Формирование иммунного ответа макроорганизма на введение белковолипополисахаридного комплекса Francisella tularensis разных подвидов: экспериментальное исследование тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 14.03.03, кандидат биологических наук Войткова, Валентина Владимировна

• Войткова, Валентина Владимировна
• кандидат биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Войткова, Валентина Владимировна

ФОРМИРОВАНИЕ ИММУННОГО ОТВЕТА МАКРООРГАНИЗМА НА ВВЕДЕНИЕ БЕЛКОВОЛИПОПОЛИСАХАРИДНОГО КОМПЛЕКСА ГКАЖШЕЫА ТиЬАЯЕтК РАЗНЫХ ПОДВИДОВ (экспериментальное исследование)

14.03.03 - патологическая физиология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, старший научный сотрудник В.И. Дубровина

Иркутск

СОДЕРЖАНИЕ

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

ГЛАВА 1 Липополисахарид возбудителя туляремии.

1.1 Сравнительная биохимическая характеристика липополисахарида подвидов F. tularensis.

1.2 Влияние хемотипа и трансформации липополисахарида F. tularensis на патогенез туляремии.

1.3 Влияние липополисахарида F. tularensis на иммунекомпетентные клетки.

ГЛАВА 2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

2.1 Экспериментальные животные.

2.2 Штаммы бактерий.

2.3 Питательные среды.

2.4 Получение белковолипополисахаридного комплекса туляремий-ного микроба.

2.4.1 Получение белковолипополисахаридного комплекса теин-экстракцией

2.4.2 Получение белковолипополисахаридного комплекса водно-фенольным методом.

2.5 Физико-химические свойства белковолипополисахаридного комплекса туляремийного микроба разных подвидов.

2.6 Получение макрофагов, полиморфноядерных лейкоцитов и лимфоцитов

2.6.1 Получение резидентных перитонеалъных макрофагов.

2.6.2 Получение полиморфноядерных лейкоцитов.

2.63 Получение лимфоцитов.

2.7 Определение фагоцитарной активности макрофагов.

2.8 Определение метаболитов кислорода в фагоцитах.

2.9 Определение активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы.

2.10 Определение активности миелопероксидазы.

2.11 Определение содержания неферментных катионных белков.

2.12 Определение активности NO-синтазы.

2.13 Определение активности супероксиддисмутазы.

2.14 Определение цитокинпродуцирующей активности.

2.15 Определение фенотипа клеток крови.

2.15.1 Титрование антител.

2.15.2 Приготовление раствора реагентов.

2.15.3 Окрашивание клеток крови.

2.15.4 Определение относительного и абсолютного количества клеток крови.

2.15.5 Определение содержания клеток, синтезирующих цитоки-ны.

2.16 Выявление фосфатидилсерина на лимфоцитах крови.

2.17 Статистические методы.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

ГЛАВА 3 ДЕЙСТВИЕ БЕЖОВОЛИПОПОЛИСАХАРИДНОГО КОМПЛЕКСА ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА РАЗНЫХ ПОДВИДОВ НА НЕСПЕЦИФИЧЕСКУЮ РЕЗИСТЕНТНОСТЬ ОРГАНИЗМА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ЖИВОТНОГО.

3.1 Влияние белковолипополисахаридного комплекса туляремийного микроба разных подвидов на фагоцитарную активность и завершенность фагоцитоза.

3.2 Бактерицидные системы фагоцитов при взаимодействии с белко-волипополисахаридным комплексом туляремийного микроба разных подвидов.

3.2.1 Кислородзависимый метаболизм фагоцитов.

3.2.2 Активность глюкоза-6-фосфатдегидрогеназы.

3.2.3 Синтез монооксида азота фагоцитами.

3.2.4 Активность супероксиддисмутазы.

3.2.5 Активность миелопероксидазы.

3.2.6 Содержание неферментных катионных белков.

3.2.7 Влияние белковолипополисахаридного комплекса туляремийного микроба на продукцию ИЛ-10.

ГЛАВА 4 ВЛИЯНИЕ БЕЖОВОЛИПОПОЛИСАХАРИДНОГО КОМПЛЕКСА FRANCISELLA TULARENSIS РАЗНЫХ ПОДВИДОВ НА СУБ-ПОПУЛЯЦИОННЫЙ СОСТАВ ЛИМФОЦИТОВ КРОВИ БЕЛЫХ МЫШЕЙ

4.1 Функциональная способность клеток крови при взаимодействии с белковолипополисахаридным комплексом F. tularensis в условиях in vitro.

4.2 Влияние белковолипополисахаридного комплекса F. tularensis разных подвидов на активацию апоптоза клеток крови.

4.3 Изменение субпопуляционного состава лимфоцитов крови в условиях in vivo.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Формирование иммунного ответа макроорганизма на введение белковолипополисахаридного комплекса Francisella tularensis разных подвидов: экспериментальное исследование»

Актуальность проблемы

Несмотря на большие достижения в изучении патогенеза туляремии, механизмы вирулентности Francisella tularensis и его взаимодействия с макроорганизмом остаются не до конца выяснены [8, 9, 33, 131, 191, 194]. Для раскрытия этих процессов необходимо привлечение новых современных подходов, способных выявлять ранее неизвестные факторы участия липопо-лисахарида (ЛПС) туляремийного микроба при формировании резистентности организма к туляремии.

В настоящее время большое внимание уделяется ЛПС F. tularensis как одному из факторов патогенности. Следует отметить, что цитотоксичность ЛПС S-форм туляремийного микроба более выражена, чем R-форм. Она проявляется деструктивным действием и отчетливой тенденцией к более резкому ингибированию функциональной активности макрофагов мышей [30]. Известно, что ЛПС возбудителя туляремии не обладает летальной токсичностью как для белых мышей [30, 38], так и для кроликов [145], и является одним из основных индукторов специфического иммунитета [8, 91]. Тем не менее, имеются сведения о том, что ЛПС туляремийного микроба является эндотоксином, однако для реализации токсических свойств необходимо его представление in vivo живыми бактериальными клетками типичных природных штаммов возбудителя [18].

Способность многих патогенных бактерий к выживанию в фагоцитах играет важную роль в патогенезе инфекции. Так, сравнительно недавно было показано участие О-антигена ЛПС F. tularensis в регуляции резистентности к комплементу, что снижает эффективность фагоцитоза макрофагами [82]. По имеющимся в литературе сведениям, О-полисахарид ЛПС F. tularensis subsp. tularensis необходим для внутриклеточного выживания, тогда как О-антиген F. tularensis subsp. novicida является решающим фактором в устойчивости к бактерицидному действию сыворотки и менее значимым для внутриклеточного выживания [53, 185]. Кроме того, способность стимулировать образование цитокинов у ЛПС F. tularensis subsp. novicida выражена сильнее, нежели у ЛПС других подвидов франциселл [84]. Известно, что иммунизация мышей ЛПС вакцинного штамма F. tularensis (LVS) вызывает активацию редкой популяции антиген-специфических В-1а клеток, продуцирующих Т-независимые антитела, что защищает мышей от гибели при заражении летальной дозой F. tularensis LVS [106].

Работы, касающиеся влияния ЛПС туляремийного микроба разных подвидов на функциональную способность иммунокомпетентных клеток, затрагивают, в основном, отдельные их субпопуляции [46, 57, 58, 64, 68, 127, 149, 199]. Между тем, функциональная активность этих клеток и их способности секретировать цитокины в ответ на введение ЛПС F. tularensis -изучены в меньшей мере. В связи с этим, исследование динамики субпопуля-ционного состава клеток крови, экспрессии активационных маркеров (в частности CD25) на поверхности лимфоцитов, а также одного из ключевых факторов подавления иммунного ответа - апоптоза клеток иммунофагоцитарной системы под действием ЛПС F. tularensis, позволит получить новые данные об особенностях взаимоотношений «хозяин-паразит», что будет способствовать пониманию механизмов патогенеза F. tularensis и экспериментальному обоснованию факторов, обеспечивающих резистентность организма к возбудителю туляремии.

Цель работы - выявить закономерности формирования иммунного ответа экспериментальных животных на введение белковолипополисахаридно-го комплекса туляремийного микроба разных подвидов.

Для реализации поставленной цели последовательно решались следующие основные задачи:

1. Изучить влияние БЛПСК туляремийного микроба разных подвидов на кислородзависимые и кислороднезависимые бактерицидные системы фагоцитов экспериментальных животных.

2. Выявить закономерности изменений цитокинпродуцирующей активности клеток иммунофагоцитарной системы под влиянием БЛПСК F. tularensis разных подвидов.

3. Дать сравнительную оценку действия БЛПСК F. tularensis разных подвидов на индукцию апоптоза клеток крови белых мышей в условиях in vivo.

4. Выяснить закономерности формирования субпопуляционного состава лимфоцитов крови белых мышей, иммунизированных БЛПСК F. tularensis разных подвидов.

Научная новизна

Получены новые сведения о формировании резистентности организма экспериментальных животных (белых мышей и морских свинок) под действием БЛПСК возбудителя туляремии разных подвидов.

Экспериментально доказано, что препараты БЛПСК F. tularensis subsp. tularensis Schu, БЛПСК F. tularensis subsp. mediasiatica A-120, БЛПСК F. tularensis subsp. novicida Utah 112, БЛПСК F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИ-ЭГ и БЛПСК F. tularensis subsp. holarctica И-250, полученные твин-экстракцией в дозе 10 мкг/106 фагоцитов являются антигенным стимулом для активации кислородзависимого метаболизма. Показано, что БЛПСК F. tularensis subsp. medias iatica, в отличие от БЛПСК туляремийного микроба других подвидов, способствует повышению содержания неферментных катион-ных белков в фагоцитах.

Новыми являются сведения о стимулирующем действии БЛПСК F. tularensis subsp. mediasiatica А-120 и БЛПСК F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ на фагоцитарную активность иммунокомпетентных клеток, обеспечивающих запуск каскада иммунных реакций, и, как следствие, завершенный фагоцитоз туляремийного микроба.

При проведении комплексного сравнительного исследования впервые установлено влияние БЛПСК F. tularensis разных подвидов на формирование субпопуляционного состава клеток крови беспородных белых мышей. Установлено, что БЛПСК туляремийного микроба является индуктором Т-лимфоцитов (СОЗ+СБ4+ и С03С08+) и моноцитов, но, тем не менее, степень активации этих клеток зависит от подвидовой принадлежности Р. Ш1агет18.

Приоритетными являются данные о том, что повышение интенсивности В-клеточной активации на фоне увеличения процентных показателей СВЗ+С04+ИЛ-4+-клеток (Т-хелперы 2 типа) в ходе антигенной (БЛПСК) стимуляции, свидетельствует о включении гуморального иммунного ответа. С применением проточной цитофлуориметрии установлено непосредственное участие БЛПСК туляремийного микроба в механизмах пролиферации имму-нокомпетентных клеток и модуляции апоптоза, регулирующего численное соотношение В- и Т-клеток в популяции лимфоцитов на разных стадиях формирования адаптивного иммунитета.

Предложена и научно обоснована концептуальная схема механизмов действия ЛПС туляремийного микроба разных подвидов на функциональное состояние клеток иммунной системы

Теоретическое и практическое значение работы

На основании проведенных исследований показана роль БЛПСК туляремийного микроба разных подвидов в реализации бактерицидных механизмов фагоцитоза (кислород-, нитроксидзависимых и кислороднезависимых) клеток иммунофагоцитарной системы.

Получены новые данные о клеточных и гуморальных факторах врожденного иммунитета и функциональных изменениях, происходящих в клетках организма при формировании адаптивного иммунитета под действием БЛПСК Р. ш1агет1я разных подвидов, которые дополняют теоретические знания и определяют направления изысканий в области изучения механизмов формирования резистентности макроорганизма к туляремийному микробу.

Экспериментально показано, что иммунный ответ, степень активации лимфоцитов, а также апоптоз иммунокомпетентных клеток лабораторных животных в ответ на введение БЛПСК туляремийного микроба зависит от подвидовой принадлежности и способа получения этих препаратов.

Патогенетически обоснована возможность применения БЛПСК туляре-мийного микроба в качестве средства, повышающего резистентность организма экспериментальных животных в отношении F. tularensis.

Материалы исследований, представленные в диссертации, использованы при составлении методических рекомендаций:

Определение функционального состояния фагоцитов в качестве показателя неспецифической защиты организма» (Иркутск, 2008);

Оценка компенсаторно-восстановительных процессов организма животных, инфицированных туляремийным микробом по индексу нейтрофильного сдвига и патологической зернистости нейтрофилов» (Иркутск, 2009);

Выявление фосфатидилсерина на лимфоцитах крови мышей с помощью проточного цитофлуориметра BD FACSCanto™ IT» (Иркутск, 2010);

Определение активности НАДФН-диафоразы в фагоцитах экспериментальных животных» (Иркутск, 2011).

Разработанные методы внедрены в практику научно-исследовательской работы ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора, Улан-Удэнского института общей и экспериментальной биологии СО РАН, Новосибирского ГНЦ ВБ «Вектор», Иркутского СИ-ФИБР СО РАН.

Научные и практически значимые материалы исследований включены в лекционные курсы дополнительного послевузовского образования при ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора.

Положения исследования, выносимые на защиту

1. Фагоциты, стимулированные БЛПСК F. tularensis, продуцируют ИЛ-1а, способствующий повышению степени активации эффекторных функций клеток иммунофагоцитарной системы (микробицидность, цитотоксичность, продукция супероксидных и нитроксидных радикалов), которая зависит от способа получения БЛПСК F. tularensis и его подвидовой принадлежности.

2. В процессе иммуногенеза, вызванного БЛПСК туляремийного микроба, активируется пролиферация иммунокомпетентных клеток и модуляция апоптоза. Особенности формирования субпопуляционного состава и образование апоптотических клеток крови белых мышей, иммунизированных БЛПСК туляремийного микроба, зависят от подвидовой принадлежности, сроков взаимодействия БЛПСК с клетками макроорганизма. Апробация работы

Материалы, изложенные в диссертации, представлены и обсуждены на: •Международных научных конференциях: «Природно-очаговые инфекции» (Улан-Батор, 2008-2010); «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями» (Санкт-Петербург, 2008);

•Ежегодном Всероссийском Конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2010; 2011);

•Всероссийских научных конференциях: «Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология» (Киров, 2008); «Современные аспекты эпидемиологического надзора и профилактики особо опасных инфекций» (Иркутск, 2009);

•конференциях молодых ученых и специалистов: «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины - 2008» (Санкт-Петербург, 2008); «Биологическая безопасность в современном мире» (Оболенск, 2009); «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2009); «Фундаментальная наука и клиническая медицина» (Санкт-Петербург, 2009); «Современные технологии обеспечения биологической безопасности» (Оболенск, 2010; 2011); III ежегодный всероссийский конгресс по инфекционным болезням (Москва, 2011); Межрегиональных научно-практических конференциях молодых ученых «Человек: здоровье и экология» (Иркутск, 2010; 2011);

•научных конференциях ФКУЗ Иркутский научно-исследовательский противочумный институт Роспотребнадзора (Иркутск, 2008-2012).

Диссертация оформлена на основе материалов плановой темы «Изучение бактерицидных механизмов фагоцитоза и морфо-функциональных изменений иммунокомпетентных клеток и органов экспериментальных животных при инфекционном процессе, вызванном Fraиcгse//a Ш/агешк разных подвидов» с № ГР 0120.0013859 (2006-2009 гг.) и результатов текущей НИР «Влияние липополисахарида туляремийного микроба разных подвидов на функциональное состояние иммунокомпетентных клеток макроорганизма» с № ГР 0120.0807000 (2008-2012 гг.).

Публикации: По теме диссертации опубликованы 25 научных работ, в том числе 5 - в рецензируемых изданиях, рекомендованных ВАК Министерства образования и науки РФ, две - в иностранных журналах.

Личный вклад соискателя. Автору принадлежит ведущая роль в проведении экспериментов, анализе и обобщении полученных результатов. В работах, выполненных в соавторстве, вклад автора является определяющим и заключается в непосредственном участии на всех этапах исследования: от постановки задач, их экспериментально-теоретической реализации до обсуждения результатов в научных публикациях и докладах.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, аналитического обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка использованных литературных источников. Работа изложена на 133 страницах машинописного текста, иллюстрирована 10 таблицами и 22 рисунками. Список литературных источников содержит 200 наименований, в том числе 163 - зарубежных.

Заключение диссертации по теме «Патологическая физиология», Войткова, Валентина Владимировна

выводы

1. Фагоцитоз туляремийного микроба макрофагами и полиморфноядер-ными лейкоцитами, примированными БЛПСКт F. tularensis разных подвидов в условиях in vitro, является преимущественно незавершенным (60-70 %), тем не менее, в случае БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ и БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica А-120 он носит завершенный характер.

2. БЛПСКт туляремийного микроба, независимо от подвидовой принадлежности, в условиях in vitro, повышает кислородзависимые и кислороднеза-висимые бактерицидные системы фагоцитов, что характеризуется высокими показателями НСТ-теста, активности глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, N0-синтазы и увеличением содержания неферментных катионных белков. Вместе с тем, достоверное повышение уровня неферментных катионных белков в 1,9 раза по сравнению с контролем выявлено в случае БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica А-120.

3. БЛПСК туляремийного микроба, независимо от подвидовой принадлежности, в условиях in vitro стимулирует продукцию ИЛ-10. Способность клеток иммунофагоцитарной системы продуцировать этот противовоспалительный цитокин выражена в большей степени относительно БЛПСКт F. tularensis subsp. tularensis Schu. Препараты БЛПСК F. tularensis в условиях in vivo стимулируют синтез ИЛ-la и ИЛ-4, тем не менее, в случае БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica А-120 и БЛПСКт/7. tularensis subsp. holarctica 15 НИИЭГ показатели содержания клеток, синтезирующих ИЛ-la, в 1,5-2,0 раз выше по сравнению с другими препаратами БЛПСК, что обеспечивает запуск каскада иммунных реакций, способствующих повышению резистентности организма экспериментальных животных.

4. БЛПСК туляремийного микроба как в условиях in vitro, так и in vivo является индуктором моноцитов, CD3+CD4+ и CD3+CD8+ Т-клеток, однако, степень активации этих клеток зависит не только от подвидовой принадлежности F. tularensis, но и от способа выделения БЛПСК. Множественные корреляционные связи субпопуляций лимфоцитов и моноцитов у мышей, иммунизированных БЛПСКт F. tularensis, указывают на высокую сопряженность между клетками иммунной системы и подтверждают их участие в формировании адаптивного иммунитета к БЛПСК туляремийного микроба.

5. БЛПСК F. tularensis оказывает влияние на уровень циркулирующих апоптотических клеток, регулируя численное соотношение В- и Т-клеток в популяции лимфоцитов на разных стадиях формирования адаптивного иммунитета.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

История изучения возбудителя туляремии - F. tularensis - насчитывает более ста лет, тем не менее, исчерпывающих сведений о факторах патогенно-сти этой бактерии и механизмах их действия до настоящего времени нет [54, 151, 155, 192]. В связи с этим, особое внимание уделяется не только изучению патогенеза и иммуногенеза самого микроорганизма, но и его детерминант вирулентности, которые могут быть использованы при конструировании химической вакцины. В частности, важными являются сведения об участии компонентов бактерий в реализации защитных механизмов врожденного и адаптивного иммунитета [8].

Согласно данным литературы, основной мишенью иммунного ответа человека при туляремийной инфекции и иммунизации является ЛПС F. tularensis, который играет существенную роль в реализации вирулентных свойств F. tularensis [49, 89, 105, 165]. Известно, что в структуре ЛПС туляремийного микроба имеются различия между подвидами, влияющие на биоактивность эндотоксина и вирулентность бактерий [139, 156]. В связи с тем, что ЛПС F. tularensis является одним из иммунодоминантных антигенов возбудителя туляремии и определило необходимость его всестороннего изучения с применением современных аналитических методов, а задача получения сопоставимых данных обусловила проведение экспериментов по единому научно-методическому плану.

Объектом исследования избран БЛПСК туляремийного микроба, который выделяли твин-экстракцией (БЛПСКт) [27] и водно-фенольным методом (БЛПСКф) [1] из клеток F. tularensis subsp. holarctica 15, F. tularensis subsp. tularensis Schu 11, F. tularensis subsp. holarctica И-250, F. tularensis subsp. mediasiatica A-120, F. tularensis subsp. novicida Utah 112.

В качестве типичного ЛПС использовали коммерческий препарат ЛПС S. enteritidis (Sigma, США). Контролем служили клетки интактных животных.

Препараты БЛПСКт по своим физико-химическим свойствам не отличались от БЛПСК, выделенных классическим водно-фенольным способом.

Электрофоретический анализ показал характерную для БЛПСК гетерогенность, проявляющуюся множественностью полос в виде «лестницы» при окраске геля ионами серебра. При взаимодействии с карбоциановым красителем «Stains all» препараты проявляли характерный для ЛПС грамотрицатель-ных бактерий метахроматический эффект. Содержание нуклеиновых кислот, белка, углеводов в исследуемых препаратах БЛПСК колебалось в пределах 0,4-0,9 %; 4,7-8,4 %; 11,4-17,8 %, соответственно.

Показано, что препараты ЛПС в дозах 10, 50 и 100 мкг не токсичны для белых мышей, тем не менее, при введении экспериментальным животным 100 мкг БЛПСК имело место увеличение размеров селезенки и регионарных лимфатических узлов (в случае БЛПСК туляремийного микроба подвида tu-larensis в 1,5-2,0 раза).

Основным механизмом защиты организма при туляремийной инфекции является активация метаболизма макрофагов [128]. Известно, что фагоциты выполняют роль фагоцитирующих клеток с киллерной активностью в неспецифическом иммунном ответе и антигенпрезентирующих клеток в специфическом адаптивном иммунитете, а также продуцируют провоспалительные цитокины [34]. В связи с этим, моделью для изучения влияния БЛПСК F. tularensis на бактерицидные механизмы фагоцитоза в отношении F. tula-rensis subsp. holarctica 15 в условиях in vitro были выбраны эти клетки. Исходя из того, что влияние БЛПСК F. tularensis на механизмы фагоцитоза туляремийного микроба вакцинного штамма могут быть поняты только при комплексном исследовании, мы попытались изучить эффективность основных стадий взаимодействия «фагоцит-микроб». Подобную комплексность и сопоставимость в достаточной мере обеспечило исследование действия БЛПСК F. tularensis на практически все стадии фагоцитарного процесса в отношении F. tularensis subsp. holarctica 15: поглощения микроба с последующим изучением активности ферментов «респираторного взрыва» и завершенности фагоцитоза. Параллельно оценивали также особенности бактерицидных механизмов (кислородзависимых и кислороднезависимых антимикробных систем) фагоцитов восприимчивых к туляремии экспериментальных животных -морских свинок и белых мышей.

С учетом цели и задач исследования в эксперименте по изучению влияния БЛПСК туляремийного микроба разных подвидов на неспецифическую резистентность организма в условиях in vitro было использовано 115 стандартных по условиям содержания и массе морских свинок и 75 беспородных белых мышей. В качестве экспериментальной модели служили перитонеаль-ные макрофаги и полиморфноядерные лейкоциты. Объектом для исследования фагоцитарной способности клеток служил вакцинный штамм F. tularensis 15 НИИЭГ.

Поглотительная способность фагоцитирующих ПМ, примированных БЛПСКт, в большей степени выражена в случае БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica, БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica 15 и БЛПСКт/7. tularensis subsp. holarctica И-250. ФЧ для этих препаратов варьировало в пределах от 1,9 ± 0,4 у. ед. до 2,4 ± 0,6 у. ед., тем не менее, завершенный фагоцитоз выявлен только в случае БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica и БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica 15 (+3,3 ± 0,9 у. ед.; +1,5 ± 0,3 у. ед. соответственно). Данное обстоятельство свидетельствует о способности этих препаратов повышать фагоцитарную активность ПМ.

Известно, что АФК являются промежуточными продуктами, которые участвуют в защите хозяина от возбудителя туляремии [116]. В ходе исследования установлено, что БЛПСК т туляремийного микроба стимулирует ки-слородзависимый метаболизм фагоцитов экспериментальных животных. Цитохимический показатель активности ПМ, примированных БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica И-250 (19,2 ± 3,0 у.е.) был достоверно выше, чем в контроле (14,1 ± 1,1 у.е.), вместе с тем, у других препаратов БЛПСКт F. tularensis выявлена тенденция к повышению этого показателя (кроме БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica 15).

Общеизвестно, что осуществление фагоцитоза клетками системы моно-нуклеарных фагоцитов и ПЯЛ сопровождается увеличением потребления кислорода, повышением активности ферментов гексозомонофосфатного шунта, а также возрастающим образованием перекиси водорода и супероксиданиона в этих клетках [34]. Г6ФДГ является ключевым ферментом пентозомонофос-фатного шунта, катализирующий начальную реакцию окисления глюкозо-6-фосфата, при которой акцептором водорода является НАДФ [26].

Анализ данных, полученных при изучении влияния БЛПСКт туляре-мийного микроба на активность Г6ФДГ показал, что все использованные в эксперименте БЛПСКт F. tularensis независимо от подвидовой принадлежности, достоверно (Р < 0,05) стимулируют активность этого фермента по сравнению с контролем, что свидетельствует об усилении в фагоцитах окисления глюкозы в гексозомонофосфатном шунте и о повышении скорости взаимопревращения НАДФ;£ НАДФ-Н. Связанная с этим активация КЗМ обеспечивает ПМ более высокий уровень бактерицидной способности. Наибольшее потребление глюкозы фагоцитами зарегистрировано в случае макрофагов, примированных БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica 15 (ИС в этом случае выше в 2,0-3,3 раза (Р < 0,05) по сравнению с фагоцитами, стимулированными БЛПСКт F. tularensis других подвидов).

Одним из медиаторов воспаления, который продуцируется при активации макрофагов, является NO, который играет существенную роль в подавлении бактериального роста и развитии экспериментального инфекционного процесса, вызванного F. tularensis [29, 72]. Так, в литературе имеются сведения о том, что ПМ крысы, инфицированные F. tularensis subsp. novicida в условиях in vitro, спонтанно высвобождают NO2 в количествах, достаточных для подавления роста бактерий [66]. Кроме того, имеются сведения о том, что продукцию NO индуцирует БЛПСК F. tularensis subsp. holarctica LVS [109].

Нами показано, что при взаимодействии БЛПСКт F. tularensis с фагоцитами происходит стимуляция NO-синтазы ПМ, тем не менее, достоверных различий по синтезу монооксида азота между БЛПСКт F. tularensis не выявлено. Полученные в ходе эксперимента данные указывают на способность

БЛПСКт F. tularensis не зависимо от подвидовой принадлежности стимулировать NO-синтазу. На основании имеющихся в литературе данных об участии монооксида азота в бактерицидных механизмах фагоцитоза, логично предположить, что БЛПСК туляремийного микроба может способствовать усилению киллинга инфекционного агента в макроорганизме.

Внутриклеточную антиокислительную защиту обеспечивают, в основном, СОД и каталаза. Считается, что СОД удаляет избыток токсических супероксидных радикалов и, тем самым, защищает биологические мембраны от окислительного повреждения. Активность этого фермента во многих случаях зависит от уровня супероксиданиона в клетках, который выступает по отношению к ферменту в качестве индуцирующего и активирующего фактора [26, 34]. В ходе эксперимента выявлена тенденция БЛПСКт F. tularensis в дозе 10 мкг/106 фагоцитов к повышению продукции фагоцитами медиатора воспаления - супероксиддисмутазы по сравнению с контролем в среднем в 1,5 раза, вместе с тем, выраженность этого процесса не зависит от подвидовой принадлежности БЛПСК туляремийного микроба и его вирулентности.

Известно, что миелопероксидаза является важной составной частью антимикробной активности фагоцитов, обеспечивающей врожденный неспецифический иммунитет [34]. В связи с чем, на следующем этапе исследований нами изучено действие БЛПСКт туляремийного микроба на миелопе-роксидазную систему ПЯЛ в условиях in vitro. Активация МПО системы фагоцитов в отношении БЛПСКт F. tularensis не была достоверной по сравнению с контролем, однако относительно БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasia-tica, БЛПСКт F. tularensis subsp. tularensis и БЛПСКт F. tularensis subsp. novi-cida выявлена тенденция к стимуляции этого фермента.

При исследовании кислороднезависимых бактерицидных механизмов фагоцитов мы уделили особое внимание неферментным катионным белкам, поскольку НКБ обладают электростатическим механизмом воздействия на клеточные структуры бактерий.

Данные, полученные по изучению влияния БЛПСКт туляремийного микроба разных подвидов, указывают на то, что у ПЯЛ, примированных БЛПСКт F. tularensis, наблюдается повышение показателей содержания неферментных катионных белков, свидетельствующее о способности этих препаратов активировать кислороднезависимые бактерицидные системы фагоцитов по сравнению с контролем (10,9 ± 3,4 у.е.). Однако достоверные различия выявлены только в случае БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica (19,2 ± 2,7 у.е.).

В следующей серии экспериментов нами проведено сравнительное изучение влияния БЛПСКт F. tularensis разных подвидов на способность моно-нуклеарных фагоцитов вырабатывать противовоспалительный цитокин -ИЛ-10.

Полученные в ходе исследований данные свидетельствуют о стимулирующем воздействии БЛПСКт туляремийного микроба на выработку ИЛ-10 ПМ белых мышей независимо от подвидовой принадлежности. Установлено, что БЛПСКт F. tularensis subsp. tularensis, БЛПСКт F. tularensis subsp. holarc-tica 15, БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica И-250 и БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica стимулируют ПМ к продукции ИЛ-10 в большей степени, чем БЛПСКт F. tularensis subsp. novicida. Тем не менее, БЛПСКт F. tularensis subsp. tularensis оказывает достоверно максимальный эффект на секрецию этого цитокина, концентрация которого превышает контрольные значения в 7,1 раза (Р < 0,001). Вместе с тем, достоверных различий относительно БЛПСКт F. tularensis subsp. tularensis и БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica И-250 не выявлено.

Таким образом, БЛПСКт F. tularensis in vitro стимулирует неспецифическую резистентность организма при участии кислородзависимых и кисло-роднезависимых бактерицидных систем фагоцитов экспериментальных животных, усиливая тем самым бактерицидный потенциал фагоцитов. Характер изменения активности NO-синтазы и СОД ПМ морских свинок при взаимодействии с БЛПСКт туляремийного микроба не зависит от подвидовой принадлежности. Статистически значимых различий в активации миелоперокси-дазной системы фагоцитов при взаимодействии БЛПСКт F. tularensis разных подвидов с ПЯЛ морских свинок не выявлено.

Имеющиеся в настоящее время в литературе сведения из-за их разрозненности и недостаточности сравнительных данных не позволяют пока определить роль БЛПСК F. tularensis в активации иммунокомпетентных клеток, в частности, их способность синтезировать цитокины и экспрессировать CD25 [46, 57, 64, 68, 127, 149, 199]. Для решения данной проблемы необходимость комплексного сравнительного исследования является очевидной. В связи с чем, следующим этапом наших исследований стало изучение действия БЛПСК туляремийного микроба на активацию лимфоцитов и моноцитов крови белых мышей в условиях in vitro.

Установлено, что БЛПСКт/ф F. tularensis независимо от подвидовой принадлежности способствует увеличению экспрессии CD25 Т-клеток (CD3+ CD25+) в среднем в 3,1 раза (Р < 0,001) по сравнению с контролем, тем не менее, в случае БЛПСКт выявлена тенденция к активации С D3"-клеток в большей степени. Показано увеличение экспрессии раннего маркера активации CD25 на CD3+CD4+ (Р < 0,01) и CD3+CD8+ лимфоцитах (Р < 0,05) в среднем в 2,0 раза по сравнению с контролем, свидетельствующее об участии в иммунном ответе, как Т-хелперов, так и цитотоксических Т-лимфоцитов.

Известно, что в регуляции иммунного ответа на внедрение патогена существенная роль отводится популяции Т-лимфоцитов с фенотипом CD3+ CD4+CD25high [65], поэтому следующим разделом нашей работы стала идентификация этой популяции в образцах клеток крови, примированных БЛПСКт/ф F. tularensis разных подвидов. Выявлены статистически значимые (Р < 0,01) различия содержания CD3+CD4+CD25hlgh Т-лимфоцитов по сравнению с контролем, которые характеризовались увеличением популяции регу-ляторных клеток. В ходе эксперимента выявлена тенденция БЛПСКт F. tularensis стимулировать образование регуляторных Т-лимфоцитов в большей степени, чем у БЛПСКф F. tularensis, однако, достоверное отличие содержания этой популяции лимфоцитов, было отмечено только в случае БЛПСК F. tularensis subsp. tularensis (Р < 0,05).

При изучении влияния БЛПСК туляремийного микроба на моноциты выявлено увеличение экспрессии CD25 в 1,3-1,7 раза по сравнению с контролем (Р < 0,05), что свидетельствует о стимулирующем эффекте БЛПСК F. tularensis на активацию этих клеток.

В литературе имеются сведения о том, что медиаторы воспалительного ответа, в том числе и цитокины, являются мощным иммунорегуляторными, про- и антивоспалительными агентами, стимуляторами образования и высвобождения других биологически активных веществ [34]. Цитокины регулируют реакции врожденного и адаптивного иммунного ответа при многих инфекционных болезнях, в том числе и туляремии [33, 87, 1 11]. ИЛ-1а выступает в качестве одного из главных медиаторов, ответственных за развитие неспецифических форм защиты, формирование местной воспалительной реакции и острофазного ответа на уровне организма при инфекционном поражении [79]. Важная роль в детоксикации ЛПС принадлежит гуморальным факторам иммунитета с участием ИЛ-4 [148, 153, 156].

Нами показано, что в случае примирования клеток БЛПСКт/ф F. tularensis разных подвидов, кроме БЛПСКф F. tularensis subsp. holarctica 15, имело место достоверное увеличение (Р < 0,05) содержания CD3+CD4+HJI-4+ Т-хелперов по сравнению с контролем. Следует отметить, что БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica стимулирует синтез ИЛ-la моноцитами в большей степени, чем БЛПСК туляремийного микроба других подвидов.

Таким образом, БЛПСК туляремийного микроба является индуктором как CD3+CD4+ и CD3+CD8+ Т-клеток, так и моноцитов, но, тем не менее, степень активации этих клеток зависит не только от подвидовой принадлежности и вирулентности F. tularensis, но и от способа выделения БЛПСК.

Выявленные в ходе эксперимента различия в активации ИЛ-la моноцитами в случае БЛПСК т F. tularensis subsp. mediasiatica, могут свидетельствовать о влиянии данного препарата на процесс пролиферации, дифференцировки и индукцию апоптоза клеток в большей степени, чем другие исследованные препараты. Данное обстоятельство, а также полученные нами данные о протективных свойствах БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica, может быть свидетельством плейотропного эффекта цитокинов, синтезированных под действием БЛПСК, на клетки, что в сою очередь способствует поддержанию тканевого гомеостаза путем формирования защитных реакций организма.

Необходимым механизмом регулирования иммунного ответа при воспалительном процессе является апоптотическая гибель иммунокомпетентных клеток, которая играет важную роль в установлении баланса между уровнем циркулирующих эффекторных клеток и их своевременным удалением. Известно, что F. tularensis вызывает апоптоз макрофагов и В-лимфоцитов мыши и человека [97, 118]. Однако, участие в реализации программы апоптоза БЛПСК F. tularensis до настоящего времени не подтверждено. Нами впервые в модельной системе in vivo с применением проточной цитофлуориметрии получены данные о влиянии БЛПСКт/ф туляремийного микроба на развитие апоптоза лейкоцитов крови белых мышей.

При изучении интенсивности апоптоза клеток крови экспериментальных животных, иммунизированных БЛПСКт/ф F. tularensis разных подвидов показано, что процент апоптотических моноцитов и лимфоцитов в крови белых мышей во все сроки наблюдения выше, чем в контроле. Так, показано, что способность клеток крови фиксировать на своей поверхности AnV в Са2+-зависимой среде достоверно повышалась к 3 суткам (Р < 0,05), по сравнению с контролем, что может свидетельствовать об усилении межклеточных взаимодействий при иммунном ответе, вызванном БЛПСК туляремийного микроба.

Установлено, что по содержанию циркулирующих АпУ+-моноцитов во все сроки наблюдения между группами экспериментальных животных, иммунизированных препаратами БЛПСКт/ф F. tularensis, статистически значимых различий не выявлено. Тем не менее, в случае БЛПСКт/ф F. tularensis subsp. tularensis и БЛПСКф F. tularensis subsp. mediasiatica на 9 сутки отмечалось повышение апоптоза моноцитов в 1,3-2,8 раз (Р < 0,05) по сравнению с 3 и 6 сутками наблюдения. Максимальные показатели АпУ+-моноцитов относительно БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica 15, БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica И-250 и БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica отмечены на 3 сутки, что может быть связано с особенностями активации иммунофаго-цитарной системы.

Полученные в ходе эксперимента данные о достоверном увеличении (Р < 0,05) на 3 сутки процентного содержания апоптотических Т-хелперов в 1,2-2,3 раза при иммунизации мышей БЛПСКт/ф F. tularensis subsp. holarctica И-250, БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica 15 и БЛПСКт/ф F. tularensis subsp. mediasiatica по сравнению с препаратами БЛПСКт/ф ту-ляремийного микроба других подвидов свидетельствуют о повышенной готовности клеток к апоптозу. Тем не менее, при определении количества AnV-положительных Т-хелперов на 6 сутки наблюдения достоверных различий между опытными группами не установлено. Апоптоз зрелых Т-хелперов является средством регуляции интенсивности и продолжительности иммунного ответа, что подтверждается высоким содержанием CD3+CD4+Ha 9 сутки по сравнению с другими субпопуляциями лимфоцитов.

Наличие АпУ+В-лимфоцитов на 3 сутки у экспериментальных животных, иммунизированных БЛПСКт/ф F. tularensis, может указывать на элиминацию аутореактивных В-клеток, избежавших делеции во время раннего развития. В связи с тем, что на 6-9 сутки увеличивается селекция В-клеточных клонов с высокой антиген-связывающей способностью [29], то повышение содержания апоптотических CD3~CD19+ в эти сроки наблюдения может свидетельствовать о гибели низкоаффинных клонов В-лимфоцитов.

Таким образом, иммунизация белых мышей препаратами БЛПСК туля-ремийного микроба приводит к активации и пролиферации Т- и В-клеток, в связи с чем, запускается механизм, позволяющий поддерживать гомеостаз в иммунной системе и элиминировать клоны клеток, которые больше не нужны. Анализ полученных в ходе экспериментов данных указывает на то, что БЛПСК F. tularensis разных подвидов, выделенных с помощью твин-экстракции и водно-фенольным методом не вызывает апоптотический дисбаланс клеточного иммунитета, тем не менее, интенсивность апоптоза клеток крови экспериментальных животных в условиях in vivo зависит от способа получения БЛПСК, его подвидовой принадлежности и сроков наблюдения.

В связи с тем, что препараты БЛПСКф F. tularensis и БЛПСКт F. tularensis являются индукторами иммунного ответа, то в следующей серии опытов по исследованию действия БЛПСК F. tularensis на субпопуляционный состав клеток крови беспородных белых мышей в модельной системе in vivo использовали препараты БЛПСК туляремийного микроба, полученные твин-экстракцией.

Воздействие БЛПСК F. tularensis на экспериментальных животных проявлялось качественными и количественными сдвигами популяций мононук-леарных клеток крови. Так, анализ параметров иммунного статуса у экспериментальных животных, иммунизированных препаратами БЛПСК F. tularensis, выявил, что количественное соотношение клеток крови находилось в пределах физиологической нормы. Тем не менее, относительно БЛПСКт F. tularensis subsp. tularensis и БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica И-250 отмечалось существенное снижение показателей содержания лейкоцитов, что, возможно, связано с миграцией клеток к очагу воспаления, а в случае БЛПСКт F. tularensis subsp. novicida - увеличение этих показателей, что указывает на развитие воспалительного процесса, сопровождающееся мобилизацией резервов, демаргинацией (мобилизации клеток маргинального пула в циркуляцию) или увеличением времени циркуляции клеток.

Сравнительный анализ полученных данных показал, что препараты БЛПСКт F. tularensis не оказывали влияние на относительное количество Т-лимфоцитов (СОЗ+-клеток) и величину ЛТИ, свидетельствующее об отсутствии Т-клеточного дефицита. Тем не менее, при оценке содержания Т-лимфоцитов выявлено увеличение ИРИ, превышающее верхнюю границу физиологической нормы до 1,8 раза за счет снижения содержания цитоток-сических Т-лимфоцитов (CD3+CD8+) и увеличения Т-хелперов (CD3+CD4+), что является подтверждением усиленной работы иммунной системы. Следует отметить, что соотношение CD4/CD8 зависит от подвидовой принадлежности БЛПСКт туляремийного микроба и сроков наблюдения.

Статистически значимое (Р < 0,01) снижение процентного содержания В-лимфоцитов и повышение величины ЛВИ, свидетельствующее об уменьшении доли СШ9 -клеток, выявлено в случае БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica и может быть связано со снижением количества Т-лимфоцитов, продуцирующих В-клеточный ростовой фактор (ИЛ-4). Достоверное увеличение В-лимфоцитов у мышей, иммунизированных БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica 15, БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica И-250, БЛПСКт F. tularensis subsp. novicida и БЛПСКт F. tularensis subsp. tularensis на 3 сутки (P < 0,05 по сравнению с контролем), на наш взгляд, может быть связано с тем, что ЛПС относят к тимуснезависимым антигенам [15, 35, 46].

Анализ полученных данных о повышении содержания числа CD3+CD25+ и CD3+CD4+CD25+-KJieTOK в большей степени при инокуляции мышам БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica И-250 и БЛПСКт F. tularensis subsp. novicida во все сроки наблюдения может указывать на особенности структуры О-антигена [144, 172]. Обращает на себя внимание достоверное увеличение на 3 сутки количества Т-хелперов и В-лимфоцитов, экспрессирующих маркер ранней активации - С025-антиген, у мышей, иммунизированных БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica (Р < 0,05), что обеспечивает быстрое размножение и последующую дифференцировку наивных клеток до зрелых форм. Выявленное в ходе эксперимента достоверное увеличение активированных Т-лимфоцитов у животных, инокулированных БЛПСКт F. tularensis subsp. tularensis, по сравнению с контролем на 9 сутки (Р < 0,05), возможно, свидетельствует об активации этих клеток путем опосредованного действия фагоцитов и В-лимфоцитов [35]. В случае БЛПСКт F. tularensis subsp. tularensis, БЛПСКт F. tularensis subsp. novicida и БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica И-250 достоверное повышение количества активированных В-лимфоцитов зарегистрировано к 6 суткам.

Таким образом, увеличение экспрессии CD25 на иммунекомпетентных клетках характеризует повышение их функциональной активности в условиях антигенной стимуляции. Сравнительный анализ полученных данных между группами обследованных экспериментальных животных в зависимости от использованного для исследования in vivo препарата показал, что высокое содержание в крови мышей, получивших БЛПСКт туляремийного микроба разных подвидов, основных субпопуляций Т-лимфоцитов, положительных по CD25, по-видимому, можно объяснить продолжительной антиген-специфической или неспецифической активацией Т-лимфоцитов. Данные настоящего исследования подтверждают существенную роль БЛПСК F. tularensis в иммуногенезе туляремии с участием моноцитов, Т-хелперов и В-лимфоцитов.

Важная роль в формировании резистентности организма к бактериальным патогенам провоспалительных цитокинов послужила основанием для исследования влияния БЛПСКт F. tularensis на активацию Т-хелперов 2 типа.

У мышей, иммунизированных БЛПСКт F. tularensis, высокое содержание CD3+CD4+HJI-4+-kietok сопровождалось снижением количества моноцитов, синтезирующих ИЛ-1 а, что, возможно, связано с ингибирующим действием ИЛ-4 на синтез этого провосполительного цитокина [15, 29].

Известно, что функционально ИЛ-1 обусловливает пролиферацию лимфоцитов при развитии иммунного ответа и выступает в качестве одного из главных медиаторов, ответственных за развитие неспецифических форм защиты - формирование местной воспалительной реакции и острофазного ответа на уровне организма при антигенной стимуляции [15,35].

Как показал детальный анализ полученных результатов, БЛПСКт F. tularensis subsp. mediasiatica и БЛПСКт F. tularensis subsp. holarctica 15 активировали моноциты (CD25+, ИЛ-1 а) в большей степени, чем другие БЛПСКт F. tularensis, что может являться объяснением способности этих препаратов повышать фагоцитарную активность СМФ.

В ходе экспериментов у мышей, иммунизированных БЛПСКт F. tularensis, выявлены множественные корреляционные связи субпопуляций лимфоцитов и моноцитов, что свидетельствует о высокой сопряженности между клетками иммунной системы и подтверждает их участие в формировании адаптивного иммунного ответа к БЛПСК туляремийного микроба.

Резюмируя представленный материал можно отметить, что БЛПСК F. tularensis является индуктором лимфоцитов и моноцитов, но, тем не менее, степень активации этих клеток зависит не только от подвидовой принадлежности F. tularensis, но и от способа выделения БЛПСК.

Повышение интенсивности В-клеточной активации на фоне увеличения процентных показателей CD3 С04+ИЛ-4+-клеток (Т-хелперы 2 типа) в ходе антигенной (БЛПСК) стимуляции, свидетельствует о включении гуморального иммунного ответа. С применением проточной цитофлуориметрии установлено непосредственное участие БЛПСК туляремийного микроба в механизмах пролиферации иммунокомпетентных клеток и модуляции апоптоза, регулирующего численное соотношение В- и Т-клеток в популяции лимфоцитов на разных стадиях формирования адаптивного иммунитета.

Кратко резюмируя изложенные выше материалы, можно констатировать, что по совокупности проведенных исследований БЛПСК туляремийного микроба обладает выраженной иммуногенной активностью. Безусловно, важен факт успешного применения БЛПСК туляремийного микроба в качестве средства, повышающего резистентность организма экспериментальных животных в отношении F. tularensis.

С учетом литературных данных о БЛПСК, материалов о роли туляремийного микроба на неспецифическую резистентность организма экспериментальных животных представляется возможным гипотетически сформулировать комплекс факторов, обеспечивающих иммунокоррегирую-щее действие БЛПСК F. tularensis разных подвидов на иммунокомпетентные клетки макроорганизма.

На основании вышеизложенного нами предложена концептуальная схема закономерностей изменений функционального состояния клеток иммунной системы под действием БЛПСК К іиіагетіз разных подвидов (рис. 22).

БЛПСК РгапсІБеІІа іиіагетія

БиЬэр. Ігоіагсііса ГІ15 НИИЭГ (вакцинный) Щ

И-250 зиЬэр. теШа.чіМіса ( я

V. 1-- ^ I зиЬэр. поуісійа эиЬзр. ¿и/ягеят

ЩЖ Л V И ■■. > ііЩ

Макроорганизм 1V Активированные фагоциты

Фагоцитарная активность

ПАФ, ФЧ) N

Кислороднезависимые (НКБ) и кислородзависимые (Г6ФДГ, НСТ-тест) бактерицидные системы

Суопопуляционныи состав клетокпериферической Г

Нитроксидзависимые (N0-синтаза) бактерицидные системы

Синтез цитокинов ж

Лимфоциты

1 2 3 4 N

5І

----і—+ —

Лейкоциты

1 2 3 N 4| 5|

Активированные моноциты

Активированные * Т-лимфоциты

В-лимфоциты

Завершенный фагоцитоза

13 I ] 2 4 5 та

Активированные В-лимфоциты

1 з N

2 4 5 Ї

Регуляторные Т-лимфоциты

Увеличение

ИРИ (С04/С08) J

Рис. 22. Концептуальная схема механизмов действия БЛПСК і7. шІагетІБ разных подвидов на функциональное состояние клеток иммунной системы

Примечание: | - активация; | - ингибирование; (+) - завершенный фагоцитов; (-) - незавершенный фагоцитоз; N - отсутствие изменений.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Войткова, Валентина Владимировна, 2012 год

1. Адаме Г. А. Выделение липополисахаридов из грамотрицательных бактерий / Г. А. Адаме // Методы исследования углеводов : Пер. с англ. -М. : Мир, 1975.-С. 126-130.

2. Аронова Н. В., Павлович Н. В. Фазовые вариации липополисаха-рида Francisella tularensis при инфекции и иммунизации человека // Журн. микробиол. 2005. - № 4. - С. 8-12.

3. Безопасность работы с микроорганизмами I-II групп патогенности (опасности) : СП 1.3.1285-03 : утв. Министерством здравоохранения РФ 12.03.2003 : ввод, в действие с 25.06.2003 г. Москва, 2003. - 61 с.

4. Брудастов Ю. А., Сборец Т. С., Дерябин Д. Г. Активность каталазы и супероксиддисмутазы Staphylococcus aureus при их персистировании в макроорганизме // Журн. микробиол. 2001. - № 2. - С. 13-16.

5. Воробьев А. А., Быковская С. Н. Роль клеток-регуляторов CD4+25+ в развитии хронических инфекционных заболеваний // Вестник РАМН. -2006.-№ 11.-С. 24-29.

6. Голубинский Е. П., Бойкова И. С., Дубровина В. И. Активность бактерицидных систем фагоцитов у интактных и иммунизированных против туляремии морских свинок // Журн. микробиол. 1995. - № 2. - С. 7779.

7. Домарадский И. В. Проблемы патогенности франсиселл и пути их решения // Журн. микробиол. 2005. - № 1. - С. 106-110.

8. Дубровина В. И. Функциональные особенности фагоцитов при инфекционном и вакцинальном процессе, вызываемом Francisella tularensis. Иркутск, 2002. - 119 с.

9. Езепчук Ю. В. Патогенность как функция биомолекул. М. : Наука, 1985.-240 с.

10. Изменение активности миелопероксидазы и кислой фосфатазы в нейтрофилах периферической крови человека при стимуляции клеток in vitro / Т. Л. Бурая и др. // Журн. микробиол. 1991. - № 10. - С. 52-55.

11. Изучение биохимических, антигенных и протективных свойств мембраны возбудителя туляремии / В. С. Хлебников и др. // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 1991. - № 7. - С. 15-20.

12. Книрель Ю. А., Кочетков Н. К. Строение липополисахаридов гра-мотрицательных бактерий. I Общая характеристика липополисахаридов и структура липида А (обзор) // Биохимия. 1993. - Т. 58. - Вып. 2. - С. 166201.

13. Методы общей бактериологии: Под ред. Ф. Герхардта и др.- М. : Мир, 1984.-С. 292-295.

14. Никулин Б. А. Оценка и коррекция иммунного статуса. М. ГЭО-ТАР-Медиа, 2008. - 376 с.

15. Николаев В. Б. Физикохимические и иммунобиологические свойства антигенов туляремийного микроба : дис. . канд. мед. наук. Саратов, 2005.- 169 с.

16. Олсуфьев Н. Г. Таксономия, микробиология и лабораторная диагностика возбудителя туляремии. М. : Медицина, 1975. - 191 с.

17. Оноприенко Н. Н., Павлович Н. В. Роль липосахарида в токсичности бактерий рода Francicella II Молекул, генетика. 2003. - № 3. - С. 2528.

18. Оноприенко Н. Н., Павлович Н. В. Взаимодействие S- и R-липополисахаридов Francisella tularensis с липополисахаридсвязывающим белком сыворотки крови человека // Журнал микробиологии. 2008. - № 4.-С. 16-21.

19. Определение функциональной способности фагоцитов в качестве показателя неспецифической защиты организма : метод, рекомендации / В. И. Дубровина и др. / Иркутский н.-и. противочум. ин-т Сибири и ДВ. -Иркутск, 2008 10 с.

20. Павлович Н. В., Сорокин В. М., Благородова Н. С. Устойчивость Francisella tularensis к бактерицидному действию нормальной сыворотки, как критерий для оценки вирулентности бактерий // Журн. микробиол. -1996.-№ 1.-С. 7-10.

21. Павлович Н. В., Тынянова В. И. Возможные механизмы реализации токсического потенциала липополисахаридов патогенных бактерий // Журн. микробиол. 2005. - № 2. - С. 9-13.

22. Павлович Н. В., Цимбалистова М. В., Маслова Н. Н. Быстрый метод оценки вирулентности Francisella tularensis in vitro // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунол. 1997. - № 2. - С. 17-20.

23. Плехова Н. Г. Бактерицидная активность фагоцитов // Журн. микробиол. 2006. - № 6. - С. 89-96.

24. Получение липополисахаридного антигена туляремийного микроба: Метод, рекомендации / В. Б. Николаев, Е. Ю. Марков, С. А. Татарникови др. // Иркутский н.-и. противочум. ин-т Сибири и ДВ. Иркутск, 2010-5 с.