Кинетические параметры инициации трансляции в эукариотических системах тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат биологических наук Алехина, Ольга Михайловна

• Алехина, Ольга Михайловна
• кандидат биологических наук
• 2011

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Алехина, Ольга Михайловна

Список сокращений

I. Введение

II. Обзор литературы

1. Основные механизмы инициации трансляции

2. Особенности эукариотических мРНК

Кэп-структура

5'-нетранслируемая область мРНК

З'-нетранслируемая область мРНК

Инициаторный кодон и консенсусная последовательность

Альтернативные инициаторные кодоны

3. Механизм 5-концевой инициации трансляции

Формирование 43 S преинициаторного комплекса

Присоединение 43 S комплексов к мРНК

Сканирование 5'-НТО мРНК

Узнавание инициаторного кодона

Блокирование рибосомы на инициаторном кодоне

Присоединение 60S рибосомной субчастицы

4. Механизм внутренней инициации трансляции

Структура IRES

IRES-связывающие белки eIF-независимые IRES

5. Регуляция инициации трансляции

Регуляция активности факторов инициации мРНК-специфическая регуляция инициации

Регуляция инициации 5'-НТО-связывающими белками

Регуляция инициации З'-НТО-связывающими белками

Стимуляция трансляции поли(А)-связывающим белком

Регуляция трансляции с помощью микроРНК

III. Материалы и методы

1. Материалы

1.1 Реактивы и ферменты

1.2Плазмиды

2. Экспериментальные процедуры

2.1 Конструирование и выделение плазмид

Полимеразная цепная реакция

Рестрикция плазмид

Выделение фрагментов ДНК из агарозного геля

Лигирование

Трансформация Е. coli

Выделение и очистка плазмидной ДНК

2.2 Электрофорез ДНК в агарозном геле

2.3 Транскрипция in vitro

2.4 Котранскрипционное кэппирование мРНК

2.5 Электрофорез РНК в агарозном геле в денатурирующих условиях

2.6 Определение концентраций ДНК и РНК

2.7 Трансляция in vitro

Трансляция в системе из зародышей пшеницы

Трансляция в бесклеточной системе Кребс

2.8 Вычисление полного времени трансляции

2.9 Определение transit time методом импульсной метки

2.10 Электрофорез белков в полиакриламидном геле

2.11 Анализ полисом методом скоростного зонального ультрацентрифугирования в градиентах сахарозы

IV. Результаты

1. Исследование кинетических параметров сканирования в процессе кэп-зависимой инициации трансляции в эукариотических бесклеточных системах

1.1 Мониторинг синтеза люциферазы в бесклеточных системах трансляции в реальном времени

1.2 Метод точного определения продолжительности синтеза одной белковой цепи

1.3 Конструирование мРНК люциферазы с 5'-НТО различной длины на основе лидера из ретротранспозона LINE-1 человека

1.4 Зависимость полного времени трансляции от длины 5'-нетранслируемой области мРНК

1.5 Определение вклада разных этапов трансляции в изменение времени синтеза белковой цепи

1.6 Установление постоянства скорости элонгации для мРНК люциферазы с 5-НТО различной длины

1.7Влияние вставки 1RES последовательности в 5'-НТО различной длины на время трансляции мРНК

1.8 Влияние элементов вторичной структуры 5-НТО на скорость сканирования

1.9 Определение скоростей сканирования 5'-НТО и процесса элонгации в эукариотических бесклеточных системах трансляции

2. Исследование инициации трансляции на некэппированных мРНК в бесклеточной системе из зародышей пшеницы

2.1 Эффект увеличения скорости белкового синтеза в ходе трансляции мРНК люциферазы с очень короткой 5'-НТО

2.2 Влияние 5-НТО на эффект ускорения трансляции

2.3 Влияние длины З'-НТО на эффект ускорения белкового синтеза

2.4 Влияние кэппирования и полиаденилирования мРНК на эффект ускорения трансляции

2.5 Измерение transit time в бесклеточной системе из зародышей пшеницы

2.6 Анализ полирибосом в бесклеточной системе трансляции

2.7 Влияние добавления кэп-аналога на эффект ускорения белкового синтеза

2.8мРНК, усиливающие трансляцию других матриц в бесклеточной системе из зародышей пшеницы

2.9 Стимуляция синтеза GFP мутантными мРНК люциферазы в пробирке (batch) и CECF системе

V. Обсуждение результатов

VI. Выводы

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Кинетические параметры инициации трансляции в эукариотических системах»

Инициация трансляции является важнейшим этапом биосинтеза белка у эукариот, именно на этой стадии действуют основные механизмы регуляции белкового синтеза в клетке. Основным механизмом эукариотической инициации является так называемая 5'-концевая инициация, при которой 40S рибосомная субчастица связывается с кэппированным 5-концом мРНК, а затем сканирует нуклеотидную последовательность до тех пор, пока не встретит инициаторный кодон в подходящем контексте. Далее на инициаторном кодоне происходит присоединение большой рибосомной субчастицы и формируется 80S рибосома, готовая к процессу элонгации. Предложенная более 30-ти лет назад М. Козак, эта простая и изящная модель позволила свести воедино большое количество накопленных экспериментальных данных и выдержала множество попыток опровержения. Однако, до последнего времени эта модель являлась не более чем гипотезой. Оставалось неясным, какие молекулярные процессы являются движущей силой инициации. Не удавалось получить прямые экспериментальные доказательства существования процесса сканирования - измерить его кинетические параметры или охарактеризовать промежуточные состояния.

В настоящее время существуют две наиболее общие модели поиска инициаторного кодона путем сканирования 5-НТО мРНК, основанные на том факте, что этот процесс является АТФ-зависимым. Согласно первой, широко распространенной модели, считается, что энергия АТФ необходима лишь для функционирования РНК-хеликаз, расплетающих шпильки структурированных 5'-НТО перед рибосомой и таким образом освобождающих дорогу для движущихся 43 S преинициаторных комплексов. В этом случае поиск инициаторного кодона происходит посредством АТФ-независимой одномерной диффузии, так называемого «бесфазного блуждания» рибосомы по цепи мРНК.

Согласно альтернативной модели, 40S субчастицы осуществляют более или ' менее равномерное, 5'—>3' направленное движение вдоль 5-IITO мРНК, которое требует энергии само по себе, независимо от проблемы расплетания вторичной структуры, так как энергонезависимое однонаправленное движение даже вдоль неструктурированных (или расплавленных) участков мРНК нарушает второй закон термодинамики. До недавнего времени существовали лишь косвенные экспериментальные данные, не позволяющие сделать определенный выбор в пользу той или иной модели сканирования.

В данной работе мы попытались установить механизм поиска инициаторного кодона, определив взаимосвязь между длиной 5'-нетранслируемой области мРНК и временем, необходимым для ее сканирования. В случае механизма случайного блуждания время сканирования должно быть пропорционально квадрату длины 5-НТО, тогда как в случае однонаправленного движения эта зависимость должна быть линейной. Применив уникальный метод in situ мониторинга синтеза люциферазы в эукариотических бесклеточных системах, мы получили возможность оценивать продолжительность одного цикла трансляции (включающую времена инициации, элонгации и терминации) с недостижимой ранее точностью порядка 5 секунд. Это позволило провести точный анализ кинетических параметров сканирования в процессе кэп-зависимой инициации трансляции.

Кроме того, исследуя трансляцию некэппированных мРНК люциферазы в бесклеточной системе из зародышей пшеницы, мы обнаружили интересный эффект - при высоких концентрациях мРНК скорость белкового синтеза заметно увеличивалась в процессе работы системы. В данной работе мы попытались установить, связано ли наблюдаемое ускорение трансляции с включением некоего альтернативного механизма инициации в процессе работы бесклеточной системы, или же оно определяется какими-то другими внутренними изменениями в трансляционной системе.

II. Обзор литературы

Инициация трансляции у эукариот

Заключение диссертации по теме «Молекулярная биология», Алехина, Ольга Михайловна

VI. Выводы

1. Разработан метод точного измерения продолжительности синтеза полипептидной цепи белка на рибосоме.

2. В эукариотических системах трансляции показана линейная зависимость времени сканирования 5-нетранслируемой области мРНК от ее длины в процессе кэп-зависимой инициации трансляции. Впервые экспериментально доказана однонаправленность движения инициирующей рибосомной субчастицы.

3. Показано, что скорость рибосомного сканирования 5'-нетранслируемой области мРНК сравнима со скоростью процесса элонгации белковой цепи.

4. Исследовано влияние вторичной структуры мРНК на процесс сканирования. Показано, что шпильки высокой стабильности уменьшают процессивность сканирования в растительной системе и уменьшают среднюю скорость сканирования в системе из клеток млекопитающих.

5. Обнаружено увеличение скорости синтеза белка в процессе трансляции некэппированных мРНК («эффект разгона»).

6. Предложена модель механизма реинициации после одного раунда трансляции, основанная на циклизации транслирующих полирибосом.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Алехина, Ольга Михайловна, 2011 год

1. Hinnebusch, A.G. (2011) Molecular mechanism of scanning and start codon selection in eukaryotes. Microbiol Mol Biol Rev, 75, 434-467.

2. Jackson, R.J., Hellen, C.U. and Pestova, T.V. (2010) The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol, 11, 113127.

3. Kozak, M. (1989) The scanning model for translation: an update. J Cell Biol, 108, 229-241.

4. Abramson, R.D., Dever, T.E. and Merrick, W.C. (1988) Biochemical evidence supporting a mechanism for cap-independent and internal initiation of eukaryotic mRNA. J Biol Chem, 263, 6016-6019.

5. Macejak, D.G. and Sarnow, P. (1991) Internal initiation of translation mediated by the 5' leader of a cellular mRNA. Nature, 353, 90-94.

6. Pyronnet, S., Pradayrol, L. and Sonenberg, N. (2000) A cell cycle-dependent internal ribosome entry site. Mol Cell, 5, 607-616.

7. Bag, J. (1991) mRNA and mRNP. In Trachsel, H. (ed.), Translation in Eukaryotes. CRC Press, Boca Raton, Ann Arbor, Boston, London, pp. 71-96.

8. Spirin, A.S. (1996) Masked and translatable messenger ribonucleoproteins in higher eukaryotes. In Hershey, J.W.B., Mathews, M.B. and Sonenberg, N. (eds.), Translational Control Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 319-334.

9. Furuichi, Y. and Miura, K. (1975) A blocked structure at the 5' terminus of mRNA from cytoplasmic polyhedrosis virus. Nature, 253, 374-375.

10. Marcotrigiano, J., Gingras, A.C., Sonenberg, N. and Burley, S.K. (1997) Cocrystal structure of the messenger RNA 5' cap-binding protein (eIF4E) bound to 7-methyl-GDP. Cell, 89, 951-961.

11. Lo, H.J., Huang, H.K. and Donahue, T.F. (1998) RNA polymerase I-promoted HIS4 expression yields uncapped, polyadenylated mRNA that is unstable and inefficiently translated in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol, 18, 665-675.

12. Kozak, M. (1979) Inability of circular mRNA to attach to eukaryotic ribosomes. Nature, 280, 82-85.

13. Kozak, M. (1986) Influences of mRNA secondary structure on initiation by eukaryotic ribosomes. Proc Natl Acad Sci USA, 83,2850-2854.

14. Pelletier, J. and Sonenberg, N. (1985) Insertion mutagenesis to increase secondary structure within the 5' noncoding region of a eukaryotic mRNA reduces translational efficiency. Cell, 40, 515-526.

15. Baim, S.B. and Sherman, F. (1988) mRNA structures influencing translation in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mo I Cell Biol, 8, 1591-1601.

16. Cigan, A.M. and Donahue, T.F. (1987) Sequence and structural features associated with translational initiator regions in yeast. Gene, 59, 1-18.

17. Berthelot, K., Muldoon, M., Rajkowitsch, L., Hughes, J. and McCarthy, J.E. (2004) Dynamics and processivity of 40S ribosome scanning on mRNA in yeast. Mol Microbiol, 51, 987-1001.

18. Kozak, M. (1991) A short leader sequence impairs the fidelity of initiation by eukaryotic ribosomes. Gene Expr, 1, 111-115.

19. Pestova, T.V. and Kolupaeva, V.G. (2002) The roles of individual eukaryotic translation initiation factors in ribosomal scanning and initiation codon selection. Genes Dev, 16, 2906-2922.

20. Kozak, M. (1991) Structural features in eukaryotic mRNAs that modulate the initiation of translation. J Biol Chem, 266, 19867-19870.

21. Vassilenko, K.S., Alekhina, O.M., Dmitriev, S.E., Shatsky, I.N. and Spirin, A.S. (2011) Unidirectional constant rate motion of the ribosomal scanning particle during eukaryotic translation initiation. Nucleic Acids Res, 39, 5555-5567.

22. Standart, N., Dale, M., Stewart, E. and Hunt, T. (1990) Maternal mRNA from clam oocytes can be specifically unmasked in vitro by antisense RNA complementary to the 3'-untranslated region. Genes Dev, 4, 2157-2168.

23. Shaw, G. and Kamen, R. (1986) A conserved AU sequence from the 3' untranslated region of GM-CSF mRNA mediates selective mRNA degradation. Cell, 46, 659667.

24. Savant-Bhonsale, S. and Cleveland, D.W. (1992) Evidence for instability of mRNAs containing AUUUA motifs mediated through translation-dependent assembly of a > 20S degradation complex. Genes Dev, 6, 1927-1939.

25. Keller, W., Bienroth, S., Lang, K.M. and Christofori, G. (1991) Cleavage and polyadenylation factor CPF specifically interacts with the pre-mRNA 3' processing signal AAUAAA. EMBOJ, 10, 4241-4249.

26. Zhao, J., I-Iyman, L. and Moore, C. (1999) Formation of mRNA 3' ends in eukaryotes: mechanism, regulation, and interrelationships with other steps in mRNA synthesis. Microbiol Mol Biol Rev, 63, 405-445.

27. Sachs, A.B. and Kornberg, R.D. (1985) Nuclear polyadenylate-binding protein. Mol Cell Biol, 5, 1993-1996.

28. Adam, S.A., Nakagawa, Т., Swanson, M.S., Woodruff, Т.К. and Dreyfiiss, G. (1986) mRNA polyadenylate-binding protein: gene isolation and sequencing and identification of a ribonucleoprotein consensus sequence. Mol Cell Biol, 6, 29322943.

29. Sachs, A.B., Bond, M.W. and Kornberg, R.D. (1986) A single gene from yeast for both nuclear and cytoplasmic polyadenylate-binding proteins: domain structure and expression. Cell, 45, 827-835.

30. Sachs, A.B., Davis, R.W. and Kornberg, R.D. (1987) A single domain of yeast poly(A)-binding protein is necessary and sufficient for RNA binding and cell viability. Mol Cell Biol, 7, 3268-3276.

31. Kozak, M. and Shatkin, A.J. (1978) Migration of 40 S ribosomal subunits on messenger RNA in the presence of edeine. J Biol Chem, 253, 6568-6577.

32. Kozak, M. (1987) An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. Nucleic Acids Res, 15, 8125-8148.

33. Kozak, M. (1984) Selection of initiation sites by eukaryotic ribosomes: effect of inserting AUG triplets upstream from the coding sequence for preproinsulin. Nucleic Acids Res, 12,3873-3893.

34. Kozak, M. (1986) Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes. Cell, 44, 283-292.

35. Kozak, M. (1997) Recognition of AUG and alternative initiator codons is augmented by G in position +4 but is not generally affected by the nucleotides in positions +5 and +6. EMBOJ, 16, 2482-2492.

36. Shabalina, S.A., Ogurtsov, A.Y., Rogozin, I.B., Koonin, E.V. and Lipman, D.J. (2004) Comparative analysis of orthologous eukaryotic mRNAs: potential hidden functional signals. Nucleic Acids Res, 32, 1774-1782.

37. Cigan, A.M., Pabich, E.K. and Donahue, T.F. (1988) Mutational analysis of the IIIS4 translational initiator region in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol, 8, 2964-2975.

38. Yun, D.F., Laz, T.M., Clements, J.M. and Sherman, P. (1996) mRNA sequences influencing translation and the selection of AUG initiator codons in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Microbiol, 19, 1225-1239.

39. Chen, S.J., Lin, G., Chang, K.J., Yeh, L.S. and Wang, C.C. (2008) Translational efficiency of a non-AUG initiation codon is significantly affected by its sequence context in yeast. J Biol Chem, 283, 3173-3180.

40. Clements, J.M., Laz, T.M. and Sherman, F. (1988) Efficiency of translation initiation by non-AUG codons in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol, 8, 45334536.

41. Peabody, D.S. (1989) Translation initiation at non-AUG triplets in mammalian cells. J Biol Chem, 264, 5031-5035.

42. Ingolia, N.T., Ghaemmaghami, S., Newman, J.R. and Weissman, J.S. (2009) Genome-wide analysis in vivo of translation with nucleotide resolution using ribosome profiling. Science, 324, 218-223.

43. Pisarev, A.V., Hellen, C.U. and Pestova, T.V. (2007) Recycling of eukaryotic posttermination ribosomal complexes. Cell, 131, 286-299.

44. Fraser, C.S., Berry, K.E., Hershey, J.W. and Doudna, J.A. (2007) eIF3j is located in the decoding center of the human 40S ribosomal subunit. Mol Cell, 26, 811-819.

45. Spahn, C.M., Beckmann, R., Eswar, N., Penczek, P.A., Sali, A., Blobel, G. and Frank, J. (2001) Structure of the 80S ribosome from Saccharomyces cerevisiae -tRNA-ribosome and subunit-subunit interactions. Cell, 107, 373-386.

46. Ben-Shem, A., Jenner, L., Yusupova, G. and Yusupov, M. (2010) Crystal structure of the eukaryotic ribosome. Science, 330, 1203-1209.

47. Siridechadilok, B., Fraser, C.S., Hall, R.J., Doudna, J.A. and Nogales, E. (2005) Structural roles for human translation factor eIF3 in initiation of protein synthesis. Science, 310, 1513-1515.

48. Yatime, L., Mechulam, Y., Blanquet, S. and Schmitt, E. (2007) Structure of an archaeal heterotrimeric initiation factor 2 reveals a nucleotide state between the GTP and the GDP states. Proc Natl Acad Sci USA, 104, 18445-18450.

49. Simonetti, A., Marzi, S., Myasnikov, A.G., Fabbretti, A., Yusupov, M., Gualerzi, C.O. and Klaholz, B.P. (2008) Structure of the 30S translation initiation complex. Nature, 455, 416-420.

50. Allen, G.S., Zavialov, A., Gursky, R., Ehrenberg, M. and Frank, J. (2005) The cryo-EM structure of a translation initiation complex from Escherichia coli. Cell, 121, 703-712.

51. Lomakin, I.B., Kolupaeva, V.G., Marintchev, A., Wagner, G. and Pestova, T.V. (2003) Position of eukaryotic initiation factor elFl on the 40S ribosomal subunit determined by directed hydroxyl radical probing. Genes Dev, 17, 2786-2797.

52. Nielsen, K.H., Behrens, M.A., He, Y., Oliveira, C.L., Jensen, L.S., Hoffmann, S.V., Pedersen, J.S. and Andersen, G.R. (2011) Synergistic activation of eIF4A by eIF4B and eIF4G. Nucleic Acids Res, 39, 2678-2689.

53. Rozovsky, N., Butterworth, A.C. and Moore, M.J. (2008) Interactions between eIF4AI and its accessory factors eIF4B and eIF4H. RNA, 14, 2136-2148.

54. Gross, J.D., Moerke, N.J., von der Haar, T., Lugovskoy, A.A., Sachs, A.B., McCarthy, J.E. and Wagner, G. (2003) Ribosome loading onto the mRNA cap is driven by conformational coupling between eIF4G and eIF4E. Cell, 115, 739-750.

55. Volpon, L., Osborne, M.J., Topisirovic, I., Siddiqui, N. and Borden, K.L. (2006) Cap-free structure of eIF4E suggests a basis for conformational regulation by its ligands. EMBOJ, 25, 5138-5149.

56. Rogers, G.W., Jr., Richter, N.J., Lima, W.F. and Merrick, W.C. (2001) Modulation of the helicase activity of eIF4A by eIF4B, eIF4H, and eIF4F. J Biol Chem, 276, 30914-30922.

57. Neff, C.L. and Sachs, A.B. (1999) Eukaryotic translation initiation factors 4G and 4A from Saccharomyces cerevisiae interact physically and functionally. Mol Cell Biol, 19, 5557-5564.

58. LeFebvre, A.K., Korneeva, N.L., Trutschl, M., Cvek, U., Duzan, R.D., Bradley, C.A., I-Iershey, J.W. and Rhoads, R.E. (2006) Translation initiation factor eIF4G-l binds to eIF3 through the eIF3e subunit. J Biol Chem, 281, 22917-22932.

59. Shirokikh, N.E. and Spirin, A.S. (2008) Poly(A) leader of eukaryotic mRNA bypasses the dependence of translation on initiation factors. Proc Natl Acad Sci USA, 105, 10738-10743.

60. Pisarev, A.V., Kolupaeva, Y.G., Yusupov, M.M., Hellen, C.U. and Pestova, T.V. (2008) Ribosomal position and contacts of mRNA in eukaryotic translation initiation complexes. EMBO J, 27, 1609-1621.

61. Jackson, R.J. (1991) The ATP requirement for initiation of eukaryotic translation varies according to the mRNA species. Eur JBiochem, 200, 285-294.

62. Spirin, A.S. (2009) How does a scanning ribosomal particle move along the 5'-untranslated region of eukaryotic mRNA? Brownian Ratchet model. Biochemistry, 48, 10688-10692.

63. Feynman, R., Leighton, R. and Sands, M. (1963) The Feynman Lectures on Physics. Addison-Wesley Publishing Company, Reading, MA.

64. Pisareva, V.P., Pisarev, A.V., Komar, A.A., Hellen, C.U. and Pestova, T.V. (2008) Translation initiation on mammalian mRNAs with structured 5'UTRs requires DExH-box protein DHX29. Cell, 135, 1237-1250.

65. Matsuda, D. and Dreher, T.W. (2006) Close spacing of AUG initiation codons confers dicistronic character on a eukaiyotic mRNA. RNA, 12, 1338-1349.

66. Marsden, S., Nardelli, M., Linder, P. and McCarthy, J.E. (2006) Unwinding single RNA molecules using helicases involved in eukaryotic translation initiation. J Mol Biol, 361, 327-335.

67. Tarn, W.Y. and Chang, T.H. (2009) The current understanding of Dedlp/DDX3 homologs from yeast to human. RNA Biol, 6, 17-20.

68. Abaeva, I.S., Marintchev, A., Pisareva, V.P., Hellen, C.U. and Pestova, T.V. (2011) Bypassing of stems versus linear base-by-base inspection of mammalian mRNAs during ribosomal scanning. EMBOJ, 30, 115-129.

69. Pestova, T.V., Borukhov, S.I. and Hellen, C.U. (1998) Eukaiyotic ribosomes require initiation factors 1 and 1A to locate initiation codons. Nature, 394, 854-859.

70. Yoon, H.J. and Donahue, T.F. (1992) The suil suppressor locus in Saccharomyces cerevisiae encodes a translation factor that functions during tRNA(iMet) recognition of the start codon. Mol Cell Biol, 12, 248-260.

71. Maag, D., Algire, M.A. and Lorsch, J.R. (2006) Communication between eukaryotic translation initiation factors 5 and 1A within the ribosomal pre-initiation complex plays a role in start site selection. J Mol Biol, 356, 724-737.

72. Maag, D., Fekete, C.A., Gryczynski, Z. and Lorsch, J.R. (2005) A conformational change in the eukaryotic translation preinitiation complex and release of elFl signal recognition of the start codon. Mol Cell, 17, 265-275.

73. Paulin, F.E., Campbell, L.E., O'Brien, K., Loughlin, J. and Proud, C.G. (2001) Eukaryotic translation initiation factor 5 (eIF5) acts as a classical GTPase-activator protein. Curr Biol, 11, 55-59.

74. Marintchev, A. and Wagner, G. (2004) Translation initiation: structures, mechanisms and evolution. Q Rev Biophys, 37, 197-284.

75. Algire, M.A., Maag, D. and Lorsch, J.R. (2005) Pi release from eIF2, not GTP hydrolysis, is the step controlled by start-site selection during eukaryotic translation initiation. Mol Cell, 20, 251-262.

76. Kolitz, S.E., Takacs, J.E. and Lorsch, J.R. (2009) Kinetic and thermodynamic analysis of the role of start codon/anticodon base pairing during eukaryotic translation initiation. RNA, 15, 138-152.

77. Nanda, J.S., Cheung, Y.N., Takacs, J.E., Martin-Marcos, P., Saini, A.K., Hinnebusch, A.G. and Lorsch, J.R. (2009) elFl controls multiple steps in start codon recognition during eukaryotic translation initiation. J Mol Biol, 394, 268-285.

78. Conte, M.R., Kelly, G., Babon, J., Sanfelice, D., Youell, J., Smerdon, S.J. and Proud, C.G. (2006) Structure of the eukaryotic initiation factor (elF) 5 reveals a fold common to several translation factors. Biochemistry, 45, 4550-4558.

79. Fletcher, C.M., Pestova, T.V., Hellen, C.U. and Wagner, G. (1999) Structure and interactions of the translation initiation factor elFl. EMBOJ, 18, 2631-2637.

80. Kapp, L.D. and Lorsch, J.R. (2004) GTP-dependent recognition of the methionine moiety on initiator tRNA by translation factor eIF2. J Mol Biol, 335, 923-936.

81. Pestova, T.V., Lomakin, I.B., Lee, J.H., Choi, S.K., Dever, T.E. and Hellen, C.U. (2000) The joining of ribosomal subunits in eukaryotes requires eIF5B. Nature, 403, 332-335.

82. Unbehaun, A., Marintchev, A., Lomakin, I.B., Didenko, T., Wagner, G., Hellen, C.U. and Pestova, T.V. (2007) Position of eukaryotic initiation factor eIF5B on the 80S ribosome mapped by directed hydroxyl radical probing. EMBO J, 26, 31093123.

83. Olsen, D.S., Savner, E.M., Mathew, A., Zhang, F., Krishnamoorthy, T., Phan, L. and Hinnebusch, A.G. (2003) Domains of elFIA that mediate binding to eIF2, eIF3 and eIF5B and promote ternary complex recruitment in vivo. EMBOJ, 22, 193-204.

84. Marintchev, A., Kolupaeva, V.G., Pestova, T.V. and Wagner, G. (2003) Mapping the binding interface between human eukaryotic initiation factors 1A and 5B: a new interaction between old partners. Proc Natl Acad Sei USA, 100, 1535-1540.

85. Acker, M.G., Shin, B.S., Dever, T.E. and Lorsch, J.R. (2006) Interaction between eukaryotic initiation factors 1A and 5B is required for efficient ribosomal subunit joining. J Biol Chem, 281, 8469-8475.

86. Acker, M.G., Shin, B.S., Nanda, J.S., Saini, A.K., Dever, T.E. and Lorsch, J.R. (2009) Kinetic analysis of late steps of eukaryotic translation initiation. J Mol Biol, 385, 491-506.

87. Pelletier, J. and Sonenberg, N. (1988) Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature, 334, 320-325.

88. Hellen, C.U. and Sarnow, P. (2001) Internal ribosome entry sites in eukaryotic mRNA molecules. Genes Dev, 15, 1593-1612.

89. Jackson, R.J., Howell, M.T. and Kaminski, A. (1990) The novel mechanism of initiation of Picornavirus RNA translation. Trends Biochem Sei, 15, 477-483.

90. Hellen, C.U., Pestova, T.V. and Wimmer, E. (1994) Effect of mutations downstream of the internal ribosome entry site on initiation of poliovirus protein synthesis. J Virol, 68, 6312-6322.

91. Kaminski, A., Howell, M.T. and Jackson, R.J. (1990) Initiation of encephalomyocarditis virus RNA translation: the authentic initiation site is not selected by a scanning mechanism. EMBOJ, 9, 3753-3759.

92. Pestova, T.V., Hellen, C.U. and Shatsky, I.N. (1996) Canonical eukaryotic initiation factors determine initiation of translation by internal ribosomal entry. Mol Cell Biol, 16, 6859-6869.

93. Jackson, R.J. (2005) Alternative mechanisms of initiating translation of mammalian mRNAs. Biochem Soc Trans, 33, 1231-1241.

94. Sasaki, J. and Nakashima, N. (1999) Translation initiation at the CUU codon is mediated by the internal ribosome entry site of an insect picorna-like virus in vitro. J Virol, 73, 1219-1226.

95. Pestova, T.V. and Hellen, C.U. (2003) Translation elongation after assembly of ribosomes on the Cricket paralysis virus internal ribosomal entry site without initiation factors or initiator tRNA. Genes Dev, 17, 181-186.

96. Hershey, J.W. (1991) Translational control in mammalian cells. Annu Rev Biochem, 60, 717-755.

97. Berlanga, J. J., Santoyo, J. and De Haro, C. (1999) Characterization of a mammalian homolog of the GCN2 eukaryotic initiation factor 2 alpha kinase. Eur J Biochem, 265, 754-762.

98. Morley, S.J. and Traugh, J.A. (1990) Differential stimulation of phosphorylation of initiation factors eIF-4F, eIF-4B, eIF-3, and ribosomal protein S6 by insulin and phorbol esters. J Biol Chem, 265, 10611-10616.

99. Tuazon, P.T., Merrick, W.C. and Traugh, J.A. (1989) Comparative analysis of phosphorylation of translational initiation and elongation factors by seven protein kinases. J Biol Chem, 264, 2773-2777.

100. Cohen, P. (1985) The coordinated control of metabolic pathways by broad-specificity protein kinases and phosphatases. Curr Top Cell Regul, 27, 23-37.

101. Lachance, P.E., Miron, M., Raught, B., Sonenberg, N. and Lasko, P. (2002) Phosphorylation of eukaryotic translation initiation factor 4E is critical for growth. Mol Cell Biol, 22, 1656-1663.

102. Raught, B., Gingras, A.C., Gygi, S.P., Imataka, H., Morino, S., Gradi, A., Aebersold, R. and Sonenberg, N. (2000) Serum-stimulated, rapamycin-sensitive phosphorylation sites in the eukaryotic translation initiation factor 4GI. EMBOJ, 19, 434-444.

103. Bolster, D.R., Vary, T.C., Kimball, S.R. and Jefferson, L.S. (2004) Leucine regulates translation initiation in rat skeletal muscle via enhanced eIF4G phosphorylation. JNutr, 134, 1704-1710.

104. Duncan, R., Milburn, S.C. and Hershey, J.W. (1987) Regulated phosphorylation and low abundance of HeLa cell initiation factor eIF-4F suggest a role in translational control. Heat shock effects on eIF-4F. J Biol Chem, 262, 380-388.

105. Haghighat, A., Mader, S., Pause, A. and Sonenberg, N. (1995) Repression of cap-dependent translation by 4E-binding protein 1: competition with p220 for binding to eukaryotic initiation factor-4E .EMBOJ, 14, 5701-5709.

106. Pause, A., Belsham, G.J., Gingras, A.C., Donzc, O., Lin, T.A., Lawrence, J.C., Jr. and Sonenberg, N. (1994) Insulin-dependent stimulation of protein synthesis by phosphorylation of a regulator of 5'-cap function. Nature, 371, 762-767.

107. Stebbins-Boaz, B., Cao, Q., de Moor, C.H., Mendez, R. and Richter, J.D. (1999) Maskin is a CPEB-associated factor that transiently interacts with elF-4E. Mol Cell, 4, 1017-1027.

108. Gebauer, F. and Flentze, M.W. (2004) Molecular mechanisms of translational control. Nat Rev Mol Cell Biol, 5, 827-835.

109. Muckenthaler, M., Gray, N.K. and Hentze, M.W. (1998) IRP-1 binding to ferritin mRNA prevents the recruitment of the small ribosomal subunit by the cap-bindingcomplex eIF4F. Mol Cell, 2,383-388.

110. Hamilton, T.L., Stoneley, M., Spriggs, K.A. and Bushell, M. (2006) TOPs and their regulation. Biochem Soc Trans, 34, 12-16.

111. Kleene, K.C. (1989) Poly(A) shortening accompanies the activation of translation of five mRNAs during spermiogenesis in the mouse. Development, 106, 367-373.

112. Sonenberg, N. and Hinnebusch, A.G. (2009) Regulation of translation initiation in eukaiyotes: mechanisms and biological targets. Cell, 136, 731-745.

113. Minshall, N., Reiter, M.IL, Weil, D. and Standart, N. (2007) CPEB interacts with an ovary-specific eIF4E and 4E-T in early Xenopus oocytes. J Biol Chem, 282, 3738937401.

114. Villaescusa, J.C., Buratti, C., Penkov, D., Mathiasen, L., Planaguma, J., Ferretti, E. and Blasi, F. (2009) Cytoplasmic Prepl interacts with 4EHP inhibiting Hoxb4 translation. PLoS One, 4, e5213.

115. Chekulaeva, M., Hentze, M.W. and Ephrussi, A. (2006) Bruno acts as a dual repressor of oskar translation, promoting mRNA oligomerization and formation of silencing particles. Cell, 124, 521-533.

116. Minshall, N. and Standart, N. (2004) The active form of Xp54 RNA helicase in translational repression is an RNA-mediated oligomer. Nucleic Acids Res, 32, 13251334.

117. Tanaka, K.J., Ogawa, K., Takagi, M., Imamoto, N., Matsumoto, K. and Tsujimoto, M. (2006) RAP55, a cytoplasmic mRNP component, represses translation in Xenopus oocytes. J Biol Chem, 281, 40096-40106.

118. Coller, J. and Parker, R. (2005) General translational repression by activators of mRNA decapping. Cell, 122, 875-886.

119. Huttelmaier, S., Zenklusen, D., Lederer, M., Dictenberg, J., Lorenz, M., Meng, X., Bassell, G.J., Condeelis, J. and Singer, R.H. (2005) Spatial regulation of beta-actin translation by Src-dependent phosphorylation ofZBPl. Nature, 438, 512-515.

120. Johnstone, O. and Lasko, P. (2004) Interaction with eIF5B is essential for Vasa function during development. Development, 131, 4167-4178.

121. Kahvejian, A., Svitkin, Y.V., Sukarieh, R., M'Boutchou, M.N. and Sonenberg, N. (2005) Mammalian poly(A)-binding protein is a eukaryotic translation initiation factor, which acts via multiple mechanisms. Genes Dev, 19, 104-113.

122. Sachs, A.B. and Davis, R;W. (1989) The poly(A) binding protein is required for poly(A) shortening and 60S ribosomal subunit-dependent translation initiation. Cell, 58, 857-867.

123. Proweller, A. and Butler, J.S. (1997) Ribosome concentration contributes to discrimination against poly(A)-mRNA during translation initiation in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem, 272, 6004-6010.

124. Tarun, S.Z., Jr. and Sachs, A.B. (1996) Association of the yeast poly(A) tail binding protein with translation initiation factor eIF-4G. EMBOJ, 15, 7168-7177.

125. Gallie, D.R. (1991) The cap and poly(A) tail function synergistically to regulate mRNA translational efficiency. Genes Dev, 5, 2108-2116.

126. Jacobson, A. (1996) Poly(A) metabolism and translation: The closed-loop model. In Hershey, J.W.B., Mathews, M.B. and Sonenberg, N. (eds.), Translational Control. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, pp. 451-480.

127. Wells, S.E., Hillner, P.E., Vale, R.D. and Sachs, A.B. (1998) Circularization of mRNA by eukaryotic translation initiation factors. Mol Cell, 2, 135-140.

128. Shelton, E. and Kuff, E.L. (1966) Substructure and configuration of ribosomes isolated from mammalian cells. J Mol Biol, 22, 23-31.

129. Yoshida, T., Wakiyama, M., Yazaki, K. and Miura, K. (1997) Transmission electron and atomic force microscopic observation of polysomes on carbon-coated grids prepared by surface spreading. J Electron Microsc (Tokyo), 46, 503-506.

130. Christensen, A.K. and Bourne, C.M. (1999) Shape of large bound polysomes in cultured fibroblasts and thyroid epithelial cells. AnatRec, 255, 116-129.

131. Philipps, G.R. (1965) Haemoglobin synthesis and polysomes in intact reticulocytes. Nature, 205, 567-570.

132. Baglioni, C., Vesco, C. and Jacobs-Lorena, M. (1969) The role of ribosomal subunits in mammalian cells. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 34, 555-565.

133. Gray, N.K., Coller, J.M., Dickson, K.S. and Wickens, M. (2000) Multiple portions of poly(A)-binding protein stimulate translation in vivo. EMBO J, 19,4723-4733.

134. Cakmakci, N.G., Lerner, R.S., Wagner, E.J., Zheng, L. and Marzluff, W.F. (2008) SLIP1, a factor required for activation of histone mRNA translation by the stem-loop binding protein. Mol Cell Biol, 28, 1182-1194.

135. Caponigro, G. and Parker, R. (1995) Multiple functions for the poly(A)-binding protein in mRNA decapping and deadenylation in yeast. Genes Dev, 9, 2421-2432.

136. Copeland, P.R. and Wormington, M. (2001) The mechanism and regulation of deadenylation: identification and characterization of Xenopus PARN. RNA, 1, 875886.

137. Bartel, D.P. (2004) MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell, 116, 281-297.

138. Macrae, I.J., Zhou, K., Li, F., Repic, A., Brooks, A.N., Cande, W.Z., Adams, P.D. and Doudna, J.A. (2006) Structural basis for double-stranded RNA processing by Dicer. Science, 311, 195-198.

139. Gregoiy, R.I., Chendrimada, T.P., Cooch, N. and Shiekhattar, R. (2005) Human RISC couples microRNA biogenesis and posttranscriptional gene silencing. Cell, 123, 631-640.

140. Bohmert, K., Camus, I., Bellini, C., Bouchez, D., Caboche, M. and Benning, C. (1998) AGOl defines a novel locus of Arabidopsis controlling leaf development. EMBO J, 17, 170-180.

141. Vaucheret, H., Vazquez, F., Crete, P. and Bartel, D.P. (2004) The action of ARGONAUTE1 in the miRNA pathway and its regulation by the miRNA pathway are crucial for plant development. Genes Dev, 18, 1187-1197.

142. Pillai, R.S., Bhattacharyya, S.N. and Filipowicz, W. (2007) Repression of protein synthesis by miRNAs: how many mechanisms? Trends Cell Biol, 17, 118-126.

143. Richter, J.D. (2008) Think you know how miRNAs work? Think again. Nat Struct MolBiol, 15, 334-336.

144. Pillai, R.S., Bhattacharyya, S.N., Artus, C.G., Zoller, T„ Cougot, N., Basyuk, E., Bertrand, E. and Filipowicz, W. (2005) Inhibition of translational initiation by Let-7 MicroRNA in human cells. Science, 309, 1573-1576.

145. Eulalio, A., Huntzinger, E. and Izaurralde, E. (2008) GW182 interaction with Argonaute is essential for miRNA-mediated translational repression and mRNA decay. Nat Struct Mol Biol, 15, 346-353.

146. Chendrimada, T.P., Finn, K.J., Ji, X., Baillat, D., Gregory, R.I., Liebhaber, S.A., Pasquinelli, A.E. and Shiekhattar, R. (2007) MicroRNA silencing through RISC recruitment of eIF6. Nature, 447, 823-828.

147. Eulalio, A., Tritschler, F. and Izaurralde, E. (2009) The GW182 protein family in animal cells: new insights into domains required for miRNA-mediated gene silencing. RNA, 15, 1433-1442.

148. Behm-Ansmant, I., Rehwinkel, J., Doerks, T., Stark, A., Bork, P. and Izaurralde, E. (2006) mRNA degradation by miRNAs and GW182 requires both CCR4:NOT deadenylase and DCP1:DCP2 decapping complexes. Genes Dev, 20, 1885-1898.

149. Nottrott, S., Simard, M.J. and Richter, J.D. (2006) Human let-7a miRNA blocks protein production on actively translating polyribosomes. Nat Struct Mol Biol, 13, 1108-1114.

150. Vasudevan, S., Tong, Y. and Steitz, J.A. (2007) Switching from repression to activation: microRNAs can up-regulate translation. Science, 318, 1931-1934.

151. Evstafieva, A.G., Ugarova, T.Y., Chernov, B.K. and Shatsky, I.N. (1991) A complex RNA sequence determines the internal initiation of encephalomyocarditis virus RNA translation. Nucleic Acids Res, 19, 665-671.

152. Kolb, V.A., Makeyev, E.V. and Spirin, A.S. (2000) Co-translational folding of an eukaryotic multidomain protein in a prokaryotic translation system. J Biol Chem, 275, 16597-16601.

153. Wakiyama, M., Futami, T. and Miura, K. (1997) Poly(A) dependent translation in rabbit reticulocyte lysate. Biochimie, 79, 781-785.

154. Zeyenko, V.V., Ryabova, L.A., Gallie, D.R. and Spirin, A.S. (1994) Enhancing effect of the 3-untranslated region of tobacco mosaic virus RNA on protein synthesis in vitro. FEBS Lett, 354, 271-273.

155. Pokrovskaya, I.D. and Gurevich, V.V. (1994) In vitro transcription: preparative RNA yields in analytical scale reactions. Anal Biochem, 220,420-423.

156. Gurevich, V.V., Pokrovskaya, I.D., Obukhova; T.A. and Zozulya, S.A. (1991) Preparative in vitro mRNA synthesis using SP6 and T7 RNA polymerases. Anal Biochem, 195, 207-213.

157. Erickson, A.H. and Blobel, G. (1983) Cell-free translation of messenger RNA in a wheat germ system. Methods Enzymol, 96, 38-50.

158. Sorensen, M.A. and Pedersen, S. (1998) Determination of the peptide elongation rate in vivo. In Martin, R. (ed.), Protein Synthesis, Methods and Protocols. Humana Press, Totowa, NJ, pp. 129-142.

159. Schagger, H. and von Jagow, G. (1987) Tricine-sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis for the separation of proteins in the range from 1 to 100 kDa. Anal Biochem, 166, 368-379.

160. Kolb, V.A., Makeyev, E.V. and Spirin, A.S. (1994) Folding of firefly luciferase during translation in a cell-free system. EMBOJ, 13, 3631-3637.

161. Cahn, F. and Lubin, M. (1978) Inhibition of elongation steps of protein synthesis at reduced potassium concentrations in reticulocytes and reticulocyte lysate. J Biol Chem, 253, 7798-7803.

162. Spirin, A.S. and Ryazanov, A.G. (1991) Regulation of elongation rate. In Trachsel, H. (ed.), Translation in Eukaryotes. CRC Press, Roca Raton, FL, pp. 325-350.

163. Hunt, T. (1974) The control of globin synthesis in rabbit reticulocytes. Ann N Y AcadSci, 241, 223-231.

164. Kopeina, G.S., Afonina, Z.A., Gromova, K.V., Shirokov, V.A., Vasiliev, V.D. and Spirin, A.S. (2008) Step-wise formation of eukaiyotic double-row polyribosomes and circular translation of polysomal mRNA. Nucleic Acids Res, 36, 2476-2488.

165. Gallie, D.R. (2002) The 5'-leader of tobacco mosaic virus promotes translation through enhanced recruitment of eIF4F. Nucleic Acids Res, 30, 3401-3411.

166. Gallie, D.R. and Tanguay, R. (1994) Poly (A) binds to initiation factors and increases cap-dependent translation in vitro. J Biol Chem, 269, 17166-17173.

167. Matveev, S.V., Illarionov, B.A., Vysotski, E.S., Bondar, V.S., Markova, S.V. and Alakhov, Y.B. (1995) Obelin mRNA a new tool for studies of translation in cellfree systems. Anal Bio chem, 231, 34-39.

168. Matthews, J.C., Hori, K. and Cormier, MJ. (1977) Purification and properties of Renilla reniformis luciferase. Biochemistry, 16, 85-91.

169. Conti, E., Lloyd, L.F., Akins, J., Franks, N.P. and Brick, P. (1996) Ciystallization and preliminary diffraction studies of firefly luciferase from Photinus pyralis. Acta Crystallogr D Biol Oystallogr, 52, 876-878.

170. Kajiyama, N. and Nakano, E. (1993) Thermostabilization of firefly luciferase by a single amino acid substitution at position 217. Biochemistry, 32, 13795-13799.

171. Kozak, M. (1980) Role of ATP in binding and migration of 40S ribosomal subunits. Cell, 22, 459-467.

172. Sarabhai, A. and Brenner, S. (1967) A mutant which reinitiates the polypeptide chain after chain termination. JMol Biol, 27, 145-162.

173. Adhin, M.R. and van Duin, J. (1990) Scanning model for translational reinitiation in eubacteria. JMol Biol, 213, 811-818.

174. Alekhina, O.M., Vassilenko, K.S. and Spirin, A.S. (2007) Translation of non-capped mRNAs in a eukaryotic cell-free system: acceleration of initiation rate in the course of polysome formation. Nucleic Acids Res, 35, 6547-6559.

175. Cordova, N.J., Ermentrout, B. and^Oster, G.F. (1992) Dynamics of single-motor molecules: the thermal ratchet model. Proc Natl Acad Sci USA, 89, 339-343.

176. Gelles, J. and Landick, R. (1998) RNA polymerase as a molecular motor. Cell, 93, 13-16.

177. Yanagida, T., Ueda, M., Murata, T., Esaki, S. and Ishii, Y. (2007) Brownian motion, fluctuation and life. Biosysterns, 88, 228-242.

178. Spirin, A.S. (2002) Ribosome as a molecular machine. FEBSLett, 514, 2-10.

179. Spirin, A.S. (2004) The ribosome as an RNA-based molecular machine. RNA Biol, I, 3-9.

180. Spirin, A.S. (2009) The ribosome as a conveying thermal ratchet machine. J Biol Chem, 284,21103-21119.

181. Nishiyama, M., Higuchi, H., Ishii, Y., Taniguchi, Y. and Yanagida, T. (2003) Single molecule processes on the stepwise movement of ATP-driven molecular motors. Biosystems, 71, 145-156.

182. Kitamura, K. and Yanagida, T. (2003) Stochastic properties of actomyosin motor. Biosystems, 71, 101-110.

183. Tarun, S.Z., Jr. and Sachs, A.B. (1995) A common function for mRNA 5' and 3' ends in translation initiation in yeast. Genes Dev, 9, 2997-3007.

184. Munroe, D. and Jacobson, A. (1990) mRNA poly(A) tail, a 3' enhancer of translational initiation. Mol Cell Biol, 10, 3441-3455.

185. Jackson, R.J., Hunt, S.L., Reynolds, J.E. and Kaminski, A. (1995) Cap-dependent and cap-independent translation: operational distinctions and mechanistic interpretations. Curr Top Microbiol Immunol, 203, 1-29.

186. Adamson, S.D., Howard, G.A. and Herbert, E. (1969) The ribosome cycle in a reconstituted cell-free system from reticulocytes. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 34, 547-554.

187. Preiss, T. and Hentze, M.W. (1999) From factors to mechanisms: translation and translational control in eukaryotes. Curr Opin Genet Dev, 9, 515-521.

188. Madin, K., Sawasaki, T., Kamura, N., Takai, K., Ogasawara, T., Yazaki, K., Takei, T., Miura, K. and Endo, Y. (2004) Formation of circular polyribosomes in wheat germ cell-free protein synthesis system. FEBS Lett, 562, 155-159.

189. Spirin, A.S. (1969) The second Sir Hans Krebs Lecture. Informosomes. Eur J Biochem, 10, 20-35.

190. Skabkin, M.A., Kiselyova, O.I., Chernov, K.G., Sorokin, A.V., Dubrovin, E.V., Yaminsky, I.V., Yasiliev, V.D. and Ovchinnikov, L.P. (2004) Structuralorganization of mRNA complexes with major core mRNP protein YB-1. Nucleic Acids Res, 32, 5621-5635.

191. Еще хочется поблагодарить свою семью родителей, мужа и дочку - за выдающееся терпение и всяческую поддержку в процессе написания и подготовки защиты диссертации.