Характеристика микросимбиоценоза кишечника у детей с реактивными артритами тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, кандидат наук Федотова Лариса Петровна

• Федотова Лариса Петровна
• кандидат наук
• 2018

Оглавление диссертации кандидат наук Федотова Лариса Петровна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 Л.Общая характеристика, эпидемиология реактивного артрита. Роль 13 микробного фактора в этиологии и патогенезе реактивного артрита 1.2.Значение кишечного микробиома и феномена антигенной мимикрии 17 в развитии реактивного артрита

1.3. Особенности взаимодействия микроорганизмов кишечной микро- 23 биоты и факторов врожденной антимикробной защиты кишечного биотопа у детей с реактивным артритом

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Дизайн исследования

2.2. Метод определения состояния микробиоценоза кишечника

2.3. Методы выделения и идентификации микроорганизмов

2.4. Методы изучения биологических свойств бактерий и грибов

2.4.1. Метод определения бактериоциногенного теста и 36 бактериоциногенной активности микроорганизмов

2.4.2. Метод определения антилизоцимной активности 37 микроорганизмов

2.4.3. Метод определения антилактоферриновой активности бактерий

2.4.4. Метод определения биопленкообразования микроорганизмов

2.4.5. Метод определения антипептидной активности микроорганизмов

2.4.6. Метод определения гемолитической активности микроорганизмов

2.5. Методы определения уровня цитокинов, лактоферрина и лизоцима 42 в копрофильтратах обследуемых детей

2.6. Методы статистической обработки 43 ГАВА 3. ОСОБЕННОСТИ СОСТОЯНИЯ МИКРОСИМБИОЦЕ- 44 НОЗА КИШЕЧНИКА У ДЕТЕЙ С РЕАКТИВНЫМ АРТРИТОМ

3.1. Сравнительная характеристика состояния кишечного микробиоце- 44 ноза у детей с реактивным артритом и здоровых детей

3.2. Сравнительная характеристика кишечного микробиоценоза у детей 53 с острым и хроническим течением реактивного артрита ГЛАВА 4. ОСОБЕННОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КИ- 60 ШЕЧНЫХ МИКРОСИМБИОНТОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ДЕТЕЙ С РЕАКТИВНЫМ АРТРИТОМ

4.1. Персистентные свойства микроорганизмов кишечной микробиоты 60 детей с реактивным артритом

4.2. Способность кишечных микросимбионтов изменять уровень 68 иммунорегуляторных пептидов (антипептидная активность)

ГЛАВА 5. ХАРАКТЕРИСТИКА ВРОЖДЕННЫХ ФАКТОРОВ 76 ЛОКАЛЬНОЙ АНТИМИКРОБНОЙ ЗАЩИТЫ КИШЕЧНОГО БИОТОПА У ДЕТЕЙ С РЕАКТИВНЫМ АРТРИТОМ

5.1. Содержание про- и противовоспалительных цитокинов, лакто- 76 феррина и лизоцима в копрофильтратах больных реактивным артритом и здоровых детей

5.2. Содержание про- и противовоспалительных цитокинов, лактофер- 80 рина и лизоцима в копрофильтратах больных реактивным артритом в зависимости от клинического варианта течения артрита

ГЛАВА 6. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ КРИТЕРИИ ПРОГНОЗИРОВА- 85 НИЯ ИСХОДА РЕАКТИВНОГО АРТРИТА У ДЕТЕЙ

6.1. Выявление значимых микробиологических показателей и их ис- 85 пользование в разработке способа прогнозирования клинического варианта течения и исхода реактивного артрита у детей

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

ВЫВОДЫ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Характеристика микросимбиоценоза кишечника у детей с реактивными артритами»

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Реактивный артрит (РеА) занимает лидирующее положение в структуре воспалительных заболеваний суставов. Частота встречаемости РеА в России - 86,9 на 100000 детского населения и регистрируется у 56% детей до 14 лет и 37% подростков с ревматической патологией [3]. В настоящее время к РеА относят воспалительные негнойные заболевания суставов, развивающиеся вследствие иммунных нарушений после кишечной, урогенитальной или носоглоточной инфекции. В подавляющем большинстве случаев РеА ассоциируется с острой или персистирующей кишечной инфекцией, вызываемой энтеробактериями (иерсиниями, сальмонеллами, шигеллами, хламидиями, клостридиями, эшерихиями и др.).

Первоначально существовало мнение о «стерильности» синовита при РеА. Считалось, что в синовиальной жидкости и в синовиальной оболочке больных инфекционные агенты и их антигены отсутствуют. В тоже время, уже в 70-х - 80-х годах XX века в биоптатах синовиальной оболочки методами световой и электронной микроскопии, иммуноцитохимическими исследованиями были обнаружены внутриклеточные включения Chlamidia trachomatis, признанной в дальнейшем одним из значимых артритогенных микроорганизмов при РеА [55].

Проведенные в дальнейшем исследования c использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) показали, что в сыворотке крови и синовиальной жидкости больных РеА выявляются бактериальные антигены и фрагменты ДНК и РНК микроорганизмов, что привело к формированию новых взглядов на этиологию и патогенез реактивного артрита. Наличие нуклеиновых кислот в тканях свидетельствовало о возможности транскрипции и активного размножения бактерий в полости сустава [1, 2, 115].

Инфекция при РеА часто не является непосредственной причиной артрита, а играет роль триггерного фактора иммунного процесса. Имеются данные исследователей, указывающих на роль кишечной микрофлоры,

прежде всего, грамотрицательных бактерий, в развитии артрита [105]. Появляется все больше фактов о потенциальной роли микроорганизмов-комменсалов, составляющих микробиоту кишечника, как инициаторов иммунозависимых воспалительных заболеваний суставов [68].

В последние годы показано, что развитие РеА связано с кишечной мик-робиотой [119, 123, 38, 99]. Выявлена связь нарушений кишечной микробио-ты с наличием гена НЬА-В27 и определена роль кишечной микрофлоры в развитии воспалительных заболеваний кишечника [71]. Важным патогенетическим фактором артрита является нарушение кишечной проницаемости. Кишечный эпителий представляет собой физический и биохимический барьер против бактерий-комменсалов и патогенных микроорганизмов, что составляет основу поддержания гомеостаза между хозяином и его микрофлорой [45]. Дисбиоз кишечника способствует повреждению этого барьера, увеличению транслокации комменсальной микробиоты, что ведет к развитию заболевания [125, 118, 126, 80].

Воспаление - обязательный компонент артрита. В настоящее время активно изучаются и дискутируются вопросы о роли биологически активных веществ - цитокинов в реализации иммунного воспаления при артритах, доказано наличие у больных как типичных, так и весьма индивидуализированных форм дисбаланса цитокинов различных классов. «Цитокиновая» концепция является одним из ведущих звеньев модели формирования артрита. Известно, что интерлейкин-1 (1Ь-1), у-интерферон (ШБ-у), фактор некроза опухоли - а (ТЫБ-а), интерлейкин-6 (1Ь-6) оказывают провоспалительное действие. Напротив, интерлейкины: 1Ь-4, 1Ь-10, 1Ь-13 являются противовоспалительными агентами [4]. Секреция цитокинов играет важную роль в патогенезе РеА и поддержании баланса цитокинов в биотопе толстого кишечника. Нарушение сигнального вектора 1Ь-23/ТЫ7 рассматривается как важный триггер хронического воспаления при артрите [58, 128].

Недостаточная изученность процессов непосредственного участия кишечных микросимбионтов, запускающих иммунное воспаление суставов, в

развитии РеА, двойственный, неоднозначный характер биологических эффектов цитокинов, недостаточная изученность их у больных с реактивными артритами, отсутствие сведений об антицитокиновой (антипептидной активности) микроорганизмов, инициирующих воспалительный процесс, обусловили выбор темы нашей работы.

Цель исследования

Определить особенности микросимбиоценоза кишечника и факторов локальной антимикробной защиты кишечного биотопа у детей с реактивными артритами.

Задачи исследования

1. Изучить состояние микросимбиоценоза кишечника у детей с реактивными артритами: видовой состав, количественные и качественные особенности кишечной микробиоты.

2. Исследовать персистентный потенциал: антилизоцимную, антилак-тоферриновую активности, способность к биопленкообразованию, антипептидную активность кишечных микросимбионтов, выделенных у детей с реактивным артритом и здоровых детей.

3. Определить баланс уровня врожденных факторов локальной антимикробной защиты (лактоферрина и лизоцима), ряда провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в копрофильтратах больных и здоровых детей.

4. Установить наиболее значимые микробиологические показатели, связанные с клиническими параметрами и на их основе разработать способ прогнозирования клинического варианта течения и исхода реактивного артрита.

Методология и методы исследования

Методологической основой выполненной работы явилось комплексное микробиологическое обследование с определением ряда врожденных факто-

ров локальной антимикробной защиты кишечного биотопа детей с реактивным артритом в сравнительном аспекте со здоровыми детьми с обязательным статистическим анализом полученных результатов. Микробиологические исследования проводились на базе лаборатории биомониторинга и молекуляр-но-генетических исследований Института клеточного и внутриклеточного симбиоза Уральского отделения РАН (зав. лабораторией - профессор РАН Перунова Наталья Борисовна). Клинический отбор детей с реактивным артритом, а также формирование обследуемых и групп сравнения осуществлялись на базе отделения кардиоревматологии детского стационара городской клинической больницы № 6 г. Оренбурга (главный врач - канд. мед. наук, Карпов Александр Ильич).

Для характеристики состояния микросимбиоценоза кишечника проведено микробиологическое обследование 75 детей (от 3 до 17 лет), из которых 50 детей с РеА и 25 условно здоровые дети (группа сравнения). Для уточнения характера микросимбиотических нарушений и значимости микроорганизмов кишечной микробиоты в развитии РеА, наряду с классическим бактериологическим методом исследования при изучении кишечного микросим-биоценоза использовали бактериоциногенный тест. Для поиска микробиологических маркеров, связанных с клиническими параметрами артрита, проведен сравнительный анализ состояния кишечного микросимбиоценоза у 34 детей с установленным течением РеА, из которых 21 больной имели острое течение и 13 детей составили группу с хроническим течением артрита. Для уточнения роли микробного фактора в развитии реактивного артрита проведено определение персистентных свойств кишечных микросимбионтов (ан-тилизоцимной активности, антилактоферриновой активности, способности к биопленкообразованию, антипептидной активности в отношении про- и противовоспалительных цитокинов, а также теста на определение количества ан-тибиотикорезистентных копроштаммов у больных с острым и хроническим течением артрита), позволяющих оценить участие микроорганизмов кишечной микробиоты в формировании артритогенного потенциала.

Известные данные о роли иммунорегуляторных пептидов в формировании РеА, а также данные о постоянном взаимодействии между цитокинами и микроорганизмами, составляющими кишечную микробиоту, послужили поводом для изучения уровня локальных антимикробных факторов защиты кишечного биотопа (лактоферрина и лизоцима) у детей с РеА, а также про- и противовоспалительных цитокинов в копрофильтратах 34 детей с РеА (21 ребенок детей с острым и 13 детей с хроническим течением). Полученные результаты исследования подвергнуты статистической обработке с использованием программного пакета Statistica 10.

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора

Достоверность полученных результатов обусловлена достаточным объемом выборки, соблюдением критериев включения детей в исследуемую группу и группу сравнения, а также соответствием сформированных групп цели и задачам исследования. В проводимой работе использовались адекватные, современные микробиологические методики исследования, выполненные на лицензированном современном оборудовании лаборатории биомониторинга и молекулярно-генетических исследований Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (зав. лабораторией - профессор РАН Перунова Н.Б.). Статистический анализ проводился с применением адекватных, корректных методов.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на третьем съезде микологов России, г. Санкт-Петербург, 2013; XVIII конгрессе педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии», Москва, 2015; на УШ-ой Российской научной конференции с международным участием «Персистенция и симбиоз микроорганизмов», г. Оренбург, 2015; на конгрессе педиатров «Инновационные технологии в педиатрии и детской хирургии», г. Москва, 2016; Ш-ей Международной научно-практической конференции «Современные проблемы развития фундаментальных и прикладных наук», 2016, Прага, Чешская республика; на 1-ом Калининградском научном иммунологическом

форуме - 2016; Х1У-ой конференции иммунологов Урала - г.Челябинск, 2017.

Результаты работы доложены на врачебной конференции педиатров г. Оренбурга и Оренбургской области и на заседании кардио-ревматологического общества детских кардио-ревматологов (г. Оренбург, 2017).

Личный вклад соискателя заключается в непосредственном участии на всех этапах выполнения работы. Цель и задачи исследования сформулированы совместно с научным руководителем профессором О.Е. Челпаченко. Автор самостоятельно изучала отечественные и зарубежные литературные источники по теме работы. Лично автором проводилась работа по формированию используемых в работе групп детей. Микробиологические исследования проводились совместно с сотрудниками лаборатории биомониторинга и мо-лекулярно-генетических исследований Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН (зав. лабораторией - профессор РАН Перунова Н.Б.). Адекватность статистических методов исследования контролировалась ведущим научным сотрудником лаборатории биомониторинга и молекуляр-но-генетических исследований Института клеточного и внутриклеточного симбиоза УрО РАН доцентом Никифоровым И.А. Оформление статей, докладов, диссертационной работы проводилось автором лично.

Положения, выносимые на защиту

1. Нарушения кишечного микросимбиоценоза при артрите выявляются в 8 раз чаще, чем у здоровых и характеризуются снижением показателя микробной обсемененности бифидобактерий и лактобацилл на фоне повышения данного показателя у ассоциативных микроорганизмов; видовым своеобразием кишечной микробиоты, подтвержденным дискриминантным анализом, а также наличием у кишечных микросимбионтов персистентных свойств (антилизоцимной и антилактоферриновой активностей, биопленко-образования, антипептидной активности в отношении цитокинов: Т№-а,

INF-y, IL-6, IL-10), характеризующихся снижением их уровня у доминантных и повышением у ассоциативных микроорганизмов.

2. Количественные изменения микробиологических показателей (антибиотикорезистентность и бактериоциногенная активность кишечных микросимбионтов, гиперколонизация грибами рода Candida), а также факторов локальной антимикробной защиты кишечного биотопа (лактоферрин, лизоцим, цитокины - TNF-a, IL-10) в зависимости от источника выделения (здоровый или больной артритом) свидетельствуют о возможности использования их в качестве маркеров для определения клинических параметров.

Научная новизна

Проведенные сравнительные микробиологические исследования состояния кишечного микросимбиоценоза у детей с реактивными артритами и здоровых лиц с применением дискриминантного анализа позволили выявить у больных артритом наличие дисбиотических изменений, сопровождающихся видовыми особенностями состава микрофлоры, нарушением количественного соотношения между микроорганизмами, составляющими нормальную микрофлору (снижение показателя микробной обсемененности бифидобак-терий и лактобацилл), на фоне роста данного показателя у представителей ассоциативной микрофлоры. Впервые выявлено наличие у кишечных микросимбионтов, выделенных у детей с артритом, персистентного потенциала: антилизоцимной активности, антилактоферриновой активности, способности к биопленкообразованию и антипептидной активности в отношении про- и противовоспалительных цитокинов с достоверным отличием уровня перси-стентных свойств у микросимбионтов - представителей нормальной микрофлоры (снижение уровня) и микроорганизмов-ассоциантов (повышение уровня).

Установлены особенности баланса уровня ряда про- и противовоспалительных цитокинов, а также факторов врожденной антимикробной защиты (лактоферрина и лизоцима) в копрофильтратах детей с артритом, позволяю-

щие оценить вклад микробного фактора в формирование артрита.

Выявлены микробиологические критерии (наличие дисбиоза дисталь-ного отдела толстого кишечника у детей, положительные значения бактерио-циногенного теста, гиперколонизация грибами рода Candida при исследовании на дисбиоз кишечника, количество антибиотикорезистентных копро-штаммов), а также факторы локальной антимикробной защиты кишечного биотопа, позволяющие использовать их для оценки клинических параметров.

Теоретическая и практическая значимость работы

Выявлены особенности кишечного микросимбиоценоза, позволяющие оценить его роль в качестве одного из факторов, инициирующих развитие острого реактивного артрита, а также способствующих формированию хронического артрита.

Доказана целесообразность определения в копрофильтратах показателей локальной антимикробной защиты кишечного биотопа - лактоферрина и лизоцима для определения тяжести и прогноза течения артрита, контроля эффективности терапии.

Определены микробиологические маркеры, связанные с клиническими параметрами, информативными для прогнозирования течения и исхода артрита:

1) сочетание факторов (лактоферрина,ТКБ-а, IL-10) в копрофильтратах больных РеА.

2) наличие положительного бактериоциногенного теста, гиперколонизация дрожжевыми грибами, количество антибиотикорезистентных копро-штаммов.

На основании выявленных микробиологических критериев разработаны способ прогнозирования исхода реактивных и инфекционных артритов у детей (патент РФ №2607375) и программа для ЭВМ «Дистара» №2016611902, позволяющая определить исход артрита.

Внедрение результатов исследования в практику

Проведенные исследования кишечного микросимбиоценоза позволили разработать микробиологические критерии, которые легли в основу разработанного способа (патент РФ №2607375) и программы ЭВМ «Дистара» (№2016611902) для определения клинического течения и исхода реактивного артрита.

Глава 1.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Общая характеристика, эпидемиология реактивного артрита. Роль микробного фактора в этиологии и патогенезе реактивного артрита

Реактивный артрит (РеА) - воспалительное негнойное заболевание суставов, развивающееся в тесной хронологической связи (обычно не позднее чем через 1 месяц) после некоторых перенесенных инфекций (кишечных, мочеполовых, носоглоточных) вследствие иммунных нарушений. Заболевание относится к группе серонегативных спондилоартритов и в большинстве случаев ассоциируется с острой или персистирующей кишечной, урогени-тальной инфекцией (вызываемой энтеробактериями, хламидиями), а также может быть связано с инфекциями дыхательных путей, вызываемых мико-плазмами и хламидиями [1, 2, 3, 31]. Имеются данные о возможной связи с некоторыми паразитарными заболеваниями. Известно, что заболевание развивается преимущественно у генетически предрасположенных лиц, являющихся носителями гена HLA-B27, определяемого у 50-70% больных РеА. Вариантом РеА является синдром Рейтера (уретроокулосиновиальный синдром), включающий наряду с артритом такие системные проявления, как конъюнктивит и уретрит, кожный синдром. Синдром Рейтера развивается после урогенной хламидийной или кишечной инфекций [25].

По данным экспертов ВОЗ, начиная с 2000 года, отмечается рост воспалительных ревматических заболеваний, лидирующих по частоте и социальной значимости как в России, так и в других странах. Наиболее распространен среди ревматических заболеваний реактивный артрит, который встречается у 86,9 на 100000 детского населения [5]. Распространенность РеА в Российской Федерации в 2013 году, по данным Минздрава России, составила 42,8; 99,0 и 172,4 случая на 100 тыс. взрослых, детей и подростков, соответственно. По данным Института ревматологии РАМН больные РеА со-

ставляют около 10% пациентов ревматологических стационаров. Рецидив заболевания после первого эпизода артрита регистрируется у 15-70% больных. У 20% больных РеА развивается хронический периферический артрит с возможным поражением осевого скелета, с последующей инвалидизацией 42% пациентов [5,6]. Приведенные показатели свидетельствуют о сохраняющейся тенденции к росту заболеваемости РеА, его социально-экономической значимости для первичного звена здравоохранения, а, следовательно, об актуальности дальнейших исследований этиологии и патогенеза данной патологии.

Термин «реактивный артрит» введен в литературу в начале 70-х годов XX века финскими учеными K. Aho и P. Ahvonen для обозначения артритов, развившихся после перенесенной иерсиниозной инфекции. Первоначально существовало мнение о «стерильности» синовита при РеА. Считалось, что в синовиальной жидкости и в синовиальной оболочке больных инфекционные агенты и их антигены отсутствуют. В тоже время, уже в 70-х - 80-х годах XX века в биоптатах синовиальной оболочки методами световой и электронной микроскопии, иммуноцитохимическими исследованиями обнаружены внутриклеточные включения Chlamydia trachomatis, признанной в дальнейшем одним из значимых артритогенных микроорганизмов при РеА [57]. Проведенные в дальнейшем исследования c использованием метода полимеразной цепной реакции (ПЦР) показали, что в сыворотке крови и синовиальной жидкости больных РеА выявляются бактериальные антигены и фрагменты ДНК и РНК микроорганизмов, что привело к формированию новых взглядов на этиологию и патогенез реактивного артрита. Наличие нуклеиновых кислот в тканях свидетельствовало о возможности транскрипции и активного размножения бактерий в полости сустава [1, 115]. Позднее обнаружено, что у здоровых людей сустав не является стерильным [103]. ДНК различных микроорганизмов была обнаружена в биоптатах синовиальной оболочки у 9% здоровых людей и 20% больных остеоартрозом.

Введенные ревматологами России критерии диагноза реактивных арт-

ритов в 2003 году свидетельствуют о разрешении споров относительно «стерильности» суставных тканей больных РеА [1]. На роль триггерной инфекции в развитии РеА указывает один из двух «больших» критериев, а именно предшествующая клинически выраженная инфекция (наличие одного из двух проявлений) - уретрит/цервицит, предшествующий артриту в течение 8 недель или энтерит, предшествующий артриту в течение 6 недель. «Малый» критерий РеА включает лабораторное подтверждение триггерных инфекций, вызванных C. trachomatis или энтеробактериями. При этом в примечании отмечено, что для доказательства инфицирования наиболее специфичным считается метод выделения хламидий из органов уретро-генитальной сферы или суставных тканей в культуре клеток [1]. Для идентификации триггерного микроорганизма наряду с микробиологическими методами используются иммунологические и молекулярно-биологические методы. Положительные результаты чаще получают при использовании иммунологических методов (определение антител к инфекционным агентам и/или их антигенам) и методов амплификации фрагментов нуклеиновых кислот микроорганизмов (ПЦР), однако эти результаты являются косвенными доказательствами наличия соответствующих микроорганизмов [25].

В Федеральных клинических рекомендациях по оказанию медицинской помощи детям с реактивным артритом (2015) представлены обобщенные критерии диагностики РеА, основанные на рекомендациях Американской коллегии ревматологов и Берлинских критериях (1999). Основные критерии включают наличие артрита, имеющего 2 из 3-х следующих признаков: асси-метричный, -моно- или олигоартрит, - поражение суставов нижних конечностей. Второй критерий - предшествующая инфекция, сопровождающаяся одним из двух признаков: энтерит в анамнезе не менее одного дня, развившийся в сроки от 3 дней до 6 недель до начала артрита; или уретрит продолжительностью не менее одного дня в сроки от 3-х дней до 6 недель до начала артрита. Дополнительными критериями являются данные лабораторных исследований, подтверждающие инфекцию: 1. положительная лигазная реакция

мочи или соскоб уретры/ шейки матки (влагалища) на C.trachomatis, а также положительное бактериологическое исследование фекалий на артритогенные кишечные инфекции; 2. данные, подтверждающие наличие инфекции в синовиальной оболочке (иммуноцитологическое исследование или ПЦР на Chlamydia). Достоверный диагноз РеА устанавливают при наличии обоих основных критериев и одного из дополнительных критериев. Диагноз вероятного РеА устанавливают при наличии обоих больших критериев и отсутствии дополнительных критериев или при наличии одного большого и одного или более дополнительных критериев с учетом идентификации триггерной инфекции [32].

В настоящее время расширяются наши знания об этиологических агентах, способствующих развитию РеА в качестве триггерных инфекций [6]. К триггерам РеА относятся возбудители кишечных инфекций: Salmonella (различные серотипы), Shigella: S. flexneri, S. disenteriae, S. sonnei; Yersinia: Y.enterocolitica (серотипы 0:3 и 0:9); Y.pseudotuberculosis; Campylobacter: C.jejuni, C.coli; Clostridium difficile; Escherichia coli (штаммы, вызывающие диарею). Возбудителями урогенитальных инфекций - триггеров РеА признаны C. trachomatis, Ureaplasma urealyticum, к возбудителям респираторных триггерных инфекций относят C. pneumonia [60].

В развитии РеА ведущим является инфекционный агент. Определено, что общими свойствами артритогенных микроорганизмов являются: троп-ность к слизистым оболочкам, высокая контагиозность, наличие в наружной мембране липополисахаридов, обладающих перекрестной реактивностью, наличие неидентифицированных специфических факторов вирулентности, способствующих выживанию и диссеминации возбудителя в организме. Одним из наиболее значимых этиологических микроорганизмов РеА считается C. trachomatis, являющаяся облигатным внутриклеточным микробом, способным существовать в двух формах адаптации - внутри и вне клетки. «Элементарные тельца» - зрелые формы бактерий, приспособленные к существованию во внешней среде, прикрепляются к чувствительным клеткам, погло-

щаются ими и формируются внутриклеточные вакуоли, которые организуются в метаболически неактивные ретикулярные тельца, не приспособленные к выживанию вне клетки. В дальнейшем идет процесс бинарного деления ретикулярных телец с образованием элементарных телец в результате процессов цитолиза или экзоцитоза, что ведет к заражению новых клеток.

Течение хламидийной инфекции при РеА определяется, в значительной мере, способностью возбудителей к образованию аберрантных (персистент-ных) форм, отличающихся рядом свойств от обычных (продуктивных) форм. Эти особенности являются важной составляющей проблем, связанных с неэффективностью лечения РеА антибактериальными препаратами, формированием рецидивирующих, хронических форм реактивного артрита [133]. Ряд авторов утверждают, что у детей ведущей причиной развития РеА чаще являются респираторные инфекции (ангина, фарингит, бронхит, острая респираторная инфекция) и наиболее частым возбудителем при этом считают, наряду с C. pneumoniae и Mycoplasma pneumoniae, стрептококковую инфекцию [26, 98]. В тоже время в соответствии с диагностическими критериями РеА, принятыми на III Международном совещании по РеА в Берлине в 1996г., стрептококковый артрит относят к критериям исключения диагноза реактивного артрита [67].

1.2. Значение кишечного микробиома и феномена антигенной мимикрии

в развитии реактивного артрита

Очевидно, что ряд вопросов, касающихся этиологии и патогенеза реактивного артрита, недостаточно изучены. Подтверждением данного положения являются материалы состоявшегося в 2014 году международного саммита по аутоиммунной патологии, раскрывающие патогенетические механизмы развития аутоиммунных заболеваний суставов при ведущей роли микробио-ма как фактора инициирующего и поддерживающего иммунное воспаление в суставах [119].

В 2010 году I. Sekirov et al. [105] провели экспериментальные исследо-

вания, демонстрирующие роль кишечного микробиома в развитии артрита. Сохраняется приоритетность изучения механизмов взаимодействия микробных факторов и макроорганизма, переноса инфекционного агента или артри-тогенных антигенов в суставную полость, а также новых инфекционных факторов [2,25]. Возрастает интерес к микроорганизмам - комменсалам, составляющим микробиоту кишечника и ротовой полости, как потенциальным инициаторам иммунозависимых воспалительных заболеваний суставов [131].

Список литературы диссертационного исследования кандидат наук Федотова Лариса Петровна, 2018 год

- - - -

Kocuria spp. - - Kocuria varians 7,7 ± 7,5

Таблица 3.2.1 - Видовой состав фекальной микрофлоры детей с острым и

хроническим течением реактивного артрита (РеА) (продолжение)

Группы микроорганизмов Острое течение РеА (n=21) Хроническое течение РеА (n=13)

Частота Частота

Вид встречаемости (%) Вид встречаемости (%)

L.rhamnosus 9,6±6,5 L.rhamnosus 15,4 ± 9,9

о £р £ о р и Lactobacillus L. gasseri 4,8±4,8 Lactococcus garvieae 7,7 ± 7,5

spp. L. paracasei 4,8±4,8 L. paracasei 7,7 ± 7,5

к S •

B. longum 76,8 ± 9.2 B. longum 61,6±13,5

Bifidobacterium spp. B. bifidum 33,6 ± 10,3 B. bifidum 30,8±12,8

B. adolescentis 14,4 ± 7,6 B. adolescentis 15,4±9,9

B. catenulatum 4,8 ± 4,8 - -

B.pseudocaten-ulatum 4,8 ± 4,8 B.pseudocaten-ulatum 7,7 ± 7,5

ы s Eubacteria spp. — — — -

со К C. perfringens 57,6 ±10,8 C. perfringens 61,6±13,5

а г р о о р к К Clostridium spp. C. indolis 4,8 ± 4,8 C. indolis 7,7 ± 7,5

S Hi Actinomyces spp. A. israelii 14,4 ± 7,6 A. israelii 15,4± 9,9

3 X ю о A. oris 19,2 ± 8,6 A. oris 7,7± 7,5

£ X а Propionibacterium spp. P. acnes 19,2 ± 8,6 P. acnes 7,7± 7,5

о X н B. vulgates 67,2 ± 10,3 B. vulgatus 46,2±13,8

сЗ U К Bacteroides spp. B.distasonis 48,0 ± 10,9 B.distasonis 38,5±13,5

ч ю о B. uniformis 4,8 ± 4,8 B. uniformis 7,7 ±7,5

Грибы рода C. albicans 48,0±10,9* C.albicans 77,0±11,7*

Candida

Примечание: * - достоверность различий показателей между группой больных с острым и хроническим течением РеА (р<0,05)

Таблица 3.2.2. - Различия показателя микробной обсемененности микроорганизмов кишечной микробиоты у больных острым и хроническим реактив-

ным артритом

Группы микроорганизмов Острое течение РеА (n=21) Хроническое течение РеА (n=13)

Вид ПМО, lg (КОЕ/г) Вид ПМО, lg (КОЕ/г)

Факультативно аэробные микроорганизмы Escherichia coli E. coli (Lac+) (гем - ) 7,2 ± 0,6 E. coli (Lac+) (гем - ) 7,5 ± 0,7

E. coli (Lac-) 6,5± 0,8 E. coli (Lac-) 6,8 ± 0,5

Klebsiella spp. K.pneumoniae 7,8 ± 0,9 K. pneumoniae 9,2 ± 0,9

K. ozaenae 7,0 ± 0,8 K.oxytoca 8,0 ± 0,8

Citrobacter spp. C. freundii 6,2 ± 0,6 C. freundii 6,0 ± 0,5

C. broakii 7,0 ± 0,9 C. koseri 7,0 ± 0,9

C. koseri 9,6 ± 6.5 - -

Enterobacter spp. E. cloacae 9,0 ± 1,0 E.aerogenes 8,9 ± 1,1

Proteus spp. P. mirabilis 7,8 ± 0,8 P. mirabilis 7,0 ± 1,0

Cronobacter spp. C. sakazakii 6,0 ± 1,0 - -

Bacillus spp. - - Bacillus spp. 9,0 ± 1,1

Staphylococcus spp. S.aureus 7,5 ± 0,7 S.aureus 7,0 ± 1,0

S. epidermidis 7,1 ± 0,6 S. epidermidis 7,2 ± 1,0

S. xylosus 8,0 ± 1,0 S. arletae 7,0 ± 1,0

S. capitis 7,5± 0,7 S.haemolyticus 6,9 ±1,1

S.equorum lec- 7,0 ± 1,0

Streptococcus spp. S. oralis 5,9 ± 0,8 Str.intermedius 7,0 ± 0,8

Str. equinus hem+ 6,0 ± 0,9 S. oralis 6,2 ± 0,5

Str.intermedius 6,0 ± 0,9 - -

Enterococcus spp. E. faecalis 5,1 ± 0,9 E. faecalis 5,0 ± 0,9

- - - -

Kocuria spp. - - Kocuria varians 5,0 ± 1,0

Таблица 3.2.2. - Различия показателя микробной обсемененности микроорганизмов кишечной микробиоты у больных острым и хроническим реактивным артритом (продолжение)

Группы микроорганизмов Острое течение РеА (n=21) Хроническое течение РеА (n=13)

Вид ПМО, lg (КОЕ/г) Вид ПМО, lg (КОЕ/г)

L.rhamnosus 5,9 ± 0,9 L.rhamnosus 5,8 ± 0,8

о р £ о р и Lactobacillus L. gasseri 4,0 ± 0,8 Lactococcus garvieae 4,6 ± 0,6

spp. L. paracasei 4,8 ± 0,9 L. paracasei 5,0 ± 1,0

к S •

B. longum 6,2 ± 0,4 B. longum 6,0 ± 0,9

Bifidobacterium spp. B. bifidum 6,0 ± 0,9 B. bifidum 5,5 ± 0,8

B. adolescentis 7,0 ± 1,0 B. adolescentis 5,0 ± 0,7

B. catenulatum 5,8 ± 0,8 - —

B.pseudocaten-ulatum 5,0 ± 0,7 B.pseudocaten-ulatum 5,0 ± 0,7

ы s Eubacteria spp. — — — —

СО X C. perfringens 9,6 ± 0,9 C. perfringens 9,0 ±1,0

а г р о о р к к Clostridium spp. C. indolis 9,0 ± 1,0 C. indolis 8,9 ± 1,0

S Hi Actinomyces spp. A. israelii 10,0 ± 1,1 A. israelii 9,8 ± 0,9

3 X ю о A. oris 9,8 ± 0,9 A. oris 10,0 ± 1,0

£ X сЗ Propionibacterium spp. P. acnes 9,0 ± 1,1 P. acnes 9,3 ± 0,9

о X н B. vulgatus 9,0 ± 0,9 B. vulgatus 9,2 ± 1,0

сЗ U К Bacteroides spp. B.distasonis 9,2 ± 0,9 B.distasonis 9,2 ±1,0

ч ю о B. uniformis 9,0 ± 0,9 B. uniformis 9,0 ±1,0

Грибы рода Candida C. albicans 5,0 ± 0,8 C.albicans 6,5 ± 0,9

Примечание: * - достоверность различий показателей между группой больных с острым и хроническим течением РеА (р<0,05)

Диаграмма БЦ-теста в зависимости от варианта течения РеА

ВАРИАНТ РеА

Рисунок 3.2.1 - Диаграмма БЦ-теста в зависимости от варианта

течения РеА (острое или хроническое течение артрита)

& & &

Таким образом, у 96% детей с РеА заболевание сопровождается нарушениями кишечного микросимбиоценоза, характеризующимися количественными изменениями в виде снижения ПМО нормофлоры (бифидобакте-рий и лактобацилл) на фоне увеличения ПМО условно-патогенных микроорганизмов (клебсиелл, цитробактера, лактозонегативных эшерихий, стафилококков, грибов рода Кандида, клостридий и бактероидов).

Наряду с количественными изменениями нарушения кишечного мик-росимбиоценоза у детей с РеА характеризуются особенностями видового состава кишечной микробиоты: повышением частоты встречаемости микро-симбионтов-ассоциантов грамотрицательных энтеробактерий (Klebsiella spp., Enterobacter spp., Citrobacter spp., а также редко встречающихся у здоровых лиц - Cronobacter spp., Burkholderia glumae), грамположительных (стафило-

кокков), клостридий и бактероидов. В тоже время, отмечается снижение видового разнообразия кишечных микросимбионтов, представляющих нормальную микрофлору (бифидобактерий и лактобацилл). Видовое своеобразие кишечного микробиоценоза больных РеА подтверждено данными дискрими-нантного анализа.

У детей с острым и хроническим вариантом течения реактивного артрита различия кишечного микробиоценоза выражены в меньшей степени как по видовому составу, так и в количественном соотношении. Исключение составляют грибы рода Candida, которые выделяются достоверно чаще и в большем количестве у больных с хроническим РеА.

Проведенные исследования бактериоциногенного теста у больных с острым и хроническим течением РеА позволили выявить связь положительного бактериоциногенного теста с хроническим течением РеА, что свидетельствует о возможности использования БЦ-теста в качестве одного из маркеров, определяющих клинический вариант течения и исхода артрита.

Результаты исследования, представленные в данной главе, опубликованы:

1. Бухарин О.В. Микросимбиоценоз кишечника у детей с реактивным артритом / О.В. Бухарин, О.Е. Челпаченко, Е.И. Данилова, И.Н. Чайникова, Н.Б. Перунова Е.В. Иванова, И.А. Никифоров, Т.А. Бондаренко, А.В. Салги-на, Л.П. Федотова // Журнал микробиол. - 2016. - №6. - С.41-48.

2. Данилова Е.И. Клиническая характеристика и особенности кишечного микробиоценоза у детей с реактивным артритом / Е.И. Данилова, О.Е. Челпаченко, Н.Б.Перунова, Е.В. Иванова, И.А. Никифоров, Л.П. Федотова // Материалы III Международной научно-практической конференции «Современные проблемы развития фундаментальных и прикладных наук». - 2016. -T.I. - Прага, Чешская республика.

ГЛАВА 4. ОСОБЕННОСТИ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КИШЕЧНЫХ МИКРОСИМБИОНТОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ОТ ДЕТЕЙ С РЕАКТИВНЫМ АРТРИТОМ

Характеристика кишечного микросимбиоценоза детей с реактивным артритом невозможна без изучения биологических свойств составляющих его микроорганизмов. Необходимым условием участия кишечных микросимбионтов в развитии артрита представляется наличие определенного патогенного потенциала, способность преодолевать распознающие механизмы врожденного иммунитета хозяина за счет приобретения антифакторов секреторной природы (антилизоцимной, антилактоферриновой активности и др.), способствующих выживанию (персистенции) микроорганизмов при инфекции [10,11].

4.1 Персистентные свойства микроорганизмов кишечной микробиоты

детей с реактивным артритом

Учитывая связь реактивного артрита с нарушением кишечного микросимбиоценоза, а также предрасположенность РеА к хронизации, мы сочли целесообразным определение персистентных свойств кишечных микросимбионтов. Наиболее приоритетными в данном контексте оказались такие базовые физиологические свойства микроорганизмов как антилизоцимная активность (АЛА), способность к биопленкообразованию (БПО), а также антилак-тоферриновая активность (АлФА) и антипептидная активность (АПА).

Данные сравнительного анализа уровня АЛА кишечных микросимбионтов у детей с острым и хроническим течением РеА и условно-здоровых детей (группа сравнения) представлены в таблице 4.1.1. В соответствии с представленными в таблице сравнительными данными значений АЛА факультативно-аэробных микроорганизмов, выделенных при обследовании на дисбиоз кишечника, у детей с РеА и здоровых детей выявлено преобладание

Таблица 4.1.1 - Антилизоцимная активность кишечных микросимбионтов, выделенных у детей с острым и хроническим течением РеА, и условно-

здоровых детей

Группа Микроорганизмов Антилизоцимная активность (мкг/мл*ОБ)

РеА острый (n=21) РеА хронический (n=13) Условно здоровые дети (n=25)

Факультативно-анаэробные E. coli (lac +) 0,65±0,04 * 2,0±0,08*,** 0,53±0,01

E. coli (lac -) 1,25±0,02 * 1,3±0,03* 0,37±0,02

Klebsiella spp. 0,7±0,08* 0,75±0,08* 0,1±0,01

Citrobacter spp. 0,8±0,03* 0,82±0,03* 0,11±0,03

Enterobacter spp. 0,1±0,02 0,12±0,02 0,13±0,05

Cronobacter spp. 0,65±0,01 - -

Bacillus spp. 0,72±0,01 - -

Staphylococcus spp. 1,5±0,14* 1,6±0,14* 0,91±0,02

Streptococcus spp. 1,4±0,05* 1,5±0,06* 0,98±0,01

Enterococcus spp. 2,0±0,08* 2,1±0,08* 1,8±0,08

Candida spp. 1,14±0,01* 1,8±0,6*, ** 0,71±0,2

Облигатно-анаэробные Bifidobacterium spp. 0,8±0,06* 0,75±0,06* 1,26±0,2

Lactobacillus spp. 1,15±0,01* 0,9±0,01*,** 2,2±0,3

Propionibacterium spp. 1,27±0,02* 1,2±0,02* 1,4±0,03

Actinomyces spp. 0,2±0,1* 0,19±0,1* 0,1±0,01

Clostridium spp. 1,16±0,015* 1,2±0,015* 0,4±0,03

Bacteroides spp. 1,3±0,015* 1,25±0,015* 0,95±0,04

Примечание: достоверность различий показателей между больными РеА и здоровыми детьми: * - р < 0,05; **- между острым и хроническим РеА, p < 0,05

уровня АЛА у условно-патогенных микросимбионтов: лактозопозитивной и лактозонегативной E. coli, Klebsiella spp., Citrobacter spp., Staphylococcus spp.,

Streptococcus spp., Enterococcus spp. и грибов рода Candida, выделенных от больных артритом. При сравнительном анализе уровня АЛА кишечных микросимбионтов, выделенных у детей с острым и хроническим РеА, выявлено достоверное увеличение уровня АЛА E. coli (lac +) и грибов рода Candida, выделенных у детей с хроническим течением РеА. Среди облигатно-анаэробных микроорганизмов достоверно выше уровень АЛА отмечается также у условно-патогенных микроорганизмов: Clostridium spp., Bacteroides spp., Actinomyces spp. В тоже время, выявлено достоверное снижение уровня АЛА у микросимбионтов - представителей нормальной микрофлоры, прежде всего, у Bifidobacterium spp., а также у других микроорганизмов, относящихся к нормобиоте (Lactobacillus spp., Propionibacterium spp.). У детей с хроническим артритом отмечалось снижение уровня АЛА у лактобацилл в сравнении с аналогичным показателем у детей с острым РеА.

Данные по определению уровня антилактоферриновой активности кишечных микросимбионтов представлены в таблице 4.1.2. Способность кишечных микросимбионтов, выделенных у детей с РеА, инактивировать лак-тоферрин представляла интерес ввиду антимикробной активности этого фактора врожденного иммунитета - железосвязывающего гликопротеина, широко представленного в барьерном эпителии и секрете пищеварительного тракта. Представляя собой природные комплексоны (хелаторы), лактоферрины (ЛФ) выполняют детоксицирующую, транспортную и антимикробную функции (бактриостатический и бактерицидный эффекты). Бактерицидное действие ЛФ обеспечивается за счет вытеснения молекул липополисахаридов (эндотоксинов) из наружной мембраны грамотрицательных бактерий в результате связывания лактоферрином Mg2+ и Ca2+ , которые стабилизируют наружную мембрану [20].

Анализ приведенных в таблице 4.1.2 данных показал, что различия уровня АЛфА кишечных микросимбионтов, выделенных от детей с острым и

Таблица 4.1.2. - Антилактоферриновая активность кишечных микросимбионтов у детей с острым и хроническим течением реактивного артрита и

условно здоровых детей

Группа Микроорганизмов Антилактоферриновая активность (ед.)

РеА острый (n=21) РеА хронический (n=13) Условно здоровые дети (n=25)

Факультативно-анаэробные E. coli (lac +) 0,5±0,06 0,48±0,06 0,43±0,05

E. coli (lac -) 0,66±0,04 * 0,32±0,05*,** 0,45±0,06

Klebsiella spp. 0,48±0,03* 0,5±0,03* 0,12±0,03

Citrobacter spp. 0,44±0,02* 0,46±0,02* 0,25±0,04

Enterobacter spp. 0,12±0,01 0,1±0,01* 0,06±0,05

Staphylococcus spp. 0,9±0,04* 0,85±0,04* 0,45±0,05

Streptococcus spp. 0,33±0,05* 0,4±0,05* 0,21±0,03

Enterococcus spp. 0,48±0,06* 0,45±0,02* 0,35±0,03

Candida spp. 0,49±0,05* 0,4±0,08* 0,21±0,03

Облигатно-анаэробные Bifidobacterium spp. 0,18±0,02* 0,32±0,04*,** 0,5±0,05

Lactobacillus spp. 0,31±0,01* 0,33±0,02* 0,42±0,05

Propionibacterium spp. 0,26±0,01* 0,24±0,04* 0,32±0,02

Actinomyces spp. 0,41±0,04 0,4±0,03 0,35±0,02

Clostridium spp. 0,76±0,02* 0,78±0,03* 0,33±0,02

Bacteroides spp. 0,84±0,04 * 0,86±0,4* 0,28±0,01

Примечание: достоверность различий показателей между больными РеА и здоровыми детьми: * - р < 0,05; ** - между больными с острым и хроническим течением реактивного артрита, р < 0,05

хроническим РеА, в сравнении со здоровыми детьми, были идентичны аналогичным изменениям показателей АЛА. У детей с РеА, в отличие от здоровых детей, условно-патогенные кишечные микросимбионты: лактозонега-тивная E. coli, Klebsiella spp., Citrobacter spp., Staphylococcus spp., Streptococcus spp., Enterococcus spp. и грибы рода Candida отличались достоверно бо-

лее высоким уровнем АЛфА. Напротив, представители нормобиоты: Bifidobacterium spp., а также, относящиеся к нормобиоте: Lactobacillus spp Propionibacterium spp., характеризовались достоверным снижением уровня АЛфА. У детей с хроническим РеА выявлено снижение уровня АЛфА у E. coli (lac -) и повышение уровня АЛфА у Bifidobacterium spp.в сравнении с данными показателями у детей с острым течением РеА.

Принимая во внимание, что состояние микросимбиоценоза характеризуется межмикробными взаимодействиями, рассматривающимися в настоящее время с позиций биокоммуникативной активности микроорганизмов, мы сочли целесообразным оценить уровень способности к биопленкообразова-нию (БПО) микросимбионтов толстого кишечника у детей с РеА. Доказано, что важная роль во взаимодействии между кишечными микросимбионтами, обеспечивающими стратегию выживания и сохранения кишечного гомеоста-за, принадлежит такому базовому биологическому свойству как БПО [9, 83]. Известно, что существование большинства видов бактерий в природе происходит не в виде свободноживущих (планктонных) клеток, а путем организации ими специфических образований - биопленок: сообществ микробных клеток, прикрепленных к поверхности или друг к другу и заключенных в матрикс синтезированных ими внеклеточных полимерных веществ [81].

С наличием биопленок связывают течение длительно рецидивирующих хронических инфекционных заболеваний, трудно поддающихся стандартной терапии [28]. Формирование биопленочных сообществ является стратегий выживания бактерий в экологической нише, которую они занимают. Бактерии в биопленках обладают повышенной защитой от действия антител, фагоцитов, противомикробных препаратов [131]. Биопленкообразование способствует защите микроорганизмов-ассоциантов от атакующих их иммунных клеточных и гуморальных факторов защиты, предоставляя возможность беспрепятственного проникновения в сосудистый кровоток с последующей транслокацией в синовиальную оболочку суставов, где формируются стойкие очаги эндогенной инфекции, которые трудно поддаются лечению антимик-

робными средствами и пробиотиками из-за неспособности дезорганизовать бактериальную биопленку ассоциантов - возбудителей воспалительного процесса.

В этом случае наблюдается хронизация и рецидивирующее течение инфекционного процесса, требующие индивидуальной этиотропной терапии и коррекции нарушений нормальной микрофлоры больного [29]. Э.В. Малафеева с соавт. (2014) показали, что бактерии, колонизирующие организм больных с ревматическими заболеваниями, обладают способностью к образованию микробных биопленок с той же частотой, как у возбудителей других воспалительных процессов [23].

Однако эти исследования проводились только в группе больных с деструктивным (ревматоидным артритом). Проведенные нами микробиологические исследования позволили определить показатели БПО микроорганизмов, выделенных из кишечника детей с реактивным артритом, в сравнении с группой условно здоровых детей (таблица 4.1.3).

При анализе полученных данных выявлено достоверное преобладание уровня БПО у выделенных от здоровых детей штаммов бифидобактерий, являющихся представителями нормальной микрофлоры кишечного микросим-биоценоза. Показатель БПО бифидобактерий, выделенных от детей с РеА, оказался на 44,4% ниже по сравнению с аналогичным показателем у здоровых детей. Снижение показателя БПО имело место у штаммов актиномице-тов (в 8 раз) и пропионибактерий (в 2 раза), выделенных у больных детей, что свидетельствует об их защитной функции в отношении колонизационной резистентности кишечника. Необходимо отметить, что у большей части микроорганизмов - представителей условно-патогенной микрофлоры кишечника детей с РеА отмечается увеличение способности к БПО. Так, у штаммов клебсиелл, выделенных от детей с РеА, способность к БПО в 8 раз выше, чем у клебсиелл, выделенных от здоровых детей. Способность к БПО у штаммов лактозонегативной кишечной палочки и грибов рода Candida, выделенных от детей с РеА, оказалась в 5 раз выше относительно группы сравнения.

Таблица 4.1.3 - Биопленкообразование микросимбионтов у детей с острым и хроническим течением реактивного артрита и условно здоровых детей

Группы микроорганизмов БПО (у.е.)

РеА острый (n=21) РеА хронический (n=13) Условно здоровые дети (n=25)

Факультативно-анаэробные Escherichia coli (lac+) 2,3 ± 0,15* 2,6 ± 0,3* 0,7 ± 0,2

Escherichia coli (lac - ) 4,0 ± 0,18* 4,5 ± 0,4* 0,8 ± 0,1

Klebsiella spp. 9,35 ± 0,21* 9,0 ± 0,3* 1,14 ± 0,4

Citrobacter spp. 4,76 ± 0,2* 4,5 ± 0,3* 3,33 ± 0,6

Enterobacter spp. 4,8 ± 0,2 5,2 ± 0,3 5,0 ± 0,4

Cronobacter spp. 12,1 ± 0,1 - -

Bacillus spp. 5,2 ± 0,9 - -

Staphylococcus spp. 5,2 ± 0,9* 4,6 ± 0,9* 2,64 ± 0,1

Enterococcus spp. 5,6 ± 0,6* 6,1 ± 0,6* 3,0 ± 0,6

Candida spp. 5,2 ± 0,9* 6,0 ± 0,9* 0,96 ± 0,2

Облигатно-анаэробные Bifidobacterium spp. 11,03 ± 0,1* 10,2 ± 0,3* 18,0 ± 0,25

Lactobacillus spp. 8,07 ± 0,2* 7,7 ± 0,5* 5,2 ± 0,4

Clostridium spp. 9,5 ± 0,8* 9,0 ± 0,9* 3,3 ± 0,1

Bacteroides spp. 9,6 ± 0,8* 9,9 ± 0,9* 6,6 ± 0,2

Actinomyces spp. 0,31 ± 0,6* 0,4 ± 0,9* 2,5 ± 0,1

Propionibacterium spp. 1,41 ± 0,9* 1,2 ± 0,9* 2,8 ± 0,2

Примечание: * - критерий достоверности показателей между больными и здоровыми детьми; ** - между острым и хроническим течением артрита, (р<0,05);

Показатель БПО лактозопозитивной кишечной палочки и клостридий, выделенных у больных артритом, в 3 раза превышает данный показатель по сравнению со здоровыми детьми. У штаммов бактероидов, цитробактера и стафилококка отмечается повышение способности к БПО на 30-50% относительно группы сравнения. Кроме того, у пациентов с РеА были выделены штаммы кронобактера и буркхолдерии, которые не высевались у здоровых

детей. При этом, данные микроорганизмы обладали также высокой способностью к БПО (12,1± 0,1 у.е и 5,2 ± 0,9 у.е.) соответственно. При сравнительном анализе уровня БПО кишечных микросимбионтов, выделенных у детей с острым и хроническим РеА, достоверных отличий уровня данного показателя между данными группами не выявлено. В то же время отмечается общая тенденция к повышению уровня БПО у условно-патогенных кишечных микросимбионтов, выделенных у детей с хроническим артритом: Escherichia coli (lac+), Escherichia coli (lac - ), Enterobacter spp., Enterococcus spp., Candida spp., Bacteroides spp., Actinomyces spp. и напротив, к снижению уровня БПО у представителей нормальной микрофлоры (Bifidobacterium spp., Lactobacillus spp., Propionibacterium spp.). У больных артритом выявлено нарушение мик-росимбиотических связей между микроорганизмами - представителями нормальной и условно-патогенной микрофлоры, что проявляется количественными и качественными нарушениями кишечного микросимбиоценоза. Одним из важных показателей межмикробного взаимодействия является био-пленкообразование, которое рассматривается как форма персистенции (выживания) патогенов и нормофлоры [9]. При анализе способности к биоплен-кообразованию (БПО) микроорганизмов, выделенных при обследовании на дисбиоз кишечника, у детей с РеА выявлено достоверное преобладание уровня БПО условно патогенных микросимбионтов: лактозопозитивной и лактозонегативной E. coli, клебсиелл, цитробактера, энтеробактера, стафилококков и грибов рода Candida, отмечается значительное превышение уровня БПО у клостридий и бактероидов. Напротив, обращает на себя внимание факт снижения уровня БПО микроорганизмов, относящихся к нормальной микрофлоре, прежде всего, бифидобактерий, а также пропионибактерий и актиномицетов. При этом способность к БПО лактобактерий характеризуется более высокими показателями в сравнении со здоровыми детьми. Этот феномен свидетельствует о защитных функциях лактобацилл и, в тоже время, о возможном условно патогенном потенциале этого рода микроорганизмов.

4.2 Способность кишечных микросимбионтов изменять уровень иммунорегуляторных пептидов (антипептидная активность)

Учитывая взаимодействие микробиоты с эффекторными молекулами и клетками иммунной системы с последующим включением сигнальных путей регуляции иммунного гомеостаза [75], мы провели сравнительный анализ способности экзометаболитов микросимбионтов, выделенных от детей с РеА и здоровых, изменять концентрацию провоспалительных цитокинов (TNF-a, IFN-y, IL-6) и противовоспалительного цитокина (IL-10) после контакта in vitro с рекомбинантными цитокинами (антипептидная активность - АПА).

Результаты исследования АПА микросимбионтов в отношении TNF-a представлены на рисунке 4.2.1. В соответствии с представленными на рисунке данными необходимо отметить, что у микроорганизмов-комменсалов: Citrobacter spp., Staphylococcus spp. и грибов рода Candida, выделенных от детей с острым и хроническим течением РеА, достоверно выше уровень АПА в отношении TNF-a в сравнении с уровнем АПА экзометаболитов этих же микроорганизмов в группе здоровых детей.

В тоже время, уровень АПА в отношении TNF-a у представителей нормобиоты: Bifidobacterium spp., выделенных от больных детей, достоверно не отличался от уровня АПА этих микроорганизмов, выделенных от здоровых детей. У экзометаболитов Lactodacillus spp. отмечалось снижение уровня АПА при остром и при хроническом течении РеА, в отличие от здоровых, но при хроническом течении уровень АПА в отношении данного цитокина был выше чем в группе с острым течением.

Уровень АПА экзометаболитов Escherichia coli (lac-)достоверно выше определялся в группе детей с хроническим течением как относительно здоровых детей, так и в сравнении с детьми с острым течением болезни.

z is s

X

о

5 о z i-

o

a <

С

<

J

x

о -

о

100 90 80 70 60 50 40 30 20 10

1

** *

ш

** *

ш

Bifidobacterium Lactobacillus Escherichia coli Escherichia coli Staphulococcus Citrobacter spp. Candida spp. spp. spp. Iac+ lac- spp.

□ условно-здоровые дети Ндети с острым течением РеА

1дети с хроническим течением РеА

Рисунок 4.2.1 - Сравнительный анализ уровня АПА экзометаболитов микросимбионтов толстого кишечника, выделенных у детей с РеА и здоровых, в отношении TNF-a.

Примечание: * - наличие достоверных различий между показателями АПА у микросимбионтов, изолированных от детей с РеА в сравнении со здоровыми, р < 0,05; ** - наличие достоверных различий между показателями АПА у микросимбионтов, изолированных от детей с хроническим РеА в сравнении с острым течением РеА, р < 0,05

Результаты влияния экзометаболитов микросимбионтов толстого кишечника, выделенных у детей с РеА и здоровых детей, на уровень АПА в отношении Ш№у представлены на рисунке 4.2.2.

Рис. 4.2.2 - Сравнительный анализ уровня АПА экзометаболитов микросимбионтов толстого кишечника, выделенных у детей с РеА и здоровых, в отношении INF-y

Примечание: * - наличие достоверных различий между показателями АПА у микросимбионтов, изолированных от детей с РеА в сравнении со здоровыми, р < 0,05

Представленные на рисунке данные демонстрируют, что у условно-патогенных микроорганизмов: Citrobacter spp., Staphylococcus spp. и грибов рода Candida, выделенных от детей с острым и хроническим реактивным артритом, значительно выше уровень АПА в отношении IFN-y относительно данных показателей у здоровых. В тоже время, у экзометаболитов представителей нормальной микрофлоры: Bifidobacterium spp. и E.coli (lac+), выделенных от больных детей, значительно ниже уровень АПА к данному цитокину относительно группы сравнения. Представляет интерес факт повышения АПА в отношении IFN-y экзометаболитов лактобактерий, выделенных у детей с острым и хроническим РеА.

Данные об экспрессии уровня АПА в отношении провоспалительного цитокина IL-6 у экзометаболитов кишечных микросимбионтов, выделенных у детей с РеА и здоровых представлены на рисунке 4.2.3. Исходя из представленных на рисунке данных нужно отметить, что уровень АПА у экзометаболитов бактерий: Staphylococcus spp. и Lactobacterium spp., выделенных у детей с острм и хроническим течением РеА, выше в сравнении с уровнем АПА в отношении данного цитокина у здоровых детей; в то время как у экзометаболитов Bifidobacterium spp. и E.coli (lac+), выделенных от больных детей, уровень АПА в отношении IL-6 ниже в сравнении с данным показателем у здоровых.

j 100 -——-

Bifidobacterium Lactobacillus Escherichia coli Escherichia coli Staphulococcus Citrobacter spp. Candida spp. spp. spp. Iac+ lac- spp.

□ условно-здоровые дети Ндети с острым течением РеА Идети с хроническим течением РеА

Рисунок 4.2.3 - Сравнительный анализ уровня АПА экзометаболитов микросимбионтов толстого кишечника, выделенных у детей с РеА и здоровых, в отношении 1Ь-6. Примечание: * - наличие достоверных различий между показателями АПА у микросимбионтов, изолированных от детей с РеА в сравнении со здоровыми, р < 0,05; ** - достоверность различий между показателями детей с хроничским РеА в сравнении с острым течением РеА, р < 0,05

Данные о влиянии экзометаболитов кишечных микросимбионтов на уровень противовоспалительного цитокина IL-10 представлены на рисунке 4.2.4. В соответствии с данными, представленными на рисунке видно, что у экзометаболитов бактерий Citrobacter spp. и Lactobacterium spp., выделенных у детей с РеА, уровень АПА в отношении IL-Ю.выше, чем у здоровых детей. Напротив, у экзометаболитов Staphylococcus spp. и E.coli (lac+), выделенных от детей с острым и хроническим течением артрита, достоверно ниже уровень АПА в отношении данного противовоспалительного цитокина.

100

Bifidobacterium Lactobacillus Escherichia coli Escherichia coli Staphulococcus Citrobacter spp. Candida spp. spp. spp. Iac+ lac- spp.

□ условно-здоровые дети Ндети с острым течением РеА

1дети с хроническим течением РеА

Рисунок 4.2.4 - Сравнительный анализ уровня АПА экзометаболитов микросимбионтов толстого кишечника, выделенных у детей с РеА и здоровых, в отношении ГЬ-10

Примечание: * - наличие достоверных различий между показателями АПА у микросимбионтов, изолированных от детей с РеА в сравнении со здоровыми, р < 0,05; ** - наличие достоверных различий между показателями АПА у микросимбионтов, изолированных от детей с хроническим РеА в сравнении с острым течением РеА, р < 0,05

Анализ полученных нами результатов свидетельствует, что независимо

от источника выделения (здоровые, дети с РеА), экзометаболиты бифидобак-терий снижали уровень провоспалительных цитокинов (особенно в отношении IFN-y), что в большей степени характерно для штаммов бифидобактерий, выделенных от здоровых детей. В тоже время, у представителей условно-патогенной микрофлоры (лактобактерий, стафилококков, цитробактера и грибов рода Candida), изолированных из фекалий детей с артритом, выявлено увеличение значений АПА для большинства исследуемых флогогенных ци-токинов в сравнении с данными показателями у здоровых детей. В отношении противовоспалительного цитокина IL-10 выявлено достоверное повышение уровня АПА у копроштаммов лактобактерий и цитробактера, выделенных от больных с острым и хроническим течением, при хроническом течении отмечались более низкие уровни АПА изучаемых копроштаммов в сравнении с острым течением РеА. Стафилококки характеризовались более низкими значениями АПА в отношении IL-10 у штаммов, выделенных от детей с острым и хроническим течением артрита в сравнении со здоровыми детьми. Особое внимание следует обратить на феномен влиния представителей нормобиоты: бифидобактерий, которые, независимо от источника выделения, изменяли содержание флогогенных цитокинов, сдвигая баланс в сторону противоспалительного потенциала, сохраняя стабильность уровня IL-10, что указывает на достаточно высокие иммунорегуляторные способности бифидобактерий.

Результаты анализа уровня АПА экзометаболитов кишечных микросимбионтов, выделенных от детей с РеА, в отношении про- и противовоспалительных цитокинов, показали, что наряду с другими факторами, микроорганизмы кишечной микробиоты участвуют в регуляции локального цитоки-нового баланса [75,86]. Этот феномен позволяет рассматривать АПА копро-штаммов микросимбионтов, выделенных у детей с РеА, в качестве маркера данного заболевания.

Проведенные исследования свидетельствуют о существенном вкладе микробиоты кишечника в развитии РеА. Использование метода сокультиви-

рования экзометаболитов бактерий и грибов с рекомбинантными цитокинами позволило количественно оценить суммарную способность компонентов, входящих в состав экзометаболитов (пептиды, белки, ферменты, кислоты, полисахариды), изменять концентрацию цитокинов в среде и, вероятно, в окружении дендритных клеток, участвующих в инициальном «сигналинге» регуляции иммунитета [75]. Формирование же определенного цитокинового баланса в кишечнике человека под влиянием микроорганизмов создает соответствующее микроокружение как для кишечной микрофлоры, так и для эн-тероцитов, выполняющих важнейшую роль в колонизационной резистентности. Выявленная способность экзометаболитов штаммов бифидобактерий, выделенных как у здоровых, так и больных детей, измененять в условиях со-культивирования концентрацию цитокинов, оппозитных по регуляции воспаления, свидетельствует о возможности опосредованного влияния бифидобак-терий на дендритные клетки и процессы реализации эффекторного звена врожденного и адаптивного иммунитета за счет формирования оптимального цитокинового баланса. Выявленная в нашей работе способность экзометабо-литов кишечных микросимбионтов значительно изменять уровень АПА в отношении как противовоспалительного цитокина ^-10, так и провоспали-тельных цитокинов, подтверждает существенное значение влияния их метаболитов на локальный и системный иммунный гомеостаз [9] и опосредованное участие в патогенезе артрита.

& & &

Таким образом, необходимо отметить, что микросимбиоценоз детей с РеА сопровождается увеличением уровня персистентных свойств ассоциативных микроорганизмов (антилизоцимной и антилактоферриновой активностей, способности к БПО), выделенных из кишечника детей с артритом, с одной стороны, на фоне снижения изучаемых свойств у представителей нормо-биоты - бифидобактерий, с другой стороны. Изучение персистентных свойств кишечных микросимбионтов позволило определить микросимбиоти-ческие взаимоотношения между представителями нормальной микрофлоры

(бифидобактериями) и микроорганизмами - комменсалами (грампозитивны-ми, грамнегативными энтеробактериями, грибами рода Candida, клостридия-ми и бактероидами), установить роль АЛА, АЛфА и БПО в качестве маркеров, участвующих в формировании артритогенного потенциала.

Установлена способность экзометаболитов кишечных микросимбионтов, выделенных от детей с РеА, изменять уровень про- и противовоспалительных цитокинов (антипептидная активность), способствуя усилению про-воспалительного потенциала цитокинового баланса.. Данный феномен позволяет рассматривать АПА как один из маркеров, отвечающих за усиление артритогенного потенциала.

Результаты исследования, представленные в данной главе, опубликованы:

1. Челпаченко О.Е. Роль межмикробных взаимодействий Candida spp. при патологии опорно-двигательного аппарата у детей. / О.Е. Челпаченко, О.В.Бухарин, Н.Б.Перунова, Е.В.Иванова, Л.П.Федотова.// Проблемы медицинской микологии. - 2013. - Т.15. - №3. - С.14-17.

2. Челпаченко О.Е. Антилизоцимная активность и способность к био-пленкообразованию Candida spp., выделенных из фекалий у детей с реактивным артритом./ О.Е.Челпаченко, Е.И.Данилова, Т.А.Бондаренко, О.И. Сидорова, Л.П.Федотова.// Проблемы медицинской микологии. - 2015. - Т.17. -№2. - С.147-148.

3. Бухарин О.В. Микросимбиоценоз кишечника у детей с реактивным артритом. / О.В. Бухарин, О.Е. Челпаченко, Е.И. Данилова, И.Н. Чайникова, Н.Б. Перунова, Е.В. Иванова, И.А. Никифоров, Л.П. Федотова, Т.А. Бонда-ренко, А.В. Салгина //Журн. Микробиология, эпидемиология и иммунология. - 2016. - №6. - С.41-48.

4. Челпаченко О.Е. Клинический случай артрита кандидозной этиологии у ребенка. / О.Е.Челпаченко, О.В.Бухарин, Е.И.Данилова, Л.П.Федотова, Н.Б. Перунова, Е.В.Иванова, А.К.Комаров, Т.Н.Игнатова. Вопросы практической педиатрии. - 2017. - Т.12. - №3. - С.77-82.

ГЛАВА 5. ХАРАКТЕРИСТИКА ВРОЖДЕННЫХ ФАКТОРОВ ЛОКАЛЬНОЙ АНТИМИКРОБНОЙ ЗАЩИТЫ КИШЕЧНОГО БИОТОПА У ДЕТЕЙ С РЕАКТИВНЫМ АРТРИТОМ 5.1. Содержание про- и противовоспалительных цитокинов, лакто-феррина и лизоцима в копрофильтратах больных реактивным артритом и здоровых детей Учитывая, что кишечный микросимбиоценоз занимает важное место в современной патогенетической концепции реактивного артрита, а также непосредственное и постоянное взаимодействие, процессы взаимной адаптации между кишечными микросимбионтами и иммунорегуляторными эф-фекторными пептидами, нам представлялось целесообразным изучение состояния локальной антимикробной защиты кишечного биотопа, играющей важную роль в обеспечении нормальной колонизационной резистентности кишечника [83, 86].

Для решения данной задачи мы провели исследования по определению в копрофильтратах детей с РеА уровня провоспалительных цитокинов (Ш№ у, TNF-a, 1Ь-6), противовоспалительного цитокина ГЬ-10, а также факторов врожденного иммунитета - лактоферрина и лизоцима. Сравнительный анализ результатов исследования указанных иммунологических показателей в ко-профильтратах детей с РеА и здоровых детей в зависимости от состояния кишечного микросимбиоценоза (эубиоз или наличие дисбиоза I, II, или III степени) представлен в таблице 5.1.1.

В соответствии с представленными данными следует, что состояние эубиоза как у детей с РеА, так и у здоровых детей сопровождается низкими -нулевыми значениями провоспалительных и противовоспалительного цито-кинов, а также лактоферрина и лизоцима. Напротив, при нарастании тяжести кищечного дисбиоза от !-ой до Ш-ей степени отмечается достоверное повышение уровня провоспалительных (ШК-у, Т№-а, 1Ь-6) и противовоспалительного^-10) цитокинов, лактоферрина и лизоцима в копрофильтратах у детей обеих групп.

Таблица 5.1.1 - Показатели Ш№у, ТЫБ-а, IL-6, IL-10, лактоферрина и лизоцима в копрофильтратах больных РеА и здоровых детей в зависимости

от состояния кишечного микробиоценоза

Больные РеА Группа сравнения

Показатель Эубиоз Дисбиоз I (М±м) Дисбиоз II (М±м) Дисбиоз III (М±м) Эубиоз (М±м) Дисбиоз I (М±м) Дисбиоз П-Ш (М±м)

(пг/мл) 0 5,56 *Э [4,53-6,59] 10,32*1 [5,24-15,4] 1741*1 [7,42-27,5] 0 4,02*Э [2,87-5,24] 10,24*Э [5,08-11,2]

Т№-а (пг/мл) 0 1,75*Э [0,3-3,2] 3,4*1 [0,66-6,19] 2,2*Э [0,67-3,7] 0 0,85*Э [0,35-2,8] 1,5*Э [0,62-3,4]

ГЬ-6 (пг/мл) 0 0 4,0*Э [0,0-4,5] 5,7*Э [0,0-6,1] 0 0 1,2*Э [0-1,3]

IL-10 (пг/мл) 0 0 3,44*Э [2,37-4,52] 4,81*Э [2,64-5,61] 0 0 3,91*Э [2,43-5,18]

479,0*Э

Лактоферрин (нг/мл) 0 343,0*Э [141,3585,3] 925,0*Э [411,01427,0] 2315,0*1 [1335,04929,0] 0 239,0*Э [141,2585,3] [277,01427,0] -1913,0*1 [13351929]

Лизоцим 0,65 1,78*Э 2,1*Э 3,18*Э 1,4 1,55 1,55

(мкг/мл) [0,0-0,8] [1,3-2,35] [1,8-5,0] [1,84-5,0] [0,0- 1,55] [1,42-1,81] [1,19-2,02] 3,13*Э1 [1,84-5,0]

Примечание: * - критерий достоверности различий показателей при р<0,05; *Э отличие

данного показателя от аналогичного при эубиозе внутри данной группы; *1 - отличие дан-

ного показателя от аналогичного при дисбиозе I- ой степени

В тоже время, у детей с артритом отмечается тенденция к более выраженному росту этих показателей в сравнении с аналогичными показателями в группе здоровых детей. Наиболее значимые, достоверные различия среди исследуемых показателей выявлены у лактоферрина и лизоцима. В совокупности с представленными нами в главе 3 данными, демонстрирующими нарастание персистентных свойств кишечных микросимбионтов, а именно, антилактоферриновой и антилизоцимной активности микроорганизмов - ас-социантов на фоне снижения этих свойств у микроорганизмов, составляющих доминантную микрофлору, а также микросимбионтов - представителей нормальной микрофлоры у детей с артритом, очевидно, что показатели уровня ЛФ и лизоцима копрофильтратов могут служить маркерами локальной антимикробной защиты кишечного биотопа больных РеА.

Для подтверждения этого положения мы провели анализ показателей лактоферрина и лизоцима в копрофильтратах детей с РеА в сравнении со здоровыми детьми независимо от степени дисбиотических нарушений. Полученные данные представлены в таблице 5.1.2.

Таблица 5.1.2 - Показатели локальных факторов антимикробной защиты (лактоферрина и лизоцима) в копрофильтратах детей с РеА в сравнении со здоровыми детьми независимо от степени дисбиоза

Показатели Категориям, детей Лизоцим (мкг/мл) Лактоферрин (нг/мл)

Эубиоз Дисбиоз Эубиоз Дисбиоз

РеА (п=34) 0,65* [0,1 - 0,8] 3,18* [1,7 - 5,0] 0 1885,0* [1820,0 - 5636,0]

Группа сравнения (п=25) 1,4 [1,3 - 1,5] 1,4 [1,3 - 1,5] 0 429,0* [429,0 - 1796,0]

Примечание: * - критерий достоверность различий показателей при р<0,05

В соответствии с представленными данными, в копрофильтратах детей, у которых состояние микробиоценоза кишечника по данным бактериологи-

ческого исследования оценивалось как эубиоз, уровень ЛФ определялся на нулевом значении также как в группе сравнения у здоровых детей. У детей с РеА, имеющих дисбиоз кишечника, уровень ЛФ оказался в 4 раза выше, чем у здоровых детей. Содержание лизоцима в копрофильтратах детей с артритом, состояние кишечного микробиоценоза которых характеризовалось эубиозом, было в 2 раза ниже, чем у здоровых детей. Напротив, у детей с РеА с дисбиозом уровень лизоцима в 2,5 раза выше относительно группы сравнения.

Полученные данные свидетельствуют о важной роли микробного фактора, в первую очередь, кишечного микросимбиоценоза в развитии реактивного артрита. Подтверждается значение цитокинов и локальных антимикробных факторов в развитии артрита, что в свою очередь, позволяет использовать ряд исследуемых показателей в качестве возможных клинических маркеров. Проведенные исследования показали связь между уровнем ЛФ и лизо-цима копрофильтратов с тяжестью микробиоценотических нарушений кишечной микрофлоры и возможность использования этих показателей в качестве маркеров локальной антимикробной защиты кишечного биотопа у детей с артритом, что согласуется с данными Ивановой Е.В. с соавт.[18]. В нашей работе выявлено, что у детей с РеА уровень ЛФ и лизоцима ассоциирован как с тяжестью кишечного дисбиоза, так и с наличием артрита. Таким образом, представляется целесообразным определение лактоферрина и лизоцима в качестве критериев локальной антимикробной защиты кишечного биотопа у больных реактивным артритом, использования ЛФ и лизоцима в качестве факторов определения активности воспалительного процесса у больных РеА, для прогнозирования течения артрита и контроля эффективности проводимой противовоспалительной терапии.

5.2. Содержание Н^-у, TNF-a, 1Ь-6, 1Ь-10, лактоферрина и лизоцима в копрофильтратах больных с острым и хроническим течением

реактивного артрита

Для уточнения возможности использования исследуемых нами имму-норегуляторных пептидов и факторов локальной антимикробной защиты в копрофильтратах детей с РеА в качестве маркеров прогнозирования исхода реактивного артрита мы провели сравнительный анализ показателей 1Ь-6, ШК-у, ТЫБ-а, 1Ь-10, ЛФ и лизоцима в копрофильтратах детей с РеА в зависимости от клинического варианта течения артрита. Результаты представлены в таблице 5.2.1.

Таблица 5.2.1 - Показатели уровня 1Ь-6, ИК-у, ТЫР-а, 1Ь-10, лактоферрина и лизоцима в копрофильтратах детей с острым и хроническим течением РеА

Течение РеА Показатели Острое течение (п=21) Хроническое течение (п=13)

1Ь-6 (пг/мл) 0,675 [0,0 - 5,7] 1,3 [0,0 - 4,4]

ШК-у (пг/мл) 0,18 [0,0 - 62,8] 1,3 [0,0 - 9,0]

ТЫБ-а (пг/мл) 1,02 [0,0 - 5,2] 1,98 [0,0 - 5,9]

1Ь-10 (пг/мл) 0,5* [0,0 - 5,0] 272,6* [64,9 - 400,0]

ЛФ (нг/мл) 1127,0 [58,0 - 5636,0] 1480,0 [233,0 - 6613,0]

Лизоцим (мкг/мл) 1,93 [0,65 - 5,0] 2,73 [0,0 - 5,0]

Примечание: * - критерий достоверность различий показателей при р<0,05

Представленные в таблице 5.2.1. данные показали, что у детей с хроническим течением РеА отмечается отчетливая тенденция к повышению уровня в копрофильтратах провоспалительных цитокинов (1Ь-6, ШК-у, ТОТ-а), достоверное увеличение уровня противовоспалительного цитокина (1Ь-10), а также тенденция к росту факторов локальной защиты кишечного биотопа

(ЛФ и лизоцима).

Для определения клинической значимости исследуемых в копрофиль-тратах детей с РеА показателей врожденных факторов локальной антимикробной защиты кишечного биотопа проведен дискриминантный анализ, результаты которого приведены в таблице 5.2.2.

Таблица 5.2.2 - Матрица стандартизованных коэффициентов канонических переменных дискриминантных корней по показателям врожденных факторов локальной антимикробной защиты кишечного биотопа в копро-фильтратах

Анализ показателей копрофильтатов

ПОКАЗАТЕЛИ ROOT 1 ROOT 2 ROOT 3 ROOT 4

IL-10 1,09 -0,14 0,03 0,14

IL-6 0,55 -0,04 -0,34 -0,03

INF-y 0,12 0,85 -0,02 0,67

ЛФ -0,02 0,54 0,92 -0,16

TNF-a -0,08 0,74 -0,32 -0,50

Собственное значение (Eigenvalue) 4,31 0,85 0,15 0,02

Кумулятивная доля объясненной дисперсии 0,81 0,97 1,00 1,00

Согласно таблице 5.2.2 в результате дискриминантного анализа исследуемых показателей копрофильтратов определились две дискриминантные функции ^ООТ1 и ROOT2), объясняющие 97% дисперсии выборки. При этом на первую функцию приходится более 80%, а на вторую - 17% суммарной дисперсии выборки, соответственно.

Ранжированная по величине факторных нагрузок структура дискрими-нантных корней этих функций представляется следующим образом:

ЯООТ1: (-0,08) ЮТ-а (-0,02)ЛФ (+0,12) ШБ-у (+0,55) 1Ь-6 (+1,09) 1Ь-10 ЯООТ2: (-0,14)!Ь-10 (-0,03)!Ь-6 (+0,54)ЛФ (+0,74)ШР-а

Количественное исследование дискриминантных корней позволило выявить особенности изучаемых параметров (рисунок 5.2.1). 2.5

Острое течение Хроническое течение

КЛИНИЧЕСКИЕ ВАРИАНТЫ РЕАКТИВНОГО АРТРИТА

фактор 1: 0.8 ЮТ-а + 0.86 ЛФ + 0.9 1Ь-10 Рисунок 5.2.1 - Результаты дискриминантного анализа показателей врожденных факторов локальной антимикробной защиты кишечного биотопа в копрофильтратах детей с острым и хроническим течением РеА

Установлено, что все значения ЯООТ1 положительны и связаны исключительно со случаями хронического течения реактивного артрита. Этот феномен, в соответствии с приведенной выше факторной структурой корня, демонстрирует, что хроническое течение болезни связано с повышением уровня в копрофильтратах 1Ь-10 и 1Ь- 6, пропорционально их факторным нагрузкам, вне зависимости от степени выраженности кишечного дисбиоза.

Самые высокие значения ЯООТ2 связаны с третьей, и в меньшей мере, со второй степенью дисбиоза кишечника у детей с острым течением реактивного артрита. Случаи эубиоза и первой степени дисбиоза не отличались друг от друга по значению дискриминантного корня ЯООТ2. Ведущими маркера-

ми острого течения РеА оказались лактоферрин и TNF-a.

Таким образом, клинико-микробиологическое и иммунологическое обследование детей с РеА и дискриминантный анализ изучаемых показателей локальной антимикробной защиты и цитокинов копрофильтратов позволили выделить достоверно значимые факторы, позволяющие дифференцировать клинические варианты течения реактивного артрита. Острое течение РеА ассоциировалось с уровнем в копрофильтратах лактоферрина и TNF-a, хроническое течение - с показателями IL-10 и IL- 6, что свидетельствует о целесообразности использования этих факторов в качестве маркеров прогнозирования исхода артрита (выздоровление или хронизация).

***

Таким образом, выявлены изменения уровня ряда врожденных факторов локальной антимикробной защиты кишечного биотопа у детей с РеА, а именно: достоверное повышение уровня лактоферрина и лизоцима, а также провоспалительных (TNF-a, INF-y, IL-6 ) и противовоспалительного (IL-10) цитокина в копрофильтратах больных реактивным артритом в сравнении с условно здоровыми детьми.

Результаты проведенного дискриминантного анализа показали связь таких показателей как уровень TNF-a, IL-10 и лактоферрин в копро-фильтратах больных с клиническими параметрами (с острым и хроническим вариантами течения РеА), что определяет возможность их использования для прогнозирования клинического течения и исхода реактивного артрита у больных.

Результаты исследования, представленные в этой главе, опубликованы:

1. Челпаченко О.Е. Локальные антимикробные факторы у детей с реактивным артритом./ О.Е.Челпаченко, Н.Б. Перунова, Е.В. Иванова, Е.И. Данилова, Т.А. Бондаренко, А.В. Салгина, Л.П. Федотова.// Российский иммунологический журнал. - 2016. - Т.10(19). - №2(1). - С.372-374.

2. Данилова Е.И. Клиническое значение локальных антимикробных

факторов и цитокинов у детей с реактивным артритом. / Е.И. Данилова, И.А. Никифоров, О.Е. Челпаченко, Л.П. Федотова, Е.В. Иванова, Н.Б. Перунова, Т.А. Бондаренко. // Российский иммунологический журнал. - 2017. - Т.11 (20). - №3. - С.367-369.

3. Челпаченко О.Е. Роль некоторых цитокинов крови и показателей врожденного иммунитета для прогнозирования исхода реактивного артрита. / О.Е. Челпаченко, Е.И. Данилова, И.А. Никифоров, Л.П. Федотова. // Российский иммунологический журнал. - 2017. - Т.11 (20). - №3. - С.559-561.

ГЛАВА 6. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ ПРОГНОЗА КЛИНИЧЕСКОГО ИСХОДА РЕАКТИВНОГО АРТРИТА У ДЕТЕЙ

6.1. Выявление значимых микробиологических показателей и их использование в разработке способа прогнозирования клинического варианта течения и исхода реактивного артрита у детей

Неоспоримым представляется факт, свидетельствующий о важной роли качественной и количественной характеристики микроорганизмов, выполняющих роль триггерной инфекции, в определении исхода артрита.

Известно, что важным свойством, обеспечивающим способность патогенных и условно-патогенных микроорганизмов к выживанию и персистен-ции, является репродуктивная функция, включающая рост и размножение микроорганизмов. Именно эти показатели являются главными критериями эффективности антибактериальной терапии, направленной против роста и размножения микробной клетки [9].

В тоже время, главной целью клиницистов при лечении реактивных артритов является ликвидация причинного фактора - инфекционного агента. Всем пациентам с РеА проводится антибактериальная терапия с учетом соответствующего триггерного агента. Учитывая выше изложенное, мы провели микробиологические исследования, направленные на поиск ключевых микробиологических маркеров, позволяющих прогнозировать характер клинического течения, тяжесть и исход (выздоровление или рецидивирующее, хроническое течение) реактивного артрита, акцентируя при этом внимание на оценку состояния кишечного микросимбиоценоза у детей с различными клиническими вариантами РеА. Проведенный четырехлетний клинико-микробиологический мониторинг 34-х детей в возрасте от 3-х до 17 лет с реактивным артритом позволил сформировать две репрезентативные группы пациентов в зависимости от клинического течения и исхода заболевания: первую группу составили 21 человек с благоприятным исходом (выздоровление); вторую группу - 13 больных с неблагоприятным исходом (рецидивирующее течение, переход в хроническую форму).

Для статистического анализа были отобраны ряд микробиологических показателей, а также показатели, свидетельствующие об активности воспалительного процесса: повышение уровня С-реактивного белка (CRP) и скорости оседания эритроцитов.

Из микробиологических показателей использовались:

- Наличие дисбиотических нарушений кишечного микросимбиоценоза, причем, конкретно мы отмечали частоту встречаемости более тяжелых форм кишечного дисбиоза II-III степени у детей с различными клиническими вариантами РеА. Основанием данного решения стали указания на роль нарушений кишечного микросимбиоценоза и его связи с тяжестью артрита как по данным литературных источников, так и в соответствии с нашими исследованиями, описанными в 3-ей и 5-ой главах работы.

- Выявление гиперколонизации дрожжеподобных грибов при исследовании на дисбиоз кишечника мы выделили как самостоятельный показатель ввиду установленных ранее данных о связи гиперколонизации кишечника дрожжеподобными грибами и патологии опорно-двигательного аппарата у детей [10]. Этот феномен подтверждают и наши исследования, свидетельствующие о достоверно высокой частоте выделения Candida spp., значительном преобладании уровня ПМО, а также о наличии у грибов рода Candida, выделенных от больных РеА, более высокого патогенного, персистентного потенциала (АЛА, АлФА, способность к БПО) в сравнении с данными показателями в группе условно здоровых детей.

- Положительный результат бактериоциногенного теста. Наряду с классическим бактериологическим исследованием на дисбиоз, мы использовали БЦ-тест для определения и подтверждения дисбиотических нарушений кишечного микросимбиоценоза различной степени выраженности у детей с РеА. Этот маркер достаточно широко используется в практической работе при различных заболеваниях человека для отражения состояния микробного ценоза [16].

- Факт проведенной антибактериальной терапии по поводу артрита.

Этот показатель имеет особое значение, так как практические врачи в настоящее время считают, что прогноз течения реактивного артрита, в первую очередь, связан с эффективностью проводимой антибактериальной терапии [3, 25].

- Количество антибиотикорезистентных копроштаммов микроорганизмов на среде с антибактериальным препаратом, использованным в лечении конкретного больного РеА. Имеется в виду определение количества колоний микроорганизмов при посеве разведения фекалий 10-5, выделенных от больных артритом, на плотную питательную среду (1,5% ГРМ-агар), в которую предварительно вводится антибактериальный препарат, который использовался в лечении данного больного, в минимальной подавляющей концентрации (МПК) в диапазоне устойчивости. Фактически мы получаем информацию об условном количестве антибиотико-резистентных копроштаммов микроорганизмов, выросших наряду с другими представителями кишечного микробиоценоза после проведенной антибактериальной терапии больного. Важное значение данного показателя связано с тем, что он ассоциирует непосредственно с решением вопроса об эффективности проводимой антибактериальной терапии больных РеА, определяющей, в конечном счете, исход артрита. У большинства больных (80-90%) РеА заканчивается полным выздоровлением. Однако, у части пациентов эпизоды РеА рецидивируют и в дальнейшем появляются признаки спондилоартрита, особенно у HLA-B27 позитивных больных [26, 70]. Переход острого артрита в хронический наблюдается у 20-50% больных [17].

Это положение стало для нас отправной точкой в проведении поиска микробиологических маркеров, определяющих характер течения РеА и исход заболевания.

Проведенный дискриминантный анализ выявил достоверно значимые (критерий достоверности p < 0,05* и p < 0,01**) микробиологические тесты:

- наличие дисбиоза кишечника (П-ой-Ш-ей степени) и гиперколонизации дрожжеподобных грибов. Грибы рода Candida в количестве более 103

КОЕ/г чаще высевались у детей с неблагоприятным исходом (69,2±7,9% против 47,6±8,5% у больных с острым течением и благоприятным исходом артрита, p < 0,05);

- положительный результат бактериоциногенного теста чаще выявлялся у детей с неблагоприятным исходом РеА (61,5±8,3% против 23,8±7,3% у детей с острым течением и благоприятным исходом артрита, p < 0,05);

- факт проведенной антибактериальной терапии. Этот показатель оказался выше у детей с благоприятным исходом артрита (62,0±8,3%) в сравнении с пациентами с неблагоприятным исходом (38,5±8,3%, p < 0,05).

Наибольшей степенью достоверности отличался критерий, определяющий исход артрита - количество антибиотикорезистентных копроштаммов микроорганизмов на среде с антибактериальным препаратом, использованным в лечении конкретного больного РеА, так как количество колоний микроорганизмов на среде с антибактериальным препаратом составляло 5000 КОЕ/ г и более у подавляющего большинства детей с неблагоприятным исходом (хронизацией, рецидивированием) артрита (13 пациентов из 13, т.е. 100%), в то время как у детей с благоприятным исходом (выздоровлением) количество антибиотикорезистентных копроштаммов было на уровне менее 5000 КОЕ/ г лишь у 6 детей из 21 (28,5±7,7%; p < 0,01).

Полученные результаты были статистически обработаны с помощью программного обеспечения STATISTICA 10 (модуль Classification Tree) и представлены на рисунке 6.1.1.

Рисунок 6.1.1 - Диагностическое дерево решений

По результатам исследований нами была определена связь количества выросших колоний с возможностью прогнозирования исхода реактивных и инфекционных артритов. Приведенные на рисунке 6.1.1 результаты свидетельствуют о том, что при остром течении артрита с благоприятным исходом у всех больных (21 ребенок - 100%) отмечается рост колоний микроорганизмов при посеве фекалий на 1,5% ГРМ-агар с антибактериальным препаратом в количестве менее 5000 КОЕ/г. Напротив, у всех 13 больных с неблагоприятным исходом артрита (хронизацией, рецидивированием) количество выросших колоний микроорганизмов равно или более 5000 КОЕ/г, причем у 24,0% больных микробная обсемененность составляла от 5000 до 10000 КОЕ/г, у 38,0% пациентов - от 10000 до 100000 КОЕ/г, у оставшихся 38,0% детей - более 100000 КОЕ/г.

Связь количества выросших колоний антибиотикорезистентных ко-проштаммов на среде с антибактериальным препаратом, использованном в лечении данного больного, с исходом артрита демонстрирует рисунок 6.1.2. У всех детей с острым течением артрита количество выросших колоний составляло менее 5000 КОЕ/г. Таким образом, при содержании колоний микроорганизмов в количестве меньше 5000 КОЕ/г прогнозируют благоприятный исход артрита (выздоровление), а при содержании колоний микроорганизмов в количестве равном или больше 5000 КОЕ/г прогнозируют неблагоприятный исход артрита (переход артрита в хроническую форму). Разработанный нами способ прогнозирования течения и исхода артрита существенно отличается от известных аналогов.

В настоящее время существует ряд способов прогнозирования исхода реактивных артритов, которые условно, в зависимости от характеристики используемых биомаркеров, можно разделить на несколько групп. К группе способов, основанных на использовании анализа клинических параметров (анамнез заболевания, динамика клинических симптомов артрита, лабораторные, ультразвуковые, рентгенологические изменения), относится способ, разработанный Т.В Гапоновой. [14].

100 -|

90 -

с

е 80 -

и.

X .0 70 -

н

п

л 60 -

о

ю

о 50 -

в

т

с е 40 -

ч

и л 30 -

о

К

20 -

10 -

0 -

< 5000

□ Острое течение РеА

□ Хроническое течение РеА

5000 - 10000 - > 100000

10000 100000

Количество колоний микроорганизмов (КОЕ/г)

Рисунок 6.1.2 - Зависимость количества колоний микроорганизмов, выросших на среде с антибактериальным препаратом, от исхода заболевания

Однако по утверждению практических врачей не всегда отмечается параллелизм между динамикой клинических симптомов на фоне лечения и клиническим течением, а также исходом артрита. К группе способов, в основе которых лежат клинико-иммунологические и иммуногенетические методы прогнозирования исхода реактивных и инфекционных артритов, относится способ А.О. Исакановой. Автором предложено использование в качестве прогностических критериев РеА иммуногенетического профиля с уточнением ИЬЛ-фенотипа [19]. К этой же группе относится способ прогнозирования исхода реактивного артрита, в основе которого лежат полученные Л.Н. Чаплыгиной данные о том, что при острых формах РеА имеет место достоверное увеличение лактоферрина крови и нейтрофилов; при рецидивирующих -увеличение уровня Т№-а, снижение ЮТ-у, показателей фагоцитарной активности, что позволяет использовать ТЫБ-а и ЮТ-у для прогнозирования исхода реактивных артритов [33].

Недостатком способов данной группы, по нашему мнению, являются необходимость наличия в лечебном учреждении иммунологической лаборатории, дорогостоящего оборудования и реактивов, специально обученного персонала и, соответственно, материальных затрат, что ограничивает использование этих способов в практическом здравоохранении.

Разработанный нами способ осуществляется следующим образом.

1. После завершения курса антибактериальной терапии у пациента производят забор кала для бактериологического исследования на микрофлору.

2. Проводят высев фекалий в разведении 10-5 на чашку Петри с 1,5% ГРМ-агаром и антибактериальным препаратом, применяемым при лечении данного больного, в минимальной подавляющей концентрации (МПК) в диапазоне устойчивости.

Величину МПК антибиотиков (в мкг/мл) в диапазоне устойчивости в отношении патогенных и условно-патогенных бактерий определяют в соответствии с критериями, официально принятыми в РФ, приведенными в Методических Указаниях 4.2. 1890. 04 [24].

Таким образом, если больному проводили лечение ампициллином, то, в соответствии с вышеупомянутыми указаниями, используют МПК ампициллина в диапазоне устойчивости, которая составляет 32 мкг/мл.

Для приготовления разведения ампициллина в указанной коцентрации во флакон с сухим веществом антибактериального препарата вводят 10 мл 0,9% физиологического раствора хлорида натрия, берут микропипеткой 64 мкл полученного раствора и смешивают со 100 мл готового расплавленного до 37^ 1,5% ГРМ-агара, тщательно перемешивают полученную среду и разливают на чашки Петри. Перед заполнением расплавленной средой чашки Петри устанавливают на строго горизонтальную поверхность. Глубина агарового слоя в чашке должна быть 3-4 мм. После заполнения чашки оставляют при комнатной температуре для застывания и подсушивания на 10-15минут. Хранить чашки можно закрытыми в полиэтиленовых пакетах при 4-

8^ в течение 7-10 суток. При использовании чашек после хранения в холодильнике их также необходимо подсушить в течение 10-20 мин. при 37^ с приоткрытой крышкой.

Готовят разведение фекалий 10-5 в 0,9% физиологическом растворе хлорида натрия. Для этого помещают 1 г фекалий в пробирку № 1 и добавляют 9,0 мл 0,9% физиологического раствора хлорида натрия. Берут 0,1 мл суспензии из пробирки № 1 и вносят в пробирку № 2, смешивали с 9,9 мл 0,9% физиологического раствора хлорида натрия.

Далее проводят посев разведения фекалий 10-5 на чашки Петри с антибактериальным препаратом. Для этого берут по 0,1 мл полученного разведения и помещают на поверхность подготовленных ранее чашек Петри с питательной средой и антибактериальным препаратом. Инокулят растирают шпателем равномерно по всей поверхности чашки.

3. Чашки инкубируют в термостате в течение 24-х часов при температуре 37°С.

4. Проводят подсчет выросших на чашке колоний микроорганизмов.

5. При содержании колоний микроорганизмов в количестве меньше 5000 КОЕ/г прогнозируют благоприятный исход артрита (выздоровление), а при содержании колоний микроорганизмов, в количестве равном или больше 5000 КОЕ/г прогнозируют неблагоприятный исход (рецидивирование, хрони-зация).

Предложенный нами способ отличается тем, что выполняется забор и высев фекалий в разведении 10-5 на чашку Петри с 1,5% ГРМ-агаром и антибактериальным препаратом, использованным для лечения данного больного, в минимальной подавляющей концентрации в диапазоне устойчивости. Проводится инкубирование, подсчет выросших на чашке колоний микроорганизмов и определяется связь количества выросших колоний с возможностью прогнозирования исхода реактивных артритов. Так при содержании колоний микроорганизмов в количестве меньше 5000 КОЕ/г прогнозируют острое течение артрита, а при содержании колоний микроорганизмов в количестве

равном или больше 5000 КОЕ/г, прогнозируют хроническое течение артрита. Наш способ прогнозирования исхода реактивного артрита отличается от ранее разработанных простотой в осуществлении и экономической выгодностью.

На основании проведенных клинико-микробиологических исследований и статистической обработки с использованием дискриминантного анализа нами экспериментально установлена новая совокупность статистически значимых биопараметров для дифференциации больных с благоприятным (выздоровление) и неблагоприятным (рецидивирование, переход в хроническое течение) исходом реактивного артрита: факт проведенной антибактериальной терапии; наличие дисбиоза кишечника с гиперколонизацией дрожже-

-5

подобных грибов в количестве более 103 КОЕ/г; положительный результат бактериоциногенного теста; количество антибиотикорезистентных копро-штаммов микроорганизмов на среде с антибактериальным препаратом, использованным в лечении конкретного больного РеА, Полученные данные легли в основу разработанной нами программы для ЭВМ №2016611902 «Ди-стара» для определения исхода реактивного артрита (2016г.) и способа прогнозирования исхода реактивных и инфекционных артритов РФ № 2607375 (2017г.).

Разработанный нами способ состоит в возможности прогнозирования исхода РеА без выделения чистой культуры возбудителя и его идентификации, сокращается время для его осуществления (не более 24-х часов). Способ является недорогим и простым в осуществлении, так как не требует для выполнения специального дорогостоящего оборудования и мероприятий по специальной подготовке персонала бактериологических лабораторий, что делает его доступным в клинической практике первичного звена здравоохранения.

***

Таким образом, проведенные микробиологические и статистические исследования позволили определить наиболее значимые микробиологиче-

ские критерии, связанные с клиническими параметрами реактивного артрита, а именно, с клиническим вариантом течения и исходом данного заболевания. Такие маркеры как наличие положительного бактериоциногенного теста; выделение при исследовании на дисбиоз кишечника грибов рода Candida c по-

-5

казателем микробной обсемененности более 10 КОЕ/ г; наличие дисбиоза кишечника II - III степени; факт проведенной антибактериальной терапии; количество антибиотикорезистентных копроштаммов, выросших на среде с антибактериальным препаратом, который был использован в лечении конкретного больного. Последний из перечисленных критериев лег в основу разработанного способа прогнозирования клинического исхода (патент РФ № 2607375). Совокупность выше перечисленных показателей была использована при разработке программы для ЭВМ «Дистара» №2016611902 для определения исхода артрита.

Результаты исследования, представленные в данной главе, опубликованы:

1. Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ № 2016611902 «Дистара». / О.В. Бухарин, И.А. Никифоров, О.Е. Чел-паченко, Н.Б. Перунова, Е.В. Иванова, Л.П. Федотова, А.В. Салгина, Т.А. Бондаренко.// Заявка № 2015662355, 2016.

2. Способ прогнозирования исхода реактивных и инфекционных артритов. / О.В. Бухарин, О.Е. Челпаченко, Н.Б. Перунова, Е.В. Иванова, Е.И. Данилова, И.А. Никифоров, Л.П. Федотова, Салгина, Т.А. Бондаренко, О.И. Сидорова.// Патент РФ № 2607375, 2017.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Реактивный артрит занимает лидирующее положение в структуре воспалительных заболеваний суставов, как у детей, так и среди взрослого населения в России и других странах. По данным [5] частота встречаемости РеА составляет 86,9 на 100.000 детского населения и относится к группе се-ронегативных спондилоартритов. В России реактивный артрит регистрируется у 56% детей до 14 лет и 37% подростков с ревматической патологией [5].

Известно, что реактивный артрит запускается микробным фактором, преимущественно - энтеробактериями (эшерихии, клебсиеллы, сальмонеллы, шигеллы, клостридии и др.), а также хламидиями, дрожжеподобными грибами. Необходимо отметить, что последнее десятилетие характеризуется новыми подходами к исследованию роли микроорганизмов в этиологии и патогенезе артритов, связанными с изучением изменений состояния микробиоты различных экологических ниш. Выявлено, что центральное патогенетическое звено в развитии ревматоидного артрита, артритов, связанных с системными заболеваниями соединительной ткани, а также спондилоартритов и анкило-зирующего спондилита ассоциирует с кишечным микробиомом [105, 131].

В соответствии с данным положением, большое внимание уделяется роли кишечного дисбиоза в патогенезе артритов. Проведенные экспериментальные исследования показали, что при наличии эубиоза в кишечнике человека имеет место нормальный иммунный гомеостаз и артрит не развивается. Напротив, кишечный дисбиоз способствует увеличению проницаемости кишечного эпителия, что ведет к транслокации бактериальных и грибковых антигенов с иммунными компонентами в кровь и синовиальную оболочку суставов, нарушается иммунный гомеостаз, идет формирование артрита [131].

В тоже время не вызывает сомнений значение воспаления как обязательного компонента артрита. Изучается роль в развитии РеА провоспали-тельных и противовоспалительных цитокинов, баланс которых находится в состоянии динамического равновесия с микробиоценозом кишечника: контролируется микроорганизмами кишечной микробиоты, с одной стороны, и в

свою очередь, определяет состояние кишечного микробиоценоза [38, 39, 131]. Установлен факт эволюционного процесса взаимодействия между кишечным микробиоценозом и иммунным ответом хозяина. Микробиота кишечника влияет на иммунную систему и модулирует состояние гомеостаза у здорового человека и, напротив, способствует развитию воспаления при наличии кишечного дисбиоза [72]. В тоже время известно, что взаимодействие микроорганизмов кишечной микробиоты и иммунной системы осуществляется посредством иммунорегуляторных пептидов. Это положение подтверждает необходимость изучения клинико-микробиологических аспектов РеА в совокупности с определением баланса уровня про- и противовоспалительных цитокинов и факторов, приводящих к его нарушению.

Регистрируемые в настоящее время рост заболеваемости реактивным артритом у детей и подростков, высокий риск хронизации РеА и связь данной патологии с микробным фактором, в том числе, с кишечным микробио-мом, определяют целесообразность микробиологических исследований, направленных на изучение этиологической и патогенетической роли микроорганизмов кишечной микробиоты дистального отдела толстого кишечника в развитии РеА.

С учетом вышеизложенных позиций цель исследования заключалась в определении особенностей нарушений микросимбиоценоза кишечника и врожденных факторов локальной антимикробной защиты кишечного биотопа у детей с реактивными артритами.

Работа выполнялась в несколько этапов. Микробиологическое обследование включало 109 детей с РеА, из которых в зависимости от задач исследования, формировались различные группы детей с артритом, отличающиеся клиническим вариантом течения и исходом РеА и 25 здоровых детей (группа сравнения).

Диагноз реактивного артрита выставлялся в соответствии с критериями III Международного совещания по РеА (Берлин,1999) и Федеральными клиническими рекомендациями по реактивному артриту (Москва, 2015). На 1-