Методология и результаты молекулярно-генетического изучения вакцинного штамма Francisella tularensis тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, доктор биологических наук Павлов, Виталий Михайлович

• Павлов, Виталий Михайлович
• доктор биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации доктор биологических наук Павлов, Виталий Михайлович

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ, УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛС

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Туляремийная инфекция - общие сведения

1.2. Таксономия рода РгапшэеИа

1.3. Геном К Ш1агет1$

1.4. Рли1агеп51Б и плазмиды

1.5. Факторы патогенно сти Р. ШШгепягя

1.6. Генетические и генно-инженерные методы исследования 37 бактерий Т7. ш1агет1Б

1.6.1. Клонирование генов

1.6. 2. Мутагенез Р. Ы1агет

1.7. Туляремийные вакцины

1.7.1. Вакцины, приготовленные из убитых клеток

1.7.2. Химические вакцины

1.7.3. Живая туляремийная вакцина

1.8. Рекомбинантные вакцины

1.9. Характеристика белков - протективных антигенов возбудите- 52 ля туберкулеза

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Методология и результаты молекулярно-генетического изучения вакцинного штамма Francisella tularensis»

Актуальность проблемы

Разработка современных лекарственных препаратов для лечения- инфекционных заболеваний и средств их профилактики основывается, на детальных данных о молекулярных структурах факторов, патогенности и механизмах их действия. В частности, для. создания вакцин важно знать, какие антигены являются протективными, а какие компоненты бактерий подавляют защитную функцию иммунной системы организма. История изучения возбудителя туляремии насчитывает более ста лет, однако до настоящего времени нет исчерпывающих сведений .о факторах патогенности бактерий Francisella tularensis, их молекулярных структурах и механизмах действия (Titball R. W. et al., 2003; Домарадский И. В., 2005; Sjostedt А., 2006). Исследование генома туляремийного микроба является' одним из магистральных направлений решения проблем, связанных с разработкой новых и совершенствованием уже имеющихся средств и методов борьбы с туляремией. Проведенные недавно работы по определению нуклеотидных последовательностей геномов аттенуированного вакцинного штамма F. tularensis subsp. holarc-tica LVS [http://bbrp.llnl;gov/bbrp/html/microbe. html] и природного штамма F. tularensis subsp. tularensis Schu4 (Larsson P. et al., 2005) открыли широкие перспективы для изучения факторов патогенности и поиска протективных антигенов •туляремийного микроба.

До недавнего времени адаптация общепринятых генетических методов для исследования генома F. tularensis представляла собой достаточно сложную проблему, что существенно препятствовало эффективному применению всего современного методического потенциала микробиологии для решения задач по выявлению факторов-патогенности и иммуногенности туляремийного микроба.

•Детальное исследование молекулярной структуры криптической плаз-миды из бактерий F. novicida like F6168 (Родионова И. В. и др. 1991) позволит получить новые данные о влиянии данной плазмиды на биологические свойства бактерий рода Francisella и получить информацию, необходимую для конструирования плазмидных векторов.

Важным этапом в исследованиях геномов микроорганизмов является перенос генетических структур в бактериальные клетки изучаемых микроорганизмов. Отсутствие информации о плазмидах, способных реплицироваться в F. tularensis, до последнего времени сдерживало адаптацию переноса ДНК в клетки туляремийного микроба методами трансформации. Оптимизация методов криотрансформации и конъюгации для F. tularensis позволит переносить в бактерии генетические конструкции для аллельного обмена и создавать модельные штаммы для изучения метаболизма туляремийного микроба.

Показано, что бактерии штамма F. tularensis LVS модулируют белковый синтез, во время роста в макрофагах. Среди белков, индуцируемых при размножении бактерий F. tularensis внутри макрофагов, выделяется' белок с молекулярной массой 23 кДа (Golovliovl. etal., 1997), однако функциональная роль этого белка в патогенезе F. tularensis до последнего времени выяснена не была. Одним из путей решения этой проблемы может стать разработка метода аллельного обмена генов в хромосоме F. tularensis, позволяющего конструировать изогенные штаммы, отличающиеся только по изучаемому гену.

Первичным защитным барьером прокариотических и эукариотических клеток являются белки семейства суперокиддисмутаз (СОД), которые превращают токсичный радикал 02 в молекулярный кислород Ог и перекись водорода (Н202) (Miller R. A. et al., 1997). У туляремийного микроба также выявлена СОД (Шимоняк Н. И. и др., 1992), тем не менее, роль этого фермента в патогенезе туляремии и в бактериальном метаболизме до последнего времени не была выяснена. Попытки инактивации СОД в других патогенных микроорганизмах приводили к потере жизнеспособности бактерий. Поскольку метод аллельного обмена позволяет не только инактивировать гены, но и модулировать их синтез, этот подход может быть использован для изучения СОД туляремийного микроба.

Живая туляремийная вакцина на основе штамма F. tularensis 15/10 была создана в СССР в 40-50 годах двадцатого столетия (Олсуфьев Н. Г., 1975). На основе этого же штамма в США был получен штамм F. tularensis LVS и создана экспериментальная живая вакцина (Eigelsbach Н. Т. et al, 1961).

Поскольку обе вакцины обладают определенной реактогенностью, обусловленной не охарактеризованными пока факторами патогенности (Олсуфьев Н. Г., 1975), то проводимый в настоящее время сравнительный анализ нук-леотидных последовательностей геномов вакцинного штамма LVS и природных штаммов, несомненно, облегчит задачу создания генетически охарактеризованного современного вакцинного штамма без остаточных факторов ре-актогенности. Очевидно, что без эффективных методов целенаправленного аллельного замещения невозможно достижение существенных успехов в понимании молекулярных основ действия факторов как реактогенности, так и иммуногенности туляремийного микроба.

В качестве бактериальных векторов для получения рекомбинантных вакцин используют целый ряд микроорганизмов, среди которых: аттенуиро-ванные штаммы М. tuberculosis (Ellner J. J., 1998; SenaratneR. H, et al., 2007; Henao-Tamayo M. et al., 2007), близкородственные микобактерии (Abou-Zeid C. et al., 1997), а также сальмонеллы (Mollenkopf H. J. et al., 2001) и некоторые другие (Miki К. et al., 2004). Известно, что туляремийная вакцина, обладая умеренной реактогенностью, вызывает формирование длительного напряженного иммунитета (Tarnvik А., 1989). Кроме специфического иммунитета вакцинные штаммы F. tularensis индуцируют краткосрочную неспецифическую защиту против других внутриклеточных патогенов - Legionella, Listeria и др. (Belyi Y. F. et al., 1996). До последнего времени изучение имму-номодулирующих свойств штамма F. tularensis 15/10 сдерживалось из-за отсутствия генетических методов по переносу дополнительных генов, кодирующих протективные антигены, в клетки вакцинного штамма туляремийного микроба. Изучение иммунобиологических свойств вакцинного штамма туляремийного микроба с гетерологичными протективными антигенами, в частности, с наиболее иммуногенными антигенами Ag85B и ESAT-6 М. tuberculosis, позволит оценить потенциал использования вакцинного ту-ляремийного штамма в качестве нового бактериального вектора.

Все вышеизложенное обосновывает актуальность разработки* молекулярных инструментов для- всестороннего исследования туляремийного микроба. Полученные модифицированные штаммы туляремийного микроба* смогут открыть новые перспективы для изучения иммунобиологических свойств туляремийного микроба и получить детальную информацию о факторах па-тогенности и иммуногенности F. tularensis.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы является разработка методологии молекулярно-генетического изучения F. tularensis и оценка с ее помощью роли отдельных генетических структур в иммунопатогенезе туляремийной инфекции.

Для осуществления данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Адаптировать и оптимизировать условия переноса плазмидных ДНК в клетки F. tularensis методами трансформации, конъюгации и мобилизации.

2. Определить и проанализировать нуклеотидную последовательность критической плазмиды из. бактерий F. novicidaAike F6168, а также исследовать функциональную активность выявленных плазмидных генов.

3. Создать ряд плазмидных векторов для' клонирования промоторов и экспрессии гетерологичных генов протективных антигенов в клетках F. tularensis и изучить их свойства.

4. Создать варианты вакцинного штамма F. tularensis 15/10, синтезирующие протективные антигены возбудителя туберкулеза, и изучить иммунобиологические свойства полученных штаммов.

5. Разработать систему аллельного замещения генов в хромосоме туляремийного микроба и способ получения вариантов вакцинного штамма F. tularensis с модифицированными генами iglC и sodB.

6. Изучить иммунобиологические свойства полученных вариантов F. tularensis 15/10 и штамма LVS, дефектных по генам iglC и sodB.

Новизна исследования

Впервые разработана система для аллельного замещения генов в хромосоме F. tularensis. Созданы плазмидные векторы для конструирования плазмид, необходимые для осуществления аллельного обмена в хромосоме F. tularensis. Предложенный метод позволяет: а) удалять определенные участки генома F. tularensis, б) модифицировать регуляторные и другие области оперонов; в) получать генетически маркированные вакцинные штаммы F. tularensis.

Впервые в геноме F. tularensis выявлены две копии гена iglC, кодирующего белок с молекулярной массой 23 кДа, и показана необходимость продукта гена iglC для внутримакрофагального размножения вакцинного штамма F. tularensis. Вариант вакцинного штамма без генов iglC не защищал вакцинированных мышей от гибели при заражении штаммом F. tularensis 503.

Показано снижение экспрессии гена sodB в F. tularensis в результате замены последовательности нуклеотидов инициирующего кодона ATG на GTG в гене sodB. Вакцинный штамм со сниженным уровнем синтеза белка СОД В обладает меньшей вирулентностью для мышей, чем немодифициро-ванный вакцинный штамм.

Впервые показана возможность введения> плазмид в вакцинный штамм туляремийного микроба методом криотрансформации. Оптимизированы условия криотрансформации F. tularensis^

Впервые показана возможность мобилизации плазмид из клеток Escherichia coli в клетки F. tularensis и оптимизированы условия межвидового скрещивания. Созданы мобилизуемые плазмидные векторы, позволяющие переносить фрагменты ДНК из клеток Е. coli в клетки F. tularensis.

Впервые получен вариант конъюгативной плазмиды pSa, способный с высокой эффективностью переноситься из клеток Е. coli в клетки F. tularensis и, наоборот, из F. tularensis в Е. coli.

Проведено структурно-функциональное исследование криптической. плазмиды из рода Francisella — плазмиды pFNLlO. Выявлена способность плазмиды pFNLlO стабильно-реплицироваться в клетках вакцинного штамма, туляремийного > микроба. Показано, что вклад в, стабильность наследования плазмиды pFNLlO бактериями,Е. tularensis вносят продукты-плазмидных генов, кодирующих белки, гомологичные белкам Phd-Doc системыфага Р 1.

Впервые' созданы стабильные плазмидные векторы для> вакцинного штамма F. tularensis, позволившие приступить к изучению возможности использования туляремийного вакцинного штамма в качестве реципиента при создании современных рекомбинантных вакцинных штаммов.

Впервые на основе вакцины F. tularensis 15/10 созданы штаммы, синтезирующие протективные. антигены возбудителя туберкулеза. Показан, повышенный синтез клетками F. tularensis гибридных белков,, состоящих из ди-дерной части предшественника основного белка внешней, мембраны F. tularensis Fop А и белкового антигена М tuberculosis.

Впервые показано формирование специфического иммунного ответа на туберкулезные антигены у мышей, вакцинированных штаммами.F. tularensis, синтезирующими протективные антигены возбудителя туберкулеза. Вакцинированные мыши обладали повышенной устойчивостью к аэрозольному заражению возбудителем туберкулеза.

Показана принципиальная возможность использования туляремийного вакцинного штамма в качестве реципиента при создании прототипов рекомбинантных вакцинных штаммов.

Практическая значимость

Разработана простая и надежная методология направленного конструирования неревертирующих мутантов F. tularensis, сочетающая локализованный мутагенез in vitro и гомологичную рекомбинацию in vivo, а также позволяющая получать достоверные данные о роли выбранных генов в проявлении патогенных и иммуногенных свойств возбудителя туляремии.

Оптимизированы способы стабилизации наследования и экспрессии генетической информации в клетках F. tularensis и подобраны векторы, обеспечивающие стабильную продукцию туберкулезных антигенов в клетках вакцинного штамма F. tularensis.'

Сконструированы, штаммы F. tularensis RVp 17 и RVpl8, способные к синтезу основных протективных антигенов- возбудителя туберкулеза, которые могут служить основой для разработки новой рекомбинантной живой туберкулезной вакцины.

В Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур ГКПМ-Оболенск) депонированы 11 авторских штаммов, необходимые для изучения генетических детерминант факторов иммуногенности и патогенности возбудителя туляремии, а также сайт-направленного мутагенеза туляремийного микроба.

Результаты проведенных исследований послужили основой или были учтены при составлении ниже перечисленных документов: Методические указания МУ 3.3.1.2161-07 «Основные требования к вакцинным штаммам туляремийного микроба»1 (Федеральный уровень внедрения, 2007 г.), Методические рекомендации «Сайт-направленный мутагенез генома туляремийного микроба» (Учрежденческий уровень внедрения, 2003 г.) и Методические рекомендации «Сайт-направленный мутагенез генома туляремийного микроба» (Учрежденческий уровень внедрения, 2009 г.)

Положения, выносимые на защиту:

1. Комплекс методических приемов, позволяющих переносить плазмиды в бактерии F. tularensis 15/10 методами криотрансформации и мобилизации. Вариант конъюгативной плазмиды pSa, при скрещивании который способен переходить из клеток Е. coli в бактерии F. tularensis 15/10 и обратно. Методология1 переноса плазмид в клетки F. tularensis позволяет создавать генетически маркированные штаммы, необходимые для всестороннего изучения факторов иммуногенности и патогенности ту-ляремийного микроба.

2. Плазмида pFNLlO, выделенная из штамма F. novicida like F6168, способна реплицироваться в F. tularensis и содержит все элементы для репликации по тета-механизму. Наличие в плазмиде pFNL 10-генов, кодирующих белки, гомологичные белкам Phd-Doc системы, обуславливает высокую стабильность наследования данной плазмиды бактериями F. tularensis. Плазмида pFNLlO является основой для создания, плаз-мидных векторов для F. tularensis.

3. Плазмидные векторы для F. tularensis, позволяющие клонировать промоторы и экспрессировать гетерологичные гены протективных антигенов в вакцинном штамме туляремийного микроба. Высокоэффективный способ экспрессии протективных антигенов М. tuberculosis в вакцинном штамме F. tularensis 15/10.

4. Штаммы F. tularensis, экспрессирующие микобактериальные антигены Ag85B и ESAT-6, которые индуцируют противотуберкулезный Т-клеточный иммунный ответ у вакцинированных мышей и создают специфическую защиту мышей на модели легочной формы туберкулеза.

5. Способ целенаправленного создания вариантов вакцинного штамма F. tularensis с модифицированными генами и делециями в хромосоме, основанный на методе аллельного обмена.

6. Ген iglC в хромосоме F. tularensis находится в двух копиях. Направленное "выключение" синтеза 23 кДа белка, кодируемого геном iglC, в штаммах F. tularensis 15/10 и LVS приводит к подавлению способности клеток F. tularensis к внутримакрофагальному размножению.

7. Продукт гена sodB F. tularensis необходим для жизнеспособности туляремийного микроба. Замена инициирующего кодона ATG на GTG в гене sodB приводит к снижению уровня экспрессии гена sodB в клетках F. tularensis. Штамм F. tularensis FtsodB, несущий модифицированный ген sodB, обладает сниженной вирулентностью для мышей по сравнению с исходным штаммом F. tularensis LVS.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ'

Материалы диссертации доложены и» представлены на 10 международных и 7 российских научных конференциях: Всесоюзной' научной конференции «Актуальные проблемы профилактики туляремии» (Симферополь, 1991); XIV научно-практической конференции ГосНИИПМ "Новые технологии и биосистемы. Достижения и перспективы" (Оболенск, 1991); Российской научной конференции "Генетика и биохимия вирулентности возбудителей особо опасных инфекций" (Волгоград, 1992); Российской научной конференции "Иммунология и специфическая профилактика особо опасных инфекций" (Саратов, 1993); Международной конференции "Проблемы биологической и экологической безопасности" (Оболенск, 2000); Юбилейной научной конференции, посвященной 75-летию НИИ микробиологии МО РФ (Киров, 2003); 3-м Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005); VII-й Межгосударственной научно-практической- конференции государств-участников СНГ (Оболенск, 2006); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 2008); First International Conference on Tularemia (Umea, Sweden, 1995); Second International Conference on Tularemia (Hradec Kralove, Czech Republic, 1997); 3rd International Conference on Anthrax University of Plymouth, (UK, 1998); International Conference 'Probth lems of Medical and Ecological Biotechnology (Obolensk, 1999); 4 International Conference on Tularemia (City of Bath, UK, 2003); First International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology "BioMicroWorld-2005" (Badajoz, Spain, March, 2005); NIAID Research Conference (Opatia, Croatia, 2006); 5th International Conference on Tularemia Marine Biological Labs Woods Hole, MA, (USA, 2006).

Диссертация обсуждена и одобрена на межлабораторной научном семинаре ГНЦ ПМБ 30 июня 2010 г. протокол № 15.

ПУБЛИКАЦИИ

По теме диссертации опубликовано 40 научных работ, в том числе 12 статей, представленных в научных журналах, рекомендованных ВАК; один патент и одна заявка на патент.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Работа состоит из введения; обзора литературы; собственных исследований, включающих описание материалов, методы исследований и экспериментальную часть; заключения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 252 страницах, содержит 31 таблицу и 69 рисунков. Список литературы включает 278 работы (из них 62 отечественных и 216 зарубежных).

Заключение диссертации по теме «Микробиология», Павлов, Виталий Михайлович

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Разработанные и адаптированные1 нами методы переноса плазмид в клетки туляремийного микроба с помощью, криотрансформации, электропо-рации-и'конъюгации позволяют не только детально изучать механизмы) переноса, плазмид в бактерии F. tularensis, но и исследовать влияние плазмид, на иммунобиологические свойства туляремийного микроба. Кроме того, такие работы тесно связаны с проблемой изучения эволюции туляремийного микроба.

Обнаружение того факта, что ряд плазмид из бацилл и стафилококков способны реплицироваться и экспрессировать свои гены антибиотикоустой-чивости в туляремийном микробе, позволило нам показать, что метод криотрансформации позволяет с высокой эффективностью передавать плазмид-ные ДНК в клетки F. tularensis . Метод электропорации, адаптированный нами для штамма F. tularensis 15/10, также может быть применим для введения плазмидных ДНК в другие штаммы туляремийного микроба.

Проведенный детальный анализ единственной обнаруженной до^ недавнего времени плазмиды pFNLlO у бактерий рода Francisella позволил нам и ряду других исследователей создать серию векторных плазмид, необходимых для изучения возбудителя туляремии. Несмотря на целый ряд полученных, интересных результатов, остается не выясненным вопрос о биологической роли данной плазмиды в метаболизме бактерий рода Francisella.

Создание эффективных методов переноса плазмид в бактерии F. tularensis позволило приступить к разработке системы аллельного обмена в туляремийном микробе. Важность данной разработки определялась тем, что в последнем десятилетии накоплен большой объем информации о нук-леотидных последовательостях геномов различных подвидов F. tularensis, позволяющий проводить внутривидовой сравнительный анализ генетических структур туляремийного микроба, но и осуществлять поиск гомологий с геномами других видов бактерий. Выявленные особенности позволяют углубить наши знания молекулярно-генетических механизмов изучаемых генов в метаболизме возбудителя туляремии.

Созданная нами плазмида рНУЗЗ'шоЬ с уникальными свойствами репликации,в туляремийного микробе с меньшей.скоростью, чем деление клеток К ¿и/ягеляи', явилась основой для создания нового вектора для аллельного обмена, позволяющего использовать не только метод' мобилизации, но и метод трансформации для< переноса созданных генетических конструкций в клетки туляремийного микроба

Поскольку теоретические выводы нуждаются в экспериментальной проверке, то метод аллельного обмена и является адекватным инструментом для решения задач подобного рода. Нами показано, что данный подход может быть использован не только для инактивации целевых генов; но и для модуляции уровня трансляции матричных РНК генов-мишеней. Не вызывает сомнений, что спектр использования разработанного метода аллельного обмена может быть расширен.

Выбранный нами ген щ1С для-демонстрации эффективности метода аллельного обмена позволил нам не только получить штаммы с делегированным геном но и показать, что в геноме туляремийного микроба находится две копии этого гена. Анализ нуклеотидной последовательностей, проведенных другими исследователями позднее, подтвердил наш вывод. Оказалось, что ген iglC находится на острове патогенности и в геноме К Ш/ш'етшя имеются две копии этого острова патогенности. Изучение свойств вариантов вакцинного штамма с делетированной одной и двумя копиями гена iglC позволило углубить наши знания об иммунопатогенезе туляремийного микроба.

Метод аллельного обмена является ключевым при создании современной живой туляремийной вакцины, поскольку такая работа должна основываться на максимально полной картине иммуннопатогенеза туляремийного микроба.

Нами были проведены исследования по возможности создания поливалентных вакцинных штаммов на основе Р. ШШгеттэ 15/10, формирующего иммунитет к нескольким возбудителям инфекционных заболеваний, таким, как туберкулез, чума и сибирская язва. Поскольку используемый вакцинный штамм Р. Ы1агегт8 15/10 обладает определенными недостатками, то в настоящее время нами ведутся исследования по снижению реактогенности и изучению возможности создания вакцинного штамма, отвечающего всем современным требованиям вакцинологии.

Созданный стабильный плазмидный вектор рРМС1 позволил нам впервые показана возможность экспрессии генов микобактериальных антигенов в клетках вакцинного штамма Р. ы1агепБ18 15/10 и Г. ¿м/штум1 ЬУ8. Для эффективной экспрессии микобактериальных антигенов в клетках туля-ремийного микроба нами были сконструированы гибридные гены, состоящие из лидерной части РорЬ мембранного белка БорА Р. ййагепзгз и структурных частей зрелых белков Ag85B и слитного белка Ag85B-ESAT6.

Полученные экспериментальные данные позволяют с уверенностью утверждать, что данное направление работы является перспективным. Однако, следует отметить, что плазмидная локализация гибридных генов протектив-ных антигенов нежелательна согласно требованиям, предъявляемым к вакцинным штаммам, в частности, требованию по исключению генов, кодирующих устойчивость бактерий к антибиотикам. Метод аллельного обмена позволяет решить эту проблему в результате встраивания дополнительных конструкций в несущественные для метаболизма области хромосомы вакцинного штамма туляремийного микроба.

Принципиальная новизна полученных результатов заключается в том, что впервые созданы молекулярные инструменты, позволившие приступить к целенаправленному созданию живой туляремийной вакцины нового поколения. Разработанная методология позволила получить новые сведения о моле-кулярно-генетических механизмах патоиммуногенеза Р. (ЫагепБгя.

Анализ публикаций в области молекулярно-генетических исследований бактерий рода РгапшеИа позволяет констатировать, что данные, полученные в ходе выполнения данной диссертационной работы, широко цитируются в научной литературе, что говорит о их современности и актуальности.

Анализ результатов диссертационной работы позволяет сделать вывод о том, что все поставленные задачи решены, а полученные результаты явились базой для решения прикладных задач по созданию новых средств профилактики, лечения и диагностики заболевания туляремией.