Модификация культуры мезенхимных стромальных клеток для клеточно-инженерного замещения дефектов гиалинового хряща тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 00.00.00, кандидат наук Божокин Михаил Сергеевич

• Божокин Михаил Сергеевич
• кандидат наук
• 2022

Оглавление диссертации кандидат наук Божокин Михаил Сергеевич

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 ГИАЛИНОВЫЙ ХРЯЩ

1.1.1 Восстановления гиалинового хряща

1.1.2 Клеточная инженерия гиалинового хряща

1.1.3 Методы модификации клеточной культуры

1.2 ЦИТОКИН TGF-P3 И ЕГО РОЛЬ В ПРОЛИФЕРАЦИИ ГИАЛИНОВОГО ХРЯЩА

1.2.1 История открытия цитокина TGF-P3

1.2.2 Характеристика белков Суперсемейства TGF-P3

1.2.3 Рецепторы цитокинов TGF-P3 на поверхности клетки

1.2.4 Сигналинг, опосредованный Smad белками

1.2.4.1 Внутриклеточное перемещение белков Smad и их роль в регуляции рецепторного комплекса TpRI/TpRII

1.2.4.2 Функции белков семейства Smad в ядре

1.2.5 Влияние цитокина TGF-P3 на экспрессию гена col2a1

1.2.5.1 Регулирование экспрессии генов внеклеточного матрикса с помощью микро-РНК

1.2.5.2 Использование TGF-P3 для замещения дефектов гиалинового хряща

1.3 СОВРЕМЕННЫЕ МЕТОДЫ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ПОВРЕЖДЁННОЙ ПОВЕРХНОСТИ ГИАЛИНОВОГО ХРЯЩА

1.3.1 Имплантация хондроцитов

1.3.2 Микрофрактурирование

1.3.3 Классическая тканевая инженерия с применением биодеградируемого полимера

1.4 МЕТОДЫ НЕВИРУСНОЙ МОДИФИКАЦИИ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ

1.4.1 Белковая модификация

1.4.2 Генетическая модификация

1.4.3 Низкоинтенсивное лазерное излучение

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1 МОЛЕКУЛЯРНЫЕ И БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ

2.1.1 Штаммы бактерий и среды для их культивирования

2.1.2 Плазмиды, использованные в работе

2.1.3 Молекулярное клонирование

2.1.4 Трансформация бактерий Escherichia coli и выделение ДНК

2.1.5 Выделение РНК

2.1.6 Полимеразная цепная реакция в реальном времени

2.2 МЕТОДЫ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК

2.2.1 Выделение и культивирование клеток

2.2.2 Криоконсервация и разморозка клеток

2.2.3 Цитофлюориметрический анализ клеточной культуры

2.2.4 Изготовление полимерного скаффолда

2.2.5 Создание клеточно-инженерной конструкции

2.3 МЕТОДЫ МОДИФИКАЦИИ КЛЕТОК

2.3.1 Белковая модификация с помощью цитокина TGF-P3

2.3.2 Трансфицирование клеток методом липофекции с помощью Lipofectamin3000©

2.3.3 Воздействие лазерным излучение длиной волны 632,8 нм

2.4 ЭКСПЕРИМЕНТЫ НА ЖИВОТНЫХ

2.4.1 Выбор экспериментального животного

2.4.2 Содержание животных

2.4.3 Ход оперативного вмешательства

2.4.4 Создание стандартизированного дефекта

2.4.5 Имплантация КИК экспериментальным животным в область созданного дефекта гиалинового хряща

2.5 ГИСТОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.5.1 Предварительная подготовка тканей экспериментального животного

2.5.2 Приготовление классических гистологических препаратов

2.5.3 Приготовление криосрезов КИК

2.5.4 Окрашивание гемотоксилином, эозином и альциановым синим

2.5.5 Флюоресцентная и конфокальная микроскопия клеточно-инженерной конструкции

2.6 СКАНИРУЮЩАЯ ЭЛЕКТРОННАЯ МИКРОСКОПИЯ

2.6.1 Подготовка тканей экспериментального животного

2.6.2 Напыление металлического слоя на исследуемую область

2.6.3 СЭМ анализ области регенерации

2.7 СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ

2.8 ОБЩАЯ СХЕМА ЭКСПЕРИМЕНТА НА ЖИВОТНЫХ ДЛЯ ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ РАЗРАБОТАННОЙ КИК С МОДИФИКАЦИЕЙ КЛЕТОК

ЦИТОКИНОМ TGF-P3

3 РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1 ВЫДЕЛЕНИЕ И ПОДТВЕРЖДЕНИЕ ПРИНАДЛЕЖНОСТИ МСК

3.1.1 Получение и культивирование клеток

3.1.2 Конфокальная микроскопия культуры клеток

3.1.3 Цитофлюориметрический анализ культуры клеток

3.2 ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНОЙ ПЛАЗМИДЫ pEGFP-N3-tgfp3

3.3 ЛИПОФЕКЦИЯ МСК РЕАГЕНТОМ LIPOFECTAMIN 3000©

3.3.1 Оценка цитотоксичности липофекции для клеточной культуры МСК

3.3.2 Эффективность трансфицирования

3.3.3 Образование клеточных агрегатов

3.4 МОДИФИКАЦИЯ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ С ПОМОЩЬЮ КОГЕРЕНТНОГО ЛАЗЕРНОГО ИЗЛУЧЕНИЯ ДЛИНОЙ ВОЛНЫ 638,2 НМ

3.4.1 Ход эксперимента и работа опытной установки

3.4.2 Цитотоксичность лазерного излучения

3.4.3 Анализ образования агрегатов клеток

3.4.4 Анализ изменения относительной экспрессии генов

3.5 БЕЛКОВАЯ МОДИФИКАЦИЯ МСК С ПОМОЩЬЮ ЦИТОКИНА TGF-p3

3.5.1 Агрегация клеток на поверхности пластика

3.5.2 Агрегация клеток на поверхности скаффолда

3.5.3 Анализ относительного изменения активности экспрессии генов при добавлении белка ТОБ-Р3

3.6 ПРИГОТОВЛЕНИЕ КИК

3.6.1 Устройство для заселения культуры клеток внутрь биодеградируемого носителя

3.6.2 Пролиферация клеточной культуры на поверхности

и внутри биодеградируемого носителя

3.7 ЭКСПЕРИМЕНТЫ НА ЖИВОТНЫХ

3.7.1 Состояние животных после операции

3.7.2 Оценка собственной регенеративной способности гиалинового хряща

крысы в динамике

3.7.3 Имплантация КИК в область поверхностного дефекта гиалинового хряща коленного сустава крысы

3.7.3.1 Сканирующая электронная микроскопия области повреждений

3.7.3.2 Гистологические препараты области повреждений гиалинового хряща

4 ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

4.1 АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ ПОВРЕЖДЕННОЙ СУСТАВНОЙ ПОВЕРХНОСТИЙ ГИАЛИНОВОГО ХРЯЩА

4.2 ИСПОЛЬЗОВАНИЕ КЛЕТОЧНОЙ ИНЖЕНЕРИИ, КАК ПЕРСПЕКТИВНОЙ МЕТОДИКИ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ПОВРЕЖДЕНИЯ

СУСТАВНОЙ ПОВЕРХНОСТИ

4.3 ВЫБОР КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ПРИ ЗАМЕЩЕНИИ ДЕФЕКТОВ ГИАЛИНОВОГО ХРЯЩА В СОСТАВЕ КЛЕТОЧНО ИНЖЕНЕРНОЙ КОНСТРУКЦИИ

4.4 МОДЕЛИРОВАНИЕ ДЕФЕКТА И СОЗДАНИЕ БИОРЕАКТОРА

ДЛЯ ЭКСПЕРИМЕНТОВ НА ЖИВОТНЫХ

4.5 МОДИФИКАЦИЯ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ, КАК КЛЮЧЕВОЙ ЭТАП ЗАМЕЩЕНИЯ ДЕФЕКТА ГИАЛИНОВОГО ХРЯЩА ПРИ ПОМОЩИ КИК

4.6 ГЕНЕТИЧЕСКАЯ МОДИФИКАЦИЯ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ

4.7 СТИМУЛЯЦИЯ НИЗКОИНТЕНСИВНЫМ ЛАЗЕРНЫМ ИЗЛУЧЕНИЕМ 632,8 НМ

4.8 МОДИФИКАЦИЯ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ С ПОМОЩЬЮ

РЕКОМБИНАНТНОГО БЕЛКА TGF-p3

4.9 АНАЛИЗ СОЗДАНИЯ КИК

4.10 РЕЗУЛЬТАТЫ, ПОЛУЧЕННЫЕ В ХОДЕ РАБОТЫ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ

БЕЛКОВОЙ МОДИФИКАЦИИ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

ПРИЛОЖЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

КИК - клеточно-инженерная конструкция

ТИК - тканеинженерная конструкция

ACI (АТХ) - аутологичная имплантация хондроцитов

МСК - мезенхимные стромальные клетки

iPSC - индуцированные плюрипотентные стромальные клетки

TGF-P3 - трансформирующий фактор роста в

SGF - фактор роста саркомы

NRK - неопухолевые клетки почки крысы

TGF - а-трансформирующий фактор роста а

BMP - костные морфогенетические белки

RUNX2 -родственный белку Runt фактор транскрипции

GDF - факторы роста и дифференцировки

FSH - фолликул стимулирующий гормон

MIF - мюллеровский ингибиторный фактор

BMPRII - рецептор для костного морфогенетического белка

ACTR - активиновый рецептор

AMHRII - рецептор антимюллерового гормона II

SUMO- малый убиквитин-подобный белок-модификатор

SSXS - мотив Ser-Ser-X-Ser

SBE - последовательность связывания с Smad белком FoxO - факторы транскрипции Forhead Sp1 - транскрипционный фактор Sp1 MMP-13 - металлопротеиназа

DGCR8 - критичный для развития синдрома Ди Джорджи регион ТИК - тканеинженерная конструкция

МАТХ - матрикс-ассоциированная трансплантация хондроцитов РТПХ - реакция трансплантат против хозяина

IKDC - International Knee Documentation Committee, Международный комитет по документации

для обследования коленного сустава

ГАГ - гликозамингликаны

FGF2 - фактор роста фибробластов

GAM - ген-активирующая матрица

СЭМ - сканирующая электронная микроскопия

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы: Гиалиновый хрящ представляет собой аваскулярную ткань с высоким содержанием специфических белков внеклеточного матрикса, воды (> 2/3 по массе) и с малым содержанием терминально дифференцированных клеток - хондроцитов [1] Биофизические свойства этой ткани в высокой степени зависят от взаимодействия белков внеклеточного матрикса с водой и уже в меньшей степени зависят от пролиферации клеток. Клеточная культура продуцирует минимальное количество внеклеточного матрикса, и в то же время внеклеточный матрикс и его взаимодействие с водой защищает хондроциты от избыточных механических нагрузок и способствует нормальной их пролиферации в 3D окружении. Тем не менее, при повреждениях внеклеточного матрикса нарушается хрупкий баланс пролиферации клеточной культуры и белков внеклеточного матрикса, что приводит к гибели клеток и дальнейшей деградации ткани.

Дегенеративные повреждения гиалинового слоя суставной поверхности крупных суставов являются актуальной проблемой для миллионов людей во всем мире. Исходя из проведенных на данный момент исследований, считается, что собственные регенеративные способности этой ткани ограничены и в случае возникновения дефектов происходит дальнейшее разрушение суставной поверхности [2]. Это приводит к значительному ухудшению качества жизни и требует на заключительном этапе заболевания проведения высокоинвазивной, рискованной и дорогостоящей операции по замене сустава на искусственный эндопротез. Несмотря на большое количество различных методов восстановления поверхности крупных суставов, доступных современных травматологам и ортопедам, данная задача до сих пор не решена в полном объеме. Существующие на сегодняшний день методы оказывают положительное терапевтическое воздействие лишь в краткосрочной и, изредка, в среднесрочной перспективе, что, в свою очередь, ставит актуальную задачу для разработки новых и перспективных методов для полного восстановления гиалинового слоя крупных суставов. Применение клеточно-инженерных конструкций (КИК), состоящих из предварительно модифицированной клеточной культуры, находящейся внутри биодеградируемого полимера (скаффолда), является одним из динамично развивающихся направлений исследований в области травматологии и ортопедии, в том числе и в разработке методов восстановления поврежденной поверхности гиалинового слоя.

Первые публикации о возможности и необходимости использования методов тканевой инженерии впервые появились в 1993 году, когда профессор Langer опубликовал свою статью «Tissue Engineering» в журнале Science [3], в которой он сформулировал принцип метода: совместить биодеградируемый каркас, клеточную культуру и стимуляторы ее пролиферации. Целью клеточной инженерии гиалинового хряща является создание in vitro максимально

приближенного по своим биомеханическим свойствам аутологичного (или аллогенного) регенерата и его имплантация в область повреждения суставной поверхности. Для получения такой КИК необходимо направленно модифицировать пролиферацию клеточной культуры, чтобы приблизить свойства получившейся КИК к параметрам нативного гиалинового хряща.

Для успешного решения этой задачи и доведения разработанной КИК до клинической апробации на ограниченной группе пациентов необходимо не только осуществить эффективную модификацию клеточной культуры для увеличения синтеза основных белков внеклеточного матрикса гиалинового хряща - таких как коллаген II типа или аггрекан -но и затем транслировать этот процесс в ограниченную клиническую практику, то есть сделать его экономически доступным, простым и безопасным способом, а значит, использовать метод без применения вирусной модификации. Однако, выбор оптимального способа невирусной модификации первичной культуры клеток и анализ эффективности его применения в тканевой инженерии гиалинового хряща является до настоящего времени нерешенной научной задачей. Несмотря на то, что существует много способов для невирусной модификации клеточной культуры, они имеют различные технологические недостатки, которые влияют на теоретическое и практическое их применение в составе КИК для замещения дефектов гиалинового хряща. Более того, некоторые методики демонстрируют существенные недостатки при их трансляции в ограниченную клиническую практику.

Цель работы: проанализировать сравнительную эффективность принципиально различных невирусных методов модификации первичной культуры мезенхимных стромальных клеток (МСК) для использования внутри клеточно-инженерной конструкции (КИК) при замещении поверхностных дефектов гиалинового хряща.

В рамках достижения цели необходимо было решить следующие экспериментальные задачи:

1. Оценить возможность эффективность модификации клеточной культуры МСК с помощью низкоинтенсивного лазерного излучения с длиной волны 632,8 нм.

2. Оценить возможность эффективность модификации клеточной культуры МСК с помощью рекомбинантного цитокина ТОБ-Р3

3. Оценить возможность эффективность модификации клеточной культуры МСК с помощью методики трансфицирования созданной плазмидой, несущей ген трансформирующего фактора роста Р3 - tgfв3.

4. Разработать методику заселения объемного биодеградируемого полимера клеточной культурой с получением опытной КИК.

5. Разработать модель стандартизированного поверхностного дефекта гиалинового хряща крысы с изготовлением опытного устройства.

6. Экспериментально оценить собственную (фоновую) регенеративную способность гиалинового хряща коленного сустава крысы.

7. Оценить результаты применения опытной КИК с выбранной системой модификации в эксперименте in vivo.

Научная новизна работы: Разработано оригинальное устройство для создания стандартизированных повреждений коленного сустава крысы и получен патент РФ (RU 175628 U1).

Разработано оригинальное устройство для совмещения биодеградируемого носителя и культуры клеток, а также получен патент РФ (RU 190863 U1).

В представленной работе впервые произведено сравнение эффективности различных методик невирусной модификации клеточной культуры МСК, таких как использование рекомбинантного белка TGF-P3, созданной рекомбинантной плазмиды, несущей ген tgfP3, а также произведено изучение сравнительной эффективности модификации клеточной культуры с помощью низкоинтенсивного когерентного лазерного излучения с длиной волны 632,8 нм. Впервые изучено сравнение эффективности данных методик и проанализирована возможность их применения в ограниченной клинической практике. В работе впервые была исследована принципиальная возможность и эффективность дальнейшего применения модифицированной данными способами клеточной культуры в составе биодеградируемой КИК при имплантации в область созданного повреждения коленного сустава экспериментального животного.

Теоретическая и практическая значимость работы: Настоящая работа расширяет имеющиеся знания и наработки по восстановлению гиалинового хряща после имплантации опытной КИК. Показана динамика дегенеративных процессов на поверхности гиалинового хряща в зависимости от первоначально созданного повреждения. По анализу результативности исследуемых методик модификации выбран оптимальный невирусный метод изменения пролиферации клеточной культуры, а также показана нецелесообразность трансфицирования клеточной культуры для использования внутри КИК. Полученная КИК с выбранной системой модификации рекомбинантным белком TGF-P3 может быть использована для замещения поверхностных дефектов гиалинового хряща у более крупных экспериментальных животных, а также в ограниченной клинической практике. Метод и оборудование для изготовления КИК может быть использован для создания аналогичных КИК и проведения дальнейших экспериментов in vitro и анализа экспериментальной эффективности альтернативных способов модификации клеточной культуры.

Положения, выносимые на защиту

1. Модификация первичной клеточной культуры МСК с помощью липофекции плазмидой, несущей ген tgfft3, возможна, однако данный метод имеет существенные ограничения при дальнейшем применении в тканевой инженерии гиалинового хряща в составе КИК из-за низкой эффективности, высокой цитотоксичности процедуры, кратковременности эффекта модификации клеток, а также сложности стандартизации методики.

2. Модификация клеточной культуры с помощью низкоинтенсивного когерентного лазерного излучения с длиной волны 632,8 нм инициирует хондрогенную дифференцировку и увеличивает экспрессию основных генов, ответственных за пролиферацию гиалинового хряща (col2a1, tgfP3, sox9), однако, это воздействие менее эффективно, чем воздействие рекомбинантным белком TGF-P3. Использование этого метода перспективно для регенерации гиалинового хряща и легко может быть транслируемо в ограниченную клиническую практику.

3. Модификация клеточной культуры МСК с помощью цитокина TGF-P3 эффективна, нетоксична, приводит к хондрогенной пролиферации клеточной культуры, образованию хондроагрегатов, значительному увеличению экспрессии основных генов хондрогенеза (col2a1, tgfft3, sox9), а также увеличению синтеза коллагена II типа. Данная невирусная модификация может быть внедрена в ограниченную клиническую практику при тканевой инженерии гиалинового хряща.

4. Созданная опытная КИК, предварительно модифицированная белком TGF-P3, при имплантации в область поверхностного экспериментального дефекта коленного сустава половозрелой крысы способствует более эффективной регенерации гиалинового хряща по сравнению с КИК без модификации и стимулирует восстановление поверхности суставного хряща.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Модификация культуры мезенхимных стромальных клеток для клеточно-инженерного замещения дефектов гиалинового хряща»

Апробация работы

Результаты представлены в следующих статьях:

1. Божокин М.С., Божкова С.А., Нетылько Г.И. (2016). Возможности современных клеточных технологий для восстановления поврежденого суставного хряща (Аналитический обзор литературы). Травматология и Ортопедия России, 22(3), 122-134.

DOI: 10.21823/2311 -2905-2016-22-3-122-134

2. Божокин М.С., Божкова С.А., Нетылько Г.И., Наконечный Д.Г., Блинова М.И.,

Нащекина Ю.А. (2018). Результаты замещения поверхностного дефекта гиалинового хряща крысы клеточно-инженерной конструкцией в эксперименте, Труды Карельского научного центра Российской академии наук. № 4. С. 13-22. DOI: 10.17076/them815

3. Божокин М.С., Божкова С.А., Вчерашний Д.Б., Бейлинсон Л.Л., Литвинов С.Д., Косьмин В.Л., Новосельцев С.В., Круглов В.Н. (2019). Динамическое заселение биодеградируемого носителя клеточной культурой мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток. Вестник медицинского института "РЕАВИЗ": реабилитация, врач и здоровье. № 6 (42). С. 38-43.

4. Божокин М.С., Божкова С.А., Нетылько Г.И., Анисимова, Наконечный, Нащекина Ю.А., Блинова М.И., Жеребцова Ю.В., Бенгардт Е.А. (2020). Результаты применения цитокина TGF-b3 для модификации клеточно-инженерной конструкции при замещении дефекта суставного гиалинового хряща в эксперименте. Современные проблемы науки и образования. № 4. С. 152. DOI: 10.17513/spno.29920

5. Bozhokin M.S., Vcherashnii D.B., Yastrebov S.G., Beilinson L.L., Khotin M.G. (2020). Stimulation of col2a1 gene expression with low-power laser radiation as a means to induce cartilage formation. Technical Physics. Т. 65. № 9. С. 1521-1523. DOI: 10.1134/S1063784220090091

6. Bozhokin M.S., Sopova Y.V., Kachkin D.V., Rubel A.A., Khotin M.G., (2020). Mechanisms of TGF-P3 action as a therapeutic agent for promoting the synthesis of extracellular matrix proteins in hyaline cartilage. Biochemistry (Moscow). Т. 85. № 4. С. 436-447. DOI: 10.1134/S0006297920040045

7. Bozhokin M.S., Bozhkova S.A., Sopova J.V., Nashchekina Y.A., Bildyug N.B., Khotin M.G., Rubel A.A. (2021). Specificities of scanning electron microscopy and histological methods in assessing cell-engineered construct effectiveness for the recovery of hyaline cartilage. Methods and Protocols. Т. 4. № 4. DOI: 10.3390/mps4040077

8. Bozhokin M.S., Bozhkova S.A., Netylko G.I., Nakonechny D.G., Anisimova L.O., Nashchekina Y.A., Blinova M.I. (2021) Experimental replacement of the surface defect of rat hyaline cartilage by a cell-engineered construct. Regenerative Engineering and Translational Medicine. Т. 7. № 2. С. 184-193. DOI: 10.1007/s40883-021-00205-2

9. Божокин М.С., Божкова С.А., Нащекина Ю.А., Сопова Ю.В., Рубель А.А., Хотин М.Г. (2021). Использование трансфекции мезенхимных мультипотентных стромальных клеток (ММСК) в качестве системы модификации культуры клеток для дальнейшего использования при замещении дефектов гиалинового хряща. Современные проблемы науки и образования. № 4. С. 90. DOI: 10.17513/spno.31052

10. Bozhokin M.S., Zherebtsova J.V., Khotin M.G., Vcherashnii D.B., Yastrebov S.G., Beilinson L.L. (2022). Low-intensity photobiomodulation at 632,8 nm increases tgffi3, col2a1, and sox9 gene expression in rat bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. Lasers in Medical Science. DOI: 10.1007/s10103-021-03279-0

11. Shestovskaya M.V., Sopova J.V., Khotin M.G., Bozhkova S.A., Bozhokin M.S. (2021).

Methods of modification of mesenchymal stem cells and conditions of their culturing for

hyaline cartilage tissue engineering. Biomedicines. V. 9. № 11. DOI:

10.3390/biomedicines9111666

По результатам работы получены следующие патенты:

Божокин М.С., Божкова С.А., Литвинов Е.М., Косьмин В.Л. Устройство для совмещения клеточной культуры и биодеградируемого носителя Патент на полезную модель RU 190863 U1, 15.07.2019. Заявка № 2019104311 от 15.02.2019.

Божокин М.С., Божкова С.А., Волков А.А. Устройство для формирования стандартизированных дефектов хрящевой поверхности суставов в эксперименте. Патент на полезную модель RU 175628 U1, 12.12.2017. Заявка № 2017116594 от 11.05.2017.

Материалы представлены на всероссийских и международных симпозиумах, конгрессах и конференциях с 10 устными докладами и 2 постерными (Young biologist Week (Петрозаводск 2017), StemCellBio (Санкт-Петербург 2018), Актуальные проблемы трансляционной медицины (Санкт-Петербург 2018), Актуальные проблемы трансляционной медицины (Санкт-Петербург 2019), Актуальные проблемы клеточной биологии и клеточных технологий (Санкт-Петербург 2019), Регенеративная медицина (Москва 2019), Конференция молодых ученых (Санкт-Петербург 2020), Актуальные проблемы биомедицины (Санкт-Петербург 2020), Регенеративная биология и медицина (Санкт-Петербург 2021), Регенеративная медицина (Москва 2017), Регенеративная медицина (Москва 2019)

Объем и структура диссертации: Диссертация изложена на 128 страницах и состоит из следующих разделов: Оглавление, Список сокращений, Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, семь глав Результатов собственных исследований, Обсуждение результатов, Выводы, Список литературы и Приложение. В список литературы включен 228 источник. Работа иллюстрирована семью таблицами и 38 рисунками. Приложение к диссертации содержит 8 страниц.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1 ГИАЛИНОВЫЙ ХРЯЩ

Гиалиновый хрящ - аваскулярная соединительная ткань поверхности суставов, состоящая преимущественно из белков внеклеточного матрикса и небольшого количества высокоспецифичныхклеток - хондроцитов (около 5% общей массы) [1].

Основные белки внеклеточного матрикса - коллаген II типа и аггрекан. Высокая насыщенность гиалинового хряща водой (2/3 от общей массы) дает ему способность не только обратимо деформироваться, но и выдерживать внушительные механические нагрузки. С другой стороны, гладкая поверхность позволяет осуществлять сгибание сустава с минимальным трением [4]. Однако, аваскулярная структура, малое количество клеток, преобладание внеклеточного матрикса и воды, а также большие механические нагрузки являются, по всей видимости, причинами недостаточной регенерации гиалинового хряща [5]. Следовательно, поиск путей и методов восстановления суставных поверхностей является актуальной и нерешенной задачей [6]. Деградация гиалинового слоя как в диаметре, так и в глубину (до субхондральной кости) обусловлена возникающими повреждениями, причем дефект стремительно увеличивается с течением времени во всех измерениях [7]. Следствием дегенеративных процессов, происходящих в гиалиновом слое, является стремительное разрушение суставного хряща. Это приводит к нарушению функции сустава, возникновению устойчивого болевого синдрома, значительному снижению качества жизни и, в силу этого, необходимости проведения сложной и инвазивной процедуры эндопротезирования. Чаще всего такой процедуре подвергаются самые нагружаемые суставы - коленный и тазобедренный [8].

Существует целый ряд причин возникновения дефектов в тазобедренных и коленных суставах: травмы, различные заболевания, избыточный вес, чрезмерные физические и спортивные нагрузки, генетическая предрасположенность [9]. Миллионы людей в современном мире страдают заболеваниями и повреждениями суставного хряща, а количество клинических вмешательств в области коленного сустава растет из года в год. Прогноз Стивена М. Курца [10] в 2007 году был довольно неутешительным. Он подсчитал, что с 2007 по 2030 годы количество эндопротезирований только коленного сустава в США из-за целого ряда факторов увеличится с 700 тысяч до 3,4 миллионов в год, то есть даже не в арифметической, а в геометрической прогрессии. К сожалению, большое количество методик восстановления поврежденного гиалинового слоя, которыми обладают современные хирурги (например, хондропластика и микрофрактурирование [8]), не дает возможности решить данную проблему в полном объеме.

1.1.1 Восстановления гиалинового хряща

Исследование проблемы восстановления повреждённой поверхности сустава началось ещё в XVIII веке. Одним из первых исследований, посвящённых регенерации гиалинового хряща была работа Вильяма Хантера 1743 г., где он отметил, что однажды повреждённый хрящ уже никогда не восстанавливался, а в 1853 г. Джеймс Рагет написал: «Неизвестно ни единого случая, когда потерянная часть хряща восстанавливалась новым, хорошо сформированным хрящом» [1]. В середине XX века исследователи предположили, что для регенерации хряща нужен доступ питательных веществ и клеток в зону дефекта из-за его аваскулярной природы. Так, в 1960-х годах появилась технология субхондральной туннелизации и её модернизированная версия - микрофрактурирование (или микрофрактуринг) [11]. Суть метода заключалась в создании в зоне дефекта гиалинового хряща множественных отверстий («туннелей») в подлежащую субхондральную кость, через которые мигрировали клетки костного мозга. Данная технология позволяла получить положительный результат только в краткосрочной перспективе, и с течением времени, регенерат, образовавшийся на месте первоначального повреждения, деградировал вновь. Несмотря на существенные недостатки, данный метод применяется в клинической практике во многих странах мира и в настоящее время [1,12]. Однако, на наш взгляд, самым широкоиспользуемым сейчас методом восстановление функции повреждённого сустава (коленного и тазобедренного) является дорогостоящая, высокоинвазивная и рискованная операция эндопротезирования, то есть замены на искусственный эндопротез.

1.1.2 Клеточная инженерия гиалинового хряща

В 1994 году группа шведских исследователей во главе с М. Бриттбергом предложила принципиально новый метод [13]. Суть его заключалась в следующем: у пациента предварительно осуществлялся забор аутологичных хондроцитов, затем проводилось их культивирование in vitro, и далее в область дефекта имплантировали культуру клеток. Данную технологию назвали ACI (Autological Chondrocyte Implantation). Со временем, вместо культуры хондроцитов предложили использовать культуру мезенхимных стромальных клеток (МСК), индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs - Induced Pluripotent Stem Cells), а также клеток из других источников [14] в сочетании с биодеградируемым носителем, который назвали скаффолдом, от английского слова scaffold - строительные леса. Широкое распространение в качестве матрицы получили биоматериалы на основе коллагена, агарозы, альгината, хитозана и гиалуроновой кислоты (ГК), а также разнообразные полимолочные кислоты (полилактиды) [15]. Существует ряд коммерческих продуктов для фиксации клеточной

культуры (например, ChondroGyde® и др.). Доказано, что трехмерная структура матрицы положительно влияет на дифференцировку клеточной культуры в хондрогенном направлении, в результате чего происходит формирование внеклеточного матрикса, характерного для гиалинового хряща и повышается синтез ключевых белков (таких как коллаген II типа и аггрекан) [16]. Так началась эпоха применения клеточно-инженерных конструкций для замещения дефектов гиалинового хряща. Использование такой комбинации позволяло зафиксировать трансплантируемую культуру клеток внутри области дефекта. Это существенно уменьшает миграцию клеток из зоны повреждения на начальном этапе, а непосредственно после трансплантации применение биодеградируемого полимера защищает клетки от значительных механических нагрузок. Уже в среднесрочной перспективе были получены положительные результаты. Но вскоре стало понятно, что на больших временных сроках регенерат снова подвергался деградации [17]. Был сделан вывод, что используемая клеточная культура (хондроцитов, МСК или других клеток), скорее всего, не позволяет за короткое время создать регенерат, способный выполнять функции неповрежденного гиалинового хряща в полной мере [1].

1.1.3 Методы модификации клеточной культуры

По лабораторным исследованиям видно, что успешное восстановление хрящевой ткани зависит не только от способности хондроцитов к пролиферации, но и от направления дедифференцировки клеток внутри тканеинженерной 3D-матрицы [18]. Для достижения лучшего терапевтического эффекта возникла идея предварительно искусственно модифицировать используемую культуру клеток, чтобы придать или усилить те свойства, которые у нее первоначально отсутствовали [1].

Потенциал для модификации клеточной культуры в настоящее время велик. Однако, существуют всего три принципиальные группы методов модификации клеточной культуры:

А) Физическое (механическое) воздействие, которое осуществляется с помощью электромагнитного излучения, механического давления, изменения газовой среды и т.д. [19,20,21,22]. Данный метод является относительно простым в исполнении и экономически доступным, однако, недостаточно эффективным. Считается, на данный момент, что возможности этого метода модификации клеточной культуры ограничены и доступны лишь в небольших пределах.

Б) Химическое воздействие представляет собой процедуру, при которой к культуре клеток добавляются различные агенты: химические соединения, гормоны, цитокины, рекомбинантные белки, факторы роста и т.д. [23, 24].

В) Генетическое воздействие - это изменение генетического материала отдельных клеток или всей клеточной популяции [25, 26]. Как следствие, изменяется уровень экспрессии отдельных генов и увеличение (или прекращение) синтеза различных белков. Такие изменения генотипа клеток методически непростая задача, так как природа эволюционно создала множество барьеров для проникновения чужеродной генетической информации в клетки.

Для генетической модификации культуры клеток и восстановления поврежденной суставной поверхности исследователи обратили свой взгляд на белки, участвующие в регуляции хондрогенеза и образовании гиалинового хряща.

1.2 ЦИТОКИН TGF-P3 И ЕГО РОЛЬ В ПРОЛИФЕРАЦИИ ГИАЛИНОВОГО ХРЯЩА

1.2.1 История открытия цитокина TGF-P3

История изучения белка TGF-P3 насчитывает более 40 лет, на сегодняшний день данному белку посвящено около 70 тысяч статей (по данным базы PubMed [27]). Многие белки, принимающие участие в регуляции пролиферации клеток, изначально были названы «факторами роста», так как было проще всего анализировать именно изменение пролиферации клеточной культуры [28]. Именно на это обратили внимание в 1978 году итальянские ученые Тодаро и Де Ларко, которые обнаружили, что клетки вирусно-трансформированной мышечной саркомы 3T3 продуцировали специальный «фактор», под влиянием которого неопухолевые клетки почки крысы (NRK) приобретали неопластический фенотип [29]. Данный фактор назвали "Sarcoma Growth Factor" (SGF) и связали его активность со способностью клеток расти на мягком агаре [30]. Было показано, что SGF состоял на самом деле из двух белков. Первый белок получил название «трансформирующий ростовой фактор-альфа» (Transforming Growth Factor-a, TGF-a). Этот белок стимулировал рост только маленьких колоний неопластических крысиных фибробластов. Второй белок, который стимулировал рост большего количества крупных колоний, назвали «трансформирующий ростовой фактор-бета» (Transforming Growth Factor-P) [31]. Американский ученый Ричард Асоян впервые выделил и подробно описал этот белок в 1983 году [32].

1.2.2 Характеристика белков Суперсемейства TGF-P3

У человека обнаружено 33 белка, имеющих сходное строение димерной структуры и входящих в так называемое Суперсемейство трансформирующего ростового фактора Р [28]. Суперсемейство TGF-P у человека имеет сложную иерархию, однако, несмотря на разнообразие данных белков, все члены и подгруппы этого семейства имеют сходную димерную структуру, похожую на «крылья бабочки». Большинство членов семейства дополнительно

стабилизируются дисульфидными связями между цепями, которые связывают мономеры между собой [33, 34].

Данная группа белков выполняет важнейшую роль в клеточной дифференцировке, миграции и адгезии [35]. Нарушения в синтезе и механизме регуляции активности белков этого семейства приводят к большому количеству заболеваний человека, в том числе, тканевым фиброзам [36] и онкологическим заболеваниям [37, 38, 39].

Суперсемейство TGF-P принципиально можно разделить на пять подгрупп:

1) Изоформы белков подсемейства TGF-P (TGF-P1,TGF-P2,TGF-P3). TGF-1 имеет фундаментальное значение для развития, физиологии и патологии сосудистой системы [40]. TGF-2 связывают с развитием дегенеративных процессов органов зрения [41, 42]. TGF-3 принимает участие в процессах формирования структур дермы (или эпидермиса), а также пролиферации и образовании гиалинового хряща [42, 43, 44].

2) Костные морфогенетические белки BMP (Bone Morfogenetic Proteins) участвуют в формировании и пролиферации костной ткани, стимулируют экспрессию гена Runx2 [45], кодирующего белок Runt-related transcription factor2 (также известного под названием CBF-alpha-1 (core-binding factor subunit alpha-1), который является, в свою очередь, ключевым транскрипционным фактором для остеогенной дифференцировки и пролиферации клеток предшественников.

3) Факторы роста и дифференцировки GDF (Growth and Differentiation Factors) - имеют гомологию с костными морфогенетическими белками, поэтому данные две группы объединены в некоторых классификациях. Белки GDF играют ключевую роль при дифференцировке во время эмбриогенеза и при пролиферации клеток в сформированных тканях, таких как селезенка, яичники, тимус, и другие [33].

4) Активины / ингибины. Данные белки были первоначально описаны в работе Джона Ю. с соавторами как регуляторы фолликул стимулирующего гормона (FSH - Follicle-Stimulating Hormone) [46]. Свое название эти белки получили в 1987 году, когда Николас Лингс с коллегами обнаружили свойство активинов стимулировать высвобождение FSH из гипофиза, в отличие от ингибина, который мог избирательно блокировать секрецию и синтез гормона FSH [47, 48].

На сегодняшний время известно, что эти представители Суперсемейства TGF-P принимают участие во многих процессах жизнедеятельности, начиная от ранних стадий эмбрионального развития и стимулирования секреции гормонов у позвоночных и заканчивая специализированными функциями в дифференцированных клетках и тканях [49].

5) Остальные белки. В эту группу входят белки Lefty, Nodal, мюллеровский ингибиторный фактор (MIF) и другие белки [50]. Они не являются димерными структурами, как остальные члены Суперсемейства TGF-ß, однако, схожи по строению мономерных частей [33, 34].

Белки этой группы имеют разнообразные функции. Так, MIF является важным регулятором дифференцировки репродуктивных органов в процессе эмбрионального развития [51]. Lefty играет важную роль в ингибировании различных сигнальных путей, влияющих на направление дифференцировки [52]. Nodal - один из ключевых белков процесса раннего эмбрионального развития и формирования мезодермы у позвоночных [53]. Номенклатура названий белков Суперсемейства TGF-ß довольно сложна, и многие из них исторически получили несколько названий, которые не всегда верно отражают их функции [54].

Белки Суперсемейства TGF-ß наиболее заметное влияние оказывают на клеточную дифференцировку в целом и синтез внеклеточного матрикса в частности, несмотря на все многообразие функций, которые выполняют [54].

В связи со значительной ролью (если не основной), которую играет непосредственно белок TGF-ß3 в пролиферации и хондрогенной дифференцировке (с учетом особой роли внеклеточного матрикса в функции гиалинового хряща), в данной работе мы подробно рассмотрим цепочку молекулярных процессов, начиная от взаимодействия белка с рецепторами на поверхности клеточной мембраны и заканчивая увеличением экспрессии генов внеклеточного матрикса.

Изоформы белка TGF-ß представляют собой небольшие секретируемые во внеклеточное пространство гомодимерные сигнальные белки [50]. У млекопитающих выявлено только три из них: TGF-ß1, TGF-ß2 и TGF-ß3. Белки семейства TGF-ß являются высококонсервативными, степень идентичности между данными изоформами у человека и некоторых млекопитающих может достигать почти 100%, поэтому в экспериментальных работах на животных часто используют белок человеческого происхождения.

1.2.3 Рецепторы цитокинов TGF-ß3 на поверхности клетки

Клеточный сигналинг, опосредованный белками подсемейства изоформ TGF-ß, начинается с взаимодействия белка TGF-ß с его рецепторами TßR, которые находятся на плазматической мембране. Три изоформы TGF-ß1, TGF-ß2 и TGF-ß3 связываются с рецепторами TßRI, TßRII и TßRIII. При этом один и тот же белок может присоединяться ко всем вышеназванным рецепторам, но с разной аффиностью [28, 55]. Рецепторы TßRI и TßRII (первого и второго типа) находятся на поверхности большинства клеток организма. Их

количество варьируется от 5 до 10 тысяч на клетку, количество рецепторов TPRIII может составлять до 200 тысяч на одну клетку [28, 56]. Рецепторы являются двухспецифическими киназами (то есть способны фосфорилировать как серин и треонин, так и тирозин [57]), передающими сигнал из внеклеточного пространства к внутриклеточным медиаторам - Smad белкам, постоянно циркулирующим между цитоплазмой и ядром. Рецептор TpRII фосфорилирует TPRI, что инициирует Smad-опосредованный сигналинг [35, 58]. В ядре Smad белки выполняют роль транскрипционных факторов и взаимодействуют с определенными последовательностями ДНК в промоторной области. Таким образом они регулируют экспрессию различных генов. Белок TGF-P3 может активировать не только сигнальный путь Smad (канонический путь - Canonical Pathway), но и другие сигнальные пути (неканонический путь - Non-canonical pathway), например, сигнальный путь фосфоинозитид-3-киназы (PI3K), путь митоген-активируемой протеинкиназы MAPK (ERK, JNK and p38), протеинкиназы В (AKT) и протеинкиназы (mTOR - мишень рапамицина у млекопитающих) - (PI3K/AKT/mTOR). Эти пути напрямую не связаны с увеличением синтеза белков внеклеточного матрикса, поэтому в данной работе подробно рассмотрены не будут.

К TpRI относятся активин-рецепторные киназы 1-7 (ALK1-7). При этом в сигналинге, опосредованном TGF-P, принимает участие киназа ALK5.

Класс TPRII включает непосредственно TPRII (TGF-P type II или TpRII, который является серин-треониновой киназой), рецептор для костного морфогенетического белка 2 (BMPRII), активиновый рецептор II (ACTRII, ACTRIIB), а также рецептор антимюллерового гормона II (AMHRII).

Класс TpRIII включает белки бетаглюкан и эндоглин, которые действуют по большей части в виде ко-рецепторов для увеличения эффективности передачи сигнала TGF-P [55].

На поверхности клетки рецепторы существуют в виде мономеров, димеров и гетеромеров. Это позволяет транслировать сигнал в клетку только в случае образования упорядоченного рецепторного комплекса при его взаимодействии с лигандом [28].

При присоединении лиганда к соответствующему рецептору происходит образование тетрамерного гетерокомплекса, который состоит из двух рецепторов I типа и двух рецепторов II типа [59, 60, 61, 62, 63, 64].

Несмотря на то, что большинство исследователей считает необходимым условием для передачи сигналов образование именно тетрамерного комплекса, Тао Хъянг с соавторами показал, что и димер, состоящий из рецепторов TpRI и TpRII, способен эффективно передать соответствующий сигнал во внутриклеточное пространство [65]. После образования

тетрамерного гетерокомплекса происходит трансфосфорилирование TpRI под действием TPRII и запускается дальнейшая цепочка передачи сигналов во внутриклеточное пространство.

Активность рецепторов также может регулироваться другими пострансляционными модификациями, например, убиквитинованием [66, 67, 68, 69]. Так как оба рецептора являются полиубиквитированными, то при удалении убиквитина с рецептора TPRI происходит стабилизация рецепторного комплекса и увеличивается эффективность передачи сигнала [70]. Тем самым, ингибирование убиквитинлигазы приводит к дополнительной активации всего комплекса передачи сигналов. Аналогично убиквитированию на рецепторы оказывает влияние сумоилирование (присоединение белка SUMO (от Small Ubiquitin-like Modifier)). Оно приводит к их стабилизации и повышению эффективности передачи сигналов. Сумоилирование также регулирует клеточную локализацию рецепторов [71], влияя на их совместную активацию. Другим механизмом активации является действие шаперона Hsp90. Он стабилизирует оба рецептора на поверхности клеточной мембраны и блокирует их взаимодействие с E3 протеин-убиквитиновой лигазой (убиквитинлигазой), кодируемой геном Smurf2. Данная лигаза взаимодействует с белком Smad7 и образует стабильный комплекс с фосфорилированными белками Smad2 и Smad3, инактивируя их.

Для рецепторного комплекса TpRI/TpRII было исследовано большое число регуляторных белков. Одни из них либо ингибируют передачу сигналов (например, BAMBI, STRAP, Tollip, SIK, FKBP12) [35], либо, наоборот, ее усиливают (например, TSC-22). Протеолитическое расщепление рецепторов под действием белков TACE или ADAM17 ингибирует дальнейший механизм передачи сигналов с помощью TGF-P [72].

1.2.4 Сигналинг, опосредованный Smad белками

Экспрессия генов регулируется белком TGF-P3 путем взаимодействия с рецепторами TpRI/TpRII. Это индуцирует опосредованную активацию внутриклеточных Smad белков. Smad белки, первоначально открытые у дрозофилы, свое название получили по аббревиатурам белков белков SMAll («маленький» червь) Caenorhabditis elegans и MAD («Mothers Against Decapentaplegic») Drosophila melanogaster. Smad белки передают сигнал с внутренней части клеточной мембраны в ядро для активации экспрессии различных генов (в том числе генов внеклеточного матрикса). Семейство Smad белков является важнейшим медиатором регуляции сигналинга TGF-P3. На сегодняшнее время описано большое количество механизмов регулирования действия данных белков [73].

Известно три разновидности белков Smad, включающих в себя 8 членов данного семейства. Их можно разделить на три принципиальные подгруппы:

рецептор-регулируемые R-Smad (Smadl, Smad2, Smad3, Smad5, Smad9) (иногда в литературе встречается обозначение Smad8 или Smad8/9, так как у белка, кодируемого геном Smad9, есть две изоформы - Smad8 и Smad8b [74]).

2)

партнеры Co-Smad (в литературе встречаются обозначение Co-Smad или CSmad, или Smad4 (Smad4 «Common partner»)),

3)

ингибиторы I-Smad (Smad6, Smad7)

Представители Smad белков - Smadl, Smad5 и Smad8/9, относящиеся к группе R-Smad, а также представитель I-Smad - белок Smad6, участвуют в передаче сигналов, опосредованных белками BMP и GDF [45, 75], но не белками TGF-P1-3. Действие белков Smad1,5,8/9 важно в регулировании процессов, связанных с остеогенезом. R-Smad могут активировать и(или) блокировать транскрипцию фактора Runx2 - главного регулятора развития костной ткани. Хондрогенная и остеогеннная дифференцировка являются взаимно исключающими одновременными процессами по отношению к одной клетке. Поэтому, мы считаем, логично, что активация одного пути неминуемо ведет к ингибированию другого. Например, было показано, что белки Smad2 и Smad3 ингибируют экспрессию гена Runx2 [75]. Smad3, проникая в составе комплекса Smad2/3 + Smad4 в ядро, рекрутирует гистон-деацетилазу II (HDAC), которая действует как ко-репрессор в Smad3-опосредованной транскрипционной репрессии фактора Runx2, что подтверждает негативное влияние воздействия исключительно TGF-P белка (без цитокина BMP2) на остеогенез [75].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Божокин Михаил Сергеевич, 2022 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Божокин, М., Божкова, С., Нетылько, Г. (2016). Возможности современных клеточных технологий для восстановления поврежденого суставного хряща (аналитический обзор литературы). Травматология и ортопедия России, 22, 122-134.

2. Roseti, L., Desando, G., Cavallo, C., Petretta, M., Grigilo, B. (2019). Articular Cartilage Regeneration in Osteoarthritis. Cells, 5(11), 1305. https://doi.org/10.3390/cells8111305.

3. Langer, E., Vacanti, J.P. Tissue enginneging. Science, 1993, 260(5110), 920-926. https://doi.org/10.1126/science.8493529.

4. Sophia Fox, A.J., Bedi, A., Rodeo, S.A. (2009). The basic science of articular cartilage: Structure, composition, and function. Sports Health, 1(6), 461-468. https://doi.org/10.1177/1941738109350438

5. Советников, Н.Н., Кальсин, В.А. Коноплянников, М.А., Муханов, В.В. (2013). Клеточные технологии и тканевая инженерия в лечении дефектов суставной поверхности. Клиническая практика, 1, 52-66.

6. Bornes, T.D., Adesida, A.B., Jomha, N.M. (2014). Mesenchymal stem cells in the treatment of traumatic articular cartilage defects: A comprehensive review. Arthritis Res Ther, 16(5), 432. https://doi.org/10.1186/s13075-014-0432-1

7. Божокин, М.С., Божкова, С.А., Нетылько, Г.И., Румакин, В.П., Наконечный, Д.Г., Чепуренко, М.Н. (2017). Морфофункциональная характеристика хондрорегенераторного процесса в экспериментальном локальном дефекте поверхности суставного хряща. Международный журнал прикладных и фундаментальных исследований, 5(2), 302-306. https://doi.org/10.1126/science.139.3549.32

8. Maglio, M., Brogini, S., Pagani, S., Giavaresi, G., Tschon, M. (2019). Current Trends in the Evaluation of Osteochondral Lesion Treatments: Histology, Histomorphometry, and Biomechanics in Preclinical Models. Biomed. Res. Int., 2019, 4040236. https://doi.org/10.1155/2019/4040236

9. Jeuken, R.M., Roth, A.K., Peters, R.J.R.W, et al. (2016). Polymers in cartilage defect repair of the knee: Current status and future prospects. Polymers (Basel), 5(6), 219.https://doi.org/10.3390/polym8060219

10. Kurtz, S., Ong, K., Lau, E., Mowat, F., Halpern, M. (2007). Projections of primary and revision hip and knee arthroplasty in the United States from 2005 to 2030. J. Bone Jt Surg - Ser A, 59(4), 780-785. https://doi.org/10.2106/JBJSJ.00222

11. Planka, L., Stary, D., Srnec, R., Necas, A., Gal P. (2008). New options for management of posttraumatic articular cartilage defects. Rozhl. Chir., 57(1), 42-45

12. Erggelet, C., Vavken, P. (2016). Microfracture for the treatment of cartilage defects in the knee joint - A golden standard? J. Clin. Orthop. Trauma, 7(3), 145-152. https://doi.org/10.1016/jjcot.2016.06.015

13. Brittberg, M., Lindahl, A., Nilsson, A., Ohlsson, C., Isaksson, O., Peterson, L. (1994). Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N. Engl. J. Med, 331(14), 889-895. https://doi.org/10.1056/NEJM199410063311401

14. Diederichs, S., Gabler, J., Autenrieth, J., et al. (2016). Differential Regulation of SOX9 Protein during Chondrogenesis of Induced Pluripotent Stem Cells Versus Mesenchymal Stromal Cells: A Shortcoming for Cartilage Formation. Stem Cells Dev. 25(8), 598-609. https://doi.org/10.1089/scd.2015.0312

15. Naderi-Meshkin, H., Andreas, K., Matin, MM. Bidkhori, H.R., Ahmadiankia, N., Bahrami, A.R. (2013). Chitosan-based injectable hydrogel as a promising in situ forming scaffold for cartilage tissue engineering. Cell Biol. Int. , 35(1), 72-84.

16. Martinez, I., Elvenes, J., Olsen, R., Bertheussen K. (2008). Redifferentiation of in vitro expanded adult articular chondrocytes by combining the hanging-drop cultivation method with hypoxic environment. Cell Transplant., 17, 987-996.

17. Xiang, Y., Bunpetch, V., Zhou, W., Ouyang H. (2019). Optimization strategies for ACI: A step-chronicle review. J. Orthop. Transl., 17, 3-14. https://doi.org/10.1016/jjot.2018.12.005

18. Grigolo, B., Lisignoli, G., Piacentini, A., Fiorini, M.G.P., Mazzotti, G., Duca, M., Pavesio A. (2002) Evidence for redifferentiation of human chondrocytes grown on a hyaluronan-based biomaterial (HYAff 11): molecular, immunohistochemical and ultrastructural analysis. Biomaterials, 23(4), 1187-1195.

19. Skuse, G.R., Lamkin-Kennard, K.A. (2013). Reverse engineering life: Physical and chemical mimetics for controlled stem cell differentiation into cardiomyocytes. Methods Mol Biol, 1001, 99-114. https://doi.org/10.1007/978-1-62703-363-3_9

20. Tokuda, S., Yu, A.S.L. (2019). Regulation of epithelial cell functions by the osmolality and hydrostatic pressure gradients: A possible role of the tight junction as a sensor. Int. J. Mol. Sci., 20(14), 3513. https://doi.org/10.3390/ijms20143513

21. Vieira, H.L.A., Alves, P.M., Vercelli, A. (2011). Modulation of neuronal stem cell differentiation by hypoxia and reactive oxygen species. Prog Neurobiol., 93(3), 444-455. https://doi.org/10.1016/j.pneurobio.2011.01.007

22. Khamo, J.S., Krishnamurthy, V.V., Sharum, S.R., Mondal, P., Zhang, K. (2017). Applications of Optobiology in Intact Cells and Multicellular Organisms. J. Mol. Biol., 429(20), 2999-3017. https://doi.org/10.1016/jjmb.2017.08.015

23. bo^okhh, M.C., Eo^KOBa, C.A., HeTbrnbKO, T.H., et al. (2018). Experimental Results of Rat

Hyaline Cartilage Surface Defect Replacement With a Cell Engineering Structure. Proc Karelian Res. Cent. Russ. Acad. Sci, 4, 13-22. https://doi.org/10.17076/them815

24. Kuroda, Y., Kawai, T., Goto, K., Matsuda, S. (2019). Clinical application of injectable growth factor for bone regeneration: a systematic review. Inflamm. Regen., 39(1), 1-10. https://doi.org/10.1186/s41232-019-0109-x

25. Hamann, A., Nguyen, A., Pannier, A.K. (2019). Nucleic acid delivery to mesenchymal stem cells: A review of nonviral methods and applications. J. Biol. Eng., 13, 7. https://doi .org/10.1186/s13036-019-0140-0

26. Oggu, G.S., Sasikumar, S., Reddy, N., Ella, K.K.R., Rao, C.M., Bokara, K.K. (2017). Gene Delivery Approaches for Mesenchymal Stem Cell Therapy: Strategies to Increase Efficiency and Specificity. Stem Cell Rev Reports, 13(6), 725-740. https://doi.org/10.1007/s12015-017-9760-2

27. Moses, H.L., Roberts, A.B., Derynck, R. (2016). The discovery and early days of TGF-b: A historical perspective. Cold Spring Harb Perspect Biol, 8(7), a021865. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a021865

28. Derynck, R., Budi, E.H. (2019). Specificity, versatility, and control of TGF-b family signaling. Sci. Signal, 12(570), eaav5183 https://doi.org/10.1126/scisignal.aav5183

29. De Larco, J.E., Todaro, G.J. (1978). Growth factors from murine sarcoma virus-transformed cells. Proc Natl Acad. Sci. USA, 75(8), 4001-4005. https://doi.org/10.1073/pnas.75.8.4001

30. Todaro, G.J., De Larco, J.E., Fryling, C.M. (1982). Sarcoma growth factor and other transforming peptides produced by human cells: interactions with membrane receptors. Fed Proc, 41(13), 2996-3003.

31. Kastin, A. Handbook of Biologically Active Peptides. (2013). Amsterdam: Elsever. https://doi.org/ 10.1016/C2010-0-66490-X

32. Assoian, R.K., Komoriya, A., Meyers, C.A., Miller, D.M., Sporn, M.B. (1983). Transforming growth factor-ß in human platelets. Identification of a major storage site., purification., and characterization. J. Biol. Chem., 258(11), 7155-7160.

33. Herpin, A., Lelong, C., Favrel P. (2004). Transforming growth factor-ß-related proteins: An ancestral and widespread superfamily of cytokines in metazoans. Dev Comp Immunol. Published online 2004. https://doi.org/10.10167j.dci.2003.09.007

34. Kwiatkowski, W., Gray, P.C., Choe, S. Engineering TGF-ß superfamily ligands for clinical applications. Trends Pharmacol. Sci, 28(5), 461-485 https://doi.org/10.1016/j.tips.2014.10.006

35. Hata, A., Chen, Y.G. (2016). TGF-ß signaling from receptors to smads. Cold Spring Harb. Perspect. Biol, 8(9), a022061. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a022061

36. Frenkel, S.R., Saadeh, P.B., Mehrara, B.J., et al. (2000). Transforming growth factor beta

superfamily members: Role in cartilage modeling. Plast. Reconstr. Surg, 105(3), 980-090. https://doi.org/10.1097/00006534-200003000-00022

37. Reddi, A.H., Cunningham, N.S. (1990). Bone induction by osteogenin and bone morphogenetic proteins. Biomaterials, 11, 33-4.

38. Glick, A.B., Weinberg, W.C., Wu, I.H., Quan, W., Yuspa, S.H. (1996). Transforming growth factor beta 1 suppresses genomic instability independent of a G1 arrest, p53, and Rb. Cancer Res, 56(16), 3645-50. [published erratum appears in Cancer Res., 1997 May 15, 57(10), 2079].

39. Massague, J. (1999). Wounding Smad. Nat. Cell. Biol, 1(5), E117-9. https://doi.org/10.1038/12944

40. Lu, Y., Boer, J.M.A., Barsova, R.M., et al. (2012). TGFB1 genetic polymorphisms and coronary heart disease risk: a meta-analysis. BMC Med. Genet., 13, 39. https://doi.org/10.1186/1471-2350-13-39

41. Rao, K.N., Nagireddy, S., Chakrabarti, S. (2011) Complex genetic mechanisms in glaucoma: An overview. Indian Journal of Ophthalmology, 59 Suppl(Suppl1), S31-42. https://doi.org/10.4103/0301-4738.73685

42. Leutermann, R., Sheikhzadeh, S., Brockstadt, L., et al. (2014). A 1-bp duplication in TGFB2 in three family members with a syndromic form of thoracic aortic aneurysm. Eur. J. Hum. Genet., 22(7), 944-8. https://doi.org/10.1038/ejhg.2013.252

43. Occleston, N.L., Laverty, H.G., O'Kane, S., Ferguson, M.W.J. (2008). Prevention and reduction of scarring in the skin by Transforming Growth Factor beta 3 (TGFP3), From laboratory discovery to clinical pharmaceutical. Journal of Biomaterials Science, Polymer Edition, 19(8), 1047-63. https://doi.org/10.1163/156856208784909345

44. Gilbert, R.W.D., Vickaryous, M.K., Viloria-Petit, A.M. (2016). Signalling by transforming growth factor beta isoforms in wound healing and tissue regeneration, J. Dev. Biol. 4(2), 21. https://doi.org/10.3390/jdb4020021

45. Furumatsu, T., Tsuda, M., Taniguchi, N., Tajima, Y., Asahara, H. (2005). Smad3 induces chondrogenesis through the activation of SOX9 via CREB-binding protein/p300 recruitment. J. Biol. Chem, 250(9), 8343-50. https://doi.org/10.1074/jbc.M413913200

46. Yu, J., Shao, L.E., Lemas, V., et al. (1987). Importance of FSH-releasing protein and inhibin in erythrodifferentiation. Nature, 330(6150), 765-7. https://doi.org/10.1038/330765a0

47. Bloise, E., Ciarmela, P., Dela Cruz, C., Luisi, S., Petraglia, F., Reis, F.M. (2019). Activin A in mammalian physiology. Physiol. Rev, 99(1), 739-780. https://doi.org/10.1152/physrev.00002.2018

48. Ling, N., Ying, S.Y., Ueno, N., et al. (1986). Pituitary FSH is released by a heterodimer of the P-subunits from the two forms of inhibin. Nature, 321(6072), 779-782.

https://doi.org/10.1038/321779a0

49. Namwanje, M., Brown, C.W. (2016). Activins and inhibins: Roles in development., physiology., and disease. Cold Spring Harb Perspect Biol., 8(7), a021881. https://doi .org/ 10.1101/cshperspect.a021881

50. Chin, D., Boyle, G.M., Parsons, P.G., Coman, W.B. (2004). What is transforming growth factor-beta (TGF-P)? Br. J. Plast. Surg, 57(3), 215-221. https://doi.org/10.10167j.bjps.2003.12.012

51. Kushnir, V.A., Seifer, D.B., Barad, D.H., Sen, A., Gleicher, N. (2017). Potential therapeutic applications of human anti-Müllerian hormone (AMH) analogues in reproductive medicine. J. Assist. Reprod. Genet, 34(9), 1105-1113. https://doi.org/10.1007/s10815-017-0977-4

52. Tabibzadeh, S., Hemmati-Brivanlou, A. (2006). Lefty at the Crossroads of "Sternness" and Differentiative Events. Stem Cells, 24(9), 1998-2006. https://doi.org/10.1634/stemcells.2006-0075

53. Jones, C.M., Kuehn, M.R., Hogan, B.L.M., Smith, J.C., Wright, C.V.E. (1995). Nodal-related signals induce axial mesoderm and dorsalize mesoderm during gastrulation. Development, 121(11), 3651-3662. https://doi.org/10.1242/dev.121.11.3651

54. Morikawa, M., Derynck, R., Miyazono K. (2016) TGF-P and the TGF-P family: Context-dependent roles in cell and tissue physiology. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8(5), a021873. https://doi .org/ 10.1101/cshperspect.a021873

55. Papageorgis, P., Stylianopoulos, T. (2015). Role of TGFP in regulation of the tumor microenvironment and drug delivery (review). Int. J. Oncol., 46(3), 933-943. https://doi.org/10.3892/ijo.2015.2816

56. Gatza, C.E., Oh, S.Y., Blobe, G.C. (2010). Roles for the type III TGF-P receptor in human cancer. Cell Signal, 22(8), 1163-1174. https://doi.org/10.1016/j.cellsig.2010.01.016

57. Lawler, S., Feng, X.H., Chen, R.H., et al. (1997). The type II transforming growth factor-P receptor autophosphorylates not only on serine and threonine but also on tyrosine residues. J. Biol. Chem, 272(23), 14850-9. https://doi.org/10.1074/jbc.272.23.14850

58. Heldin, C.H., Moustakas, A. (2016). Signaling receptors for TGF-P family members. Cold Spring Harb Perspect Biol, 8(8), a022053. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a022053

59. Ahmadi, A., Najafi, M., Farhood, B., Mortezaee, K. (2019). Transforming growth factor-P signaling: Tumorigenesis and targeting for cancer therapy. J, Cell Physiol., 234(8), 1217312187. https://doi.org/10.1002/jcp.27955

60. Wrana, J.L., Attisano, L., Cárcamo, J., et al. (1992). TGFP signals through a heteromeric protein kinase receptor complex. Cell, 71(6), 1003-1014. https://doi.org/10.1016/0092-8674(92)90395-S

61. Yamashita, H., Ten Dijke, P., Franzén, P., Miyazono, K., Heldin, C.H. (1994). Formation of

hetero-oligomeric complexes of type I and type II receptors for transforming growth factor-ß. J. Biol. Chem, 269(31), 20172-20178.

62. Massagué, J. (1998). TGF-ß signal transduction. Annu. Rev. Biochem., 296(5573), 1646-1647. https://doi.org/10.1146/annurev.biochem.67.L753

63. Massagué, J., Chen, Y.G. (2000). Controlling TGF-beta signaling. Genes Dev, 14(6), 627-644.

64. Feng, X.-H., Derynck, R. (2005). Specificity and versatility in TGF-ß signaling through smads. Annu. Rev. Cell. Dev. Biol, 21, 659-693. https://doi.org/10.1146/annurev.cellbio.21.022404.142018

65. Huang, T., David, L., Mendoza, V., Yang, Y., Villarreal, M., Keya, De., Sun, L., Fang, X., Lopez-Casillas, F., Wrana, J., Hinck, A. (2011). TGF-ß signalling is mediated by two autonomously functioning TßRI:TßRII pairs. EMBO J, 30(7), 1263-1276. https://doi.org/10.1038/emboj.2011.54

66. Atfi, A., Dumont, E., Colland, F., Bonnier, D., Lhelgoualch, A., Prunier, C., Ferrand, N., Clément, B., Wewer, U., Théret, N. (2007). The disintegrin and metalloproteinase ADAM12 contributes to TGF-ß signaling through interaction with the type II receptor. J. Cell. Biol., 178(2), 201-208. https://doi.org/10.1083/jcb.200612046

67. Kang, J.S., Liu, C., Derynck, R. (2009). New regulatory mechanisms of TGF-ß receptor function. Trends Cell Biol, 19(8), 385-394. https://doi.org/10.1016Zj.tcb.2009.05.008

68. Imamura, T., Oshima, Y., Hikita, A. (2013). Regulation of TGF-ß family signalling by ubiquitination and deubiquitination. J Biochem, 154(6), 481-489. https://doi.org/10.1093/jb/mvt097

69. Zuo, W., Huang, F., Chiang, Y.J., et al. (2013). C-Cbl-Mediated Neddylation Antagonizes Ubiquitination and Degradation of the TGF-ß Type II Receptor. Mol. Cell., 49(3), 499-510. https://doi.org/10.10167j.molcel.2012.12.002

70. Zhang, L., Zhou, F., Drabsch, Y., et al. (2012). USP4 is regulated by AKT phosphorylation and directly deubiquitylates TGF-ß type i receptor. Nat. Cell Biol., 14(7), 717-726. https://doi.org/10.1038/ncb2522

71. Flotho, A., Melchior F. (2013). Sumoylation: A Regulatory Protein Modification in Health and Disease. Annu. Rev. Biochem., 82, 357-385. https://doi.org/10.1146/annurev-biochem-061909-093311

72. Mu, Y., Sundar, R., Thakur, N., et al. (2011). TRAF6 ubiquitinates TGFß type i receptor to promote its cleavage and nuclear translocation in cancer. Nat Commun, 2, 330. https://doi.org/10.1038/ncomms1332

73. Massagué, J. (2012). TGFß signalling in context. Nat. Rev. Mol. Cell Biol., 13(10), 616-630. https://doi .org/ 10.1038/nrm3434

74. Nishita, M., Ueno, N., Shibuya, H. (1999). Smad8B, a Smad8 splice variant lacking the SSXS site that inhibits Smad8-mediated signalling. Genes to Cells, 10, 583-591. https://doi.Org/10.1046/j.1365-2443.1999.00285.x

75. Wu, M., Chen, G., Li, Y.P. (2016). TGF-P and BMP signaling in osteoblast., skeletal development., and bone formation., homeostasis and disease. Bone Res, 4, 16009. https://doi.Org/10.1038/boneres.2016.9

76. Zhang, S., Fei, T., Zhang, L., et al. (2007). Smad7 Antagonizes Transforming Growth Factor Signaling in the Nucleus by Interfering with Functional Smad-DNA Complex Formation. Mol. Cell. Biol, 27(12), 4488-4499. https://doi.org/10.1128/mcb.01636-06

77. Gu, W., Monteiro, R., Zuo, J., et al. (2015) A Novel TGFp Modulator that Uncouples R-Smad/I-Smad-Mediated Negative Feedback from R-Smad/Ligand-Driven Positive Feedback. PLoS Biol, 13(2), e1002051. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.1002051

78. Hill, C.S. (2009). Nucleocytoplasmic shuttling of Smad proteins. Cell Res., 19(1), 36-46. https://doi.org/10.1038/cr.2008.325

79. Thielen, N.G.M., van der Kraan, P.M., van Caam, A.P.M. (2019). TGFp/BMP Signaling Pathway in Cartilage Homeostasis. Cells, 5(9), 969. https://doi.org/10.3390/cells8090969.

80. Li, Y., Luo, W., Yang W. (2018). Nuclear Transport and Accumulation of Smad Proteins Studied by Single-Molecule Microscopy. Biophys. J., 114(9), 2243-2251. https://doi.org/10.1016Zj.bpj.2018.03.018

81. Jin, Q., Gao, G., Mulder, K M. (2009). Requirement of a dynein light chain in TGFp/Smad3 signaling. J. Cell. Physiol, 221(3), 707-715. https://doi.org/10.1002/jcp.21910.

82. Batut, J., Howell, M., Hill, C.S. (2007). Kinesin-Mediated Transport of Smad2 Is Required for Signaling in Response to TGF-P Ligands. Dev Cell, 12(2), 261-74. https://doi.org/10.10167j.devcel.2007.01.010

83. Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. (2005). Smad transcription factors. Genes Dev. Published online 2005. https://doi.org/10.1101/gad.1350705

84. Hill, C.S. (2005). Transcriptional control by the SMADs. Cold. Spring Harb. Perspect Biol, 19(23), 2783-810. https://doi.org/10.1101/cshperspect.a022079

85. Qiao, B., Padilla, S.R., Benya, P.D. (2005). Transforming growth factor (TGF)-P-activated kinase 1 mimics and mediates TGF-P-induced stimulation of type II collagen synthesis in chondrocytes independent of Col2a1 transcription and Smad3 signaling. J. Biol. Chem., 250(17), 17562-17571. https://doi.org/10.1074/jbc.M500646200

86. Bhogal, R.K., Stoica, C.M., McGaha, T.L., Bona, C.A. (2005). Molecular aspects of regulation of collagen gene expression in fibrosis. J. Clin. Immunol, 25(6), 592-603. https://doi.org/10.1007/s10875-005-7827-3

87. Bell, D.M., Leung, K.K.H., Wheatley, S.C., et al. (1997). SOX9 directly regulates the type-II collagen gene. Nat Genet., 16(2), 174-178. https://doi.org/10.1038/ng0697-174

88. Sen, R., Pezoa, S.A., Shull, L.C., Hernandez-Lagunas, L., Niswander, L.A., Artinger, K.B. (2018). Kat2a and Kat2b acetyltransferase activity regulates craniofacial cartilage and bone differentiation in Zebrafish and mice. J. Dev. Biol, 6(4), 27. https://doi.org/10.3390/jdb6040027

89. Chen, X., Huang, H., Wang, H., et al. (2014). Characterization of zebrafish pax1b and pax9 in fin bud development. Biomed. Res. Int., 2014, 309385. https://doi.org/10.1155/2014/309385

90. Seoane, J., Le, H.V., Shen, L., Anderson, S.A., Massague, J. (2004). Integration of smad and forkhead pathways in the control of neuroepithelial and glioblastoma cell proliferation. Cell, 117(2), 211-223. https://doi.org/10.1016/S0092-8674(04)00298-3

91. Naka, K., Hoshii, T., Muraguchi, T., et al. (2010). TGF-B-FOXO signalling maintains leukaemia-initiating cells in chronic myeloid leukaemia. Nature, 463(7281), 676-680. https://doi.org/10.1038/nature08734

92. Kang, Y., Chen, C.R., Massague, J. (2003). A self-enabling TGFß response coupled to stress signaling: Smad engages stress response factor ATF3 for Id1 repression in epithelial cells. Mol. Cell, 11(4), 915-926. https://doi.org/10.1016/S1097-2765(03)00109-6

93. Vincent, T., Neve, E.P.A., Johnson, J.R., et al. (2009). A SNAIL1-SMAD3/4 transcriptional repressor complex promotes TGF-ß mediated epithelial-mesenchymal transition. Nat. Cell. Biol, 11(8), 943-950. https://doi.org/10.1038/ncb1905

94. Pardali, K., Kurisaki, A., Moren, A., Ten Dijke, P., Kardassis, D., Moustakas, A. (2000). Role of Smad proteins and transcription factor Sp1 in p21Waf1/Cip1 regulation by transforming growth factor-ß. J. Biol. Chem, 275(38), 29244-29256. https://doi.org/10.1074/jbc.M909467199

95. Bauge, C., Cauvard, O., Leclercq, S., Galera, P., Boumediene K. (2011). Modulation of transforming growth factor beta signalling pathway genes by transforming growth factor beta in human osteoarthritic chondrocytes: Involvement of Sp1 in both early and late response cells to transforming growth factor beta. Arthritis Res. Ther., 13(1), R23. https://doi.org/10.1186/ar3247

96. Davidson, E.N.B., Remst, D.F.G., Vitters, E.L., et al. (2009). Increase in ALK1/ALK5 Ratio as a Cause for Elevated MMP-13 Expression in Osteoarthritis in Humans and Mice. J. Immunol., 182(12), 7937-45. https://doi.org/10.4049/jimmunol.0803991

97. Siomi, H., Siomi, M.C. (2010). Posttranscriptional Regulation of MicroRNA Biogenesis in Animals. Mol. Cell, 38(3), 323-332. https://doi.org/10.1016Zj.molcel.2010.03.013

98. Ha, M., Kim, V.N. (2014). Regulation of microRNA biogenesis. Nat Rev Mol Cell Biol., 15(8), 509-524. https://doi.org/10.1038/nrm3838

99. Blahna, M.T., Hata, A. Smad-mediated regulation of microRNA biosynthesis. FEBS Lett, 586(14), 1906-1912. https://doi.org/10.1016/j.febslet.2012.01.041

100. Zhang, Y., Huang, X., Yuan, Y. (2017). MicroRNA-410 promotes chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells through down-regulating Wnt3a. Am J Transl Res, 9(1), 136-145.

101. Lee, S., Yoon, D.S., Paik, S., Lee, K.M., Jang, Y., Lee, J.W. (2014). MicroRNA-495 Inhibits chondrogenic differentiation in human mesenchymal stem cells by targeting Sox9. Stem Cells Dev., 23(15), 1798-1808. https://doi.org/10.1089/scd.2013.0609

102. Yanagawa., Y., Hiraide., S., and Iizuka K. (2016). Isoform_ specific regulation of transforming growth factor p mRNA expression in macrophages in response to adrenoceptor stimulation. Microbiol. Immunol., 60, 56-63. https://doi.org/10.1111/1348-0421.12344

103. Frangogiannis, N.G. (2017). The role of transforming growth factor (TGF) p in the infarcted myocardium. J. Thor. Dis., 9, 52-63. https://doi.org/10.21037/jtd.2016.11.19

104. Luo, Z., Jiang, L., Xu, Y., Li, H., Xu, W., Wu, S., Wang, Y., Tang, Z., Lv, Y., Yang, L. (2015). Mechano growth fac_ tor (MGF) and transforming growth factor (TGF)P3 functionalized silk scaffolds enhance articular hyaline cartilage regeneration in rabbit model. Biomaterials, 52, 463-475. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2015.01.001

105. Yang, S.S., Jin, L.H., Park, S.H., Kim, M.S., Kim, Y.J., Choi, B.H., Lee, C.T., Park, S.R., Min, B.H. (2016). Extracellular matrix (ECM) multilayer membrane as a sustained releasing growth factor delivery system for rh TGFP3 in articular cartilage repair. PLoS One, 11(6), e0156292. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0156292

106. Yang, Q., Teng, B.H., Wang, LN., et al. (2017). Silk fibroin/cartilage extracellular matrix scaffolds with sequential delivery of TGF-P3 for chondrogenic differentiation of adipose-derived stem cells. Int. J. Nanomedicine, 12, 6721-6733. https://doi.org/10.2147/IJN.S141888

107. Wang, X., Li, Y., Han, R., He, C., Wang, G., Wang, J., Zheng, J., Pei, M., Wei, L. (2014). Demineralized bone matrix combined bone marrow mesenchymal stem cells., bone morphogenetic protein 2 and transforming growth factor P3 gene promoted pig cartilage defect repair. PLoS One, 9(12), e116061. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0116061.

108. Sun, Q., Zhang, L., Xu, T., et al. (2018). Combined use of adipose derived stem cells and TGF-P3 microspheres promotes articular cartilage regeneration in vivo. Biotech Histochem., 93(3), 168-176. https://doi.org/10.1080/10520295.2017.1401663

109. Zhou, M., Lozano, N., Wychowaniec, J.K., Hodgkinson, T., Richardson, S.M., Kostarelos, K., Hoyland, J.A. (2019). Graphene oxide: a growth factor delivery carrier to enhance chondrogenic differentiation of human mesenchymal stem cells in 3D hydrogels. Acta Biomater, 96, 271-280. https://doi.org/10.1016/j.actbio.2019.07.027

110. Rothrauff, B., Sasaki, H., Kihara, S., Overholt, K., Gottardi, R., Lin, H., Fu, F., Tuan, R., Alexander, P. (2019). Point of care procedure for enhancement of meniscal healing in a goat

model utilizing infrapatellar fat padderived stromal vascular fraction cells seeded in photocrosslinkable hydrogel. Am. J. Sport. Med., 47, 3396-3405. https://doi.org/10.1177/0363546519880468

111. Gonzalez-Fernandez, T., Tierney, E.G., Cunniffe, G.M., O'Brien, F.J., Kelly, D.J. (2016). Gene Delivery of TGF-P3 and BMP2 in an MSC-Laden Alginate Hydrogel for Articular Cartilage and Endochondral Bone Tissue Engineering. Tissue Eng - Part A, 22(9-10), 776-787. https://doi.org/10.1089/ten.tea.2015.0576

112. Gille, J., Schuseil, E., Wimmer, J., Gellissen, J.S.A., Behrens, P. (2010). Mid-term results of autologous matrixinduced chondrogenesis for treatment of focal cartilage defects in the knee. Knee Surg Sport Traumatol Arthrosc. 18(11), 1456-1465. https://doi.org/10.1007/s00167-010-1042-3

113. Vasiliadis, H.S, Danielson, B., Ljungberg, M, McKeon, B., Lindahl, A., Peterson, L. (2010). Implantation of autologous chondrocytes for cartilagenous lesions in young patients. Am. J. Sport Med, 38(5), 943-949. https://doi.org/10.1177/0363546509358266

114. Kuroda, R., Ishida, K., Matsumoto, T., et al. (2007). Treatment of a full-thickness articular cartilage defect in the femoral condyle of an athlete with autologous bone-marrow stromal cells. Osteoarthr Cartil., 15(2), 226-231. https://doi.org/10.1016/jjoca.2006.08.008

115. Nashhekina, Ju.A., Nikonov, P.O., Mikailov, V.M., Pinaev, G.P. (2014) The Dependence of the filling BMSC on the three-dimensial matrix from method of seeding and type of sutface matrix modification. Cytology, 56(4), 283-290.

116. Martin, I., Muraglia, A., Campanile, G., Cancedda, R., Quarto, R. (1997). Fibroblast growth factor-2 supports ex vivo expansion and maintenance of osteogenic precursors from human bone marrow. Endocrinology, 138(10), 4456-4462. https://doi.org/10.1210/endo.138.10.5425

117. Giannini, S., Buda, R., Vannini, F., Cavallo, M., Grigolo, B. (2009). One-step bone marrow-derived cell transplantation in talar osteochondral lesions. Clin. Orthop. Relat. Res., 467(12), 3307-20. https://doi.org/10.1007/s11999-009-0885-8

118. Uematsu, K., Hattori, K., Ishimoto, J., Habata, T., Takakura, Y., Ohgushi, H., Fukuchi, T., Sato, M. (2005) Cartilage regeneration using mesenchymal stem cells and a three-dimensional poly-lactic-glycolic acid (PLGA) scaffold. Biomaterials, 26(20), 4273-9. https://doi.org/10.10167j.biomaterials.2004.10.037

119. Steinwachs, M., Peterson, L., Bobic, V., Verdonk, P., Niemeyer, P. (2012). Cell-seeded collagen matrix-supported autologous chondrocyte transplantation (ACT-CS), a consensus statement on surgical technique. Cartilage, 3(1), 5-12. https://doi.org/10.1177/1947603511415839.

120. Брянская, А.И., Куляба, Т.А. Корннилов, Н.Н., Румакин, В.П., Горностаев, В.С. (2014). Артропластика с использованием аутологичных мультипотентных мезенхимальных

клеток и коллагеновой мембраны ChondroGyde®. Вестник травматологии и ортопедии им НН Приорова, 1, 62-66.

121. Kon, E., Vannini, F., Buda, R., Filardo, G., Cavallo, M., Ruffilli A., Nanni M., Di Martino, A., Marcacci, M., Giannini, S. (2012). How to treat osteochondritis dissecans of the knee: surgical techniques and new trends. J. Bone Jt. Surg. Am., 94(1), e1(1-8). https://doi.org/10.2106/JBJS.K.00748

122. Teo, B.J., Buhary K., Tai, B.C., Hui, J.H. (2012). Cell-based therapy improves function in adolescents and young adults with patellar osteochondritis dissecans. Clin. Orthop. Relat. Res., 471(4), 1152-1158. https://doi.org/10.1007/ s11999-012-2338-z

123. Wakitani, S., Imoto, K., Yamamoto, T., Saito, M., Murata, N., Yoneda, M. (2002). Human autologous culture expanded bone marrow mesenchymal cell transplantation for repair of cartilage defects in osteoarthritic knees. Osteoarthr. Cart, 10(3), 199-206. https://doi.org/10.1053/ joca.2001.0504

124. Madry, H., Orth, P., Kaul, G., et al. (2010). Acceleration of articular cartilage repair by combined gene transfer of human insulin-like growth factor i and fibroblast growth factor-2 in vivo. Arch Orthop Trauma Surg, 130(10), 1311-1322. https://doi.org/10.1007/s00402-010-1130-3

125. Mobasheri, A., Kalamegam, G., Musumeci, G., Batt, M.E. (2014). Chondrocyte and mesenchymal stem cell-based therapies for cartilage repair in osteoarthritis and related orthopaedic conditions. Maturitas, 78(3), 188-198. https://doi.org/10.10167j.maturitas.2014.04.017

126. Saris, D B F., Vanlauwe, J., Victor, J., Haspl, M., Bohnsack, M., et al. (2008). Characterized chondrocyte implantation results in better structural repair when treating symptomatic cartilage defects of the knee in a randomized controlled trial versus microfracture. Am. J. Sport. Med., 36(2), 235-46. https://doi.org/10.1177/0363546507311095

127. Darling, E.M., Athanasiou, A.K. (2005). Rapid phenotypic changes in passaged articular chondrocyte subpopulations. J. Orthop. Res., 23(2), 425-432. https://doi.org/10.1016/ j.orthres.2004.08.008

128. Marlovits, S., Hombauer, M., Truppe, M., Vevsei, V., Schlegel, W. (2004). Changes in the ratio of type-I and type-II collagen expression during monolayer culture of human chondrocytes. J Bone Jt Surg Br, 86(2), 286-295. https://doi.org/10.1302/0301-620x.86b2.14918

129. Pittenger, M.F., Mackay, A.M., Beck, S.C., Jaiswal, R.K., Douglas R., Mosca, J.D., Moorman, M.A., et al. (1999). Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science, 284(5411), 143-147. https://doi.org/10.1126/science.284.5411.143

130. Johnstone B., Hering, M., Caplan, I., Goldberg, V.M., Yoo, J.U. (1998). In vitro chondrogenesis

of bone marrow-derived mesenchymal progenitor cells. Exp. Cell Res, 238(1), 265-272. https://doi .org/ 10.1006/excr.1997.3858.

131. Sciarretta, F.V. (2013). 5 to 8 years follow-up of knee chondral defects treated by PVA-H hydrogel implants. Eur. Rev. Med. Pharmacol. Sci., 17(22), 3031-3038.

132. Saw, K.Y., Anz, A., Merican, S., Tay, Y.G., Ragavanaidu, K., Jee, C.S.Y., McGuire, D.A. (2011). Articular cartilage regeneration with autologous peripheral blood progenitor cells and hyaluronic acid after arthroscopic subchondral drilling: a report of 5 cases with histology. Arthroscopy, 27(4), 493-506. https://doi.org/10.1016Zj.arthro.2010.11.054

133. Sakaguchi, Y., Sekiya, I., Yagishita, K., Muneta, T. (2005). Comparison of human stem cells derived from various mesenchymal tissues: superiority of synovium as a cell source. Arthritis Rheum, 52(8), 2521-2529. https://doi.org/10.1002/art.21212

134. Li, Q., Tang, J., Wang, R., Bei, C., Xin, L., et al. (2010). Comparing the chondrogenic potential in vivo of autogeneic mesenchymal stem cells derived from different tissues. Artif Cells Blood Substit Immob Biotechnol, 39(1), 31-38. https://doi.org/10.3109/10731191003776769

135. Mukonoweshuro, B., Brown, C.J., Fisher, J., Ingham, E. (2014). Immunogenicity of undifferentiated and differentiated allogeneic mouse mesenchymal stem cells. J. Tissue Eng., 29; 5. https://doi.org/10.1177/2041731414534255

136. Adesida, A.B., Mulet-Sierra, A., Jomha, N.M. (2012). Hypoxia mediated isolation and expansion enhances the chondrogenic capacity of bone marrow mesenchymal stromal cells. Stem Cell Res Ther, 3(2), 9. https://doi.org/10.1186/ scrt100

137. Choi J., Choi B., Park S., Pai K., Li, T., et al. (2013). Mechanical stimulation by ultrasound enhances chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells in a fibrin-hyaluronic acid hydrogel. Artif Organs, 37(7), 648-655. https://doi.org/https://doi.org/10.1111/aor.12041

138. Khan, W.S., Tew, S.R., Adesida, A.B., Hardingham, T.E. (2008). Human infrapatellar fat pad-derived stem cells express the pericyte marker 3G5 and show enhanced chondrogenesis after expansion in fibroblast growth factor-2. Arthritis Res Ther., 10(4), 10-17. https://doi.org/10.1186/ar2448

139. Matsuda, C., Takagi, M., Hattori, T., Wakitani, S., Yoshida, T. (2005). Differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells to chondrocytes for construction of threedimensional cartilage tissue. Cytotechnology, 47(1-3), 11-17. https://doi.org/10.1007/s10616-005-3751-x

140. Stokes, D.G., Liu, G., Dharmavaram, R. Piera-Velazquez, S., Jimenez, S.A. (2001). Regulation of type-II collagen gene expression during human chondrocyte de-differentiation and recovery of chondrocyte-specific phenotype in culture involves Sry-type high-mobilitygroup box (SOX) transcription factors. Biochem. J, 360(Pt 2), 461-470. https://doi.org/10.1042/bj3600461

141. Neumann, A.J., Alini M., Archer, C.W., Stoddart, M.J. (2013). Chondrogenesis of human bone

marrow-derived mesenchymal stem cells is modulated by complex mechanical stimulation and adenoviral-mediated overexpression of bone morphogenetic protein 2. Tissue Eng Part A, 19(11-12), 1285-1294. https://doi.org/10.1089/ten. tea.2012.0411

142. Zhao, Y.H., Yang Q., Xia Q., Peng J., Lu, S.B., et al. (2013). In vitro cartilage production using an extracellular matrix-derived scaffold and bone marrowderived mesenchymal stem cells. Chin. Med. J. (Engl), 126, 3130-3137. https://doi.org/10.1007/s12015-013-9456-1

143. Kafienah W., Mistry S., Dickinson, S.C., Sims, T.J., Learmonth, I., Hollander, A.P. (2007). Three-dimensional cartilage tissue engineering using adult stem cells from osteoarthritis patients. Arthritis Rheum., 56(1), 177-187. https://doi.org/d10.1016/s1063-4584(07)61356-9

144. Shimomura K., Ando W., Tateishi K., Nansai, R., Fujie, H., Hart, D.A., Kohda, H., Kita, K., Kanamoto, T. Mae, T., Nakata, K., Shino, K., Yoshikawa, H., Nakamura, N. (2010). The influence of skeletal maturity on allogenic synovial mesenchymal stem cell-based repair of cartilage in a large animal model. Biomaterials, 31(31), 8004-8011. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2010.07.017

145. Ando, W., Fujie, H., Moriguchi, Y., Nansai, R., Shimomura, K., Hart, D.A., Yoshikawa, H., Nakamura, N. (2012). Detection of abnormalities in the superficial zone of cartilage repaired using a tissue engineered construct derived from synovial stem cells. Eur Cell Mater., 24, 292307. https://doi.org/10.1016/jjbiomech.2015.10.015

146. Melle, M., Narcisi, R., Kops, N., Koevoet, W.J.L.M., Bos, P.K., Murphy, J.M., et al. (2014). Chondrogenesis of mesenchymal stem cells in an osteochondral environment is mediated by the subchondral bone. Tissue Eng Part A, 20(1-2), 23-33. https://doi.org/10.1089/ten.tea.2013.0080

147. Wayne, J.S., McDowell, C.L., Shields, K.J., Tuan, R.S. (2005). In vivo response of polylactic acid-alginate scaffolds and bone marrow-derived cells for cartilage tissue engineering. Tissue Eng, 11(5-6), 953-963. https://doi.org/10.1089/ten.2005.11.953

148. Marquass, B., Schulz, R., Hepp, P., Zscharnack, M., Aigner, T., Schmidt, S., Stein, F., Richter, R., Osterhoff, G., Aust, G., Josten, C., Bader, A. (2011). Matrix-associated implantation of predifferentiated mesenchymal stem cells versus articular chondrocytes: in vivo results of cartilage repair after 1 year. Am. J. Sport. Med, 39(7), 1401-1412. https://doi.org/10.1177/0363546511398646

149. Bekkers, J.E., Tsuchida, A.I., van Rijen, M.H., Vonk, L.A., Dhert, W.J., Creemers, L.B., Saris, D.B. (2013). Single-stage cellbased cartilage regeneration using a combination of chondrons and mesenchymal stromal cells: comparison with microfracture. Am. J. Sport. Med, 41(9), 21582166. https://doi.org/10.1177/0363546513494181

150. Григорян, А.С., Деев, Р.В., Кругляков, П.В., Билибина, А.А., Соколова, И.Б., Павличенко, Н.Н., Полынцев, Д.Г. (2010). Применение трансплантатов, содержащих мультипотентные

мезенхимальные стромальные клетки, для восстановления поврежденных суставных поверхностей в эксперименте. Гены и клетки, 5(2), 44-55.

151. Giannini, S., Buda, R., Cavallo, M., Ruffilli, A., Cenacchi, A., Cavallo C., Vannini, F. (2010). Cartilage Repair Evolution in Post-Traumatic Osteochondral Lesions of The Talus, From Open Field Autologous Chondrocyte to Bone-Marrowderived Cells Transplantation. Injury, 41, 11961203. https://doi.org/10.1016/j.injury.2010.09.028

152. Gigante, A., Cecconi, S., Calcagno, S., Busilacchi, A., Enea, D. (2012). Arthroscopic Knee Cartilage Repair With Covered Microfracture and Bone Marrow Concentrate. Arthrose Tech., 1(2), e175-e180. https://doi.org/10.1016Zj.eats.2012.07.001

153. Karlsen, T.A., Shahdadfar, A., Brinchmann, J.E. (2011). Human primary articular chondrocytes, chondroblasts-like cells, and dedifferentiated chondrocytes: differences in gene, microRNA, and protein expression and phenotype. Tissue Eng Part C Methods, 17(2), 219-227. https://doi.org/10.1089/ten.tec.2010.0200

154. Wakitani, S., Nawata, M., Tensho, K., Okabe, T., Machida, H., Ohgushi, H. (2007). Repair of articular cartilage defects in the patello-femoral joint with autologous bone marrow mesenchymal cell transplantation, Three case reports involving nine defects in five knees. J. Tissue Eng. Regen. Med. 1(1), 74-9. https://doi.org/10.1002/term.8

155. Gun-Il Im. (2016) Gene transfer strategies to promote chondrogenesis and cartilage regeneration. Tissue Eng. Part B: Rev., 22(2), 136-148. https://doi.org/10.1089/ten.teb.2015.0347

156. Yu-Chen Hu. (2014). Gene Therapy for Cartilage and Bone Tissue Engineering. Springer. https://doi.org/10.1007/978-3-642-53923-7

157. Gurusinghe, S., Strappe, P. (2014). Gene modification of mesenchymal stem cells and articular chondrocytes to enhance chondrogenesis. Biomed. Res. Int., 2014, 369528. https://doi.org/10.1155/2014/369528

158. Sun, J., Zhong, N., Li, Q., Min, Z., Zhao, W., Sun Q. Tian, L., Yu, H., Shi, Q., Zhang, F., Lu, S. (2011). MicroRNAs of rat articular cartilage at different developmental stages identified by Solexa sequencing. Osteoarthr Cart, 19(10), 1237-1245. https://doi.org/10.1016/jjoca.2011.07.002

159. Karlsen, T.A., Shahdadfar, A., Brinchmann, J.E. (2011). Human primary articular chondrocytes., chondroblasts-like cells., and dedifferentiated chondrocytes, differences in gene., microRNA., and protein expression and phenotype. Tissue Eng. Part C: Methods, 17(2), 219227. https://doi.org/10.1089/ten.TEC.2010.0200

160. Yan, C., Wang, Y., Shen X.Y., Yang, G., Jia, J., Wang, H.-S., Chen, G.-Q., Wu, Q. (2011). MicroRNA regulation associated chondrogenesis of mouse MSCs grown on

polyhydroxyalkanoates. Biomaterials, 32(27), 6435-6444. https://doi.Org/10.1016/j.biomaterials.2011.05.031

161. Liao, Y.H., Chang, Y.H., Sung, L.Y., Li, K.C., Yeh, C.-L., Yen, T.-C., Hwang, S.-M., Lin, K.J., Hu, Y.-C. (2014). Osteogenic differentiation of adipose-derived stem cells and calvarial defect repair using baculovirus-mediated co-expression of BMP-2 and miR-148b. Biomaterials, 35(18), 4901-4910. https://doi.org/10.1016Zj.biomaterials.2014.02.055

162. Raisin, S., Belamie E., Morille, M. (2016). Non-viral gene activated matrices for mesenchymal stem cells based tissue engineering of bone and cartilage. Biomaterials, 21(104), 223-237. https://doi.org/10.1016Zj.biomaterials.2016.07.017

163. Vassao, P.G., de Souza, M.C., Silva, B.A., Junqueira, R.G., de Camargo, M.R., Dourado, V.Z., Tucci, H.T., Renno, A.C. (2020). Photobiomodulation via a cluster device associated with a physical exercise program in the level of pain and muscle strength in middle-aged and older women with knee osteoarthritis, a randomized placebo-controlled trial. Lasers Med. Sci., 35(1), 139-148. https://doi.org/10.1007/s10103-019-02807-3

164. Bjordal, J.M., Couppe, C., Chow, R.T., Ljunggren, E.A. (2003) A systematic review of low level laser therapy with location-specific doses for pain from chronic joint disorders. J. Physiother, 49(2), 107-122. https://doi.org/10.1016/S0004-9514(14)60127-6

165. Xu, Y., Li, Y., Liu, Y., Li, H., Jia, Z., Tang, Y., Jiang, G., Zhang, X., Duan, L. (2019). Surface modification of decellularized trachea matrix with collagen and laser micropore technique to promote cartilage regeneration. Am J. Transl. Res., 11(9), 5390-5403.

166. Farivar, S., Ramezankhani, R., Mohajerani, E., Ghazimoradi, M.H., Reza, S. (2019) Gene Expression Analysis of Chondrogenic Markers in Hair Follicle Dermal Papillae Cells Under the Effect of Laser Photobiomodulation and the Synovial Fluid. J. Lasers Med. Sci., 10(3), 171178. https://doi.org/10.15171/jlms.2019.27

167. Pfander, D., Jörgensen, B., Rohde, E., Bindig, U., Müller, G., Scheller, E. (2006). The influence of laser irradiation of low-power density on an experimental cartilage damage in rabbit knee-joints, an in vivo investigation considering macroscopic, histological and immunohistochemical changes. Biomed Tech. (Berl.), 51(3), 131-138.

168. Jones, N., Sviridov, A., Sobol, E., Omelchenko, A., Lowe, J. (2001). Aprospective randomised study of laser reshaping of cartilage in vivo. Lasers Med. Sci., 16(4), 284-290. https://doi.org/10.1007/PL00011365

169. Sobol, E.N., Baum, O.I., Shekhter, A.B., Guller, A., Baskov, A.V. (2011). Laser-induced regeneration of cartilage. J. of Biomedical Optics, 16(8), 080902. https://doi.org/10.1117/L3614565

170. Xin, W., Heilig, J., Paulsson, M., Zaucke, F. (2015). Collagen II Regulates Chondroycte Integrin

Expression Profile and Differentiation. Connect Tissue Res., 56(4), 307-314. https://doi.org/10.3109/03008207.2015.1026965

171. Lefebvre, V., Angelozzi, M., Hasseb, A. (2019). SOX9 in Cartilage Development and Disease. Rev Curr Opin Cell Biol, 61, 39-47. https://doi.org/10.10167j.ceb.2019.07.008

172. Nazempour, A., Quisenberry C.R., Van Wie B.J., Abu-Lail, N.I. (2016). Nanomechanics of Engineered Articular Cartilage: Synergistic Influences of Transforming Growth Factor-ß3 and Oscillating Pressure. J. Nanosci. Nanotechnol., 16(3), 3136-3145. https://doi.org/10.1166/jnn.2016.12564

173. Goessler, U.R., Bugert, P., Bieback, K., Deml, M., Sadick, H., Hormann, K. et al. (2005). In-vitro analysis of the expression of TGFbeta-superfamily-members during chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells and chondrocytes during dedifferentiation in cell culture. Cell Mol Biol Lett, 10(2), 345-362.

174. Holden, P.K., Li, C., Da Costa, V., Sun, C.H., Bryant, S.V., Gardiner, D.M., Wong, B.J.F. The effects of laser irradiation of cartilage on chondrocyte gene expression and the collagen matrix. (2009). Lasers Surg. Med, 41(7), 487-491.https://doi.org/10.1002/lsm.20795

175. Green, M.R., Sambrook, J. (2012). Molecular Cloning a laboratory manual.

176. Brunger, J.M., Huynh, N.P., Guenther, C.M., Guilak, F. (2014). Scaffold-mediated lentiviral transduction for functional tissue engineering of cartilage. Proc. Natl. Acad. Sci., 111(9), 798806. https://doi.org/10.1073/pnas.1321744111

177. Inoue, H., Nojima H., Okayama, H. (1990). High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids. Gene, 96(1), 23-28. https://doi.org/10.1016/0378-1119(90)90336-p

178. Birnboim, H.C.,Doly, J. (1979). A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res, 7(6), 1513-1523. https://doi.org/10.1093/nar/7.6.1513

179. Лилли, Р., Патогистологическая Техника и Практическая Гистохимия (1969). Москва: Издательство Мир.

180. van den Borne, M.P.J., Raijmakers, N.J.H., Vanlauwe, J., et al. (2007). International Cartilage Repair Society (ICRS) and Oswestry macroscopic cartilage evaluation scores validated for use in Autologous Chondrocyte Implantation (ACI) and microfracture. Osteoarthr. Cartil., 15(12), 1387-1402. https://doi.org/10.1016/jjoca.2007.05.005

181. Rutgers, M., van Pelt, M.J.P., Dhert, W.J.A., Creemers, L.B., Saris, DBF. (2010). Evaluation of histological scoring systems for tissue-engineered., repaired and osteoarthritic cartilage. Osteoarthr Cartil, 18(1), 12-23. https://doi.org/10.1016/jjoca.2009.08.009

182. Божокин, М.С., Божкова, С.А., Литвинов, Е.М., Косьмин В.Л. (2019). Устройство для совмещения клеточной культуры и биодеградируемого носителя. RU 190863 U1, 1-8.

183. Walter, S.G., Ossendorff, R., Schildberg, F.A. (2019). Articular cartilage regeneration and tissue engineering models, a systematic review. Arch Orthop Trauma Surg., 139, 305-316. https://doi.org/10.1007/s00402-018-3057-z

184. Gang-Un, Kim, Soo-Eun, Sung, Kyung-Ku, Kang, Joo-Hee, Choi, Sijoon, Lee, Minkyoung, Sung, Seung, Yun Yang, Seul-Ki, Kim, Young, In Kim., Ju-Hyeon, Lim., Min-Soo Seo, Lee, G.W. (2021). Therapeutic Potential of Mesenchymal Stem Cells (MSCs) and MSC-Derived Extracellular Vesicles for the Treatment of Spinal Cord Injury. Int. J. Mol. Sci., 22(4). https://doi.org/10.3390/ijms222413672

185. Fellows, C.R., Matta, C., Zakany, R., Khan, I.M., Mobasheri, A. (2016). Adipose, Bone Marrow and Synovial Joint-Derived Mesenchymal Stem Cells for Cartilage Repair. Front Genet, 7(213). https://doi.org/10.3389/fgene.2016.00213

186. Bekkers, J.E.J, Tsuchida, A.I., van Rijen, M.H.P., Vonk, L.A., Dhert, W.J.A., Creemers, L.B., Saris, D.B.F. (2013). Single-stage cell-based cartilage regeneration using a combination of chondrons and mesenchymal stromal cells, comparison with microfacture. Am. J. Sport. Med., 41(9), 2158-2166. https://doi.org/10.1177/0363546513494181

187. Li, F., Truong, V.X., Thissen, H., Frith, J.E., Forsythe, J.S. (2017). Microfluidic Encapsulation of Human Mesenchymal Stem Cells for Articular Cartilage Tissue Regeneration. ACS Appl. Mater. Interfaces, 9, 8589-8601.

188. Gomez-Leduc, T., Desance, M., Hervieu, M., Legendre, F., Ollitrault., D., De Vienne, C., Herlicoviez, M., Galera, P., Demoor, M. (1933). Hypoxia Is a Critical Parameter for Chondrogenic Differentiation of Human Umbilical Cord Blood Mesenchymal Stem Cells in Type I/III Collagen Sponges. Int. J. Mol. Sci., 18.

189. Kim, Y., Sah, R., Grodzinsky, A., Plaas, A., Sandy, J. (1994). Mechanical Regulation of Cartilage Biosynthetic Behavior, Physical Stimuli. Arch. Biochem. Biophys., 311, 1-12.

190. Marks, R. (2021). Articular Cartilage Degradation and Photobiomodulation Therapy. CPQ Orthop., 5, 1-20.

191. Huang, X., Das, R., Patel, A., Nguyen, T.D. (2018). Physical Stimulations for Bone and Cartilage Regeneration. Regen. Eng. Transl. Med., 4, 216-237.

192. Parate, D., Franco-Obregon, A., Fröhlich, J., Beyer, C., Abbas, A.A., Kamarul., T., Hui, J.H.P., Yang, Z. (2017). Enhancement of mesenchymal stem cell chondrogenesis with short-term low intensity pulsed electromagnetic fields. Sci. Rep, 7, 1-13.

193. Kozhemyakina, E., Lassar, A.B., Zelzer, E. (2015). A pathway to bone. Signaling molecules and transcription factors involved in chondrocyte development and maturation. Development., 142, 817-831.

194. Samsa, W.E., Zhou, X., Zhou, G. (2017). Signaling pathways regulating cartilage growth plate

formation and activity. Semin Cell Dev Biol, 62, 3-15.

195. Zhao, L., Huang, J., Fan, Y., Li, J., You, T., He, S., Xiao, G., Chen, D. (2019). Exploration of CRISPR/Cas9-based gene editing as therapy for osteoarthritis. Ann Rheum Dis., 78, 676-682.

196. Adkar, S.S., Brunger, J.M., Willard, V.P., Wu, C.-L., Gersbach, C.A., Guilak, F. (2017). Genome Engineering for Personalized Arthritis Therapeutics. Trends Mol. Med, 23, 917-931.

197. Mali, P., Esvelt, K.M., Church, G. (2013). Cas9 as a versatile tool for engineering biology. Nat. Methods, 10, 957-963.

198. Божокин, М.С., Божкова, С.А., Нащекина, Ю.А., Сопова, Ю.В., Рубель, А.А., Хотин, М.Г. (2021). Использование трансфекции мезенхимных мультипотентных стромальных клеток (ММСК) в качестве системы модификации культуры клеток для дальнейшего использования при замещении дефектов гиалинового хряща. Современные проблемы науки и образования, 4(90). https://doi.org/10.17513/spno.31052

199. Li-Ming Li, Gui-Xin Ruan, Ming-Yi HuangFu, Zhi-Lan Chen, Hui-Na Liu, Lin-Xian Li, Yu-Lan Hu, Min Han, Davidson, G., Levkin, P.A., Gao, J.-Q. (2015). ScreenFect A: an efficient and low toxic liposome for gene delivery to mesenchymal stem cells. Int. J. Pharm., 488(1-2), 1-11. https://doi.org/10.1016/j.ijpharm.2015.04.050

200. McMillan, A., Nguyen, M.K., Gonzalez-Fernandez, T., Peilin Ge, Xiaohua Yu., Murphy, W.L., Kelly, D.J., Alsberg, E. (2018). Dual non-viral gene delivery from microparticles within 3D high-density stem cell constructs for enhanced bone tissue engineering. Biomaterials, 161, 240255. https://doi.org/10.1016/j.biomaterials.2018.01.006

201. Wang, Y.T., Zheng, Q.X., Guo, X.D. (2004). Wild-type Smad3 gene promotes osteoblastic differentiation of rat bone marrow-derived mesenchymal stem cells in vitro. Zhonghua Yi Xue Za Zhi, 84(18), 1523-1527.

202. Kim, S., Yoon, Y.M., Han, Y.-S., Lee, J.H., Hur, J., Lee, S.H. (2018). Administration of Cripto in GRP78 overexpressed human MSCs enhances stem cell viability and angiogenesis during human MSC transplantation therapy. CellProlif., 51(5). https://doi.org/10.1111/cpr.12463

203. Kumar, M., Yasotha, T., Singh, R.K., Singh, R., Kumar, K., Ranjan, R., Meshram, G.D., Das, B.S., Sadhan, B. (2013). Generation of transgenic mesenchymal stem cells expressing green fluorescent protein as reporter gene using no viral vector in caprine. Indian J. Exp. Biol, 51(7), 502-509. https://doi.org/23898548

204. Xia Cao, Wenwen Deng, Yuan Wei, Yan Yang, Weiyan Su, Yawei Wei, Ximing Xu, Jiangnan Yu. (2012). Incorporating pTGF-ß1/calcium phosphate nanoparticles with fibronectin into 3-dimensional collagen/chitosan scaffolds, efficient., sustained gene delivery to stem cells for chondrogenic differentiation. Eur. Cell Mater, 23, 81-93. https://doi.org/10.22203/ecm.v023a06

205. Diaz, P., Cuevas, F., Peralta, O.A. (2015). GFP labelling and epigenetic enzyme expression of bone marrow-derived mesenchymal stem cells from bovine foetuses. Res. Vet. Sci., 99, 120128. https://doi.org/10.1016/j.rvsc.2014.12.019

206. Hoare, M., Greiser, U., Schu, S., Mashayekhi, K., Aydogan, E., Murphy, M., Barry, F., Ritter, T., O'Brien, T. (2010). Enhanced lipoplex-mediated gene expression in mesenchymal stem cells using reiterated nuclear localization sequence peptides. J. Gene Med., 12(2), 207-218. https://doi.org/10.1002/jgm.1426

207. Hyung-Ho Moon, Min Kyung Joo, Hyejung Mok, Minhyung Lee, Ki-Chul Hwang, Sung Wan Kim, Ji Hoon Jeong, Donghoon Choi, Sun Hwa Kim. (2014). MSC-based VEGF gene therapy in rat myocardial infarction model using facial amphipathic bile acid-conjugated polyethyleneimine. Biomaterials, 35(5), 1744-1755. https://doi.org/10.10167j.biomaterials.2013.11.019

208. Bozhokin, M.S., Sopova, Y.V., Kachkin, D.V., Rubel, A.A., Khotin, M.G. (2020). Mechanisms of TGFP3 Action as a Therapeutic Agent for Promoting the Synthesis of Extracellular Matrix Proteins in Hyaline Cartilage. Biochemistry (Moscow), 85(4), 436-447. https://doi.org/10.1134/S0006297920040045

209. Bozhokin, M.S., Vcherashnii, D.B., Yastrebov, S.G., Beilinson, L.L., Zherebtsova, Ju.V., Khotin, M.G. (2022). Low-intensity photobiomodulation at 632,8 nm increases tgf^3, col2a1, and sox9 gene expression in rat bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. Lasers Med. Sci., 37, 435-441. https://doi.org/10.1007/s10103-021-03279-0

210. Milares, L.P., Assis, L., Siqueira, A., Claudino, V., Domingos, H., Almeida, T., Tim, A., et al. (2016). Effectiveness of an aquatic exercise program and low-level laser therapy on articular cartilage in an experimental model of osteoarthritis in rats. Connect Tissue Res, 57(5), 398-407.

211. Божокин, М.С., Вчерашний, Д.Б., Ястребов, С.Г., Бейлинсон, Л.Л., Хотин, М.Г. (2020). Стимуляция экспрессии гена col2a1 низкоинтенсивным лазерным излучением -инструмент для индукции образования хрящевой ткани. Журнал технической физики, 90(9), 1586-1588.

212. Kushibiki, K., Tajiri, T., Ninomiya, Y., Awazu, K. (2010). Chondrogenic mRNA expression in prechondrogenic cells after blue laser irradiation. J. Photochem. Photobiol. B, 98(3), 211-215. https://doi.org/10.1016/jjphotobiol.2010.01.008

213. Houreld, N.N., Masha, R.T., Abrahamse, H. (2012). Low-intensity laser irradiation at 660 nm stimulates cytochrome c oxidase in stressed fibroblast cells. Lasers Surg. Med., 44(5), 429-434.

214. Wang, X., Tian, F., Soni S.S., Gonzalez-Lima, F., Liu, H. (2016). Interplay between up-regulation of cytochrome-c-oxidase and hemoglobin oxygenation induced by near-infrared laser. Sci. Rep., 6, 30540. https://doi.org/10.1038/srep30540

215. de Brito Vieira, W.H., Ferraresi, C., Schwantes, M.L.B., de Andrade Perez, S.E., Baldissera, V., Cerqueira, M.S., Parizotto, N.A. (2018). Photobiomodulation increases mitochondrial citrate synthase activity in rats submitted to aerobic training. Lasers Med. Sci., 33(4), 803-810. https://doi .org/ 10.1007/s10103-017-2424-2

216. Bozhokin, M.S., Bozhkova, S.A., Sopova, J.V., Nashchekina, Y.A., Bildyug, N.B., Khotin, M.G., Rubel, A.A. (2021) Specificities of scanning electron microscopy and histological methods in assessing cell-engineered construct effectiveness for the recovery of hyaline cartilage. Methods and Protocols, 4(4). https://doi.org/10.3390/mps4040077

217. Божокин, М.С., Божкова, С.А., Нетылько, Г.И., Анисимова Л.О., Наконечный, Д.Г., Нащекина, Ю.А., Блинова, М.И., Жеребцова, Ю.В., Бенгардт, Е.А. (2020). Результаты применения цитокина tgfß3 для модификации клеточно-инженерной конструкции при замещении дефекта суставного гиалинового хряща в эксперименте. Современные проблемы науки и образования, 4, 156-156.

218. Krstic, J., Trivanovic, D., Obradovic, H., Kukolj, T., Bugarski, D., Santibanez, J.F. (2017). Regulation of Mesenchymal Stem Cell Differentiation by Transforming Growth Factor Beta Superfamily. Curr. Protein. Pept. Sci, 19(12), 1138-1154. https://doi.org/10.2174/1389203718666171117103418

219. Neybecker, P., Henrionnet, C., Pape, E., et al. (2018). In vitro and in vivo potentialities for cartilage repair from human advanced knee osteoarthritis synovial fluid-derived mesenchymal stem cells. Stem Cell Res Ther, 9, 329. https://doi.org/10.1186/s13287-018-1071-2

220. Ruvinov, E., Tavor Re"em, T., Witte, F., Cohen, S. (2019). Articular cartilage regeneration using acellular bioactive affinity-binding alginate hydrogel: A 6-month study in a mini-pig model of osteochondral defects. J. Orthop. Transl., 16, 40-52. https://doi.org/10.1016/jjot.2018.08.003

221. Божокин, М.С., Божкова, С.А., Вчерашний, Д.Б., Бейлинсон, Л.Л., Литвинов, С.Д., Косьмин, В.Л., Новосельцев, С.В., Круглов, В.Н. (2019). Динамическое заселение биодеградируемого носителя клеточной культурой мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток. Вестник медицинского института "РЕАВИЗ" реабилитация: врач и здоровье, 6(42), 38-43.

222. Божокин, М.С., Божкова, С.А., Волков, А.А. (2017). Устройство для формирования стандартизированных дефектов хрящевой поверхности суставов в эксперименте. RU 175628 U1.

223. Xiongfa Ji, Zehua Lei, Meng Yuan, Hao Zhu, Xi Yuan, Wenbin Liu, Hongxu Pu, Jiang, J., Zhang, Yu., Jiang X., Xiao, J. (2020). Cartilage repair mediated by thermosensitive photocrosslinkable TGFß1-loaded GM-HPCH via immunomodulating macrophages., recruiting

MSCs and promoting chondrogenesis. Theranostics, 10(6), 2872-2887. https://doi.org/10.7150/thno.41622

224. Cai-Xia He, Tian-Yuan Zhang, Pei-Hong Miao, Zhong-Jie Hu, Min Han, Tabata. Yu., Yu-Lan Hu. (2012). TGF-ß1 gene-engineered mesenchymal stem cells induce rat cartilage regeneration using nonviral gene vector. BiotechnolApplBiochem., 59(3), 163-169.

225. Tengfei Zhou, Xiaolong Li, Guo Li, Taoran Tian, Shiyu Lin, Sirong Shi JL., Xiaoxiao Cai, Yunfeng Lin. (2017). Injectable and thermosensitive TGF-ß1-loaded PCEC hydrogel system for in vivo cartilage repair. Sci. Rep., 5(7). https://doi.org/10.1038/s41598-017-11322w

226. Bozhokin, M.S., Bozhkova, S.A., Netylko, G.I., Nakonechny, D.G., Nashchekina, Y.A., Blinova, M.I., Anisimova, L.O. (2021). Experimental replacement of the surface defect of rat hyaline cartilage by a cell-engineered construct. Regenerative Engineering and Translational Medicine, 7(2), 184-193. https://doi.org/10.1007/s40883-021-00205-2

227. Ho, S.T., Hutmacher, D.W. (2006). A comparison of micro CT with other techniques used in the characterization of scaffolds. Biomaterials, 27(8), 1362-1376. https://doi.org/10.1016Zj.biomaterials.2005.08.035

228. Shestovskaya, M.V., Sopova, J.V., Khotin, M.G., Bozhokin, M.S., Bozhkova, S.A. (2021). Methods of modification of mesenchymal stem cells and conditions of their culturing for hyaline cartilage tissue engineering. Biomedicines, 9(11), 1166. https://doi.org/10.3390/biomedicines9111666

ПРИЛОЖЕНИЕ

1. Божокин М.С., Божкова С.А., Нетылько Г.И. (2016). Возможности современных клеточных технологий для восстановления поврежденого суставного хряща (Аналитический обзор литературы). Травматология и Ортопедия России. 22(3), 122-134. DOI: 10.21823/2311-29052016-22-3-122-134 Реферат

Несмотря на внедрение в клиническую практику широкого спектра хирургических методик лечения повреждений суставного хряща, на современном этапе развития медицины и биотехнологий поиск методов восстановления суставных поверхностей остается очень актуальной и нерешенной задачей. В последние годы все больше надежд связывают с разработкой клеточных методов восстановления гиалинового хряща, таких как аутологичная имплантация хондроцитов, имплантация клеточной культуры мезенхимальных стволовых клеток (МСК), в том числе с технологиями генной модификации клеток. Целью настоящего обзора было обобщение опубликованной в научной литературе информации о полученных на современном этапе результатах при разработке перспективных клеточных технологий восстановления суставного хряща. первой клинически применяемой методикой для восстановления гиалинового хряща с использованием клеточных технологий считается аутологичная трансплантация хондроцитов, впервые осуществленная группой шведских ученых в 1987 г. Однако пересаженная культура клеток характеризуется низким пролиферативным потенциалам и неспособностью сформировать устойчивый к повышенным физическим нагрузкам регенерат. Следующее поколение методик, появившееся на рубеже веков, использует вместо аутологичных хондроцитов мезенхимальные стволовые клетки, заготовка которых является менее инвазивной процедурой по сравнению с получением хондроцитов, а сама культура обладает повышенным пролиферативным потенциалом. Для надежной фиксации клеток исследователи используют различные биодеградируемые носители (матрицы). Несмотря на хорошие клинические результаты, полученные в среднесрочной перспективе, с течением времени в результате клеточной де-дифференцировки имплантированная тканеинженерная конструкция деградирует. Следующим поколением методов, находящимся в стадии доклинических исследований, является предварительная хондрогенная модификация имплантированной клеточной культуры. Использование различных факторов роста, модифицированного клеточного продукта и гено-активирующих матриц, позволяет достичь стабильного синтеза регуляторных и ключевых белков, точечно повлиять на пролиферацию регенерата в хондрогенном направлении и, как следствие, сформировать полноценный гиалиновый хрящ, устойчивый во времени к большим физическим нагрузкам.

Таким образом, разработка путей восстановления суставного хряща давно вышла за рамки интересов врачей клинических специальностей, и только тесное междисциплинарное взаимодействие клиницистов со специалистами в области клеточной биологии, молекулярной генетики, и, возможно, вирусологии позволит восстановить на месте дефекта полноценный гиалиновый хрящ.

2. Божокин М.С., Божкова С.А., Нетылько Г.И., Наконечный Д.Г., Блинова М.И., Нащекина Ю.А. (2018) Результаты замещения поверхностного дефекта гиалинового хряща крысы клеточно-инженерной конструкцией в эксперименте. Труды Карельского научного центра Российской академии наук. 4, 13-22.

DOI: 10.17076/them815 Реферат

Лечение и восстановление поврежденного слоя гиалинового хряща на сегодняшний день является важной и актуальной задачей, которая, несмотря на большое количество применяемых в клинической практике методик, до сих пор не решена в полном объеме. Перспективным направлением в решении данной проблемы может быть трансплантация клеточно-инженерной конструкции (КИК), состоящей из культуры клеток и биодеградируемого каркаса (мембраны). В экспериментальной работе на крысах была использована мембрана на основе полилактида и культуры мезенхимальных мультипотентных стволовых клеток (ММСК), а модель повреждения гиалинового слоя коленного сустава создавалась с помощью стоматологического бора. Клеточную культуру предварительно модифицировали с помощью белкового фактора роста TGF-B-3 для увеличения синтеза белков внеклеточного матрикса (ВКМ), в результате чего экспрессия генов Acan и col2a1, ответственных за синтез ВКМ, увеличилась в 4 раза по сравнению с контрольным образцом. При анализе области повреждения на длительных сроках наблюдения (до 90 суток) с помощью методики сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) удалось выявить уменьшение диаметра повреждения при трансплантации КИК, в то время как в контрольной группе, без применения КИК, диаметр повреждения увеличивался более чем в 2,5 раза. Таким образом, использование клеточно-инженерных конструкций является перспективным методом для восстановления поврежденного слоя гиалинового хряща, однако требуется проведение дополнительных исследований, направленных на увеличение эффективности модификации клеточной культуры, разработку методов совмещения ее с биодеградируемым каркасом, а также выбор способа фиксации КИК в области повреждения.

3. Божокин М.С., Божкова С.А., Вчерашний Д.Б., Бейлинсон Л.Л., Литвинов С.Д., Косьмин В.Л., Новосельцев С.В., Круглов В.Н. (2019). Динамическое заселение биодеградируемого носителя клеточной культурой мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток. Вестник медицинского института "РЕАВИЗ": реабилитация, врач и здоровье. 6(42), 38-43.

Реферат

Травмы и заболевания, приводящие к дефектам опорно-двигательного аппарата, затрагивают миллионы пациентов во всем мире. Для восстановления поврежденных участков хрящевой и костной ткани, зачастую недостаточно собственных регенеративных возможностей организма. Это приводит к необходимости дорогостоящих оперативных вмешательств. Одним из способов замещения костных и хрящевых дефектов, а также эффективного восстановления поврежденного связочного аппарата является применение клеточно-инженерных конструкций (КИК). Клеточно-инженерная конструкция из биодеградируемого полимера (матрицы, скаффолда) и культуры аутологичных (или аллогенных) клеток может быть безопасно трансплантирована в область повреждения. Затем, скаффолд биодеградирует, а клеточная культура синтезирует необходимое количество внеклеточного матрикса, который замещает участок костного или хрящевого дефекта. В данной работе описано работоспособное устройство для динамического заселения клеточной культуры мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток костного мозга на всю глубину биодеградируемой полимерной матрицы.

4. Bozhokin M.S., Khotin M.G., Sopova Y.V., Kachkin D.V., Rubel A.A. (2020). Mechanisms of TGF-P3 action as a therapeutic agent for promoting the synthesis of extracellular matrix proteins in hyaline cartilage. Biochemistry (Moscow). 55(4), 436-447.

DOI: 10.1134/S0006297920040045 Abstract

Hyaline cartilage is a nonvascular connective tissue covering the joint surface. It consists mostly of the extracellular matrix proteins and a small number of highly differentiated chondrocytes. At present, various techniques for repairing joint surfaces damage, for example, the use of modified cell cultures and biodegradable scaffolds, are under investigation. Molecular mechanisms of cartilage tissue proliferation have been also actively studied in recent years. TGFP3, which plays a critical role in the proliferation of normal cartilage tissue, is one of the most important protein among cytokines and growth factors affecting chondrogenesis. By interacting directly with receptors on the cell membrane surface, TGFP3 triggers a cascade of molecular interactions involving transcription factor Sox9. In this review, we describe the effects of TGFP3 on the receptor complex activation and subsequent intracellular trafficking of Smad proteins and analyze the relation between these processes and upregulation of expression of major extracellular matrix genes, such as col2a1 and acan.

5. Bozhokin M.S., Vcherashnii D.B., Yastrebov S.G., Beilinson L.L., Khotin M.G.. (2020). Stimulation of col2a1 gene expression with low-power laser radiation as a means to induce cartilage formation. Technical Physics. 65(9), 1521-1523.

DOI: 10.1134/S1063784220090091

Abstract

Elevated expression of the col2a1 gene responsible for synthesis of type II collagen, a major extracellular matrix protein of hyaline cartilage, was observed in multipotent stem cells of rat bone marrow exposed to low-power laser radiation with a wavelength of 0.63 p,m and power of 1.7 mW. The result suggests that this procedure may be employed in treatment of diseases associated with damage to the surface of articular cartilage.

6. Божокин М.С., Божкова С.А., Нетылько Г.И., Анисимова Л.О., Наконечный Д.Г., Нащекина Ю.А., Блинова М.И., Жеребцова Ю.В., Бенгардт Е.А. (2020). Результаты применения цитокина TGB-P3 для модификации клеточно-инженерной конструкции при замещении дефекта суставного гиалинового хряща в эксперименте. Современные проблемы науки и образования, 4 (152)

DOI: 10.17513/spno.29920 Реферат

Восстановление гиалинового слоя суставной поверхности является важной и актуальной задачей медицины, которая полностью не решена до настоящего времени. Одним из перспективных направлений ее решения является трансплантация специализированной клеточно-инженерной конструкции (КИК) из биодеградируемого полимера (скаффолда) и культуры аутологичных клеток. Цель исследования: оценить влияние цитокина TgffP3 на экспрессию генов хондрогенеза (col2a1, tgf^3, sox9) и динамику перифокальных реакций при замещении дефекта суставного хряща клеточно-инженерной конструкцией в эксперименте. Методом РВ-ПЦР в эксперименте in vitro была выполнена оценка экспрессии генов col2a1, tgffP3, sox9 в культуре ММСК при воздействии цитокина Tgf^3. В эксперименте in vivo на 27 половозрелых крысах изучали динамику гистологических изменений на 14-е, 30-е и 90-е сутки после формирования дефекта суставного хряща в 3 группах экспериментальных животных: без замещения дефекта, с трансплантацией клеточно-инженерной конструкции с культурой мезенхимных мультипотентных стромальных клеток (ММСК) без модификации и с модификацией цитокином TgffP3. Установлено относительное увеличение экспрессии генов col2a1, TgffP3, sox9 в 800, 20 и 120 раз соответственно под действием цитокина Tgf^3 на культуру ММСК in vitro.

7. Bozhokin M.S., Zherebtsova J.V., Khotin M.G., Vcherashnii D.B., Yastrebov S.G., Beilinson L.L.. (2022). Low-intensity photobiomodulation at 632,8 nm increases tgffi3, col2a1, and sox9 gene expression in rat bone marrow mesenchymal stem cells in vitro. Lasers in Medical Science. 37(1), 435-441.

DOI: 10.1007/s10103 -021 -03279-0 Abstract

The high incidence of cartilage destructions, as well as the social and economic importance of this pathology attracted great interest to the problem. At the present time, some data are available about the 632,8 nm low-intensity laser photobiomodulation positive effect on the cartilage tissue proliferation. The effect of this wavelength laser irradiation on the mesenchimal stem cell (MSC) differentiation in the chondrogenic direction was studied. The main aim of this work was to assess the low-intensity photobiomodulation effect on chondrogenesis. In this experiment, the cell model was used to compare the photobiomodulation and cytokine TgfP3 (transforming growth factor p 3) effects. Bone marrow MSCs were isolated from Wistar rats and cultured for the third passage. Chondrogenic effects of low-intensity He-Ne laser photobiomodulation and cytokine TgfP3 (10 ng/^L) were analyzed and compared after 21 days. The radiation source was the standard LGN-208 helium-neon (He-Ne) laser (632,8 nm, 1.7 mWt). Irradiation was performed cyclically for 15 min with 45-min pauses. The increase of the responsible for chondrogenesis (col2a1, tgfP3, and sox9) main gene expression under the photobiomodulation at 632,8 nm was evaluated in comparison with TgfP3 effect. The tgf]P3, col2a1, and sox9 gene expression increase was obtained in two experimental groups: using the laser photobiomodulation and cytokine TgfP3 effect. Gene expression levels of tgf^3, col2a1, and sox9 were measured using real-time polymerase chain reaction (RT-PCR) according to the -AACt method. It was found that the responsible for chondrogenesis genes expression (tgf]P3, col2a1, sox9) increased under the action of specific laser photobiomodulation during the observation period (from 0 to 21 days). The chondrogenic differentiation effect under the laser irradiation is less significant than Tgf^3 cytokine effect.

8. Bozhokin M.S., Bozhkova S.A., Netylko G.I., Nakonechny D.G., Nashchekina Y.A., Blinova M.I., Anisimova L.O. (2021). Experimental replacement of the surface defect of rat hyaline cartilage by a cell-engineered construct. Regenerative Engineering and TranslationalMedicine. 7(2), 184-193. DOI: 10.1007/s40883-021 -00205-2 Abstract

Hyaline cartilage damage is an urgent problem for millions of people all over the world. A promising emerging area in the recovery of the hyaline cartilage is the transplantation a modified cell culture in combination with a biodegradable matrix. Methods. In the present study, chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) was achieved by adding 10 ng/mL of recombinant TgfP3 protein to the cells during culturing. The resulting cell culture was seeded on a poly(lactic acid) scaffold and transplanted into an experimentally model surface defect of rat hyaline cartilage. Results. The applying of cellular engineering construct (CEC) with Tgf^3 protein has led to significant recovery of damaged hyaline cartilage, in contrast to the control group, which has been confirmed by means of histology and scanning electron microscopy. Prolonged observation of the experimental groups treated with CEC has revealed that the initial injury is filled with the newly formed regenerate

upon 90 days. Conclusion. The designed CEC with recombinant Tgf^3 leads to the formation of a regenerate resistant to external loads with a synthesized extracellular matrix of hyaline cartilage. Lay Summary. Damages of hyaline cartilage is an urgent problem for millions of people around the world. Current methods of its treatment have not full solved the problem of recovery of the articular surface. At the present time, one of the most promising technique is to use tissue engineering. In our work, we have created a cell-engineered construct (CEC) based on a biodegradable polymer (polylactide) with a culture of mesenchymal stem cells (MSCs) modified with recombinant protein (transforming growth factor beta 3). Further, we transplanted this CEC to an experimental group of rats with a preliminarily created defect of the hyaline cartilage and observed the damage recovery for a long time. We found a decrease the damage size in the experimental group, which indicates the efficiency of this approach. In our future work, we plan to continue with larger animals (rabbits) and to produce out the CEC modification using both a recombinant protein and a lentivirus with increased expression of key genes for chondrogenesis tgffi3 and sox9

9. Божокин М.С., Божкова С.А., Нащекина Ю.А., Сопова Ю.В., Рубель А.А., Хотин М.Г. (2021). Использование трансфекции мезенхимных мультипотентных стромальных клеток (ММСК) в качестве системы модификации культуры клеток для дальнейшего использования при замещении дефектов гиалинового хряща. Современные проблемы науки и образования. 4, 90.

DOI: 10.17513/spno.31052 Реферат

Для тканевой инженерии гиалинового хряща требуется эффективная модификация клеток для увеличенного синтеза белков внеклеточного матрикса после имплантации. Одним из наиболее распространенных методов изменения пролиферации клеток является трансфецирование с помощью липофекции благодаря своей простоте, эффективности, безопасности и экономической доступности для исследователей. Была изучена эффективность трансфецирования клеточной культуры мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток сконструированной оригинальной экспрессионной плазмидой pEGFP-N3-tgf^3 методом липофекции реагентом Lipofectamin3000. Анализ жизнеспособности клеток и эффективности модификации проводился методом проточной цитометрии на 3, 5 и 7 пассажах на 3-й и 7-й дни наблюдения. Результаты трансфекции мезенхимальных мультипотентных стромальных клеток костного мозга крысы показывают низкую эффективность, а также большую цитотоксичность, что в целом свидетельствует о неоптимальности применения трансфекции в целом и липофекции в частности при модификации первичной культуры клеток для их применения в тканевой инженерии гиалинового хряща. Было выявлено, что анализ эффективности такой модификации должен обязательно включать не только данные флюоресцентной микроскопии,

но и данные проточной цитометрии, так как при этом исключены ложноположительные результаты.

10. Bozhokin M.S., Bozhkova S.A., Sopova J.V., Nashchekina Y.A., Bildyug N.B., Khotin M.G., Rubel A.A. (2021) Specificities of scanning electron microscopy and histological methods in assessing cell-engineered construct effectiveness for the recovery of hyaline cartilage. Methods and Protocols. 4(4)

DOI: 10.3390/mps4040077 Abstract

Hyaline cartilage damage is an urgent problem for millions of people all over the world. A promising emerging area in the recovery of the hyaline cartilage is the transplantation a modified cell culture in combination with a biodegradable matrix. In the present study, chondrogenic differentiation of bone marrow mesenchymal stem cells (MSCs) was achieved by adding 10 ng/mL of recombinant Tgf^3 protein to the cells during culturing. The resulting cell culture was seeded on a poly(lactic acid) scaffold and transplanted into an experimentally model surface defect of rat hyaline cartilage. The applying of cellular engineering construct (CEC) with Tgf^3 protein has led to significant recovery of damaged hyaline cartilage, in contrast to the control group, which has been confirmed by means of histology and scanning electron microscopy. Prolonged observation of the experimental groups treated with CEC has revealed that the initial injury is filled with the newly formed regenerate upon 90 days. The designed CEC with recombinant Tgf^3 leads to the formation of a regenerate resistant to external loads with a synthesized extracellular matrix of hyaline cartilage. Damages of hyaline cartilage is an urgent problem for millions of people around the world. Current methods of its treatment have not full solved the problem of recovery of the articular surface. At the present time, one of the most promising technique is to use tissue engineering. In our work, we have created a cell-engineered construct (CEC) based on a biodegradable polymer (polylactide) with a culture of mesenchymal stem cells (MSCs) modified with recombinant protein (transforming growth factor beta 3). Further, we transplanted this CEC to an experimental group of rats with a preliminarily created defect of the hyaline cartilage and observed the damage recovery for a long time. We found a decrease the damage size in the experimental group, which indicates the efficiency of this approach. In our future work, we plan to continue with larger animals (rabbits) and to produce out the CEC modification using both a recombinant protein and a lentivirus with increased expression of key genes for chondrogenesis tgf^3 and sox9.

11. Shestovskaya M.V., Sopova J.V., Khotin M.G., Bozhokin M.S., Bozhkova S.A. (2021). Methods of modification of mesenchymal stem cells and conditions of their culturing for hyaline cartilage tissue engineering. Biomedicines. Т. 9. № 11.

DOI: 10.3390/biomedicines9111666

Abstract

The use of mesenchymal stromal cells (MSCs) for tissue engineering of hyaline cartilage is a topical area of regenerative medicine that has already entered clinical practice. The key stage of this procedure is to create conditions for chondrogenic differentiation of MSCs, increase the synthesis of hyaline cartilage extracellular matrix proteins by these cells and activate their proliferation. The first such works consisted in the indirect modification of cells, namely, in changing the conditions in which they are located, including microfracturing of the subchondral bone and the use of 3D biodegradable scaffolds. The most effective methods for modifying the cell culture of MSCs are protein and physical, which have already been partially introduced into clinical practice. Genetic methods for modifying MSCs, despite their effectiveness, have significant limitations. Techniques have not yet been developed that allow studying the effectiveness of their application even in limited groups of patients. The use of MSC modification methods allows precise regulation of cell culture proliferation, and in combination with the use of a 3D biodegradable scaffold, it allows obtaining a hyaline-like regenerate in the damaged area. This review is devoted to the consideration and comparison of various methods used to modify the cell culture of MSCs for their use in regenerative medicine of cartilage tissue.

VREDEN NATIONAL MEDICAL RESEARCH CENTRE FOR TRAUMATOLOGY AND ORTHOPEDICS OF THE MINISTRY OF HEALTH OF RUSSIA

ST. PETERSBURG STATE UNIVERSITY

As Manuscript

Bozhokin Mikhail Sergeevich

MODIFICATION OF MESENCHYMAL STROMALE CELLS FOR CELL-ENGINEERED RECOVERY OF HYALINE CARTILAGE DEFECTS

Scientific specialization 1.5.22. Cell biology

Thesis for a Candidate degree in biological sciences Translation from Russian

Scientific supervisor Sopova Julia Viktorovna, PhD

St. Petersburg 2022

TABLE OF CONTENTS

LIST OF ABBREVIATIONS............................................................................................................134

INTRODUCTION..............................................................................................................................136

1 LITERATURE REVIEW...............................................................................................................142

1.1. HYALINE CARTILAGE...........................................................................................................142

1.1.1 Restoration of hyaline cartilage...................................................................................................142

1.1.2 Cellular engineering of hyaline cartilage....................................................................................143

1.1.3 Cell culture modification methods..............................................................................................144

1.2 CYTOKINE TGF-P3 AND ITS ROLE IN HYALINE CARTILAGE PROLIFERATION . 144

1.2.1 History of the discovery of the cytokine TGF-P3.......................................................................144

1.2.2 Characterization of TGF-P3 Superfamily Proteins.....................................................................145

1.2.3 Cytokine TGF-P3 receptors on the cell surface..........................................................................146

1.2.4 Signaling mediated by Smad proteins.........................................................................................148

1.2.4.1 Intracellular movement of Smad proteins and their role in the regulation of the TPRI/TPRII receptor complex..................................................................................................................................150

1.2.4.2 Functions of Smad family proteins in the nucleus...................................................................150

1.2.5 Effect of TGF -P3 cytokine on col2a1 gene expression..............................................................152

1.2.5.1 Regulation of extracellular matrix gene expression by miRNA..............................................152

1.2.5.2 Use of TGF-P3 to replace hyaline cartilage defects.................................................................153

1.3 MODERN METHODS FOR RESTORATION OF DAMAGED SURFACE

OF HYALINE CARTILAGE...........................................................................................................154

1.3.1 Chondrocyte implantation...........................................................................................................154

1.3.2 Microfracturing...........................................................................................................................157

1.3.3 Classical tissue engineering using a biodegradable polymer......................................................157

1.4 METHODS FOR NON-VIRAL CELL CULTURE MODIFICATION.................................160

1.4.1 Protein modification....................................................................................................................160

1.4.2 Genetic modification...................................................................................................................161

1.4.3 Low-intensity laser radiation.......................................................................................................162

2. MATERIALS AND METHODS...................................................................................................163

2.1 MOLECULAR AND BIOCHEMICAL METHODS................................................................163

2.1.1 Bacterial strains and culture media.............................................................................................163

2.1.2 Plasmids used in the work...........................................................................................................163

2.1.3 Molecular cloning.......................................................................................................................163

2.1.4 Transformation of Escherichia coli and DNA isolation.............................................................164

2.1.5 RNA isolation..............................................................................................................................164

2.1.6 Real-time polymerase chain reaction..........................................................................................165

2.2 CELL CULTURING METHODS..............................................................................................165

2.2.1 Cell isolation and culture.............................................................................................................165

2.2.2 Cryopreservation and thawing of cells........................................................................................165

2.2.3. Cytofluorimetric analysis of cell culture....................................................................................166

2.2.4. Production of a polymer scaffold...............................................................................................166

2.2.5. Creation of a cell-engineering construct....................................................................................167

2.3 CELL MODIFICATION METHODS.......................................................................................169

2.3.1. Protein modification by the cytokine TGF-P3...........................................................................169

2.3.2. Transfection of cells by lipofection with Lipofectamine3000©................................................169

2.3.3. Exposure to laser radiation with a wavelength of 632,8 nm......................................................170

2.4 ANIMAL EXPERIMENTS.........................................................................................................171

2.4.1 Choice of experimental animal...................................................................................................171

2.4.2 Keeping animals..........................................................................................................................171

2.4.3 The course of surgery..................................................................................................................172

2.4.4 Creating a standardized defect....................................................................................................172

2.4.5 Implantation of CEC in experimental animals in the area

of the created hyaline cartilage defect..................................................................................................173

2.5 HISTOLOGICAL STUDIES......................................................................................................174

2.5.1 Preliminary preparation of experimental animal tissues.............................................................174

2.5.2 Preparation of classical histological slides..................................................................................174

2.5.3 Preparation of CEC cryosections................................................................................................176

2.5.4 Staining with hematoxylin, eosin and alcian blue.......................................................................176

2.5.5 Fluorescence and confocal microscopy of a cell-engineered construct......................................176

2.6 SCANNING ELECTRON MICROSCOPY..............................................................................177

2.6.1 Preparation of tissues of the experimental animal......................................................................177

2.6.2 Deposition of a metal layer on the area under study...................................................................177

2.6.3 SEM analysis of the regeneration area........................................................................................177

2.7 STATISTICAL PROCESSING OF THE RESULTS...............................................................178

2.8 GENERAL SCHEME OF ANIMAL EXPERIMENT TO EVALUATE THE EFFICIENCY OF THE DEVELOPED CEC WITH CELL MODIFICATION

WITH TGF-P3 CYTOKINE.............................................................................................................178

3 RESULTS.........................................................................................................................................179

3.1 IDENTIFICATION AND CONFIRMATION OF MSC TYPE..............................................179

3.1.1 Obtaining and culturing cells......................................................................................................179

3.1.2 Confocal microscopy of cell culture...........................................................................................179

3.1.3 Cytofluorimetric analysis of cell culture.....................................................................................180

3.2 PRODUCTION OF RECOMBINANT PLASMIDS pEGFP-N3-tgf p3.................................181

3.3 LIPOFECTION OF MSCs WITH LIPOFECTAMIN 3000© REAGENT....................................181

3.3.1 Assessing the cytotoxicity of lipofection for MSC cell culture..................................................181

3.3.2 Transfection efficiency................................................................................................................182

3.3.3 Formation of cell aggregates.......................................................................................................184

3.4 MODIFICATION OF CELL CULTURE USING 638,2 nm COHERENT LASER

RADIATION.......................................................................................................................................185

3.4.1 The course of the experiment and the operation of the pilot plant..............................................185

3.4.2. Cytotoxicity of laser radiation....................................................................................................186

3.4.3 Analysis of cell aggregate formation..........................................................................................186

3.4.4 Analysis of changes in relative gene expression.........................................................................187

3.5 PROTEIN MODIFICATION OF MSCS USING CYTOKINE TGF-P3................................187

3.5.1 Cell aggregation on the plastic surface.......................................................................................187

3.5.2 Cell aggregation on the scaffold surface.....................................................................................189

3.5.3 Analysis of relative change in gene expression activity upon addition of TGF-P3 protein........190

3.6 PREPARING CEC.......................................................................................................................190

3.6.1 Device for colonizing cell culture inside a biodegradable carrier...............................................190

3.6.2 Cell culture proliferation on the surface and within a biodegradable carrier..............................191

3.7 ANIMAL EXPERIMENTS.........................................................................................................193

3.7.1 Condition of animals after surgery..............................................................................................193

3.7.2 Evaluation of the intrinsic regenerative capacity of rat hyaline cartilage over time...................194

3.7.3 Implantation of CEC in the area of the superficial defect of the hyaline cartilage of the rat knee joint.......................................................................................................................................................198

3.7.3.1 Scanning electron microscopy of the damaged area................................................................199

3.7.3.2 Histological preparations of the area of damage to the hyaline cartilage................................201

4 RESULTS AND DISCUSSION......................................................................................................205

4.1 RELEVANCE OF THE PROBLEM OF DAMAGED ARTICULAR SURFACES OF HYALINE CARTILAGE..................................................................................................................205

4.2 USING CELL ENGINEERING AS A PROMISING METHOD FOR RECOVERY

OF DAMAGE TO THE ARTICULAR SURFACE........................................................................205

4.3 SELECTION OF A CELL CULTURE FOR USE IN REPLACING HYALINE CARTILAGE DEFECTS AS A PART OF A CELL-ENGINEERED CONSTRUCTION........205

4.4 SIMULATION OF A DEFECT AND CREATION OF A BIOREACTOR FOR ANIMAL

EXPERIMENTS.................................................................................................................................206

4.5 MODIFICATION OF CELL CULTURE AS A KEY STAGE IN THE REPLACEMENT OF A HYALINE CARTILAGE DEFECT WITH THE HELP OF CEC.....................................207

4.6 GENETIC MODIFICATION OF CELL CULTURE..............................................................208

4.7 LOW-INTENSITY LASER STIMULATION 632,8 nm..........................................................211

4.8 MODIFICATION OF CELL CULTURE MODIFICATION USING RECOMBINANT PROTEIN TGF-ß3.............................................................................................................................212

4.9 CEC CREATION ANALYSIS....................................................................................................213

4.10 RESULTS OBTAINED DURING THE WORK USING PROTEIN MODIFICATION

OF CELL CULTURE........................................................................................................................214

CONCLUSIONS.................................................................................................................................217

REFERENCES...................................................................................................................................218

APPENDIX.........................................................................................................................................240

LIST OF ABBREVIATIONS