Клеточные и молекулярные механизмы разрушения суставного хряща при остеоартрозе тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.03.04, доктор биологических наук Четина, Елена Васильевна

• Четина, Елена Васильевна
• доктор биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации доктор биологических наук Четина, Елена Васильевна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. РОСТКОВАЯ ПЛАСТИНКА: КЛЕТОЧНАЯ ФИЗИОЛОГИЯ, ФОРМИРОВАНИЕ ХРЯЩА И МИНЕРАЛИЗАЦИЯ

1.1 .Структура и организация ростковой пластинки.

1.2. Особенности хондроцитов ростковой пластинки на клеточном уровне.

1.3.Зональная экспрессия генов и соответствующих им белков в ростковой пластинке.

1 АРегуляция дифференцировки хондроцитов в ростковой пластинке.

Глава 2. СУСТАВНОЙ ХРЯЩ И ЕГО ОРГАНИЗАЦИЯ

2.1.Строение и зональная структура хряща.

2.2. Функциональная характеристика здорового хряща.

Глава 3. ВОЗРАСТНЫЕ И ПАТОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ХРЯЩА

3.1. Изменения суставного хряща при старении.

3.2. Патологические изменения хряща при остеоартрозе (ОА).

3.3. Специфика молекулярных изменений в суставном хряще в зависимости от степени тяжести ОА.

3.4. Ингибирование разрушения хряща при ОА ростовыми факторами.

3.5. Роль медиаторов воспаления при остеоартрозе.

Глава 4. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

4.1. Структура и объем выборки.

4.2. Подготовка фетальных тканей теленка.

4.3. Подготовка суставного хряща, имеющего фокальные повреждения.

4.4. Подготовка суставного хряща больных остеоартрозом.

4.5. Подготовка суставного хряща взрослого быка.

4.6. Культивирование хрящевых эксплантатов.

4.7. Культивирование суставных хондроцитов в виде осадочных культур.

4.8. Фракционирование и культивирование фетальных хондроцитов.

4.9. Определение активности расщепление коллагена II типа коллагеназой с использованием фермент-зависимого иммуносорбентного метода.

4.10. Определение коллагеназной активности.

4.11. Определение минерализации матрикса, используя включение кальция (45Са2+).

4.12. Биосинтез коллагена и общий оборот белка.

4.13. Определение содержания общего количества коллагена 2 типа или степени его денатурации.

4.14. Определение содержания и свободных протеогликанов.

4.15. Определение содержания общего кальция и фосфата.

4.16. Количественное определение секреции простагландина Е2.

4.17. Очистка коллагена 2 типа и синтез его производных пептидов.

4.18. Электрофорез и иммуноблоттинг.

4.19. Иммуногистохимические методы.

4.20. Выделение общей РНК.

4.21. Обратная транскрипция.

4.22. Полимеразная цепная реакция (ПЦР).

4.23. Количественный анализ экспрессии генов посредством ПЦР в режиме реального времени.

4.24. Статистический анализ.

Глава 5. КООРДИНАЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ И БЕЖОВ В

ХОНДРОЦИТАХ ПРОЛИФЕРАТИВНОЙ И ГИПЕРТРОФНОЙ ЗОН РОСТКОВОЙ ПЛАСТИНКИ

5.1. Молекулярно-биологические исследования ростковой пластинки быка.

5.2. Исследования экспрессии генов; связанных с дифференцировкой хондроцитов и соответствующих им белков в культурах фетальных хондроцитов быка.

Глава 6. ПРИЗНАКИ ДИФФЕРЕНЦИРОВКИ/ГИПЕРТРОФИИ

СУСТАВНЫХ ХОНДРОЦИТОВ ПРИ ФОРМИРОВАНИИ РАННИХ

ПОВРЕЖДЕНИЙ ХРЯЩА У ПОЖИЛЫХ ЛЮДЕЙ.

Глава 7. СПОСОБНОСТЬ ФРАГМЕНТА КОЛЛАГЕНА 2 ТИПА ИНДУЦИРОВАТЬ РАСЩЕПЛЕНИЕ КОЛЛАГЕНА И ГИПЕРТРОФИЮ СУСТАВНЫХ ХОНДРОЦИТОВ В ЗДОРОВОМ ХРЯЩЕ БЫКА И ЧЕЛОВЕКА

7.1. Индуция расщепления коллагена 2 типа под действием пептида СВ12-2.

7.2.Индуция экспрессии коллагеназ ММР-13 и ММР-1 действием пептида СВ12-2.

7.3. Денатурация коллагена 2 типа и экспозиция пептида СВ12-2 во внеклеточном матриксе суставного хряща больного OA.

7.4. Активация металлопротеиназ матрикса и процесса дифференцировки хондроцитов в здоровом хряще быка при индукции повышенного расщепления коллагена.

7.5.Индукция повышенного расщепления коллагена посредством коллагеназы под действием пептида СВ12-2 сопровождается активацией металлопротеиназ матрикса и дифференцировкой хондроцитов в здоровом хряще человека.

Глава 8. РОЛЬ РОСТОВЫХ ФАКТОРОВ В ПОДАВЛЕНИИ РАЗРУШЕНИЯ КОЛЛАГЕНА И ГИПЕРТРОФИИ ХОНДРОЦИТОВ ПРИ ОСТЕОАРТРОЗЕ

8.1.Ингибирование коллагеназной активности ростовыми факторами.

8.2.Влияние ростовых факторов на освобождение протеогликанов.

8.3.Изменения экспрессии генов в эксплантатах хряща больных ОА под действием ростовых факторов.

8.4.Увеличение образования PGE2 под действием TGFß2.

8.5. Ингибирование усиленного расщепления коллагена под действием пептида СВ12-2 и подавление экспрессии генов, сопряженных с гипертрофией хондроцитов смесью ростовых факторов.

Глава 9. СПОСОБНОСТЬ МАЛЫХ ДОЗ ПРОСТАГЛАНДИНА Е

ПОДАВЛЯТЬ РАЗРУШЕНИЕ КОЛЛАГЕНА В ЭКСПЛАНТАТАХ

СУСТАВНОГО ХРЯЩА БОЛЬНЫХ ОА

9.1.Ингибирование коллагеназной активности в эксплантатах суставных хрящей больных ОА посредством PGE2.

9.2,Освобождение протеогликанов в эксплантатах хряща, культивируемых в присутствии PGE2.

9.3.Изменения экспрессии генов в эксплантатах хрящей больных ОА в присутствии PGE2.

9.4.Способность ингибитора циклооксигеназы влиянию TGFß2 на расщепление коллагена.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Клеточные и молекулярные механизмы разрушения суставного хряща при остеоартрозе»

Актуальность проблемы

Остеоартроз (ОА) - это наиболее распространенное заболевание лиц пожилого возраста. Основным проявлением этого заболевания является эрозия суставного.хряща, ктороая развивается вследствие повреждения и резорбции внеклеточного матрикса (ВКМ), окружающего хондроциты. ВКМ преимущественно состоит из коллагена второго типа и протеогликана аггрекана [325]. В разрушении ВКМ принимают участие коллагеназы, в частности, коллагеназа 3 (ММР-13) и металлопротеиназы матрикса (ММР). Разрушение хряща при ОА сопровождается воспалительным процессом и характеризуется повышением экспрессии цитокинов, таких как интерлейкины (1Ь)-1 а /(3 и фактор некроза опухолей (ТМ^а, которые, как предполагается, активируют металлопротеиназы [347]. В настоящее время считается, что разрушение хряща при ОА инициируется повышенной активностью цитокинов [311].

Вместе с тем при ОА в хряще также активируются анаболические процессы, которые могут быть причиной фенотипических изменений хондроцитов. В частности, такие фенотипические изменения могут включать элементы терминальной дифференцировки хондроцитов, характеризующейся повышением экспрессии коллагена 10 типа, признаки ранних фаз дифференцировки хондроцитов, о чем свидетельствует появление в матриксе коллагена 2А типа и де-дифференцировки клеток хрящевой ткани, что сопровождается экспрессией коллагенов 1 и 3 типов [38].

Следует отметить, что изменения в клетках суставного хряща при ОА, в частности, очаги пролиферации хондроцитов с образованием клонов отдельных клеток, а также экспрессия генов коллагена 10 типа, аннексинов, щелочной фосфатазы и белка, родственного паратироидному гормону (РТНгР), кальцификация матрикса и гибель клеток посредством апоптоза, включая ускоренное расщепление коллагена 2 типа посредством ММР-13, также наблюдаются в гипертрофных хондроцитах ростковой пластинки при эмбриональном развитии [383].

В настоящее время не существует эффективных лекарственных препаратов, способных восстановить хрящевую ткань. Лечение заболевания проводится противовоспалительными и болеутоляющими средствами, которые могут вызвать осложнения [325].

В связи с этим существует настоятельная необходимость поиска других подходов к лечению ОА, основанных на понимании клеточных и молекулярных механизмов этого заболевания.

Гипотеза: Поскольку в онтогенезе происходит резорбция хряща при замене его костью, мы предположили, что разрушение коллагенового матрикса при остеоартрозе может регулироваться механизмами, сходными с теми, которые ответственны за терминальную дифференцировку хондроцитов и резорбцию внеклеточного матрикса при развитии скелета.

Цель настоящей работы: Исследовать роль клеточных и молекулярных механизмов в разрушении коллагенового матрикса суставного хряща при остеоартрозе.

Задачи исследования:

1. Определить маркерные гены, ответственные за процессы пролиферации и гипертрофии хондроцитов ростковой пластинки.

2. Сопоставить уровень активности расщепления коллагена 2 типа и характер экспрессии генов, отвечающих за дифференцировку хондроцитов, при развитии ранних фокальных повреждений хряща, подобных наблюдаемым при ОА у лиц пожилого возраста.

3. Изучить особенности экспрессии генов при дифференцировке хондроцитов здорового зрелого суставного хряща, при стимуляции расщепления коллагена.

4. Разработать способы подавления разрушение хряща путем подавления расщепления коллагена 2 типа агентами, используя факторы, замедляющие процессы перехода хондроцитов к гипертрофии.

Научная новизна

Обосновано новое понимание механизма развития остеоартроза, дополняющее общепринятое представление о разрушении хряща при развитии заболевания вследствие повышенной активности коллагеназ, индуцированных цитокинами.

Разрушение хряща при OA происходит в результате изменений метаболизма суставных хондроцитов, сходных с теми, что наблюдаются при гипертрофии хондроцитов ростковой пластинки при морфогенезе и сопровождаются разрушением ВКМ. Наряду с процессом пролиферации, ранее описанным как клонирование хондроцитов в хряще больных OA, они переходят в состояние сходное с состоянием фетальных хондроцитов из зоны гипертрофии, а именно экспрессируют коллаген 10 типа, ростовые факторы TGF|31 и Indian hedgehog (Ihh), и металлопротеиназы, включая коллагеназы. Именно коллагеназы, индуцированные гипертрофными изменениями суставных хондроцитов, разрушают коллаген внеклеточного матрикса, что приводит к деградации хрящевой ткани. На начальном этапе этот процесс может проходить при отсутствии воспаления.

1. В связи с этим впервые показано, что в относительно здоровых хрящах пожилых людей образование ранних OA-подобных повреждений связано с усилением расщепления коллагена, что сопровождается повышением экспрессии генов гипертрофной фазы дифференцировки хондроцитов ростковой пластинки.

2. Впервые показано, что в случае искусственной стимуляции расщепления коллагена 2 типа в здоровом хряще также происходит усиление экспрессии генов и синтеза белков, свойственных гипертрофной фазе дифференцировки хондроцитов.

3. Впервые показано, что в культурах эксплантатов хрящей больных ОА на поздней стадии заболевания можно подавить расщепление коллагена 2 типа с одновременным ингибированием экспрессии генов, ответственных за гипертрофию фетальных хондроцитов, а.также индукторов воспаления - цитокинов, в присутствии ТОБр2 или при низких концентрациях простагландина Е2 (РОЕ2).

4. Впервые установлено, что в зрелых хондроцитах суставного хряща при ОА процессы расщепления коллагена 2 типа и экспрессия гипертрофного фенотипа взаимообуславливают друг друга и механизм деградации ВКМ в суставном хряще при ОА идентичен процессу разрушения внеклеточного матрикса хондроцитов ростковой пластинки при морфогенезе.

Научно-практическая значимость работы Поскольку в основе повреждения коллагена 2 типа, а следовательно, разрушения хрящевой ткани при ОА лежат механизмы, сходные с теми, что наблюдаются при гипертрофии хондроцитов в морфогенезе, регуляция гипертрофии может быть одним из перспективных направлений в терапии разрушения суставного хряща при ОА.

В частности повышение уровня ТОБр2 и поддержание низких уровней РвЕ2 в суставной сумке будет способствовать подавлению расщепления коллагена и разрушению хрящевой ткани при ОА.

Предложенная в данной работе новая интерпретация механизма возникновения ОА позволит определить новые фармакологические мишени для лечения заболевания или предотвращения его развития на самой ранней стадии.

Положения, выносимые на защиту:

1. Хондроциты суставного хряща способны возобновить процесс дифференцировки, сходный с таковым у фетальных хондроцитов ростковой пластинки, и этот процесс лежит в основе резорбции хряща, при, остеоартрозе.

2. Дифференцировку хондроцитов суставного хряща можно инициировать in vitro агентами^ стимулирующими первичное расщепление коллагена коллагеназой.

3. Дифференцировка хондроцитов лежит в основе разрушения хряща при возрастных изменениях, сходных с остеоартрозными, причем начинается она до макроскопических изменений хряща, регистрируемых гистологически, и проявляется в повышении экспрессии генов, которые активны в зонах пролиферации и гипертрофии ростковой пластинки.

4. Разрушение матрикса суставного хряща больных остеоартрозом можно остановить действием ростовых факторов, которые способны блокировать дифференцировку хондроцитов ростковой пластинки. Это сопровождается ингибированием маркерных генов дифференцировки хондроцитов и подавлением активности расщепления коллагена коллагеназой.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены на ТТТТТТТТТ Российской научно-практической конференции «Терапевтические проблемы пожилого человека» (Санкт-Петербург, 2010); X Конгрессе Международной ассоциации морфологов (Ярославль, 2010); VIII конгрессе Российского Артроскопического Общества (Москва, 2009); на Российском конгрессе ASAMI (Курган, 2009); на Всемирном конгрессе общества по исследованю кости и минерала (American Society for Bone and Mineral Research) (Сиэтл, 2004; Сан Антонио, 2002); Всемирном конгрессе Американского общества ревматологов (American College of Rheumatology) (Новый Орлеан, 2002; Сан Франциско, 2001; Филадельфия, 2000); Всемирном конгрессе общества ортопедов (Orthopaedic Research Society) (Сан-Франциско, 2001; Даллас, 2002); Всемирном конгрессе по остеоартрозу (OARSI) (Берлин, 2003); Конференции Канадской лиги по исследованию артрита (Canadian Arthritis Network) (Монреаль, 2003); Канадской конференции по соединительной ткани (Canadian Connective Tissue Conference) (Монреаль, 2003; 1999; Шербрук, 2002; Торонто, 2001; Квебек, 2000; Лондон, 1998).

Первичная экспертиза диссертации проведена на заседании Ученого совета Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательского института ревматологии РАМН 16 марта 2010 г.

Публикации

По теме диссертации опубликована 47 печатных работ: 19 журнальных статей (из них 12 статей в зарубежных журналах) и 28 тезисов (в том числе 23 - на зарубежных симпозиумах).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 234 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей описание материалов и методов исследования, основных результатов исследования ростковой пластинки, здорового суставного хряща быка и человека и поврежденного суставного хряща больных остеоартрозом, заключения, выводов и списка литературы. Работа иллюстрирована 55 рисунками и 5 таблицами. Библиография включает 465 публикации, в том числе 27 отечественных и 43 8,зарубежных авторов.

Заключение диссертации по теме «Клеточная биология, цитология, гистология», Четина, Елена Васильевна

выводы

1. При воздействии неблагоприятных факторов хондроциты суставного-хряща способны возобновить процесс дифференцировки, сходный с таковым у фетальных хондроцитов ростковой пластинки, одним из аспектов которой является резорбция хрящевого матрикса. При этом именно эти процессы. постэмбриональной дифференцировки суставных хондроцитов' лежат в основе начальных процессов разрушения, суставного хряща при остеоартрозе.

2. В ходе дифференцировки хондроцитов в ростковой пластинке наблюдается экспрессия разных групп генов: в верхней пролиферативной зоне усиливается экспрессия маркера пролиферации циклина В2, ростовых факторов, таких как трансформирующего ростового фактора бета 2 (TGFP2), белка, родственного паратироидному гормону (РТНгР), ростового фактора фибробластов 2 (FGF-2), а также протеиназ внеклеточного матрикса ММР-13,-3, МТ1-ММР, катепсина К и их тканевых ингибиторов TIMP-1, -2, -3; структурных компонентов матрикса коллагенов 2 и б типов, аггрекана, гиалуронана (о последнем судили по уровню экспрессии гиалуронан синтазы 2 (HAS-2), декорина, фибромодулина, каспазы 3 и специфического транскрипционного фактора (Sox 9) коллагена 2 типа.

3. В нижней пролиферативной зоне возрастает уровень экспрессии специфического транскрипционного фактора остеобластов Cbfal, а также Sox 9, желатиназы ММР-9, тканевых ингибиторов металлопрот'еиназ - TIMP-1 и -2, структурных компонентов матрикса коллагена 2 и б типов и фибромодулина.

4. В гипертрофной зоне экспрессируются маркер гипертрофии -коллаген 10 типа (COLlOAl), каспаза 3 и ростовые факторы TGF01 и Ihh, которые не экспрессировались в пролиферативной зоне, а также происходит повышение экспрессии большинства ранее перечисленных генов протеиназ, • их тканевых ингибиторов и структурных компонентов матрикса, за исключением РТНгР; РОР-2, коллагена 6 типа и декорина, наивысший уровень экспрессии которых наблюдался в верхней пролиферативной зоне ростковой пластинки.

5. Предикторами развития ОА-подобных изменений являются экспрессия факторов роста, связанных с зоной пролиферации хондроцитов ростковой пластинки, а именно РТНгР, РСБ-2, ТОБрШ, а также макромолекул матрикса СОЬ2А1 и аггрекана как на соседних с повреждениями участках, так и на значительном расстоянии от центра повреждения.

6. При ОА-подобных повреждениях хряща, происходит повышение активности расщепления коллагена 2 типа, сопровождающееся повышением экспрессии коллагеназ ММР-1, -14 (МТ1-ММР), аггреканазы АОАМТ8-5; цитокинов интерлейкинов-1 (1Ь-1) а /|3 и фактора некроза опухолей а (Т№а); а также увеличением экспрессии генов, связанных с гипертрофией хондроцитов СОЫОА1, ММР-13, ММР-9, ШЬ и каспазы 3 в непосредственной близости от повреждений. Каспаза 3 и АХ)АМТ8-5 экспрессируются исключительно в центре повреждения хрящевой ткани.

7. Усиление расщепления коллагена в локусах образования ранних повреждений хряща сопровождается не только усилением экспрессии генов, ответственных за разрушение матрикса, но и генов, связанных с конечной дифференцировкой хондроцитов в ростковой пластинке. Поэтому дифференцировка хондроцитов является ранним событием, связанным с повреждением хряща, которое происходит при ОА.

8. На неповрежденных участках хряща не наблюдается ни усиленного расщепления* коллагена, ни избыточной экспрессии генов; связанных с различными фазами, дифференцировки хондроцитов ростковой пластинки.

9. Совместным воздействием ростовых факторов; а именно ТОБр2, РОР-2 и инсулином, активность разрушения коллагена значительно ингибируется в эксплантатах суставного хряща больных ОА. ТОБр2 наиболее эффективно предотвращает разрушение хряща: В суставных хондроцитах хрящей больных ОА подавление избыточного расщепления' коллагена этими ростовыми факторами как в комбинации, так и исключительно ТОБр2 сопровождается уменьшением экспрессии генов, связанных с гипертрофией хондроцитов, а также увеличением экспрессии простагландин Е синтазы (РОЕ8-1) и освобождением в среду простагландина Е2 (ТСЕ2).

10. РвЕ2 при низкой концентрации также способен значительно подавлять расщепление коллагена, уменьшая при этом экспрессию ММР-13, ММР-1, цитокинов и маркера гипертрофии хондроцитов СОЫОА1. Тот факт, что напроксен, неспецифический ингибитор циклооксигеназы (СОХ) -1 и -2, способен противодействовать влиянию ТОБр2 в подавлении расщепления коллагена, свидетельствует о том, что РОЕ2'опосредует действие этого ростового фактора. РвЕ2 в концентрации значительно меньшей, чем при воспалительном процессе, обладает хондропротективными свойствами, селективно подавляя расщепление коллагена и функционально связанную с ним гипертрофию суставных хондроцитов в хряще больных ОА.

11. Дифференцировка хондроцитов предшествует разрушению коллагена в нормальном хряще при воздействии агентов, способных стимулировать коллагеназную активность. Одним из таких агентов является обнаруженный нами пептид коллагена 2 типа - СВ12-2. Пептид коллагена 2 типа - СВ12-2. Пептид СВ12-2 присутствует в значительных концентрациях в хряще больных ОА и обладает способностью увеличивать активность расщепления коллагена 2 типа коллагеназой.

12. В здоровом суставном хряще расщеплению коллагена в присутствии СВ12-2 предшествует увеличение пролиферативной активности хондроцитов,с последующей экспрессией генов терминальной дифференцировки хондроцитов и увеличением числа апоптозных клеток. Подавление экспрессии гипертрофного фенотипа суставных хондроцитов ростовыми факторами в сочетании с СВ12-2 предотвращает избыточное расщепление коллагена и ингибирует экспрессию протеиназ, цитокинов и белков, сопряженных с гипертрофией хондроцитов.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Здоровье суставного хряща определяется целостностью внеклеточного-матрикса и жизнеспособностью хондроцитов, продуцирующих этот матрикс в результате своей жизнедеятельности. Основу поддержания целостности" суставного хряща составляет ремоделирование ВКМ хондроцитами. С точки зрения молекулярной биологии здоровый хрящ характеризуется очень низким уровнем экспрессии коллагена 2 типа, отсутствием экспрессии коллагенов 1, 3 или 10 типов, относительно высоким кругооборотом аггрекана и очень ограниченной репликацией хондроцитов [34, 36-38, 326, 175, 409]. Он также характеризуется ограниченной экспрессией TGFßl и полным отсутствием экспрессии TGFß2, FGF-2, инсулинового ростового фактора (IGF)-l и Ihh, а также очень малой скоростью апоптоза хондроцитов [350, 82, 246, 227]. В целом взрослый суставной хрящ обычно классифицируется как пост-митотическая ткань с незначительной активностью обменных процессов [35]. Более того; усиление митотической активности клеток в хряще больных ОА [339, 257, 36] может быть более разрушительным, чем созидательным для ткани, поскольку образующиеся кластеры не способствуют анаболическим процессам в матриксе [34] и не компенсируют потерю клеток на других участках хряща.

С возрастом и/или при дегенеративных заболеваниях хряща, таких как остеоартроз, нарушается целостность ВКМ вследствие нарушения функционирования хондроцитов, продуцирующих матрикс. Существуют две основные теории патогенеза ОА. Наиболее ранней является теория патогенеза первичного ОА в результате кумулятивного эффекта длительного механического изнашивания хряща с аккумулированием циклов нагрузки [40]. Эта гипотеза предусматривает непрерывную микротравматизацию хряща в процессе физиологической нагрузки и перегрузках, которые приводят к повторяющемуся повреждению ВКМ и завершаются полным разрушением ткани. В этом случае любая терапия в значительной степени бесполезна.

Другая теория рассматривает разрушение хряща при развитии ОА, как результат прогрессирования возрастных повреждений хрящевого матрикса в результате механической нагрузки, а также ферментативной активности разрушающих ферментов (коллагеназ, аггреканаз итд.). При этом механизм разрушения хряща при ОА заключается в нарушении баланса анаболических и катаболических процессов с преобладанием последних. Поэтому, если поврежденные молекулы не замещаются вновь синтезированными, создается угроза нарушения функциональной целостности ВКМ. В суставном хряще это прежде всего относится к коллагену и протеогликану, а также другим молекулам матрикса - фибронектину, декорину, бигликану и т. д., хотя изменения их кругооборота мало изучены. В этом случае восстановление хряща возможно при условии восстановления его активных репаративных функций.

При повреждении хряща активируются протеиназы матрикса вследствие усиленной продукции цитокинов, таких как 1Ь-1р и Т№а, а также нарушается баланс соотношения уровней протеаза/ингибитор, которые приводят к усилению активности металлопротеиназ (ММР) [116]. В связи с этим, как было изложено ранее, для лечения ОА используются противовоспалительные препараты или препараты, основой действия которых является подавление ферментов, вызывающих деструкцию хряща, в частности коллагеназ и других ММР, а также провоспалительных цитокинов.

Однако, учитывая сложную систему регуляции всех внутриклеточных процессов, представляется маловероятным, что нарушение лишь одного звена, а именно усиление активности ММР цитокинами, может привести к полному необратимому разрушению ткани. В связи с этим поиску глубинных причин процесса, лежащего в основе разрушения суставного хряща при ОА было посвящено данное исследование.

Мы предположили, что в основе разрушения суставного хряща при ОА могут лежать те же механизмы деградации ВКМ, которые включаются в гипертрофных хондроцитах ростковой пластинки при эмбриональном и раннем постэмбриональном развитии. Это предположение базируется на факте о том, что при нормальной эндохондральной оссификации гипертрофные хондроциты резорбируют ВКМ посредством активации коллагеназ и других ферментов, расщепляющих компоненты матрикса, а затем погибают в результате клеточного апоптоза, освобождая место для остеобластов, формирующих кость.

Для проверки этого предположения нами были проведены исследования, тестирующие адекватность нашей гипотезы на уровне, как экспрессии генов, так и продукции соответствующих белков и их активности. В частности, мы определили круг генов, экспрессия которых преимущественно связана со взаимоисключающими процессами пролиферации и терминальной дифференцровки (гипертрофии) хондроцитов ростковой пластинки. В дальнейшем мы показали, что усиление экспрессии генов терминальной дифференцировки/гипертрофии хондроцитов ассоциировалась с повышенной активностью расщепления коллагена при фокальных повреждениях хряща при возрастных повреждениях суставного хряща, которая имеет сходство с ранней стадией заболевания ОА. С другой стороны, ингибирование тех же генов терминальной дифференцировки/гипертрофии хондроцитов происходило при подавлении активности расщепления коллагена как посредством ростовых факторов, в том числе как ТОР|32, так и РОЕ2. Наконец, индукция активности расщепления коллагена в здоровом хряще животных и человека также сопровождалась усилением экспрессии генов терминальной дифференцировки/гипертрофии хондроцитов и продукцией соответствующих белков.

В частности, наши исследования уровня экспрессии генов хондроцитами ростковой пластинки выявили 2 группы генов. Эти гены активируются либо при пролиферации, либо при терминальной дифференцировке (гипертрофии) хондроцитов. При этом экспрессия РТНгР и FGF-2 наблюдается только при пролиферации. Напротив, на этапе дифференцировки в гипертрофной зоне экспрессировалась другая группа генов, а именно СОЫОА1, Gbfal, ММР-9, Ihh и TGFpl. Такие гены, как, TGFP2, ММР-13, циклин В2 и Sox-9 имели максимумы экспрессии как в пролиферативной зоне, так и в более мощный в гипертрофной зоне ростковой пластинки.

Хотя здоровый суставной хрящ состоит из одного типа клеток — хондроцитов, эти клетки неоднородны и находятся на разных уровнях дифференцировки, которые выделяют в морфотипы. Их формирование происходит в эмбриогенезе при эндохондральной оссификации: хрящевой рудимент активно замещается костью, а когда необходимо сформировать суставной хрящ из остатков рудимента, процессы в ростковой пластинке резко замедляются. Именно поэтому строение хряща напоминает строение ростковой пластинки. При этом хондроциты фиксируются на определенной фазе дифференцировки. При OA, когда процесс дифференцировки возобновляется, каждый хондроцит продолжает свою программу в зависимости от того, на какой стадии он был остановлен. Поэтому в образцах хряща, содержащего все его зоны, наблюдается экспрессия генов, связанных как с пролиферацией, так и с гипертрофией эмбриональных хондроцитов. Однако на участках повышенной активности коллагеназы и резорбции матрикса преобладает экспрессия генов, ассоциированных с гипертрофной зоной ростковой пластинки.

Поскольку OA развивается преимущественно у пожилых людей и тесно связан со старением организма [35], в деградации хрящевой ткани следует различать процессы, связанные со старением (aging) или дряхлением (senescence). Клеточным дряхлением является состояние митотического ареста, который усиливается активностью опухолевых генов- супрессоров р!6 и р21. Митотический арест в дряхлеющих клетках необратим и поэтому отличается от форм временного ареста роста, характерного для большинства пост-митотических тканей. Дряхление может наступать при достижении предельного числа делений (число Хайфлика) или в результате эрозии теломеры (репликативное дряхление), а также при окислительном повреждении ДНК или других компонентов, клетки (дряхление, индуцированное стрессом) [35]. Фенотипические изменения в дряхлеющих клетках включают низкий митотический индекс, ослабление реакции на ростовые факторы и цитокины, суперпродукцию р16 и р-галактозидазной активности [166, 225, 273]. Остеоартрозные хондроциты, вероятно, обладают фенотипом старения, поскольку частично возможна его реверсия блокированием экспрессии р16 [464].

Кроме того, ОА-подобные повреждения хряща часто наблюдаются в процессе старения организма. Ранние макроскопические фокальные повреждения, которые значительно более выражены, чем изученные нами в данном исследовании, характеризовались усиленным расщеплением коллагена посредством коллагеназ, приводящим к потере коллагена и протеогликанов [374]. Это сопровождалось усилением синтеза и кругооборота матрикса. В данной работе мы также наблюдали градиент гистологического и молекулярного повреждения, который распространялся из центра повреждения,и в дальнейшем мог распространяться на здоровый хрящ. Поэтому мы предположили, что если разрушение хряща является, результатом терминальной дифференцировки хондроцитов, начало этого процесса является очень ранним событием в процессе формирования повреждения.

Ранний ОА характеризуется фокальными повреждениями хряща с потерей матрикса по механизму, который включает усиление протеолиза и синтеза матрикса одновременно [373]. На ранних этапах локальное увеличение активности ММР, которое происходит в результате повышения, экспрессии коллагеназ ММР-13 и ММР-1, а также АХ)АМТ8-5,1Ь-1а/р, но не ТЫРа связано с очень ранними дегенеративными изменениями хряща регистрируемыми гистологически) и с терминальной дифференцировкой хондроцитов, экспрессирующих COLlOAl и каспазу 3. Это означает, что резорбция ВКМ-при участии этих протеиназ и цитокинов является ранним событием в патологии разрушения гиалинового хряща и тесно связана с изменениями фенотипа хондроцитов.

Наше исследование также показало; что гены, которые участвуют в дифференцировке хондроцитов при морфогенезе, экспрессируются в зонах очень ранних фокальных повреждений, выявляемых как зона повышенной активности расщепления коллагена 2 типа (по сравнению с фоновым уровнем) совместно с ранней дегенерацией ткани (степень 3 и выше по Манкину). Детальный анализ локальных повреждений на ранней фазе их формирования, приведенный для трех пациентов, показал, что расщепление коллагена часто связано с зоной повреждения или усиливается вблизи нее и сопровождается экспрессией генов, связанных с дифференцировкой хондроцитов, а именно COLlOAl, TGFpl, Ihh, ММР-9, каспазы 3, РТНгР и FGF-2. В менее поврежденных зонах и вдали от повреждения (более 2 срезов от центра) гены поздней дифференцировки обычно не экспрессируются, включая каспазу 3, тогда как экспрессия TGFp2, РТНгР и циклин В2 обычно наблюдаются. Коллагеназы ММР-1 и МТ1-ММР обычно экспрессировались в связи с повреждением и/или вблизи него, как и ADAMTS-5 - аггреканаза, способная расщеплять аггрекан [98]. Экспрессия ММР-13 наблюдалась в 1/3 повреждений и в 1/3 неповрежденного хряща. Цитокины IL-1|3 и TNFa экспрессировались в зоне повреждения или вблизи него. IL-la в большинстве случаев не экспрессировался. Следовательно, экспрессия коллагеназ, аггреканаз и про-воспалительных цитокинов часто была связана с разрушенными частями хряща, но наблюдалась также и не только в зонах повышенной активности расщепления коллагена. Экспрессия аггрекана и COL2A1 обнаружена как в зоне повреждений, так и вдали от них.

Экспрессия каспазы 3, которая наблюдается в гипертрофной и в ранней пролиферативной зонах в бычьей ростковой пластинке, где она коэкспресировалась с ММР-13 (ЧетинаЕ.В. и Пул А.Р., неопубликованнные данные) была всегда связана с повышенной коллагеназной активностью на ранней стадии повреждения. Как и экспрессия ADAMTS-5, экспрессия каспазы 3 никогда не наблюдалась вдали от зоны повреждения. В целом наличие в. области ранних повреждений хряща экспрессии генов, которые обычно не детектируются к здоровом хряще, позволяют заключить, что на этих участках хрящ уже более нельзя считать здоровым.

Увеличенная активность расщепления коллагена на очень ранних стадиях повреждения хряща сопровождается выраженной экспрессией генов, связанных с дифференцировкой хондроцитов, тех же что и в фетальной ростковой пластинке. Следовательно, с суставными хондроцитами могут происходить фенотипические изменения, сходные с таковыми у хондроцитов ростковой пластинки в гипертрофной зоне при их терминальной дифференцировке.

Экспрессия генов, связанных с дифференцировкой хондроцитов, которая не сопровождалась расщеплением коллагена и деградацией матрикса (степень 1 по Манкину), может происходить в результате изменения нагрузки и/или ремоделирования матрикса, которые могут предшествовать проявлению фенотипа заболевания, характеризующегося повышением коллагеназной активности. Превратятся ли эти предшествующие заболеванию изменениям постоянную патологию - ОА, зависит от того, смогут ли клетки вернуться к «здоровому» состоянию или будут продолжать свою дифференцировку к гипертрофии, приводящей к разрушению матрикса и заболеванию. Те участки, в которых наблюдается увеличенная коллагеназная активность, разрушение хряща, а также увеличение экспрессии COLlOAl, каспазы 3, ADAMTS-5 и IL-la/p и уменьшение экспрессии аггрекана могут представлять ранний этап заболевания.

В целом наши результаты исследования возрастных, сходных с ОА, повреждений на ранней стадии их формирования свидетельствуют о сходстве процессов, происходящих в ростковой пластинке в процессе дифференцировки хондроцитов при эндохондралыюй оссификации и теми, что наблюдаются при формировании возрастных фокальных повреждений хряща, подобных ОА. В обоих случаях разрушению хрящевого матрикса предшествует увеличение экспрессии генов, связанных с фазой пролиферации хондроцитов, а именно PTHrP, FGF-2, TGFpi/2, а также макромолекул матрикса COL2A1 и аггрекана, которые наблюдались, как в пролиферативной зоне ростковой пластинки, так и на соседних с повреждениями участках или на значительном расстоянии от центра фокального повреждения на ранней стадии. Напротив, в зонах активного разрушения матрикса, как в гипертрофной зоне ростковой пластинки, так и вблизи центра фокального повреждения на раннем этапе его формирования наблюдался высокий уровень экспрессии коллагеназ ММР-1, -14 (МТ1-ММР), аггреканазы ADAMTS-5, цитокинов IL-la /|3 и TNFa, а также генов, связанных с гипертрофией хондроцитов COLlOAl, ММР-13, ММР-9, Ihh и каспазы 3.

Результаты, представленные здесь, показывают, что на ранней стадии повреждения суставного хряща его разрушение включает в себя увеличение активности расщепления коллагена и сопровождается экспрессией генов, тесно связанных с дифференцировкой хондроцитов. Обратимо ли это изменение - пока неясно. Следовательно, дифференцировка хондроцитов может представлять раннее событие в процессе разрушения хряща, приводящее к резорбции матрикса.

На следующем этапе наше предположение о том, что в основе разрушения хрящевой ткани при ОА лежит процесс дифференцировки хондроцитов, нашло подтверждение в опытах по искусственной индукции разрушения коллагена здорового суставного хряща пептидом коллагена 2 типа. Пептид, который мы исследовали в данной работе, экспонируется в больших количествах в хряще больных ОА [454]. Расчеты количества этого пептида на основе анализа денатурации коллагена 2 типа в хряще больных

OA [180] показали его содержание в пределах 10-25 мкМ, т.е. в той концентрации, при которой наблюдалась его активность in vitro.

В здоровом суставном хряще взрослого человека дифференцировка хондроцитов не наблюдается в некальцифицированной зоне хряща [62], хотя она отмечена в кальцифицированном хряще вблизи субхондральной кости. Однако как описано выше, усиленная резорбция коллагена матрикса, связанная с пролиферацией клеток и гипертрофией хондроцитов и приводящая к опосредованному коллагеназой расщеплению коллагена 2 типа, сопровождается увеличением содержания денатурированного коллагена 2 типа, что также происходит в ростковой пластинке [292]. Более того, ингибирование ММР-13, коллагеназы, ответственной за большую часть активности расщепления коллагена в суставном хряще [111] и ростковой пластинке, также приводит к подавлению гипертрофии хондроцитов в ростковой пластинке [441]. В случае здоровых хрящей быка и человека оказалось, что похожая цепочка-клеточных превращений происходит при культивировании хряща в присутствии коллагеного пептида и проявляется в способности пептида СВ12-2 индуцировать сначала пролиферацию хондроцитов, затем терминальную дифференцировку, которая сопровождается усиленной резорбцией и экспрессией генов COLlOAl и ММР-13 с последующим апоптозом.

В целом, хондроциты бычьего суставного хряща вначале отвечают на действие СВ12-2 появлением пролиферативных антигенов, о наличии которых свидетельствует усиление окрашивания анти-PCNA и анти-Кл67 на 1-е сутки в средней и глубокой зонах, которое сопровождается повышенной экспрессией ММР-13. Далее, на 4-е сутки хондроциты экспрессируют характерный маркер гипертрофии - COLlOAl, что сопровождается появлением коллагена 10 типа в средней зоне и поддержанием повышенного уровня экспрессии ММР-13. В то же время и в тех же участках мы наблюдали, начиная с 4-х суток и далее, повышение активности расщепления коллагена 2 типа, на что указывает окрашивание с использованием антител к коллагену 2 типа и усиление коллагеназной активности, измеряемой С2С методом. К 4-6 суткам эти изменения распространяются на поверхностную зону, где происходит смерть клеток посредством апоптоза - маркера терминальной дифференцировки хондроцитов. Причиной того, что апоптоз наблюдается только в поверхностной зоне в связи с усиленным расщеплением коллагена, может быть следствием того, что в этой области коллаген является наиболее восприимчивым к деградации и является наиболее денатурированным при ОА [181].

Изменения, выявленные в эксплантатах бычьего суставного хряща в присутствии пептида СВ12-2, напоминают связанные с гипертрофией изменения, наблюдаемые в суставном хряще при его деградации у человека при ОА и в модельных опытах на животных [325]. Эти изменения в основном происходят в поверхностной и средней зонах. Они включают увеличение объема хондроцита [94], что свойственно гипертрофным хондроцитам ростковой пластинки, что, однако, в наших эксплантатах не наблюдалось. Кроме того, появляется большое количество денатурированного коллагена 2 типа [181] вследствие усиленного расщепления тройной спирали этого коллагена [74]. Также происходит продукция коллагена 10 типа [421], аннексинов 2, 5, 6, и 8 [215, 312], кластерина [108], РСИА, синдекана-3, и щелочной фосфатазы [312]. Напротив, апоптоз, наблюдаемый в глубокой зоне, по-видимому, не относится к гипертрофии хондроцитов, индуцированной пептидом, поскольку он наблюдается и в контрольных культурах.

Таким образом, полученные нами результаты показывают, что достаточная деградация и денатурация коллагена 2 типа с экспозицией скрытых последовательностей, которые могут встречаться как при эндохондральноой оссификации, так и при ОА, возможно, оказывают существенное влияние на фенотипическую экспрессию хондроцитов. Прежде сообщалось, что обработка хряща коллагеназой также приводит к индукции апоптоза [210]. Этому может также предшествовать гипертрофия хондроцитов. Эти данные вместе с недавно продемонстрированной нами функциональной связью между гипертрофией и усиленным расщеплением коллагена 2 типа в хряще больных ОА проясняет молекулярные и клеточные связи между гипертрофией и усиленным расщеплением коллагена в здоровом хряще и при заболевании.

Ингибирование разрушения суставного хряща является наиболее важным показателем эффективности лечения ОА, поскольку в настоящее время выбор лечебных средств очень ограничен. Так как в отличие от потери протеогликана, разрушение коллагена 2 типа считается необратимой стадией разрушения хряща при ОА [325], ингибирование этого процесса является важным этапом прекращения деградации хрящевой ткани. В настоящее время частично противодействовать разрушению ВКМ удавалось путем прямого ингибирования ММР и аггреканаз синтетическими молекулами или доксициклином [335, 443, 138, 85]. Вместе с тем отмечалось, что такие ингибиторы могут быть причиной побочных эффектов в скелетных мышцах и приводят к скованности в суставе, его фиброплазии, а также аккумуляцию коллагена 1 типа [335]. С другой стороны, учитывая возможное вовлечения ремоделирования субхондальной кости, были сделаны попытки анти-резорптивной терапии субхондральной кости кальцитонином или бисфосфанатами [84,143,144,256, 293, 186], а в настоящее время проверяется влияние остеопротегерина и антител к КАМСЬ [310]. Однако эти попытки не дали однозначных результатов в отношении протекции хряща, хотя отмечался анти-резорбтивный эффект на уровне субхондральной кости [96, 371].

Поскольку в результате наших исследований обнаружены сходства между разрушением коллагена 2 типа при ОА и в гипертрофной зоне первичной ростковой пластинки, как например, повышение активности расщепления коллагена 2 типа коллагеназами, и экспрессия генов, связанных с гипертрофией хондроцитов, противодействовать разрушению матрикса оказалось возможным посредством ингибирования гипертрофии. При этом гипертрофия хондроцитов является процессом, который может быть остановлен в нескольких критических точках. Такими ключевыми пунктами является верхне-пролиферативная зона, дальнейшее продвижение по которой может быть заблокировано смесью ростовых факторов ТСБР2, БОР-2 и инсулина или каждым по отдельности, а также верхняя гипертрофная зона;, блокируемая РТНгР и ШЬ [383]. Использование механизма ингибирования гипертрофии является, стратегией, стимулирующей анаболические процессы в хряще. Преимущество ее состоит в том, что ингибирование патологического процесса потери коллагена матрикса происходит не под непосредственным воздействием агента на активность протеиназ, а в результате изменения фенотипа хондроцитов больных ОА на более здоровый.

В связи с этим интересно было наблюдать, что снижение активности расщепления коллагена 2 типа индуцируется теми же ростовыми факторами, которые подавляют гипертрофию хондроцитов ростковой пластинки в культуре клеток [80, 383]. Из трех исследованных ростовых факторов ТОБр2 оказался наиболее эффективен в подавлении расщепления коллагена 2 типа. Он также подавлял экспрессию генов, связанных с гипертрофией хондроцитов, таких как СОЫОА1, ММР-9 и РТНгР, а также ММР-13 -коллагеназы, которая основным ферментом, разрушающим ВКМ в хряще при ОА [75, 111]. Поэтому ингибирование расщепления коллагена посредством ТОБР2 включает подавление терминальной дифференцровки хондроцитов.

В случае РТНгР в некоторых случаях наблюдалось слабое увеличение его экспрессии. В целом это благоприятно для подавления любого прогрессирования гипертрофии, поскольку РТНгР сам является маркером пролиферации хондроцитов й ингибирует их терминальную дифференцировку [431].

Об особом значении Тврр в поддержании гомеостаза здорового суставного хряща свидетельствовали генетические эксперименты на мышах, в которых использовались мутации, приводящие к гиперпродукции дефектного рецептора 2 типа TGFP [358] или к делетированию компонента» сигнального пути SMAD — 8 экзона Smad3 [452]. В обоих случаях одним из проявлений генетических изменений была деградация и потеря суставного хряща у стареющих животных, сходная с таковой при ОА у человека. Это сопровождалось развитием обширных зон гипертрофии хондроцитов и образованиемболыних остеофитов. Более того, мыши, нокаутированные по TGEP2, имели множественные скелетные дефекты, которые приводили к уменьшению размеров нормальных тканей в процессе эндохондрального образования костей [349]. Эти мыши отличались от мышей, нокаутированных по TGFpl, у которых развивалось ауто-иммунное воспалительное заболевание [366].

Хотя трудно предсказать насколько соответствуют результаты исследований in vitro тому, что происходит in vivo, имеющиеся данные позволяют предположить, что наличие TGF|32 также благоприятно для формирования и поддержания суставного хряща in vivo. Это подтверждается тем, что TGFP2 наиболее высоко экспрессирутся по сравнению с другими изоформами TGFp во всех зонах развивающихся костей человека и его экспрессия уменьшается во взрослом суставном хряще у крыс, когда происходят его дегенеративные изменения [150]. Поскольку ОА встречается, главным образом, у лиц пожилого возраста, дефицит TGFP2 может также способствовать деградации хряща. Это подтверждается тем, что TGFP2 значительно снижается на последней стадии ОА, как у человека [417,418], так и при экспериментальном ОА у животных [74].

Мы не наблюдали катаболического действия TGFp2 в суставном хряще при ОА. Между тем этот ростовой фактор может оказывать деструктивное действие в нормальном суставном хряще, поскольку при внутрисуставной иньекции TGFP2 в высокой концентрации (1мкг) наблюдались' катаболические изменениям в здоровых суставах кроликов, вызывая их припухание, пролиферацию фибробластов синовиальной мембраны и значительную потерю протеогликана хряща [136].

Наблюдаемое подавление экспрессии* ММР-13 и сокращение расщепления коллагена посредством TGF(32 также согласуется с наблюдением, о том, что семейство TGFP может ингибировать экспрессию ММР-13 [365]. Напротив, другие авторы сообщали, что TGFp-1 и-2 могут индуцировать экспрессию коллагеназы [281].

Хотя сам TGFp2 более эффективен в регуляции разрушения коллагена, чем другие ростовые факторы, комбинация нескольких ростовых факторов может производить более благоприятное действие in vivo, когда необходимо совместить ингибирование расщепления коллагена со стимулированием восстановления ВКМ. Так, например, у чувствительных пациентов инсулин может стимулировать восстановление ткани, поскольку он является главным анаболическим агентом суставного хряща [401]. FGF-2 также может способствовать восстановлению хряща [432, 448]. Кроме того, комбинации этих или других ростовых факторов оказывают синергическое действие в поддержании синтеза компонентов ВКМ в суставном хряще или ростковой пластинке [446]. Напротив, сам TGFP2 может не обладать способностью восстановления анаболических функций, поскольку сообщалось, что он подавляет синтез коллагена 2 типа и аггрекана [80, 136].

В нашем исследовании in vitro TGFP2 ингибирует экспрессию IL-ip и

TNFa, которые как и остальные исследованные гены, а именно COLlOAl,

ММР-13, -9, РТНгР, обычно не экспрессируются в нормальном суставном, хряще [37]. При этом подавление экспрессии цитокинов IL-lp и TNFa важно, поскольку они являются катаболическими факторами при OA и ингибирование этих цитокинов также способно подавлять коллагеназную активность и разрушение протеогликанов в хряще при OA [221]. Кроме того, показана способность TGFpi противодействовать катаболическому действию

1Ь-1р паракринового происхождения в суставных хондроцитах грызунов [350, 351,369, 408].

Повышение*экспрессии простагландин Е синтазы 1 (РСЕ8-1), а также освобождение в среду РОЕ2 под действием ТОРР2, наблюдаемое нами, согласуется с сообщением об^увеличении содержания РОЕ2 в здоровом суставе кролика после внутри-артикулярного введения трансформирующего^ фактора роста Р2 [135]. Ингибирование терминальной дифференцировки, хондроцитов посредством РОЕ2 отмечалось также в опытах на животных [238, 462]. Наши результаты показывают, что увеличение экспрессии РОЕ8-1 и образование РОЕ2 происходит в связи с ингибированием расщепления коллагена.

Следовательно, результаты проведенных исследований показывают, что активное расщепление коллагена в эксплантатах суставного хряща при ОА может быть подавлено ТОрр2. С этим процессом связаны такие клеточные механизмы, как ингибирование гипертрофии и экспрессии 1Ь-1р и ЮТа и увеличение продукции РОЕ2. Поскольку ТОБр2 может благоприятствовать формированию прегипертрофного фенотипа, лекарственные препараты, способные регулировать дифференцировку хондроцитов могут быть эффективны для лечения разрушения хряща у больных ОА.

РОЕ2 может оказывать на суставные хондроциты, как катаболическое, так и анаболическое действие. Циклооксигеназа-зависимые простагландины участвуют в различных физиологических процессах, включая мужскую плодуктивность, менструации, овуляцию, беременность, имплантацию, а также и в патологических процессах при различных воспалительных заболеваниях и неоплазиях, таких как артриты и рак [249]. О потенциальном патологическом действии РОЕ2 на суставной хрящ также сообщалось.ранее [56].

В наших исследованиях при низких концентрациях 10пг/мл РвЕ2 оказался способен селективно ингибировать повышенную активность расщепления коллагена, которая наблюдается при культивировании хрящей больных ОА. Это сопровождалось подавлением экспрессии коллагеназ ММР-1 и ММР-13; цитокинов IL-1J3, TNFa и маркера гипертрофии COLIOAI.

Ранее сообщалось,.4TO PGE2 подавляет дифференцировку/гипертрофию хондроцитов в онтогенезе [238, 462]. Нам удалось показать, что это ингибирующее действие распространяется на патологию, включающую усиленное расщепление коллагена в суставном хряще человека при ОА. Ингибирующее действие PGE2 в эксплантатах хрящей больных ОА, вероятно, связано с ингибирующим действием TGFJ32, которое сопровождается увеличением синтеза PGE2 [249].

Эти данные, а также ингибирующее действие напроксена - ингибитора циклооксигеназы, который снимает хондропротективное действие TGF(32 на деградацию коллагена в хрящах больных ОА, указывают на то, что PGE2 является медиатором хондропротективного действия TGF(32 в хряще больных ОА. Поэтому наши исследования подтверждают предположение, что PGE2 может опосредовать ингибирующее действие TGF02 .на деградацию коллагена в хряще больных ОА.

Ингибирующее действие PGE2 наблюдалось только при концентрациях значительно ниже тех, что зарегистрированы при воспалительном процессе [268]. Как сообщалось, PGE2 ответствен, как за катаболические, так и за анаболические изменения в суставном хряще [53, 268]. Он способен ингибировать синтез коллагена хондроцитами ростковой пластинки [305], опосредовать производство ММР в суставных хондроцитах и хряще [53, 305], ингибировать пролиферацию хондроцитов [78], усиливать экспрессию IL-1J3 [245] и индуцировать апоптоз [280]. С другой стороны, он также может ингибировать экспрессию коллагеназы и стромелизина [122, 345, 403], IL-lp и TNFa [93,403], стимулировать синтез коллагена и протеогликана [248, 263, 120], пролиферацию хондроцитов [248], ингибировать терминальную дифференцировку/гипертрофию хондроцитов [238, 462] и апоптоз в клетках эндотелия [140].

Взаимоисключающие последствия действия PGE2 на хондроциты могут зависеть от дозы агента [122, 158]. Наша экспериментальная система, содержащаяЛОпг/мл PGE2, оказывала хондропротекторное действие на эксплантаты суставного хряща больных ОА: подавляла расщепление коллагена и экспрессию генов, связанных с расщеплением коллагена, про-воспалительных цитокинов и гипертрофии. Она не усиливала пролиферацию хондроцитов, апоптоз, синтез коллагена 2 типа и простагландинов, как показывает отсутствие значительных изменений экспрессии циклина В2, каспазы 3, COL2A1, СОХ-2 и PGES-1, соответственно. В настоящее время неясно, почему такие низкие дозы являются хондропротекторными. Для этого необходимо провести исследования по анализу рецепторов, которые позволят объяснить это наблюдение.

Наконец важно отметить, что в присутствии физиологических доз TGF02 [321] или PGE2 не только хондроциты больных ОА способны возвращаться к более здоровому фенотипу, сопряженному с ослаблением деградации коллагенового матрикса, но и остеобласты, поскольку те же концентрации PGE2 увеличивали активность щелочной фосфатазы, ключевого медиатора формирования кости [158, 354]. Поэтому наши результаты ставят под сомнение целесообразность полного ингибирования циклооксигеназы ввиду протективной роли очень низких концентраций PGE2. Несомненно, низкие концентрации должны поддерживаться in vivo для защиты скелета, а не элиминироваться большими дозами ингибиторов.

Таким образом, хондроциты суставного хряща способны возобновить процесс дифференцировки, сходный с таковым в фетальных хондроцитах. При этом происходит повышение экспрессии аналогичных генов, связанных с пролиферацией и гипертрофией хондроцитов, как в ростковой пластинке. Дифференцировка хондроцитов, вероятно, лежит в основе развития остеоартроза. Ее можно инициировать агентами, индуцирующими первичное расщепление коллагена коллагеназой. Разрушение матрикса суставного хряща больных ОА, как и дифференцировку хондроцитов ростковой пластинки, можно остановить действием ростовых факторов, в особенности ТОрр2, или РОЕ2. Это сопровождается ингибированием маркерных генов дифференцировки и подавлением активности расщепления коллагена коллагеназой.

Список литературы диссертационного исследования доктор биологических наук Четина, Елена Васильевна, 2011 год

1. Алексеева JIM., Зайцева ЕМ Остеоартроз и остеопороз. // Медицина 2006. - Т. 16.-С. 2-7.

2. Жилкин Б.А., Докторов A.A., Денисов-Никольский Ю.И. Минеральный компонент гиалинового хряща.//Биомедицинские технологии М. - 2002. - С. 140-146.

3. Каменев Ю.Ф., Башенов НД. Теория и практика лечения болевого синдрома при деформирующем артрозе крупных суставов.// Конспект практического врача.-М 1997.-16 с.

4. Ким Зон Чхол, Быков В.А., Николаева С.С. и др. Изменения биохимических характеристик коллагена и состояния воды хряща при остеоартрозе.// Вопр. мед. химии.- 2001. Т. 47, №5. - С. 498-505.

5. Ким Зон Чхол., Быков В А, Николаева С.С. Состояние воды в гиалиновом хряще и его основных компонентах.// Биомедицинские технологии. — М. — 2000. Т. 14. - С. 85-90.

6. Клионер М.Л. Старческие и дегенеративные изменения в суставах и позвоночнике.// М. 1962. - 151 с.

7. Копьева Т.Н., Бельская О.Б., Остаренко М.Г. и др. Морфология суставного хряща при остеоартрозе.// Архивы патологии.- 1986.- Т. 48.- С. 40-46.

8. Копьева Т.Н., Мульдияров П.Я., Бельская О.Б. и др. Структура суставного хряща в пожилом возрасте.//Архивы анатомии, гистологии и эмбриологии.- 1983,- Т. 85. -С. 60-67.

9. Коршунов Н.И., Марасаев В.В., Баранова Э.Я. и др. Роль воспаления и оценка хондропротективного действия Афлутопа у больных остеоартрозом по данным магнитно-резонансной томографии коленного сустава.//Ревматология. М. - 2003. - № 23. - С. 13201323.

10. Лила A.M. Современные* аспекты диагностики илечения остеоартроза.// Русский медицинский журнал. 2007. - №-5, -Т. 15. — С. 331-334.11". Маколкин В.И., Пак Ю.В., Меньшикова И.В.

11. Коксартроз: этиология, эпидемиология, клинические проявления и новые подходы к терапии.// Терапевтический Архив.- 2007, Т.- 79. -С. 81-85.

12. Мажуга П.М. Клеточные механизмы дифференцировки суставного хряща. // Цитология и генетика. -1996.- Т.- 30. С. -3-10.

13. З.Миронов С.П., Омельяненко Н.П, Семенова Л.А. и др. Структурные изменения суставного хряща при остеоартрозе.// Биомедицинские технологии. -2004.- Т.23.-С.91-105.

14. Миронов С.П., Омельяненко Н.П., Семенова Л.А., и др. Остеоартроз. Структурная характеристика и клинические проявления.// Актуальные проблемы теоретической и клинической остеоартрологии М. -2005. — С. 301-335.

15. Миронов СП., Омельяненко Н.П., Орлецкий А.К. и др. Остеоартроз: современное состояние проблемы (аналитический обзор).// Вестн. травматол. ортопед. — 2001. № 2. — С. 96- 99.

16. Насонов Е.Л. Остеопороз и остеоартроз: взаимодействующие или взаимоисключающие болезни?// Консилиум.- 2000.- № 2- С. 248-250.

17. Насонова В.А. Проблемы остеоартроза в начале XXI века.// Consilium medicum. 2000. - № 6.- Т. 2. - С. 244-248.

18. Николаева С.С, Ким Зон Чхол, Быков В.А., и др. Влагообменные процессы в гиалиновом хряще и его основных компонентах в норме и остеоартрозе// Вопр. мед. химии. 2000. - Т. 46, № 6. — С. 581— 590.

19. Николаева С.С., Ким Зон Чхсш, Быков В А и др. Биохимические и влагообменные характеристики поверхностного слоя суставного хряща человекаУ/ Бюллетень эсперем. биолопш и медицины. 2002.-Т. 134.- № 10.-С. 390-392.

20. Оганесян 0:В., Семенова JI.A., Хапилин А.П., и др. Применение препаратов гиалуроновой кислоты для лечения остеоартроза.// Вестник травматологии и ортопедии. 2007. - №* 2. — С. 41-46.

21. Омельяненко HXL, Селезнев НВ., Семенова JI.А Формирование гиалиновой' хрящевой ткани* на поврежденных суставных концах сочленяющихся костей при пассивных движениях в суставе //Морфология. 2004.— № 4.- С. 95:

22. Омельяненко НИ, Семенова J1A. Возрастная динамика пограничных слоев суставного хряща человека//Морфология. —2004.—№ 4.—С. 96.

23. Миронов С.П., Омельяненко Н.П., Шерепо КМ и др. Морфология тканевых компонентов тазобедренного сустава у экспериментальных животных при моделировании остеоартроза.//Вестник травматологии и ортопедии 2006-№ 1-С-57-63.

24. Павлова В.Н., Копьева Т.Н., Слуцкий Л.И. др. Хрящ.// М. - 1988. - 320 с.

25. Подрушняк Е.П. Возрастные изменения суставов человека.//-Киев. -1972.-212 с.

26. Раденска-Лоповок С.Г. Остеоартроз: возможности морфологической диагностики.//Клиническая геронтология.- 2004.- Т. 10.- С. 46-47.

27. Слюсаренко Н.А., Капустин Л.Ф., Торба А.И. Функциональная морфология-коленного сустава у собак в норме и в условиях действия глюкозаминаУ/ Биомедицинские технологии. -1998. Вып. 9. - С. 44-48.

28. Goldring SR, Goldring MB.The role of cytokines in cartilage matrix degeneration in osteoarthritis.// Clinical Orthopaedics. — 2004/-V. 427 (Suppl).- P. S27-S36.

29. Benito MJ, Veale DJ, FitzGerald O. et al. Synovial tissue inflammation in early and late osteoarthritis.// Annals Rheum Dis. 2005.- V. 64.- P. 12631267.

30. Goldring MB. Update on the biology of the chondrocyte and new approaches to teating cartilage diseases.// Best Practice Res Clin Rheumatol.-2006.- V. 20.- C.-1003-1025.

31. Aigner T. Osteoarthritis.// Current Opin Rheumatol*.-2007.-V. 19.-P.427-428.

32. Aigner T, Gluckert K, von der Mark K. Activation of flbrillarcollagen synthesis and phenotypic modulation of chondrocytes in early human osteoarthritic cartilage lesions.// Osteoarthritis Cartilage.- 1997.- V. 5.-P. 183-189.

33. Aigner T, Haag J, Martin J et al. Osteoarthritis: Aging of matrix and cells -going for a remedy.// Curr Drug Targets.- 2007.- V. 8.- P. 325-331.

34. Aigner T, McKenna L. Molecular pathology and pathobiology of osteoarthritic cartilage.// Cell Mol Life Sei.- 2002.- V. 59.- P. 5-18.

35. Aigner T, Stoss Hj Weseloh G; Zeiler G, von der Mark K. Activation of collagen type ir expression in osteoarthritic and rheumatoid cartilage:// Virchows Arch.- 1992.- V.B62.-P. 337-345.

36. Aigner T, Zien A, Hanisch D, et al. Gene expression in chondrocytes-assessed with use of microarrays.// J Bone Joint Surg Am.- 2003.- V. 85-A.-Suppl2-P. 117-123.

37. EndbcftMetab.'Iimn^ 2006.-Y. 383-3941

38. Alini M, Roughley PJ. Changes in leucine-rich repeat proteoglycans duringf maturation of the bovine growth plate.// Matrix Biol.r 2001.- V. 19.-P.8051.813.i

39. Alini M, Kofsky Y, Wu W et al. In serum free thyroid hormones can inducefull expression of chondrocyte hypertrophy leading to matrix calcification.//f J Bone Miner Res.- 1996.- V. 11.-P. 105-113.

40. Altman R, Asch E, Bloch D, et al. Development of criteria for the classification and reporting of osteoarthritis: classification of osteoarthritis of the knee.// Arthritis Rheum.- 1986.- V. 29.-P.1039-1149.

41. Alvarez J, Costales L, Serra R, et al. Expression patterns of matrix metalloproteinases and vascular endothelial growth factor during epiphyseal ossification.// J Bone Miner Res.- 2005.- V. 20.-P.1011-1021.

42. Alvarez J; Balbin M, Santos F, et al. Different bone growth rates are associated with changes in the expression pattern of types II and X collagens and collagenase 3 in proximal growth plates of the rat tibia.// J Bone Miner Res.- 2000.-V. 15.-P.82-94.

43. Ames BN. Assay of inorganic phosphate, total phosphate, and phosphatases.// Methods Enzymol.- 1966.- V. 8.-P.115-118.

44. Amin AR, Attur M, Patel RN, et al. Superinduction of cyclooxygenase-2 activity in human osteoarthritis-affected cartilage. Influence of nitric oxide.// J Clin Invest.- 1997.- V. 99.-P.1231-1237.

45. Amizuka N, Warshavsky H, Henderson JD et al. Parathyroid hormone-related peptide-depleted mice show abnormal epiphyseal cartilage development and altered endochondral bone formation.// J Cell Biol.- 1994.-V. 126.-P.1611-1623.

46. Anderson HC, Hodges PT, Aguilera XM, et al. Bone morphogenetic protein (BMP) localization in developing human and rat growth plate, metaphysis, epiphysis, and articular cartilage.// J Histochem Cytochem.- 2000.-V. 48-P. 1493-1502.

47. Aoyama T, Liang B, Okamoto T, et al. PGE2 signal through EP2 promotes the growth of articular chondrocytes.// J Bone Miner Res.- 2005.- V. 20.-P.377-389.

48. Appleton CT, Usmani SE, Bernier SM et al. Transforming growth factor alpha suppression of articular chondrocyte phenotype and Sox9 expression in a rat model of osteoarthritis.// Arthritis Rheum.- 2007.- V. 56.-P.3693-3705.

49. Appleton CT, Pitelka V, Henry J, et al. Global analyses of gene expression in early experimental osteoarthritis.// Arthritis Rheum.- 2007.- V. 56.-P.1854-68.

50. Armstrong CG, Mow VC. Variations in the intrinsic mechanical properties of human articular cartilage with-age, degeneration and water content:// J' bone Joint Surg Am.- 1982.- V. 64.-P. 88-94.

51. Attur MG, Dave MN, Stuchin S et al. Osteopontin: an intrinsic inhibitor in cartilage.// Arthritis Rheum.- 2001.- V. 44.-P.578-584.

52. Aurich M, Poole AR, Reiner A et al. Matrix homeostasis in aging normal ankle cartilage.// Arthritis Rheum.- 2002.- V. 46-P. 2903-2910.

53. Babarina AV, Mollers U, Bittner K, et al. Role of subchondral vascular system in endochondral ossification: endothelial cell-derived proteinases derepress late cartilage differentiation in vitro.// Matrix Biol.- 2001.- V. 20.-P.205-213.

54. Baginsky ES, Marie SS, Clark WL, et al. Direct microdetermination of serum calcium.// Chim Acta .- 1973.- V. 46.-P.46-54.

55. Ballock RT, Heydemann A, Wakefield LM, et al. TGF-beta 1 prevents hypertrophy of epiphyseal chondrocytes: regulation of gene expression for cartilage matrix proteins and metalloproteases.// Dev Biol.- 1993.- V. 158.-P.414-429.

56. Bank RA, Soudry M, Maroudas A et al. The increased swelling and instantaneous deformation of osteoarthritic cartilage ias highly correlated -with collagen degradation.// Arthritis Rheum.- 2000.- V. 43.-P.2202-2210.

57. Barakat AF, Elson CJ, Westacott CI. Susceptibility to physiological concentrations of IL-lß varies in cartilage at different anatomical locations on human osteoarthritic knee joints.// Osteoarthritis Cartilage.- 2002.- V. 10.-P. 264-269.

58. Barbero A-, Grogan S, Schafer D, et al. Age related changes in human articular chondrocyte yield, proliferation and post-expansion chondrogenic capacity.// Osteoarthritis Cartilage.- 2004.- V.12.-P. 476-484.

59. Bayliss MT, Ali SY. Age-related changes in the composition and structure of human articular cartilage proteoglycans.// Biochem J.- 1978.- V. 176.-P. 683-693:

60. Beier F, Ali Z, Mok D, Taylor, AC et al. TGFbetaand PTHrP control chondrocyte proliferation'by activating cyclin D1 expression.// Mol Biol Cell.- 2001.- V. 12.-P.3 852-3 859.

61. Bernstein B, Forrester D, Singsen B et al. Hip joint restoration in juvenile rheumatoid arthritis.// Arthritis Rheum.- 1977.- V. 20.-P. 1099-1104.

62. Bi W, Huang W, Whitworth DJ, et al. Haploinsufficiency of Sox9 results in defective cartilage primarodia and premature skeletal mineralization.// Proc Natl Acad Sci USA.- 2001.- V. 98.- P. 6698-6703.

63. Billinghurst RC, Dahlberg L, Ionescu M et al. Enhanced cleavage of type II collagen by collagenases in osteoarthritic articular cartuilage.// J Clin Invest.- 1997.- V. 99.-P.1534-1545.

64. Blanco FJ Guitan R, Vazquez-Martel E et al. Osteoarthritic chondrocytes die by apoptosis: a passible pathway for osteoarthritis pathology.// Arthritis Rheum.- 1998.- V. 41.-P.284-289.

65. Blanco FJ, Lötz M. IL-l-induced nitric oxide inhibits chondrocyte proliferation via PGE2.// Exp Cell Res.- 1995,- V. 218.- P.319-325.

66. Blaney Davidson EN, Vitters EL, van den Berg WB et al. TGF beta-induced cartilage repair is maintained but fibrosis is blocked in the presence of Smad7.// Arthritis Res Ther.- 2006.- V. 8.-P. R65.

67. Böhme K, Winterhalter ICH, Bruckner P. Terminal differentiation of chondrocytes is a spontaneous process and is arrested by transforming growth factor-beta-2 and basic fibroblast growth factor in synergy.// Exp Cell Res.- 1995.-V.216.-P. 191-198.

68. Borden P, Solymar D, Sucharczuk A, et al. Cytokine control of interstitial collagenase and collagenase-3 gene expression in human chondrocytes.// J Biol Chem.- 1996.- V. 271-P.23577-23581.

69. Bos PK, van Osch JVM, Frenz DA, et al: Growth factor expression in cartilage wound healing: temporal and spatial immunolocalization in a rabbit auricular cartilage wound model.// Osteoarthritis Cartilage.- 2001,- V. 9.-P. 382-389.

70. Boskey AL, Posner AS, Lane JM, et al. Distribution of lipids associated with mineralzation in the bovine epiphyseal growth plate.// Arch Biochem Biophys.- 1980.- V. 199.-P. 305-311.

71. Brandt KD,' Smith G, Kang SY, et al. Effects of diacerhein in an accelerated canine model of osteoarthritis.// Osteoarthritis Cartilage.- 1997.- V. 5.-P.438-439.

72. Brandt KD, Mazzuca SA, Katz BP, et al. Effects of doxycycline on progression of osteoarthritis: results of a randomized, placebo-controlled, double-blind trial.// Arthritis Rheum.- 2005.- V. 52.-P. 2015-2025.

73. Brenner DA, 0"Hara M, Angel P et al. Prolonged activation of jun and collagenase genes by tumor necrosis factor a.// Nature.- 1989.- V. 337.-P.661-663.

74. Brocklehurst R, Bayliss M, Maurodas A, et al.- 117- The composition of normal and osteoarthritic articular cartilage from human knee joints.// Bone Joint Surg Am.- 1984.- V. 66.-P. 95-106.

75. Buckwalter JA, Mankin HJ. Articular cartilage repair and transplantation.// Arthritis Rheum.- 1998.- V. 41.-P.1331-1342.

76. Buckwalter JA, Mower D, Ungar R et al. Morphometric analysis of chondrocyte hypertrophy.// J Bone Joint Surg Am.- 1986.- V. 68.-P. 243255.

77. Bunning RA, Russell RG: The effect of tumor necrosis factor a and y-interferon production of prostaglandin E and of caseinase activity by human articular chondrocytes.// Arthritis Rheum.- 1989.- V. 32.-P.780-784.

78. Bush PG, Hall AC. The volume and morphology of chondrocytes within non-degenerate and degenerate human articular cartilage.// Osteoarthritis Cartilage.- 2003.- V. 11.-P.242-251.

79. Campo RD. Effects of cations on cartilage structure: swelling of growth plate and degradation of proteoglycans induced by chelators of divalent cations.//Calcif Tissue Int.- 1988.- V.43.-P. 108-121.

80. Carbone LD, Nevitt MC, Wildy K, et al. The relationship of antiresorptive drug use to structural findings and symptoms of knee osteoarthritis.// Arthritis Rheum.- 2004.- V. 50.- P. 3516-3525.

81. Caterson B, Flannery CR, Hughes CE, et al. Mechanisms involved in cartilage proteoglycan catabolism.// Matrix Biol.- 2000.- Y. 19.-P.333-344'.

82. Cawston TE, Ellis AJ, Lean E et al: Interleukin-1 and oncostatin M in combination promote the release of collagen fragments from bovine nasal cartilage in culture.// Biochem Biophys Res Comun.- 1995.- V. 215.-P.377-385.

83. Chen Q, Johnson DM, Haudenschild DR, et al. Cartilage matrix protein forms a type II collagen-independent filamentous network: analysis in primary cell cultures with a retrovirus expression system.// Mol Biol Cell.- 1995.- V. 6.-P.1743-1753.

84. Chen Q, Johnson DM, Haudenschild DR, et al. Progression and recapitulation of the chondrocyte differentiation program: cartilage matrix protein is a marker for cartilage maturation.// Dev Biol.- 1995.- V. 172-P. 293-306.

85. Cheung WH, Lee KM, Fung KP, et al. Growth plate chondrocytes inhibit neo-angiogenesis ~ a possible mechanism for tumor control.// Cancer Lett.- 2001.- V. 163.-P.25-32.

86. Cheung WH, Lee KM, Fung KP, et al. TGF-betal is the factor secreted by proliferative chondrocytes to inhibit neo-angiogenesis.// J Cell Biochem Suppl.- 2001.- Suppl 36.-P.79-88.

87. Cheung HS, Ryan LM, Kozin F et al. Identification of collagen subtypes in synovial fluid sediments from arthritic patients.// Am J Med.-1980.- V. 68.-P.73-79.

88. Chrysis D, Nilsson O, Ritzen EM et al. Apoptosis is developmentally regulated in rat growth plate.// Endocrine.- 2002.- V. 18.-P. 271-278.

89. Cole AA, Chubinskaya S, Luchene LJ, et al. Doxycycline disrupts chondrocyte differentiation and inhibits, cartilage matrix degradation:// Arthritis Rheum.-1994.- V. 37.-P. 1727-rl734.

90. Connor JR, Kumar S, Sathe G, et al. Glusterin expression in adult human normal and osteoarthritic articular cartilage.// Osteoarthritis Cartilage.- 2001,- V. 9.-P. 727-737.

91. Damron TA, Mathur S, Horton JA et al. Temporal changes in PTHrP, Bcl-2, Bax, caspase, TGF-beta, and FGF-2 expression following growth plate irradiation with or without radioprotectant.// J Histochem Cytochem.-2004.-V. 52.-P. 157-167.

92. Miller EJ. Isolation and characterization of a collagen from chick cartilage containing three identical a-chains.// Biochem J.- 1971.- V. 10-P.1652-1659.

93. Dean DD, Martel-Pelletier J, Pelletier JP et al. Evidence for metalloproteinase and metalloproteinase inhibitor imbalance in human osteoarthritic cartilage.//J Clin Invest.- 1989.- V. 84.-P.678-685.

94. Dean DD, Muniz OE, Woessner JF et al. Production of collagenase and tissue inhibitor of metalloproteinase by rat growth plates in culture.// Matrix.- 1990.- V. 10.-P.320-330.

95. Dean DD, Woessner Jr JF. A sensitive, specific assay for tissue collagenase using telopeptide-free 3H. acetylated collagen.// Anal Biochem.- 1985.-Y. 148.-P. 174-181.

96. DiBattista JA, Martel-Pelletier J, Cloutier JM, Pelletier JP: Modulation of glucocorticoid receptor expression in human articular chondrocytes by cAMP and prostaglandins.// J Rheumatol.- 1991.- V. 27.- P. 102-105.

97. Dieppe P, Cushnaghan J, Jasani MK et al. A two year, placebo-control trial of non-steroidal antiinflammatory therapy in osteoarthritis of the knee joint.// Brit J Rheumatol.- 1993.- V. 32.-P.595-600.

98. Dieppe PA, Sathapatayavongs B, Jones HE et al. Intraarticular steroids in osteoarthritis.//Rheum Rehabil.- 1980.- V. 19.-P.212-217.

99. Dingle JT, Horsfield P, Fell HB et al. Breakdown of proteoglycan and' collagen induced in pig articular cartilage in organ culture.// Ann Rheum Dis.- 1975.- V. 34.-P.303-311.

100. Distel M, Mueleer C, Bluhmki E et al. Safety of meloxicam: a global analysis of clinical trials.// Brit J Rheumatol.- 1996.- V. 35.- Suppl 1-P.68-77.

101. Dong Y, Drissi H, Chen M, et al. Wnt-mediated regulation of chondrocyte maturation: modulation by TGF-beta.// J Cell Biochem.- 2005.-V. 95.-P. 1057-1068.

102. Ducy P, Zhang R, Geoffroy V, et al. 1997 Osf2/Cbfal : A transcriptional activator of osteoblast differentiation.// Cell.- 1997.- V. 80.-P.371-378.

103. Dumond H, Presle N, Pottie P, et al. Site specific changes in gene expression and cartilage metabolism during early experimental osteoarthritis.// Osteoarthritis Cartilage.- 2004.- V. 12.-P. 284-295.

104. Eeckhout Y, Vaes G. Further studies on the activation of procollagenase, the latent precursor of bone collagenase: effects of lysosomal cathepsin B, plasmin and kallilrein and spontaneous activation.// Biochem J.- 1977.-V. 166.-P.21-31.

105. Elford PR, Graeber M, Ohtsu H, et al. Induction of swelling, synovial hyperplasia and cartilage proteoglycan loss upon intra-articular injection of transforming growth factor-f32 in the rabbit.// Cytokine.- 1992.- V. 4.-P. 232-238.

106. Ellis A J, Curry VA, Powell EK et al. The prevention of collagenbreakdown in bovine nasal cartilage by TIMP, TIMP-2 and a low molecular weight synthetic inhibitor.// Biochem Biophys Commun.- 1994.- V. 202.-P. 94-101.

107. Engel CK, Pirard B, Schimanski S, et al. Structural basis for the highly selective inhibition of MMP-13.// Chem Biol.- 2005.- V. 12.-P.' 181189.

108. Evans C. An inverse relationship between mammalian lifespan and cartilage cellularity.// Exp Gerontol.- 1983.- V. 18.-P.137-138.

109. Farquharson C, Jeffries D, Seawright T, et al. The role of the PTHrP-Indian hedgehog axis.//Endocrinology.- 2001.- V. 142.-P.4131-4040.

110. Felisaz N, Boumediene K, Ghayor C et al. Stimulating effect of diacerein on TGF-betal and beta2 expression in articular chondrocytes cultured with and without interleukin-1.// Osteoarthritis Cartilage.- 1999.- V. 7.-P. 255-264.

111. Fenton JI, Chlebek-Brown KA, Peters TL, et al. Glucosamine HCl reduces equine articular cartilage degradation in expiants culture.// Osteoarthritis Cartilage.- 2000.- V. 8.-P. 258-265.

112. Fenwick SA, Gregg PJ, Rooney P. Osteoarthritic cartilage loses its ability to remain avascular.// Osteoarthritis Cartilage.- 1999.- V. 7.-P.441-452.

113. Feraandes JC, Martel-Pelletier J, Lascau-Coman V, et al. Collagenase-1 and collagenase-3 synthesis in normal and early experimental osteoarthritic canine cartilage: an immunohistochemical study.// J Rheumatol.- 1998 .- V. 25.-P.1585-1594.

114. Ferrara N. Role of vascular endothelial growth factor in the regulation of angiogenesis.// Kidney Int.- 1999.- V. 56.-P.794-814.

115. Flannery CR, Lark MW, Sandy JD. Identification of a stromelysin cleavage site within the interglobular domain of human aggrecan: evidence for proteolysis at this site in vivo in human articular cartilage.// J Biol Chem.-1992.- V. 267.-P.1998-1014.

116. Franzen A, Inerot S, Hejderup S-O et al. Variations in the composition^ ofbovine hip articular cartilage with distance from the articular surface.// BiochemJ.- 1981'.- V. 195.-P.535-543.

117. Fukumura K, Matsunaga S, Yamamoto T, et al. Immunolocalization of transforming growth factor-ps and type I andtype Ilreceptorsin rat articular cartilage.//Anticancer Res:- 1998.-V. 18.- P. 4189-41941.

118. Fukunaga T, Yamashiro T, Oya S, et al. Connective tissue growth factor mRNA expression pattern in cartilages is associated with their type I collagen expression.// Bone.- 2003.- V. 33.-P. 911-918.

119. Gabay C: IL-1 trap. Regeneron/Novartis.// Curr Opin Investig Drugs.-2003.- V. 4.- P.593-597.

120. Gack S, Vallon R, Schmidt J, et al. Expression of interstitial collagenase during skeletal development of the mouse is restricted to osteoblast-like cells and hypertrophic chondrocytes.// Cell Growth Differ.-1995.- V. 6.-P.759-767.

121. Gallyas F, Merchenthaler I. Copper-H202 oxidation strikingly improves silver intensification of the nickel-diaminobenzidine (Ni-DAB) end-product of the peroxidase reaction.// J Histochem Cytochem.- 1988.- V. 36.-P.807-810

122. Garcia-Moteo O, Babini JC, Maldonado-Cocco JA et al. Remodelling of the hip joint in juvenile rheumatoid arthritis.// Arthritis Rheum.- 1981.- V. 24.-P.1570-1574.

123. Garcia-Ramirez M, Toran Nj Andaluz P, et al. Vascular endothelial growth factor is expressed in human fetal growth cartilage.// J Bone Miner Res.- 2000.- V. 15.-P. 534-540.

124. Garnero P, Ayral X, Rousseau JC, et al. Uncoupling of type II collagen synthesis and degradation predicts progression of joint damage in patients with knee osteoarthritis.//Arthritis Rheum.- 2002,- V. 46.-P. 26132624.

125. Gately S: The contributions of cyclooxygenase-2 to tumor angiogenesis.// Cancer Metastasis Rev.- 2000.- V. 19.- P. 19-27.

126. Gebauer M, Saas J, Haag J, et al. Repression of anti-proliferative factor,Tob 1 in osteoarthritic cartilage.// Arthritis Res Ther.- 2005.- V. 7.-P. R274-284.

127. Gerber HP, Vu TH, Ryan AM, et al: VEGF couples hypertrophic cartilage remodeling, ossification and angiogenesis during endochondral' bone formation.//Nat Med.- 1999.- V. 5.-P. 623-628.

128. Gilroy DW, Colville-Nash PR, Willis D, et al. Inducible cyclooxygenase may have anti-inflammatory properties.// Nat Med.- 1999.-V. 5.-P. 698-701.

129. Girkontaite I, Frischholz S, Lammi P, et al. Immunolocalization of type X collagen in normal fetal and adult osteoarthritic cartiláge with monoclonal antibodies.//Matrix Biol.- 1996.- V. 15.- P. 231-238.

130. Glansbeek HL, van Beuningen HM, Vitters EL, et al. Stimulation of articular cartilage repair in established arthritis by local administration of transforming growth factor-ß into murine knee joint.// Lab Invest.- 1998.- V. 78.-P. 133-142.

131. Glasson SS, Askew R, Sheppard B, et al. Deletion of active ADAMTS5 prevents cartilage degradation in a murine model of osteoarthritis.//Nature.- 2005.-V. 434.-P. 644-648.

132. Glimcher MJ. The nature of the mineral component of bone and themechanism of calcification./ In: Coe FL, Favus MJ (eds.) Disorders of Bone Mineral Metabolism.Raven Press, Ltd., New York, NY USA 1992-P. 265286.

133. Golden TR, Melov S. Mitochondrial DNA mutations, oxidative stress, and aging.// Mech Ageing Dev.- 2001.- V. 122.-P.1577-1589:

134. Gómez-Barrena E, Sánchez-Pernaute O, Largo R, et al. Sequential changes of parathyroid hormone related protein (PTHrP) in articularcartilage during progression of inflammatory and degenerative arthritis.// Ann Rheum Dis.- 2004.- V. 63-P. 917-922.

135. Gordan GV, Villanueva T, Schumacher HR et al. Autopsy study correlating degree of osteoarthritis, synovitis and evidence of articular calcification:// J Rheumatol:- 1984.- V. 11.-P.681-686.

136. Grimsrud GD, Romano PR, D'Souza M, et al: BMP-6 is an autocrine stimulator of chondrocyte differentiation.// J-Bone Miner Res.- 1999.- V. 14-P.475-482.

137. Guerne P-A, Blanco F, Kadin A et al. Growth factors responsiveness of human articular chondrocytes in aging and development.// Arthritis Rheum.- 1995.- V. 38.-P: 960-968.

138. Guilak F, Ratcliffe A, Lane N et al. Mechanical and biochemical changes in the superficial zone of articular cartilage in canine experimental osteoarthritis.// J Orthop Res.- 1994.- V. 12.-P.474-484.

139. Gunther M, Haubeck H-D, Van de Leur E et al. Transforming growth factor pi regulates tissue inhibitor of metalloproteinases-1 expression in differentiated human articular chondrocytes.// Arthritis Rheum.- 1994.- V. 37.-P. 395-405.

140. Hardest TE, Gay CV, Schraer H et al. Vertical distribution of elements in cells and matrix of epiphyseal growth plate cartilage determined by quantitative electron probe analysis.// J Histochem Cytochem.- 1985,- V. 33. -P. 275-286.

141. Hardingham TE, Bayliss MT, Rayan V, et al. Effects of growth factors and cytokines on proteoglycan turnover in articular cartilage.// Br J Rheumatol.- 1992.- V. 31.- Suppl 1.-P.1-6.

142. HensonFM, DaviesME, Skepper JN et al'. Localisation of alkaline phosphatase in equine growth cartilage.// J Anat.- 1995.- V. 187.- (Pt 1).-P.151-159.

143. Ho ML, Chang JK, Wu SC, et al. A novel terminal differentiation model of human articular chondrocytes in three-dimensional cultures mimicking chondrocytic changes in osteoarthritis.// Cell Biol Int.- 2006.- V. 30:-P. 288-294.

144. Hollander AP, Heathfield TF, Webber C, et al: Increased damage to type II collagen in osteoarthritic articular cartilage detected by a new immunoassay.// J Clin Invest.- 1994.- V. 93.- P. 1722-1732.

145. Homandberg GA. Cartilage damage by matrix degradation products: fibronectin fragments.// Clin Orthop Relat Res.- 2001.- V. 391.- Suppl-P.-P. S100-107.

146. Horner A, Kemp P, Summers C, et al. Expression and distribution of transforming growth factor-P isoforms and their signalling receptors in growing human bone.// Bone.- 1998.- V. 23.-P.95-102.

147. Hoshi K, Komori T, Ozawa H. Morphological characterization of skeletal cells in Cbfal-deficient mice.// Bone.- 1999.- V. 25-P.639-651.

148. Howell DS, Dean DD, Muniz OE et al. Hypertrophic cell zone growth cartilage contains heparin-binding growth factors.// Trans Orthop Res Soc.-1989.- V. 14-P. 525-531.

149. Hui W, Rowan AD, Cawston TE. Transforming growth factor ß 1 blocks the release of collagen fragments from bovine nasal cartilage stimulated by oncostatin M in combination with interleukin-1.// Cytokine.-2000.-V. 12.-P. 765-769.

150. Hunter GK, Wong KS, Kim JJ. Binding of calcium to glycosaminoglycans: an equilibrium dialysis study.// Arch Biochem Biophys.- 1988.- V. 260. -P.161-167.

151. Hunter DJ, Felson DT. Osteoarthritis.// BMJ.- 2006.- V. 332.-P. 639642.

152. Hunziker EB, Schenk RK. Cruz-Orive LM. Quantitation of chondrocyte performance in growth plate cartilage during longitudinal bone growth.// J Bone Joint Surg Am.- 1987.- V. 69.-P.162-173.

153. Huskinsson EG, Berry H, Gishen P et al. On behalf of the LINK study group.effects of anti-inflammatory drugs on the progression of osteoarthritis of the knee.// J Rheumatol.- 1995.- V. 22.-P. 1941-1946.

154. Jiang J, Leong NL, Mung JC, et al. Interaction between zonal populations of articular chondrocytes suppresses chondrocyte mineralization and this process is mediated by PTHrP.// Osteoarthritis Cartilage.- 2008.- V. 16.-P.70-82.

155. Jimenez MJG, Balbin M, Lopez JM et al. Collagenase-3 is a target of Cbfal, a transcription factor of the runt gene family involved in bone formation://Mol Cell Biol:-1999.- V. 19.-P. 4431-4442.

156. Johansson N, Saarialho-Kere Y, Airiola C, et al. Collagenase-3 (MMP-13) is expressed by hypertrophic chondrocytes, periosteal cells, and osteoblast during human fetal bone development.// Dev Dyn.- 1997.- V. 208.-P. 387-397.

157. Johnson K, Goding J, Van Etten D et al. Linked deficiencies inextracellular PPi and osteopontin mediate pathologic calcification associated with defective PC-1 and ANK expression.// J Bone Miner Res.- 2003;- V. 18.-P. 994-1004.

158. Jubb RW, Piva S, Beinat L, et al. A one-year, randomised, placebo^ (saline) controlled clinical trial of 500-730 kDa sodium hyaluronate (Hyalgan) on the radiological change in osteoarthritis of the knee.// Int J Clin Pract.- 2003.- V. 57.- P. 467-474.

159. Kafienah W, Mistry S, Dickinson SC, et al. Three-dimensional:: cartilage tissue engineering using adult stem cells from.osteoarthritis patients.// Arthritis Rheum.- 2007.- V. 56.-P. 177-187.

160. Kamekura S, Kawasaki Y, Hoshi K, et al. Contribution of runt-related transcription factor 2 to the pathogenesis of osteoarthritis in mice afterinduction of knee joint instability.// Arthritis Rheum.- 2006.- V. 54.-P. 24622470.

161. Karaplis AC, Luz J, Gowacki J et al. Lethal skeletal dysplasia from targeted disruption of the parathyroid hormone-related peptide gene.// Genes, Dev.- 1994.-V. 8.-P. 277-289.

162. Karpousas GA, Terkeltaub RA. New developments in the pathogenesis of articular cartilage calcification.// Curr Rheumatol Reps.-1999.-V. 1.-P.212-217.

163. Kato Y, Iwamoto M. Fibroblast growth factor is an inhibitor of terminal differentiation.// J Biol Chem.- 1990.-V. 110.-P. 1417-1426.

164. Kawashima-Ohya Y, Satakeda H, Kuruta Y, et al. Effects of parathyroid hormone (PTH) and PTH-related peptide on expressions of matrix metalloproteinase-2, -3, and -9 in growth plate chondrocyte cultures.//Endocrinology.- 1998.-V. 139-P. 2120-2127.

165. Kember NF. Cell division in endochondral ossification: a study of cell proliferation in rat bones by the method of tritiated thymidine autoradiography.// J Bone Joint Surg Br.- I960,- V. 42.-P. 824-839.

166. Kempson GE, Muir H, Pollard C, et al. The tensile properties of the cartilage of humanfemoral condyles related to the content of collagen and glycosaminoglycans.//Biochim Biophys Acta.- 1973.- V. 297.-P.465-472.

167. Kempson GE. Age-related changes in the tensile properties of human articular cartilage: a comparative study between the femoral head of the hip joint and the talus of the ankle joint.// Biochim Biophys Acta.- 1991,- V. 1075.-P. 223-230.

168. Kim HA, Suh DI, Song YW. Relationship between chondrocyte apoptosis and matrix depletion in human articular cartilage.// J Rheumatol.-2001.- V. 28.-P. 2038-2045.

169. Kim HA, Song YW. Apoptotic chondrocyte death in rheumatoid arthritis.// Arthritis Rheum.- 1999.-V. 42.-P. 1528-1537.

170. Kirsch T, Swoboda B, Nah H. Activation of annexin II and Vexpression- terminal differentiation, mineralization and apoptosis in human osteoarthritic cartilage.// Osteoarthritis,Cartilage.- 2000.- V. 8.-P. 294-302:

171. Kitahara H, Hayami T, Tokunaga K, et al: Chondromodulin-I expression in rat articular cartilage.// Arch Histol Cytol.- 2003.- V. 66.-P. 221-228.

172. Klatt ARj.Klinger G, Neumiiller O, et al. TAK1 downregulation reduces IL-lbeta induced expression of MMP13, MMP1 and TNF-alpha.// Biomed Pharmacother.- 2006.- V. 60.-P.55-61.

173. Knauper V, Lopez-Otin C, Smith B et al. Biochemical characterizatrion of human collagenase-3.//J BioLChem.- 1996.- V. 271.-P.1544-1550.

174. Knauper V, Will H, Lopez-Otin C et al. Cellular mechanisms for human procollagenase-3 (MMP-13) activation: evidence that MT1-MMP (MMP-14) and gelatinase A (MMP-2) are able to generate active enzyme.// J Biol Chem.- 1996.- V. 271.-P. 17124-17131.

175. Knott I, Dieu M^ Burton M, et al. Induction of cyclooxygenase by interleukin 1: Comparative study between human synovial cells and chondrocytes.// J Rheumatol.- 1994.- V. 21 .-P. 462-466.

176. Kobayashi Mj Squires GR^ Mousa A, et al. Role of interleukin 1 and tumor necrosis factor alpha in matrix degradation of human osteoarthritic cartilage.// Arthritis Rheum.- 2005.- V. 52.-P. 128-135.

177. Komori T, Yagi H, Nomura S, et al. Targeted disruption of Cbfal results in a complete lack of bone formation owing to maturational arrest of osteoblasts.// Cell.- 1997.- V. 89.-P. 755-764.

178. Komori T. A fundamental transcription factor for bone and cartilage.// Biochem Biophys Res Commun.- 2000.- V. 276.-P.813-816.

179. Konttinen YT, MordelinJ, Li T-F et al. Acidic endoproteinase cathepsin K in the degeneration of the superficial articular hyaline cartilage in osteoarthritis.// Arthritis Rheum.- 2002.- V. 46.-P.953-960.

180. Kopsidas G Kovalenko SA, Kelso JM et al. An age-associated correlation between cellular bioenergy decline and mtDNA rearrangements in human skeletal muscle.// Mutat Res.- 1998.- V. 421-P.27-36.

181. Kronenberg HM. PTHrP and skeletal development.// Ann N Y Acad Sci.- 2006.-V. 1068-P.1-13.

182. Kuhn K, D'Lima DD, Hashimoto S, Lotz M. Cell death in cartilage.// Osteoarthritis Cartilage.- 2004.- V.12.-P. 1-16.

183. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.//Nature.- 1970.- v. 227.-P.680-685.

184. Lafyatis R, Kim S-J, Angel P et al. Interleukin-1 stimulates and all-trans-retinoic acid inghibits collagenasegene expression through its 58 activator protein-1-binding site.// Mol Endocrinol.- 1990.- V. 4.-P. 873-980.

185. Lanske B, Karaplis AC, Lee K et al. PTH/PTHrP receptor in early development and Indian hedgehog-regulated bone growth.// Science.- 1996.-V. 273.-P.663-666.

186. Lark MW, Bayne EK, Flanagan J et al. Aggrecan degradation in human cartilage: evidence for both matrix metalloproteinase and aggrecanase activity in normal osteoarthritic and rheumatoid joints.// J Clin Invest.-1997.-V. 100.-P. 93-106.

187. Lee ER, Smith CE, Poole AR. Ultrastructural localization of the C-propeptide released from type II procollagen in fetal bovine growth plate cartilage.// J Histochem Cytochem.- 1996.- V. 44.- P. 433-443.

188. Lee ER, Matsui Y, Poole AR. Immunochemical and immunocytochemical studies of the c-propeptide of type II procollagen in chondrocytes of the growth plate.// J Histochem Cytochem.- 1990.- V. 38.-P. 659-673.

189. Li- C, Chen L, Iwata T, et al: A Lys644Glu substitution in fibroblast, growth factor receptor 3 (FGFR3) causes dwarfism in mice by activation of STATs and ink4 cell cycle inhibitors.// Hum Mol Genet.- 1999.- V. 8.-P.35-44.

190. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.//Nature.- 1970.- V. 227.-P. 680-685.

191. Li TF, Dong Y, Ionescu AM, et al. Parathyroid hormone-related peptide (PTHrP) inhibits Runx2 expression through the PKA signaling pathway.// Exp Cell Res.- 2004.- V. 299.-P. 128-136.

192. Li TF, Darowish M, Zuscik MJ, et al. Smad3-deficient chondrocytes have enhanced BMP signaling and accelerated differentiation.// J Bone Miner Res.- 2006.- V. 21.-P. 4-16.

193. Li T-F, Zuscik MJ, Ionescu AM, et al. PGE2 inhibits chondrocyte differentiation through PKA and PKC signaling.// Exp Cell Res.- 2004.- V. 300.-P. 159-169.

194. Liacini A, Sylvester J, Li WQ et al. Induction of matrix metalloproteinase-13 gene expression by TNFa is mediated by MAP kinases, AP-1, and NFkB transcription factors in articulr chondrocytes.- Exp Cell Res.- 2003.- V. 288.-P. 208-217.

195. Lingetti M, D'Ambrosio, Grezia F, et al. A controlled study in the treatment of osteoarthritis with diacerein (Artrodar).// Curr Therp Res.-1982.- V.31.-P. 408-412.

196. Lo YYC, Cruz TF. Reactive oxygen species mediate cytokine activation of c-Jun NH2-terminal kinases.// J Biol Chem.- 1996,- V. 271.-P. 15703-15707.

197. Lo YYC, Cruz TF. Involvement of reactive oxygen speciaes in cytokine and growth factor induction of c-fos expression in chondrocytes.// J Biol Chem.- 1995.- V. 270.-P. 11727-11730.

198. Lorenz JJ, Furdon PJ, Taylor JD, et al. A cyclic adenosine 3',5'-monophosphate signal is required for the induction of IL-ip by TNF-a in human monocytes.//J Immunol.- 1995.-V. 155.-P. 836-844.

199. Lorenz H, Richter W. Osteoarthritis: cellular and molecular changes in degenerating cartilage.// Prog Histochem Cytochem.- 2006,- V. 40.-P. 135-163.

200. Lotz M, Guerne P-A. Interleukin-6 induces the synthesis of tissue inhibitor of metalloproteinases-l/erythroid potentiating activity (TIMP-1/EPA).// J Biol Chem.- 1991.- V. 266-P. 2017-2020.

201. Lowe GN, Fu YH, McDougall S, et al. Effects of prostaglandins on deoxyribonucleic acid and aggrecan synthesis in the RCJ 3.1C5.18 chondrocyte cell line: role of second messengers.// Endocrinology.- 1996.-V. 137.-P. 2208-2216.

202. Luo C, He M-L, Bohlin L. Is COX-2 a perpetrator or a protector?' Selective COX-2 inhibitors remain controversial.// Acta Pharmacol Sin.-2005.- V. 26.-P. 926-933.

203. Ma Q, Li X, Vale-Cruz D, Brown ML, et al. Activating transcription factor 2 controls Bcl-2 promoter activity in growth plate chondrocytes.// J Cell Biochem.- 2007.- V. 101.-P.477-487.

204. Mankin HJ, Dorfman H, Lipiello L et al. Biochemical and metabolic abnormalities'in articular cartilage from osteo-arthritic human hips. II. Correlation of morphology with biochemical and metabolic data.// J Bone Joint Surg.- 1971.- V. 53A.-P. 523-537.

205. Marcolonge R, Fioravanti A, Adami S, et al. Efficacy and tolerability of diacerein in the treament of osteoarthrosis.// Gurr Therp Res.- 1988.- V. 37.-P. 529-536.

206. Martin I, Jakob M, Schafer D, et al. Quantitative analysis of gene, expression in human articular cartilage from normal and osteoarthritic joints.// Osteoarthritis Cartilage.- 2000.- V. 9. -P. 112-118.

207. Martin JA &Buckwalter JA. Telomere erosion and senescence in human articular cartlage chondrocytes.// J Gerontol A Biol Sei Med Sci.-2001.- V. 56.-P. 172-179.

208. Mastbergen SC, Jansen NWD, Bijisma JWJ, et al. Differential direct effects of cyclo-oxygenase-1/2 inhibition on proteoglycan turnover of human osteoarthritic cartilage: an in vitro study.// Arthritis Res Ther.-2006.- V. 8-P. R2.

209. Matsui Y, Alini M, Webber C et al. Characterization of aggregating proteoglycans from the proliferative, meturing, hypertrophic and calcifying zones of the cartilaginous physis.// J Bone Joint Surg Am.- 1991.- V. 73.-P. 1064-1074.

210. Mätsumoto T, Tsukazaki T, Enomoto H et al. Effects of interleukin-lß on insulin-like growth factor-1 autocrine/paracrine axis in culture rat articular chondrocytes.// Ann Rheum Dis.- 1994.- V. 53.-P.128-133.

211. Matsunaga S, Yamamoto T, Fukumura K. Temporal and spatial expressions of transforming growth factor-betas and their receptors in epiphyseal growth plate.// Int J Oncol.- 1999.- V. 14.- P. 1063-1067.

212. Mattews JL, Martin HW, Sampson AS. Et al. Mitochondrial granules in the normal and rachitic rat epyphysis.// Calcified Tissue Res.- 1970.- V. 5.-P. 91-99.

213. Matyas JR, Huang D, Chung M, et al. Regional quantification of cartilage type II collagen and aggrecan messenger RNA in joints with early experimental osteoarthritis.// Arthritis Rheum.- 2002.- V. 46.-P. 1536-1543.

214. Mazieres B, Berda L. Effect of diacerein (ART 50) on an experimental post-contusive model of OA.// Osteoarthritis Cart.- 1993.- V. 1-P. 47.

215. Melchiorri C, Meliconi R, Frizzizro L et al. Enhanced and coordinated in vivo expression of inflammatory cytokines and nitric oxide suynthase by chondrocytes from patients with osteoarthritis.// Arthritis Rheum.- 1998.-V. 41-P.2165-2174.

216. Melov S. Mitochondrial oxidative stress. Physiologic consequences and potential for a role in aging.// Ann NY Acad Sei.- 2000.- V. 908-P. 219225.

217. Mengshol JA, Vincenti MP, Coon CI et al. Interleukin-1 induction of collagenase 3 (matrix metalloproteinase 13) gene expression in chondrocytes requires p38, C-JUN N-terminal kinase and nuclear factor Kß.// Arthritis Rheum.- 2000.- V. 43 .-P.801-811.

218. Middleton JFS, Tyler JA. Upregulation of insulin-like growth factor 1 gene expression in the lesions of osteoarthritic human articular cartilage.// Ann Rheum Dis.- 1992.- V. 51.-P.440-447.

219. Milner JM, Elliot S-F, Cawston TE. Activation of procollagenases is a key control point in cartilage collagen degradation. Interaction of serine and metalloproteinase pathways.// Arthritis Rheum,- 2001,- V. 44. -P.2084-2096.

220. Miosge N, Hartmann M, Maelicke C, et al. Expression of collagen type I and type II in consecutive stages of human osteoarthritis.// Histochem Cell Biol.- 2004.- V. 122.-P. 229-236.

221. Mitchel PH, Magna HA, Reeves LM et al. Cloning, expression and type I collagenolytic activity of matrix metalloproteinase-13 from human osteoarthritic cartilage.// J Clin Invest.- 1996.- V. 97.-P. 761-768.

222. Mitrovic D, Quintero M, Stankovic A, et al. Cell density of adult human femoral condylar articular cartilage: joints with normal and fibrillated surfaces.// Lab Invest.- 1983.- V. 49.-P. 309-316.

223. Miwa M, Saura R, Hirata S, et al. Induction of apoptosis in bovine articular chondrocyte by prostaglandin E2 through cAMP-dependent pathway.// Osteoarthritis Cartilage.- 2000.- V. 8.- P. 17-24.

224. Moldovan F, Pelletier JP, Mineau F, et al. Modulation of collagenase 3 in human osteoarthritic cartilage by activation of extracellular transforming growth factor beta: role of furin convertase.// Arthritis Rlieum.-2000.- V. 43.-P. 2100-2109.

225. Morales TI, Wahl LM, Hascall VC. The effect of bacterial lipopolysaccharides on the biosynthesis and release of proteoglycans from calf articular cartilage cultures.// J Biol Chem.- 1984.- V. 259.-P. 67206729.

226. Morales TI. Transforming growth factor-beta and insulin-like growth factor-1 restore proteoglycan metabolism of bovine articular cartilage after depletion by retinoic acid.//Arch Biochem Biophys.- 1994.-V. 315.-P. 190198.

227. Morales TI. The insulin growth factor binding proteins in uncultured human cartilage. Increases in insulin-like growth factor binding proteins during osteoarthritis.// Arthritis Rheum.- 2001.- V. 44.-P. 578-584.

228. Morreale P, Manopulo R, Galati Met al. Comparison of the antiinflammatory efficacy of chondroitin sulphate and diclofenac sodium in patients with knee osteoarthritis.// J Rheumatol.- 1996.- V. 23.-P.1385-1391.

229. Mort JS, Magny M-C, Lee ER. Cathepsin B an alternative protease for generation of an aggrecan "metalloproteinase"cleavage neoepitope.// Biochem J.- 1998 .- V. 335.-P. 491-494.

230. Mort JS, Poole AR. Mediators of inflammation, tissue destruction and repair. Protease and their inhibitors./ In: Klippel JH, ed. Primer in the rheumatic diseases. 12th ed. Atlanta:Arthritis Foundation.- 2001.-P.72-81.

231. Muir IHM. Biochemistry./ In: Freeman MAR, ed. Adult articular cartilage, 2nd ed. Tunbridge Wells, UK:Pitman Medical.- 1979.-P. 145214.

232. Murphy G, Cockett MI, Stephens PE et al. Stromelysin is an activator of procollagenase: a study with natural and recombinant enzymes.// Biochem J.- 1987.- V. 248.-P. 265-268.

233. Mwale F, Demers CN, Petit A, et al. A synthetic peptide of link protein stimulates the biosynthesis of collagens II, IX and proteoglycan by cells of the intervertebral disc.//J Cell Biochem.- 2003.- V. 88.-P. 12021213.

234. Mwale F, Billinghurst C, Wu W, et al. The assembly and degradation of types II and IX collagens associated with expression of the hypertrophic phenotype.// Dev Dyn.- 2000.- V. 218.-P. 648-662.

235. Myers SL, Brandt KD, Burr DB, et al. Effects of a bisphosphonate on bone histomorphometry and dynamics in the canine cruciate deficiency model of osteoarthritis.// J Rheumatol.- 1999.- V. 26.- P. 2645-2653.

236. Nagai H, Aoki M. Inhibition of growth plate angiogenesis and endochondral ossification with diminished expression of MMP-13 in hypertrophic chondrocytes in FGF-2-treated rats.// J Bone Miner Metab.-2002.- V. 20.-P. 142-147.

237. Nemoto О, Yamada H, Mukaida M et al. Stimulation of TIMP-1 production by oncostatin M in human articular cartilage.// Arthritis Rheum.-1996.- V. 39.-P.560-566.

238. Neriich AG, Wiest I, von der Mark K. Immunohistochemical analysis of interstitial collagens in cartilage of different"stages of osteoarthrosis.// Virchows Arch.- 1993.- V. B63.- P. 249-255.

239. Neuhold LA, Killar L, Zhao W, et al. Postnatal expression in hyaline cartilage of constitutively active human collagenase-3 (MMP-13) induces osteoarthritis in mice.// J Clin Invest.- 2001.- V. 107.-P. 35-44.

240. Ng LJ, Wheatley S, Muscat GEO, et al. Sox9 binds DNA, activates transcription, and coexpresses with type II collagen during chondrogenesis in the mouse.//Dev Biol.- 1997.-V. 183.-P. 108-121.

241. Nicolae C, Ko YP, Miosge N et al. Abnormal collagen fibrils in cartilage of matrilin-l/matrilin-3-deficient mice.//J Biol Chem.- 2007.- V. 282.-P. 22163-22175.

242. Nilsson O, Parker EA, Hegde A, et al. Gradients in bone morphogenetic protein-related gene expression across the growth plate.// J Endocrinol.- 2007.- V. 193.-P. 75-84.

243. Ohlsson C, Isgaard J, Törnell J, et al. Endocrine regulation of longitudinal bone growth.//ActaPaediatr Suppl.- 1993.- V. 82.- Suppl 391.-P.33-40.

244. Ohuchi E, Imai K, Fuji Y, et al. Membrane type 1 matrix metalloproteinase digests interstitial collagens and.other extracellular matrix macromolecules.// J Biol Chem.- 1997.- V. 272.-P. 2446-2451.

245. O'Keefe RJ, Crabb ID, Puzas JE, et al. Influence of prostaglandins on DNA and matrix synthesis in growth plate chondrocytes.// J Bone Miner Res.- 1992.- V. 7.-P.397-404.

246. Pacific! M; Shimo T, Gentiii C, et al. Syndecan-3: a cell-surface heparan sulfate proteoglycan important for chondrocyte proliferation and* function during limb skeletogenesis.// J-Bone Miner Metab.- 2005.- V. 23.-P.191-199.

247. Pavelka KJ, Sedlackova M, Gatterova J et al. GAGPS (Arteparona) in osteoarthritis of the knee.// Osteoarthritis .- 1995,-V. 3.-P; 15-23.

248. Pelletier J-P, Martel-Pelletier J, Raynauld J-P. Most recent developments in strategies to reduce the progression of structural changes in osteoarthritis: today and tomorrow.// Arthritis Res Ther.- 2006.- V. 8.-P. 206-220.

249. Pfander D, Rahmanzadeh R, Scheller EE. Presence and distribution of collagen II, collagen I, fibronectin, and tenascin in rabbit normal and osteoarthritic cartilage.// J Rheumatol.- 1999.- V. 26.-P. 386-394.

250. Pickvance EA, Oegema J-R, Thompson RC. Immunolocalization of selected cytokines and proteases in canine articular cartilage transarticular loading.//J Orthop Res.- 1993.-V. 11.-P. 313-323.

251. Poole AR, Ionescu M; Fitzcharles MA, et al. The assessment of cartilage degradationin vivo: development of an immunoassay for the measurement in body fluids of typeiP collagen-cleaved by collagenases.// Ji Immunol'Methods.- 2004.- 294.-P.145-153.

252. Poole AR, Ionescu M, Swan A, et al. Changes in cartilage metabolism in arthritis are reflected by altered serum and synovial fluid levels of the cartilage proteoglycan aggrecan. Implications for pathogenesis.// JClin Invest.- 1994.- V. 94.-P. 25-33.

253. Poole AR, Nelson F, Tchetina E, et al. Proteolysis of the collagen fibril in osteoarthritis.// Biochem Soc Symp.- 2003.- V. 70.-P.115-123.

254. Poole AR. The growth plate: Cellular physiology, cartilage assembly and mineralization./ In: Hall B, Newman S (eds.) Cartilage: Molecular Aspects. CRC Press, Boca Raton, FL, USA.- 1991.- P. 179-211.

255. Poole AR, Pidoux I, Reiner A, et al. Association of an extracellular protein (chondrocalcin) with the calcification of cartilage in endochondral bone fromation.// J Cell Biol.- 1984.- V. 98-P.54-65.

256. Poole AR, Alini M, Hollander AP. Cellular biology of cartilage degradation./ In: Henderson B, Pettifer R, Edwards J, eds. Mechanisms and models in rheumatoid »arthritis. London:Academic.- 1995.- P.163-204.

257. Poole AR, Howell DS. Etiopathogenesis of osteoarthritis. /In: Osteoarthritis: Diagnosis and Medical/Surgical Management, ed 3. Edited by RW Moskowitz, Howell DS, Altman RD, Buckwalter JA, Goldberg VM. Philadelphia, WB Saunders Co.- 2001.-P. 29-47.

258. Poole AR, Pidoux I, Reiner A et al. An immunoelectron microscope study of the organization of proteoglycan monomer, link protein and collagen in the matrix of articular cartilage.// J Cell Biol.- 1982.- V. 93 .-P. 921-937.

259. Poole AR, Rosenberg LC, Reiner A, et al. Contents and distribution of the proteoglycans decorin and biglycan in normal and osteoarthritic human articular cartilage.// J Orthop Res.- 1996.- V. 14.-P. 681-689.

260. Poole AR, Webber C, Pidoux I, et aK Localization of a dermatan sulphate proteoglycan in cartilage and the presence of an immunologically related species in other tissues.// J Histochem Cytochem.- 1986.- V.34.-P. 619-625.

261. Poole AR: Cartilage in health and disease./ In: Arthritis and Allied Conditions: A Textbook of Rheumatology, ed 15. Edited by Koopman W. Philadelphia, Lippincott, Williams, and Wilkins.- 2005.-P. 223-269.

262. Poole AR: What type of cartilage repair are we attempting to attain?// J Bone Joint Surg.- 2003.- V. 85A.-(Suppl 2).-P. 40-44.

263. Porte D, Tuckermann J, Becker M, et al. Both AP-1 and Cbfal-like factors are required for the induction of interstitial collagenase by parathyroid hormone.// Oncogene.- 1999.-V. 18.-P. 667-678.

264. Price JS, Bickerstaff DR, Bayliss MT et al. Degradation of cartilage type II collagen precedes the onset of osteoarthritis following anterior cruciate ligament rupture.// Arthritis Rheum.- 1999.- V. 42.-P. 2390-2398.

265. Pringle GA, Dodd CM. Immunoelectron microscopic localization of the core protein of decorin near the d- and e-bonds of tendon collagen fibrils by use of monoclonal antibodies.// J Histochem Cytochem.- 1990.- V. 38.-P. 1504-1411.

266. Pullig O, Weseloh G, Ronneberger D, et al. Chondrocyte differentiation in human osteoarthritis: expression of osteocalcin in normal and osteoarthritic cartilage and bone.// Calcif Tissue Int.- 2000 .- V. 67.-P.23 0-240.

267. Quintavaila J, Kumar C, Daouti S, et al. Chondrocyte cluster formation in agarose cultures as a functional assay to identify genes expressed in osteoarthritis.// J Cell Physiol.- 2005.- V. 204.-P. 560-566.

268. Rantakokko J, Aro-HT, Savontaus M, et al. Mouse cathepsin K: cDNA cloning and predominant! expression of the gene in osteoclasts, and in some hypertrophy ingchondrocytes during mouse development;// FEBS Lett.- 1996.- V. 393.-P.307-313.

269. RayiA, KwokoK, GookJE et al. Induction of matrix metalloproteinase geneexpressionisregulatedby inflammation-responsivetranscription factor SAF-1 in osteoarthritis.// Arthritis Rheum.- 2003.-V. 48-P. 134-145:

270. Reginato AM, Lash JW, Jimenez SA. Expression of type X collagen mRNA levels in embryonic chick sternum during development.// Biochem Biophys Res Commun.- 1986.- V. 137.-P.1125-1132.

271. Renkiewicz R, Qiu L, Lesch C, et al. Broad-spectrum matrix metalloproteinase inhibitor marimastat-induced musculoskeletal side effects in rats.// Arthritis Rheum.- 2003.- V. 48.- P. 1742-1749.

272. Rothwell AG, & Bentley G. Chondrocyte multiplication in osteoarthritic articular cartilage.// J Bone Joint Surg.- 1973.- V. 55B.-P. 588594.

273. Roughley PJ, White RJ, Poole AR. Identification of a hyaluronic acid-binding protein that interferes with the preparation of high buoyant density proteoglycan,aggregates from adult human articular cartilage.// Biochem'J.-1985.-V. 231.-P.129-138.

274. Rudolphi K, Gerwin N, Verzijl N, et al. Pralnacasan, an inhibitor of. interleukin-lbeta converting enzyme, reduces joint damage in two murine models of osteoarthritis.// Osteoarthritis Cartilage.- 2003.- V. 11.- P. 738746.

275. Sakou T, Onishi T, Yamamoto T, et al. Localization of Smads, the TGF-beta family intracellular signaling components during endochondral ossification.//J Bone Miner Res.- 1999.-V. 14.-P. 1145-1152.

276. Saha N, Moldovan F, Tardif G, et al. Interleukin-1 ß-converting enzyme/Caspase-1 in human osteoartliritic tissues: Localization and role in the maturation of IL-lß and IL-18.// Arthritis Rheum.- 1999.- V. 42.-P. 1577-1587.

277. Sakiyama H, Inaba N, Toyoguchi T, et al. Immunolocalization of complement Cls and matrix metalloproteinase 9 (92kDa gelatinase/type IV collagenase) in the primary ossification center of the human femur.// Cell Tissue Res.- 1994.- V. 277.-P. 239-245.

278. Salvatory R, Guidon PT, Rapuano BE, et al. Prostaglandin El inhibits collagenase gene expression in,rabbit synoviocytes and human fibroblasts.// Endocrinology.- 1992.- V.131.-P. 21-28.

279. Sandberg M, Vuorio E. Localization of types I. II and III collagen mRNAs in developing human skeletal tissue by in situ hybridization.// J Cell Biol.- 1987.-V. 104.-P. 1077-1084.

280. Sandel LJ, Aigner T. Articular cartilage and changes in arthritis. An introduction: cell biology of osteoarthritis.// Arthritis Res.- 2001.- V. 3.-P. 107-113.

281. Sandy JD, Neame PJ, Boyton RE et al. Catabolism of aggrecan in cartilage expiants: identification of a major cleavage site within the interglobular domain.// J Biol Chem.- 1991.- V. 266.-P. 8683-8685.

282. Sanford LP, Ormsby I, Gittenberger-de Groot AC, et al. TGFß2 knockout mice have multiple developmental defects that are nonoverlapping with other TGFß knockout phenotypes.// Development.- 1997.-V. 124.-P. 2659-2670.

283. Scharstuhl A, Glansbeek HL, van Beuningen HM; et al. Inhibition of endogenous TGFbeta during experimental osteoarthritis prevents osteophyte formation and impairs.cartilage repair.// J Immunol 2002.- V. 169.-P.507-514.

284. Scharstuhr A, van Beuningen HM, Vitters EL et al. Loss of Transforming growth factor counteraction on interleukin-1 mediated effects in cartlage of old mice.// Ann Rheum Dis.- 2002.- V. 61.-P. 1095-1098.

285. Schenk RK, Wiener J, Spiro D. Fine structural aspects of vascular invasion of the tibial epiphyseal plate of growing rats.// Acta Anat .-1968.-V. 69.-P.1-17.

286. Schneiderman R, Rosenberg N, Hiss J et al. Concentration and distribution of insulin-like growth factor-2 in human normal and osteoarthritic synovial fluid and cartilage.// Arch Biochem Biohys.- 1995.- V. 324.-P. 173-188.

287. Schwartz Z, Gilley RM, Sylvia VL, et al. The effect of prostaglandin E2 on costochondral chondrocyte differentiation is mediated by cyclic adenosine 3',5'-monophosphate and protein kinase C.// Endocrinology .-1998.-V. 139.-P. 1825-1834.

288. Semevolos SA, Strassheim ML, Haupt JL, et al. Expression patterns of hedgehog signaling peptides in naturally acquired equine osteochondrosis.// J Orthop Res.- 2005.- V. 23.-P. 1152-1159.

289. Serra R, Karaplis A, Sohn P. Parathyroid hormone-related peptide (PTHrP)-dependent and -independent effects of transforming growth factorbeta (TGF-beta) on endochondral boneformation.// J'Cell Biol.- 1999:- V. 145.-P. 783-794.

290. Serra R, Johnson M, Filvaroff EH, et al. Expression of a truncated!, kinase-defective TGF(3 type II receptor in mouse skeletal tissue promotes terminal, chondrocyte differentiation and osteoarthritis.// J Cell Biol.- 1997.-V. 139.-P.541-552.

291. Setton LA, Mow VC, Muller FJ et al. Mechanical properties of canine articular cartilage are significantly altered following transaction of the anterior cruciate ligament.//J Orthop Res.- 1994.- V. 12.-P.451-463.

292. Schiff MH, DiVittorio G, Tesser J, et al. The safety of anakinra in high risk patients with active rheumatoid arthritis: six-month observations of patients with comorbid conditions.// Arthritis Rheum.- 2004.- V. 50.- P. 1752-1760.

293. Shapiro IM, Adams CS, Freeman T, et al. Fate of the hypertrophic chondrocyte: microenvironmental perspectives on apoptosis and survival in the epiphyseal growth plate.// Birth Defects Res C Embryo Today.- 2005.-V. 75.-P. 330-339:

294. Shida J-I, Jingushi S, Izumi T, et al Basic fibroblast growth factor regulates expression of growth factors in rat epiphyseal chondrocytes.// J Orthop Res.- 2001.- V. 19.-P. 259-264.

295. Shinar DM, Endo N, Halperin D, et al. Differential expression of insulin-like growth factor-I (IGF-I) and IGF-II messenger ribonucleic acid in growing rat bone.// Endocrinology.- 1993.- V. 132.-P. 1158-1167.

296. Shull MM, Ormsby I, Kier AB, et al. Targeted disruption of the mouse transforming growth factor-beta 1 gene results in multifocal inflammatory disease.// Nature.- 1992.- V. 359.-P. 693-699:

297. Smith GN, Jr., Myers SL, Brandt KD, et al. Diacerhein treatment reduces the severity of osteoarthritis in the canine cruciate-deficiency model of osteoarthritis.// Arthritis Rheum.- 1999.- V. 42.-P. 545-554.

298. Smith P, Shuler FD, Georgescu HI, et al. Genetic enhancement of matrix synthesis by articular chondrocytes.// Arthritis Rheum.- 2000.- V. 43.-P. 156-164.

299. Söderström M, Salminen H, Glumoff V, et al. Cathepsin expression during skeletal development.//Biochim Biophys Acta.- 1999.- V. 1446.-P. 35-46.

300. Spector TD, Conaghan PG, Buckland-Wright JC, et al. Effect of risedronate on joint structure and symptoms of knee osteoarthritis: results of the BRISK randomized, controlled trial.// Arthritis Res Ther.- 2005.- V. 7.-P. R625-633.

301. Squires G, Okouneff S, Ionesku M et al. Pathobiology of focal lesion development in aging human articular cartilage reveals molecular matrixchanges characteristic of osteoarthritis. //Arthritis Rheum.- 2003.- V. 48.-P. 1261-1270.

302. Squires GR, Pidoux I, Okouneff S, et al. The development of focal lesions in aging human articular cartilage involves molecular changes in type II collagen and aggrecan characteristic of osteoarthritis.// Arthritis Rheum.- 2002:- V. 48.-P. 1261-1270:

303. Stewart MC, Kadlcek RM; Robbins PD, et al. Expression and activity of the CDK inhibitor p57Kip2 in chondrocytes undergoing hypertrophic differentiation.// J Bone Miner Res.- 2004.- V. 19.-P.123-132.

304. St-Jacques B, Hammerschmidt M, McMahon AP. Indian hedgehog signaling regulates proliferation and differentiation of chondrocytes and is essential for bone formation.// Genes Dev.- 1999.- V. 13.-P. 2072-2086.

305. Stockwell R. The interrelationship of cell density and cartilage thickness in mammalian articular cartilage.// J Anat.- 1971.- V. 109.-P. 411421

306. Stockwell RA, Meachin G. The chondrocytes./ In: Freeman MAR, ed. Adult articular cartilage, 2nd ed. Tunbrige Wells, UK:Pitman Medical.-1979.-P. 69-144.

307. Stocum DL, Davis RM, Leger M, et al. Development of the tibiotarsus in the chick embryo: biosynthetic activities of histologically distinct regions.// J Embryol Exp Morphol.- 1979.- V. 54-P. 155-170.

308. Stoop R, van der Kraan PM, Buma P et al. Type II collagen degradation in spontaneous osteoarthritis in C57/B1/6 and BALB/c mice.// Arthritis Rheum.- 1999.- V. 42.-P. 2381-2389.

309. Sweet M, Thonar E, Immelman A et al. Biochemical changes inprogressive osteoarthritis.// Ann Rheum Dis.- 1977.- V. 36.-P. 387-398.

310. Sztrolovics R, White RJ, Poole ART et al. Resistance of small leucine rich repeat proteolycans to proteolytic during interleukin-1 stimulated cartilage.// Biochem J.- 1999.- V. 339.-P. 571-577.

311. Szuts V, Mollers U, Bittner K, et al. Terminal differentiation of chondrocytes is arrested at distinct stages identified by their expression repertoire of marker genes.// Matrix Biol.- 1998.- V. 17.-P. 435-4481

312. Takahashi T, Morris EA, Trippel SB. Bone morphogenetic protein-2 and -9 regulate the interaction of insulin-like growth factor-I with growth plate chondrocytes.// Int J Mol Med.- 2007.-V. 20.-P. 53-57. •

313. Takahashi T, Ogasawara T, Asawa Y, et al. Three-dimensional microenvironments retain chondrocyte phenotypes during proliferation culture.// Tissue Eng.- 2007.- V. 13.-P.1583-1592.

314. Fernandes JC, Martel-Pelletier J, Pelletier JP. The role of cytokines in osteoarthritis pathophysiology.// Biorheology. 2002.- V.- 39.- P.- 237-246.

315. Teree TM, Klein L. Hypophosphatasia, clinical and metabolic studies.//J:Pediatr.- 1986.- V.- 72.-P.50-57.

316. Tetlow LC, Adlàm D J~ Woolley DE. Matrix metalloproteinase and5 proinflammatory cytokine production by chondrocytes of human osteoarthritic cartilage: associations with degenerative changes.// Arthritis Rheum.- 2001.- V. 44.-P. 585-5941

317. Thomas JT, Grant ME. Cartilage proteoglycan aggregate and fibronectin can modulate the expression of type X collagen by embryonic chick chondrocytes cultured in collagen gels.//Biosci Rep.- 1988;-V. 8i-P. 163-171.

318. Thomas CM, Fuller CJ, Whittles CE, Sharif M. Chondrocyte death by apoptosis is associated with cartilage matrix degradation.// Osteoarthritis Cartilage.- 2007.- V. 15.-P. 27-34.

319. Tiku ML, Liesch JB, Robertson FM. Production of hydrogen peroxide by rabbit articular chondrocytes : enhancement by cytokines.// J Immunol.-1990.- V. 145.-P. 690-696.

320. Tortorella MD, Burn TC, Pratta MA et al. Purification and*cloning of aggrecanase-1: a member fámily of proteins.// Science.- 1999.- V. 284.-P. 1664-1666.

321. Trippel SB. Growth factor inhibition. Potential role in the etiopathogenesis of osteoarthritis.// Clin Orthop Rel Res.- 2004.- V. 427.- P. S47-S52.

322. Ueta C, Iwamoto M, Kanatani N, et al. Skeletal malformations caused by overexpression of Cbfal or its dominant negative form in chondrocytes.// J Cell Biol.- 2001.-V. 153.-P. 87-100.

323. Uría JA, Balbín M, López JM, et al. Collagenase-3 (MMP-13) expression in chondrosarcoma cells and its regulation by basic fibroblast growth factor.//Am J Pathol.- 1998.-V. 153.-P. 91-101.

324. Uría JA, Jiménez MG, Balbín M, et al. Differential effects of transforming growth factor-beta on the expression of collagenase-1 and' collagenase-3 in human fibroblasts.// J Biol Chem.- 1998.- V. 273 .-P. 97699777.

325. Van Meurs J, van Lent P, Stoop R et al. Cleavage of aggrecan at the ASN341-PHE342 site coincides with the initiation of collagen damage in murine antigen-induced arthritis.// Arthritis Rheum.- 1999.- V. 42.-P. 20742084.

326. Van Meurs JB, van Lent PL, Holthuysen AE et al. Kinetics of aggrecanase-and metalloproteinase-induced neoepitopes in various stages of cartilagedestruction in murine arthritis.// Arthritis Rheum.- 1999.- V. 42.-P.1128-1139.

327. Van Wart HE, Birkedl-Hansen H. The cystein switch: a principal of regulätion of metalloproteinases activity with potential applicability to the entire matrix metalloproteinase gene family.// Proc Natl Acad1 Sei USA> 1990.- V. 87.-P. 364-3681

328. Veje K, Hyllested-Winge JL, Ostergaard K. Topographic and zonal distribution of tenascin in human articular cartilage from femoral heads: normal versus mild and severe osteoarthritis.// Osteoarthritis Cartilage.-2003.- V. 11-PJ 217-227.

329. Venn MF. Variation of chemical composition with age in human femoral head cartilage.// Ann Rheum Dis.- 1978.- V. 37-P.168-174.

330. Verdier M-P, Seite S, Guntzer K, et al. Immunohistochemical analysis of transforming growth factor beta isoforms and their receptors in human cartilage from normal and osteoarthritic femoral heads.// RheumatoLInt.-2005.- V. 25.-P. 118-124.

331. Vortkamp A, Lee K, Lanske B; Segre GV, et al. Regulation of rate of cartilage differentiation by Indian hedgehog and PTH-related protein.// Science.- 1996.- V. 273.-P. 613-22.

332. Wang W, Kirsch T. Annexin V/beta5 integrin interactions regulate apoptosis of growth plate chondrocytes.// J Biol Chem. -2006.- V. 281.-P. 30848-30856.

333. Wang X, Manner PA, Horner A, et al. Regulation of MMP-13 expression by RUNX2 and FGF2 in osteoarthritic cartilage.// Osteoarthritis Cartilage.- 2004.- V. 12.-P. 963-973.

334. Wang Y, Middleton F, Horton JA, et al. Microarray analysis of proliferative and hypertrophic growth plate zones identifies differentiation markers and signal pathways. //Bone.- 2004.- V. 35.-P. 1273-1293.

335. Wang W, Xu J, Kirsch T. Annexin V and terminal differentiation of growth plate chondrocytes.// Exp Cell Res.- 2005.- V. 305.-P. 156-165.

336. Wang W, Xu J, Du B, Kirsch T. Role of the progressive ankylosis gene (ank) in cartilage mineralization.// Mol Cell Biol.- 2005.- V. 25.-P. 312-323.

337. O.Wang J, Elefant D, Veys EM et al. Insulin-like growth factor-1 rides the activity of interleukin-1 receptor II over and controls the homeostasis of the extracellular matrix of cartilage.// Arthritis Rheum.- 2003.- V. 48.-P. 12811291.

338. Weir EC, Philbrick WM, Amling LA, et al .Targeted overexpression of parathyroid hormone-related peptide in chondrocytes causes chondrodysplasia and delayed endocondral bone formation.// Proc Natl Acad Sei USA.- 1996.- V. 93.-P. 10240-10245.

339. White AH; Watson RE, Newman B, et al. Annexin.VIII is differentially expressed by chondrocytes in the mammalian growth plate' during endochondral ossification and in osteoarthritic cartilage.// J Bone Miner Res.- 2002.- V. 17.-P. 1851-1858.

340. Witter J Roughley PJ, Webber C et al. The immunological detection and characterization of cartilage proteoglican degradation products in synovial fluids of patients with arthritis.//Arthritis Rheum.- 1987.- V. 30.-P. 519-526.

341. Wright MO, Nishida K, Bavington C et al. Hyperpolarization of cultured human chondrocytes follows cyclical pressure-induced- strain: evidence of a role for a5pi integrin as a chondrocyte mechanoreceptor.// J Orthop Res.-1997.-V. 15.-P. 742-747.

342. Wroblewski J, Edwall-Arvidsson C. Inhibitory effects of basic fibroblast growth factor on chondrocyte differentiation.// J Bone Miner Res.- 1995,- V. 10.-P. 735-742.

343. Wu J-J, Lark M, Chum LE Eyre DR. Sites of stromelysin cleavage in collagen types II, IX, X, and XI of cartilage.// J Biol Chem.- 1991.- V. 266.-P. 5625-5628.

344. Wu W, Tchetina E, Mwale F et al'. Proteolysis involving MMP-13 (collagenase-3) and the expression of the chondrocyte hypertrophic phenotype.// J Bone Miner Res.- 2002.- V.17-P. 639-651.

345. Wu J, Rush TS 3rd, Hotchandani R, et al. Identification of potent and selective MMP-13 inhibitors.// Bioorg Med Chem Lett.- 2005.- V. 15.-P. 4105-4109.

346. Wuthier RE, Register TC. Role of alkaline phosphatase, a polyfunctional enzyme in mineralizing tissues./ In: The Chemistry and Biology of Mineralized Tissues Ed Butler WT. Ebso Media, Birmingham, AL.- 1984.-P. 113-124.

347. Wuthier RE. A review of the primary mechanism of endochondral calcification with special emphasis on the role of cells, mitochondria and matrix vesicles.// Clin Orthop.- 1982.- V. 169. -P. 219-242.

348. Yamada H, Nakagawa T, Stephens RW et al. Proteinases and their inhibitors in normal and osteoarthritic articular cartilage.// Biomed Res.-1987.- V. 8.-P. 289-300.

349. Yamane S, Reddi AH. Induction of chondrogenesis and superficial' zone protein accumulation in synovial«side population cells by BMP-7 and; TGE-betal.// J Orthop Res.- 2008.- V. 26.-P.485-92.

350. Yamashita F, Sakakida K, KusuzaldK, et al. Immunohistochemical localization of interleukin 1 in human growth cartilage.// Nippon Seikeigeka Gakkai Zasshi. -1989.- V. 63-P. 562-568.

351. Yang X, Chen L, Xu X, et al. TGF(32/Smad signals repress chondrocyte hypertrophic differentiation and are required for maintaining articular cartilage.// J Cell Biol.- 2001.V. 153.-P. 35-46.

352. Yasuda T, Poole AR. A flbronectin fragment induces type II collagen degradation by collagenase through an interleukin-1-mediated pathway.// Arthritis Rheum.- 2002.- V. 46-P. 138-148.

353. Yasuda T, Tchetina E, Ohsawa K, et al. Peptides of type II collagen can induce the cleavage of typeil collagen and aggrecan in articular cartilage.//Matrix Bioh -2006 .-V. 25.-P. 419-429.

354. Yoon HS, Kim HA, Song YW. Inhibition of NF-kappaB renders human juvenile costal chondrocyte cell lines sensitive to TNF-alpha-mediated cell death.// Rheumatol Int.- 2006.- V. 26.-P. 201-208.

355. Zhang D, Schwarz EM, Rosier RN, et al. ALK2 functions as a BMP type Preceptor and induces Indian hedgehog in chondrocytes during skeletal development.// J Bone Miner Res.- 2003.- V. 18.-P. 1593-1604.

356. Zhang R, Simmon DJ. Transforming growth factor-J32 mRNA level in unloaded bone analyzed by quantitative in situ hybridization.// J Bone Miner Res.- 1996.-V. 11.-P. S322.

357. Zhang X, Ziran N, Goater JJ, et al. Primary murine limb bud mesenchimal cells in long-term culture complete chondrocyte differentiation: TGF-p delays hypertrophy andJPGE2 inhibits terminal differentiation.// Bone .-2004.- V. 34.-P. 809-817.

358. Zhao Q, Eberspaecher H, Lefebvre V, et al. Parallel expression of Sox9 and GOL2A1 in cells undergoing chondrogenesis.// Dev Dyn.- 1997.-V. 209:-P. 377-386.

359. Zhou HW, Lou SQ, Zhang R. Recovery of function in osteoarthritic chondrocytes induced by pi6INK4a-specific siRNA in vitro.// Rheumatology (Oxford).- 2004.-V. 43.-P. 555-568.

360. Zuscik MJ, Baden JF, Wu Q, et al. 5-azacytidine alters TGF-beta and BMP signaling and induces maturation in articular chondrocytes.// J Cell Biochem.-2004.-V. 92.-P. 316-331.