Изучение временной и пространственной регуляции трансляции усовершенствованными методами мРНК-трансфекции тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.01.03, кандидат наук Лашкевич Ксения Александровна

• Лашкевич Ксения Александровна
• кандидат наук
• 2020

Оглавление диссертации кандидат наук Лашкевич Ксения Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Инициация трансляции у эукариот: обзор основных механизмов

2.1.1. Классическое кэп-зависимое сканирование

2.1.2. Неканоническая инициация: 4 типа IRES элементов

2.1.3. Реинициация трансляции, «проскальзывание» рибосомы и рибосомный слайдинг

2.1.4. Другие механизмы

2.2. Основные пути регуляции трансляции у эукариот

2.2.1. Инактивация фактора eIF2

2.2.2. Инактивация компонентов комплекса eIF4F

2.2.3. мРНК-специфичная регуляция

2.3. Адресация, транспорт и локальная трансляция мРНК в клетках эукариот

2.3.1. Трансляция, ассоциированная с мембраной ЭПР

2.3.2. Трансляция, ассоциированная с внешней мембраной митохондрий

2.2.4. Особенности регуляции локализованной трансляции

2.3. Метод репортёрных конструкций в изучении регуляции трансляции

2.4. Заключение к обзору литературы

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

3.1. МАТЕРИАЛЫ

3.1.1. Реактивы и коммерческие наборы

3.1.2. Плазмидные конструкции и олигонуклеотиды

3.1.3. Буферы и растворы

3.2. МЕТОДЫ

3.2.1. Получение библиотек кДНК

3.2.2. Центрифугирование в градиенте концентрации сахарозы

3.2.3. Полимеразная цепная реакция

3.2.4. Электрофорез ДНК в агарозном геле

3.2.5. Очистка ДНК методом фенольной экстракции и осаждение

3.2.6. Молекулярное клонирование

3.2.7. Транскрипция и кэпирование мРНК

3.2.8. Электрофорез РНК в ПААГ в денатурирующих условиях

3.2.9. Культивирование клеточных культур млекопитающих

3.2.10. Трансфекция культивируемых клеток

3.2.10. Синхронизация клеток и анализ клеточного цикла

3.2.11. Трансляция в бесклеточной системе

3.2.12. Ту-принтинг

3.2.13. Создание клеточной линии с нокаутом по избранному гену

3.2.14. Электрофорез белков в ДСН-ПААГ по Лэммли

3.2.15. Вестерн-блоттинг

3.2.16. Обработка данных

4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

4.1. Часть I. Регуляция трансляции во времени: краткосрочные эффекты и длительная динамика

4.1.1. Разработка методологии краткосрочной мРНК-трансфекции (БЬЕЯТ)

4.1.2. Анализ эффекта клеточных стрессов на трансляцию мРНК с различными механизмами инициации трансляции

4.1.3. Трансляция безлидерной мРНК в живых клетках млекопитающих относительно устойчива к различным стрессовым условиям

4.1.4. Амикумацин А ингибирует трансляцию в эукариотической системе

4.1.5. Бластицидин 8 ингибирует стадию элонгацию трансляции в эукариотической системе

4.1.6. Разработка методологии измерения люминесценции в режиме реального времени в живых клетках

4.1.7. Длительная динамика трансляции репортёрных мРНК во время стрессов

4.1.8. Сплайсинг искусственной мРНК в трансфицированных клетках

4.2. Часть II. Регуляция трансляции в пространстве: изучение эффекта локализации на трансляцию репортёрных мРНК

4.2.1. Влияние ядерных событий на регуляцию трансляции репортёрной мРНК

4.2.2. Дизайн и создание репортёрных конструкций с разной локализацией трансляции мРНК

4.2.3. Проверка корректности и эффективности работы конструкций с разной локализацией трансляции

4.2.4. Трансфекция культивируемых клеток люциферазными репортёрами методом РЬБЯТ

4.2.5. Отсутствие существенного вклада природной 3 - НТО в наблюдаемые эффекты

4.2.6. Исследование трансляции локализованных репортёров в динамике

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

БЛАГОДАРНОСТИ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

АТФ аденозинтрифосфат

АФК активные формы кислорода

ГТФ гуанозитрифосфат

ДМСО диметилсульфоксид

ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота

дНТФ дезоксирибонуклеозидтрифосфат

ДСН додецилсульфат натрия

ДТТ дитиотреитол

кДНК комплементарная ДНК

пДНК плазмидная ДНК

мРНК матричная рибонукленивая кислота

миРНК микро РНК

ЛД люменальный домен ЭПР

МХ митохондрия

54 З-НТО 5\ 3л-нетранслируемая область

ОТ-ПЦР полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией

ПААГ полиакриламидный гель

ПСА персульфат аммония

ПЦР полимеразная цепная реакция

САМ сигнл адресации в митохондрии

СП сигнальная последовательность

ТЕМЕД -тетраметилэтилендиамин

ТМД трансмембранный домен

Трис К-трис(гидроксиметил)аминометан

ЦД цитозольный домен

ЭДТА этилендиаминтетраацетат

ЭПР эндоплазматический ретикулум

DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium

EGFP enhanced green fluorescent protein

elF eukaryotic initiation factor

FLERT fleeting mRNA transfection

FACS fluorescence-activated cell sorter

Fluc firefly luciferase

IRES internal ribosome entry site

ISR integrated stress response

PBS phosphate buffered saline

RAPP regulation of aberrant protein production

Rluc renilla luciferase

RIDD regulated IRE1-dependent decay

SR SRP-receptor

SRP signal recognition particle

uORF upstream open reading frame

UPR unfolded protein response

1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Биосинтез белка является фундаментальным клеточным процессом, обеспечивающим жизнедеятельность клетки и выполнение ею заданных функций. Регуляция экспрессии генов на уровне трансляции играет важную роль в процессах пролиферации, дифференцировки, запрограммированной смерти, ответе на инфекцию и стрессовые воздействия. Изучение такой регуляции и лежащих в её основе механизмов является ключевым вопросом фундаментальных исследований и имеет большое значение для клинической практики. Поиск и изучение эукариотических антибиотиков, в частности, ингибиторов трансляции, является перспективным направлением в борьбе с онкологическими заболеваниями.

Считается, что именно на стадии инициации контроль трансляции является самым оперативным и результативным, позволяя клетке в кратчайшие сроки скорректировать метаболизм, сократив энергетические затраты на биосинтез белка и направив высвобожденные ресурсы на борьбу со стрессом. Глобальная регуляция инициации у эукариот осуществляется посредством модификации ключевых инициаторных факторов. Тем не менее, такому контролю подвержены не все мРНК. Уникальной особенностью некоторых эукариотических мРНК является возможность инициировать трансляцию несколькими различными способами (классическое кэп-зависимое сканирование, IRES-направленное рекрутирование рибосомы, прямое связывание 80S рибосомного комплекса и др.). Зачастую это происходит в обход некоторых факторов инициации, что исключает такие мРНК из глобальной регуляции, придавая им особые трансляционные свойства. Каждый из этих механизмов в отдельности изучен довольно подробно, в частности, с использованием in vitro подходов. Однако систематического исследования трансляционных свойств мРНК с различными механизмами инициации в условиях изменения трансляционного статуса (например, при стрессе) в живой клетке в рамках одного исследования, в котором можно было бы их корректно сравнивать, а также с применением адекватных и физиологически значимых методов, предпринято не было.

Методология изучения трансляции и ее регуляции активно развивается и последнее десятилетие ознаменовано большими достижениями, в частности, благодаря таким ярким методическим разработкам, как рибосомный профайлинг, визуализация единичных мРНК и процесса трансляции в живой клетке. Тем не менее, целый ряд вопросов в этой области остается изученным недостаточно хорошо.

Компартментализация трансляции, т.е. пространственное разграничение этого процесса внутри клетки, а также ее последствия вызывают повышенный интерес. В литературе стали появляться указания на то, что внутриклеточная локализация мРНК и ее избирательная трансляция в определенном компартменте клетки, а также предшествующие этому события (например, процессинг первичного мРНК-транскрипта в ядре), оказывают существенное влияние на эффективность трансляции этой мРНК, включая характер трансляционного ответа на стрессовые воздействия. Таким образом, современная наука предлагает считать компартмент-зависимую регуляцию трансляции в клетке еще одним этапом регуляции генной экспрессии на уровне трансляции. Однако до сих пор не было попыток изучить эти события с помощью метода репортёрных мРНК.

Другой важный вопрос, не получивший пока большого внимания, это временная динамика трансляции при ответе на стресс и механизмы регуляции этого ответа. Подавляющая часть исследований в этом направлении ограничивается несколькими избранными временными точками, а то и вовсе одной, на основании чего невозможно получить полную картину экспрессии генов во времени в зависимости от меняющихся условий.

В рамках данного диссертационного проекта мы попытались изучить такие актуальные аспекты трансляции, как ее пространственная и временная регуляция, объединив исследование этих направлений с помощью наших оригинальных методических разработок.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение временной и пространственной регуляции трансляции усовершенствованными методами мРНК-трансфекции»

Цель и задачи работы

Целью данной работы было описание и анализ краткосрочной и долговременной динамики трансляции широкого набора репортёрных мРНК в условиях различных стрессов, а также в зависимости от локализации трансляции в эукариотической системе.

Для этого были поставлены следующие задачи:

- охарактеризовать первичный трансляционный ответ в условиях стрессов различной природы на наборе репортёрных мРНК с различными механизмами инициации трансляции методом краткосрочной мРНК-трансфекции;

- наладить метод прижизненного измерения люминесценции в режиме реального времени в культивируемых клетках и применить его к изучению динамики трансляции репортёрных мРНК в норме и в условиях стрессов;

- разработать и приготовить репортёрные конструкции, трансляция которых ассоциирована с разными клеточными компартментами: происходит либо в цитоплазме, либо на мембране эндоплазматического ретикулума, либо на внешней мембране митохондрий, а также мРНК с интроном в кодирующей части для отслеживания трансляции мРНК, претерпевшей сплайсинг;

- сравнить эффективности трансляции полученных репортёрных мРНК в клетках млекопитающих при помощи разработанных методов мРНК-трансфекции в норме и в условиях стрессов.

Научная новизна и практическая значимость работы

В ходе выполнения диссертационной работы был разработан ряд новых экспериментальных подходов к изучению трансляции, включая метод краткосрочной мРНК-трансфекции, а также методология длительного измерения активности репортёрной активности в живых клетках. Новые методические подходы были применены к изучению трансляции большого набора репортёрных мРНК, включая мРНК с различными механизмами инициации трансляции, и

позволили выявить дифференциальные эффекты в ответ на стрессовые условия, в том числе ранее не описанные в литературе.

Впервые были описаны трансляционные свойства безлидерной мРНК в культивируемых клетках высших эукариот и показана ее устойчивая трансляция в условиях стрессов разной природы интенсивности, при которых трансляция репортёрной мРНК с классическим кеп-зависимым клеточным лидером значительно ингибировалась или даже полностью подавлялась.

Показано, что антибиотик амикумацин А ингибирует элонгацию трансляции репортёрных мРНК в клетках эукариот, что может быть использовано в дальнейшем для разработки нового противоопухолевого препарата. Для другого рибосомного ингибитора, бластицидина 8, показана активность ингибировать трансляцию у эукариот преимущественно на стадии элонгации.

Метод мРНК-трансфекции впервые применен для оценки влияния локализации мРНК на ее трансляцию. Выявлены дифференциальные трансляционные эффекты репортёрных мРНК с разной локализацией трансляции в ответ на некоторые виды клеточных стрессов.

Положения, выносимые на защиту

1. Разработан метод краткосрочной мРНК-трансфекции и с его помощью показано, что репортёрные мРНК с разными механизмами инициации трансляции проявляют дифференциальные первичные трансляционные эффекты в ответ на стрессовые воздействия в клетках млекопитающих.

2. Разработан метод длительного измерения люминесценции в живых клетках в режиме реального времени и применен к изучению долговременной динамики трансляции репортёрных мРНК в условиях стресса.

3. Локализация трансляции репортёрных мРНК на мембране эндоплазматического ретикулума оказывает существенное влияние на уровень продукции белка, временной профиль экспрессии и характер их изменений при стрессе.

4. Анализ влияния митохондриальных стрессов на репортёрную мРНК, трансляция которой направлена на внешнюю мембрану митохондрий, не выявил различий в регуляции трансляции по сравнению с мРНК, транслируемой в цитозоле.

5. Искусственная мРНК, содержащая интрон, подвергается сплайсингу в трансфицированных пролиферирующих клетках и способна эффективно транслироваться.

6. Амикумацин А и бластицидин S ингибируют трансляцию в эукариотической системе на стадии элонгации.

Методология исследования

В основе исследования лежит метод мРНК-трансфекции культивируемых клеток, который мы модифицировали, разработав новые методологические подходы, а затем применили в своем исследовании. Для получения плазмидных конструкций использовали стандартные методы молекулярного клонирования, репортёрные мРНК получали на матрице ПЦР-продуктов в системе in vitro транскрипции с последующим кэпированием. Культивируемые клетки млекопитающих трансфицировали готовыми транскриптами, анализ люминесценции проводили в клеточном лизате или в живых клетках. Трансляцию репортёрных мРНК проводили также в бесклеточной системе, полученной из цитоплазматических клеточных экстрактов. Клеточные линии с нокаутом гена получали методом CRISPR/Cas9 редактирования. Эффективность нокаута оценивали вестерн-блоттингом. Ту-принтинг использовали для анализа позиции рибосомных комплексов на мРНК.

Личный вклад соискателя

Личный вклад соискателя состоял в анализе литературных данных, планировании и проведении экспериментов, анализе результатов, представлении результатов на конференциях и участии в подготовке публикаций. Основные результаты, представленные в работе, получены самим автором.

Степень достоверности результатов

Результаты были получены с применением классических, а также новых современных методов, с использованием современного оборудования и качественных реактивов. Все эксперименты были поставлены в нескольких технических и биологических повторах с соответствующими контролями и хорошо воспроизводились.

Апробация работа и публикации

По материалам работы опубликовано 3 статьи в зарубежных рецензируемых журналах, входящих в перечень ВАК РФ.

Диссертация апробирована на научном семинаре отдела взаимодействия вирусов с клеткой Научно-исследовательского института Физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ. Результаты работы были представлены на 42-м конгрессе европейского биохимического общества FEBS Congress "From molecules to cells and back", Иерусалим, Израиль, 10-14 сентября 2017; конференции EMBO Conference: Protein Synthesis and Translational Control, Heidelberg, Германия, 6-9 сентября 2017; XXIV Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых "Ломоносов - 2017", МГУ имени М.В.Ломоносова, Россия, 20 апреля 2017; конференции EMBO Conference: Protein Synthesis and Translational Control, Cold Spring Harbor, США, 1-4 сентября 2020.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 138 страницах и включает следующие разделы: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение, Заключение, Выводы, Список литературы. Диссертация содержит 44 рисунка и 3 таблицы. Список литературы включает 168 источников.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Инициация трансляции у эукариот: обзор основных механизмов 2.1.1. Классическое кэп-зависимое сканирование

Биосинтез белка - сложный, энергозатратный и многостадийный процесс, который принято подразделять на несколько этапов: инициацию, элонгацию, терминацию и рециклинг рибосом. Первый этап, инициация, - скорость-лимитирующая стадия в биосинтезе белка и наиболее распространенная цель для контроля трансляции. Инициация представляет собой последовательность процессов, приводящих к сборке функциональной 80S рибосомы и расположению стартового AUG кодона мРНК в ее Р-сайте. Особенностью эукариот является способность инициировать трансляцию несколькими способами, в основе которых лежат различные механизмы, зависящие от структурных особенностей мРНК, ее происхождения, клеточных условий и др. Инициация трансляции подавляющего большинства эукариотических мРНК происходит по кэп-зависимому механизму, описание которого следует далее (Jackson, Hellen and Pestova 2010, Hinnebusch and Lorsch 2012).

Большинство эукариотических мРНК имеют несколько особенностей: они содержат на 5'-конце кэп-структуру: «инвертировнный» и метилированный ГТФ (7mG(5')ppp(5')N, где N - первый нуклеотид мРНК), и несколько десятков остатков аденозина на З'-конце. Эти и другие отличия от прокариотических мРНК обуславливают существенно более высокую стабильность, особый механизм трансляции и другие особенности жизненного цикла эукариотической мРНК.

Сборка инициаторного комплекса происходит последовательно и состоит из двух этапов: формирования 48S комплекса с установлением кодон-антикодоновых взаимодействий в Р-сайте 40S рибосомных субчастиц и присоединения 60S субчастиц к 48S комплексам. Важнейшими участниками на каждом из них выступают факторы инициации трансляции (eIFs), количество которых насчитывается более десятка у млекопитающих и несколько варьирует среди эукариот. Они способствуют правильной последовательности событий при сборке

инициаторных комплексов, обеспечивают контроль их качества, служат связующим звеном при взаимодействии мРНК с рибосомными субчастицами, а также участвуют в регуляции трансляции в нормальных условиях и при стрессе.

На большинстве эукариотических мРНК сборка 488 комплекса и идентификация стартового кодона происходит с помощью механизма «сканирования». Согласно этой модели, пре-иниациаторный комплекс 43S производит понуклеотидное сканирование 5'-нетранслируемой области (5'-НТО) в направлении от 5'-к З'-концу мРНК в поисках инициаторного кодона (рис. 1).

Scanning of the 5' UTR

Рис. 1. Схематическое представление 43S и 48S инициаторных комплексов. В

составе 43S отображены факторы eIF1, eIF1A, eIF3, eIF5 и тройной комплекс (eIF2, Мет-тРНКМеш, ГТФ). С мРНК ассоциированы факторы 4-ой группы (eIF4A; eIF4B; eIF4E; eIF4G) и PABP, формирующие структуру по типу замкнутого кольца. (Chu et al. 2016)

43S комплекс представляет собой комплекс малой субъединицы рибосомы с

факторами инициации трансляции eIF1, elFIA, eIF2, eIF3, eIF5 (схематически

представлены на рис. 1). Сборка этого комплекса происходит независимо от мРНК,

и все факторы свободно связываются с 40S рибосомой. eIF2 ассоциирован с 40S в

составе тройного комплекса с ГТФ и Мет-тРНК;Мет. Факторы eIF1 и elFIA -

небольшие белки (13 и 16 кДа), в комплексе с 40S они вызывают ее

конформационные изменения, меняющие свойства мРНК-связывающего канала.

После связывания с мРНК они участвуют в следующих этапах инициации -

участвуют в сканировании и определяют точность выбора стартового кодона.

eIF3 - крупнейший инициаторный фактор (800 кДа), насчитывающий до 13 негомологичных субъединиц (eIF3a-m) у млекопитающих (6 у дрожжей). Он служит каркасным белком для связывания с другими факторами инициации (eIF1, 4G, 5), стимулирует связывание тройного комплекса с 40S, играет ключевую роль в рекрутировании 43S комплекса на мРНК. Помимо участия непосредственно в инициации, eIF3 участвует в рециклинге рибосом - помогает рибосомным субчастицам диссоциировать после терминации (Valasek et al. 2017).

Доставку инициаторной Мет-тРНКМет на рибосому в составе тройного комплекса с ГТФ обеспечивает важнейший фактор инициации eIF2. Он состоит из трех разных субъединиц - а, в и у. у-субъединица несет основную ответственность за связывание ГТФ и Мет-тРНКМет; через в-субъединицу происходит взаимодействие с факторами eIF2B и eIF5, а РНК-связывающий домен в в, возможно, взаимодействует с мРНК. а-субъединица выполняет регуляторную функцию - она является мишенью для ряда клеточных киназ, которые фосфорилируют 51-ый аминокислотный остаток (Ser), тем самым ингибируя основную функцию белка и исключая его из процесса инициации трансляции, что в свою очередь приводит к глобальному снижению биосинтеза белка в клетке.

Связывание 43S-преинициаторного комплекса с мРНК происходит не напрямую - этому процессу предшествует «активация» мРНК - изменение структуры и состава комплексов мРНК с РНК-связывающими белками, сопровождающими мРНК на пути из ядра в цитозоль для подготовки к трансляции. Ключевая роль в процессе активации мРНК принадлежит нескольким белкам, объединенных в 4-ую группу инициаторных факторов - eIF4E, eIF4G и eIF4A -элементов комплекса 4F.

Узнавание и связывание кэпа посредством стэкингового взаимодействия с остатками триптофана обеспечивает небольшой белок eIF4E (24 кДа). В клетке он присутствует в свободной форме, в составе 4F комплекса или в комплексе с белком-репрессором 4E-BP, играющим огромную роль в регуляции кэп-зависимой трансляции. Свободный eIF4E способен напрямую связываться с кэпом, однако это взаимодействие нестабильно и легко обратимо. Связывание с eIF4G вызывает

структурные изменения eIF4E, повышающие аффинность к кэпу и стимулирующие

связывание всего eIF4F комплекса с мРНК (Batool, Aashaq and Andrabi 2019).

eIF4G - большой (175 кДа) мультифункциональный белок, обеспечивающий

связь между разными белками. eIF4G содержит домены для связывания мРНК,

eIF4E, eIF4A, PABP, eIF3 (у млекопитающих). Одновременное связывание eIF4E,

PABP, мРНК и eIF4G способствует псевдоциркуляризации мРНК - образованию

высокостабильного мРНК-белкового комплекса в форме замкнутого кольца

(«closed-loop», рис. 1), усиливающего взаимодействие всех элементов этого

комплекса друг с другом, а также способствующего быстрой реинициации

трансляции на одной матрице за счет сближения 5 - и 3Л-концов мРНК.

Комплексы 43S способны к прямому присоединению 5Л-конца мРНК с

полностью неструктурированными 5'-НТО (Pestova and Kolupaeva 2002) за счет

взаимодействия с eIF4E-eIF4G, однако природные лидеры часто обладают развитой

вторичной структурой, поэтому для связывания 43S требуется совместное действие

нескольких дополнительных факторов, которые расплетают 5Л-проксимальный

участок мРНК, чтобы подготовить его к связыванию с рибосомой. Такой функцией

обладают РНК-специфичные хеликазы, в частности, eIF4A, которая, используя

энергию АТФ, разворачивает элементы вторичной структуры 5'-концевого участка

мРНК. Этот процесс стимулируется факторами eIF4B и/или еШ4Н - вероятно, они

связывают уже расплетённые, одноцепочечные участки мРНК, предотвращая

повторное образование стабильных структур и поддерживают однонаправленное

движение eIF4A, а затем и рибосомного комплекса.

Цепочка взаимодействий кэп-eIF4E-eIF4G-eIF3-40S приводит к

рекрутированию 43S-комплекса на мРНК и образованию 488-преинициаторного

комплекса, осуществляющего следующий этап инициации - «сканирование».

Сканирование - понуклеотидное движение рибосомного комплекса в

направлении от 5 - к 3 -концу мРНК в поисках инициаторного кодона.

Сканирование состоит из трёх связанных процессов: релаксации вторичных

структур в 5'-НТО, движения рибосомы вдоль нее и «просматривания»

последовательности на предмет наличия AUG. Сканирование коротких

неструктурированных лидеров может происходить без хеликазной активности,

16

однако 43S космплекс не способен самостоятельно преодолевать структурированные участки мРНК, содержащие шпильки, псевдоузлы и другие структуры. Хеликаза eIF4A не является высокопроцессивным белком, поэтому в процессе сканирования, по-видимому, участвуют и другие родственные факторы семейства DEAD-мотив содержащих хеликаз (по названию содержащихся аминокислотных остатков), включая Dhx29 и Ddx3, способные расплетать более сложные и энергоемкие структуры, которые препятствуют движению рибосомы.

Критическим моментом в процессе сканирования, определяющем точность инициации и последующей трансляции, является выбор правильного стартового кодона. Принципы этого процесса были исследованы М.Козак в 80-х годах прошлого века (Kozak 1978, Kozak 1986, Kozak 1987). Согласно классической модели, инициациаторным является AUG-кодон мРНК, находящийся в оптимальном контексте - пурины (A или G) в положении -4 и +3 относительно первого нуклеотида триплета AUG (консенсусная последовательность Козак). У позвоночных животных оптимальный контекст имеет вид gccRcc^^GG (R-пурин), у других эукариот эта последовательность может варьировать. AUG-кодон, находящийся в слабом контексте, может пропускаться рибосомой - это явление получило название «leaky skanning», что буквально означает «проскальзывание» рибосомы. В этом случае рибосома продолжает сканирование в поисках следующего инициаторного кодона в хорошем контексте.

Помимо поддержания необходимой для сканирования конформации 40S, факторы eIF1A и eIF1 играют ключевую роль в идентификации правильного инициаторного кодона. При сканировании им отведена роль «контролёров», дискриминирующих неточные кодон-антикодоновые взаимодействия и при их случайном возникновении способствующих диссоциации рибосомных комплексов. eIF1A связывается в районе А-сайта рибосомы, блокируя доступ к нему элонгационных тРНК и обеспечивая правильную установку инициаторной тРНК в Р-сайте. eIF1 связывается в Р-сайте и способствует проскальзыванию через AUG-подобные кодоны (отличающиеся от AUG одним нуклеотидом), AUG в слабом контексте или расположенные ближе, чем ~10 нт к 5Л-концу, оставляя мРНК-

связывающий канал открытым для связывания с Мет-тРНК;Мет и препятствуя преждевременному гидролизу ГТФ в тройном комплексе.

При установлении точного кодон-антикодонового взаимодействия конформационные изменения в 43 S приводят к вытеснению eIF1 из Р-сайта и образованию «закрытого» комплекса, неспособного к дальнейшему сканированию и способствующего гидролизу ГТФ и высвобождению пирофосфата. После этого происходит освобождение 40 S рибосомы от инициаторных факторов, необходимое для объединения рибосомных субчастиц.

Гидролиз ГТФ снижает сродство eIF2 к Мет-тРНК;Мет, что приводит к диссоциации еШ2-ГДФ из 40S субъединиц. Этот процесс обеспечивается фактором eIF5, который является еШ2-специфичным GAP-белком (англ. GTPase activating protein, активатор ГТФазы). eIF5 связывает ß-субъединицу eIF2 и индуцирует ГТФ-азную активность у-субъединицы eIF2, но только в комплексах еШ2-ГТФ-Мет-тРНК{Мет, которые связаны с субъединицами 40S. eIF5 присутствует в комплексе еще с момента формирования 43 S комплекса и функцию активации гидролиза выполняет задолго до установления кодон-антикодоновой пары, однако именно это узнавание вызывает структурные изменения eIF2, высвобождающие фосфат.

Комплекс еШ2-ГДФ является неактивным, он диссоциирует из 40 S в комплексе с eIF5 и нуждается в активации, чтобы быть вовлеченным в следующий раунд инициации. Таким активатором служит белок eIF2B семейства GEF (англ. guanine nucleotide exchange factor, фактор обмена гуаниновых нуклеотидов), который стимулирует диссоциацию ГДФ из комплекса и последующее связывание ГТФ.

Объединение субъединиц 60S обеспечивается фактором eIF5B. eIF5B -крупный мономерный белок (140 кДа), ГТФаза, комплекс которого с ГТФ необходим для сборки 80S. Присоединенная 60S-субъединица стимулирует гидролиз ГТФ, необходимый для диссоциации самого eIF5B. После ухода eIF5B-ГДФ 80S комплекс готов принять соответствующую аминоацил-тРНК в А-сайт и синтезировать первую пептидную связь (Jackson et al. 2010, Hinnebusch and Lorsch 2012).

2.1.2. Неканоническая инициация: 4 типа IRES элементов

В природе существует некоторое количество активно транслируемых в клетках эукариот мРНК, структура 5'-НТО которых исключает возможность инициации трансляции по классическому механизму кэп-зависимого сканирования. В первую очередь речь идет о вирусах, которые разработали различные эволюционные стратегии, позволяющие использовать трансляционный аппарат клетки-хозяина для эффективной трансляции своих мРНК. Открытие одного из таких механизмов в конце 1980-х годов связано с изучением пикорнавирусов (вируса энцефаломиокардита, полиовируса).

5'-НТО этих РНК чрезвычайно структурированы, содержат большое количество AUG-кодонов в разных рамках считывания и нуклеотидных контекстах, что полностью исключает возможность инициации трансляции на последнем AUG такой 5'-НТО по классическому механизму. Было показано, что инициация трансляции РНК пикорнавирусов происходит по альтернативному механизму - за счет присоединения рибосомы к некоторому участку мРНК, названному IRES (англ. Internal Ribosome Entry Site, участок внутренней посадки рибосом). На сегодняшний день известно большое разнообразие IRES-элементов. Их функция заключается в привлечении и посадке рибосомы на мРНК для инициации трансляции, однако не существует единого механизма функционирования всех таких участков, нет консенсусных последовательностей или структур РНК, которые однозначно определяли бы IRES, их сложно предсказать биоинформатическими методами. Многие известные на данный момент IRES объединены в 4 группы на основе механизма функционирования (рис. 2, описание далее в тексте), хотя доля не классифицируемых тоже довольно велика. Особенностью каждой из этих групп является способность рекрутировать рибосому на мРНК в обход некоторых или даже всех факторов инициации трансляции, необходимость и важность которых для инициации клеточных мРНК обсуждалась ранее в контексте классического механизма. Таким образом, IRES дает вирусным мРНК преимущество в трансляции перед эндогенными мРНК клетки-хозяина. Более того, многие вирусы целенаправленно угнетают трансляцию

клеточных мРНК, снижая конкуренцию и обеспечивая тем самым себе исключительное право на трансляцию собственной мРНК (Martinez-Salas et al. 2017, Balvay et al. 2009).

В инициации, опосредованной IRES-элементами, могут быть задействованы не только классические факторы инициации трансляции, но и дополнительные белки, называемые ITAFs (англ., IRES Trans-Acting Factors). ITAFs стабилизируют структуру IRES, придавая необходимую для связывания с рибосомой конформацию, могут выполнять регуляторные функции в зависимости от условий, защищают от действия РНКаз (Godet et al. 2019).

EMCV IRES (encephalomyocarditis virus, вирус энцефаломиокардита)

Пикорнавирусы, к которым относится EMCV и полиовирус (PV), были одними их первых вирусов, у чьих мРНК обнаружилась особенность направлять инициацию трансляции независимо от кэпа и 5 -конца мРНК (Pelletier and Sonenberg 1988).

мРНК EMCV не кэпирована, поэтому для инициации трансляции ей не нужен кэп-связывающий фактор eIF4E. Кроме того, в зараженной клетке вирус нарабатывает особую протеазу, которая расщепляет фактор инициации eIF4G в сайте связывания с eIF4E, что приводит к блокированию кэп-зависимой инициации клеточных мРНК. Самому же EMCV IRES достаточно участия eIF4A и центральной части белка eIF4G. Согласно функциональной модели (рис. 1, тип II (EMCV)), определенный район IRES EMCV (JK-домен) взаимодействует с факторами eIF4G и eIF4A, которые, в свою очередь, обеспечивают связывание с 43S преинициаторным комплексом - эту же функцию они выполняют и при кэп-зависимой инициации. Далее при помощи eIF1 инициаторный комплекс устанавливается на «правильном» стартовом кодоне, и происходит сборка 80S рибосомы.

Тип III (HCV) Тип IV (CrPV)

Рис. 2. 4 типа IRES-элементов: схематическое изображение структур и ассоциированных инициаторных факторов. Yn-Ym-олигопиримидиновый тракт, PK-псевдоузел. (Svitkin 2015)

Типы I и II IRES-элементов, представленные у пикорнавирусов PV и EMCV, соответственно, функционально очень похожи, их главное отличие заключается в том, что рекрутирование рибосомы на мРНК PV происходит за несколько десятков нуклеотидов перед стартовым AUG-кодоном и требуется стадия сканирования лидерной области, чтобы его достичь (рис. 2, тип I (PV)). В случае мРНК EMCV стадия сканирования почти не требуется - рибосома взаимодействует с IRES, расположенным непосредственно перед стартовым кодоном (рис. 2, тип II (EMCV).

HCV IRES (human hepatitus virus С, вирус гепатита Ц человека)

Механизм внутренней инициации трансляции, обеспечиваемый HCV- и HCV-подобными IRES-элементами III типа вирусов семейства Flaviviridae и

некоторых представителей Picornaviridae, выглядит весьма необычным. Наиболее изученным представителем этой группы является HCV IRES (Niepmann 2013, Khawaja, Vopalensky and Pospisek 2015). 5-НТО мРНК HCV состоит из нескольких структурных и функциональных доменов: I и II вовлечены в репликацию генома вируса, II-IV домены образуют IRES и участвуют в рекрутировании рибосомы на стартовый кодон РНК (рис. 2, тип III (HCV)). HCV IRES формирует компактную пространственную структуру, в которой РНК-петли, а также образуемый одним из доменов псевдоузел способствуют взаимодействию с 40S-субъединицей и узнаванию AUG-кодона. Особенность этого IRES состоит в том, что он способен связываться с 40S рибосомой в отсутствие целого ряда факторов (eIF1, eIF1A, eIF4A, eIF4B, eIF4F), а в некоторых случаях не требует и тройного комплекса. В системе сборки из очищенных компонентов было показано, что добавленные 40S субчастицы напрямую связывают HCV IRES с установлением стартового кодона прямо в Р-сайт, полностью исключая этап сканирования. Последующее добавление тройного комплекса приводило к образованию 48S инициаторного комплекса, в составе которого стартовый AUG-кодон взаимодействовал с антикодоном инициаторной тРНК (Pestova et al. 1998). Однако инициаторный комплекс на HCV IRES может собираться альтернативным путем - с помощью фактора eIF5B, независимо от eIF2 (Terenin et al. 2008). Кроме того, описано большое количество ITAFs, взаимодействующих с HCV IRES и способствующих инициации на нем: PTB, PCBP2, SSB (La), NSAP1, AUF1 и другие РНК-связывающие белки с разнообразными функциями (Niepmann 2013).

CrPV IRES (cricket paralysis virus, вирус паралича сверчка)

CrPV и другие родственные вирусы насекомых из семейства Discistroviridae (BQCV, вирус черной королевы) используют еще более неординарный механизм инициации трансляции (Pfingsten and Kieft 2008). РНК вирусов этого семейства бицистронна - содержит две рамки считывания, первая из которых кодирует неструктурный белок, а вторая, отделенная небольшим участком РНК, кодирует белок оболочки вируса. Трансляция обеих рамок считывания происходит по

механизму внутренней инициации, однако инициация второй рамки обеспечивается уникальным IRES-элементом, расположенным в межгенной области, на котором мы остановимся чуть подробнее. Сборка функциональной 80S рибосомы на этом IRES происходит в отсутствие вообще каких-либо факторов инициации трансляции и даже в отсутствие инициаторной Мет-тРНК;Мет, Стартовым кодоном соответствующего гена служит не AUG и даже не «вырожденные» варианты стартового кодона - CUG и GUG. Инициация трансляции, направляемая IRES вирусов, родственных CrPV, происходит на CUU, САА, GCA или GCU-кодонах (в разных вирусах), при этом синтез полипептида начинается не с метионина. (Wilson et al. 2000, Pestova, Lomakin and Hellen 2004)

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Лашкевич Ксения Александровна, 2020 год

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Adelman, M. R., D. D. Sabatini & G. Blobel (1973) Ribosome-membrane interaction. Nondestructive disassembly of rat liver rough microsomes into ribosomal and membranous components. J Cell Biol, 56, 206-29.

2. Akulich, K. A., D. E. Andreev, I. M. Terenin, V. V. Smirnova, A. S. Anisimova, D. S. Makeeva, V. I. Arkhipova, E. A. Stolboushkina, M. B. Garber, M. M. Prokofjeva, P. V. Spirin, V. S. Prassolov, I. N. Shatsky & S. E. Dmitriev (2016) Four translation initiation pathways employed by the leaderless mRNA in eukaryotes. Sci Rep, 6, 37905.

3. Andreev, D. E., I. M. Terenin, S. E. Dmitriev & I. N. Shatsky (2016) Pros and cons of pDNA and mRNA transfection to study mRNA translation in mammalian cells. Gene, 578, 1-6.

4. Andreev, D. E., I. M. Terenin, Y. E. Dunaevsky, S. E. Dmitriev & I. N. Shatsky (2006) A leaderless mRNA can bind to mammalian 80S ribosomes and direct polypeptide synthesis in the absence of translation initiation factors. Mol Cell Biol, 26, 3164-9.

5. Ast, T. & M. Schuldiner (2013) All roads lead to Rome (but some may be harder to travel): SRP-independent translocation into the endoplasmic reticulum. Crit Rev Biochem Mol Biol, 48, 273-88.

6. Aulas, A., M. M. Fay, S. M. Lyons, C. A. Achorn, N. Kedersha, P. Anderson & P. Ivanov (2017) Stress-specific differences in assembly and composition of stress granules and related foci. J Cell Sci, 130, 927-937.

7. Backes, S., S. Hess, F. Boos, M. W. Woellhaf, S. Godel, M. Jung, T. Muhlhaus & J. M. Herrmann (2018) Tom70 enhances mitochondrial preprotein import efficiency by binding to internal targeting sequences. J Cell Biol, 217, 1369-1382.

8. Bahar Halpern, K., I. Caspi, D. Lemze, M. Levy, S. Landen, E. Elinav, I. Ulitsky & S. Itzkovitz (2015) Nuclear Retention of mRNA in Mammalian Tissues. Cell Rep, 13, 2653-62.

9. Balakin, A. G., E. A. Skripkin, I. N. Shatsky & A. A. Bogdanov (1992) Unusual ribosome binding properties of mRNA encoding bacteriophage lambda repressor. Nucleic Acids Res, 20, 563-71.

10. Balvay, L., R. Soto Rifo, E. P. Ricci, D. Decimo & T. Ohlmann (2009) Structural and functional diversity of viral IRESes. Biochim Biophys Acta, 1789, 542-57.

11. Batool, A., S. Aashaq & K. I. Andrabi (2019) Eukaryotic initiation factor 4E (eIF4E): A recap of the cap-binding protein. J Cell Biochem, 120, 14201-14212.

12. Benelli, D. & P. Londei (2011) Translation initiation in Archaea: conserved and domain-specific features. Biochem Soc Trans, 39, 89-93.

13. Blobel, G., P. Walter, C. N. Chang, B. M. Goldman, A. H. Erickson & V. R. Lingappa (1979) Translocation of proteins across membranes: the signal hypothesis and beyond. Symp Soc Exp Biol, 33, 9-36.

14. Borgese, D., G. Blobel & D. D. Sabatini (1973) In vitro exchange of ribosomal subunits between free and membrane-bound ribosomes. J Mol Biol, 74, 415-38.

15. Bruchhaus, I., M. Leippe, C. Lioutas & E. Tannich (1993) Unusual gene organization in the protozoan parasite Entamoeba histolytica. DNA Cell Biol, 12, 925-33.

16. Buxbaum, A. R., G. Haimovich & R. H. Singer (2015) In the right place at the right time: visualizing and understanding mRNA localization. Nat Rev Mol Cell Biol, 16, 95-109.

17. Carrie, C. & I. Small (2013) A reevaluation of dual-targeting of proteins to mitochondria and chloroplasts. Biochim Biophys Acta, 1833, 253-9.

18. Chan, L. Y., C. F. Mugler, S. Heinrich, P. Vallotton & K. Weis (2018) Noninvasive measurement of mRNA decay reveals translation initiation as the major determinant of mRNA stability. Elife, 7.

19. Chin, A. & E. Lecuyer (2017) RNA localization: Making its way to the center stage. Biochim Biophys Acta Gen Subj, 1861, 2956-2970.

20. Chu, J., M. Cargnello, I. Topisirovic & J. Pelletier (2016) Translation Initiation Factors: Reprogramming Protein Synthesis in Cancer. Trends Cell Biol, 26, 918933.

21. Coelho, D. S. & P. M. Domingos (2014) Physiological roles of regulated Ire1 dependent decay. Front Genet, 5, 76.

22. Corral-Debrinski, M., C. Blugeon & C. Jacq (2000) In yeast, the 3' untranslated region or the presequence of ATM1 is required for the exclusive localization of its mRNA to the vicinity of mitochondria. Mol Cell Biol, 20, 7881-92.

23. Craig, F. F., A. C. Simmonds, D. Watmore, F. McCapra & M. R. White (1991) Membrane-permeable luciferin esters for assay of firefly luciferase in live intact cells. Biochem J, 276 ( Pt 3), 637-41.

24. Cui, X. A., H. Zhang & A. F. Palazzo (2012) p180 promotes the ribosome-independent localization of a subset of mRNA to the endoplasmic reticulum. PLoS Biol, 10, e1001336.

25. del Alamo, M., D. J. Hogan, S. Pechmann, V. Albanese, P. O. Brown & J. Frydman (2011) Defining the specificity of cotranslationally acting chaperones by systematic analysis of mRNAs associated with ribosome-nascent chain complexes. PLoS Biol, 9, e1001100.

26. Denis, M. M., N. D. Tolley, M. Bunting, H. Schwertz, H. Jiang, S. Lindemann, C. C. Yost, F. J. Rubner, K. H. Albertine, K. J. Swoboda, C. M. Fratto, E. Tolley, L. W. Kraiss, T. M. McIntyre, G. A. Zimmerman & A. S. Weyrich (2005) Escaping the nuclear confines: signal-dependent pre-mRNA splicing in anucleate platelets. Cell, 122, 379-91.

27. Deniz, N., E. M. Lenarcic, D. M. Landry & S. R. Thompson (2009) Translation initiation factors are not required for Dicistroviridae IRES function in vivo. RNA, 15, 932-46.

28. Didiot, M. C., S. Serafini, M. J. Pfeifer, F. J. King & C. N. Parker (2011) Multiplexed reporter gene assays: monitoring the cell viability and the compound kinetics on luciferase activity. JBiomol Screen, 16, 786-93.

29. Diehn, M., M. B. Eisen, D. Botstein & P. O. Brown (2000) Large-scale identification of secreted and membrane-associated gene products using DNA microarrays. Nat Genet, 25, 58-62.

30. Dmitriev, S. E., D. E. Andreev, Z. V. Ad'ianova, I. M. Terenin & I. N. Shatskii (2009) [Efficient cap-dependent in vitro and in vivo translation of mammalian mRNAs with long and highly structured 5'-untranslated regions]. Mol Biol (Mosk), 43,119-25.

31. Dmitriev, S. E., A. V. Pisarev, M. P. Rubtsova, Y. E. Dunaevsky & I. N. Shatsky (2003) Conversion of 48S translation preinitiation complexes into 80S initiation complexes as revealed by toeprinting. FEBS Lett, 533, 99-104.

32. Dmitriev, S. E., I. M. Terenin, D. E. Andreev, P. A. Ivanov, J. E. Dunaevsky, W. C. Merrick & I. N. Shatsky (2010) GTP-independent tRNA delivery to the ribosomal P-site by a novel eukaryotic translation factor. J Biol Chem, 285, 26779-87.

33. Elfakess, R. & R. Dikstein (2008) A translation initiation element specific to mRNAs with very short 5'UTR that also regulates transcription. PLoS One, 3, e3094.

34. Eliyahu, E., L. Pnueli, D. Melamed, T. Scherrer, A. P. Gerber, O. Pines, D. Rapaport & Y. Arava (2010) Tom20 mediates localization of mRNAs to mitochondria in a translation-dependent manner. Mol Cell Biol, 30, 284-94.

35. Fazal, F. M., S. Han, K. R. Parker, P. Kaewsapsak, J. Xu, A. N. Boettiger, H. Y. Chang & A. Y. Ting (2019) Atlas of Subcellular RNA Localization Revealed by APEX-Seq. Cell, 178, 473-490 e26.

36. Fernandez, I. S., X. C. Bai, G. Murshudov, S. H. Scheres & V. Ramakrishnan (2014) Initiation of translation by cricket paralysis virus IRES requires its translocation in the ribosome. Cell, 157, 823-31.

37. Fernandez, J., I. Yaman, P. Sarnow, M. D. Snider & M. Hatzoglou (2002) Regulation of internal ribosomal entry site-mediated translation by phosphorylation of the translation initiation factor eIF2alpha. J Biol Chem, 277, 19198-205.

38. Flora, S. J. (2011) Arsenic-induced oxidative stress and its reversibility. Free Radic Biol Med, 51, 257-81.

39. Frischmeyer, P. A., A. van Hoof, K. O'Donnell, A. L. Guerrerio, R. Parker & H. C. Dietz (2002) An mRNA surveillance mechanism that eliminates transcripts lacking termination codons. Science, 295, 2258-61.

40. Fujiki, M. & K. Verner (1993) Coupling of cytosolic protein synthesis and mitochondrial protein import in yeast. Evidence for cotranslational import in vivo. J Biol Chem, 268, 1914-20.

41. Gadir, N., L. Haim-Vilmovsky, J. Kraut-Cohen & J. E. Gerst (2011) Localization of mRNAs coding for mitochondrial proteins in the yeast Saccharomyces cerevisiae. RNA, 17, 1551-65.

42. Gamerdinger, M., K. Kobayashi, A. Wallisch, S. G. Kreft, C. Sailer, R. Schlomer, N. Sachs, A. Jomaa, F. Stengel, N. Ban & E. Deuerling (2019) Early Scanning of Nascent Polypeptides inside the Ribosomal Tunnel by NAC. Mol Cell, 75, 9961006 e8.

43. Gandin, V., L. Masvidal, L. Hulea, S. P. Gravel, M. Cargnello, S. McLaughlan, Y. Cai, P. Balanathan, M. Morita, A. Rajakumar, L. Furic, M. Pollak, J. A. Porco, Jr., J. St-Pierre, J. Pelletier, O. Larsson & I. Topisirovic (2016) nanoCAGE reveals 5' UTR features that define specific modes of translation of functionally related MTOR-sensitive mRNAs. Genome Res, 26, 636-48.

44. Gilmore, R., G. Blobel & P. Walter (1982) Protein translocation across the endoplasmic reticulum. I. Detection in the microsomal membrane of a receptor for the signal recognition particle. J Cell Biol, 95, 463-9.

45. Gingras, A. C., S. P. Gygi, B. Raught, R. D. Polakiewicz, R. T. Abraham, M. F. Hoekstra, R. Aebersold & N. Sonenberg (1999) Regulation of 4E-BP1 phosphorylation: a novel two-step mechanism. Genes Dev, 13, 1422-37.

46. Glanzer, J., K. Y. Miyashiro, J. Y. Sul, L. Barrett, B. Belt, P. Haydon & J. Eberwine (2005) RNA splicing capability of live neuronal dendrites. Proc Natl Acad Sci U SA, 102, 16859-64.

47. Godet, A. C., F. David, F. Hantelys, F. Tatin, E. Lacazette, B. Garmy-Susini & A. C. Prats (2019) IRES Trans-Acting Factors, Key Actors of the Stress Response. Int J Mol Sci, 20.

48. Golani-Armon, A. & Y. Arava (2016) Localization of Nuclear-Encoded mRNAs to Mitochondria Outer Surface. Biochemistry (Mosc), 81, 1038-1043.

49. Gold, V. A., P. Chroscicki, P. Bragoszewski & A. Chacinska (2017) Visualization of cytosolic ribosomes on the surface of mitochondria by electron cryo-tomography. EMBO Rep, 18, 1786-1800.

50. Guan, B. J., D. Krokowski, M. Majumder, C. L. Schmotzer, S. R. Kimball, W. C. Merrick, A. E. Koromilas & M. Hatzoglou (2014) Translational control during endoplasmic reticulum stress beyond phosphorylation of the translation initiation factor eIF2alpha. J Biol Chem, 289, 12593-611.

51. Hansen, K. G., N. Aviram, J. Laborenz, C. Bibi, M. Meyer, A. Spang, M. Schuldiner & J. M. Herrmann (2018) An ER surface retrieval pathway safeguards the import of mitochondrial membrane proteins in yeast. Science, 361, 1118-1122.

52. Hansen, K. G. & J. M. Herrmann (2019) Transport of Proteins into Mitochondria. Protein J, 38, 330-342.

53. Hertz, M. I. & S. R. Thompson (2011) In vivo functional analysis of the Dicistroviridae intergenic region internal ribosome entry sites. Nucleic Acids Res, 39, 7276-88.

54. Higgins, R., J. M. Gendron, L. Rising, R. Mak, K. Webb, S. E. Kaiser, N. Zuzow, P. Riviere, B. Yang, E. Fenech, X. Tang, S. A. Lindsay, J. C. Christianson, R. Y. Hampton, S. A. Wasserman & E. J. Bennett (2015) The Unfolded Protein Response Triggers Site-Specific Regulatory Ubiquitylation of 40S Ribosomal Proteins. Mol Cell, 59, 35-49.

55. Hinnebusch, A. G. (2005) Translational regulation of GCN4 and the general amino acid control of yeast. Annu Rev Microbiol, 59, 407-50.

56. Hinnebusch, A. G., I. P. Ivanov & N. Sonenberg (2016) Translational control by 5'-untranslated regions of eukaryotic mRNAs. Science, 352, 1413-6.

57. Hinnebusch, A. G. & J. R. Lorsch (2012) The mechanism of eukaryotic translation initiation: new insights and challenges. Cold Spring Harb Perspect Biol, 4.

58. Hoffman, A. M., Q. Chen, T. Zheng & C. V. Nicchitta (2019) Heterogeneous translational landscape of the endoplasmic reticulum revealed by ribosome proximity labeling and transcriptome analysis. J Biol Chem, 294, 8942-8958.

59. Hollien, J., J. H. Lin, H. Li, N. Stevens, P. Walter & J. S. Weissman (2009) Regulated Ire1-dependent decay of messenger RNAs in mammalian cells. J Cell Biol, 186, 323-31.

60. Hua, H., Q. Kong, H. Zhang, J. Wang, T. Luo & Y. Jiang (2019) Targeting mTOR for cancer therapy. J Hematol Oncol, 12, 71.

61. Iaconis, D., M. Monti, M. Renda, A. van Koppen, R. Tammaro, M. Chiaravalli, F. Cozzolino, P. Pignata, C. Crina, P. Pucci, A. Boletta, V. Belcastro, R. H. Giles, E. M. Surace, S. Gallo, M. Pende & B. Franco (2017) The centrosomal OFD1 protein interacts with the translation machinery and regulates the synthesis of specific targets. Sci Rep, 7, 1224.

62. Ishigaki, Y., X. Li, G. Serin & L. E. Maquat (2001) Evidence for a pioneer round of mRNA translation: mRNAs subject to nonsense-mediated decay in mammalian cells are bound by CBP80 and CBP20. Cell, 106, 607-17.

63. Jackson, R. J., C. U. Hellen & T. V. Pestova (2010) The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol, 11, 113-27.

64. Jagannathan, S., J. C. Hsu, D. W. Reid, Q. Chen, W. J. Thompson, A. M. Moseley & C. V. Nicchitta (2014a) Multifunctional roles for the protein translocation machinery in RNA anchoring to the endoplasmic reticulum. J Biol Chem, 289, 25907-24.

65. Jagannathan, S., D. W. Reid, A. H. Cox & C. V. Nicchitta (2014b) De novo translation initiation on membrane-bound ribosomes as a mechanism for localization of cytosolic protein mRNAs to the endoplasmic reticulum. RNA, 20, 1489-98.

66. Jan, C. H., C. C. Williams & J. S. Weissman (2014) Principles of ER cotranslational translocation revealed by proximity-specific ribosome profiling. Science, 346, 1257521.

67. --- (2015) LOCAL TRANSLATION. Response to Comment on "Principles of ER cotranslational translocation revealed by proximity-specific ribosome profiling". Science, 348, 1217.

68. Jiang, H. Y., L. Jiang & R. C. Wek (2007) The eukaryotic initiation factor-2 kinase pathway facilitates differential GADD45a expression in response to environmental stress. J Biol Chem, 282, 3755-65.

69. Johnson, N., K. Powis & S. High (2013) Post-translational translocation into the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta, 1833, 2403-9.

70. Jousse, C., S. Oyadomari, I. Novoa, P. Lu, Y. Zhang, H. P. Harding & D. Ron (2003) Inhibition of a constitutive translation initiation factor 2alpha phosphatase, CReP, promotes survival of stressed cells. J Cell Biol, 163, 767-75.

71. Kaewsapsak, P., D. M. Shechner, W. Mallard, J. L. Rinn & A. Y. Ting (2017) Live-cell mapping of organelle-associated RNAs via proximity biotinylation combined with protein-RNA crosslinking. Elife, 6.

72. Kalies, K. U., D. Gorlich & T. A. Rapoport (1994) Binding of ribosomes to the rough endoplasmic reticulum mediated by the Sec61p-complex. J Cell Biol, 126, 925-34.

73. Karamyshev, A. L., A. E. Patrick, Z. N. Karamysheva, D. S. Griesemer, H. Hudson, S. Tjon-Kon-Sang, I. Nilsson, H. Otto, Q. Liu, S. Rospert, G. von Heijne, A. E. Johnson & P. J. Thomas (2014) Inefficient SRP interaction with a nascent chain triggers a mRNA quality control pathway. Cell, 156, 146-57.

74. Kaskova, Z. M., A. S. Tsarkova & I. V. Yampolsky (2016) 1001 lights: luciferins, luciferases, their mechanisms of action and applications in chemical analysis, biology and medicine. Chem Soc Rev, 45, 6048-6077.

75. Kedersha, N. L., M. Gupta, W. Li, I. Miller & P. Anderson (1999) RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules. J Cell Biol, 147, 1431-42.

76. Kellems, R. E. & R. A. Butow (1972) Cytoplasmic-type 80 S ribosomes associated with yeast mitochondria. I. Evidence for ribosome binding sites on yeast mitochondria. J Biol Chem, 247, 8043-50.

77. Kenney, J. W., C. E. Moore, X. Wang & C. G. Proud (2014) Eukaryotic elongation factor 2 kinase, an unusual enzyme with multiple roles. Adv Biol Regul, 55, 15-27.

78. Khawaja, A., V. Vopalensky & M. Pospisek (2015) Understanding the potential of hepatitis C virus internal ribosome entry site domains to modulate translation initiation via their structure and function. Wiley Interdiscip Rev RNA, 6, 211-24.

79. Kloc, M., N. R. Zearfoss & L. D. Etkin (2002) Mechanisms of subcellular mRNA localization. Cell, 108, 533-44.

80. Komili, S., N. G. Farny, F. P. Roth & P. A. Silver (2007) Functional specificity among ribosomal proteins regulates gene expression. Cell, 131, 557-71.

81. Kozak, M. (1978) How do eucaryotic ribosomes select initiation regions in messenger RNA? Cell, 15, 1109-23.

82. — (1986) Point mutations define a sequence flanking the AUG initiator codon that modulates translation by eukaryotic ribosomes. Cell, 44, 283-92.

83. — (1987) At least six nucleotides preceding the AUG initiator codon enhance translation in mammalian cells. J Mol Biol, 196, 947-50.

84. Kraut-Cohen, J. & J. E. Gerst (2010) Addressing mRNAs to the ER: cis sequences act up! Trends Biochem Sci, 35, 459-69.

85. Krishnamoorthy, T., G. D. Pavitt, F. Zhang, T. E. Dever & A. G. Hinnebusch (2001) Tight binding of the phosphorylated alpha subunit of initiation factor 2 (eIF2alpha) to the regulatory subunits of guanine nucleotide exchange factor eIF2B is required for inhibition of translation initiation. Mol Cell Biol, 21, 501830.

86. Kwan, T. & S. R. Thompson (2019) Noncanonical Translation Initiation in Eukaryotes. Cold Spring Harb Perspect Biol, 11.

87. Lapointe, C. P., J. A. Stefely, A. Jochem, P. D. Hutchins, G. M. Wilson, N. W. Kwiecien, J. J. Coon, M. Wickens & D. J. Pagliarini (2018) Multi-omics Reveal Specific Targets of the RNA-Binding Protein Puf3p and Its Orchestration of Mitochondrial Biogenesis. Cell Syst, 6, 125-135 e6.

88. Lerner, R. S. & C. V. Nicchitta (2006) mRNA translation is compartmentalized to the endoplasmic reticulum following physiological inhibition of cap-dependent translation. RNA, 12, 775-89.

89. Lerner, R. S., R. M. Seiser, T. Zheng, P. J. Lager, M. C. Reedy, J. D. Keene & C. V. Nicchitta (2003) Partitioning and translation of mRNAs encoding soluble proteins on membrane-bound ribosomes. RNA, 9, 1123-37.

90. Lesnik, C., A. Golani-Armon & Y. Arava (2015) Localized translation near the mitochondrial outer membrane: An update. RNA Biol, 12, 801-9.

91. Liao, G., X. Ma & G. Liu (2011) An RNA-zipcode-independent mechanism that localizes Dia1 mRNA to the perinuclear ER through interactions between Dia1 nascent peptide and Rho-GTP. J Cell Sci, 124, 589-99.

92. Liu, L., X. H. Liang, S. Uliel, R. Unger, E. Ullu & S. Michaeli (2002) RNA interference of signal peptide-binding protein SRP54 elicits deleterious effects and protein sorting defects in trypanosomes. J Biol Chem, 277, 47348-57.

93. Lui, J., L. M. Castelli, M. Pizzinga, C. E. Simpson, N. P. Hoyle, K. L. Bailey, S. G. Campbell & M. P. Ashe (2014) Granules harboring translationally active mRNAs provide a platform for P-body formation following stress. Cell Rep, 9, 944-54.

94. MacKenzie, J. A. & R. M. Payne (2004) Ribosomes specifically bind to mammalian mitochondria via protease-sensitive proteins on the outer membrane. J Biol Chem, 279, 9803-10.

95. Maicas, E., M. Shago & J. D. Friesen (1990) Translation of the Saccharomyces cerevisiae tcml gene in the absence of a 5'-untranslated leader. Nucleic Acids Res, 18, 5823-8.

96. Maquat, L. E., W. Y. Tarn & O. Isken (2010) The pioneer round of translation: features and functions. Cell, 142, 368-74.

97. Martinez-Salas, E., R. Francisco-Velilla, J. Fernandez-Chamorro & A. M. Embarek (2017) Insights into Structural and Mechanistic Features of Viral IRES Elements. Front Microbiol, 8, 2629.

98. Matsumoto, S., T. Uchiumi, T. Saito, M. Yagi, S. Takazaki, T. Kanki & D. Kang (2012) Localization of mRNAs encoding human mitochondrial oxidative phosphorylation proteins. Mitochondrion, 12, 391-8.

99. McLeod, T., A. Abdullahi, M. Li & S. Brogna (2014) Recent studies implicate the nucleolus as the major site of nuclear translation. Biochem Soc Trans, 42, 1224-8.

100. Mezzanotte, L., M. van 't Root, H. Karatas, E. A. Goun & C. Lowik (2017) In Vivo Molecular Bioluminescence Imaging: New Tools and Applications. Trends Biotechnol, 35, 640-652.

101. Mortimer, I., P. Tam, I. MacLachlan, R. W. Graham, E. G. Saravolac & P. B. Joshi (1999) Cationic lipid-mediated transfection of cells in culture requires mitotic activity. Gene Ther, 6, 403-11.

102. Mukhopadhyay, A., L. Ni & H. Weiner (2004) A co-translational model to explain the in vivo import of proteins into HeLa cell mitochondria. Biochem J, 382, 385-92.

103. Mutka, S. C. & P. Walter (2001) Multifaceted physiological response allows yeast to adapt to the loss of the signal recognition particle-dependent protein-targeting pathway. Mol Biol Cell, 12, 577-88.

104. Nicchitta, C. V., R. S. Lerner, S. B. Stephens, R. D. Dodd & B. Pyhtila (2005) Pathways for compartmentalizing protein synthesis in eukaryotic cells: the template-partitioning model. Biochem Cell Biol, 83, 687-95.

105. Niepmann, M. (2013) Hepatitis C virus RNA translation. Curr Top Microbiol Immunol, 369, 143-66.

106. Nyathi, Y., B. M. Wilkinson & M. R. Pool (2013) Co-translational targeting and translocation of proteins to the endoplasmic reticulum. Biochim Biophys Acta, 1833, 2392-402.

107. Oikawa, D., M. Tokuda, A. Hosoda & T. Iwawaki (2010) Identification of a consensus element recognized and cleaved by IRE1 alpha. Nucleic Acids Res, 38, 6265-73.

108. Pakos-Zebrucka, K., I. Koryga, K. Mnich, M. Ljujic, A. Samali & A. M. Gorman (2016) The integrated stress response. EMBO Rep, 17, 1374-1395.

109. Palade, G. E. (1955) A small particulate component of the cytoplasm. J Biophys Biochem Cytol, 1, 59-68.

110. Patel, J., L. E. McLeod, R. G. Vries, A. Flynn, X. Wang & C. G. Proud (2002) Cellular stresses profoundly inhibit protein synthesis and modulate the states of phosphorylation of multiple translation factors. Eur J Biochem, 269, 3076-85.

111. Peer, E., S. Moshitch-Moshkovitz, G. Rechavi & D. Dominissini (2019) The Epitranscriptome in Translation Regulation. Cold Spring Harb Perspect Biol, 11.

112. Pelletier, J. & N. Sonenberg (1988) Internal initiation of translation of eukaryotic mRNA directed by a sequence derived from poliovirus RNA. Nature, 334, 320-5.

113. Pestova, T. V. & V. G. Kolupaeva (2002) The roles of individual eukaryotic translation initiation factors in ribosomal scanning and initiation codon selection. Genes Dev, 16, 2906-22.

114. Pestova, T. V., I. B. Lomakin & C. U. Hellen (2004) Position of the CrPV IRES on the 40S subunit and factor dependence of IRES/80S ribosome assembly. EMBO Reep, 5, 906-13.

115. Pestova, T. V., I. N. Shatsky, S. P. Fletcher, R. J. Jackson & C. U. Hellen (1998) A prokaryotic-like mode of cytoplasmic eukaryotic ribosome binding to the initiation codon during internal translation initiation of hepatitis C and classical swine fever virus RNAs. Genes Dev, 12, 67-83.

116. Pfeffer, S., J. Dudek, R. Zimmermann & F. Forster (2016) Organization of the native ribosome-translocon complex at the mammalian endoplasmic reticulum membrane. Biochim Biophys Acta, 1860, 2122-9.

117. Pfingsten, J. S. & J. S. Kieft (2008) RNA structure-based ribosome recruitment: lessons from the Dicistroviridae intergenic region IRESes. RNA, 14, 1255-63.

118. Polikanov, Y. S., I. A. Osterman, T. Szal, V. N. Tashlitsky, M. V. Serebryakova, P. Kusochek, D. Bulkley, I. A. Malanicheva, T. A. Efimenko, O. V. Efremenkova, A. L. Konevega, K. J. Shaw, A. A. Bogdanov, M. V. Rodnina, O. A. Dontsova, A. S. Mankin, T. A. Steitz & P. V. Sergiev (2014) Amicoumacin a inhibits translation by stabilizing mRNA interaction with the ribosome. Mol Cell, 56, 531-40.

119. Ponce-Rojas, J. C., M. C. Avendano-Monsalve, A. R. Yanez-Falcon, F. Jaimes-Miranda, E. Garay, F. Torres-Quiroz, A. DeLuna & S. Funes (2017) alphabeta'-NAC cooperates with Sam37 to mediate early stages of mitochondrial protein import. FEBS J, 284, 814-830.

120. Potter, M. D. & C. V. Nicchitta (2000) Regulation of ribosome detachment from the mammalian endoplasmic reticulum membrane. J Biol Chem, 275, 3382835.

121. Prokhorova, I. V., K. A. Akulich, D. S. Makeeva, I. A. Osterman, D. A. Skvortsov, P. V. Sergiev, O. A. Dontsova, G. Yusupova, M. M. Yusupov & S. E.

Dmitriev (2016) Amicoumacin A induces cancer cell death by targeting the eukaryotic ribosome. Sci Rep, 6, 27720.

122. Pyhtila, B., T. Zheng, P. J. Lager, J. D. Keene, M. C. Reedy & C. V. Nicchitta (2008) Signal sequence- and translation-independent mRNA localization to the endoplasmic reticulum. RNA, 14, 445-53.

123. Quenault, T., T. Lithgow & A. Traven (2011) PUF proteins: repression, activation and mRNA localization. Trends Cell Biol, 21, 104-12.

124. Ran, F. A., P. D. Hsu, J. Wright, V. Agarwala, D. A. Scott & F. Zhang (2013) Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc, 8, 22812308.

125. Reid, D. W., Q. Chen, A. S. Tay, S. Shenolikar & C. V. Nicchitta (2014) The unfolded protein response triggers selective mRNA release from the endoplasmic reticulum. Cell, 158, 1362-1374.

126. Reid, D. W. & C. V. Nicchitta (2012) Primary role for endoplasmic reticulum-bound ribosomes in cellular translation identified by ribosome profiling. J Biol Chem, 287, 5518-27.

127. — (2015a) Diversity and selectivity in mRNA translation on the endoplasmic reticulum. Nat Rev Mol Cell Biol, 16, 221-31.

128. --- (2015b) LOCAL TRANSLATION. Comment on "Principles of ER cotranslational translocation revealed by proximity-specific ribosome profiling". Science, 348, 1217.

129. Ryoo, H. D. & D. Vasudevan (2017) Two distinct nodes of translational inhibition in the Integrated Stress Response. BMB Rep, 50, 539-545.

130. Ryu, I. & Y. K. Kim (2017) Translation initiation mediated by nuclear cap-binding protein complex. BMB Rep, 50, 186-193.

131. Sanchez, M., Y. Lin, C. C. Yang, P. McQuary, A. Rosa Campos, P. Aza Blanc & D. A. Wolf (2019) Cross Talk between eIF2alpha and eEF2 Phosphorylation Pathways Optimizes Translational Arrest in Response to Oxidative Stress. iScience, 20, 466-480.

132. Savitz, A. J. & D. I. Meyer (1990) Identification of a ribosome receptor in the rough endoplasmic reticulum. Nature, 346, 540-4.

133. Schieber, M. & N. S. Chandel (2014) ROS function in redox signaling and oxidative stress. Curr Biol, 24, R453-62.

134. Schleiff, E. & T. Becker (2011) Common ground for protein translocation: access control for mitochondria and chloroplasts. Nat Rev Mol Cell Biol, 12, 4859.

135. Shao, S. & R. S. Hegde (2011) A calmodulin-dependent translocation pathway for small secretory proteins. Cell, 147, 1576-88.

136. Shatsky, I. N., I. M. Terenin, V. V. Smirnova & D. E. Andreev (2018) Cap-Independent Translation: What's in a Name? Trends Biochem Sci, 43, 882-895.

137. Shimizu, S. (2019) Organelle zones in mitochondria. J Biochem, 165, 101107.

138. Simsek, D., G. C. Tiu, R. A. Flynn, G. W. Byeon, K. Leppek, A. F. Xu, H. Y. Chang & M. Barna (2017) The Mammalian Ribo-interactome Reveals Ribosome Functional Diversity and Heterogeneity. Cell, 169, 1051-1065 e18.

139. Sinvani, H., O. Haimov, Y. Svitkin, N. Sonenberg, A. Tamarkin-Ben-Harush, B. Viollet & R. Dikstein (2015) Translational tolerance of mitochondrial genes to metabolic energy stress involves TISU and eIF1-eIF4GI cooperation in start codon selection. Cell Metab, 21, 479-92.

140. Sivan, G., N. Kedersha & O. Elroy-Stein (2007) Ribosomal slowdown mediates translational arrest during cellular division. Mol Cell Biol, 27, 6639-46.

141. Sonenberg, N. & A. G. Hinnebusch (2009) Regulation of translation initiation in eukaryotes: mechanisms and biological targets. Cell, 136, 731-45.

142. Staudacher, J. J., I. S. Naarmann-de Vries, S. J. Ujvari, B. Klinger, M. Kasim, E. Benko, A. Ostareck-Lederer, D. H. Ostareck, A. Bondke Persson, S. Lorenzen, J. C. Meier, N. Bluthgen, P. B. Persson, A. Henrion-Caude, R. Mrowka & M. Fahling (2015) Hypoxia-induced gene expression results from selective mRNA partitioning to the endoplasmic reticulum. Nucleic Acids Res, 43, 3219-36.

143. Stephens, S. B., R. D. Dodd, J. W. Brewer, P. J. Lager, J. D. Keene & C. V. Nicchitta (2005) Stable ribosome binding to the endoplasmic reticulum enables compartment-specific regulation of mRNA translation. Mol Biol Cell, 16, 581931.

144. Svidritskiy, E. & A. A. Korostelev (2018) Mechanism of Inhibition of Translation Termination by Blasticidin S. J Mol Biol, 430, 591-593.

145. Svidritskiy, E., C. Ling, D. N. Ermolenko & A. A. Korostelev (2013) Blasticidin S inhibits translation by trapping deformed tRNA on the ribosome. Proc Natl Acad Sci U S A, 110, 12283-8.

146. Svitkin, Y. S., N.; Sonenberg, N. (2015) Protein Synthesis Initiation in Eukaryotes: IRES-mediated Internal Initiation. eLS.

147. Sylvestre, J., A. Margeot, C. Jacq, G. Dujardin & M. Corral-Debrinski (2003 a) The role of the 3' untranslated region in mRNA sorting to the vicinity of mitochondria is conserved from yeast to human cells. Mol Biol Cell, 14, 3848-56.

148. Sylvestre, J., S. Vialette, M. Corral Debrinski & C. Jacq (2003b) Long mRNAs coding for yeast mitochondrial proteins of prokaryotic origin preferentially localize to the vicinity of mitochondria. Genome Biol, 4, R44.

149. Terenin, I. M., K. A. Akulich, D. E. Andreev, S. A. Polyanskaya, I. N. Shatsky & S. E. Dmitriev (2016) Sliding of a 43S ribosomal complex from the recognized AUG codon triggered by a delay in eIF2-bound GTP hydrolysis. Nucleic Acids Res, 44, 1882-93.

150. Terenin, I. M., S. E. Dmitriev, D. E. Andreev & I. N. Shatsky (2008) Eukaryotic translation initiation machinery can operate in a bacterial-like mode without eIF2. Nat Struct Mol Biol, 15, 836-41.

151. Terenin, I. M., V. V. Smirnova, D. E. Andreev, S. E. Dmitriev & I. N. Shatsky (2017) A researcher's guide to the galaxy of IRESs. Cell Mol Life Sci, 74, 1431-1455.

152. Thastrup, O., P. J. Cullen, B. K. Drobak, M. R. Hanley & A. P. Dawson (1990) Thapsigargin, a tumor promoter, discharges intracellular Ca2+ stores by specific inhibition of the endoplasmic reticulum Ca2(+)-ATPase. Proc Natl Acad Sci U SA, 87, 2466-70.

153. Thoreen, C. C. (2017) The molecular basis of mTORC1-regulated translation. Biochem Soc Trans, 45, 213-221.

154. Ueno, T., K. Kaneko, T. Sata, S. Hattori & K. Ogawa-Goto (2012) Regulation of polysome assembly on the endoplasmic reticulum by a coiled-coil protein, p180. Nucleic Acids Res, 40, 3006-17.

155. Unsworth, H., S. Raguz, H. J. Edwards, C. F. Higgins & E. Yague (2010) mRNA escape from stress granule sequestration is dictated by localization to the endoplasmic reticulum. FASEB J, 24, 3370-80.

156. Valasek, L. S., J. Zeman, S. Wagner, P. Beznoskova, Z. Pavlikova, M. P. Mohammad, V. Hronova, A. Herrmannova, Y. Hashem & S. Gunisova (2017) Embraced by eIF3: structural and functional insights into the roles of eIF3 across the translation cycle. Nucleic Acids Res, 45, 10948-10968.

157. Vattem, K. M. & R. C. Wek (2004) Reinitiation involving upstream ORFs regulates ATF4 mRNA translation in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A, 101, 11269-74.

158. Voigt, F., H. Zhang, X. A. Cui, D. Triebold, A. X. Liu, J. Eglinger, E. S. Lee, J. A. Chao & A. F. Palazzo (2017) Single-Molecule Quantification of Translation-Dependent Association of mRNAs with the Endoplasmic Reticulum. Cell Rep, 21, 3740-3753.

159. Walsh, D., M. B. Mathews & I. Mohr (2013) Tinkering with translation: protein synthesis in virus-infected cells. Cold Spring Harb Perspect Biol, 5, a012351.

160. Walter, P., I. Ibrahimi & G. Blobel (1981) Translocation of proteins across the endoplasmic reticulum. I. Signal recognition protein (SRP) binds to in-vitro-assembled polysomes synthesizing secretory protein. J Cell Biol, 91, 545-50.

161. Walter, P. & D. Ron (2011) The unfolded protein response: from stress pathway to homeostatic regulation. Science, 334, 1081-6.

162. Wang, X., S. Regufe da Mota, R. Liu, C. E. Moore, J. Xie, F. Lanucara, U. Agarwala, S. Pyr Dit Ruys, D. Vertommen, M. H. Rider, C. E. Eyers & C. G. Proud (2014) Eukaryotic elongation factor 2 kinase activity is controlled by multiple inputs from oncogenic signaling. Mol Cell Biol, 34, 4088-103.

163. Weis, B. L., E. Schleiff & W. Zerges (2013) Protein targeting to subcellular organelles via MRNA localization. Biochim Biophys Acta, 1833, 260-73.

164. Welnowska, E., M. A. Sanz, N. Redondo & L. Carrasco (2011) Translation of viral mRNA without active eIF2: the case of picornaviruses. PLoS One, 6, e22230.

165. Williams, C. C., C. H. Jan & J. S. Weissman (2014) Targeting and plasticity of mitochondrial proteins revealed by proximity-specific ribosome profiling. Science, 346, 748-51.

166. Wilson, D. N. (2009) The A-Z of bacterial translation inhibitors. Crit Rev Biochem Mol Biol, 44, 393-433.

167. Wilson, J. E., T. V. Pestova, C. U. Hellen & P. Sarnow (2000) Initiation of protein synthesis from the A site of the ribosome. Cell, 102, 511-20.

168. Yogev, O., S. Karniely & O. Pines (2007) Translation-coupled translocation of yeast fumarase into mitochondria in vivo. J Biol Chem, 282, 29222-9.