Комплексный подход к исследованию структуры белков на основе электронной микроскопии тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.02, доктор биологических наук Соколова, Ольга Сергеевна

• Соколова, Ольга Сергеевна
• доктор биологических наук
• 2012

Оглавление диссертации доктор биологических наук Соколова, Ольга Сергеевна

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ГЛАВА 1. КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД К ИЗУЧЕНИЮ ЧЕТВЕРТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ МАКРОМОЛЕКУЛ.

1.1. Применение электронной микроскопии в биологии, основы структурной протеомики.

1.2. Подготовка образцов нанобиообъектов.

1.2.1. Объектные сетки и пленки-подложки:.

1.2.2. Негативное контрастирование - преимущества и недостатки:.

1.2.3. Крио-микроскопия:.

1.2.4. Формирование изображения в ПЭМ:.

1.3. Получение электронно-микроскопических изображений. Разрешение и критерии его оценки.

1.3.1. Сходство и различие светового и электронного микроскопов:.

1.3.2. Аберрации:.

1.4. Принципы реконструкции макромолекул.

1.4.1. Сбор изображений частиц:.

1.4.2. Двухмерные проекции как основа для трехмерного изображения:.

1.4.3. Преобразование Фурье и факторы, влияющие на реконструкцию:.

1.4.4. Центрирование:.

1.4.5. Трансляционное и ротационное выравнивание:.

1.4.6. Классификация электронно-микроскопических изображений.

1.5. Трехмерная реконструкция: основные принципы.

1.5.1. Факторы реконструкции:.

1.5.2. Метод случайного конического наклона (КСТ):.

1.5.3. Метод обратных проекций:.

1.5.4. Сопоставление проекций:.

1.5.5. Разрешение реконструкции:.

1.6. Методы определения трехмерной структуры целых клеток и клеточных органелл

1.6.1. Стереопары:.

1.6.2. Принципы электронной томографии:.

1.7. Интерпретация трехмерной структуры.

1.7.1. «Визуальный» фиттинг.

1.7.2. Фиттинг известной кристаллической структуры:.

1.7.3. Программы для автоматического фиттинга:.

1.7.4. Построение молекулярных моделей белков на основе моделирования по гомологии:.

1.7.5. Мечение антителами или иммуномечение:.

1.7.6. Мутагенез:.

1.7.7. Кластеризация и образование комплексов:.

1.7.8. Мечение наночастицами золота:.

1.8. Значение структурной информации для медицины.

1.8.1. Роль потенциал-зависимых калиевых каналов в организме человека.

1.8.2 Канал Ку2.1.

1.8.3. Канал Ку1 0.2:.

1.8.4. Роль АСБ в организме человека:.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Комплексный подход к исследованию структуры белков на основе электронной микроскопии»

3.2. Очистка белков Kv каналов.90

3.2.1. Kv1.1:.91

3.2.2. Kv2.1áC и Kv2.1ACTA:.92

3.2.3. Kv10.2:.92

3.3. Электронная микроскопия и обработка изображений:.93

3.4. Строение и конформационные изменения канала Kv1.1 (Shaker).96

3.4.1. Трехмерная структура канала Shaker.96

3.4.2. Интерпретация 3D структуры и локализация доменов канала Shaker.98

3.4.3. Конформационные перестройки С-концевого домена канала Kv1 (Shaker) при взаимодействии с р-субъединицей:.100

3.5. Трехмерная структура канала Kv2.1 и докализация его С-концевых доменов.107

3.5.1. Трехмерные структуры мутантных каналов Kv2.1ACTA и Kv2.1aC:.108

3.5.2. Интерпретация 3D структур и локализация цитоплазматических доменов канала Kv2.1:.110

3.5.3. Сравнение структурных данных о цитоплазматических доменах канала Kv2.1 с экспериментальными:.112

3.5.4. Локализация «окон» между цитоплазматической и мембранной частями канала Kv2.1:.113

3.5.5. Конформационные изменения мембранного домена канала Kv2.1:.114

3.6. Построение молекулярной модели полноразмерного канала Kv10.2.121

3.7. Кластеризация Kv каналов и роль цитоплазматических доменов в этом процессе. .126

3.7.1. Кластеризация каналов Kv2.1.126

3.7.2. Кластеризация каналов Kv10.2.129

3.7.3. Механизм образования кластеров.129

3.8. Гипотеза изменения конформационного состояния калиевых каналов при активации

131

3.9. Заключение.133

ГЛАВА 4 КОНФОРМАЦИОННЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ В АКТИНСВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКАХ ПРИ АКТИВАЦИИ И ВЗАИМОДЕЙСТВИИ С ЛИГАНДАМИ.134

4.1. Введение.134

4.2.Трехмерная структура комплекса CAP/srv2.134

4.2.1. Очистка белка Srv2:.136

4.2.2. Электронная микроскопия и обработка изображений:.136

4.2.3. Трехмерная структура N-Srv2:.137

4.2.4. Функциональная характеристика гексамера N-Srv2:.139

4.2.5. Структура С-концевого домена Srv2:.143

4.2.6. Модель полноразмерного комплекса Srv2:.145

4.3. Трехмерная структура формина mDial и основы его автоингибирования.147

4.3.1. Очистка формина, электронная микроскопия и обработка изображений:.148

4.3.2. 3D структура формина mDial (55-1255), полученная с помощью метода RCT: 149

4.3.3. 3D структура формина mDial (55-1255), полученная с помощью метода обратных проекций:.149

4.3.4. Интерпретация 3D структуры формина:.152

4.3.5. Сравнение ПЭМ данных о расположении доменов формина с данными рентгенострукгурного анализа:.155

4.3.6. Гипотеза физиологического обновления формина в клетке:.156

4.4. Структура комплекса Агр2/3 и его взаимодействие с лигандами.157

4.4.1. Электронная микроскопия и обработка изображений:.158

4.4.2. Конформационные изменения Агр2/3 комплекса при взаимодействии с лигандами:.159

4.4.3. Роль субъединицы р35 в активации Агр2/3 комплекса:.162

4.4.4. Гипотеза конформационных изменений Агр2/3 комплекса при активации и инактивации:.164

4.5. Заключение.165

ГЛАВА 5. СТРУКТУРНЫЕ ОСНОВЫ МОДИФИКАЦИИ ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ I-BAR БЕЛКАМИ.166

5.1. Введение.166

5.2. Модификация липидных мембран I-BAR доменами.167

5.3. Структура полноразмерного IRSp53.175

5.3.1. Очистка IRSp53:.175

5.3.2. Электронная микроскопия и обработка изображений.176

5.3.3 Трехмерная структура полноразмерного IRSp53.177

5.4. Заключение.178

ГЛАВА 6. ЧЕТВЕРТИЧНАЯ СТРУКТУРА СПИДРОИНОВ, ПРИМЕНЯЕМЫХ В ТРАНСПЛАНТАЛОГИИ.179

6.1. Введение.179

6.2. Морфология синтетических нитей паутины.180

6.2.1. Морфология «0»-нитей:.180

6.2.2. Формование и морфология вытянутых нитей:.182

6.3. Морфология нанофибрилл, образованных белками паутины.185

6.4. Модельная система для изучения фолдинга нитей паутины.189

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.192

ВЫВОДЫ:.194

ЦИТИРУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА.195

БЛАГОДАРНОСТИ.221

Мы не должны обижаться на тех ученых, которые вначале не поверили в электронный микроскоп» Э.Руска, Нобелевская лекция, 1986 г.

ВВЕДЕНИЕ

Современная молекулярная биология стремительно расширяет круг знаний, область интересов перемещается от одиночных молекул к более сложным молекулярным машинам, растет потребность в структурной информации о комплексах нанобиообъектов.

В настоящее время (2012 г.) в мире расшифровано более 77000 атомных структур белков, в их числе мембранные белки, ионные каналы, аквапорины, рибосомальные субъединицы и др. Однако структура одиночного компонента может рассматриваться только как первый шаг к пониманию основ функционирования всей системы в целом. Известно, что изменение конформационного состояния белка отражается на его функциональной активности (Рубин, 2004). Знание структуры макромолекулярных комплексов дает возможность интерпретировать конформационные изменения в молекулах в процессе их активации и автоингибирования, а также при связывании с лигандами и/или плазматической мембраной.

Признанными методами для изучения структуры и конформационных изменений в белковых молекулах являются: рентгеноструктурный анализ, ЯМР, метод спиновых меток, детекция люминисценции и спектроскопические методы ((Blow, 2002; Tyszka et al, 2005; Вассерман & Коварский, 1986)). Каждый из этих методов имеет свои преимущества и ограничения. Большинство методов способны детектировать лишь незначительные изменения полипептидной цепи и далеко не всеми методами можно определить, какая часть белка и как изменила свою конформацию. Световая микроскопия в последние годы достигла разрешения около 50 нм, используя флуоресцентные маркеры и FRET метод наблюдения отдельных молекул (Huang et al, 2009). Рентгеновская томография позволяет изучать толстые (около 10 мкм) срезы с разрешением 15 нм (McDermott et al, 2009). Метод просвечивающей электронной микроскопии (ПЭМ) макромолекул позволяют визуализировать не только трехмерную структуру, но и динамику самых разнообразных биологических нанообъектов с разрешением от 25 нм до атомного (0,2 нм) (Al-Amoudi et al, 2004; Bhushan et al, 2011; Dubochet et al, 1988; Gonen et al, 2005; Henderson et al, 1990; Zlegler et al, 2002). I

IS f

Метод ПЭМ не обременен многими сложностями, характерными для других структурных методов: в нем нет лимитирующего размера частиц, не обязательно наличие кристаллов, количество используемого материала достаточно мало, крио-модификация метода ПЭМ позволяет наблюдать молекулы в нативном водном окружении в состоянии, близком к физиологическому (Dubochet et al, 1988; Koster et al, 1997; Lucic et al, 2008; Mcintosh et al, 2005). В сочетании с методом реконструкции макромолекул (Van Heel, 1987а) и фиттингом кристаллических структур, ПЭМ белков позволяет получить представление о трехмерной структуре и конформационных изменениях макромолекулярных комплексов. Для изучения замороженных срезов клеток и тканей используют крио-томографию (Al-Amoudi et al, 2004; Hsieh et al, 2002).

В данной работе метод ПЭМ использовался для получения впервые трехмерных структур крупных мембранных и цитоплазматических глобулярных белков, а также для изучения основ формирования фибриллярных структур белками паутины, спидроинами.

Целью работы является разработка комплексного подхода к изучению четвертичной структуры белковых молекул на основе просвечивающей электронной микроскопии.

Для достижения цели решаются следующие задачи:

1. Формулировка основных положений комплексного подхода к изучению четвертичной структуры белков;

2. Получение трехмерных структур ряда мембранных и цитоплазматических белков с разрешением 1,8-2,5 нм;

3. Построение молекулярных моделей белков на основе моделирования по гомологии и фиттинга;

4. Изучение конформационных перестроек в белковых молекулах при активации, взаимодействии с лигандами и с плазматической мембраной.

В работе были исследованы важные структурные особенности макромолекул и белок-белковых комплексов, до настоящего времени не закристаллизованных. В работе впервые:

1. Получены трехмерные структуры калиевых потенциал-зависимых каналов Kv1.1, Kv2.1, Kv10.2 и их транкированных мутантов с разрешением 2,0-2,5 нм;

2. Получены трехмерные структуры актинсвязывающих белков (mDial, Агр2/3, Srv2, IRSp53) и их изолированных доменов с разрешением 1,8-2,5 нм;

3. Показано наличие конформационных перестроек в цитоплазматических доменах калиевых потенциал-зависимых каналов при межмолекулярных взаимодействиях, связывании лигандов и проведении ионов;

4. Изучены структурные основы кластеризации потенциал-зависимых каналов семейства Kv10;

5. Предложена гипотеза изменения конформационного состояния калиевых каналов при активации;

6. Определены конформации комплекса Агр2/3 в нативном состоянии и при связывании с лигандами и выяснена связь Агр2/3 с функциональной активностью клетки;

7. Показано, что автоингибирование формина mDial связано со стерическим блокированием сайтов связывания актина;

8. Предложена гипотеза изменения конформационного состояния формина в зависимости от его функционального состояния;

9. Определено олигомерное строение комплекса Srv2, и показано, что олигомер N-концевых доменов Srv2 способен взаимодействовать с полимиризованым F- актином в присутствии кофилина;

10. Изучены структурные основы активации и модификации плазматической мембраны I-BAR белками;

11. Разработана модель для изучения фолдинга белков паутины и получена структура нанофибрилл спидроина I.

Полученные знания в дальнейшем могут быть применены для теоретических исследований в области строения белков, белок-белковых комплексов, как структурные предпосылки для молекулярного моделирования (направленная доставка лекарств, дизайн новых лекарственных средств), а также для практической работы по детекции и анализу наночастиц биологического происхождения. Результаты моделирования in vitro процессов прядения паутины свидетельствуют о принципиальной возможности разработки биоматериалов с уникальными свойствами на основе рекомбинантных аналогов белков паутины путем имитации природных процессов формирования нитей паутины. Эти результаты используются при производстве матриксов для культивирования клеток в транспланталогии.

Материалы диссертации используются при чтении курсов «Введение в методы микроскопии в биологии» студентам, обучающимся по специальности «Биоинженерия» на кафедре биоинженерии Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова. Современные методы, изложенные в диссертации, включены в разделы практикумов по биоинженерии на кафедре биоинженерии Биологического факультета МГУ имени М.В.Ломоносова, используются студентами и аспирантами при выполнении курсовых, дипломных, магистерских и диссертационных работ.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

3D - трехмерный

ACF - автокорреляционная функция

АдТх2 -аджитоксин-2

СС - взаимно-коррелятивная функция

CD - круговой дихроизм

CMC -критическая концентрация мицелл

CTF - частотно-контрастная характеристика

FTIR - инфракрасная спектроскопия с преобразованием Фурье

FRC - коэффициент двумерной корреляции Фурье

FSC - коэффициент объемной корреляции Фурье

GFP - зеленый флуоресцентный белок

Kv - потенциал-зависимые калиевые каналы

RCT - метод случайного конического наклона

RMSD - среднеквадратичное отклонение

TIRFM - флуоресцентная микроскопия полного внутреннего отражения а.к. - аминокислота

АСБ - актинсвязывающие белки

АСМ - атомно-силовая микроскопия

КРЭП - карты распределения электронной плотности

МД - молекулярная динамика

ММ - молекулярное моделирование

МРА - мультирефересный анализ

МСА - многомерный статистический анализ

НПФ - факторы, способствующие нуклеации

ПААГ - полиакриламидный гель

ПЗС - прибор с зарядовой связью

ПО - программное обеспечение

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПЭМ - просвечивающая электронная микроскопия

ЯМР - ядерно-магнитный резонанс

Заключение диссертации по теме «Биофизика», Соколова, Ольга Сергеевна

ВЫВОДЫ:

1. Разработан комплексный подход к изучению четвертичной структуры белковых молекул на основе просвечивающей электронной микроскопии.

2. Получены трехмерные структуры ряда мембранных и цитоплазматических белков, до настоящего времени не подвергшихся кристаллизации.

3. С использованием трехмерных структур, моделирования по гомологии и фиттинга построены молекулярные модели ряда мембранных и цитоплазматических белков.

4. Показана принципиальная возможность использования просвечивающей электронной микроскопии в комплексе с молекулярным моделированием для изучения конформационных изменений в мембранных и цитоплазматических белках.

5. Показана возможность разработки биоматериалов с уникальными свойствами путем имитации природных процессов формирования нитей паутины.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Знание атомной структуры белковой молекулы позволяет интерпретировать функциональные изменения в молекуле в процессе ее активации и ингибирования. Однако далеко не все структуры белков известны к настоящему времени. Для изучения структур белков, не подвергшихся кристаллизации, перспективными являются комплексные методы, совмещающие структурные эксперименты с компьютерным молекулярным моделированием. При отсутствии кристаллических структур, моделирование может проводиться на основе выравнивания гомологичных аминокислотных последовательностей. В данном исследовании моделирование по гомологии проводилось для получения ряда структур мембранных и цитоплазматических доменов ионных каналов, а также глобулярных АСБ. Известно, что каналы зукариот достаточно гомологичны бактериальным каналам, для которых кристаллизация осуществлена более успешно (Doyle et al, 1998а; Kuo et al, 2003).

На современном уровне развития протеомики становится все более важным не только определение структуры и функции отдельных белков, но и оценка активности различных мутантов. В частности, мутации в генах, связанных с функционированием потенциал-зависимых ионных каналов, являются причиной таких тяжелых наследственных заболеваний, как глухота, эпилепсия, а также сердечная аритмия, рассеянный склероз и болевой синдром (Beekwilder et al, 2003; Droge & Schipper, 2007; Niizuma et al, 2009; Reynolds et al, 2007). В последние пять лет изучению молекулярного строения ионных каналов уделяется особое внимание во всем мире в связи с разработкой новых эффективных лекарств против этих болезней.

Полученные нами с использованием комплексного подхода модели четвертичных структур мутантных ионных каналов Kv1, Kv2, Kv10 позволили изучить взаимное расположение и специфические взаимодействия цитоплазматических доменов этих каналов, и их роль в регуляции активности. В частности, сравнение структурных данных с результатами электрофизиологических экспериментов позволило сделать вывод о возможном влиянии цитоплазматических доменов на активацию/инактивацию каналов.

Все больше данных свидетельствует о том, что наличие нанофибрилл в нитях паутины обеспечивает ее уникальные механические свойства (Bogush et al, 2009). Полученные в данном исследовании новые знания о четвертичной

192 структуре и конформационных перестройках белков паутины - спидроинов -имеют большое научное и практическое значение. Трехмерные матрицы на основе рекомбинантных спидроинов можно рассматривать в качестве перспективного материала для создания искусственных тканей и органов.

Согласно имеющимся данным, нарушения в функционировании актинсвязывающих белков являются отличительной особенностью необластических клеток (Васильев, 1996). Открытый в неметастазирующих раковых клетках белок MIM (Lee et al, 2002) и гомологичный ему белок IRSp53 представляют особый интерес для исследования, так как они одновременно регулируют сборку актиновых филаменов и стимулируют образование филоподий (Mattila et al, 2003). Результаты исследования ряда структур АСБ, представленные в данной работе, существенно дополнили и скорректировали наши представления о механизмах функционирования АСБ.

Разработанный в данном исследовании комплексный подход к изучению четвертичной структуры белковых молекул на основе просвечивающей электронной микроскопии позволил получить новые молекулярные и структурные данные о строении ряда мембранных и цитоплазматических белков. Эти данные могут служить основой для дальнейших экспериментов по моделированию активации/инактивации, для планирования новых экспериментов по направленному мутагенезу и компьютерного дизайна новых лекарственных средств.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Соколова, Ольга Сергеевна, 2012 год

1. Abola ЕЕ, Sussman JL, Prilusky J, Manning NO (1997) Protein Data Bank archives of three-dimensional macromolecular structures. Methods Enzymol 277:556-571

2. Adair B, Nunn R, Lewis S, Dukes I, Philipson L, Yeager M (2008) Single particle image reconstruction of the human recombinant Kv2.1 channel. BiophysJS4: 2106-2114

3. Adrian M, Dubochet J, Fuller SD, Harris JR (1998) Cryo-negative staining. Micron 29:145-160

4. Aizenman E, Stout AK, Hartnett KA, Dineley KE, McLaughlin B, Reynolds IJ (2000) Induction of neuronal apoptosis by thiol oxidation: putative role of intracellular zinc release. J Neurochem 75: 1878-1888

5. Al-Amoudi A, Chang JJ, Leforestier A, McDowall A, Salamin LM, Norlen LP, Richter K, Blanc NS, Studer D, Dubochet J (2004) Cryo-electron microscopy of vitreous sections. Embo J 23:3583-3588

6. Alber F, Forster F, Korkin D, Topf M, Sali A (2008) Integrating diverse data for structure determination of macromolecular assemblies. Annu Rev Biochem 77:443-477

7. Albrecht B, Lorra C, Stocker M, Pongs О (1993) Cloning and characterization of a human delayed rectifier potassium channel gene. Receptors Channels 1:99-110

8. Andre I, Bradley P, Wang C, Baker D (2007) Prediction of the structure of symmetrical protein assemblies. Proc Natl Acad Sci U S A 104:17656-17661

9. Andrianantoandro E, Pollard TD (2006) Mechanism of actin filament turnover by severing and nucleation at different concentrations of ADF/cofilin. Mol Cell 24:13-23

10. Arkhipov A, Yin Y, Schulten К (2008) Four-scale description of membrane sculpting by BAR domains. Biophys J 95: 2806-2821

11. Baker TS, Johnson JE (1996) Low resolution meets high: towards a resolution continuum from cells to atoms. Curr Opin Struct Biol 6:585-594

12. Ben-Zeev E, Kowalsman N, Ben-Shimon A, Segal D, Atarot T, Noivirt O, Shay T, Eisenstein M (2005) Docking to single-domain and multiple-domain proteins: old and new challenges. Proteins 60:195201

13. Berchanski A, Segal D, Eisenstein M (2005) Modeling oligomers with Cn or Dn symmetry: application to CAPRI target 10. Proteins 60:202-206

14. Berendsen HJC, Vanderspoel D, Vandrunen R (1995) Gromacs a Message-Passing Parallel Molecular-Dynamics Implementation. Comput Phys Comrrwn 91:43-56

15. Berriman J, Unwin N (1994) Analysis of transient structures by cryo-microscopy combined with rapid mixing of spray droplets. Ultramicroscopy 56:241-252

16. Bhushan S, Hoffmann T, Seidelt B, Frauenfeld J, Mielke T, Berninghausen O, Wilson DN, Beckmann R (2011) SecM-stalled ribosomes adopt an altered geometry at the peptidyl transferase center. PLoS Biol 9: el000581

17. Bixby KA, Nanao MH, Shen NV, Kreusch A, Bellamy H, Pfaffinger PJ, Choe S (1999) Zn2+-binding and molecular determinants of tetramerization in voltage-gated K+ channels. Nat Struct Biol 6:38-43

18. Blow D (2002) Outline of Crystallography for Biologists, Oxford: Oxford University Press.

19. Bompard G, Sharp SJ, Freiss G, Machesky LM (2005) Involvement of Rac in actin cytoskeleton rearrangements induced by MIM-B. J CellSci 118:5393-5403

20. Bossy-Wetzel E, Schwarzenbacher R, Lipton SA (2004) Molecular pathways to neurodegeneration. Nat Med 10 Suppl: S2-9

21. Bracey K, Ju M, Tian C, Stevens L, Wray D (2008) Tubulin as a binding partner of the heag2 voltage-gated potassium channel. J Membr Biol 222:115-125

22. Cai L, Makhov AM, Schafer DA, Bear JE (2008) Coronin IB antagonizes cortactin and remodels Arp2/3-containing actin branches in lamellipodia. Cell 134:828-842

23. Cai SO, Sesti F (2007) A new mode of regulation of N-type inactivation in a Caenorhabditis elegans voltage-gated potassium channel. J Biol Chem 282:18597-18601

24. Camacho J (2006) Ether a go-go potassium channels and cancer. Cancer Lett 233:1-928.