США), первой конференции по взаимодействию между хозяином и патогенным
микроорганизмом в биозащите и новым болезням (штат Виргиния, США, 2012), среднеатлантической встрече ученых (по итогам конкурса работа признана лучшей, а её автор была награждена грантом для посещения встречи-конферснции) по микробному патогенезу (Виргиния, США, 2013).
Автор работы является стипендиатом программы Фулбрайт в 2011-2012 гг, победителем конкурса «Молодые новаторы аграрной России» в 2010 г, по итогам которого был получен грант на исследования, и победителем олимпиад по нанотехиологиям в 2010 и 2011 годах (МГУ имени М.В. Ломоносова).
Публикации результатов работы. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работы, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, 1 - в сборниках международных конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 134 страницах машинописного текста и содержит следующие главы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, список использованной литературы, список сокращений, список иллюстраций и приложения. Работа содержит 8 таблиц, 29 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 168 литературных источника, в том числе 158 зарубежных.
Основные положения, выносимые на защиту:
1. Сконструированный рекомбинантный вектор позволяет клонировать гены и экспрессировать их в клетках бактерий ЕгапшеИа. .
2. Белки ФТТ-0482, ФТТ-1693, ФТТ-0900 не модифицируются пренилтрансферазами клеток эмбриональной почки человека.
3. ФТН-0357 пренилируется при экспрессии в гетерологических условиях.
Рекомендации по практическому использованию научных результатов:
Материалы, изложенные в диссертации, использованы в учебном процессе по дисциплинам «Молекулярная биология», «Основы генной инженерии», «Генетическая инженерия» ФГБОУ ВПО МГАВМиБ. На основе материалов
диссертации подготовлены «Методические указания по клонированию генов в рКК-полилинкер».
Плазмидный вектор рКК-полилинкер депонирован в ГНУ ВНИИВВиМ; используется для создания новых конструкций для введения генов в клетки бактерий Ргапс18е11а и комплементации делеционных мутаций в университете Дж. Мэйсона.
Для расшифровки механизмов инфекционного процесса, вызываемого РгапЫзеИа, в частности, для изучения функции белка ФТН-0357, рекомендуем применять сконструированную нами плазмиду, несущую выделенный из генома К по\пск1а Ш 12 ген ФТН-0357.
1. Обзор литературы 1.1. Туляремия
Туляремия, известная также под такими синонимами как кроличья лихорадка, лихорадка оленьей мухи, представляет собой острое инфекционное заболевание, вызываемое Ггапа'яеПа Пйагети. Для данного заболевания характерны следующие признаки: общая интоксикация, лихорадка, поражение лимфатических узлов. Формы заболевания прямо зависят от ворот входа инфекции: формирование так называемых бубонов наблюдается при заражении через кожу, попадании микроба на слизистую или употреблении зараженной воды; легочная форма развивается при аэрогенном заражении [1]. Туляремию относят к зоонозам с природной очаговостью. Резервуарами туляремийных микробов в природе являются грызуны, зайцеобразные, насекомоядные, сумчатые, хищники, копытные, птицы, амфибии, рыбы и беспозвоночные (более 80 видов животных) [9, 62]. Предполагают, что при инфицировании рыб важную роль могут играть простейшие, поскольку экспериментально была показана инфекция франчизеллой клеток АсаШНатоеЪа са${е11апИ и возможность формирования цист, содержащих франчизеллу [10].
Течение болезни определяется способом заражения, восприимчивостью иммунитета и концентрацией возбудителя. В среднем инкубационный период длится от трех до семи дней. После чего температура тела повышается (38-39 °С), начинаются головные боли, слабость, разбитость, сильная интоксикация. При попадании возбудителя через кожу происходит увеличение лимфатических узлов до 3-5 сантиметров, а также формирование местных язв - так званых бубонов. Бубон со временем может либо размягчаться, либо уплотняться, либо вскрываться с выделением гноя. Легочная форма может быть с поражением бронхов и/или легких. Болезнь протекает тяжело и долго, она опасна абсцессами легких, бронхоэктазиями, гангренами и гнойными плевритами.
Человек может заразиться при контакте с больным животным или его трупом, через зараженную воду, еду или укус насекомого (комары, клещи, слепни) [6, 117]. Хотя и существует вероятность заразиться туляремией аэрогенным способом, но на сегодняшний день случаев передачи инфекции от человека к человеку не зарегистрировано [122]. Возбудитель сохраняет инфекционную активность в водной среде до трех месяцев, в сухих растениях -до шести месяцев, в организме мертвых животных - до трех месяцев, в шкурках и моллюсках - до сорока суток. Фрапчизелла чувствительна к дезинфицирующим средствам и температуре: при кипячении бактерии гибнут немедленно, а при 60°С жизнеспособны около 20 минут [1].
Впервые туляремия была описана в Японии в начале девятнадцатого века. В начале двадцатого века американские ученые изучали эпидемию чумы среди грызунов в Туляре, штат Калифорния [2]. Ученые установили, что причиной инфекции была Bacterium lularense. В этой экспедиции участвовали ученые Э. Френсис, Г. Мак-Кой и К. Чепин. Сам К. Чепин и его команда переболели туляремией и установили, что этот микроб также опасен и для человека.
В Советском Союзе туляремия впервые была описана врачами С. В. Суворовым, А. А. Вольферцом, М, М. Воронковой. В 1926 году они наблюдали около 200 заболеваний среди населения двух совхозов в дельте Волги [7]. Изучение материала, который они получили из больных, показало, что они имели дело именно с туляремийным микробом Еще до установления точной клинической картины и возбудителя, туляремию принимали за легкую форму чумы. Эта болезнь была описана для многих регионов России (даже за Полярным кругом [132]), США, Канады, Китая и многих других стран [2, 159].
Francisella - это кокковидные или эллипсоидные полиморфные грамотрицательные палочки, формирующие слизистую капсулу [4]. Бактерии этого рода являются высоко контагиозными, с очень малой инфекционной дозой (10 клеток) [46]. Именно из-за низкой инфекционной дозы и легкости
распространения с аэрозолями Р. Ш1агет1з причисляют к бактериям, которые могут быть использованы в качестве биологического оружия [92]. Отдел Здоровья и Безопасности США внес Р. ийагет'и в список особо опасных агентов класса А [69].
Существует две общие классификации этого рода бактерий. Немного устаревшая классификация основывается на географической локализации выделенного возбудителя, морфологии и биохимических свойствах. По этой классификации все Е. Ш1агепя15 делят на три группы: неарктическая раса (тип А), выделенная в Северной Америке; голарктическая раса (тип В) распространена в станах Евразии, в том числе России; среднеазиатская раса, для нее характерно также ферментация глицерина и цитруллина [62].
Новая классификация дополнительно включает результаты анализа секвенированньтх геномов. Род Ргапс^яеНа относится к классу Саттарго(еоЬас(ег1а. На основе генетических и биохимических (способность метаболизировать глицерин и цитруллин) особенностей выделяют три подвида: Р. Ш1агет1з йиЬяр. (и/агетчх. Р. 1и1агет1$ БиЬзр. 1ю1агсИса, и Р. 1и1агет1з эиЬзр. тесИа^1а11са.
Ргапс1зе11а по\пск1а также относят к роду Ргапс1$е11а, хотя генетический анализ показал большое количество полиморфизмов, что сильно отдаляет Р. поУ1С1с1а от Р. 1и1агет'т на филогенетической карте, поэтому иногда подрод Р. поуш(1а классифицируют как отдельный вид [90].
Р. ийагепш зиЬэр. 1и\аге}ш$ и Р. ийагет'м эиЬзр. Ио1агсИса способны инфицировать человека. Р. 1и1агеп$1$ яиЬэр. Ш1агеж1$ также известен как тип А (по устар. неарктическая раса). Тип А обладает малой инфекционной дозой: 1-10 бактериальных клеток способны вызвать заболевание у человека. Тип А распространен в основном в Северной Америке. Показано, что этот микроб провоцирует в большинстве случаев легочную форму заболевания. Результаты молекулярных исследований дают основание разделить подрод Р. Ыагет1з еще
на две группы (А1 и А2), которые отличаются течением вызываемой болезни, способами передачи и географией [40].
F. tularensis subsp. holarctica относят к типу В или по устаревшей классификации - к голарктической расе. Этот тип распространен в Европе и северном полушарии, провоцирует более легкую форму туляремии человека и характеризуется меньшей заразностью (<103 бактерий) [122]. Живая вакцина из штамма LVS - это аттенуированная форма возбудителя типа В, была разработана СССР в 50х годах двадцатого столетия и подарена США.
F. tularensis subsp. mediasiatica и F. novicida очагово распространены и редко ассоциированы с заболеванием туляремией человека. F. tularensis subsp. mediasiatica также известна под названием «среднеазиатская раса», поскольку распространена в Азиатской части бывшего СССР [90]. Что же касается F. novicida, то ее выявляли в Северной Америке и Австралии [62].
Генетический анализ бактерий Yersinia philomiragia показал, что эти бактерии несут типичную для Francisella ДНК, после чего Yersinia philomiragia переименовали в Francisella philomiragia [83]. Позднее анализ последовательностей 16S рДНК подтвердил верность этого решения [70]. Также существует большое количество данных о Francisella, непатогенных для человека, например, патогенные для рыб бактерии F. philomiragia и F. Noatunensis безопасны для человека [142]. Было показано, что F. piscicidci (GM2212) и F. philomiragia подвид noatunensis (NC1MB 14265Т) вызывают инфекции у Gadus morhua. Позднее выяснилось, что F. piscicida (GM2212) и F. philomiragia подвид noatunensis (NCIMB 14265Т) - это гетеротипичные синонимы [33]. Также было описано присутствие франчизелл в образцах почвы и воды [24].
Геном F. tularensis subsp. tularensis SCHU S4 относительно мал, составляет 1.9 миллиона п.н. и содержит 1804 предсказанных гена, из которых 302 -уникальны для Francisella [109]. На 2009 год было полностью секвенировано 9 геномов Francisella-. F. tularensis subsp. tularensis (FSC198 [NC 008245], SCHU S4
[NC 006570], WY96-3418 [NC 009257]), F. tularensis subsp. holarctica (FTNF002-00 [NC 009749], OSU18 [NC 008369], LVS [NC 067880]), F. tularensis subsp. mediasiatica (FSC147 [NC 010677]), F. novicida (U112 [NC 008601]) [122]. Ha 2013 год также секвенированы Francisella tularensis subsp.. holarctica немецкий штамм F92 [21], Francisella noatunensis [NC 017909.1] [145], Francisella hispaniensis CCUG 58020 [142], Francisella philomiragia [NC 010336.1] [96]. Генетический анализ геномов показал высокую гомологию (до 97-99 %) внутри рода, все геномы содержат около 32% Г-Ц пар, количество предсказанных генов составляет 1800-2000.
Интересно, что у типа А и В найдено 200-300 псевдогенов, в то время как в геноме F. novicida U112 найдено всего 14 [152]. Был идентифицирован фрагмент (по две копии в геномах типа А и В, но всего одна копия в геноме F. novicida [122]) размером 30000 п.н., который несет наиболее важные гены для инфекции. Этот регион был назван исследователями «островок патогепности» (FPI) и характеризуется низким содержанием Г-Ц пар (27,5%).
1.2. Механизм инфекционного процесса, вызываемого Francisella
Жизненный цикл Francisella состоит из следующих стадий: проникновение в клетку хозяина, выход из фагосомы, размножение, выход из клетки. Бактерия попадает в эукариотическую клетку с помощью фагоцитоза, этот процесс изучен хорошо. Считается, что маннозный рецептор играет немалую роль в поглощении макрофагами франчизеллы, этот феномен был показан для производных моноцитов человека, макрофагов мыши и культуры клеток J774A (макрофаго-подобных клеток) [38].
Было показано, что поглощение Francisella макрофагами значительно увеличивается при опсонизации сывороткой [3, 43]. При изучении ультраструктур, что формируются при проникновении F. tularensis (LVS, тип А) в макрофаги человека (производные моноцитов) и клеточную культуру ТНР-1, было показано, что процесс проникновения бактерии очень сильно зависит от
филаментов актина, компонента комплемента СЗ и специфичных для комплемента рецепторов [47]. Рецептор CR3 важен для фагоцитоза опсонизированных F. novicida макрофагами человека и мыши, а также нейтрофилами и дендритными клетками. Были изучены и другие факторы, важные для проникновения бактерии в макрофаг, а именно: SR рецептор A, Fey рецепторы, нуклеолин, легочный белок SP-A [38].
Далее происходит формирование ранних и поздних фагосом. Для каждого типа фагосом характерна экспрессия на поверхности фагосомы собственных факторов: ЕЕА-1 (характерен для ранней фазы), CD63, LAMP-1, LAMP-2, Rab7 [77]. Исчезновение этих факторов часто указывает на разрушение фагосомы. Но фагосома не сливается с лизосомой, то есть не происходит формирование фаголизосомы. Механизм, каким образом франчизелла препятствует этому процессу, все еще изучается. Согласно наиболее распространенной теории франчизелла выходит из фагосомы до момента слияния с лизосомой [43]. Подтверждением этого служат исследования Santic М. и др. [138], результаты которых указывают на то, что мутанты F. tularensis по генам mglA (синоним iglD) и iglC не способны выжить при инфекции макрофагов из-за неспособности выбраться из фагосомы. Другим важным фактором формирования фаголизосомы является подкисление среды фагосомы благодаря работе вакуолярной АТФазы [86]. Известно, что франчизелла резистентна к кислотности в ограниченных количествах, а также повышение кислотности играет важную роля для выхода бактерии из фагосомы [38]. Скорее всего подкисление среды активирует процессы или факторы, продуцируемые бактериями, необходимые для разрушения фагосомы.
Предполагают, что механизм выхода бактерии из фагосомы консервативен внутри рода. Экспериментально доказано, что выход франчизеллы происходит в течение 1-8 часов и зависит от тканеспецифичности и штамма. В отличие от Listeria monocytogenes и Shigella flexneri, в геноме Francisella нет липидных гидролаз или фосфолипаз, которые могут быть вовлечены в гидролиз мембраны
фагосомьт [95]. На счет типа системы секреции ученые все еще дискутируют, но по последним данным для франчизелл характерна система секреции типа VI, кодируемая FP1. Этот же тип секреционпой системы описан для Vibrio cholera и Pseudomonas aeruginosa. [43]. В процессе выхода из фагосомы показана важная роль таких генов FPI F. tularensis как i gl С, iglD, pdpA, igll, iglJ, vgrG, dotU, mglA, fevR, migR [45]. Также в этом процессе важны и другие гены, что не включены в FPI: гены кислотных фосфотаз (АсрА, АсрВ, АсрС, Нар), гены пиримидинового биосинтеза {сагА, сагВ, ругВ), гены с неизвестной функцией (FTT1103, FTT1676). Со стороны клетки-хозяина доказана важная роль таких факторов: CDC27 (убиквитин лигаза), Akt (серин/треонип киназа), SHIP (инозитол-5-фосфотаза) [38].
Следующий этап жизненного цикла фраичизеллы - это размножение в цитозоле эукариотической клетки. Именно эта фаза жизненного цикла бактерии считается главной для патогенеза заболевания [118]. Несмотря на большое количество опубликованных работ по изучению этана размножения франчизеллы в цитозоле [147], в том числе и делеционных мутантов, процесс этот до конца не ясен, поскольку очень трудно различить мутантов, дефектных по генам размножения или по генам выхода из фагосомы. Поэтому данные получают не только благодаря изучению мутантов, но и с помощью альтернативных методов, например, изучая транскриптом макрофагов [157].
На данный момент известно, продукты каких генов участвуют в репродукции бактерии внутри клетки - это pmrA, FTT0989, dsbB, iglD, iglB, iglA, pdpB, cds2, mglB, FTT0369c, pwMCD, ggt, ripA, htpG, dsbB. Хотя генам iglD, iglA, iglB, pdpB, cds2 и приписывалась функция регулирования выхода бактерии из фагосомы, по стало понятно, что они могут также быть вовлечены в размножение бактерий в цитозоле [43]. Akimana С. и др. [12] с помощью анализа RNAi в Drosophila melanogaster S2R+ показали, что USP22 (убиквитин-специфичпая пептидаза) необходима для размножения F. novicida. К другим белкам клетки хозяина, что играют важную роль в репродукции франчизеллы, относятся Ras,
S0S2, GrB2,PI<CCa, PKC(31, PI4KCA [12]. В результате успешного размножения внутри клетки, Francise/la инициирует внутренние процессы, которые приводят к гибели клетки и выходу бактерий из нее. Вышедшие бактерии заражают новые клетки, и цикл повторяется.
Francisella размножается в цитоплазме клетки, поэтому определенный процент бактериальных клеток может быть элиминирован, и антигены бактерии могут быть представлены на поверхности клетки [51]. Чаще всего липополисахариды (LPS) грамотрицательных бактерий узнаются TLR-4, но для франчизелл характерна особенная структура LPS [81], в результате чего происходит стимуляция TLR-2 [48]. После такой стимуляции происходит синтез цитокинов (ILip, pro-IL18). TNF-a и IL-12 также вносят свой вклад в контроль инфекции [61]. Сами TNF-a могут действовать как антигенпрезентирующие клетки, активируя окислительный взрыв. IL-12 могут активировать Т-клетки и натуральные киллеры, которые, в свою очередь, продуцируют IFN-y, который активирует антигенпрезентирующие клетки [32]. Новейшие исследования на модели мыши показывают, что натуральные киллеры не играют существенной роли в защите от респираторной формы туляремии [139]. Важно отметить, что на уровне единичной клетки может осуществляться автофагия (от англ. autophagy) -процесс, в котором бактерия заключается в мембрану и расщепляется с помощью ферментов лизосомы [97]. Процесс автофагии используется клеткой как альтернатива протеосомам. Доказательства автофагии были получены на модели макрофагов мыши. Установлено, чго Francisella может подавлять этот процесс на уровне экспрессии генов [44].
1.3. Липидные посттрансляционные модификации и методы их
изучения
Посттрансляционные модификации (Г1ТМ) существенным образом сказываются на функционировании, локализации, скорости и способе деградации новосинтезированных белков. Присоединение липидного компонента:
миристоила (к N концу), гликозилфосфатидилинозитола (к С концу), пренилировапие, пальмитоилирование по остаткам цистеина приводит к прочному заякориванию липонротсинов в мембранах. Предсказание таких модификаций на основании известной последовательности гена и его продукта является необходимым этапом анализа любого генома, облегчает работу по исследованию функции, локализации и метаболизма конкретных белков.
ПТМ новосинтезированных белков играют ключевую роль в регуляции биологии клетки. ПТМ представляют собой энзиматические превращения белков сразу после трансляции мРНК. ПТМ могут осуществляться с помощью ковалентпого присоединения молекул (ацетат, фосфат, карбогидраты, липидньте компоненты, пептиды и др.), изменения свойств аминокислот (цитрулирование, дезамидироваиие и др.), протеолитического отсоединения регуляторных участков белков и даже полной деградации белков. ПТМ влияют на физические и химические свойства белков, их активность, локализацию и стабильность [67]. В связи с огромным количеством данных, полученных в результате секвенирования геномов, ученые сталкиваются с проблемой анализа этих данных и их применения для изучения структур и функций белков.
Несмотря на огромные успехи протеомики, анализ ПТМодифицированных белков все еще остается сложной задачей [149]. Чаще всего модифицированные белки составляют лишь очень малую часть от общего количества белка, например, лишь 5-10% фосфорелированпого субстрата протеин киназы от общего числа, следовательно, для изучения этой модификации необходимы методы детекции очень малых концентраций (<5-10 fmol) [140]. Более того, чаще всего очень тяжело получить отдельный пептид с модифицированной группой из-за нестабильности таких пептидов в ходе приготовления образцов для масс-спектрометрии [140]. Для изучения разных ПТМ раньше чаще всего применяли метод радиоизотопных меток с дальнейшим масс-спектральпым анализом [102].
В последние годы были разработаны альтернативные биохимические методы для изучения ПТМ [42]. Которые основываются на введении меченного аналога предшественника на этапе синтеза липидньтх компонентов, таких как изопреноиды, миристоил группы и др. Эти компоненты сшиты с флюрофором, биотипом, фото-кросслинкером или азид/алкин группой [42]. Важно отметить, что исследуемые клетки культивируются в присутствии ингибиторов процесса липидирования, например ферментов, которые катализируют саму ПТМ, или же синтеза предшественников [131]. Описанные методы успешно применяются для изучения липидирования, идентификации новых лииидируемых белков и их очистки с дальнейшим анализом с помощью масс-спектрометрии [42]. Наименее ресурсозатратными методами до сих пор остаются методы биоинформатики. В последнее время появилось огромное количество онлайн программ для анализа ПТМ.
Липидирование является основным методом модификации белков, которые благодаря приобретению гидрофобных свойств и увеличения аффинности модифицируемых белков к мембранам, впоследствии направляются в плазматическую мембрану и мембраны клеточных органелл (ЭПР, аппарат Гольджи, митохондрии). Белок может липидироваться па ТЯ-конце (Ы-концевое миристоилирование), С-конце (С-концевая вР1, пренилированис), или независимо от расположения сайта липидирования (Э-миристоилирование, 8-пальмитоилирование). Не искшочина возможность модификации одним или несколькими способами одновременно [156].
СРЬмодификация, как правило, ориентирует белки К-концом в просвет ЭПР, откуда они направляются в комплекс Гольжи и далее на внешнюю поверхность клетки. После экспорта белка в ЭПР, часто с помощью сигнального пептида, С-концевой пропептид удаляется, а синтезированный ранее вР1 липид присоединяется к новому С-концу в омега сайте. Эта реакция катализируется трансамидазой, находящейся в просвете ЭПР [56].
Что же касается препилировапия, пальмитоилирования и миристоилирования, то белки модифицируются непосредственно после синтеза [56]. Примером могут служить Н-, N-, K-Ras белки, которые сразу после синтеза фарнезилируются в цитозоле, после чего они связываются с ЭПР, где происходит дальнейший процессинг СааХ региона (отщепление ааХ, метилирование цистеина). После чего K-Ras направляется непосредственно в плазматическую мембрану клетки (механизм не изучен). В аппарат Гольджи с транспортными везикулами передаются Н- и N-Ras, где они подвергаются пальмитоилированию с помощью резидентных компонентов PAT и DHHC9. Далее модифицированные II-и N-Ras направляются в плазматическую мембрану по центральному пути секреции [131].
N-миристоилирование происходит сразу после отщепления мегионина с помощью мегионинаминпептидазы. Также N-миристоилирование может иметь место в случае проапоптического белка BID, где каспаза 8 открывает спрятанный сайт миристоилирования [66]. Миристоилирование - это очень распространенная ПТМ, и она была показана для 150 белков человека [131].
N-концевое миристоилирование имеет место тогда, когда на N-конце располагается глицин. К глицину присоединяется 14-углеродная насыщенная жирная кислота (миристоил группа), эта модификация необратима и катализируется N- мирпстоилтрапсферазой с образованием амидной связи [124]. Такая модификация консервативна и описана для грибов, вирусов и высших эукариот. Миристоилирование важно для многих процессов в клетке, таких как передача сигналов, апоптоз, альтернативный экзотранспорт белков [104]. Примерами служат белки семейства киназы Src, растительная вТРаза Rab, Са-зависимые иротеннкипазы Arabidopsis thaliana, Oryza sativa, Lycopersicon esciilentum, Cucurbita pepo, Solanum tuberosum и многие другие [124]. Возможность предсказания сайтов N-концевого миристоилирования открывает новые перспективы в изучении мест локализации и функций белков в тех случаях, где применение биохимических методов невозможно [124].
Первым наиболее известным методом является КМТ. Название программы происходит от расшифровки аббревиатуры 1ЧМТ: «миристоилирование с помощью белкового миристоил-СоА: К- миристоилтрансферазы» [104]. Ее можно использовать для анализа последовательностей аминокислот эукариотических и вирусных белков (см. таблицу 1).
Похожие диссертационные работы по специальности «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», 03.01.06 шифр ВАК
Сравнительная характеристика липополисахаридов бактерий рода Fpancisella2001 год, кандидат биологических наук Оноприенко, Наталья Николаевна
Физическая и функциональная характеристика криптической плазмиды pPМ1 возбудителя мелиоидоза1998 год, кандидат биологических наук Захарова, Ирина Борисовна
Влияние серотонина на свойства возбудителя чумы, индуцированный апоптоз и пролиферацию иммунокомпетентных клеток2008 год, кандидат биологических наук Клюева, Светлана Николаевна
Роль бактерицидных механизмов фагоцитоза Francisella tularensis разных подвидов в патогенезе туляремии (экспериментальное исследование)2010 год, кандидат медицинских наук Татарников, Станислав Александрович
Взаимодействие бактерий, вирусов и эукариотических клеток в условиях смешанной инфекции (электронно-микроскопическое исследование)1984 год, кандидат биологических наук Гостева, Вера Викторовна
Заключение диссертации по теме «Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)», Маракасова, Екатерина Семеновна
113 Выводы
1. Сконструирована плазмида рКК-полилинкср, обеспечивающая ком-плементировапие делеционных мутантных штаммов Р. novicida Ш12, и депонирована в ГНУ ВНИИВВиМ.
2. С помощью программы РгеР8 предсказано пренилирование белков Р. ийагети БСНИ 84 ФТТ-0482, ФТТ-1693, ФТТ-0900 в клетках человека. Получены плазмидные конструкции pTagRFP-0482, pTagRFP-1693, pTagRFP-0900, несущие гены предсказанных белков.
3. Экспрессия плазмидных конструкций pTagRFP-0482, pTagRFP-1693, pTagRFP-0900 в клетках человека доказала отсутствие пренилирования бел-ков ФТТ-0482, ФТТ-1693, ФТТ-0900.
4. Установлено, что белок ФТТ-0482 непосредственно участвует в инфек-ционном процессе, а белок ФТТ-0900 принимает участие в общих процессах жизнедеятельности бактерии Р. ийагети.
5. Пренилирование белка ФТН-0357 Р. novicida Ш12 доказано методами масс-спектроскопии и иммуноблоттинга.
1.6. Заключение
F. tularensis - это грамотрицательная бактерия, возбудитель туляремии. Francisella проникает в макрофаг с помощью фагоцитоза, выходит из фагосомы, размножается, затем выходит из клетки и опять заражает здоровые клетки. Каждая из стадий пристально изучается учеными по всему миру, но механизм выхода франчизелл из фагосомы всс еще остается невыясненным. Бактерия вступает с клеткой-хозяином в различные взаимодействия, в том числе она секретирует в среду или вводит непосредственно в клетку ряд эффекторных молекул. Бактериальные эффекторы, в свою очередь, могут вступать во взаимодействия с белками клетки-хозяина, а также служить субстратами для посттрансляционных модификаций эукариотическими ферментами.
Липидирование белков - это ПТМ, заключающаяся в присоединении гидрофобного хвоста к цистеину или глицину па С- или N-конце. В результате этого события белок приобретает гидрофобные свойства, и это служит сигналом к его ориентации внутри и/или снаружи клетки. Более того, липидация может служить механизмом включения/выключения активной функции белка [110]. Изучение липидирования с помощью методов протеомики довольно осложнено потому, что эти модификации сложно детектировать с использованием стандартных методов [149]. Биоинформатика позволяет решить эту проблему, указанные методы могут помочь сузить круг экспериментально изучаемых белков от сотни к десятку объектов.
Пренилирование - это важный процесс посттрансляционной модификации, вследствие которого пренилированные белки приобретают способность локализоваться в плазматической мембране и/или мембране органелл. Хорошо изученные пренилированные белки человека (например, Rac, Rho, Ras) играют ключевую роль в процессах клеточной дифференцировки, пролиферации, апоптоза и общего метаболизма. Изучение процесса пренилирования открыло новые перспективы в лечении некоторых тяжелых заболеваний, в том числе злокачественных новообразований.
С помощью биоинформатического анализа был предсказан ряд бактериальных белков, которые могут пренилироваться в клетках хозяина. На данный момент, использование аппарата пренилирования хозяина доказано экспериментально лишь для двух белков, SifA Salmonella и AnkB Legionella. Дальнейшее изучение механизмов пренилирования бактериальных белков в клетках хозяина может привести к выявлению новых мишеней для терапевтического воздействия при лечении болезней, вызываемых данными патогенными микроорганизмами.
2. Материалы и методы исследований
Работа выполнена в ФГБОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина в «Лаборатории молекулярных методов исследований» с 2011 года, часть работы выполнена в университете Джорджа Мэйсопа с 2011 по 2013 в рамках стажировки по программе Фулбрайта. Работа проводилась в лабораториях BSL-2 (по классификации ABSA), соблюдая правила техники безопасности и стерильной работы. Автор работы проходил обучение и медицинские освидетельствования для получения доступа к лабораториям BSL-2 в России с 2009 г. и в США с 20112013 г.г.
2.1. Бактериальные штаммы, плазмиды и условия культивирования. Бактериальные штаммы и плазмиды, использованные и полученные в работе, описаны в Таблице 2. E.coli культивировали на ТВ или L-агаре (Invitrogen, США). При трансформации E.coli использовали SOC среду (New England Biolabs, США). Для выращивания F. novicida мы использовали TSB -С (триптический соевый бульон, 0.1% цистеина, BD, США) или TSA-C (BD, США). Как E.coli, так и F. novicida растили при 37°С. В среду добавляли антибиотики: 50 мкг/мл канамицин сульфата (Km), 50 мкг/мл ампициллина натриевую соль (Amp), 6 мкг/мл тетрациклина (Tet). Все антибиотики были приобретены в Sigma-Aldrich и приготовлены, следуя инструкциям производителя.
Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Маракасова, Екатерина Семеновна, 2013 год
Список использованной литературы
1. Гольдин, Р. Б. Руководство по военной микробиологии / Р. Б. Гольдип. -М.: Мин. обор. РФ, 2002. - 394 с.
2. Дранкии, Д. И. Зоонозы / Д. И. Дранкин. -М.: Знание, 1983. -96 с.
3. Дубровина, В. И. Механизмы фагоцитоза и его роль при формировании резистентности организма к возбудителям чумы, псевдотуберкулеза и туляремии: автореф. диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук: 14.00.16 / Дубровина Валентина Ивановна. - Иркутск, 2004. - 261 с.
4. Кишкун, А. А. Руководство по лабораторным методам диагностики: для врачей и фельдшеров, оказывающих первую мед.-санитар, помощь / А. А. Кишкун. - ГЭОТАР, 2009. -496 с.
5. Кузнецова, Е. М. Оптимизация способов получения антигенных комплексов туляремийного микроба и конструирование на их основе диагностических препаратов: автореф. диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук: 03.02.03 / Кузнецова Екатерина Михайловна. -Саратов, 2011. - 22 с.
6. Максимов, А. А. Природные очаги туляремии в СССР / А. А. Максимов. -М.: Изд. Академии Наук СССР, 1960.-292 с.
7. Олсуфьев, Н. Г. Современное состояние и перспективы развития исследований по природной-очаговости туляремии / II. Г. Олсуфьев. - М.: Природно-очаговые болезни человека, 1979. -45 с.
8. Павлов, В. М. Методология и результаты молекулярно-генетического изучения вакцинного штамма Francisella lularensis: автореф. диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук : 03.02.03 / Павлов Виталий Михайлович. - Оболенск, 2011. - 252 с.
9. Петров, В. Г. Экспериментальное изучение клещей Dermacentor marginatus Sulz. и Rhipicephalus rossicus Jak. et K. Jak. как переносчиков туляремии / В. Г. Петров. - М.: Вопросы эпидемиологии и профилактической туляремии, 1958. - 118 с.
10. Abd, Н. Survival and growth of Francisella tularensis in Acanthamoeba castellanii / H. Abd, T. Johansson, I. Golovliov, G. Sandstrom, M. Forsman // Applied and environmental microbiology. - 2003. - № 69. - P. 600-606.
11. Aicart-Ramos, C. Protein palmitoylation and subcellular trafficking / C. Aicart-Ramos, R. A. Valero, I. Rodriguez-Crespo // Biochimica et biophysica acta. -2011. - № 1808. - P. 2981 -2994.
12. Akimana, C. Host factors required for modulation of phagosome biogenesis and proliferation of Francisella tularensis within the cytosol / C. Akimana, S. Al-Khodor, Y. Abu Kwaik // PloS one. - 2010. - № 5. - P. el 1025.
13. Al-Khodor, S. A Dot/Icm-translocated ankyrin protein of Legionella pneumophila is required for intracellular proliferation within human macrophages and protozoa / S. Al-Khodor, C. T. Price, F. Habyarimana, A. Kalia, Y. Abu Kwaik // Mol. Microbiol. . - 2008. - № 70(4). - P. 908-923.
14. Al-Khodor, S. Triggering Ras signalling by intracellular Francisella tularensis through recruitment of PKCalpha and betal to the SOS2/GrB2 complex is essential for bacterial proliferation in the cytosol / S. Al-Khodor, Y. Abu Kwaik // Cellular microbiology. -2010. -№ 12.-P. 1604-1621.
15. Al-Khodor, S. Exploitation of evolutionary conserved amoeba and mammalian processes by Legionella / T. Al-Quadan, C. T. Price, Y. Abu Kwaik // Trends Microbiol. - 2012. - № 20. - P. 299-306.
16. Al-Quadan, T. Anchoring of bacterial effectors to host membranes through host-mediated lipidation by prenylation: a common paradigm / T. Al-Quadan, C. T. Price, N. London, O. Schueler-Furman, Y. AbuKwaik // Trends Microbiol. - 2011. - № 19. - P. 573-579.
17. Al-Quadan, T. Molecular Characterization of Exploitation of the Polyubiquitination and Farnesylation Machineries of Dictyostelium Discoideum by the AnkB F-Box Effector of Legionella Pneumophila / T. Al-Quadan, Y. A. Kwaik // Frontiers in microbiology. - 2011. - № 2. - P. 23.
18. Altschul, S. F. Basic local alignment search tool / S. F. Altschul, W. Gish, W. Miller, E. W. Myers, D. J. Lipman // Journal of molecular biology. - 1990. - № 215. -P. 403-410.
19. Anderegg, R. J. Structure of Saccharomyces cerevisiae mating hormone a-factor. Identification of S-farnesyl cysteine as a structural component / R. J. Anderegg, R. Betz, S. A. Carr, J. W. Crabb, W. Duntze // The Journal of biological chemistry. -1988.-№263.-P. 18236-18240.
20. Anthony, L. D. Growth of Francisella spp. in rodent macrophages / L. D. Anthony, R. D. Burke, F. E. Nano // Infection and immunity. - 1991. - № 59. - P. 3291-3296.
21. Antwerpen, M. H. Complete Genome Sequence of a Francisella tularensis subsp. holarctica Strain from Germany Causing Lethal Infection in Common Marmosets / M. FI. Antwerpen, E. Schacht, P. Kaysser, W. D. Splettstoesser // Genome announcements. -2013. -№ 1. - P. e00135-12.
22. Appels, N. M. Development of farnesyl transferase inhibitors: a review / N. M. Appels, J. H. Beijnen, J. H. Schellens // The oncologist. - 2005. - № 10. - P. 565578.
23. Asare, R. Molecular complexity orchestrates modulation of phagosome biogenesis and escape to the cytosol of macrophages by Francisella tularensis / R. Asare, Y. Abu Kwaik // Environmental microbiology. - 2010. - № 12. - P. 2559-2586.
24. Barns, S. M. Detection of diverse new Francisella-Wkc bacteria in environmental samples / S. M. Barns, C. C. Grow, R. T. Okinaka, P. Keim, C. R. Kuske // Applied and environmental microbiology. -2005. -№ 71. - P. 5494-5500.
25. Baron, G. S. Electroporation of Francisella tularensis / G. S. Baron, S. V. Myltseva, F. E. Nano // Methods in molecular biology. - 1995. -№ 47. - P. 149-154.
26. Bell, B. L. Regulation of virulence gene transcripts by the Francisella novicida orphan response regulator PmrA: role of phosphorylation and evidence of MglA/SspA interaction / B. L. Bell, N. P. Mohapatra, J. S. Gunn // Infection and immunity. - 2010. - № 78. - P. 2189-2198.
27. Benctka, W. Farnesylation or geranylgeranylation? Efficient assays for testing protein prenylation in vitro and in vivo / W. Benetka, M. Koranda, S. Maurer-Stroh, F. Pittner, F. Eisenhaber II BMC biochemistry. - 2006. - № 7. - P. 6.
28. Benetka, W. Experimental testing of predicted myristoylation targets involved in asymmetric ccll division and calcium-dependent signalling / W. Benetka, N. Mehlmer, S. Maurer-Stroh, M. Sammer, M. Koranda, et al. // Cell cycle (Georgetown, Tex.). - 2008. - № 7. - P. 3709-3719.
29. Benetka, W. Protein Prenylation: An (Almost) Comprehensive Overview on Discovery History, Enzymology, and Significance in Physiology and Disease / W. Benetka, M. Koranda, F. Eisenhaber // Monatsh. Chem. - 2006. - № 137. - P. 12411281.
30. Bologna, G. N-Terminal myristoylation predictions by ensembles of neural networks / G. Bologna, C. Yvon, S. Duvaud, A. L. Veuthey // Proteomics. - 2004. -№
4.-P. 1626-1632.
31. Bonitz, T. Evolutionary relationships of microbial aromatic prenyltransferases / T. Bonitz, V. Alva, O. Saleh, A. N. Lupas, L. Heide // PloS one. - 2011. - № 6. - P. e27336.
32. Bosio, C. M. The subversion of the immune system by Francisella tularensis / C. M. Bosio // Frontiers in microbiology. - 2011. - № 2. - P. 9.
33. Brevik, O. J. Multiple-locus, variable number of tandem repeat analysis (MLVA) of the fish-pathogen Francisella noatunensis / O. J. Brevik, K. F. Ottem, A. Nylund // BMC veterinary research. - 2011. - № 7. - P. 5.
34. Britten, C. D. A phase I and pharmacological study of the farnesyl protein transferase inhibitor L-778,123 in patients with solid malignancies / C. D. Britten, E. K. Rowinsky, S. Soignet, A. Patnaik, S. L. Yao, et al. // Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. - 2001. - № 7. - P. 3894-3903.
35. Brumell, J. H. SifA, a type III secreted effector of Salmonella typhimurium, directs Salmonella-induced filament (Sif) formation along microtubules / J. II. Brumell, D. L. Goosney, B. B. Finlay // Traffic. - 2002. - № 3. - P. 407-415.
36. Buckner, F. S. Cloning, heterologous expression, and distinct substrate specificity of protein farnesyltransferase from Trypanosoma brucei / F. S. Buckner, K. Yokoyama, L. Nguyen, A. Grewal, H. Erdjument-Bromage, et al. // The Journal of biological chemistry. - 2000. -№ 275. - P. 21870-21876.
37. Casey, P. J. Biochemistry of protein prenylation / P. J. Casey // J Lipid Res. -1992.-№33.-P. 1731-1740.
38. Celli, J. Mechanisms of Francisella tularensis intracellular pathogenesis / J. Celli, T. C. Zahrt // Cold Spring Harbor perspectives in medicine. -2013. -№ 3. — P. 115.
39. Chakrabarti, D. Protein farnesyltransferase and protein prenylation in Plasmodium falciparum / D. Chakrabarti, T. Da Silva, J. Barger, S. Paquette, H. Patel,
5. Patterson, C. M. Allen // The Journal of biological chemistry. - 2002. - № 277. - P. 42066-42073.
40. Champion, M. D. Comparative genomic characterization of Francisella tularensis strains belonging to low and high virulence subspecies / M. D. Champion, Q.
Zeng, E. B. Nix, F. E. Nano, P. Keim, ct al. // PLoS pathogens. - 2009. - № 5. - P. el 000459.
41. Chan, L. N. A novel approach to tag and identify geranylgeranylated proteins / L. N. Chan, C. Hart, L. Guo, T. Nyberg, B. S. Davies, L. G. Fong, S. G. Young, B. J. Agnew, F. Tamanoi // Electrophoresis. - 2009. - № 30. - P. 3598-3606.
42. Charron, G. Chemical tools for understanding protein lipidation in eukaryotes / G. Charron, J. Wilson, H. C. Hang// Current opinion in chemical biology. -2009. -№ 13. -P. 382-391.
43. Chong, A. The Francisella intracellular life cycle: toward molecular mechanisms of intracellular survival and proliferation / A. Chong, J. Celli // Frontiers in microbiology.-2010.-№ l.-P. 138.
44. Chong, A. Cytosolic clearance of replication-deficient mutants reveals Francisella tularensis interactions with the autophagic pathway / A. Chong, T. D. Wehrly, R. Child, B. Hansen, S. Hwang, H. W. Virgin, J. Celli // Autophagy. - 2012. -№ 8.-P. 1342-1356.
45. Chong, A. The early phagosomal stage of Francisella tularensis determines optimal phagosomal escape and Francisella pathogenicity island protein expression / A. Chong, T. D. Wehrly, V. Nair, E. R. Fischer, J. R. Barker, K. E. Klose, J. Celli // Infection and immunity. - 2008. - № 76. - P. 5488-5499.
46. Chopra, K. Bioterrorism: preparing the plastic surgeon / K. Chopra, A. Conde-Green, M. K. Folstein, E. K. Knepp, M. R. Christy, D. P. Singh // Eplasty. -2011. - № 11.-P. e47.
47. Clemens, D. L. Francisella tularensis enters macrophages via a novel process involving pseudopod loops / D. L. Clemens, B. Y. Lee, M. A. Horwitz // Infection and immunity. - 2005. - № 73. - P. 5892-5902.
48. Cole, L. E. Toll-like receptor 2-mediated signaling requirements for Francisella tularensis live vaccine strain infection of murine macrophages / L. E. Cole, K. A. Shircy, E. Barry, A. Santiago, P. Rallabhandi, K. L. Elkins, A. C. Puche, S. M. Michalek, S. N. Vogel//Infection and immunity. - 2007. -№ 75. - P. 4127-4137.
49. De Smedt, F. Post-translational modification of human brain type I inositol-1,4,5-trisphosphate 5-phosphatase by farnesylation / F. De Smedt, A. Boom, X. Pesesse, S. N. Schiffmann, C. Erneux // The Journal of biological chemistry. - 1996. - № 271. -P. 10419-10424.
50. Deng, W. Insights into the distribution and functions of the eukaryotic GPI-like anchored genes among Mycobacterium from a comparative genomic perspective / W. Deng, J. Zeng, X. Xiang, J. Xie // Critical reviews in eukaryotic gene expression. -2012.-№22.-P. 299-307.
51. Deretic, V. Aulophagy as an immune defense mechanism / V. Deretic // Current opinion in immunology. - 2006. - № 18. - P. 375-382.
52. Dumelin, C. E. Discovery and biological characterization of geranylated RNA in bacteria / C. E. Dumelin, Y. Chen, A. M. Leconte, Y. G. Chen, D. R. Liu // Nature chemical biology. - 2012. - № 8. - P. 913-919.
53. Eastman, R. T. Thematic review series: lipid posttranslational modifications. Fighting parasitic disease by blocking protein farnesylation / R. T. Eastman, F. S. Buckner, K. Yokoyama, M. II. Gelb, W. C. Van Voorhis // Journal of lipid research. -2006.-№47.-P. 233-240.
54. Eisenhaber, B. Posttranslational modifications and subcellular localization signals: indicators of sequence regions without inherent 3D structure? / B. Eisenhaber, F. Eisenhaber // Current protein & peptide science. - 2007. - № 8. - P. 197-203.
55. Eisenhaber, B. Prediction of posttranslational modification of proteins from their amino acid sequence / B. Eisenhaber, F. Eisenhaber // Methods in molecular biology. - 2010. - № 609. - P. 365-384.
56. Eisenhaber, B. Prediction of potential GPI-modification sites in proprotein sequences / B. Eisenhaber, P. Bork, F. Eisenhaber // Journal of molecular biology. — 1999.-№292.-P. 741-758.
57. Eisenhaber, B. A sensitive predictor for potential GPI lipid modification sites in fungal protein sequences and its application to genome-wide studies for Aspergillus niclulans, Candida albicans, Neurospora crassa, Saccharomyces cerevisiae and Schizosaccharomyces pombe / B. Eisenhaber, G. Schneider, M. Wildpaner, F. Eisenhaber//Journal of molecular biology. - 2004. -№ 337. - P. 243-253.
58. Eisenhaber, B. Glycosylphosphatidylinositol lipid anchoring of plant proteins. Sensitive prediction from sequence- and genome-wide studies for Arabidopsis and rice / B. Eisenhaber, M. Wildpaner, C. J. Schultz, G. II. Borner, P. Dupree, F. Eisenhaber // Plant physiology.-2003,-№ 133. - P. 1691-1701.
59. Eisenhaber, B. Posttranslational Modification of Proteins from Their Amino Acid Sequence / B. Eisenhaber, F. Eisenhaber // Data Mining Techniques for the Life Sciences. - 2010. - № 609. - P. 365-384.
60. Eisenhaber, B. Automated annotation of GP1 anchor sites: case study C. elegans / B. Eisenhaber, P. Bork, Y. Yuan, G. Loffler, F. Eisenhaber // Trends in biochemical sciences. - 2000. - № 25. - P. 340-341.
61. Elkins, K. L. In vivo clearance of an intracellular bacterium, Francisella tularensis LVS, is dependent on the p40 subunit of interleukin-12 (IL-12) but not on IL-12 p70 / K. L. Elkins, A. Cooper, S. M. Colombini, S. C. Cowley, T. L. Kieffer // Infection and immunity. - 2002. - № 70. - P. 1936-1948.
62. Ellis, J. Tularemia / J. Ellis, P. C. Oyston, M. Green, R. W. Titball // Clinical microbiology reviews. - 2002. -№ 15. - P. 631-646.
63. Engelson, E. J. An essential farnesylated kinesin in Trypanosoma brucei / E. J. Engelson, F. S. Buckner, W. C. Van Voorhis // PloS one. -2011. -№ 6. - P. e26508.
64. Ericsson, M. Characterization of the nucleotide sequence of the groE operon encoding heat shock proteins chaperonc-60 and -10 of Francisella tularensis and determination of the T-cell response to the proteins in individuals vaccinated with F. tularensis / M. Ericsson, I. Golovliov, G. Sandstrom, A. Tarnvik, A. Sjostedt // Infection and immunity. - 1997. -№ 65. - P. 1824-1829.
65. Fankhauser, N. Identification of GPI anchor attachment signals by a Kohonen self-organizing map / N. Fankhauser, P. Maser // Bioinformatics. - 2005. - № 21. - P. 1846-1852.
66. Farazi, T. A. The biology and enzymology of protein N-myristoylation / T. A. Farazi, G. Waksman, J. I. Gordon // The Journal of biological chemistry. - 2001. - № 276.-P. 39501-39504.
67. Farley, A. R. Identification and quantification of protein posttranslational modifications / A. R. Farley, A. J. Link // Methods in enzymology. - 2009. - № 463. -P. 725-763.
68. Fiser, A. ModLoop: automated modeling of loops in protein structures / A. Fiser, A. Sali // Bioinformatics. - 2003. - № 19. - P. 2500-2501.
69. Foley, J. E. Tularemia / J. E. Foley, N. C. Nieto // Veterinary microbiology. -2010.-№ 140.-P. 332-338.
70. Forsman, M. Analysis of 16S ribosomal DNA sequences of Francisella strains and utilization for determination of the phylogeny of the genus and for identification of strains by PCR / M. Forsman, G. Sandstrom, A. Sjostedt // International journal of systematic bacteriology. - 1994. -№ 44. - P. 38-46.
71. Fujihashi, M. Ciystal structure of cis-prenyl chain elongating enzyme, undecaprenyl diphosphate synthase / M. Fujihashi, Y. W. Zhang, Y. Higuchi, X. Y. Li, T. Koyama, K. Miki // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. -2001. -№ 98. - P. 4337-4342.
72. Fujikura, K. Kinetic studies of Micrococcus luteus B-P 26 undecaprenyl diphosphate synthase reaction using 3-desmethyl allylic substrate analogs / K. Fujikura, Y. Maki, N. Ohya, M. Satoh, T. Koyama // Biosc. Biotechnol. Biochem. - 2008. - № 72. - P. 851-855.
73. Fukata, Y. Protein Palmitoylation by DHHC Protein Family.The Dynamic Synapse: Molecular Methods in Ionotropic Receptor Biology / Y. Fukata, D. S. Bredt, M. Fukata. - Boca Raton FL. Taylor & Francis Group: LLC, 2006. - Ch. 5.
74. Gagniuc, P. Detection of possible restriction sites for type II restriction enzymes in DNA sequences / P. Gagniuc, D. Cimponeriu, C. Ionescu-Tirgoviste, A. Mihai, M. Stavarachi, T. Mihai, L. Gavrila // Romanian journal of internal medicine = Revue roumaine de medecine interne. - 2011. - № 49. - P. 121-128.
75. Gallagher, L. A. A comprehensive transposon mutant library of Francisella novicida, a bioweapon surrogate / L. A. Gallagher, E. Ramage, M. A. Jacobs, R. Kaul, M. Brittnacher, C. Manoil // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.-2007,-№ 104.-P. 1009-1014.
76. Gao, J. CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis / J. Gao, J. Liao, G. Y. Yang // American journal of translational research. - 2009. - № 1. - P. 312-325.
77. Geier, LI. Phagocytic receptors dictate phagosomal escape and intracellular proliferation of Francisella tularensis / FI. Geier, J. Colli // Infection and immunity. -2011.-№79.-P. 2204-2214.
78. Gelb, M. H. Therapeutic intervention based on protein prenylation and associated modifications / M. H. Gelb, L. Brunsveld, C. A. I-Irycyna, S. Michaelis, F. Tamanoi, W. C. Van Voorhis, H. Waldmann // Nature chemical biology. - 2006. - № 2. -P. 518-528.
79. Gelb, M. H. Protein prenylation: from discovery to prospects for cancer treatment / M. I-I. Gelb, J. D. Scholten, J. S. Sebolt-Leopold // Current opinion in chemical biology. - 1998. -№ 2. - P. 40-48.
80. Godlewska, R. Peptidoglycan-associatcd lipoprotein (Pal) of Gram-negative bacteria: function, structure, role in pathogenesis and potential application in
immunoprophylaxis / R. Godlewska, K. Wisniewska, Z. Pictras, E. K. Jagusztyn-Krynicka // FEMS microbiology letters. - 2009. -№ 298. - P. 1-11.
81. Hajjar, A. M. Lack of in vitro and in vivo recognition of Francisella tularensis subspecies lipopolysaccharide by Toll-like reccptors / A. M. Hajjar, M. D. I-Iarvcy, S. A. Shaffer, D. R. Goodlett, A. Sjostedt, et al. // Infection and immunity. -2006. - № 74. - P. 6730-6738.
82. Hast, M. A. Structural basis for binding and selectivity of antimalarial and anticancer ethylenediamine inhibitors to protein farnesyltransferase / M. A. Hast, S. Fletcher, C. G. Cummings, E. E. Pusateri, M. A. Blaskovich, et al. // Chemistry & biology.-2009.-№ 16.-P. 181-192.
83. Hollis, D. G. Francisella philomiragia comb. nov. (formerly Yersinia philomiragia) and Francisella tularensis biogroup novicicla (formerly Francisella novicida) associated with human disease / D. G. Hollis, R. E. Weaver, A. G. Steigerwalt, J. D. Wenger, C. W. Moss, D. J. Brenner // Journal of clinical microbiology. - 1989.-№27.-P. 1601-1608.
84. Horn, M. P. Simvastatin inhibits Staphylococcus aureus host cell invasion through modulation of isoprenoid intermediates / M. P. Horn, S. M. Knecht, F. L. Rushing, J. Birdsong, C. P. Siddall, et al. // J. Pharmacol. Exp. Ther. - 2008. -№ 326. -P. 135-143.
85. Howe, R. Isoprenoid biosynthesis inhibition disrupts Rab5 localization and food vacuolar integrity in Plasmodium falciparum / R. Howe, M. Kelly, J. Jimah, D. Hodge, A. R. Odom//Eukaryotic cell. - 2013. - № 12. - P. 215-223.
86. I-Iuynh, K. K. Regulation of vacuolar pH and its modulation by some microbial species / K. K. Huynh, S. Grinstein // Microbiology and molecular biology reviews. - 2007. - № 71. - P. 452-462.
87. Ikezawa H. Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins / PI. Ikezawa // Biological & pharmaceutical bulletin. - 2002. - № 25. - P. 409-417.
88. Ivanov, S. S. Lipidation by the host prenyltransferase machinery facilitates membrane localization of Legionella pneumophila effector proteins / S. S. Ivanov, G. Charron, II. C. Ilang, C. R. Roy // The Journal of biological chemistry. - 2010. - № 285.-P. 34686-34698.
89. Kamiya, Y. Structure of rhodotorucine A, a novel lipopeptide, inducing mating tube formation in Rhodosporidium toruloicles / Y. Kamiya, A. Sakurai, S.
Tamura, N. Takahashi // Biochemical and biophysical research communications. -1978.-№ 83.-P. 1077-1083.
90. Keim, P. Molecular epidemiology, evolution, and ecology of Francisella / P. Keim, A. Johansson, D. M. Wagner // Annals of the New York Academy of Sciences. -2007.-№ 1105.-P. 30-66.
91. Kellogg, B. A. Chain elongation in the isoprenoid biosynthetic pathway / B. A. Kellogg, C. D. Poulter // Current opinion in chemical biology. - 1997. - № 1. - P. 570-578.
92. Kilmury, S. L. The Francisella tularensis proteome and its recognition by antibodies / S. L. Kilmury, S. M. Twine // Frontiers in microbiology. - 2010. - № 1. -P. 143.
93. Krzysiak, A. J. Combinatorial modulation of protein prenylation / A. J. Krzysiak, D. S. Rawat, S. A. Scott, J. E. Pais, M. Flandley, M. L. I-Iarrison, C. A. Fierke, R. A. Gibbs. - ACS Chem. Biol., 2007 -P. 385-389.
94. Kumano, T. Chcmoenzymatic syntheses of prenylated aromatic small molecules using Streptomyces prenyltransferases with relaxed substrate specificities / T. Kumano, S. B. Richard, J. P. Noel, M. Nishiyama, T. Kuzuyama // Bioorg. Med. Chem. - 2008. - № 16.-P. 8117-8126.
95. Larsson, P. The complete genome sequence of Francisella tularensis, the causative agent of tularemia / P. Larsson, P. C. Oyston, P. Chain, M. C. Chu, M. Duffield, et al. // Nature genetics. - 2005. - № 37. - P. 153-159.
96. Le Pihive, E. Description of two new plasmids isolated from Francisella philomiragia strains and construction of shuttle vectors for the study of Francisella tularensis / E. Le Pihive, D. Blaha, S. Chenavas, F. Thibault, D. Vidal, E. Valade // Plasmid.-2009.-№62.-P. 147-157.
97. Levine, B. Autophagy in immunity and inflammation / B. Levine, N. Mizushima, H. W. Virgin//Nature.-2011.-№ 469.-P. 323-335.
98. Liang P. H. Reaction kinetics, catalytic mechanisms, conformational changes, and inhibitor design for prenyltransferases / P. H. Liang // Biochemistry. - 2009. - № 48.-P. 6562-6570.
99. Liang P. H. Structure, mechanism and function of prenyltransferases / P. H. Liang, Т. P. Ко, A. II. Wang // European journal of biochemistry. - 2002. - № 269. - P. 3339-3354.
100. Lytle, C. A. Sensitive characterization of microbial ubiquinones from biofilms by electrospray/mass spectrometry / C. A. Lytle, Y. D. Gan, K. Salone, D. C. White // Environmental microbiology. - 2001. -№ 3. - P. 265-272.
101. Maier, T. M. Construction and characterization of a highly efficient Francisella shuttle plasmid / T. M. Maicr, A. I-Iavig, M. Casey, F. E. Nano, D. W. Frank, T. C. Zahrt // Applied and environmental microbiology. - 2004. - № 70. - P. 7511-7519.
102. Mann, M. Proteomic analysis of post-translational modifications / M. Mann, O. N. Jensen // Nature biotechnology. - 2003. -№ 21. - P. 255-261.
103. Marchler-Bauer, A. CDD: conserved domains and protein three-dimensional structure / A. Marchler-Bauer, C. Zheng, F. Chitsaz, M. K. Derbyshire, L. Y. Geer, et al. //Nucleic acids research. -2013.-№ 41. - P. 348-352.
104. Maurer-Stroh, S. Towards complete sets of farnesylated and geranylgeranylated proteins / S. Maurer-Stroh, M. Koranda, W. Benetka, G. Schneider, F. L. Sirota, F. Eisenhaber // PLoS computational biology. - 2007. - № 3. - P. e66.
105. Maurer-Stroh, S. N-terminal N-myristoylation of proteins: prediction of substrate proteins from amino acid sequence / S. Maurer-Stroh, B. Eisenhaber, F. Eisenhaber//Journal of molecular biology. -2002. -№ 317. - P. 541-557.
106. Maurer-Stroh, S. MYRbase: analysis of genome-wide glycine myristoylation enlarges the functional spectrum of eukaryotic myristoylated proteins / S. Maurer-Stroh, M. Gouda, M. Novatchkova, A. Schleiffer, G. Schneider, F. L. Sirota, M. Wildpaner, N. Hayashi, F. Eisenhaber // Genome biology. - 2004. - № 5. - P. R21.
107. Maurer-Stroh, S. Refinement and prediction of protein prenylation motifs / S. Maurer-Stroh, F. Eisenhaber // Genome biology. - 2005. -№ 6. - P. R55.
108. Mayaka, R. K. Antimicrobial prenylated acetophenones from berries of Harrisonia abyssinica / R. K. Mayaka, M. K. Langat, J. O. Omolo, P. K. Cheplogoi // Planta medica. - 2012. - № 78. - P. 383-386.
109. McLendon, M. K. Francisella tularensis: taxonomy, genetics, and Immunopathogenesis of a potential agent of biowarfare / M. K. McLendon, M. A. Apicella, L. A. Allen// Annual review of microbiology. -2006. -№ 60. - P. 167-185.
110. Meinnel, T. Protein lipidation meets proteomics / T. Meinnel, C. Giglione // Frontiers in bioscience : a journal and virtual library. -2008. -№ 13. - P. 6326-6340.
111. Metzger, U. Structure and mechanism of the magnesium-independent aromatic prenyltransferase CloQ from the clorobiocin biosynthetic pathway / U.
Metzger, S. Keller, C. E. Stevenson, L. Heide, D. M. Lawson // Journal of molecular biology. - 2010. - № 404. - P. 611 -626.
112. Murata, D. GPT-anchor synthesis is indispensable for the germline development of the nematode Caenorhabditis elegans / D. Murata, K. H. Nomura, K. Dejima, S. Mizuguchi, N. Kawasaki, et al. // Molecular biology of the cell. - 2012. - № 23. - P. 982-995.
113. Navarro-Lerida, I. A palmitoylation switch mechanism regulates Racl function and membrane organization /1. Navarro-Lerida, S. Sanchez-Perales, M. Calvo, C. Rentero, Y. Zheng, C. Enrich, M. A. Del Pozo // The EMBO journal. - 2012. - № 31. -P. 534-551.
114. Norqvist, A. Construction of a shuttle vector for use in Francisella tularensis / A. Norqvist, K. Kuoppa, G. Sandstrom // FEMS immunology and medical microbiology. - 1996. - № 13. - P. 257-260.
115. Novelli, G. Protein farnesylation and disease / G. Novelli, M. R. D'Apice // Journal of inherited metabolic disease. -2012. -№ 35. - P. 917-926.
116. Ogura, K. Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation / K. Ogura, T. Koyama // Chemical reviews. - 1998. - № 98. - P. 1263-1276.
117. Oyston, P. C. Tularaemia: bioterrorism defence renews interest in Francisella tidarensis / P. C. Oyston, A. Sjostedt, R. W. Titball // Nature reviews. Microbiology. - 2004. - № 2. - P. 967-978.
118. Oyston, P. C. Francisella virulence: significant advances, ongoing challenges and unmet needs / P. C. Oyston, R. Griffiths // Expert review of vaccines. -2009.-№ 8.-P. 1575-1585.
119. Ozaki, T. NovQ is a prenyltransferase capable of catalyzing the addition of a dimethylallyl group to both phenylpropanoids and llavonoids / T. Ozaki, S. Mishima, M. Nishiyama, T. Kuzuyama // J. Antibiot. - 2009. - № 62. - P. 385-392.
120. Ozaki, T. Novel Tryptophan Metabolism by a Potential Gene Cluster That Is Widely Distributed among Actinomycetes / T. Ozaki, M. Nishiyama, T. Kuzuyama // The Journal of biological chemistry. - 2013. -№ 288. - P. 9946-9956.
121. Parsons, L. M. Peptidoglycan recognition by Pal, an outer membrane lipoprotein / L. M. Parsons, F. Lin, J. Orban // Biochemistry. - 2006. - № 45. - P. 21222128.
122. Pechous, R. D. Working toward the future: insights into Francisella tularensis pathogenesis and vaccine development / R. D. Pechous, T. R. McCarthy, T.
C. Zahrt // Microbiology and molecular biology reviews : MMBR. - 2009. - № 73. - P. 684-711.
123. Petersen, T. N. SignalP 4.0: discriminating signal peptides from transmembrane regions / T. N. Petersen, S. Brunak, G. von Heijne, H. Nielsen // Nature methods. - 2011. - № 8. - P. 785-786.
124. Podell, S. Predicting N-terminal myristoylation sites in plant proteins / S. Podell, M. Gribskov // BMC genomics. - 2004. - № 5. - P. 37.
125. Price, C. T. Exploitation of conserved eukaryotic host cell farnesylation machinery by an F-box effector oi Legionella pneumophila / C. T. Price, T. Al-Quadan, M. Santic, S. C. Jones, Y. Abu Kwaik// The Journal of experimental medicine. -2010. -№207.-P. 1713-1726.
126. Price, C. T. Host-mediated post-translational prenylation of novel dot/icm-translocated effectors of Legionella pneumophila / C. T. Price, S. C. Jones, K. E. Amundson, Y. A. Kwaik // Frontiers in microbiology. - 2010. - № 1. - P. 131.
127. Raslco, D. A. Development of novel plasmid vectors and a promoter trap system in Francisella tularensis compatible with the pFLNIO based plasmids / D. A. Rasko, C. D. Esteban, V. Sperandio // Plasmid. - 2007. -№ 58. - P. 159-166.
128. Reid, T. S. Crystallographic analysis reveals that anticancer clinical candidate L-778,123 inhibits protein farnesyltransferase and geranylgeranyltransferase-I by different binding modes / T. S. Reid, S. B. Long, L. S. Becse // Biochemistry. -2004. - № 43. - P. 9000-9008.
129. Reinicke, A. T. A Salmonella typhimwium effector protein SifA is modified by host cell prenylation and S-acylation machinery / A. T. Reinicke, J. L. Hutchinson, A. I. Magee, P. Mastroeni, J. Trowsdale, A. P. Kelly // The Journal of biological chemistry. - 2005. - № 280. - P. 4620-4627.
130. Ren, J. CSS-Palm 2.0: an updated software for palmitoylation sites prediction / J. Ren, L. Wen, X. Gao, C. Jin, Y. Xue, X. Yao // Protein engineering, design & selection: PEDS. - 2008. - № 21. - P. 639-644.
131. Resh, M. D. Targeting protein lipidation in disease / M. D. Resh // Trends in molecular medicine.-2012.-№ 18.-P. 206-214.
132. Revich, B. Climate change and zoonotic infections in the Russian Arctic / B. Revich, N. Tokarevich, A. J. Parkinson // International journal of circumpolar health. -2012.-№71.-P. 18792.
133. Rice, K. R. Dyslipidemia, statins and prostate cancer / K. R. Rice, M. 0. Koch, L. Cheng, T. A. Masterson // Expert review of anticancer therapy. - 2012. - №
12.-P. 981-990.
134. Richards, A. M. Cellular microbiology and molecular ecology of Legionella-amoeba interaction / A. M. Richards, J. E. Von Dwingelo, C. T. Price, Y. Abu Kwaik // Virulence. -2013. -№ 4. - P. 307 - 314.
135. Roberts, P. J. Rho Family GTPase modification and dependence on CAAX motif-signaled posttranslational modification / P. J. Roberts, N. Mitin, P. J. Keller, E. J. Chenette, J. P. Madigan, et al. // The Journal of biological chemistry. - 2008. - № 283. -P. 25150-25163.
136. Roskoski, R. Protein prenylation: a pivotal posttranslational process / R. Roskoski, Jr. // Biochemical and biophysical research communications. - 2003. - № 303.-P. 1-7.
137. Sambrook, J. Molecular Cloning: A Laboratory Manual / J. Sambrook, D. W. Russell. - Cold Spring Flarbor Laboratory Press, 2001. -V. 1 - 3.
138. Santic, M. The Francisella iularensis pathogenicity island protein IglC and its regulator MglA are essential for modulating phagosome biogenesis and subsequent bacterial escape into the cytoplasm / M. Santic, M. Molmeret, K. E. Klose, S. Jones, Y. A. Kwaik // Cellular microbiology. - 2005. - № 7. - P. 969-979.
139. Schmitt, D. M. Role ofNK cells in host defense against pulmonary type A Francisella iularensis infection / D. M. Schmitt, D. M. O'Dee, M. J. Brown, J. Florzempa, B. C. Russo, P. A. Morel, G. J. Nau // Microbes and infection Institut Pasteur. - 2013. - № 15. - P. 201 -211.
140. Seo, J. Post-translational modifications and their biological functions: proteomic analysis and systematic approaches / J. Seo, K. J. Lee // Journal of biochemistry and molecular biology. - 2004. - № 37. - P. 35-44.
141. Sigrist, C. J. PROSITE: a documented database using patterns and profiles as motif descriptors / C. J. Sigrist, L. Cerutti, N. I-Iulo, A. Gattiker, L. Falquet, M. Pagni, A. Bairoch, P. Bucher // Briefings in bioinformatics. - 2002. - № 3. - P. 265274.
142. Sjodin, A. Genome characterisation of the genus Francisella reveals insight into similar evolutionary paths in pathogens of mammals and fish / A. Sjodin, K. Svensson, C. Ohrman, J. Ahlinder, P. Lindgren, et al. // BMC genomics. - 2012. - №
13.-P. 268.
143. Sohn, H. Y. Antimicrobial and cytotoxic activity of 18 prenylated flavonoids isolated from medicinal plants: Moras alba L., Morns mongolica Schneider, Broussnetia papyrifera (L.) Vent, Sophora flavescens Ait and Echinosophora koreensis Nakai / II. Y. Sohn, K. II. Son, C. S. Kwon, G. S. Kwon, S. S. Kang // Phytomedicine : international journal of phytotherapy and phytopharmacology. - 2004. - № 11. - P. 666-672.
144. Sorek, N. Differential effects of prenylation and s-acylation on type I and II ROPS membrane interaction and function / N. Sorek, O. Gutinan, E. Bar, M. Abu-Abied, X. Feng, et al. // Plant physiology. - 2011. - № 155. - P. 706-720.
145. Soto, E. Francisella noatunensis subsp. orientalis pathogenesis analyzed by experimental immersion challenge in Nile (ilapia, Oreochromis niloticus (L.) / E. Soto, S. Kidd, S. Mcndez, D. Marancik, F. Revan, D. Hiltchie, A. Camus // Veterinary microbiology.-2013,-№ 164.-P. 77-84.
146. Stothard, P. The sequence manipulation suite: JavaScript programs for analyzing and formatting protein and DNA sequences / P. Stothard // Biotechniques. -2000.-№28.-P. 1102-1104.
147. Su, J. Genome-wide identification of Francisella talarensis virulence determinants / J. Su, J. Yang, D. Zhao, T. H. Kawula, J. A. Banas, J. R. Zhang // Infection and immunity. - 2007. - № 75. - P. 3089-3101.
148. Sugiyama, A. Metabolic engineering for the production of prenylated polyphenols in transgenic legume plants using bacterial and plant prenyltransferases / A. Sugiyama, P. J. Linley, K. Sasaki, T. Kumano, H. Yamamoto, et al. // Metab. Eng. -2011. -№ 13. - P. 629-637.
149. Tate, E. W. Recent advances in chemical proteomics: exploring the post-translational proteome / E. W. Tate // Journal of chemical biology. - 2008. - № 1. - P. 17-26.
150. Thakran, S. Identification of Francisella tularensis lipoproteins that stimulate the toll-like receptor (TLR) 2/TLR1 heterodimer / S. Thakran, H. Li, C. L. Lavine, M. A. Miller, J. E. Bina, X. R. Bina, F. Re // The Journal of biological chemistry. - 2008. - № 283. - P. 3751 -3760.
151. Thurnher, M. Novel aspects of mevalonate pathway inhibitors as antitumor agents / M. Thurnher, O. Nussbaumer, G. Gruenbacher // Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. - 2012. - № 18. - P. 3524-3531.
152. Titball, R. W. Francisella tularensis genomics and proteomics / R. W. Titball, J. F. Petrosino // Annals of the New York Academy of Sciences. - 2007. - № 1105.-P. 98-121.
153. Trueblood, C. E. Genetic evidence for in vivo cross-specificity of the CaaX-box protein prenyltransferases farnesyltransferase and geranylgeranyltransferase-I in Saccharomyces cerevisiae / C. E. Trueblood, Y. Ohya, J. Rine // Molecular and cellular biology. - 1993. - № 13. - P. 4260-4275.
154. Tsuji, F. Geranyl modification on the tryptophan residue of ComXRO-E-2 pheromone by a cell-free system / F. Tsuji, A. Ishihara, K. Kurata, A. Nakagawa, M. Okada, et al. // FEBS letters. - 2012. -№ 586. - P. 174-179.
155. Vanhaesebroeck, B. Signaling by distinct classes of phosphoinositide 3-kinases / B. Vanhaesebroeck, M. D. Waterfield // Experimental cell research. - 1999. -№ 253. -P. 239-254.
156. Walsh, C. T. Posttranslational Modification Of Proteins: Expanding Nature's Inventory / C. T. Walsh. - Roberts and Company Publishers, 2006. - 495 p.
157. Wehrly, T. D. Intracellular biology and virulence determinants of Francisella tularensis revealed by transcriptional profiling inside macrophages / T. D. Wehrly, A. Chong, K. Virtaneva, D. E. Sturdevant, R. Child, et al. // Cellular microbiology.-2009.-№ 11. - P. 1128-1150.
158. Winter-Vann, A. M. Targeting Ras signaling through inhibition of carboxyl methylation: an unexpected property of methotrexate / A. M. Winter-Vann, B. A. Kamen, M. O. Bergo, S. G. Young, S. Melnyk, S. J. James, P. J. Casey // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. - 2003. -№ 100. -P. 6529-6534.
159. Wobeser, G. Tularemia, plague, yersiniosis, and Tyzzer's disease in wild rodents and lagomorphs in Canada: a review / G. Wobeser, G. D. Campbell, A. Dallaire, S. McBurney // The Canadian veterinary journal. La revue veterinaire canadienne. -2009.-№50.-P. 1251-1256.
160. Wolfe, L. M. Proteomic definition of the cell wall of Mycobacterium tuberculosis / L. M. Wolfe, S. B. Mahaffey, N. A. Kruh, K. M. Dobos // Journal of proteome research. -2010. -№ 9. - P. 5816-5826.
161. Wollack, J. W. Multifunctional prenylated peptides for live cell analysis / J. W. Wollack, N. A. Zeliadt, D. G. Mullen, G. Amundson, S. Geier, S. Falkum, E. V.
Wattenberg, G. Barany, M. D. Distefano // Journal of the American Chemical Society. -2009.-№ 131.-P. 7293-7303.
162. Xue, Y. NBA-Palm: prediction of palmitoylation site implemented in Naive Bayes algorithm / Y. Xue, H. Chen, C. Jin, Z. Sun, X. Yao // BMC bioinformatics. -2006,-№7.-P. 458.
163. Yokoyama, K. Protein farnesyltransferase from Trypanosoma brucei. A heterodimer of 61- and 65-kda subunits as a new target for antiparasite therapeutics / K. Yokoyama, P. Trobridge, F. S. Buckner, W. C. Van Voorhis, K. D. Stuart, M. H. Gelb // The Journal of biological chemistry. - 1998. -№ 273. - P. 26497-26505.
164. Yokoyama, K. Prenylation of proteins in Trypanosoma brucei / K. Yokoyama, Y. Lin, K. D. Stuart, M. H. Gelb // Molecular and biochemical parasitology. - 1997.-№87.-P. 61-69.
165. Zhang, F. L. Protein prenylation: molecular mechanisms and functional consequences / F. L. Zhang, P. J. Casey // Annual review of biochemistry. - 1996. - № 65.-P. 241-269.
166. Zhang, Y. I-TASSER server for protein 3D structure prediction / Y. Zhang // BMC bioinformatics. - 2008. - № 9. - P. 40.
167. Zhou, F. CSS-Palm: palmitoylation site prediction with a clustering and scoring strategy (CSS) / F. Zhou, Y. Xue, X. Yao, Y. Xu // Bioinformatics. - 2006. -№ 22.-P. 894-896.
168. Zogaj, X. Genetic manipulation of Francisella tularensis / X. Zogaj, K. E. Klose // Frontiers in microbiology. - 2010. - № 1. - P. 142.
Список использованных сокращений
а.о. - аминокислотный остаток
ГТААГ - полиакриламидный гель
п.н. - пар нуклеотидов
ГТТМ - посттрансляционные модификации
ЭПР - эндоплазматический ретикулум
CFU - единица, формирующая одну колонию
DPPS — декапренилпирофосфатсинтаза
FGPPS - фарнезилгеранилпирофосфатсинтаза
FPI - «островок» патогенности франчизеллы
FPP - фарнезилпирофосфат
FT - фарнезилтрансфераза
FTI - ингибиторы фарнезилтрансфераз
GGPPS — геранилгеранилпирофосфатсинтаза
GGT1 - гсранилгеранилтрансфераза 1
GGT2 - геранилгеранилтрансфераза 2
GPI -гликозилфосфатидилинозитол
GPP - геранилгеранилпирофосфата
HepPPS - гептапренилпирофосфатсинтаза
HMG-CoA - З-гидрокси-З-метилглутарил коэнзим А
ICMT — изопренил-цистеинкарбоксил метилтрансфераза
IPP - изопентенилдифосфат
IPPS - изопренилпирофосфатсинтазы
MOI - от англ. multiplicity of infection
MVA - мевалонат
MVAP - 5-фосфомевалонат
OD - оптическая плотность
OPPS - октапренилпирофосфатсинтаза
PrePS — от англ. Prenylation Prediction Suite
PT - пренилтрансфераза
RCE1 - Ras- конвертирующий фермент 1
RFP - красный флуоресцентный белок
SCV - вакуоль, содержащая сальмонеллу
SPPS - соланезилпирофосфатсинтаза
UPP - ундекапренилдифосфатсинтаза
Список иллюстративного материала
Страница
Список таблиц:
Таблица 1. Программы для предсказания сайтов ковалентного
присоединения к белкам гидрофобных групп................................. 21
Таблица 2. Бактериальные штаммы и плазмиды.................... 47
Таблица 3. Праймеры..................................................... 51
Таблица.4. Предсказание пренилирования с помощью
программы РгеРБ..................................................................... 79
Таблица.5. Результаты моделирования 1-ТА88ЕЯ..................
Таблица 6. Результаты масс-спектрального анализа............... 93
Таблица 7. Анализ гомологичных белков к ФТН-0357 внутри
рода Ргапс1зе11а....................................................................... 99
Таблица 8. Результаты РгеРБ анализа бактериальных белков ОшрА семйства.......................................................................
Список рисунков:
Рис.1. Биосинтез изопреноидов в эукариотичсских клетках............26
Рис.2. Процесс пренилирования в эукариотических клетках... ... 29
Рис.3. Молекулярные маркеры для электрофореза ДНК......................54
Рис.4 Молекулярные маркеры для электрофореза белков..................62
Рис.5. Результаты секвестрования рКК2\4-РтгА......................................70
Рис.6. Рестрикционный анализ рКК214-РтгА................................................71
Рис.7. Полилинкерный регион: графическое представление
всех коммерчески доступных сайтов узнавания рестриктазами........................72
Рис.8. Отбор плазмидной ДНК, несущей вставку полилинкера... 73
Рис.9. Результаты секвенирования рКК-полилинкер....... ................74
Рис.10. Рестрикционный анализ рКК-полилинкер........ ....................74
Рис.11. ПЦР амплификация ФТН-0627 гена....................................................75
Рис.12. ПЦР для проверки эффективности реакции
лигирования......................................................................................................................................................76
Рис.13. Отбор рКК-ФТН-6027 с помощью рестрикции по Ря(1... 77 Рис.14. Карта-схема конструкций рКК-полилинкер и рКК-
ФТН-6027............................................................................................................................................................77
Рис.15. Хитиназная активность штаммов Р. поутйа Ш12................78
Рис.16. ПЦР амплификация генов Г. Пйагепз\$ 8СНи 84....................81
Рис.17. ПЦР для отбора рекомбинантных конструкций........................82
Рис.18. Карты-схемы конструкций............................................................................83-85
Рис.19. Иммуноблотинг для детектирования экспрессии и
пренилировнаия............................................................................................................................................86
Рис.20. Результаты метода клик-ит..........................................................................88
Рис.21. Изучение мутантных штаммов Р. по\\сгс1а Ш12 по
генам ФТН-1542, ФТН-0573, ФТН-0592,ФТН-0426......................................................89
Рис.22. Инфекция культуры клеток Т7! поУ1С1с!а Ш12..............................91
Рис.23. Обогащение гидрофобных фракций белка....................................92
Рис.24. ПЦР ФТН-0357........................................................................................................95
Рис.25. Экспрессия ФТН-0357 и обнаружение его
пренилирования............................................................................................................................................95
Рис.26. Предсказание вторичной структуры ФТН-0357........................96
Рис. 27.Предсказание пространственной структуры ФТН-0357.. 97 Рис.28. Результаты анализа белка ФТН-0357 с помощью
SignalP 4.1............................................................................................................................................................98
Рис.29. ФТН-0357: события в клетке........................................................................109
Обратите внимание, представленные выше научные тексты размещены для ознакомления и получены посредством распознавания оригинальных текстов диссертаций (OCR). В связи с чем, в них могут содержаться ошибки, связанные с несовершенством алгоритмов распознавания. В PDF файлах диссертаций и авторефератов, которые мы доставляем, подобных ошибок нет.