Морфологическая и гистохимическая характеристика изготовленных in vitro хондротрансплантатов лошадей тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 16.00.02, кандидат биологических наук Пономарев, Игорь Владимирович

• Пономарев, Игорь Владимирович
• кандидат биологических наук
• 2008

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Пономарев, Игорь Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Объективные предпосылки возникновения метода тканевой инженерии.

1.2. Особенности морфологии суставного хряща.

1.3. Методы восстановления повреждений суставного хряща.

1.3.1. Радикальные хирургические методы.

1.3.2. Методы тканевой инженерии.

1.3.2.1. Клеточная терапия.

1.3.2.2. Трёхмерные системы поддержки хондрогенного фенотипа.

1.4. Альтернативные методы создания трёхмерных хондротрансплантатов.

1.5. Механическая стимуляция при создании тканеинженерных хондротрансплантатов.

2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Изолирование и культивирование лошадиных хондроцитов в монослое.

2.2. Культивирование хондроцитов в условиях трёхмерного состояния.

2.3. Морфологические, биохимические, гистологические и иммуно-гистохимические исследования.

2.3.1. Биохимические исследования.

2.3.2. Гистологические и иммуногистохимические исследования.

2.4. Статистические методы исследований.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Анализ морфологических изменений тканеинженерных хрящевых конструктов.

3.1.1. Морфологические изменения мембраны С1юпс1го-01с1е®.

3.1.2. Морфологические изменения на матрице Е^пбогЬ®.

3.1.3. Морфологические изменения трёхмерных хрящевых конструктов изготовленных без использования матриц-носителей.

3.1.3.1. Субклеточные изменения трёхмерных конструкций.

3.1.3.2. Макроскопическая оценка хондротрансплантатов.

3.2. Биохимический анализ тканеинженерных хрящевых конструктов.

3.2.1. Количественное определение кислых гликозаминогликанов.

3.2.2. Количественное определение гидроксипролина.

3.2.3. Количественное определение гидроксилизина.

3.3. Гистологический анализ тканеинженерных хрящевых конструктов.

3.3.1. Гистоморфологическая оценка хондротрансплантатов на матрице С1юпс1го-С1с1е®.

3.3.2. Гистоморфологическая оценка хондротрансплантатов на матрице Е^богЬ

3.3.3.Гистоморфологическая оценка хондротрансплантатов изготовленных без применения матрицы-носителя.

3.4. Иммуногистохимические исследования тканеинженерных хрящевых конструктов.

3.4.1. Иммуногистохимический анализ коллагена II типа в хондротрансплантатах изготовленных без применения искусственных матриц - носителей.

3.4.2.Иммуногистохимический анализ сульфатировапных гликозаминогликанов в ТХКбМН.

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

ВЫВОДЫ.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Морфологическая и гистохимическая характеристика изготовленных in vitro хондротрансплантатов лошадей»

Актуальность темы. В настоящее время ведётся активный поиск оптимальных методов лечения травматических и дегенеративных повреждений гиалинового хряща коленного сустава. Расширение спектра лечебных мероприятий привело к появлению и развитию нового направления, находящегося на стыке биотехнологии и медицины — тканевой инженерии. В современной ортопедии достаточно широко используются методы тканеинженерного восстановления дегенеративных изменений гиалинового (суставного) хряща, такие как Mosaik-Plastik-Transplantation (MPT), Autologe Chondrocyten Transplantation (ACT) и Matrix Associated Autologous Chondrocyte Transplantation (MACT). Два последних метода находят всё большее применение в ветеринарии, в особенности при лечении суставных заболеваний лошадей (Bamewitz et al., 2003; Litzke et al., 2004).

Травмы, а также дегенеративные изменения хряща как следствие реакции сустава на перегрузку играют в развитии остеоартроза (OA) в случае, например, спортивных лошадей значительно большую роль, чем возрастные или инфекционные факторы (Mac Kay-Smith, 1962; Raker et al., 1966; Vachon et al., 1986).

Необходимость создания нового направления регенеративной медицины обусловлена ограниченной возможностью к самовосстановлению гиалинового хряща in vivo. Основой метода тканевой инженерии является создание трёхмерных хрящевых трансплантатов в условиях in vitro и последующая их имплантация в область поражения поверхности сустава. В качестве клеточного материала для изготовления „инженерных" хондротрансплантатов используются аутологичные хондроциты, полученные путём биопсии. Изолированные из хрящевой ткани биоптата клетки размножают затем в монослойной культуре до необходимой концентрации, после чего их переводят в трёхмерную форму. Для поддержания пространственной формы существования клеток суставного хряща in vitro применяют, как правило, различные резорбируемые матрицы-носители (Sittinger et al., 1994). Их изготавливают либо из синтетических полимеров молочной и/или гликолевой кислот, либо из органических материалов типа коллагена.

Несмотря на многочисленные позитивные свойства, матрицы-носители являются чужеродными агентами в среде как самого трансплантата, так и всего сустава в целом. Резорбция материалов, из которых состоят матрицы, в условиях суставной жидкости происходит значительно дольше (год и более) чем, к примеру, в костной ткани, а то и вовсе „ограничивается" капсулированием инородного тела. Процесс элиминации компонентов матриц-носителей сопровождается повышением местного иммунитета, в частности, значительным увеличением количества макрофагов. К тому же продукты распада влияют на изменение рН среды как в условиях in vitro, так и in vivo. Необходимо учитывать и тот факт, что все предлагаемые в качестве матриц-носителей препараты являются коммерческими продуктами и соответственно повышают конечную стоимость лечения.

Исходя из этого была разработана концепция создания трёхмерных хрящевых трансплантатов лошади без применения матриц-носителей (Ponomarev, Wilke, 2004). В основе метода лежит способность клеток гиалинового хряща активно синтезировать компоненты внеклеточного матрикса (коллаген и протеогликаны) в ответ на механическую стимуляцию. С помощью данной методики удалось получить хондротрансплантаты размером до 2 см в диаметре и толщиной до 3 мм, которые по своей природе являются полностью аутологичными пациенту, так как состоят из собственных клеток и продуктов их синтеза. К тому же в процессе культивирования клеток в качестве необходимой добавки к питательной среде используется аутологичная сыворотка крови.

Использование в экспериментах по изучению репарации гиалинового хряща лабораторных мышей и кроликов сыграло важную роль в понимании механизмов хондрогенеза, однако экстраполяция результатов, полученных на суставах мелких животных (толщина коленного хряща кролика около 400 мкм), на крупные объекты, например лошадь (толщина коленного хряща 3-5 мм), представляется проблематичной. Имеется незначительное количество публикаций по использованию лошадей в качестве экспериментальных животных (Barnewitz et al., 2003; Litzke et al., 2004), что, по-видимому, объяснимо стоимостью проведения исследований. Исходя из этого, изготовление объёмных (диаметром более 1 см и толщиной 2-4 мм) тканеинженерных конструктов из хондроцитов лошади и изучение процессов формирования хрящевой ткани в них является актуальной задачей.

Имеется ограниченное количество публикаций по созданию хрящевых трансплантатов без применения матриц-носителей (Adamietz et al., 2003; Grogan et al., 2003), но размеры этих конструктов не превышают 5 мм в диаметре, что является серьёзным ограничением при внедрении данных методов в ветеринарную лечебную практику крупных животных, каковым является лошадь.

Таким образом, учитывая важность изучения процессов восстановления повреждений суставного хряща, проведение сравнительного анализа качества хондротрансплантатов, изготовленных по различным методикам в условиях in vitro, является актуальной задачей, решение которой имеет не только теоретический, но и практический интерес.

Цель исследования. Дать сравнительную морфологическую, биохимическую и гистологическую характеристику хондротрансплантатов лошадей, изготовленных in vitro на основе коммерческих матриц-носителей, и альтернативных им трёхмерных хрящевых конструктов, созданных по оригинальной методике.

В задачи исследования входило:

- изучение морфологических изменений в клеточных популяциях хондроцитов в процессе культивирования трёхмерных конструкций хрящевых трансплантатов in vitro; исследование особенностей биохимических параметров внеклеточного матрикса, синтезированного хондроцитами коленного сустава лошадей, полученного на коммерческих матрицах-носителях, и трёхмерных хрящевых конструктов, созданных по оригинальной методике;

- оценка гистологически выявляемых преобразований в трёхмерных хрящевых конструктах, созданных с применением матриц-носителей или без таковых;

- изучение влияния механического стимулирования на биохимические и гистологические показатели внеклеточного матрикса в тканеинженерных конструктах хондроцитов лошади, изготовленных без использования матриц-носителей;

- иммуногистохимический анализ внеклеточного матрикса de novo в созданных in vitro хондротрапсплантатах лошадей.

Научная новизна. Впервые представлен способ изготовления трёхмерных хрящевых трансплантатов лошади без применения синтетических и искусственных матриц-носителей. Показано, что разработанный способ изготовления хондротрансплантатов без применения матриц-носителей является достойной альтернативой и дополнением существующим инвазивным методам репарации повреждений суставного хряща. Выявлено положительное влияние механической стимуляции на изменение биохимических и гистологических параметров в трёхмерных культурах хондроцитов лошади in vitro, что может являться фактором, повышающим адаптацию хрящевого регенерата к условиям сустава in situ. В сравнительном аспекте изучены хондротрансплантаты лошадей, созданные на основе современных матриц-носителей и тканеинженерных конструктов, изготовленных по оригинальной методике. Выявлено, что независимо от природы и структуры материала носителя синтез основных компонентов внеклеточного матрикса происходит на поверхности хондротрансплантата, тогда как глубжележащие участки демонстрируют отсутствие поддержки хондрогенеза в ткани de novo. В противоположность результатам на искусственных матрицах-носителях хрящевые конструкты, изготовленные по оригинальной методике, проявляют значительное морфологическое и биохимическое сходство с нативным гиалиновым хрящом.

Практическое значение исследований. Оценена практическая значимость коммерческих матриц-носителей для использования в ветеринарной практике крупных животных на примере лошадей.

Предложенный способ микрокапельного нанесения суспензии хондроцитов на матрицы-носители и последующего предкультивирования представляет интерес для специалистов медико-биологического профиля, занимающихся проблемами тканевой инженерии гиалинового хряща.

Изменение биохимических и гистологических параметров внеклеточного хрящевого матрикса под влиянием механического воздействия свидетельствует о целесообразности использования данного вида стимуляции трёхмерных клеточных культур в условиях in vitro как подготовительного этапа при оперативном способе репарации суставных повреждений.

Использование лошади в качестве модельного животного и полученные результаты позволяют не только расширить спектр лечебных мероприятий в случаях травматических артрозов, например, спортивных лошадей, но и дают возможность применения полученных данных в клинических исследованиях, поскольку коленный сустав лошади наиболее схож по таким параметрам, как толщина, площадь и степень нагрузки, с аналогичным суставом человека.

Апробация. Основные положения и результаты диссертационной работы докладывались на международной научно-практической конференции "Проблемы развития коневодства и конного сорта в России", Новосибирск, 2003; 11. Heiligenstädter Kolloquium - Technische Systeme für Biotechnologie und Umwelt, Heiligenstadt, Germany, 2003; Conference "Strategies in Tissue Engineering", Würzburg, Germany, June, 2004; 2nd World Congress on Regenerative Medicine, Leipzig, Germany, May, 2005; 4th Annual Meeting of the European Tissue Engineering Society, Munich, Germany, August, 2005; региональной научно-практической конференции "Болезни лошадей",

Новосибирск, 2006; II международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы животноводства", Новосибирск, 2006; ЕСМ VII Meeting „Cartilage & Joint Repair", Davos, Switzerland, June, 2006.

Публикации. По результатам исследований опубликовано 17 научных работ, в том числе в журнале "Сибирский вестник сельскохозяйственной науки", сборниках научных трудов НГАУ, СибНИПТИЖ СО РАСХН.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов исследований, обсуждения и выводов. Диссертация изложена на 98 страницах машинописного текста, содержит 31 рисунок и 1 таблицу. Библиографический список включает 130 источников.

Заключение диссертации по теме «Патология, онкология и морфология животных», Пономарев, Игорь Владимирович

выводы

1. В результате проведённого исследования были установлены значительные морфологические, биохимические и гистологические различия между изготовленными in vitro хондротрансплантатами лошадей на основе коммерческих матриц-носителей и трёхмерных хрящевых конструктов без применения матриц-носителей.

2. Биохимический и гистологический анализы выявили незначительную поддержку хондрогенеза на матрице Chondro-Gide® у размноженных в монослое и привитых на носитель хондроцитов. В связи с этим применение данной матрицы для проведения инвазивной репарации повреждений суставного хряща лошади методом тканевой инженерии не является оптимальным.

3. Матрица Ethisorb® продемонстрировала свойства, необходимые для поддержания трёхмерного клеточного фенотипа: гомогенное распределение клеток по материалу носителя, пролиферация клеток, синтез основных компонентов внеклеточного матрикса. Однако наличие крупных нерезорбированных полимерных блоков в структуре хондротрансплантата оставляет нерешённой проблему полноценного замещения пространства искусственного материала на вновь синтезированный внеклеточный матрикс гиалинового хряща. Также представляется проблемной структурная организация матрикса de novo, выявляемая гистологически: основная масса плотного внеклеточного матрикса располагается поверхностно, тогда как глубокие слои хондротрансплантата заполнены рыхлой тканью и клетками со слабо выраженным хондроцитарным фенотипом.

4. Тканеинженерные конструкты, созданные без применения матриц-носителей, обнаруживали значительное морфологическое, биохимическое и гистологическое подобие с гиалиновым хрящом:

1) клеточная морфология и структурная организация хондротрансплантата схожи с нативной тканью;

2) распределение основных компонентов внеклеточного матрикса (коллагенов и протеогликанов) в тканеинженерном конструкте соответствует таковому в суставном хряще;

3) концентрация протеогликанов в конструкте составляла до 35%, а содержание коллагенспецифических аминокислот гидроксипролина и гидроксилизина - 29,3 и 18,4% соответственно от такового в нативной ткани;

4) иммуногистохимически установлено, что основным типом коллагена в хондротрансплантате является коллаген II типа, а локализация кератансульфата в околоклеточном пространстве свидетельствует об активности хондроцитов в отношении синтеза протеогликанов.

5. Выявленные в результате исследования морфологические, биохимические и гистологические различия между изготовленными in vitro по различным методикам хондротрансплантатами лошади свидетельствуют о перспективности применения при репарации повреждений суставного гиалинового хряща тканеинженерных конструктов, созданных без применения искусственных матриц-носителей.

6. Несмотря на большое число пассажей монослойных культур (3-4), использованная при создании трёхмерных хрящевых конструктов механическая стимуляция значительно влияет на поддержание тканевого хондроцитарного фенотипа и синтетическую активность клеток, что является важной предпосылкой для успешного применения хондротрансплантата при репарации повреждений суставного хряща лошади.

7. Полная аутологичность тканеинженерного хондротрансплантата, изготовленного без применения матриц-носителей, к хрящевой ткани пациента позволяет говорить о возможности апробации данного метода и в клинической практике.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Пономарев, Игорь Владимирович, 2008 год

1. Aicher, W. K. Quality assurance of autologous chondrocyte transplantation / W. K. Aicher, С. Gaissmaier, J. Fritz // Cartilage Surgery and Future Perspectives (Paperback) / C. Hendrich et. all.. Heidelberg : Springer Verlag, 2003. - P. 123-129.

2. Aigner, Т. Collagens : major component of the physiological cartilage matrix, major target of cartilage degeneration, major tool in cartilage repair / T. Aigner, J. Stove // Advanced drug delivery reviews. 2003. - Vol. 55, № 12.-P. 1569-1593.

3. Tissue engineering: new treatment of cartilage alterations in degenerative joint diseases in horses preliminary results of a long term study / D. Bamewitz et. all. // Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr. - 2003. - Vol. 116, №3-4.-P. 157-161.

4. Length variation in the keratan sulfate domain of mammalian aggrecan / F. P. Barry et. all. // Matrix. Biol. 1994. - Vol. 14, № 4. - P. 323-328.

5. N- and O-linked keratan sulfate on the hyaluronan binding region of aggrecan from mature and immature bovine cartilage / F. P. Barry et. all. // J. Biol. Chem. 1995. - Vol. 270, № 35. - P. 20516-20524.

6. Bassett, C. A. L. Influence of oxygen concentration and mechanical factors on differentiation of connective tissues in vitro / C. A. L. Bassett, I.

7. Herrmann. 11 Natur. 1961. - № 190. - P. 460-461.

8. Indications and implementation of recommendations of the working group "Tissue Regeneration and Tissue Substitutes" for autologous chondrocyte transplantation (ACT) / P. Behrens et. all. //. Z. Orthop. Ihre Grenzgeb. — 2004. Vol. 142, № 5. - P. 529-539.

9. A prospective randomised comparison of autologous chondrocyte implantation versus mosaicplasty for osteochondral defects in the knee / G. Bentley et. all. // J. Bone. Joint. Surg. Br. 2003. - Vol. 85, № 2. - P. 223230.

10. Benya, P. D. Dedifferentiated chondrocytes reexpress the differentiated collagen phenotype when cultured in agarose gels / P. D. Benya, J. D. Shaffer // Cell. 1982. - Vol. 30, № 1. - P. 215-224.

11. Blumenkrantz, N. An improved method for the assay of hydroxylysine I N. Blumenkrantz, G. Asboe-Hansen // Anal. Biochem. 1973. - Vol. 56, № 1. — P. 10-15.

12. Blumenkrantz, N. Hydroxyproline to hydroxylysine molar ratio indicates collagen type / N. Blumenkrantz, G. Asboe-Hansen //Acta Derm. Venereol. — 1978.-Vol. 58, №2.-P. 111-115.

13. Bobic, V. Arthroskopie osteochondral autograft transplantation in anterior cruciate ligament reconstruction: a preliminary clinical study / V. Bobic // Knee. Surg. Sports Traumatol. Artrose. 1996. - № 3. - P. 262-264.

14. Bonassar, L. J. Tissue Engineering: The first decade and beyond / L. J. Bonassar, C. A. Vacanti // J. Cell. Biochem. 1998. Vol. 72, № 30/31. - P. 297-303.

15. Reexpression of cartilage-specific genes by dedifferentiated human articular chondrocytes cultured in alginate beads / J. Bonaventure et. all. // Exp. Cell. Res. 1994.-Vol. 212, № l.-P. 97-104.

16. Long-term results of rib perichondrial grafts for repair of cartilage defects in the human knee / S. J. Bouwmeester et. all. // Int. Orthop. 1997. Vol. 21, №5. p. 313-317.

17. Repair of superficial osteochondral defects with an autologous scaffold-free cartilage construct in a caprine model: implantation method and short-term results / W. Brehm et. all. // Osteoarthritis Cartilage. 2006. - № 4(12). -P. 1214-1226.

18. Human aggrecan keratan sulfate undergoes structural changes during adolescent development / G. M. Brown et. all. // J. Biol. Chem. 1998. -Vol. 273, №41.-P. 26408-26414.

19. Buckwalter, J. A. Articular cartilage repair and transplantation / J. A. Buckwalter, H. J. Mankin // Arthritis Rheum. 1998. - № 41. - P. 13311342.

20. Buckwalter, J. A. Articular cartilage / J. A. Buckwalter // Instr. Course Lect. 1983. -№32. - P. 349-70.

21. Effects Of Growth Factors On Cell Proliferation By Human Nasal Septal Chondrocytes Cultured In Monolayer / J. E. Bujia et. all. // Acta Otolaryngol. 1994. - Vol. 114, № 5. - P. 539-543.

22. Bullough, P. The significance of the fine structure of articular cartilage / P. Bullough, J. Goodfellow // J Bone Joint Surg Br. 1968. - Vol. 50, № 4. - P. 852-857.

23. Burgeson, R. E. Collagen types : molecular structure and tissue distribution / R. E. Burgeson, M. E. Nimni // Clinical orthopaedics and related research. -1992. -№ 282.-P. 250-272.

24. Altered aggrecan synthesis correlates with cell and nucleus structure in statically compressed cartilage / M. D. Buschmann et. all. // J. Cell Science. 1996. Vol. 109, № 2. - P. 499-508.

25. Cohen, N. P. Composition and dynamics of articular cartilage: structure, function and maintaining healthy state / N. P. Cohen, R. J. Foster, V. C. Mow // J. Orthop. Sports. Phys. Ther. 1998. - Vol. 28, № 4. - P. 203-215.

26. A human-specific polymorphism in the coding region of the aggrecan gene. Variable number of tandem repeats produce a range of core protein sizes in the general population / K. J. Doege et. all. // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272, №21.-P. 13974-13979.

27. Recent developments in cartilage reseach: matrix biology of the collagen II/IX/XI heterofibril network / D. R. Eyre et. all. // Biochem. Soc. Trans. — 2002. Vol. 30, № 6. - P. 893-899.

28. Farndale, R. W. Improved quantitation and discrimination of sulphated glycosaminoglycans by use of dimethylmethylene blue / R. W. Farndale, D. J. Buttle, A. J. Barrett // Biochim. Biophys. Acta. 1986. - Vol. 883, № 2. -P. 173-177.

29. Articular Cartilage Repair In Rabbits By Using Suspensions Of Allogenic Chondrocytes In Alginate / E. M. Fragonas et. all. // Biomaterials. 2000. -Vol. 21, № 8.-P. 795-801.

30. Fraser, J. R. Hyaluronan: its nature, distribution, functions and turnover / J. R. Fraser, T. C. Laurent, U. B. Laurent // J. Intern. Med. 1997. - Vol. 242, № 1.-P. 27-33.

31. Biomaterialien für die Transplantation chondrogener Zellen zur biologischen Rekonstruktion artikulärer Knorpeldefekte / C. Gaissmaier et. all. // SFA Arthroskopie Aktuell. 2003. - № 16. - P. 1-16.

32. Apoptotic chondrocyte death in cell-matrix biocomposites used in autologous chondrocyte transplantation / J. Gille et. all. // Annals of anatomy. -2002. Vol. 184, № 4. p. 325-332.

33. Goldwasser, M. Analysis of types of collagen present in human newborn and adult articular cartilage / M. Goldwasser, M. Van der Rest, F. H. Glovieux // Trans. Orthop. Res. Soc. 1978. - № 3. - P. 75.

34. IGF-I and mechanical environment interact to modulate engineered cartilage de-velopment / K. J. Gooch et. all. // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2001. - Vol. 286, № 5. - P. 909-915.

35. Cartilage tissue remodeling in response to mechanical forces / A. J. Grodzinsky et. al. //Annu. Rev. Biomed. Eng. 2000. - № 2. - P. 691-713.

36. A static, closed and scaffold-free bioreactor system that permits chondrogenesis in vitro / S. P. Grogan et. al. // Osteoarthritis Cartilage. -2003 . Vol. 11, № 6 (Jun.). - P. 403-411.

37. Guo, J. F. Culture and growth characteristics of chondrocytes encapsulated in alginate beads / J. F. Guo, G. W. Jourdian, D. K. MacCallum // Connect Tissue Res. 1989. - Vol. 19, № 2/4. - P. 277-297.

38. Haebler, C. Experimentelle Untersuchungen über die Regeneration des Gelenkknorpels / C. Haebler // Klin. Chir. 1925. - № 134. - S. 602-640.

39. Treatment of osteochondritis dis-secans of the talus : use of the mosaic-plasty technique a preliminary report / L. Hangody et. al. // Foot Ankle Int. - 1997. - № 18. - P. 628-634.

40. Hardingham, T. A Tissue engineering : chondrocytes and cartilage / T. Hardingham, S. Tew, A. Murdoch // Supplement Review. Arthritis Res. -2002. № 4 (Suppl. 3). - P. 63-68

41. Hardingham, T. Aggrecan, the chondroitin sulfate/keratan sulfate proteoglycan from cartilage / T. Hardingham, A. J. Fosang, J. Dudhia //

42. Articular cartilage and osteoarthritis / in eds. : K E. Kuettner, R. Schleyerbach, J. G. Peyron, V. C. Hascall. N. Y. : Raven Press, 1992. - P. 5-20.

43. Synthesis and turnover of proteoglycans by human and bovine adult articular chondrocytes cultured in alginate beads / H. J. Hauselmann et. al. // Matrix. 1992. - № 12. - P. 116-129.

44. Adult human chondrocytes cultured in alginate form a matrix similar to native human articular cartilage / H. J. Hauselmann et. al. // Am J Physiol. 1996. - Vol. 271. - P. 742-752.

45. Phenotypic stability of bovine articular chondrocytes after long-term culture in alginate beads. / H. J. Hauselmann et. al. // J Cell Sei. 1994. - Vol. 107.-P. 17-27

46. Herbage, D. Biochemical and physiochemical characterization of pepsin-solubilized type-II collagen from bovine articular cartilage / D. Herbage, J. Bouillet, J. C. Bernengo // Biochem J. 1977. - Vol. 161, № 2. - P. 303312.

47. Holtzer, H. J. The Loss Of Phenotypic Traits By Differentiated Cells In Vitro. I. Dedifferentiation Of Cartilage Cells / H. J. Holtzer et. al. // Proc Nat Acad Science. 1960. - № 46. - P. 1533-1542.

48. Horas, U. Autologous chondrocyte implantation and osteochondral cylinder transplantation in cartilage repair of the knee joint. A prospektive, comparative trial / Horas U. et. al. // J Bone Joint Surg Am. 2003. - P. 2487-2488.

49. Hunter, W. Of The Structure And Diseases Of Articulating Cartilages / W. Hunter // Philos Trans Roy Soc. L., 1743. - № 42. - P. 514-521.

50. ITunziker, E. B. Articular cartilage repair : basic science and clinical progress. A review of the current status and prospects / E. B. Hunziker // Osteoarthritis Cartilage. 2002. - № 10. - P. 432-463.

51. Arthroscopic mosaic arthroplasty in the equine third carpal bone / M. Hurtig et. al. // Vet Surg. 2001. - Vol. 30, № 3 (May-Jun.). - P. 228-239.

52. The new collagen gene COL27A1 contains SOX9-responsive enhancer elements / E. Jenkins et. al. // Matrix Biol. 2005. - № 24. - P. 177-184.

53. Discrete integration of collagen XVI into tissue-specific collagen fibrils or beaded microfibrils / A. Kassner et. al. // Matrix Biol. 2003. - № 22. - P. 131-143.

54. Knudson, C. B. Cartilage proteoglycans / C. B. Knudson, W. Knudson // Semin Cell Dev Biol. 2001. - Vol. 12, № 2. - P. 69-78.

55. A novel marker of tissue junctions, collagen XXII / M. Koch // J. Biol. Chem. 2004. - Vol. 279, № 21. - P. 22514-22521.

56. Expression of cartilage-specific molecules is retained on long-term culture of human articular chondrocytes / E. Kolettas // J Cell Sci. 1995. - Vol. 108, № 5.-P. 1991-1999.

57. Kuettner, K. E. Articular cartilage matrix and structure / K. E. Kuettner, M. B. Aydelotte, E. J. Thonar // J Rheumatol 1991. - № 18. (Suppl. 27). - P. 46-48.

58. Kurz, B. Physiko-mechanische Stimulation von Zellen am Beispiel des Gelenkknorpels / B. Kurz, M. Schiinke // Tissue Engineering : neues zum Gewebeersatz im Muskel-Skelett-System / ed. J. Bruns, V. Steinkopff. -Darmstadt, 2003.-S. 11-20.

59. Langer R. Tissue engineering / R. Langer // Mol Ther. 2000. - Vol. 1, № 1. -P. 12-15.

60. Lee, D. A. Expansion of chondrocytes for tissue engineering in alginate beads enhances chondrocytic phenotype compared to conventional monolayer techniques / D. A. Lee, T. Reisler, D. L. Bader // Acta Orthop Scand. — 2003. T. 74, № 1.-P. 6-15.

61. Lewis, M. L. Use of microgravity bioreactors for development of an in vitro rat salivary gland cell culture model / M. L. Lewis, D. M. Moriarity, P. S. Campbell // J Cell Biochem. 1993. - Vol. 51, № 3. - P. 265-273.

62. Lexer, E. Ueber Gelenktransplantationen // Arch Klin Chir. 1909. - Vol. 90.-P. 263-278.

63. Repair of extensive articular cartilage defects in horses by autologous chondrocyte transplantation / L. F. Litzke et. al. // Annals of Biomedical Engeneering. 2004. - Vol. 32. - P. 57-69.

64. Mac Kay-Smith, M. Pathogenesis and pathology of equine ostheoarthritis // J.Am. Vet. Med. Assoc.-1962.-Vol. 141.-P. 1246.

65. Articular cartilage repair using a tissue-engineered cartilage-like implant: an animal study / P. Mainil-Varlet et. al. // Osteoarthritis Cartilage. 2001. -№9(Suppl.A).-P. 6-15.

66. Chondrogenesis of aged human articular carlilage in a scaffold-free bioreactor / S. Marlovits et. al. // Tissue engineering. — 2003. Vol. 9, № 6. -P. 1215-1226.

67. A novel two-step method for the formation of tissue-engineered cartilage by mature bovine chondrocytes: the alginate-recovered-chondrocyte (ARC) method / K. Masuda et. al. // J. Orthop Res. 2003. - Vol. 21, № 1. - P. 139-148.

68. Mow, V. C. Cartilage and diarthrodial joints as paradigms for hierarchical materials and structures / V. C. Mow, A. Ratcliffe, A. R. Poole // Biomaterials. 1992. - № 13. - P. 67-97.

69. Muir, H. The chondrocyte, architect of cartilage. Biomechanics, structure, function and molecular biology of cartilage matrix macromolecules / H. Muir//Bioessays.- 1995.-Vol. 17, № 12.-P. 1039-1048.

70. Scaffold-free, engineered porcine cartilage construct for cartilage defect repair—in vitro and in vivo study / K. Park et al. // Artif Organs. — 2006. — Vol. 30, №8. -P. 586-596.

71. Pauwels, F. Eine neue Theorie über den Einfluss mechanischer Reize auf die Differenzie-rung der Stützgewebe / F. Pauwels // Z Anat Entwicklungsgesch. 1960.-Vol. 121, № 6.-S. 478-515.

72. Piez, K. A. Structure and assembly of the native collagen fibril / K. A. Piez // Connect Tissue Res. 1982. - Vol. 10, № 1. - P. 25-36.

73. Ponomarev, I. Regenerative medicine : New production process for cartilagetransplant / I. Ponomarev, M. Fischer, I. Wilke // 2nd World Congress on Regenerative Medicine, Leipzig, Germany, May, 2005. Leipzig, 2005. - P. 94.

74. Poole, A. R. Cartilage in health and disease / A. R. Poole // Arthritis and Allied Conditions : a Textbook of Rheumatology. Philadelphia : Lea & Febiger, 1993. - P. 279-333.

75. Poole, C. R. The structure and function of articular cartilage matrices / C. R. Poole. -NY. : Marcel Dekker, 1993.

76. Pridie, K. H. A method of resurfacing osteoarthritic knee joints / K. H. Pridie // J Bone Joint Surg Br. 1959. - Vol. 41. - P. 618-619.

77. Radin, E. L. Joint physiology and biomechanics / E. L. Radin, D. Fyhrine. -NY. : Springer-Verlag , 1990.

78. Chondrocyte extrazellular matrix synthesis and turnover are influenced by static compression in a new alginate disk culture system / P. M. Ragan // Arch Biochem Biophys. 2000. - № 383, № 2. - P. 256. - 264.

79. Raker, C. Pathophysiology of equine degenerative joint disease and lameness / C. Raker, R. Baker, J. D. Wheat // Proc. 12th Ann. Meeting Am. Assoc. Equine Pract. 1966. - P. 229-241.

80. Robins, S. P. A Cross-linking of collagen. Location of pyridinoline in bovine articular cartilage at two sites of the molecule / S. P. Robins, A. Duncan // Biochem J. 1983.-Vol. 215, № l.-P. 175-182.

81. Roughley, P. J. The structure and function of cartilage proteoglycans / P. J. Roughley // European Cells and Materials. 2006. - Vol. 12, sup. l.-P. 11.

82. Roughley, P. J. Cartilage proteoglycans: structure and potential functions / P. J. Roughley, E. R. Lee // Microsc. Res. Tech. 1994. - Vol. 28, № 5. - P. 385-397.

83. Rubak, J. M. Reconstruction of articular cartilage defects with free periosteal grafts : an experimental study / J. M. Rubak // Acta Orthop. Scand. 1982. -Vol. 53, №2.-P. 175-180.

84. Sah, R. L. The biomechanical faces of articular cartilage in growth, aging,and osteoarthritis / R. L. Sar // The Many Faces of Osteoarthritis / ed by K. E. Kuettner and V. C. Hascall. New York, 2002.

85. The biological effect of continuous passive motion on the healing of full-thickness defects in articular cartilage / R. B. Salter et al. // J. Bone Joint Surg. 1980. - Vol. 62, № 8. - P. 1232-1251.

86. Isolation and characterization of disulfide-bonded peptides from the three globular domains of aggregating cartilage proteoglycan / J. D. Sandy et al. //J. Biol. Chem. 1990. - Vol. 265, is.34.-P. 21108-21113.

87. Santer, V. O-Linked oligosaccharides of human articular cartilage proteoglycan / V. Santer, R. J. White, P. J. Roughley // Biochim. Biophys. Acta. 1982. - Vol. 716, № 3. - P. 277-282.

88. Seyer, J. M. Covalent structure of collagen / J. M. Seyer, K. A.Hasty, A. H. Kang // Eur J Biochem. Amino acid sequence of an arthritogenic cyanogen bromide peptide : II collagen of bovine cartilage. 1989. - Vol. 181. № l.-P. 159-173.

89. Shapiro, F. Cell origin and differentiation in the repair of full-thickness defects of articular cartilage / F. Shapiro, S. Koide, M. J. Glimcher // J. Bone Joint Surg. 1993. - Vol. 75A. - P. 532-553.

90. Tissue engineering and autologous transplant formation : practical approaches with resorbable biomaterials and new cell culture techniques / M. Sittinger et al. // Biomaterials. 1996. - Vol. 17, № 3. - P. 237-242.

91. Engineering of cartilage tissue using bioresorbable polymer carriers in perfusion culture / M. Sittinger et al. // Biomat. 1994. - Vol. 15. - P. 451456.

92. Sittinger, M. Künstlicher Gewebeersatz aus vitalen Komponenten / M.

93. Sittinger // Tissue Engineering : Laryngo Rhino Otol. — 1995. Vol. 74. - S. 695-699.

94. Outcome after total hip arthroplasty : Part II. Disease-specific follow up and the Swedish National Total Hip Arthroplasty Register / P. Soderman //Acta Orthop. Scand. 2001. -Vol. 72, №2.-P. 113-119.

95. Solursh, M. Formation of cartilage tissue in vitro / M. Solursh // J. Cell Biochem. 1991. - Vol. 45, № 3. - P. 258-260.

96. Solursh, M. Effects Of Cell Density On The Expression Of Differentiation By Chick Embryo Chondrocytes / M. Solursh, S. Meier // J. Exp. Zool.- 1974. -Vol. 187, № 3. P. 311-322.

97. Die Technik der Mikrofrakturierung zur Behandlung von kompletten Knorpeldefekten im Kniegelenk / J. R. Steadman et al. // Orthopäde. -1999.-Vol. 28.-S. 26-32.

98. Stockwell, R. A. The cell density of human articular and costal cartilage / R. A. Stockwell // J. Anat. 1967. - Vol. 101, № 4. - P. 753-763.

99. Stoddart, M. J. Enhanced matrix synthesis in de novo, scaffold free cartilage-like tissue subjected to compression and shear / M. J. Stoddart, L. Ettinger, H. J. Hauselmann // Biotech, and Bioeng. 2006. - Vol. 95, № 6. -P. 1043-1051.

100. Stoddart, M. J. Generation of a scaffold tree cartilage-like implant from a small amount of starting material / M. J. Stoddart, L. Ettinger, H. J. Hauselmann // J. Cell Mol Med. 2006. - Vol. 10, № 2. - P. 480-492.

101. Structure of equine type I and type II collagens / R. J. Todhunter et al. //Am J. Vet Res. 1994. - Vol. 55, № 3. - P. 425-431.

102. Vacanti, C. A. Tissue-engineered morphogenesis of cartilage and bone by means of cell transplantation using synthetic biodegradable polymer matrices / C. A. Vacanti, J. Upton // Clin. Plast. Surg. 1994. - Vol. 21, № 3. - P. 445-462.

103. Evaluation of the repair process of cartilage defects of the equine third carpal bone with and without subchondral bone perforation / A. Vachon etal. //Am. J. Vet. Res. 1986. - Vol. 47, № 12. - P. 2637-2645.

104. Van den Berg, F. Das Bindegewebe des Bewegungsapparates verstehen und beeinflussen / F. Van den Berg // Angewandte Physiologie : 1. Stuttgart; NY. : Thieme, 1999. -P. 80-81.

105. Identification of hyaluronan-binding domains of aggrecan / H. Watanabe et al. // J. Biol Chem. 1997. - Vol. 272, № 44. - P. 2805728065.

106. Characterization of collagen types XII and XIV from fetal bovine cartilage / S. L. Watt et al. // J. Biol. Chem. 1992. - Vol. 267, is. 28. - P. 20093-20099.

107. Weigel, P. H. Hyaluronan synthases / P. H. Weigel, V. C. Hascall, M. Tammi // J. Biol Chem. 1997. - Vol. 272, № 22. - P. 13997-14000.

108. Williams, D. F. Engineering a concept : the creation of tissue engineering / D. F. Williams // Med. Device Technol. 1997. - Vol. 8, № 7. -P. 8-11.

109. Wolf, A. Collagen synthesis of articular cartilage explants in response to frequency of cyclic mechanical loading / A. Wolf, B. Ackermann, J. Steinmeyer // Cell and Tissue Research. 2007. - Vol. 327, № 1. - P. 155156.

110. Wolter, J. R. Sessile macrophages forming clear endothelium-like membrane on inside of successful keratoprosthesis / J. R. Wolter, R. F. Meyer // Trans Am Ophthalmol Soc. 1984. - Vol. 82. - P. 187-202.

111. Woo, S. L. Y. Injury and Repair of the Musculoskeletal Soft Tissue / S. L. Y. Woo, J. A. Buckwalter // 1st ed. Park Ridge : American Academy of Orthopaedic Surgeons. 1992.

112. Wu, J. J. Identification of hydroxypyridinium cross-linking sites in type II collagen of bovine articular cartilage / J. J. Wu, D. R. Eyre // Biochemistry. 1984. - Vol. 23, № 8. - P. 1850-1857.

113. Hyaluronan-based polymers in the treatment of osteochondral defects / J. U. Yoo et al. // J. Orthop. Res. 2000. - Vol. 18, № 5. - P. 773-780.

114. Молекулярная биология клетки. В 3-х т. Т. 2 / Б. Албертс и др.. — М. :Мир, 1993.-499 с.

115. Гланц, С. Медико-биологическая статистика : пер. с англ. / С. Гланц. М. : Практика, 1999. - 459 с.

116. Тканевая инженерия при репарации повреждений суставного хряща у лошадей / И. Пономарев и др. // Актуальные проблемы животноводства: наука, производство и образование. Новосибирск: НГАУ, 2006. - С. 221-222.