Комплексная оценка морфофункциональных и микробиологических показателей половых клеток быков - производителей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.02.01, доктор наук Борунова Сеидфатима Мировна

• Борунова Сеидфатима Мировна
• доктор наук
• 2019

Оглавление диссертации доктор наук Борунова Сеидфатима Мировна

ВВЕДЕНИЕ

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 1. АНАЛИТИЧЕСКИЙ ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ И ВЫБОР НАПРАВЛЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

1.1. Концепция повышения качества половых клеток крупного рогатого скота в современной России

1.2. Система международного обмена спермопродукцией

1.3. Морфологическая и молекулярно-биологическая характеристика сперматозоидов

1.4. Ветеринарно-санитарный контроль качества замороженной спермы быков-производителей

1.5. Влияние условно-патогенных бактерий и грибов - контаминантов на сперматозоиды, оплодотворяемость и развитие гинекологических болезней

1.5.1. Контаминация спермы возбудителями инфекционных болезней крупного рогатого скота и уровень эмбриональной смертности после искусственного осеменения

1.5.2. Выделение из спермы быков-производителей микоплазм и их влияние на воспроизводство

1.6. Генетические аномалии крупного рогатого скота, передающиеся при искусственном осеменении

1.6.1. Роль мутаций в возникновении врожденных аномалий и нарушений воспроизводительной функции животных

1.6.2. Характеристика основных мутаций крупного рогатого скота

1.7. Применение сексированного семени в России и характеристика его воспроизводительной активности в сравнительном аспекте с обычной спермой крупного рогатого скота

1.8. Заключение по разделу

ГЛАВА 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Описание использованных методов исследований, материалов и оборудования

2.2. Определение качества спермы быков-производителей в зависимости от физико-химических свойств спермы и технологии ее получения

2.3. Отработка методики экспресс-окрашивания спермы для оценки морфологии сперматозоидов при идентификации аномальных спермиев

2.4. Оценка акросомной реакции спермопродукции

2.5. Разработка методики подсчета индекса фрагментации ДНК-хроматина сперматозоида

2.6 Разработка режимов лазерного излучения для воздействия на свежеполученный и криоконсервированный эякулят спермы при моделировании технологии получения сексированного семени

2.6.1. Оценка качества облученной спермы по морфологическим показателям

2.7 Заключение по разделу

ГЛАВА 3. УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДОВ ВЫЯВЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ИНФЕКЦИОННЫХ БОЛЕЗНЕЙ ЖИВОТНЫХ В ГЕНЕТИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ, ПОСТУПАЮЩЕМ В РОССИЙСКУЮ ФЕДЕРАЦИЮ ИЗ-ЗА РУБЕЖА

3.1. Изучение контаминации спермы крупного рогатого скота отечественного и зарубежного производства возбудителями бактериальных инфекций

3.1.1. Контаминация спермы быков-производителей бактериями рода Mycoplasma

3.1.2. Мониторинг выявляемости бактерий рода Campilobacter из спермы, поступающей в РФ из-за рубежа

3.1.3. Изучение антибиотикорезистентности Pseudomonas aeruginosa, выделенной из криоконсервированной спермы

3.2. Определение уровня обсемененности спермы микромицетами

3.3. Заключение по разделу

ГЛАВА 4. РАЗРАБОТКА МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ИДЕНТИФИКАЦИИ МУТАЦИЙ, АССОЦИИРОВАННЫХ С НАСЛЕДСТВЕННЫМИ ПАТОЛОГИЯМИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА212

4.1. Идентификация мутаций, обуславливающих наследственные заболевания крупного рогатого скота голштинской и бурой швицкой пород215

4.2. Оценка качества спермы Бельгийской бело-голубой породы крупного рогатого скота

4.3. Заключение по разделу

ГЛАВА 5. РАЗРАБОТКА КОМПЛЕКСА МЕРОПРИЯТИЙ ПО КОНТРОЛЮ И МОНИТОРИНГУ КАЧЕСТВА ИМПОРТНОЙ СПЕРМЫ ПО

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫМ, МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИМ,

ГЕНЕТИЧЕСКИМ И РЕПРОДУКТИВНЫМ ПАРАМЕТРАМ

Глава 6. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Сведения о практическом использовании полученных научных результатов

Рекомендации по использованию научных результатов

Перспективы дальнейшей разработки темы

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЯ

Приложение 1 Акт внедрения результатов исследований

Приложение 2 Справка о внедрении результатов исследований

Приложение 3 Патент «Способ определения индекса фрагментации ДНК сперматозоидов у животных-производителей»

Приложение 4 Сообщение Росстандарта о направлении поправок к ГОСТу на экспертизу

Приложение 5 ГОСТ 26030-2015 «Средства воспроизводства. Сперма быков замороженная»

Приложение 6 Поправки (с опубликование) к ГОСТу 26030-2015 «Средства воспроизводства. Сперма быков замороженная»

Приложение 7 Новая форма сертификата для быков-производителей с внесёнными изменениями

Приложение 8 Золотая медаль и диплом выставки «Золотая осень-2018» за подготовку и издание ученика «Методология научного исследования»

Приложение 9 Методические рекомендации «Культуральное микологическое исследование спермы»

Приложение 10 Методические указания «Ветеринарно-санитарный контроль качества замороженной спермы быков-производителей. Методы исследований физических, биологических свойств и морфофункциональный анализ качества криоконсервированной спермы»

Приложение 11 Методические указания «Ветеринарно-санитарный контроль качества замороженной спермы быков-производителей. Методы исследований

физических, биологических свойств и морфофункциональный анализ качества криоконсервированной спермы, разделённой по полу»

Приложение 12 Методические рекомендации «Методы исследований физических, биологических свойств и морфофункциональный анализ качества криоконсервированной спермы быков-произодителей»

Приложение 13 Методические рекомендации «Биологический мониторинг качества сперм, разделённой по полу быков-производителей. Методы исследований физических, биологических свойств и морфофункциональный анализ сексированного семени»

Приложение 14 Методические рекомендации «Определение цеостности акросомы сперматозоидов в замороженной сперме быков-производителей»358

Приложение 15 Методические рекомендации «Определение индекса фрагментации ДНК в замороженной сперме у животных производителей»

Приложение 16 Методические рекомендации «Идентификация мутаци, ассоциированных с наиболее распространёнными наследственными патологиями крупного рогатого скота бурой швицкой порды, молекулярно-генетическими методами»

Приложение 17 Методические рекомендации «Исследование замороженно-оттаянной спермы быков-произвдителей. Методика определения прямолинейной поступательной подвижности сперматозоидов в молочной среде»

Приложение 18 Методические указания «Ветеринарно-санитарный контроль качества спермы быков-производителей. Методы микробиологического анализа замороженно-оттаянной спермы быков-производителей»

Приложение 19 Методические рекомендации «Методика определения прямолинейной поступательной подвижности сперматозоидов в сперме быков-производителей, криоконсервированной в молочной среде»

Приложение 20 Сертификат V конгресса Европейской ассоциации ветеринарных диагностических лабораторий (Брюссель, Бельгия)

Приложение 21 Сертификат XXII ветеринарной конференции по репродукции (Кордова, Испания)

Приложение 22 Справка о внедрнии результатов исследований в учебный процесс ФГБОУ ВО МГАВМиБ-МВА им. К.И.Скрябина

Приложение 23 Справка о внедрении результатов исследований в учебный процесс ФГБОУ РАМЖ

Приложение 24 Справка о внедрении результатов исследований в учебный процесс ФГБОУ ВО Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана

ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

АМ - артрогрипоз (Arthrogryposis multiplex);

ВН2 - гаплотип 2 бурой швицкой (Haplotype BH2;

BY - Брахиспина;

BLAD - дефицит лейкоцитарной адгезии;

БК - процент быстрых клеток;

DD - дупликация развития = полимелия (Developmental Duplications = Polymelia);

DM - гипертрофия мускулатуры (Muscular hypertrophy);

DTT - 1,4-дитиотреитол;

DW - карликовость (Dwarfism);

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

И-1 - И-4 - лазерные излучатели;

С - концентрация клеток;

CDH - дефицит холестерина;

CVM - комплексный порок позвоночника;

FXID - дефицит фактора крови;

КРС - крупный рогатый скот;

М - маркер молекулярных масс;

MA - маннозидоз альфа (Mannosidosis а);

ОКО - отрицательный контрольный образец;

ПКО положительный контрольный образец;

п.н. - пара нуклеотидов;

ППД - прямолинейное поступательное движение;

РНК - рибонуклеиновая кислота;

ТАЕ - трисацетатный электродный буфер;

ТРГ - индекс племенной ценности быков-производителей;

OS - остеопетроз (Osteopetrosis);

ОСД - общая (средняя) скорость движения;

SAA - синдром арахномиелии и артрогрипоза (Arachnomelia);

SDM - спинальная демиелинизация (Spinal dysmyelination);

SMA - спинальная мышечная атрофия (Spinal muscular atrophy);

W - синдром Вивера, прогрессирующая дегенеративная миелоэнцефалопатия (Weaver syndrome);

ФГБУ - ФГБУ «Всероссийский государственный Центр каче-

«ВГНКИ» ства и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов»;

ЭДТА - натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования. В соответствии с современными тенденциями развития сельского хозяйства в РФ и за рубежом, выполняя Указ Президента РФ от 21 июля 2016 г № 350 « О мерах по реализации государственной научно-технической политики в интересах развития сельского хозяйства», и реализуя положения Доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации, утвержденной указом Президента РФ от 30 января 2010 г. № 120, требуется инновационный подход к такому традиционному для нашей страны направлению животноводства, как разведение крупного рогатого скота.

Для достижения высоких показателей экономической эффективности страны, позволяющих удовлетворить возрастающий внутренний спрос на сельскохозяйственную продукцию животного происхождения, необходимы строгие меры по организации безопасности животноводства и пищевой продукции. При этом возрастает значимость применения актуальных подходов к контрольно-надзорной деятельности как самих хозяйствующих субъектов РФ, так и официальных органов власти (Прокофьева С.Е., Богатырев Е.Д., Панина О.В., Еремин С.Г., 2017).

Всемирная организация здравоохранения животных (МЭБ), а также смежные международные организации (Комиссия «Кодекс Алиментариус», ВТО) рекомендуют применять в области защиты животных так называемый риск-ориентированный подход, основанный на анализе рисков.

По данным Хишова А.С., Мельничука Е.В. и др. (2016), оценка рисков включает последовательную идентификацию потенциальных опасностей, прогнозирование последствий их реализации в случае неблагоприятного развития событий и научное обоснование принимаемых ветеринарно-санитарных мер. Вспомогательными инструментами для оценки рисков являются эпизоотический анализ, ранжирование рисков, сравнительный анализ эпизоотологических и эпидемиологических данных и т.д.

В настоящее время наблюдается увеличение импорта на территорию Рос-

сийской Федерации обычной и сексированной спермы быков-производителей (Карцев Б.В., Мусинова Н.Н., 2016).

Контроль качества генетического материала до 90-х годов ХХ века позволил предупредить ввоз и распространение возбудителей инфекционных болезней, передающихся половым путем при искусственном осеменении животных, и в полном объеме осуществлять ветеринарно-санитарный контроль спермопро-дукции, ввозимой на территорию нашей страны (Грязнева Т.Н. Борунова С.М., 2016 и др.).

Однако, в 90-е годы были открыты все границы и в Россию хлынул неконтролируемый поток разного рода биологической продукции, в том числе генетического материала, в условиях отсутствия научно-обоснованной селекционной программы и прогноза конечного результата. Оценку репродуктивного потенциала крупного рогатого скота при импорте как племенных животных, так и спер-мопродукции практически не проводились, так как отсутствовали эффективные лабораторные методы и оборудование, необходимые для контроля качества све-жеполученной и криоконсервированной спермы.

Постановлением Правительства РФ от 13.11.2010 г. № 906 «О внесении изменений в Постановление Правительства РФ от 01.12.2009 № 982 «Об утверждении единого перечня продукции, подлежащей обязательной сертификации, и единого перечня продукции, подтверждение соответствия которой осуществляется в форме принятия декларации о соответствии», сперма сельскохозяйственных животных была исключена из перечня продукции, подлежащей обязательному подтверждению соответствия. В результате этого, в настоящее время ветеринарный рынок насыщен генетической продукцией сомнительного качества, которая подвергается формально только «бумажному» контролю.

Анализ и оценка отечественными учеными (Дунин И.М., Новиков А.А., 2003; Зиновьева Н.А., Моисейкина Л.Г., Кленовицкий П.М., Гладырь Е.А., Ген-джиева О.Б., 2014; Чинаров В.И. Стрекозов Н.И., 2017, и др.) сложившейся ситуации в области воспроизводства и искусственного осеменения крупного рогатого скота с целью селекционирования высокопродуктивных животных, на фоне

отсутствия генетического контроля, позволили констатировать факт наличия в генетическом материале, ввозимом на территорию нашей страны от племенных быков - лидеров коммерчески значимых пород, различных генетических аберраций, носителями которых являются представители голштинской, абердин-ангусской, бурой швицкой и др. пород.

Кроме того, российскими учеными установлено, что сексированная сперма, в последние годы в большом количестве поступающая в РФ из-за рубежа, может содержать аномальные формы спермиев и мутированные гены, так как в процессе разделения по полу проходит стадии жесткого физического и химического воздействия, что негативно воздействует на качество генетического материала и может привести к развитию наследственных болезней у животных (Гуськова С.В., Турбина И.С., Ескин Г.В., Комбарова Н.А., 2014; Зиновьева Н.А., Костю-нина О.В., Волкова В.В., 2016).

По мнению многих отечественных специалистов (Баранов М.Л., 2015; Карцев Б.В., Мусинова Н.Н., 2016; Богатырев Е.Д., Прокофьева С.Е., Панина О.В., Еремина С.Г., 2017), в целях реализации Доктрины продовольственной безопасности Российской Федерации назрела необходимость разработки и внедрения в экономику страны новых подходов хозяйственной и контрольно-надзорной деятельности, а именно создание и применение современных норм, стандартов и алгоритмов работы с генетическим материалом крупного рогатого скота.

В связи с вышеизложенным, перед ветеринарными специалистами страны стоит острая и актуальная проблема - разработка ветеринарно-санитарных требований по контролю качества спермодоз продуктивных животных, поступающих на территорию России из-за рубежа, которые будут содержать исчерпывающую информацию о спермопродукции по результатам проведения детального микробиологического, биологического и генетического мониторинга, отвечающим реалиям сегодняшнего дня.

Степень разработанности темы. Основу ветеринарного контроля при искусственном осеменении продуктивных животных, который включает многоплановые функционально значимые аспекты исследований как племенных жи-

вотных, так и генетического материала, составляют биологические, биохимические, микробиологические, бактериологические и вирусологические методы.

При наличии большого количества научных работ, проведенных в вышеперечисленных направлениях (Абилов М.Ю., Комбарова Н.А., Гуськова С.В., Грязнева Т.Н., Борунова С.М., 2000-2018), недостаточно достоверной информации в области доказательной базы безопасности генетического материала крупного рогатого скота, поступающего в Россию из-за рубежа.

На протяжении нескольких десятилетий в РФ создавалась иллюзия ветеринарного благополучия животных и молодняка в отечественном скотоводстве, а данные о наличие опасных заболеваний животных, передающихся половым путем и при искусственном осеменении (инфекционный ринотрахеит, вирусная диарея, кампилобактериоз, микоплазмоз и др.), в открытой печати отсутствовали.

Существенный вклад в изучении проблемы ветеринарно-санитарного котроля генетического материала и болезней инфекциооного характера, передающихся половым путем, внесли такие ученые как Балашов Н.Г., Родина В.Н. (1990) и др.

В последние 15 лет проблеме разработки биологических и биохимических методов для определения качества генетического материала уделяли внимание Брагина Е.Е., 2017; Зиновьеа Н.А., Кленовицкий П.М., Иолчиев Б.С., 2007 и др.

Их работы содержат фундаментальные основы, которые всесторонне освещают вопросы, связанные с морфофункциональными особенностями половых клеток, содержанием в них микроорганизмов - контаминантов и влиянием их на качество спермы, оплодотворяемость, возникновение болезней и абортов у животных, осеменённых импортной спермой.

Данные исследования в значительной мере иницировали задачу изучения морфофункциональных характеристик сперматозоидов на основе применения электронной микроскопии.

В работах российских ученых отражены функциональные механизмы органоидов половой клетки, но не рассматриваются вопросы идентификации патоло-

гий, приводящих к фертильности самцов-производителей и снижению качества замороженно-оттаянной спермы.

Вместе с тем, полученных отечественными учеными научных результатов недостаточно, чтобы заложить базу для разработки системы контроля комплексной оценки морфофункциональных и микробиологических показателей половых клеток быков-производителей в целях обеспечения Государственного контроля при ввозе на территорию Российской Федерации спермопродукции стратегического назначения, а анализ доступной литературы позволяет сделать вывод о необходимости дальнейших исследований в данном направлении.

Цель исследований: разработать систему комплексной оценки морфо-функциональных и микробиологических показателей половых клеток быков-производителей и на этом основании усовершенствовать методы контроля их качества.

Для решения были поставлены следующие задачи:

1. Усовершенствовать экспресс-метод идентификации аномальных форм сперматозоидов.

2. Оценить целостность акросомы спермопродукции, поступающей в РФ из-за рубежа.

3. Разработать методику подсчета индекса фрагментации ДНК-хроматина сперматозоида.

4. Сконструировать лабораторные модели лазерных излучателей и разработать режимы облучения спермы, применяемые при ее сексировании.

5. Установить морфофункциональные показатели и оплодотворяющую способность спермы после воздействия на нее лазерного излучения.

6. Усовершенствовать методы выявления и идентификации возбудителей инфекционных болезней животных в импортируемой в РФ спермопродукции.

7. Разработать молекулярно-генетические методы идентификации мутаций, ассоциированных с наиболее распространенными наследственными патологиями крупного рогатого скота.

8. Разработать алгоритм оценки качества импортируемой спермы по мор-

фофункциональным, микробиологическим, генетическим и репродуктивным параметрам.

Научная новизна.

Разработан алгоритм комплексной оценки морфофункциональных и микробиологических показателей половых клеток быков-производителей

Модифицирован метод идентификации сперматозоидов с использованием красителя Farelli при клинических исследованиях биоматериала, позволяющий объективно количественно оценивать морфологические особенности спермиев на целостность их акросомы. Установлено, что поступающая в РФ из-за рубежа сперма, разделенная по полу, содержит патологические формы половых клеток (фрагментация ДНК в головке, отклонение от биомеханической оси движения, митохондриальная дисфункция), около 10% спермодоз из зарубежных стран несут аномальные гены, снижающие уровень оплодотворяемости коров, жизнеспособность молодняка. Это приводит к эмбриональной смертности и абортам, а выделенные из 40% исследованных спермодоз микроорганизмы P.aueroginosa, E.coli, Mycoplama spp., Mycoplama bovigenetalium, Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Ureaplasma diversum, Aspergillus niger, Aspergillus flavus могут представлять потенциальную биологическую опасность для животноводства РФ.

Предложен экспресс-тест по определению структуры ДНК-хроматина для анализа маркеров апоптоза половых клеток крупного рогатого скота и определены пороговые значения показателя его фрагментации как маркера фертильности самцов - производителей.

Научно обосновано и экспериментально подтверждено повреждающее действие лазерного облучения на сперматозоиды быков-производителей при получении сексированного семени и представлен детальный биофизический скрининг исследуемых образцов спермопроб, раскрывающий патоморфизм половых клеток после воздействия лазерных лучей с учетом их длины волны и мощности. Представлены данные по фотосенсибилизирующему эффекту лазерному, флю-рохромному и электромагнитному воздействию на половые клетки.

Апробированы методологические подходы к микологической экспертизе

половых клеток животных-производителей, предназначенных для индикации и идентификации грибов.

Разработаны параметры рабочих характеристик современных питательных сред, предназначенных для выявления разных видов грибов с экспериментально установленными условиями инокуляции и культивирования.

Научная новизна работы подтверждена Патентом № 2657609 от 14 июня 2018 г. «Способ определения индекса фрагментации ДНК сперматозоидов у животных-производителей».

Теоретическая и практическая значимость работы.

На основании установленных морфофункциональных и микробиологических показателей гамет быков-производителей разработана концептуальная база о потенциальных рисках распространения инфекционных болезней, генетических аномалий и патологий органов репродуктивной системы крупного рогатого скота.

На основании результатов исследований в Межгосударственный стандарт -ГОСТ 26030-2015 «Средства воспроизводства. Сперма быков замороженная. Технические условия» было внесено 18 поправок, которые нашли отражение в положениях нового ГОСТа 26030-2017 «Средства воспроизводства. Сперма замороженная. Технические условия».

Разработанные молекулярно-генетические методы идентификации мутаций, ассоциированных с наиболее распространенными наследственными патологиями крупного рогатого скота, позволили выявить в сперме быков-производителей, поступающей в РФ из-за рубежа, такие генетические аномалии, как брахиспинальный синдром, комплексный порок позвоночника, недостаток адгезии лейкоцитов, недостаток уридинмонофосфатсинтетазы, цитруллинемии, дефицит фактора свертывания XI, дефицит холестерина.

Биологическая оценка спермопроб как отечественного, так и зарубежного производства выявила случаи ее контаминации патогенными и условно-патогенными микроорганизмами: Pseudomonas aueroginosa, Ureaplasma diversum, Mucoplasma californicum, Mucoplasma bovigenitalium, E. coli, Campilobacter spp.,

Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Aspergillus niger, Aspergillus flavus, Mucor spp.

Показано, что оценка репродуктивных параметров половых клеток позволяет увеличить процент выявляемости спермопродукции низкого качества, завозимую на территорию РФ по морфофункциональным и репродуктивным характеристикам.

Результаты мониторинговых исследований явились базой для формирования комплекса нормативных документов по анализу репродуктивных параметров спермопроб по биологическим, микробиологическим и генетическим показателям, а также для разработки методических указаний и рекомендаций по ве-теринарно-санитарному контролю генетического материала, которые были утвержденные отделом обеспечения единства измерения ФГБУ «ВГНКИ», одобрены на заседании ученого совета ФГБУ «ВГНКИ», на Секции «Зоотехния и ветеринария» отделения сельскохозяйственных наук 28 августа 2017 года.

Для определения качества генетического материала быков-производителей разработаны, прошли успешную метрологическую экспертизу и валидированы экспертной комиссией отдела обеспечения единства измерений ФГБУ «ВГНКИ», а также утверждены на Секции «Зоотехния и ветеринария» отделения сельскохозяйственных наук РАН семь методических рекомендаций и два методических указания.

Результаты проведенных исследований отражены в учебнике «Методология научного исследования» (2017), рекомендованном ФУМО в системе высшего образования по укрепленной группе специальностей и направлений подготовки.

Научные данные, полученные в ходе выполнения работы, используются в учебном процессе в ФГОУ ВО МГАВМиБ - МВА имени К.И. Скрябина, в ФГБОУ РАМЖ, ФГБОУ ВО Казанская ГАВМ.

Методология и методы исследований.

Материалом для количественных и качественных (морфологических, мор-фофункциональных, физико-химических, генетических, микробиологических и

др.) исследований являлась спермопродукция крупного рогатого скота разных пород как отечественного, так и зарубежного происхождения, а также патогенные и условно-патогенные бактерии и грибы, выделенные из спермы племенных быков. В качестве лабораторных методов при исследовании спермопродукции использовали молекулярно-генетический, бактериологический, микологический, физические и химические методы.

Использовали как общепринятые, сертифицированные методы, так и разработанные, и усовершенствованные нами в процессе проведения научных исследований.

Степень достоверности.

Результаты работы были получены при использовании утвержденных в установленном порядке методов и ГОСТов, на сертифицированном оборудовании и определяются достаточным количеством проведенных исследований на большой выборке животных. Все образцы изучаемого генетического материала на всем протяжении проведения научных исследований имели одинаковый объем и концентрацию. Выборка биоматериалов являлась репрезентативной и достоверно отражала основные признаки генеральной совокупности изучаемых объектов.

Микробиологические и генетические исследования спермопродукции были проведены на базе лицензированных и аккредитованных лабораторий ФГБУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов».

Цифровой материал был подвергнут статистической обработке по методике Яковенко А.М. «Биометрические методы анализа качественных и количественных признаков в зоотехнии» (2013).

Соответствие паспортам специальностей.

По специальности 06.02.01 - Диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных диссертационная работа выполнена в следующих областях исследований: вопросы клинической ветеринарии, принципы, методы и технологии обследования, частная синдроматика (репро-

дуктивные расстройства); особенности патоморфологических проявлений, их значение для диагностики; структура и функции клеток и тканей животных, взаимосвязь функциональных и структурных изменений в норме и патологии; морфологические критерии оценки, обеспечивающие производство высококачественных продуктов животного происхождения.

По специальности 06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология диссертационная работа выполнена в следующих областях исследований: морфологические, биологические, физико-химические свойства патогенных бактерий и грибов; генетика, культивирование бактерий и грибов; методы выделения микроорганизмов из патологического материала, средства и методы диагностики инфекционных болезней животных, индикация патогенных микроорганизмов; развитие и совершенствование ветеринарной службы страны, обеспечение, планирование и осуществление ветеринарных мероприятий при инфекционных болезнях животных.

Работа соответствует паспортам специальностей 06.02.01 - диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных и 06.02.02 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Комплексная оценка морфофункциональных и микробиологических показателей половых клеток быков - производителей»

Апробация работы.

Основные результаты проведенных исследований были доложены:

На международных конгрессах:

- 4th EAVLD Congress of the European Association of Veterinary laboratory Diagnosticians (Чехия, Прага, 2016) (Приложение 21, 22, 23).

На международных конференциях:

- международная научно-практическая конференция «Приоритеты ветеринарной науки и инновационный опыт» (Республика Азербайджан, Баку, 2016);

- IV международная научная конференция «Достижения молодых ученых в ветеринарную практику», посвященная 55-летию учреждения аспирантуры для подготовки научных работников в ФГБУ «ВНИИЗЖ» (Владимир, 2016);

- международная научно-практическая конференция «Проблемы и перспективы развития современной репродуктивной технологии, криобиологии и их роль в интенсификации животноводства» (Московская обл., пос. Дубровицы, 2017);

- международная научно-практическая конференция «Перспективы и актуальные проблемы развития высокопродуктивного молочного и мясного скотоводства» (Республика Беларусь, Витебск, 2017);

- международная научно-практическая конференция «Генетический материал - стратегический запас страны. Требования к проведению контроля качества генетического материала» (ОАО «Головной центр по воспроизводству сельскохозяйственных животных», Московская обл., Быково, 2017),

На международных выставках:

- 14-я международная выставка «Молочная и мясная индустрия» (Москва, 2016).

На научно-практических конференциях:

- практическое использование современных научных разработок в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота (Московская обл., Быково, ОАО «ГЦВ», 2011);

- племенные ресурсы ОАО «Московское» по племенной работе и их использование в совершенствовании скота РФ (Московская обл., Ногинск, 2017);

- племенная база животноводства России: стратегия развития, (Московская обл., Быково, 2018).

На совещаниях:

- Всероссийское совещание «Итоги племенной работы за 2016 год и задачи на 2017 год», (Волгоград, 2017).

На семинарах:

- семинар по оценке качества семени, организованный IMV Technologies (Франция, г. Лэгль, 2017);

- требования и процедуры контроля пищевой безопасности в Латинской Америке при экспорте в Эквадор (Эквадор, 2017);

- современное племенное молочное животноводство Московского региона и перспективы его развития» (Московская обл., Ногинск, 2017).

На круглых столах:

- приоритетные направления законодательного обеспечения развития молочного животноводства до 2020 года (Москва, Комитет Государственной Думы по аграрным вопросам, 2016);

- проведение комиссионного эпизоотического обследования племенных хозяйств Приозерского и Лужского районов Ленинградской области, закупающих импортный племенной материал (Санкт-Петербург, 2018).

Публикации.

По результатам диссертации опубликовано 38 научных и учебно-методических работ, в том числе 24 научных статей, из них 14 научных статей опубликованы в журналах, рекомендованных ВАК; 1 патент; 1 ГОСТ, 1 учебник; 2 учебно-методических пособия; 2 методических указания и 7 методических рекомендаций, утвержденных РАН.

Личный вклад автора.

Работа выполнена автором самостоятельно. Автору принадлежат организация и непосредственное осуществление исследований по изучению морфофунк-циональных особенностей, биологической и бактериологической безопасности генетического материала крупного рогатого скота, поступающего в РФ из-за рубежа; разработка алгоритма оценки спермопродукции; усовершенствование комплекса мероприятий по контролю и мониторингу качества импортируемой спермы по морфофункциональным, микробиологическим, генетическим и репродуктивным параметрам; разработка и усовершенствование бактериологических и микологических методов исследования спермопродукции; внесение изменений и дополнений в нормативные документы на сперму крупного рогатого скота; создание новых тест-систем и методов тестирования качества генетического материала, утвержденных РАН и др.

В работе использованы материалы, полученные лично автором, а также в

соавторстве:

- Давыдова Е.Е. - кандидат химических наук, зав. отделом молекулярной биологии отделения биотехнологии испытательного центра ФГБУ ВГНКИ, г. Москва (разработка методики идентификации мутаций, ассоциированных с наиболее распространенными патологиями крупного рогатого скота);

- Яцентюк С.П. - кандидат биологических наук, зав. отделом генодиагностики инфекционных болезней животных ФГБУ ВГНКИ (разработка и усовершенствование методов выявления в сперме фрагментов генома возбудителей инфекционных болезней крупного рогатого скота).

- Новиков В.И. - кандидат биологических наук, доцент кафедры радиобиологии и вирусологии ФГБОУ ВО МГАВМиБ-МВА имени К.И. Скрябина (разработка лабораторных моделей лазерных излучателей и режимов облучения спермы).

- Иолчиев Б.С. - ведущий научный сотрудник лаборатории репродуктивных животных ВИЖ им. Л.К.Эрнста, доктор биол. наук (изучение особенностей морфофункциональных характенристик половых клеток)

Всем соавторам выражаю глубокую благодарность за помощь и поддержку.

Объем и структура диссертации. Материалы диссертации изложены на 379 страницах машинописного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, заключение, сведения о практическом использовании научных результатов, рекомендации по использованию научных результатов, список использованной литературы (495 источника, из которых 333 отечественных и 162 иностранных авторов). Работа содержит 30 таблиц, 82 рисунка, 54 страниц приложений.

Основные положения и результаты, выносимые на защиту.

1. Теоретическое и экспериментальное обоснование эффективности разработанной комплексной оценки морфофункциональных и микробиологических показателей спермы быков-производителей в целях совершенствования её репродуктивных качеств.

2. Лазерное излучение, как фактор негативного воздействия на спермото-

зоиды быков - производителей при их делении по полу.

3. Разработанные и усовершенствованные методы в идентификации аномальных сперматозоидов и мутаций, ассоциированных с наследственными патологиями крупного рогатого скота.

4. Выявление в спермопродукции, поступающей из-за рубежа, возбудителей инфекционных болезней, как критерий оценки ее ветеринарно-санитарного благополучия.

5. Алгоритм комплексной оценки биологических, генетических, репродуктивных качеств половых клеток быков-производителей.

ОСНОВНАЯ ЧАСТЬ

ГЛАВА 1. Аналитический обзор литературы и выбор направления

исследований

1.1. Концепция повышения качества половых клеток крупного рогатого скота в современной России

Новые эпизоотические риски в животноводстве, зависимость от импорта племенных ресурсов, потеря отечественных основных и ведущих научных школ по ряду дисциплин, появление новых видов загрязнителей, новых видов патогенов, завоз экзотических бактериальных и вирусных патогенов с продовольствием из различных регионов мира, резистентность микроорганизмов к антибиотикам и целый ряд других проблем, которые негативно влияют на процесс перехода на качественно новый уровень введения племенного животноводства в нашей стране (Борунова С.М. Сборник международной научно-практичекой конференции «Приоритеты ветеринарной науки и инновационный опыт». Азербайджанская Республика, Баку. 2016).

Активная реализация Приоритетного национального проекта «Развитие в рамках государственной поддержки отечественного животноводства» позволило по ряду показателей достичь уже сегодня мирового уровня, за счет повышения в том числе и генетического потенциала как в молочном, так и в мясном скотоводстве.

Однако, как отмечает директор департамента животноводства и племенного дела Амерханов Х.А. (2018), в нашей стране существенного сдвига в увеличении продукции скотоводства не произошло. В 2017 году в хозяйствах всех категорий производство молока составило 30,72 млн. тонн, что на 0,2 % меньше уровня 2015 года, тогда как в США при численности 9 млн. коров получают около 95 млн. тонн молока.

Основной причиной снижения производства мяса и молока в России является сокращения поголовья коров, низкий генетический потенциал ввозимых пород на территорию нашей страны и непрофессиональный маркетинг местных

пород (Горбунов Г.Д., 2009; Чинаров В.И., 2017).

Шевхужев А.Ф. (2015) считает, что одним из важных сегментов в модернизации и актуализации технологии молочного и мясного животноводства является воспроизводство и организация получения здорового потомства, при том, что существует острая необходимость в откормочных площадках именно бычков-производителей. Существенной проблемой является пполучение телочек, как инструмента воспроизводства стада, медленный процесс замены больных коров на нетелей, что ведет к экономическим потерям и снижает рентабельность отрасли - исключается вариант продажи сверхремонтного молодняка телок и нетелей в другие хозяйства, которые по объективным причинам не способны покрывать выбытие коров основного стада.

По данным академика Дунина И.М. (2015), проблема увеличения продуктивности коров является особенно актуальной. Так, за период 2005-2014 г. возраст коров в отелах и возраст выбытия коров в среднем по стране имел тенденцию к снижению от 3,15 до 2,79 отелов и от 3,94 до 3,48 отелов, соответственно. Это свидетельствует о том, что животные не доживают до возраста 5-6 лактаций, в котором у них могла бы проявиться максимальная продуктивность.

Для решения вышеобозначенных проблем выдвигались разного рода концепции быстрого решения существующих пробелов, в основе которых лежали такие постулаты, как выведение новых высопродуктивных типов на основе местного (районизированного) скота в отечественной зооветеринарной практике и крупномасштабное использование мирового генофонда крупного рогатого скота молочных и мясных пород.

По мнению Дунина И.М. (2013), такие современные приемы повышения ээфективности животноводства, как пересадка эмбрионов, генная инженерия по выведению высокопродуктивных пород, типов и линий, рассматриваются в РФ применительно к отдаленному будущему.

Однако, совершенствование существующих и создание новых высокопродуктивных стад, сохранение популяций местных пород скота, сочетающих в себе высокий генетический потенциал с увеличенным сроком продуктивности,

плодовитости и приспособленности к специфике кормовых и климатических условий, является приоритетным направлением в поисковых исследованиях по формированию путей увеличения производства молочной и мясной продуктивности во всех развитых странах.

Наша страна обладает огромным генофондом животноводства и не случайно ФАО в свое время издало монографию о генетических ресурсах сельскохозяйственных животных СССР, а в ноябре 2009 года на 36-й сессии Конференции ФАО «Евразия-БИО» в отношении стратегии совершенствования сельскохозяйственной и сельской политики представители ООН единогласно поддержали общее согласие о необходимости реформы и укрепления систем фундаментальных исследований во всем мире на основе программы преобразования мировых систем сельскохозяйственных исследований, чтобы повысить их актуальность, действенность и значимость для достижения целей развития данной отрасли (Борунова С.М., Панков Б.Г., 2011; Доклад Группы экспертов высокого уровня по вопросам продовольственной безопасности ФАО, 2012).

Биотехнология и её приемы в воспроизводстве и селекции крупного рогатого скота имеют особое значение во всем мире, а с развитием нано-технологичных приемов в этой отрасли, становятся актуальными вопросы биологической безопасности любой современной страны, поэтому на первый план выходят приоритетные задачи - обеспечение национальной безопасности Российской Федерации (Эрнст Л.К., 2008.; Зиновьева Н.А., 2002.; Глазко В. И., 2001).

Зависимость от импорта продовольствия - завоевания внутреннего рынка иностранными компаниями любой развитой страны Мира, ведет к подрыванию её экономической базы и создаёт несомненную угрозу её безопасности (Коров-кин В.П., 2007; Коровкин В.П., 2008). Обеспечение населения продовольствием и здоровое питание - актуальная задача государственного значения. Без её решения невозможна социальная стабильность общества и здоровье населения. Для дальнейшего перспективного движения необходимо особое внимание уделить повышению качества выпускаемой продукции и, прежде всего, сырья жи-

вотного происхождения (Алтухов А.И., 2008).

За последние годы в стране, в связи с изменением характера отечественного рынка приняты меры по интеграции российской экономики в мировую. При решении этой важной государственной задачи учитываются требования экологического и санитарного контроля, возложенного на Россию странами-участницами ВТО (Ромашкин Р.А., 2005; Сучкова Н. А., 2010; Чинаров В.И., 2013).

Государственная система биологической безопасности представляет собой комплекс организационных и технических мер, направленных на предотвращение ущерба и достижение защищенности личности, общества и государства от потенциальных и реальных биологических угроз.

Одно из ключевых направлений в решении данной проблемы - эффективное проведение практических мероприятий по предотвращению возникновения опасных ситуаций, связанных с экспортом/импортом генетического материала крупного рогатого скота на территорию нашей страны, чтобы минимизировать негативные последствия при проведении искусственного осеменении скота в отечественных сельскохозяйственных организациях (Борунова С.М., Ветеринария, зоотехния и биотехнология. № 11. с. 57-64. 2017).

Это можно достичь путем введения риск-ориентированного подхода управления данным процессом, который включает следующие этапы (Макаров В.В., 2009; Зимнин С.В., 2006):

1. Идентификация факторов риска - выявление источников опасности и их ранжирование.

2. Оценка рисков - процесс определения возникновения негативного события в течении определенного периода (масштаб, последствия, здоровье нации).

3. Управление риском - внедрение современных механизмов регулирования (включать и создавать новые НД, ГОСТы, ОСТы и т.д).

Кардинальное решение проблемы продовольственной безопасности РФ базируется на ускоренном воспроизводстве скота, переходу к нетрадиционным и к

«инновационно - креативным» способам увеличения плодовитости животных. Для этого применяют целый ряд биотехнических методов, разработанных на основе углубленных исследований репродуктивной функции, её регуляции, а также направленных на совершенствование приемов манипуляции с эмбрионами, половыми и соматическими клетками (Зиновьева Н.А., 2014).

Межгосударственная торговля инновационным генетическим материалом должна стать преобладающей и даже исключительной в селекционных программах стран, заботящихся о своей эпизоотологической и эпидемиологической безопасности.

Генетические ресурсы животных представляют ценный и стратегически важный капитал любой страны, так как они связаны с решением проблемы обеспечения населения страны продовольствием, промышленности - сырьем (Дунин И.М., 2000).

На сегодняшний день в клинической зооветеринарной практике существуют два основных параметра, которые являются общепринятыми критериями оценки сперматогенеза - это процент подвижных сперматозоидов с поступательным движением и доминирование морфологически нормальных сперматозоидов (Борунова С.М. Вестник алтайского государственного аграрного университета. 2018).

Безусловно, целый ряд морфологических аномалий сперматозоидов можно определить визуально, причем не только без привлечения компьютерной мор-фометрии, но и вообще без измерений. Это относится, прежде всего к дефектам незрелых и конъюгированных форм сперматозоидов. Вместе с тем существует целый ряд параметров сперматозоидов, позволяющих отнести его к нормальной форме, т.к. эти параметры задаются достаточно в узких пределах и не могут с необходимой точностью быть измерены при помощи окуляра, а тем более линейки (Гончаров Н.П., 2018).

В последние годы интенсивно развиваются биотехнологические методы исследования функциональных свойств сперматозоидов быков-производителей, определяющих их репродуктивный потенциал.

Основное биологическое свойство спермы - оплодотворяющая способность - определяют прямыми (по результатам искусственного осеменения самок) и косвенными методами (лабораторными исследованиями).

Однако, Борунова С.М. (2018) и ряд других авторов считают, что оплодотворяющая способность спермиев обусловлена морфологическими, биохимическими, физическими, биологическими свойствами и санитарными показателями спермы. Следовательно, каждый из методов, взятых в отдельности, не позволяет в полной мере оценить качество спермы и не может в достаточной степени охарактеризовать оплодотворяющую способность. Поэтому для оценки спермы применяют одновременно несколько методов и по результатам исследований составляют спермограмму, которая и служит критерием установления качества спермы. Эти методы должны соответствовать реалиям современного развития биотехнологии в животноводстве.

Современная репродуктология должна уделять особое внимание морфо-функциональным дефектам при изучении спермограмм животных-производителей. Достижения молекулярной биологии, цитологии и генетики дают возможность определить морфологический субстрат почти для каждой функции сперматозоида. В частности, Брагина Е.Е. (2000) установила, что морфология сперматозоидов является показателем их компетентности как в процессе собственно оплодотворения (проникновения сперматозоида в яйцеклетку), так и в процессе эмбриогенеза.

Отсюда вытекает, что спермопатология представляет собой частный случай генеральной концепции клеточной патологии, разработанной Вирховым Р. (1956), который обосновал идею о том, что в основе всех заболеваний лежат патология клетки и особенности структуры и функции клеточных органоидов.

С тех пор отечественными и зарубежными учеными были достигнуты большие успехи в области оценки качества спермы: разработан алгоритм оценки оплодотворяющей способности спермиев быков-производителей, основанных на анализе их морфофункциональных, биохимических, биофизических и ветери-нарно-санитарных показателей; выявлены морфофункциональные дефекты по-

ловых клеток (макроголовка - головка имеет значительный размер по отношению к шейке и жгутику; микроголовка - головка маленькая по сравнению с телом спермия; двойная - из шейки произрастает две головки; возможен вариант, что из одной головки произрастает две шейки; грушевидная - когда головка имеет грушевидную и где-то даже конусообразную форму; патологическая головка - в этом случае строение основания деформировано и головка имеет не овальную, круглую форму, а сморщена и сплюснута; патология шейки - шейка имеет зигзагообразную форму и как следствие, спермий становится малоподвижный и безжизненный); разработан алгоритм оценки оплодотворяющей способности спермиев позволил выявить курабельные причины инфертильности сельскохозяйственных производителей, а также установил у них нарушения в метаболическом статусе, где патогенетическая связь напрямую зависела от репродуктивной функции быка-донора; внесен вклад в решение проблемы спермо-патологии быков-производителей путем разработки ряда методик идентификации дефектов патоспермий.

Однако многие вопросы комплексной оценки качества спермы остаются не изученными.

Поэтому, актуальны м и приоритетным направлением является проведение исследований по выявлению факторов, способствующих реализации генетического потенциала и повышению производственного использования быков-производителей в современном отечественном животноводстве с учетом передовых технологий в области биотехнологии, эпизоотического анализа рисков, морфофункциональных особенностей половых клеток и формированию современного базиса Концепции повышения качества генетического материала крупного рогатого скота в современной России.

1.2. Система международного обмена спермопродукцией

В настоящее время наблюдается активный рост импорта спермы сельскохозяйственных производителей на территорию Российской Федерации. Достаточно долгое время наша страна была закрыта для массового ввоза импортного генетического материала, поэтому с первых дней проведения международного обмена спермой встал вопрос о её санитарном контроле с целью предупреждения завоза в страну возбудителей инфекционных болезней (Борунова С.М. Ветеринария, Зоотехния и Биотехнология. 2016).

Поступление спермопродукции осуществлялось только через контроль со стороны государства и только по обоснованным причинам. В этом случае страна-импортер замораживала сперму в соответствии с требованиями РФ, где учитывались как биологические, так и ветеринарные показатели (Балашов Н.Г., 1980).

Контроль импортной спермы осуществлялся в соответствии с распоряжением МСХ СССР за №115-62 от 30.12.83 (№000014) и соответствовал ГОСТу 26030-83 «Сперма быков замороженная».

При карантинировании спермы контролировалось проведение ветеринарных исследований в стране-импортере по требованию РФ, проверялись качественные и количественные характеристики спермодоз, проводилась ветеринар-но-санитарная экспертиза (определение патогенности микроорганизмов и коли-титра/индекса), согласно требованиям ГОСТа.

Жесткий контроль позволил предупредить распространение опасных инфекционных заболеваний, передающихся половым путем при искусственном осеменении животных и в полном объеме осуществлять ветеринарно-санитарный контроль спермопродукции, ввозимой на территорию нашей страны.

Ветеринарный контроль всей ввозимой спермы и эмбринов осуществлялся только через лабораторию по контролю за искусственным осеменением ФГБУ «ВГНКИ», образованную Министерством сельского хозяйства СССР в 1973 го-

ду.

Из данных исторических аналитических справок, приводимых экспертами Россельхознадзора, была установлена целесообразность проведения международного обмена спермой высокоценных быков между странами - членами СЭВ (VI заседание ПК СЭВ по экономическому и научно - техническому сотрудничеству в области сельского хозяйства, 1959).

Впервые сперма была импортирована в СССР в 1963 году из Народной Республики Болгарии. До 1968 года в СССР сперма поступала только из стран -членов СЭВ в порядке широкого эксперимента. С 1969 года сперма стала поступать из капиталистических стран. Импорт спермы из года в год увеличивался. В СССР поступала сперма из 17 стран: Австралии, Болгарии, Венгрии, Голландии, Индии, Италии, Канады, Кубы, Новой Зеландии, Польши, ГДР, Румынии, США, Франции, ФРГ, Швейцарии и Финляндии (Балашов Н.Г., 1971).

Многочисленными исследованиями и практическими наблюдениями было установлено, что со спермой при искусственном осеменении передаются многие возбудители инфекционных болезней (бруцеллеза, лептоспироза, туберкулеза, паратуберкулеза, кампилобактериоза, трихомоноза, хламидиоза и т.д. (Баталин Ю.Е., 2001; Джулина С.И., 2001; Кувшинова З.Я., 1980; Кувшинова З.Я., 1982; Кузин А.И., 2002; Мухамеддинина, А.Р., 2003; Незнаев И.Н., 1995; Нежданова А.Г., 2003).

Для предупреждения заноса со спермой возбудителей инфекционных болезней на территорию РФ на XIV заседании ПРГ по ветеринарии стран - членов СЭВ (г. Зелин, ГДР, 24 - 27/1Х 1970) были приняты «Единые методы микробиологического исследования и ветеринарно-санитарной оценки спермы (производителей сельскохозяйственных животных), предназначенной для взаимных поставок».

По данным Кудряшова М.Д. (1981), на XVII заседании ПРГ по ветеринарии стран - членов СЭВ (Стара - Загора, Народной Республики Болгарии, 7 -12^,1973 года) были приняты единые методы микробиологических исследований и оценки экспортной спермы на присутствие возбудителей инфекционных

болезней - лептоспироза, бруцеллеза, туберкулеза, листериоза и других болезней). На XXXXIV заседании ПК по с/х СЭВ (Гавана, 1976) были приняты «Вете-ринарно-санитарные правила, осуществляемые странами - членами СЭВ при экспорте - импорте пищевых продуктов и сырья животного происхождения, которые могут быть носителями возбудителей инфекционных и паразитарных болезней животных».

Сперма, предназначенная для экспорта/импорта, была определена ФАО ООН, как продукция животного происхождения, которая может быть носителем возбудителей инфекционных и паразитарных болезней. Одновременно были определены санитарные нормы для спермы.

С учетом принятых санитарных требований и методов контроля, в СССР утверждено «Положение о порядке ввоза, хранения, контроля и использования спермы быков - производителей поступившей в СССР по импорту» (утверждено МСХ СССР, № 115 - 62, 30.1283).

ГОСТ 26030-83 на замороженную сперму быков, по которому до 2016 года работали все племенные предприятия страны, подразумевал, что изначально к работе допускаются быки-производители, прошедшие все необходимые ветеринарные исследования, согласно Инструкции по организации и технологии работы станций по искусственному осеменению сельскохозяйственных животных, утвержденные в 1981 году. Но на сегодняшний день вся спермопродукция, поступающая к нам из-за рубежа, заморожена согласно требованиям, которые приняты в стране изготовителе, без учета отечественных ветеринарно-санитарных требований, предъявляемых к спермопродукции (Борунова С.М., 2016).

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Борунова Сеидфатима Мировна, 2019 год

Библиография

[1] Единив ветвринарныв (автвринарнп-евнитарныя) требования предъявляемые к товарам, подлежащим ветеринарному контролю (надзору!. Утьершоенные эеюением Ксмиссии "аСложенного союза от 1(1 июня 2UID года Mi 31 г [Z\ Йетеоинарно-свнптарный Кодекс МЭЬ Паэил: 1907

Поправка к ГОСТ 26030-2015 Средства воспроизводства

Сперма быков замороженная. Технические условия

В каком месте Напечатано Должно быть

Пункт 4.3. Таблица 1. Графа «Характеристика и

норма». Показатель светло-желтая светло-желтая*

«Внешний вид, консистенция, цвет»

Показатель «Число сперматозоидов с прямолинейно-поступательным движением в дозе, млн, не менее»

Общее число Общее число

Пункт 4.4. Таблица 2. непатогенных ненатогенных

Графа «Наименование микроорганизмов в дозе, микроорганизмов в дозе,

показателя» шт., не более КОЕ, не более

Коли-титр, см3, не более Коли - титр

Раздел 7, пункт 7.10

Определение патогенных и условно-патогетпшх бактерий, вирусов, грибов - по ГОСТ ISO 8607 и ГОСТ 32198, микоплазмы - методом полимеразной цепной реакции (11ЦР) с использованием соответствующих тест-систем по документам, действующим на территории государства, принявшего стандарт.

Определение патогенных и условпо-патогенных микроорганизмов — по ГОСТ ISO 8607 и ГОСТ 32198.

Библиография. Позиция Ветервнарно-санитарный m Кодекс МЭБ. Париж,

1997

(ИУС № 8 2017 г.)

Приложение 1.

Сертификат для быков производителей с внесенными изменениями (форма)

PRATT RUS. updated by RJ oil 17.-12-09: ПРОЕКТ ДОКУМЕНТА RUS. рймд Ef 17-12-Ю ORIGINAL / ОРИГИНАЛ I COVY!КОПИЯ I Total number of copies issued / Количество выданных копт I

1. Shipment description / Описание поставки 1.7. Certificate №/ Сертнфикат №

î.i. груз. Name and address of consignor / Название и адрес оотпраеителя: *П *■ * EU ★ ***** Veterinary certificate for bovine semen exported from the EU to the Russian Federation Ветеринарный сертификат на сперму быков-производителей, экспортируемую из Европейского Союза в Российскую Федерацию

_

1.2. груз Чате and address of consignee / Название и адрес ополучателя:

1.3. Total number of doses of the semen in the consignment I Количество доз спермы в партии груза:

1.4. Number of packages/ Число мест: 1.8. Country of origin / Страна происхождения продукции:

1.5. Identification marks on transport container/ Маркировка пломбы на транспортном контейнере 1.9. Competent authority in the EU IКомпетентное ведомство EC:

1.6. Means of transport / Транспорт: (the number of the flight-number, name of the ship, the number of the railway carriage, truck / A& рейса самолета, название судна, номер вагона, автомашины.) 1.10. Organisation in the EU issuing this certificate / Учреждение EC, выдавшее сертификат

1.11. Country (s) of transit / Страна (ы) транзита:

1.12. Pomt of crossing the border of the Russian Federation / Пункт пересечения границы Российской Федерации:

2, 2.1. 2.2. Origin of the semen / Происхождение спермы: Administrative-territorial unit I Административно-территориалънаяединица:

Name and address of the semen collection centre approved by the Competent Veterinary Service in the EU / Название и адрес центра взятия спермы, утвержденного компетентной ветеринарной службой ЕС

3. Information concerning donor-bulls / Инс юрмацпя о быках-донорах:

N 0 № Name / Кличка Ear tag number / Номер ушной бирки Date of birth / Дата рождения Breed / Порода Date of semen collection / Дата взятия спермы Semen straws / Пробирки со спермой /

Batch №/ Маркировка Number of doses/ Количество доз

1.

2.

3.

4.

5.

The inventory is made, if more than semen from 5 animals is shipped, it is signed by the State/official veterinarian of exporting country and constitutes an integral part of this certificate / При перевозке спермы от более чем 5 животных, составляется опись, которая подписывается государственным/официальным ветеринарным врачом страны-экспортера и является неотъемлемой частью настоящего сертификата.

4. Health information / Информация о состоянии здоровья

I. the undersigned State/official veterinarian certify that: !Я, нижеподписавшийся государственный/официальный ветеринарный врач, удостоверяю следующее:

4.1. Semen from donor-bulls is received in semen collection centre(s) that are under permanent control of the State veterinary service of exporting-country./ Сперма быков-доноров получена в центрах взятия спермы, находящихся под постоянным контролем государственной ветеринарной службы страны-экспортера.

4.2. Donor-bulls, from which the semen was collected, were kept on the above mentioned semen collection centre(s) not less than 30 days before semen collection and are not used for natural mating. / Быки-доноры, от которых получена сперма, находились в центре/центрах взятия спермы не менее 30 дней до сбора спермы и не использовались для естественного осеменения.

4.3. Быки доноры должны быть свободны от всех известных на момент ввоза спермы генетических аномалий и гаплотипов, отрицательно влияющих на фертильность, или вызывающих метаболические нарушения v потомства. Носительство неносительство должно быть подтверждено результатами исследования в генетической лаборатории.

4.4. Semen originates from semen collection centre(s) and/or administrative territory which are officially free from following contagious diseases:/ Сперма происходит из центра взятия спермы и/или административной территории, официально свободных от следующих заразных болезней:

- foot-and-mouth disease, vesicular stomatitis, rinderpest, contagious bovine pleuropneumonia, peste des petits ruminants - during the last 12 months on the territory of the EU Member State / ящура, везикулярного стоматита, чумы крупного рогатого скота, контагиозной плевропневмонии, чумы мелких жвачных - в течение последних 12 месяцев на территории страны-члена ЕС;

- brucellosis, leucosis, tuberculosis - during the last 3 years in the semen collection center / бруцеллеза, лейкоза, туберкулеза - в течение последних 3

лет в центре взятия спермы:

- infectious bovine rhmotracheitis, trichomoniasis, campylobacteriosis (Campylobacter fetus venerahs) - during the last 12 months in the semen collection center / инфекционного ринотрахеита, трихомоноза, камгтлобактериоза (Campylobacter fetus venerahs) - в течение последних 12 месяцев в центре взятия спермы.',

- lbluetongue — during the last 12 months in the premises and'or administrative territory where cattle was not vaccinated against bluetongue. or during not fewer than last 3 months in the premises where cattle was vaccinated against all bluetongue serotypes present or likely to be present in an epidemio logically relevant geographical area of origin / инфекционной катаральной лихорадки овец(блутанга)- в течение последних 12 месяцев

в хозяйстве и/или на административной территории, в которых скот не подвергался вакцинации против инфекционной катаральной лихорадки овец(блутанга)- или в течение не менее, чем 3 последних месяцев в хозяйствах, в которых скот подвергался вакцинации против всех серологических типов вируса катаральной лихорадки овец (блутанга) присутствующих или подозреваемых в соответствующем эпидемиологическом районе происхождения ',

- anthrax and blackleg — during the last 20 days in the semen collection center / сибирской язвы и эмфизематозного карбункула - в течение последних 20 дней в центре взятия спермы.

- bovine viral diarrhea, — during the last 12 months in the premises and/or administrative territory / Вирусной диареи крупного рогатого скота - в течении последних 12 месяцев в хозяйстве и/или административной территории.

- leptospirosis - during the last 3 months in the premises and/or administrative territory / лептоспироза - в течении последних 12 месяцев в хозяйстве и/или административной территории.

4.5. The semen presented for examination was derived from donor-bulls which were not vaccinated against brucellosis./ представленная для анализа сперма была получена от быков-производителей, которые не вакцинированы против бруцеллеза.

1

4.6. [a) Bluetongue was never registered ш the semen collection centre(s) and regular laboratory testing showed no seropositive results and no PC'] l-positive

animals were detected, or / Блютанг никогда не регистрировался в центре (ах) сбора спермы и регулярные лабораторные анализы не показывали сероположительных результатов и положительно реагирующих животных при ПЦР исследовании обнаружено не было, или]

2

~ [b) the donor bulls / Быки-доноры:

1) were subjected to a serological test according to the Terrestrial Manual to detect antibody to the В TV group, with negative results, at least every 60 days throughout the collection period and between 21 and 60 days after the final collection for this consignment; and/or / подвергались проверке на серологическую реакцию в соответствии с правилами Санитарного Кодекса наземных животных МЭБ для обнаружения антител на группу вирусов инфекционной катаральной лихорадки овец (блютанга) с отрицательным результатом по меньшей мере каждые 60 дней в течение периода взятия спермы и между 21 и 60 днями после последнего взятия спермы для этой партии; и ¡или

2) were subjected to an agent identification test according to the Terrestrial Manual on blood samples collected at commencement and conclusion of. and at least every 7 days (virus isolation test) or at least every 28 days (PCR test) during, semen collection for this consignment, with negative test results / подвергались проверке на определение агента в соответствии с правилами Санитарного Кодекса наземных животных МЭБ на основе образцов крови, которые брались в начале и в конце, по меньшей мере каждые 7 дней (тест на изоляцию вируса), или, по меньшей мере каждые 28 дней (ПЦР - исследование) во время взятия семени для этой партии, с отрицательным результатом;]

4.7. Быки-доноры не должны быть вакцинированы против ИРТ и ВД.

4.S. Donor-bulls, from which the semen was collected, were not fed with feeds of animal origin containing proteins processed from ruminant animals, excluding milk proteins ! Быки-доноры, от которых получена сперма, не получали корма животного происхождения, при изготовлении которых использовались белки жвачных животных, за исключением белков молока.

4.9. The donor bulls were not kept together with small ruminants at the semen collection centre, f Быки-доноры не содержались совместно с мелким рогатым скотом в центре взятия спермы.

4.10 Российская сторона оставляет за собой право выборочной проверки поставляемой спермы на генетические и инфекционные аномалии.

4.11 The donor-bulls showed negative results to tuberculin tests carried out annually. / Быки-доноры показали отрицательные результаты при ежегодных исследованиях на туберкулёз.

4.12 Быки-доноры показали отрицательные результаты при ежегодных исследованиях на микоплазмоз с тппированпем до вида.

4.13. The donors bulls are at least tested once a year examined with negative diagnostic findings in a state approved laboratory by diagnosis test which accords with the methods approved by the exporting country (specify the method and date of testing) for the following diseases: ! Быки-доноры исследовались no меньшей мере раз в год с негативным результатом в утвержденной государственной лаборатории методами, принятыми в стране- экспортере (указать метод и дату исследования.) на наличие следующих заболеваний:

- paramberculosis/паратуберкулёз_

- brucellosis /бруцеллез_

- leucosis Í лейкоз __

- trichomoniasis ! трихомоноз__

- campylobacteryosis (Campylobacterfetus ven era I is) - Í кампилобактериоз (Campylobacterfetus veneralis)_

- (33bluetongue testing by PCR and ELISA (to indicate the date of investigation)/ исследование на блютанг методами ПЦР и ELISA (указать дату-

Приложение 2.

Сертификат соответствия с внесенными изменениями (форма) СИСТЕМА СЕРТИФИКАЦИИ ГОСТ Р ГОССТАНДАРТ РОССИИ СЕРТИФИКАТ СООТВЕТСТВИЯ №

Дата

Дата

РОСС 1Ш.0001.11ФВ01 Орган по сертификации продукции (Федеральное государственное бюджетное учреждение «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» - ФГБУ «ВГНКИ»)

123022, Москва, Звенигородское шоссе, д. 5, телефон [phone]

Сперма быка-производителя по кличке замороженная

По спецификации фирмы , государство

Партия N2 - N доз дата, по контракту № от

, регистрационный №

9 8 8 5 1 1

ГОСТ 26030-83 «Сперма быков замороженная»;

Правила по ветеринарно-санитарному контролю качества замороженной спермы быков-производителей

№ сертификата (импортного)

0511100000

«Наименование и адрес изготовителя» (не продавца)

Название (продавца) адрес реквизиты

Протокола испытаний на соответствии ГОСТ 26030-15. №дата

Протокола испытаний на соответствие ветеринарному сертификату на импортируемую сперму

Выпускается расфасованной в по мл, хранится и транспортируется в жидком азоте в сосуде Дьюара. Продукция подлежит маркированию знаком соответствия по Положению о знаке системы сертификации ГОСТ Р от 04.11.2000 г. N2 76. Схема сертификации №7.Срок реализации партии по дата.

-.МИНИСТЕРСТВО сельского ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ЗОЛОТАЯ ОСЕНЬ

f о'сси inc. к д ч

. Г РО ПР0 МЫ -Д1Л С." IIA«

в ы с t«. в к

GOLDEN AUTUMN

A CPfwULT VHAL c x и i в ir KÖN

•i V: Ш ■ iP

I

gags Ф

■ ' Sät

■Ш

m

награждается золотой медалью Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии- МВА имени К.И. Скрябина»

За подготовку и издание учебника «Методология научного исследования))

10-13

октября 201Ö

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Д.Н.ПАТРУШЕВ

Москва ВДНХ

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ

УЧРЕЖДЕНИЕ «ВСЕРОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЦЕНТР КАЧЕСТВА И СТАНДАРТИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ И КОРМОВ» ФГБУ «ВГНКИ»

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ КУЛЬТУРАЛЬНОЕ МИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕРМЫ

«УТВЕРЖДАЮ»

Зам.руководителя Секции

«Зоотехния и ветеринария»

Отделения сельскохозяйственных наук РАН

2017 г.

Москва 2017

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ВЕТЕРИНАРНОМУ И ФИТОСАНИТАРНОМУ НАДЗОРУ (РОССЕЛЬХОЗНАДЗОР) ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«ВСЕРОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЦЕНТР КАЧЕСТВА И СТАНДАРТИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ И КОРМОВ» (ФГБУ «ВГНКИ»)

УТВЕРЖДАЮ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Встеринарно-санитарный контроль качества замороженной спермы быков-производителей. Методы исследований физических, биологических свойств и морфофункциональный анализ качества криоконсеви-

рованной спермы

Москва 2018

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ВЕТЕРИНАРНОМУ И ФНТОСАНИТАРНОМУ НАДЗОРУ (РОССЕЛЬХОЗНАДЮР) ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«ВСЕРОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЦЕНТР КАЧЕСТВА И СТАНДАРТИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ И КОРМОВ» (ФГБУ «ВГНКИ»)

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

Ветеринарно-еаннтарный контроль качества замороженной спермы

быков-производителей. Методы исследований физических, биологических свойств и морфофункциональный анализ качества криоконсевированной спермы, разделенной но полу

Москва 2018

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ВЕТЕРИНАРНОМУ И ФИТОСАНИТАРНОМУ НАДЗОРУ (РОССЕЛЬХОЗНАДЗОР) ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«ВСЕРОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЦЕНТР КАЧЕСТВА И СТАНДАРТИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ И КОРМОВ» (ФГБУ «ВГНКИ»)

УТВЕРЖДАЮ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Методы исследований физических, биологических свойств и морфо-функциональный анализ качества криоконсевированной спермы быков — производителей

Москва 2017

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов»

(ФГБУ «ВГНКИ»)

УТВЕРЖДАЮ Начальник отдела обеспечение сданстка измерений "А.М.Зайцев

/¿Г » 2017

г.

ЭКСПЕРТНОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ № МЭ 1/0024 по результатам метрологической экспертизы

«Методы исследований физических, биологических свойств и морфофункциональный анализ качества крио консервированной спермы быков-производителей» Номер и наименование технической документации

Разработан проект методических рекомендаций сотрудниками федерального государственного бюджетного учреждения «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» ("ФГБУ «ВГНКИ»),

Проведена на основании заявки от 07.09.2017 г № МЭ 1/0024.

На метрологическую экспертизу представлены документы: Проект методических рекомендаций «Методы исследований физических, биологических свойств и морфофункциональный анализ качества криок о не с р вир о в а н н о й спермы быков-производителей».

В результате метрологической экспертизы установлено следующее: проект методических рекомендаций соответствует требованиям ГОСТ Р 8.563-2009 «ГСОЕИ. Методики (методы измерений)», ГОСТ 8.417-2002 «ГСИ. Единицы величин»; РМГ 292013 «ГСИ. Метрология. Основные термины и определения»; ПМГ 92-2009 «Метрологическая экспертиза проектов межгосударственных и национальных стандартов»; ПМГ 126-2013 «ГСИ. Порядок аттестации методик выполнения измерений и их применения в сферах законодательной метрологии государств-участников содружества независимых государств», ГОСТ 1.5-2001 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Общие требования к построению, изложению, оформлению, содержанию и обозначению», ГОСТ ИСО 5725-(1-6)-2003 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

Старший специалист отдела обеспечения единства измерений

А.С. Коршунова

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ВЕТЕРИНАРНОМУ И ФИТОС АНИТ АРНОМУ НАДЗОРУ (РОССЕЛЬХОЗНАДЗОР) ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«ВСЕРОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЦЕНТР КАЧЕСТВА И СТАНДАРТИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ И КОРМОВ» (ФГБУ «ВГНКИ»)

Биологический мониторинг качества спермы, разделенной по полу быков - производителей. Методы исследований физических, биологических свойств и морфофункциональный анализ сексированного семени

Методические рекомендации разработаны отделом по контролю качества и стандартизации генетического материала и препаратов, применяемых при воспроизводстве животных ФГБУ «ВГНКИ» (Борунова С.М., зав. отделом, кандидат биологических наук, Бадмаев О.Э. мл. научный сотрудник) и ФБГУ «ВИЖ им, Л.К. Эрнста» (Иолчиев Б.С., доктор биологических наук) и распространяются на образцы, поступающие в ФГБУ «ВГНКИ».

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Москва 2017

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)

«Биологический мониторинг качества спермы, разделенной по полу быков-производителей. Методы исследований физических, биологических свойств и _морфофункциональный анализ секснрованного семени»

Разработан проект методических рекомендаций разработанный сотрудниками федерального государственного бюджетного учреждения «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» Г ФГБУ «ВГНКИ»),

Проведена на основании заявки от 07.09.2017 г № МЭ 1/0025.

На метрологическую экспертизу представлены документы: Проект методических рекомендаций «Биологический мониторинг качества спермы, разделенной по полу быков-производителей. Методы исследований физических. биологических свойств и морфофункциональный анализ секснрованного семени».

В результате метрологической экспертизы установлено следующее: проект методических рекомендаций соответствует требованиям ГОСТ Р 8.563-2009 «ГСОЕИ. Методики (методы измерений)», ГОСТ 8.417-2002 «ГСИ. Единицы величин»; РМГ 29-2013 «ГСИ. Метрология. Основные термины и определения»; ПМГ 92-2009 «Метрологическая экспертиза проектов межгосударственных и национальных стандартов»; ПМГ 126-2013 «ГСИ. Порядок аттестации методик выполнения измерений и их применения в сферах законодательной метрологии государств-участников содружества независимых государств», ГОСТ 1.5-2001 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Общие требования к построению, изложению, оформлению, содержанию и обозначению»; ГОСТ ИСО 5725-(1-6)-2003 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

УТВЕРЖДАЮ Начальник отдела

( ^ и

_» 2017 г.

ЭКСПЕРТНОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ № МЭ 1/0025 по результатам метрологической экспертизы

Номер и наименование технической документации

Старший специалист отдела обеспечения единства измерений

А.С. Коршунова

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ВСЕРОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЦЕНТР КАЧЕСТВА И СТАНДАРТИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ И КОРМОВ» ФГБУ«ВГНКИ»

«УТВЕРЖДАЮ»

Зам. руководителя Секции «Зоотехния и ветеринария» отдел^Й^е!^й®№озяйственнь1Х наук РАН

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Определение целостности акросомы сперматозоидов в замороженной сперме у животных-производителей

Москва 2017

Методические рекомендации разработаны отделом по контролю качества и стандартизации генетического материала и препаратов, применяемых при воспроизводстве животных ФГБУ «ВГНКИ» (Борунова СМ., кандидат биологических наук, Бадмаев О.Э., Тумилович Я.И., Рибченко A.C.) и ФБГУ «ВИЖ им. Л.К. Эрнста» (Иолчиев B.C., доктор биологических наук, Таджиева A.B. кандидат с-х. наук).

1. Сущность метода, термины и определения

Сущность метода заключается в подсчете под микроскопом количества сперматозоидов с интактной или поврежденной акросомой. Целостность акросомы определяют с помощью дифференцированного окрашивания специальными красителями.

Акросома - органоид сперматозоида, расположенный на вершине его головки. Обычно имеет копьевидную или чашевидную форму. Образуется в процессе спермиогенеза из элементов комплекса Гольджи. При оплодотворении в момент соприкосновения сперматозоида с яйцом содержащиеся в акросоме ферменты высвобождаются и растворяют лицевые оболочки, обеспечивая проникновение сперматозоида в яйцо; мембрана акросомы образует трубчатые выпячивания, которые проникают через растворённый участок оболочек в кортикальный слой ооплазмы, осуществляя активацию яйца. Интактная акросома - неповрежденная акросома Поврежденная акросома - повреждение целостности акросомы

2. Область применения и ограничения метода

Настоящие методические рекомендации распространяются на исследование замороженно-оттаянной спермы у животных-производителей и устанавливает методы определения целостности акросомы сперматозоидов.

Метод с применением набора красителей Диахим-Дифф-Квик используется для in vitro диагностики.

3. Оборудование, материалы и реактивы

- микроскоп биологический с окуляром 15х и объективом 20х, 40ч;

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)

УТВЕРЖДАЮ

Начальник отдела обеспечения единства измерений ФГБУ «В!

_А.М. Зайцев «03» февраля 2017г,

ЭКСПЕРТНОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Регистрационный № МЭ 1/0021

на проект методических рекомендаций «Определение целостности акросомы спермотозоидов в замороженной сперме у животных-производителей»

На рассмотрение представлены методические рекомендации, разработанные сотрудниками отдела по контролю качества и стандартизации генетического материала и препаратов, применяемых при воспроизводстве животных ФГБУ «ВГНКИ» и сотрудниками «ВИЖ им, Л.К. Эрнста».

Метрологическая экспертиза проекта методических рекомендаций проводилась в соответствии с ГОСТ 8.010-2013 «ГСИ. Методики выполнения измерений. Основные положения», ГОСТ 8.417-2002 «ГСИ. Единицы величин»; РМГ 29-2013 «ГСИ. Метрология. Основные термины и определения»; ПМГ 92-2009 «Метрологическая экспертиза проектов межгосударственных и национальных стандартов»; ПМГ 126-2013 «ГСИ. Порядок аттестации методик выполнения измерений и их применения в сферах законодательной метрологии государств-участников содружества независимых государств», ГОСТ Р 1.5-2012 «Стандартизация в Российской Федерации. Стандарты национальные. Правила построения, изложения, оформления и обозначения»; ГОСТ ИСО 5725-(1-6)-2003 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

В результате метрологической экспертизы установлено следующее:

Текст методических рекомендаций доработать с учетом замечаний.

По тексту методических рекомендаций предлагается внести следующие изменения и дополнения:

1. «Оглавление» заменить на «Содержание» согласно ГОСТ Р 1.5.

2. На стр.3 убрать «сотрудниками...», оставить в виде «Методические рекомендации разработаны отделом по контролю качества и стандартизации генетического материала и препаратов, применяемых при воспроизводстве животных ФГБУ «ВГНКИ», и «ВИЖ им. Л.К. Эрнста».

3. В п. 3 ГОСТ 24104 и ГОСТ 302 утратили силу в РФ, необходимо заменить действующими документами.

4. После п. 3 должны идти пункты 5 «Условия безопасного проведения работ», п. 6 «Требования к квалификации операторов», п. 7 «Условия выполнения измерений».

5. В п. 4 исправить «спремопробы» на «спермопробы», убрать «необходимо», оставить в виде «Достать соломинку из сосуда...... Упоминаются корнцанг, водяная баня, термостат, ножницы», пробирки, стерильные салфетки, которых нет в п. 3, надо указать.

6. В п. 5.1 упоминается «смесь для обезжиривания предметных стекол» ее нет в п.З, также «стеклянный мостик», надо указать.

7. Последний абзац п. 5.1, надо расписать фиксацию мазка.

8. В п. 5.2 расписать приготовление красителей. Все необходимое оборудование, расходные материалы и реактивы, упоминаемые в тексте, должны быть указаны в п. 3.

9. В п. 6.1 указать, чем нагревают образец спермы, чем добавляют 1,5 мкл смеси красителей и 50 мкл разбавленной и нагретой спермы. Чем разбавляют сперму? Какая смесь красителей? Ее приготовление надо расписать.

10. В п. 6.2 «Инкубировать...» образец спермы? На чем?

«После инкубирования нанести каплю...» каплю чего? Образца спермы?

Краситель Р1 не указан в п. 3, указать.

Эксперт

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«ВСЕРОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЦЕНТР КАЧЕСТВА И СТАНДАРТИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ

И КОРМОВ» (ФГБУ «ВГНКИ»)

Определение индекса фрагментации ДНК в замороженной сперме у

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

животных-производителей

Москва 2017

Методические рекомендации разработаны отделом по контролю качества и стандартизации генетического материала и препаратов, применяемых при воспроизводстве животных ФГБУ «ВГНКИ» (Боруиова С.М., кандидат биологических наук, Бадмаев О.Э., Тумилович ЯЛ, Рибченко A.C.) и ФБГУ «ВИЖ им. Л.К. Эрнста» (Иолчиев Б.С., доктор биологических наук, Таджиева A.B. кандидат с-х. наук).

Данный метод является технологически-современным анализом маркеров апоптоза и играет важную роль в регуляции фертильности, которую нужно учитывать при естественном осеменении, так и при искусственном осеменении сельскохозяйственных животных.

Фрагментация ДНК в сперматозоидах характеризуется двух цепочечными и одноцепочечпыми разрывами молекулы ДНК. Это связано с дефицитом содержания в хромосомах специальных транспортных белков -протаминов, защищающих ДНК от внешних повреждений. Фрагментация ДНК сперматозоидов оказывает влияние не только на фертильность, но и па ранние этапы эмбрионального развития плода, особенно на формирования бластоцисты в предимплаптационный период эмбрионального развития (т.с до прикрепления зародыша к стенке матки).

1. Термины, определения и сокращения

ДНК - дезоксирибонуклеиповая кислота

РНК - рибонуклеиновая кислота

SCSA - анализ структуры хроматина в сперматозоиде

Фрагментация ДНК - разрыв молекулы ДНК

Проточная цитометрия - метод исследования дисперсных сред в режиме поштучного анализа элементов дисперсной фазы по сигналам светорассеяния и флуоресценции

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)

УТВЕРЖДАЮ

Начальник отдела обеспечения единства измерений ФГБУ «ВГНКИ»

« 03 » февраля 2017 г.

ЭКСПЕРТНОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ Регистрационный № МЭ 1/0020 на проект методических рекомендаций «Определение индекса фрагментации ДНК в замороженной сперме у животных-производителей»

На рассмотрение представлены методические рекомендации разработанные отделом по контролю качества и стандартизации генетического материала и препаратов, применяемых при воспроизводстве животных ФГБУ «ВГНКИ» и «ВИЖ им. Л.К. Эрнста».

Метрологическая экспертиза проекта методических рекомендаций проводилась в соответствии с ГОСТ 8.010-2013 «ГСИ. Методики выполнения измерений. Основные положения», ГОСТ 8.417-2002 «ГСИ. Единицы величин»; РМГ 29-2013 «ГСИ. Метрология. Основные термины и определения»; ПМГ 92-2009 «Метрологическая экспертиза проектов межгосударственных и национальных стандартов»; ПМГ 126-2013 «ГСИ. Порядок аттестации методик выполнения измерений и их применения в сферах законодательной метрологии государств-участников содружества независимых государств», ГОСТ Р 1.5-2012 «Стандартизация в Российской Федерации. Стандарты национальные. Правила построения, изложения, оформления и обозначения»; ГОСТ ИСО 5725-(1-б)-2003 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

В результате метрологической экспертизы установлено следующее: Текст методических рекомендаций доработать с учетом замечаний. По тексту методических рекомендаций предлагается внести следующие изменения и дополнения:

1. «Оглавление» заменить на «Содержание» согласно ГОСТ Р 1.5, в данном разделе пропущен п. 4 «Необходимое оборудование, расходные материалы и реактивы», далее изменить нумерацию пунктов так, как в тексте.

2. На стр.З убрать «сотрудниками»..., оставить в виде «Методические рекомендации разработаны отделом по контролю качества и стандартизации генетического материала и препаратов, применяемых при воспроизводстве животных ФГБУ «ВГНКИ», и «ВИЖ им. Л.К. Эрнста».

3. П. 2 должно быть «Метод основан на определении индекса фрагментации ДНК в сперматозоидах ...»,

4. В п. 4 ГОСТ 24104 и ГОСТ 302 утратили силу в РФ, необходимо заменить действующими документами.

5. После п. 4 должны идти пункты 5 «Условия безопасного проведения работ», п. 6 «Требования к квалификации операторов», п. 7 «Условия выполнения измерений».

6. В п. 5Л упоминаются корнцанг, водяная баня, термостат, ножницы, пробирки, стерильные салфетки, которых нет в п. 4, надо указать. Убрать «необходимо», предложение сформировать в виде «Достать соломинку......»

7. В п. 5.2 упоминается «смесь для обезжиривания предметных стекол» ее нет в п.4, также «стеклянный мостик», надо указать.

8. Последний абзац п. 5.2, надо расписать, например:

«Фиксацию мазка производят спиртовым раствором уксусной кислоты.

Приготовление спиртового раствора уксусной кислоты

В мерной колбе вместимостью ... разводят 1 часть уксусной кислоты ледяной и 3 части 96% этилового спирта. Хранят раствор? в течение 1 часа в холодильной камере при постоянной температуре (5+ ) 5С».

Расписать, как проводят фиксацию мазка.

Мерных колб, холодильной камеры нет в п. 4, надо указать.

9. В п. 6.1 расписать приготовление красителей, например:

«Приготовление раствора лимонной кислоты

В мерную колбу вместимостью 1000 см3 вносят навеску 21,01 г лимонной кислоты доводят раствор до метки дистиллированной водой.».

Необходимое оборудование, расходные материалы и реактивы, упоминаемые в тексте, должны быть указаны в п. 4.

В приготовлении красителя, необходимо указать чем добавляют 40 см3 раствора лимонной кислоты и 2,5 см3 раствора гидрофосфата натрия и 10 см3 1% акридина оранжевого. Описать приготовление 1 % акридина оранжевого. Все оборудование должно быть в п. 4.

Указать сроки хранения растворов лимонной кислоты и гидрофосфата натрия.

Эксперт

А.М. Зайцев

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ВСЕРОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЦЕНТР КАЧЕСТВА И СТАНДАРТИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ И КОРМОВ» ФГБУ«ВГНКИ»

«УТВЕРЖДАЮ»

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ Идентификация мутаций, ассоциированных с наиболее распространенными наследственными патологиями крупного рогатого скота бурой швицкои породы, молекулярно-генетическими методами

Москва 2017

Предисловие

Данные Методические рекомендации разработаны Федеральным государственным бюджетным учреждением «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ») Разработчики:

Давыдова Е.Е. к.х.н., заведующая отделом молекулярной биологии, Борунова С.М. к.б.н., заведующая отделом по контролю качества и стандартизации генетического материала и препаратов, применяемых при воспроизводстве животных;

сотрудники отдела молекулярной биологии: Солтынская И.В.; Богомазова А.Н. к.б.н., Крылова Е.В., к.б.н.; Прасолова О.В.; Минайлова A.C.; Ветошникова Б.Ю.; Плескачева М.А.; Головко О.О., Корниенко Е.С.

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ВЕТЕРИНАРНОМУ И ФИТОСАНИТАРНОМУ НАДЗОРУ (РОССЕЛЬХОЗНАДЗОР) ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«ВСЕРОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЦЕНТР КАЧЕСТВА И СТАНДАРТИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ И КОРМОВ» (ФГБУ «ВГНКИ»)

Исследование заморожено-оттаянной спермы быков производителей. Методика определения прямолинейной поступательной подвижности сперматозоидов в молочной среде

Методические рекомендации разработаны отделом по контролю качества и стандартизации генетического материала и препаратов, применяемых при воспроизводстве животных ФГБУ «ВГНКИ» (Борунова С.М., зав. отделом, кандидат биологических наук, Бадмаев О.Э. мл. научный сотрудник) и ФБГУ «ВИЖ им. Л.К. Эрнста» (Иолчиев Б.С., доктор биологических наук), ОАО «Головной центр по воспроизводству сельскохозяйственных животных» (Комбарова Н.А. кандидат биологических наук) и распространяются на образцы, поступающие в ФГБУ «ВГНКИ».

УТВЕРЖДАЮ

МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Москва 2017

Федеральное государственное бюджетное учреждение «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)

УТВЕРЖДАЮ Начальник отдела обеспечения единства измерений

А.М.Зайцев

/3 » 17 г.

ЭКСПЕРТНОЕ ЗАКЛЮЧЕНИЕ № МЭ 1/0026 по результатам метрологической экспертизы

«Исследование заморожено-оттаянной спермы быков производителей. Методика определения прямолинейной поступательной подвижности сперматозоидов в мо___лочпой среде»_

Номер и наименование технической документации

Разработан проект методических рекомендаций сотрудниками федерального государственного бюджетного учреждения «Всероссийский государственный Центр качества и станларгичяпии лекарственшге средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»). " --

Проведена на основании заявки от 07.09.2017 г№ МЭ 1/0026.

На метрологическую экспертизу представлены документы: Проект методических рекомендаций «Исследование заморожено-оттаянной спермы быков производителей. Методика определения прямолинейной поступательной подвижности сперматозоидов в молочной среде».

В результате метрологической экспертизы установлено следующее: проект методических рекомендаций соответствует ' требованиям

ГОСТ Р 8.563-2009 «ГСОЕИ. Методики (методы измерений)», ГОСТ 8 417-2002 «ГСП. Единицы величин»; РМГ 29-2013 «ГСП. Метрология. Основные термины и определения»; ПМГ 92-2009 «Метрологическая экспертиза проектов межгосударственных и национальных стандартов»; ПМГ 126-2013 «ГСП Порядок аттестации методик выполнения измерений и их применения в сферах законодательной метрологии государств-участников содружества независимых государств», ГОСТ 1.52001 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Общие требования к построению, изложению, оформлению, содержанию и обозначению»; ГОСТ ИСО 5725-(1-6)-2003 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

Старший специалист отдела обеспечения единства измерений

А.С. Коршунова

ФЕДЕРАЛЬНАЯ СЛУЖБА ПО ВЕТЕРИНАРНОМУ И ФЙТОСАНИТАРНОМУ НАДЗОРУ (РОССЕЛЬХОЗНАДЗОР) ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ

«ВСЕРОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЦЕНТР КАЧЕСТВА И СТА1ЩАРТИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ И КОРМОВ» (ФГБУ «ВГНКИ»)

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ Ветеринарно-санитарный контроль качества замороженной спермы быков-производителей. Методы микробиологического анализа замороженно-оттаянной спермы быков-производителей

Москва 2018

российская академия наук

федеральное государственное бюджетное

учреждение

«всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (фгбу «вгнки»)

методические рекомендации

«Методика определения прямолинейной поступательной подвижности сперматозоидов в сперме быков производителей, криоконсервированной в молочной среде»

Москва 2017

GÄ£>

Ф>

s

W

-A

14-17 OCTOBER 2018

'/ce ft.SINESî ANC cot^ire^ce CEMK r JÎÎÏLS

CERTIFICATE OF ATTENDANCE

We hereby confirm that

Seidfatima Borunova

attended the 5*1 Congress of the European Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians held in Brussels, Belgium, 14-17 October 2018.

Elena Maria Bozzeta

EAVLD President

Certificate of Attendance

This is to certify that

Borunova Seidfatima

attended the

22nd Annual ESDAR Conference 2018 27-29 September 2018 in Cordoba/Spain

Prof. Or. Manuef Hidalgo

Chair of the Loca? Organizing Ccnnmittee

I

Министерство сельского хозяйства Российской Федерации

федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение дополнительного профессионального образования

«РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕНЕДЖМЕНТА В ЖИВОТНОВОДСТВЕ»

142143, Московская область, городской округ Подольск, посёлок Быково, улица Академическая, дом 9. ИНН 5074004425 КПП 507401001 ОГРН1035011450165

об использовании научных исследований

Результаты научных исследований Боруновой Сеидфатимы Мировны «Комплексная оценка морфофункциональных и микробиологических показателей половых клеток быков-производителей» используются профессорско-преподавательским составом кафедры воспроизводства, искусственного осеменения и трансплантации эмбрионов сельскохозяйственных животных нашего учреждения в учебном процессе при повышении квалификации и профессиональной переподготовке специалистов животноводства.

(ФГБОУ РАМЖ)

СПРАВКА

Тел./факс: [phone] Тел./факс: [phone] [e-mail]; www.ramj.ru

-¿.¿^¿(Р''^' А.П. Пыжов

УТВЕРЖДАЮ

СПРАВКА О ВНЕДРЕНИИ

Результаты научных исследований Боруновой Сеидфатимы Мировны «Комплексная оценка морфофункциональных и микробиологических показателей половых клеток быков-производителей» раздельно и в сочетании используется в учебном процессе (при чтении лекций и проведении практических занятий) на кафедре микробиологии ФГБОУ ВО Казанская государственная академия ветеринарной медицины им. Н.Э. Баумана.

Материалы рассмотрены на заседании кафедры ( протокол № 5 от 23.04.2019).

Зав. кафедрой

хирургии, акушерства и патологии мелких животных,

д. вет. наук, профессор

А.К. Галиуллин