Роль бифидофлоры в ассоциативном симбиозе кишечной микробиоты человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.02.03, доктор наук Иванова Елена Валерьевна

• Иванова Елена Валерьевна
• доктор наук
• 2018

Оглавление диссертации доктор наук Иванова Елена Валерьевна

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Понятие «доминантность» в структуре микробных сообществ 16 и биокоммуникативная активность бифидофлоры

1.2. Аспекты интеграции бифидобактерий с организмом хозяина

1.3. Бифидобактерии - основа для разработки новых лечебных 42 препаратов и перспективы создания синбиотиков

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Характеристика микроорганизмов, используемых в работе

2.2. Методика определения состояния микробиоценоза кишечника

2.3. Методы выделения и идентификации микроорганизмов

2.3.1. Метод выделения микроорганизмов из микросимбиоценоза 50 толстого кишечника человека

2.3.2. Биохимическая идентификация бактерий

2.3.3. Масспекрометрическая идентификация бифидофлоры

2.3.4. Генотипическая идентификация бифидобактерий

2.4. Молекулярно-генетические методы исследования культур

2.4.1. Полногеномное секвенирование и сравнительный анализ геномов 54 микроорганизмов

2.4.2. ПЦР-анализ на наличие генов колибактинов (clbA, clbB, clbQ, 56 clbN) у штаммов E. coli M-17 и E. coli ЛЭГМ-18

2.5. Хроматографический метод исследования спектра и уровня 57 короткоцепочечных жирных кислот в метаболитах бифидобактерий

2.6. Фенотипические методы изучения биологических свойств бактерий

2.6.1. Антилизоцимная активность микроорганизмов

2.6.2. Антилактоферриновая активность бактерий

2.6.3. Антииммуноглобулиновая активность бифидобактерий

2.6.4. Антипептидная активность микроорганизмов

2.6.5. Иммунорегуляторная активность бактерий

2.6.6. Биопленкообразование микроорганизмов

2.6.7. Антагонистическая активность бактерий

2.6.8. Гемолитическая активность микроорганизмов

2.7. Метод определения «свой-чужой» в паре «доминант-ассоциант» 66 в микросимбиоценозе толстого кишечника человека

2.8. Изучение уровня локальных антимикробных факторов и цитокинов 67 в копрофильтратах человека

2.8.1. Метод получения копрофильтратов человека

2.8.2. Определение лизоцима, лактоферрина, про- и противовоспали- 67 тельных цитокинов в копрофильтратах

2.9. Статистические методы обработки полученных результатов 68 ГЛАВА 3. СТУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРСТИКА 69 БИФИДОФЛОРЫ ТОЛСТОГО КИШЕЧНИКА ЧЕЛОВЕКА

3.1. Таксономическая характеристика бифидофлоры при эубиозе и 69 дисбиозе толстого кишечника человека

3.2. Характеристика генома, масс-спектров белков и состава короткоцепо- 77 чечных жирных кислот бифидобактерий кишечного микросимбиоценоза

3.3. Персистентный потенциал бифидобактерий в ассоциативном 100 симбиозе человека

3.4. Обсуждение результатов 111 ГЛАВА 4. АСПЕКТЫ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ БИФИДОБАКТЕ- 115 РИЙ С СИСТЕМОЙ ИММУНИТЕТА ХОЗЯИНА

4.1. Влияния метаболитов бифидофлоры на баланс про- и 115 противовоспалительных цитокинов на модели клеток врожденного

и адаптивного иммунитета

4.2. Оценка способности метаболитов бифидобактерий изменять 126 уровень про- и противовоспалительных цитокинов после контакта

in vitro с рекомбинантными цитокинами

4.3. Иммунорегуляторные свойства метаболитов бифидобактерий 130 при эубиозе и дисбиозе толстого кишечника человека

4.4. Обсуждение результатов 136 ГЛАВА 5. РОЛЬ БИФИДОБАКТЕРИЙ В РЕГУЛЯЦИИ 139 КИШЕЧНОГО МИКРОСИМБИОЦЕНОЗА ЧЕЛОВЕКА

5.1. Роль бифидобактерий в межмикробном распознавании 140 «свой-чужой» в паре «доминант-ассоциант»

5.2. Разработка способа определения биосовместимости кишечных 155 микросимбионтов на основе феномена распознавания «свой-чужой»

5.3. Обсуждение результатов 170 ГЛАВА 6. ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ 173 ИССЛЕДОВАНИЯ БИФИДОБАКТЕРИЙ

6.1. Функциональные группы бифидофлоры кишечной микробиоты 174 в ассоциативном симбиозе человека

6.2. Бифидобактерии - регулятор иммунного гомеостаза хозяина 184 в условиях ассоциативного симбиоза

6.3. Определение уровня биосовместимости пробиотических штаммов 204 в симбиотической композиции и оценка биологической активности

новых композиций in vitro

6.4. Обсуждение результатов 227 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 229 ВЫВОДЫ 251 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 254 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Роль бифидофлоры в ассоциативном симбиозе кишечной микробиоты человека»

Актуальность темы исследования и степень ее разработанности

Проблема исследования бифидофлоры насчитывает более 100 лет. Впервые вопрос о значении бифидобактерий для организма человека, антагонистических взаимоотношениях в микробных сообществах пищеварительного тракта, возможности и путях коррекции микрофлоры кишечника был поднят основоположником русской бактериологии И.И. Мечниковым и его школой на рубеже прошлого столетия. Дальнейшие исследования по изучению биологии бифидобактерий позволили установить у данной группы микроорганизмов широкий спектр антимикробных соединений (бактериоцины и бактериоциноподобные соединения, сидерофоры, карбоновые кислоты), защищающих желудочно-кишечный тракт от проникновения различных патогенов, чрезмерного роста и размножения условно-патогенных микроорганизмов [102, 103, 131, 227]. Было установлено, что бифидофлоре принадлежит ведущая роль в синтезе биологически активных веществ, в том числе, витаминов, улучшении процессов всасывания и гидролиза жиров, белкового и минерального обмена [89, 117, 132, 273, 313].

В последние десятилетия накоплены данные об иммунотропной активности бифидобактерий [153, 299]. Показан вклад микробиоты, включая бифидофлору, в развитие и функционирование изолированных лимфоидных фолликулов, специализированных кишечных структур, составленных из дендритных клеток и агрегатов В-клеток. В физиологических условиях штаммы бифидобактерий повышают колонизационную резистентность, подавляют воспалительные реакции и апоптоз [128, 231, 252, 309].

Все эти положительные эффекты позволили рассматривать бифидобактерии как эффективный биокорректор и основу для создания препаратов и продуктов категории функционального питания, имеющих ряд положительных эффектов в клинических исследованиях [26, 113, 161, 191].

К тому же, начало XXI века ознаменовалось сменой концепции коховской доктрины в инфектологии на симбиотический подход, где организм человека предложено рассматривать как «суперорганизм» [188] с населяющим его микробным сообществом. Симбиотические связи микросимбионтов оказывают влияние на метаболизм и физиологию "хозяина", определяя трансгеномные перестройки микробной флоры [10]. Использование симбиотического подхода при изучении роли бифидофлоры в организме человека на основе концепции ассоциативного симбиоза - многокомпонентной интегральной системы с её трёхвекторной структурой [6] резко расширило возможности изучения физиологической роли бифидобактерий в регуляции гомеостаза кишечного биотопа человека. Рассмотрение бифидофлоры с позиции ассоциативного симбиоза позволило провести комплексное изучение разнообразных функции бифидобактерий, определяющих механизмы интегративных взаимодействий микробиоты с организмом человека и раскрывающих физиологическую основу ключевой (доминантной) роли бифидобактерий в процессах формирования симбиотических отношений как внутри микросимбиоценоза, так и с организмом хозяина. Не исключено, что использование инфектологического подхода в изучении данной проблемы может позволить расширить возможности использования бифидобактерий в прикладных целях: разработка критериев для отбора эффективных пробиотиков, конструирование новых симбиотиков (синбиотиков), создание эффективных биопрепаратов и продуктов функционального питания для стабилизации микробного баланса кишечной микробиоты человека.

Цель исследования

Определить роль бифидобактерий в регуляции гомеостаза биотопа толстого кишечника человека с позиции ассоциативного симбиоза.

Задачи исследования

1. Изучить таксономическую характеристику бифидофлоры в зависимости от микроэкологического состояния толстого кишечника человека.

2. Провести анализ генома, масс-спектров белков, состава летучих жирных кислот, персистентных свойств бифидобактерий, изолированных при эубиозе и дисбиозе толстого кишечника.

3. Охарактеризовать иммунорегуляторное влияние метаболитов бифи-дофлоры на баланс провоспалительных и противовоспалительных цитокинов на модели клеток врожденного и адаптивного иммунитета.

4. Оценить способность различных видов бифидобактерий участвовать в микробном распознавании «свой-чужой» ассоциативной микробиоты кишечника человека.

5. Определить функциональные группы бифидофлоры толстого кишечника человека на основе анализа особенностей спектра метаболитов, биопрофиля, иммунорегуляторных свойств и способности бактерий осуществлять дифферен-цировку «свой-чужой» среди ассоциантов.

6. Разработать способ биосовместимости пробиотических штаммов в симбиотической композиции и оценить биологическую активность новых композиций in vitro.

Методология и методы диссертационного исследования

Исследования выполнены на базе лаборатории биомониторинга и молеку-лярно-генетических исследований ИКВС УрО РАН (зав.- проф. РАН Н.Б. Перу-нова). Основным методологическим принципом исследовательской работы явился комплексный симбиотический подход для изучения роли бифидофлоры в ассоциативном симбиозе человека. Для достижения цели и решения поставленных задач автором проведены экспериментальные исследования, где у доминантного микросимбионта с использованием бактериологических, молекулярно-генетических, масс-спектрометрического, хроматографического, иммунологических методов охарактеризованы фено- и генотипические особенности бифидобак-

терий, определяющие специализацию прокариот к занимаемому биотопу. Исследования были проведены на 260 штаммах бифидобактерий, выделенных из 122 кишечных микросимбиоценозов при обследовании лиц в возрасте от 1 года до 45 лет на дисбиоз толстого кишечника.

Для характеристики аспектов интегративных взаимодействий бифидофлоры с организмом хозяина изучена роль бифидобактерий в функционировании векторов ассоциативного симбиоза «доминант-ассоциант» и «доминант-макропартнер». Материалы по взаимодействию бифидобактерий с ассоциативным звеном микросимбиоценоза включали: исследования антагонистической активности бифидофлоры, её способность к микробному распознаванию «свой-чужой» по оппозитному (усиление/подавление) феномену регуляторных отношений микросимбионтов, где кроме репродуктивной функции (размножение) использовали критерии адаптационного потенциала (образование биопленок и антилизоцимный тест) бактерий.

Раздел работы по изучению особенностей взаимодействий бифидобактерий с системой врожденного и адаптивного иммунитета макропартнера выполнен при консультировании и участии сотрудников проблемной лаборатории по изучению механизмов естественного иммунитета ФГБОУ ВО ОрГМУ Министерства здравоохранения РФ (зав. - проф. А.И. Смолягин). Оценена способность метаболитов доминантов изменять продукцию про- (ШК-у, ТЫБ-а, ГЬ-17, 1Ь-8, 1Ь-6) и противовоспалительных (ГЬ-10, 1Ь-Жа) цитокинов с помощью ИФА на модели перито-неальных макрофагов мышей-гибридов (СВАхС57В16)Б1 и мононуклеаров периферической крови здоровых лиц (доноров), а также при соинкубировании метаболитов бактерий с рекомбинантными цитокинами.

Определение физиологического значения функциональных групп бифидоф-лоры в ассоциативном симбиозе человека проводили на основании данных биологического, протеомного и метаболитного профилей (по 27 характеристикам) с использованием кластерного и дискриминантного анализов.

При разработке принципа биосовместимости пробиотических штаммов для создания симбиотической композиции был использован прием индукции метабо-

литов индикаторного штамма бифидобактерий, как «доминанта», путем предварительного соинкубирования с метаболитами исследуемых «ассоциантов» и формированием обратной связи в паре «доминант-ассоциант» с оценкой результата по изменению базовых физиологических характеристик микробов (рост/размножение, образование биопленок и антилизоцимный тест). Для определения эффективности и целесообразности симбиотических композиций с высокой биосовместимостью была исследована в условиях in vitro сравнительная регуля-торная и антагонистическая активность монокультур пробиотических штаммов и созданных композиций, а также коммерческих бактерийных препаратов («Макси-лак», «Genexo Sp.z.o.o.», Польша; «Нормобакт», Chr. Hansen A/S 10-12 Boege Alle DK-2970 Hoersholm, Дания; «Аципол», «ЛЕККО», Россия) в отношении тест-культур.

Результаты исследований были статистически обработаны методами вариационной статистики с использованием пакета прикладных программ Microsoft Excel и «STATISTICA 10.0», включая методы как параметрического (t-критерий Стьюдента), так и непараметрического (U-критерий Манна-Уитни) анализов.

Степень достоверности, апробация результатов, личное участие автора

Достоверность полученных результатов достигнута за счет применения в качестве методологической и теоретической базы фундаментальных трудов в области инфекционной симбиологии; соответствия результатов современному уровню методик проведения исследований.

Основные положения диссертации обсуждены на Всероссийской молодёжной научной школе-конференции «Микробные симбиозы в природных и экспериментальных экосистемах» (Оренбург, 2011, 2014, 2017), Всероссийской с международным участием школе-конференции молодых учёных «Современные проблемы микробиологии, иммунологии и биотехнологии» (Пермь, 2011, 2015), Российской научной конференции с международным участием «Персистенция и симбиоз микроорганизмов» (Оренбург, 2012, 2015), Российской научно-практической конференции по медицинской микробиологии и клинической микологии с меж-

дународным участием (XV, XVI Кашкинские чтения) (Санкт-Петербург, 2012, 2013), III Региональном молодёжном инновационном конвенте (Оренбург, 2013), Молодежной научно-практической конференция «Молодые ученые Оренбуржья -наука XXI века» (Оренбург, 2015), XIII, XIV конференциях иммунологов Урала с международным участием (Калининград, 2016; Челябинск, 2017), XVI Всероссийском научном форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе Дни Иммунологии (Санкт-Петербург, 2017), Международной выставке-конкурсе «Биоиндустрия» (Санкт-Петербург, 2017), III Национальный конгресс бактериологов (Москва, 2017).

Личный вклад автора состоит в непосредственном участии на всех этапах диссертационного исследования. Основная идея, планирование научной работы, включая формулировку рабочей гипотезы, определение методологии и общей концепции диссертационного исследования, формулировка цели и задач, разработка дизайна исследования проводились совместно с научным консультантом д.м.н., профессором РАН Н.Б. Перуновой и главным научным сотрудником ИКВС УрО РАН академиком РАН О.В. Бухариным. Экспериментальные исследования, статистическая обработка и анализ полученных данных, их интерпретация, подготовка публикаций проводились совместно с сотрудниками лаборатории биомониторинга и молекулярно-генетических исследований ИКВС УрО РАН (зав. лабораторией - д.м.н., профессор РАН Н.Б. Перунова). Иммунорегуляторная активность бифидобактерий изучалась совместно с коллегами проблемной лаборатории по изучению механизмов естественного иммунитета ФГБОУ ВО ОрГМУ Министерства здравоохранения РФ (зав. лабораторией - д.м.н., профессор А.И. Смоля-гин). Секвенирование штаммов бифидобактерий - совместно с сотрудниками Центра коллективного пользования ИКВС УрО РАН (зав. ЦКП - к.м.н., доцент Плотников А.О.). Определение масс-спектров протеомных профилей бифидобак-терий проводилось на базе Тюменского научно-исследовательского института краевой инфекционной патологии. Прототип симбиотических композиции про-биотиков был подготовлен ООО «НПК «Миламед» (г. Пермь). Статистическая

обработка результатов, изучение литературных источников и подготовка текста диссертации проведены лично автором.

Положения, выносимые на защиту

1. Доминантность бифидофлоры обусловлена особенностями генома, белкового, метаболического и персистентного профиля Bifidobacteriaceae, отражающими их штаммоспецифичность и биокоммуникативную активность в мик-росимбиоценозе, включая интеграцию с организмом хозяина, и определяет специализацию вида (видов) микроорганизмов в занимаемом биотопе.

2. Бифидофлора - ключевое звено микробиоты в регуляции гомеостаза кишечного биотопа, осуществляющее дискриминацию патогенов с последующим «сигналингом» через дендритные клетки при формировании иммунного гомеоста-за.

3. Физиологическая роль бифидофлоры в ассоциативном симбиозе человека определяется наличием функциональных групп доминанта (бифидобактерий): первой - регулирующей цитокиновый баланс, второй - осуществляющей дискриминацию патогенов и третьей - участвующей в поддержании барьерной метаболической функции энтероцитов в толстом кишечнике человека.

4. Биосовместимость микробных культур на основе межмикробного распознавания «свой-чужой» с участием метаболитов изучаемых бактерий и индикаторного штамма B. longum определяется через усиление (более 50 % и выше) адаптационных характеристик (биопленкообразование и антилизоцимная активность) ассоцианта в сочетании с антагонистической активностью метаболитов бифидофлоры.

Научная новизна

Экспериментальные исследования позволили обосновать роль бифидобактерий как микробного регулятора гомеостаза биотопа толстого кишечника человека с позиции ассоциативного симбиоза, характеризующиеся наличием штам-моспецифических особенностей генома, белкового, метаболического и перси-стентного профиля Bifidobactericeae, отражающие биокоммуникативную актив-

ность в микросимбиоценозе и интеграцию с организмом хозяина, определяя обли-гатную специализацию вида (видов) микроорганизмов в занимаемом биотопе.

Показано, что первичная дискриминация «чужеродного материала» бифи-добактериями - инициальный этап последующего «сигналинга» в регуляции иммунного гомеостаза хозяина. Дальнейшие этапы регуляции осуществляются активацией дендритных клеток непосредственно бифидобактериями, их метаболитами с последующим влиянием на дифференцировку наивных CD4+ Т- лимфоцитов в сторону регуляторных лимфоцитов и поддержанием оптимального цитокинового баланса кишечного биотопа человека.

Новые данные об особенностях метаболитного, протеомного, биологического профиля бифидобактерий при эубиозе и дисбиозе толстого кишечника человека использованы для определения физиологической роли различных видов бифидофлоры, характеризующей их способность участвовать в регуляции векторов «доминант-ассоциант», «доминант-макропартнер» при ассоциативном симбиозе человека. Разделение штаммов, имеющих штаммоспецифические особенности, на группы бифидобактерий по изучаемым параметрам позволило определить группы параметров (метаболический спектр, системообразующий фактор микро-симбиоценоза и цитокиновый профиль), определяющие значение данных свойств в реализации ключевой функции бифидофлоры - регуляции гомеостаза кишечного биотопа и рассматривать первую группу как кластер, формирующий цитокино-вый баланс, вторую - как кластер, ответственный за дискриминацию патогенов, и кластер, образующий третью группу, ответственную за поддержание барьерной метаболической функции энтероцитов в толстом кишечнике человека. Использование инфектологического подхода в изучении функциональных групп доминан-тов позволяет расширить круг возможностей клинического использования бифи-добактерий: диагностика микроэкологических нарушений биотопа (дисбиоз), разработка критериев для отбора биосовместимых композиций пробиотиков, а также конструирование новых биопрепаратов (про- и синбиотиков) для коррекции дис-биотических нарушений кишечной микробиоты с учетом физиологической роли бифидобактерий.

Разработан способ биосовместимости микробных культур, основанный на оппозитном (усиление/подавление) феномене регуляторных отношений микросимбионтов в межмикробном распознавании «свой-чужой», позволяющий получить симбиотические композиции. Новизна способа отбора пробиотических штаммов определяется расширением «линейки» критериев изучаемых физиологических тестов, где, кроме репродукции культур, определяются адаптационные характеристики (образование биопленок и антилизоцимный тест) отбираемых штаммов.

Теоретическая и практическая значимость работы

Впервые проведено комплексное исследование видового состава, перси-стентных свойств, метаболического и протеомного профиля бифидобактерий, позволившее выделить кластеры бифидофлоры, определяющие их физиологического значение в биотопе дистального отдела толстого кишечника человека. Полученные результаты расширяют теоретические представления о симбиотических взаимодействиях доминантных бактерий при ассоциативном симбиозе человека.

Штаммоспецифические особенности биологических свойств микроорганизмов рода Bifidobacterium, их метаболического и протеомного спектра, являющиеся индивидуальным маркером штамма («fingerprint»), вносят вклад в понимание адаптивной стратегии прокариот при различных микроэкологических состояниях биотопа, а также интеграцию с организмом хозяина при ассоциативном симбиозе человека.

Сформировано представление о роли Bifidobacterium spp. в качестве регулятора физиологических функций по векторам - «доминант - хозяин», «доминант -ассоциант». Определено, что бифидобактерии способны вносить свою лепту и в регуляцию взаимоотношений вектора «хозяин - ассоциант», поскольку способны не только распознавать «свои» и «чужие» штаммы микросимбионтов, опережая «иммунологический сигналинг» человека, но и оказывать иммунорегуляторное действие на систему иммунитета (посредством цитокинов), что вносит вклад в понимание механизмов реализации воспалительной реакции и начальных этапов адаптивного ответа.

Оценка иммунорегуляторных свойств бифидобактерий, основанная на определении влияния супернатантов бифидофлоры на баланс про- и противовоспалительных цитокинов, позволила выявить новые штаммы В. Ыу^ыш (депонирование в ГНМК и регистрация в базе данных ^В! ВюРгсцеС:), которые могут быть пригодны при создании новых пробиотиков «мишень-направленного» действия с высокими с противовопалительными свойствами.

Разработан способ определения биосовместимости пробиотических штаммов в микробном консорциуме с включением критериев адаптационного потенциала (образование биопленок и антилизоцимный тест) бактерий и одновременным определением антагонистической активности микроорганизмов. Полученные данные расширяют перечень критериев оценки эффективности пробиотиков, что важно при создании новых композиций про- и синбиотиков, а также могут быть учтены при оценке качества коммерческих биопрепаратов. Использование способа определения биосовместимости штаммов в микробном консорциуме позволило создать две новые микробные композиции, включающие производственные штаммы бифидо - и лактобактерий, более эффективно подавляющие ростовые свойства, антилизоцимную активность и биопленкообразование микроорганизмов, чем ряд коммерческих многокомпонентных пробиотиков. Полученные результаты открывают перспективу создания здоровье-сберегающих технологий, а также импортозамещения пробиотической продукции.

Представленные данные - составная часть темы открытого плана НИР «Роль микробного фактора в функционировании физиологических систем организма человека» (№ гос. регистрации 116021510073); проектов программы фундаментальных исследований УрО РАН «Изучение механизмов микробной регуляции ассоциативного симбиоза при инфекции» (15-3-4-36) и «Роль бифидофлоры в формировании гомеостаза человека» (15-5-4-7); проектов программы Президиума РАН «Инфектологические механизмы ассоциативного симбиоза человека» (09-П-4-1007) и «Изучение интеграционных механизмов межмикробных взаимоотношений микросимбионтов кишечной микробиоты человека» (12-П-4-1045).

Являлась руководителем инновационного проекта молодых ученых УрО РАН «Поиск бактерий - продуцентов ингибиторов провоспалительных цитоки-нов» (13-4-ИП-205). Фундаментальные результаты диссертационного исследования включены в итоговые отчеты УрО РАН и Отделения физиологических наук РАН (2012 - 2016 гг.).

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедры микробиологии ФГБОУ ВПО "Тюменский государственный медицинский университет" Минздрава России. Результаты диссертационной работы используются в научно-исследовательской работе ФГБУН ИКВС УрО РАН и в прикладных исследованиях ООО Биотехнологическая фирма «Компонент» по разработке новых микробных композиций для создания пробиотиков, синбиотиков, метабиотиков и продуктов функционального питания для профилактики и лечения дисбиозов толстого кишечника человека.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Понятие «доминантность» в структуре микробных сообществ и биокоммуникативная активность бифидофлоры

Согласно современным представлениям, человек представляет собой «на-дорганизм» или «суперорганизм» - симбиотическое сообщество эукариотических клеток и микробиоты, оптимальное количество которых, их соотношение, физиологическое состояние, функционирование и взаимодействие определяет его здоровье [188, 208]. Микросимбиоценозы человека представлены большим количеством таксонов микроорганизмов, одним из самых многочисленных и сложных является микросимбиоценоз толстого кишечника [10]. На чрезвычайную сложность и высокую плотность микробного сообщества, населяющей человека и животных, указывает тот факт, что в 1 грамме содержимого слепой кишки определяется 17 различных семейств микроорганизмов, 45 родов, свыше 400 видов с

11 12

общим количеством 10 -1012 клеток и весом более 1 кг [116, 239]. В последние десятилетия, использование современных молекулярно-генетических подходов (секвенирование 16S рРНК), позволило расширить наши представления не только о составе микробиоты, но и о динамике и экологии, что отражает эволюционную сторону формирования симбиотических отношений в системе «паразит-хозяин» [125].

Наряду с этим, выделение в структуре микробного сообщества доминантного звена, имеющего ключевое значение в регуляции симбиотических отношений прокариот-хозяин, могло бы способствовать раскрытию механизмов формирования и функционирования микросимбиоценоза, а также пониманию аспектов интеграции микробиоты и организма хозяина. Поскольку, известно, что «не все организмы сообщества играют одинаково важную роль в определении его природы и функций. Из сотен или тысяч видов, входящих в состав какого-либо сообщества, обычно лишь относительно немногие виды или группы оказывают на

него определенное воздействие, обусловленное их численностью, размерами, продукцией или другими параметрами...» [30].

При анализе литературы мы рассматривали только экологический аспект понятия «доминирования», так как поставленные вопросы находятся в области микробной экологии. Хотя при анализе литературы обращает внимание то, что поставленные вопросы наиболее изучены в области общей экологии, и в доступных источниках описаны понятия, такие так «доминантность» и «доминирование».

Доминирование на протяжении более ста лет понимаются ведущими экологами неоднозначно, что видно из приводимых ниже цитат. При выделении доминирующих видов опираются на разные показатели: численность, биомассу, продукцию, проективное покрытие, встречаемость, часто учитывается несколько показателей. Разумеется, вид, доминирующий по одному показателю, может не быть таковым по другому критерию.

В работах В.Д. Федорова (1969) было выделено два аспекта этого термина -структурный и функциональный [30]. В первом случае к доминирующим относили виды, имеющие наибольшую биомассу, численность, то есть которых по какому-то показателю «больше», чем прочих видов сообщества. Во втором - виды, наиболее сильно влияющие на другие виды сообщества, при этом сила влияния вида может быть не пропорциональна его биомассе или даже продукции. В изучении структуры микросимбиоценозов, населяющих различные биотопы организма человека, важным является разобраться в физиологической основе доминирования и определить критерии доминантности, позволяющие выделить из микросимбионтов «ключевые» виды (вид).

Так Макфедьен Э. (1965) рассматривал структурный аспект в доминировании вида, характеризующийся как «.преобладание или относительное обилие, т.е. отношение числа особей данного вида к общему числу особей всех видов, выраженное в процентах». Использование количественного подхода при определении доминирования применительно к растениям, большинство которых имеют одинаковые размеры, оправданно [30]. Вместе с тем, рядом исследователей на

примере растительного мета-сообщества было показано, что количественное (структурное) доминирование, включающее в себя филогенетическое превосходство вида (количество и численность вида) над другими в сообществе не позволяет выявить исторический детерминизм и стохастические процессы, которые влияют на состав экологического сообщества [107, 250]. Результаты анализа сходства и доминирования биологических видов мета-сообщества альпийских растений свидетельствуют о том, что для доминантов характерно более высокое функциональное, нежели филогенетическое обилие, в то время как у остальных представителей сообщества преобладало структурное разнообразие [101].

Список литературы диссертационного исследования доктор наук Иванова Елена Валерьевна, 2018 год

- - - -

© о °

о О

о с о О о QD О

О

<зол о = L

о о т

4

-2

2

Root 1

Variable ROOT1

ПЦ ФНО-« -1 . 69

ПЦ ИЛ-В -1 . 00

АЦА iHO-tt -О . 33

АЛА -0 . 07

ПМО -0.07

АЦА_ИВФ-у -0 . 06

ПЦ ИЛ-10 1 . 44

ПЦИВФ-у 2 . 80

Variable ROOT 2

ПЦ ФНО-л -О . 87

ПЦ_ИЛ-В -П . 67

АЦА_ИН*-у -0 . 07

АЦА ФВО-а. -0.05

АЛА 0 . 07

ПЦ ИЛ-10 0 . 22

ПЦИНФ-у 0 . 85

ПМО О . 99

О О

ЭУБИОЗ ДБЗ 1 ▲ ДБЗ_2

ЭК дбз_З

Рисунок 15 - Дискриминантный анализ биологических параметров би-фидобактерий в зависимости от микроэкологического состояния толстого кишечника человека.

Примечание: ПЦ - продукция цитокинов, АПА - антипептидная активность, ПМО -показатель микробной обсеменённости, АЛА - антилизоцимная активность, ДБЗ - дисбиоз 1, 2, 3 степени

ни (ДБЗ 2), как и при дисбиозе 1 степени, была свойственна способность влиять на продукцию ГЬ-8 (21,2%) и дополнительно - на секрецию ТЫБ-а (32,4%). При тяжелой степени нарушений микробиоценоза (ДБЗ 3) бифидо-бактерии проявляли наиболее выраженную способность среди других групп штаммов влиять на продукцию ГЫБ-у (46,4%). Дискриминантный анализ исследуемых характеристик бифидобактерий выявил параметры со стабильными значениями (продукция 1Ь-10, АПА в отношении 1Ь-10 и 1Ь-8), не зависящими от микроэкологического состояния биотопа толстого кишечника, поэтому при обработке результатов они не вошли в группу информативных показателей, представленных на рисунке 2б.

Таким образом, использование дискриминантного анализа параметров, характеризующих способность бифидобактерий взаимодействовать с эффекторами врожденного (лизоцим) и адаптивного иммунитета (влияние на продукцию цитокинов мононуклеарами периферической крови человека), позволило выявить информативные параметры, пригодные для оценки функционального состояния доминантной микрофлоры с учетом уровня дисбиотиче-ских нарушений.

Проведенные исследования позволили рассмотреть роль бифидобакте-рий в качестве микробного регулятора кишечного гомеостаза человека. При анализе исследуемых свойств бифидобактерий с использованием дискрими-нантного анализа определены информативные параметры, определяющие степень устойчивости кишечного гомеостаза в условиях эубиоза и дисбио-тических нарушений от 1 до 3 степени. Следует отметить, что проведенный дискриминантный анализ исследуемых биологических свойств эубиотиче-ских и дисбиотических клинических штаммов бифидобактерий распределил все исследуемые изоляты на 4 группы с почти 100% точностью, отразив их принадлежность к биотопу толстого кишечника при физиологическом состоянии микробиоценоза и при дисбиотических нарушениях 1,2 и наиболее тяжелой 3 степени. Полученный результат подтверждает адекватность проведенного исследования с применением указанного математического анализа и важность изученных биологических свойств бифидобактерий для оценки состояния кишечного гомеостаза, реализуемого с участием метаболитов доминантных бактерий.

Установлено, что в формировании состояния эубиоза толстого кишечника существенная роль среди всех анализируемых свойств бифидобактерий принадлежит уровню микробной обсемененности (66,3% от вклада исследуемых показателей для эубиотических штаммов), что согласуется с общепринятыми критериями микробиологической диагностики дисбиоза толстого кишечника [приказ]. Вторым по значимости (25,0%) оказался показатель, характеризующий способность бифидобактерий снижать концентрацию т

vitro одного из ранних провоспалительных цитокинов системного действия TNF-a, что может указывать на потенциальную способность эубиотических клинических штаммов ограничивать уровень воспалительной реакции в кишечнике, минимизируя риск избыточной стимуляции иммунитета, способный нанести вред собственным клеткам хозяина. Указанное качество бифи-добактерий изучалось многими авторами, преимущественно на пробиотиче-ских штаммах [149, 178], реже на клинических, но без учета состояния микробиоценоза толстого кишечника.

Оценивая информативные параметры, определяющие вклад бифидо-бактерий в формирование устойчивости кишечного гомеостаза в условиях измененного микроэкологического состояния (дисбиоз), обращает внимание участие свойств, характеризующих способность доминантных бактерий влиять на продукцию провоспалительных цитокинов мононуклеарами человека: хемокина IL-8 (вклад 21,1%, информативен для дисбиоза 1 и 2 степени), TNF-a (32,4%, информативен для дисбиоза 2 степени) и IFN-y (46,4%, информативен для дисбиоза 3 степени). Полученные результаты свидетельствуют о способности бифидобактерий, основной доминантной флоры биотопа толстого кишечника, изменять продукцию провоспалительных цитокинов в большей мере в условиях нарушения микросимбиоценоза от легкой до тяжелой степени дисбиоза. Однонаправленность изменений показателей, характеризующих продукцию IL-10 и АЦА в отношении IL-10, IL-8, независимо от состояния микросимбиоценоза толстого кишечника, свидетельствует о высокой степени стабильности данных признаков у доминантов. Способность би-фидобактерий усиливать продукцию IL-10 в сочетании с низкой антицитоки-новой активностью в отношении данного цитокина и хемокина IL-8, вероятно, характеризует значительный адаптационный потенциал доминанта в противовоспалительном эффекте и поддержании иммунологической толерантности, реализуемый даже при глубоких микроэкологических нарушениях в биотопе толстого кишечника. Вот почему полученные результаты свидетель-

ствуют о связи цитокинового статуса хозяина с характером его взаимодействия с нормофлорой (бифидобактериями).

4.4. Обсуждение результатов

Материалы, представленные в данной главе исследований прежде всего свидетельствуют о том, что метаболиты бифидобактерий способны реализо-вывать иммунорегуляторное влияние и оказывать противовоспалительный эффект в зависимости от типа иммунокомпетентных клеток. Наряду с противовоспалительным эффектом метаболиты Bifidobacterium spp. способны усиливать бактерицидный потенциал перитонеальных макрофагов мышей -гибридов (CBAxC57Bl6)F1, реализуемый при участии оксида азота. Установлено наличие иммуномодулирующей вариабельности между видами и штаммами кишечных бифидобактерий (штаммоспецифичность).

Поддержание баланса про- (IFN-y, TNF-a, IL-17, IL-8, IL-6) и противовоспалительных (IL-10, IL-1Ra) регуляторных медиаторов иммунитета в кишечнике человека реализуется метаболитами бифидобактерий как опосредованно путем модуляции секреции регуляторных молекул эффекторами как врожденного, так и адаптивного иммунитета, так и через прямое влияние на цитокины в среде (антипептидная активность).

Полученные материалы раскрывают механизмы иммунорегуляторного влияния метаболитов бифидофлоры в поддержании гомеостаза кишечной микробиоты через цитокиновый профиль хозяина. Высокая степень точности распределения штаммов бифидобактерий при эубиозе и дисбиозе на основании оценки их способности взаимодействовать с эффекторами врожденного и адаптивного иммунитета подтверждают значимость интегративных взаимодействия бифидобактерий с иммунорегуляторными молекулами при формировании кишечного гомеостаза.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ, ИЗЛОЖЕННЫМ В 4 ГЛАВЕ Монография:

1. Бухарин О.В., Перунова Н.Б., Иванова Е.В. Бифидофлора при ассоциативном симбиозе человека. - Екатеринбург: УрО РАН, 2014. - 212 с.(глава 2,4).

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК:

1. Бухарин, О.В. Антицитокиновая активность микроорганизмов / О.В. Бухарин, Н.Б. Перунова, И.Н. Чайникова, А.И. Смолягин, Е.В. Иванова // Журнал микробиология, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2011. - № 4. - С.56-61.

2. Перунова, Н.Б. Изменение концентрации про- и противовоспалительных цитокинов человека под действием супернатантов микроорганизмов/ Н.Б. Перунова, Е.В. Иванова, И.В. Новикова, Т.П. Ларина // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011. - № 4/1 (38). - С.100-101.

3. Иванова, Е.В. Влияние бактериальных метаболитов на уровень цитокинов в условиях in vitro / Е.В. Иванова, Н.Б. Перунова, И.Н. Чайникова // Проблемы медицинской микологии. - 2013. - Т. 15., № 2. - С.79.

4. Бухарин, О.В. Иммунорегуляторные свойства метаболитов бифидобак-терий при эубиозе и дисбиозе толстого кишечника человека / О.В. Бухарин, Е.В. Иванова, Н.Б. Перунова, И.Н. Чайникова, И.А. Никифоров, Т.А. Бон-даренко // Журнал микробиология, эпидемиологии и иммунобиологии. -2015. - № 4. - С.89 - 96.

5. Иванова, Е.В. Характеристика цитокинового спектра под влиянием метаболитов пробиотических штаммов микроорганизмов / Е.В. Иванова, Т.А. Бондаренко, Н.Б. Перунова, И.Н. Чайникова, О.Е. Челпаченко, С.В. Андрю-щенко, О.И. Сидорова, О.В. Бухарин // Российский Иммунологический Журнал. - 2016. - № 2(1). - С. 357 - 359.

Учебное пособие:

1. Бухарин О.В., Перунова Н.Б., Иванова Е.В., Андрющенко С.В. Роль би-фидофлоры в организме человека: учебное пособие, Екатеринбург: УрО РАН, 2013. - 128 с. ISBN 978-5-7691-2342-9

Патент РФ:

1. Патент РФ №2575799 «Применение штамма бактерий Bacillus cereus №279 в качестве продуцента ингибитора цитокина ФНО-а» (Бюл. №5, 2016 г). Авторы: Бухарин О.В., Перунова Н.Б., Чайникова И.Н., Иванова Е.В., Челпаченко О.Е., Андрющенко С.В., Бондаренко Т.А.

ГЛАВА 5. РОЛЬ БИФИДОБАКТЕРИЙ В РЕГУЛЯЦИИ КИШЕЧНОГО МИКРОСИМБИОЦЕНОЗА ЧЕЛОВЕКА

Бифидобактерии, обладая широким спектром антагонистической активности за счет продукции антимикробных соединений (бактериоцины, бакте-риоциноподобные соединения, сидерофоры, карбоновые кислоты), являются первой линией обороны желудочно-кишечного тракта от проникновения различных патогенов [14, 102, 103, 131].

Помимо прямого антимикробного действия бифидофлора осуществляет регуляцию состава кишечного микросимбиоценоза путем подавления перси-стентного потенциала бактерий [6, 8, 10], что повышает чувствительность бактерий к действию факторов естественной резистентности хозяина. В высоких концентрациях экзометаболиты бифидобактерий подавляли размножение условно-патогенных микроорганизмов, а в субингибиторных - модифицировали персистентный потенциал (АЛА и БПО) последних. Эти эксперименты послужили основой для разработки способа микробного распознавания «свой -чужой» в микросимбиоценозе кишечника человека с использованием метаболитов микросимбионтов при соинкубировании доминантной микрофлоры с ассоциативной.

Как было показано в работах Shank A. E. and Kolter R. (2009) [281] межмикробные взаимодействия связаны с наличием в супернатанте бактерий «сигнальных» молекул. Это свидетельствует, что представители микрофлоры, общаясь с помощью малых микробных молекул, используют их в качестве индукторов новых метаболитов-посредников, что влияет на результат межвидового взаимодействия симбионтов.

Несмотря на достаточную изученность роли бифидофлоры в организме человека появляются новые данные о функциях доминантов. Так, было показано, что бифидобактерии способны осуществлять первичный отбор микросимбионтов, реализуя феномен микробного распознования «свой-чужой» [10, 51]. Выявленный феномен микробного распознавания, заключается в способ-

ности бифидофлоры оппозитно (усиление/подавление) влиять на параметры базовых физиологических функций микросимбионтов в паре «доминант-ассоциант». В результате формирование микросимбиоценоза толстого кишечника человека осуществляется бифидофлорой за счет межмикробного распознавания, где проявляется как выраженный антагонизм в отношении «чужих», так и синергизм в отношении «своих» микросимбионтов.

5.1. Роль бифидобактерий в межмикробном распознавании «свой-чужой»

в паре «доминант-ассоциант»

Способность распознавать «свое» и «чужое» является важнейшим фундаментальным свойством иммунной системы, обеспечивающим наилучшую приспособляемость и самоидентификацию организма человека в окружающей среде. Результатом чего является нейтрализация и уничтожение чужеродного материала [51].

Вместе с тем, генетические и биохимические основы различения своих и чужих у бактерий пока малоизученны. Известно, что прокариоты выработали систему внутриклеточной защиты против вирусов. В частности, описаны ферменты рестрикции микроорганизмов, способны разрушать гены бактериофага, вторгшегося в микробную клетку [201]. В работах K. Gibbs (2008) проводилось исследование микробного распознавания «своего» и «чужого» на модели взаимодействия «прокариот-прокариот» с использованием популяции протея. В результате исследований выяснилось, что исследуемые культуры Proteus spp. имеют участок генома, содержащий шесть генов -idsABCDEF, играющих ключевую роль в дифференцировке «свой-чужой» у бактерий. Похожие генетические системы идентификации были обнаружены и у других штаммов Proteus mirabilis. Полагают, что система идентификации у P. mirabilis не ограничена участком idsABCDEF. Вероятно, существуют другие, пока еще не выявленные гены, участвующие в распознавании «свой-чужой», а система микробного сенсинга в целом может оказаться весьма

сложной и многоплановой [143].

Исходя из этого, внедрение микроорганизма в организм хозяина, его выживание будет зависеть не только от результата распознавания бактерий иммунной системой человека, но и от итога взаимоотношений с уже существующей (индигенной) микрофлорой данного биотопа, что может привести к различным исходам инфекции [6, 7]. Однако, изучение механизмов реализации микробного распознавания «свой-чужой» требует междисциплинарного подхода с применением современных молекулярно-генетических методов исследований.

Вместе с тем, на данном этапе работы мы сочли возможным более подробно остановиться на изучении особенностей биологических свойств как до-минантов, так и ассоциантов, имеющих значение в дифференцировки микросимбионтов на «своих» и «чужих». Важным представляется сравнительная характеристика способности доминантов к распознаванию, в значительной степени расширяющей наши представления о биокоммуникативных возможностях различных видов бифидобактерий. Проведение ранжирования среди кишечных микросимбионтов с использованием данного алгоритма на наличие «чужеродности» позволит выделить степень биосовместимости ассоци-антов с доминантами кишечного микросимбиоценоза человека.

Для изучения роли биологических характеристик бифидобактерий при реализации микробного распознавания были изучены системообразующие факторы клинических изолятов бифидофлоры, обладающих способностью в паре «доминант-ассоциант» дифференцировать микросимбионтов на «свои» и «чужие». В качестве доминантов использовали штаммы бифидобактерий, лидирующие в структуре бифидофлоры кишечного микросимбиоценоза (В. ЫАйиш, В. longum, В. сМвпиШиш и В. айо1еясепИя), и штаммы предоминант-ного вида - В. ряеийоса1епиШиш. В качестве тест-культур использованы пробиотические культуры В. Ы/гйиш 791 и В. longum МС-42. Ассоциативные микроорганизмы были использованы в количестве 120 штаммов, являющихся типичными представителями микрофлоры кишечника человека: гемоли-

тические (hly «+»), лактозонегативные (lac «-») E. coli, негемолитические (hly «-») лактозопозитивные (lac «+») E. coli, K. pneumoniaе, P. aeruginosa, C. perfringens, B. fragilis, P. acnes, L. rhamnosus, S. aureus, E. faecium и C. albicans (по 12 штаммов каждого вида). Экспериментальные исследования по изучению микробного распознавания доминантами «своих» и «чужих» среди ассоциантов кишечного микросимбиоценоза проводились по ранее разработанному алгоритму [51].

Анализ результатов распознования ассоциантов бифидофлорой проводили по разработанному ранее адекватному математическому выражению:

Д = ххах + х2а2 + хзаз + С,

где Д - дискриминантная функция, характеризующая искомый вариант распознавания микросимбионтов бифидофлорой; х - различие между значением свойства ассоцианта в опыте (под действием супернатанта би-фидобактерий, предварительно соинкубированных с экзометаболитами данного ассоцианта) и контроле (без влияния бифидобактерий) в %; а - коэффициент показателя; С - поправочная константа.

Таблица 10 - Коэффициенты показателей и поправочные константы для дифференциации «свой-чужой» бифидобактериями при взаимодействии с ассоциантами

Дискриминантная функция Ростовые свойства АЛА БПО С

Д1 - «свой» 2,78710 8,43545 7,23118 -272,13568

Д2 -«чужой» -3,74074 -10,87087 -6,50287 -358,01895

Для установления принадлежности исследуемых микросимбионтов к «своему» или «чужому» штамму, находили разницу полученных у ассоциан-тов количественных значения по показателям в опыте (под действием супер

натанта бифидобактерий, предварительно соинкубированных с экзометаболитами данного ассоцианта) и контроле (без влияния бифидобакте-

рий), переводя их в проценты и используя для расчета дискриминантной функции по приведенной формуле. Расчет проводили по всем строкам соответствующей таблицы. Наибольшая величина дискриминантной функции из всех полученных в 95% случаев соответствует обозначенному на данной строке результату (типу) распознавания (таблица 11).

В результате для каждой пары «доминант-ассоциант» были получены значения обеих дискриминантных функций (Д1 и Д2), среди которых выбиралась максимальная величина либо на первой (Д1), либо на второй строке (Д2), что позволяло отнести исследуемую культуру к «своему» или «чужому» штамму ассоциантов.

Применение математической модели для штаммов лактозопозитивных негемолитических E. coli, B. fragilis, L. rhamnosus и E. faecium позволило определить, что у всех исследуемых культур максимальная величина дис-криминантной функции была установлена на первой стоке (Д1), на основании чего исследуемые культуры были отнесены к «своим» штаммам микросимбионтов.

Исследование штаммов лактозонегативных гемолитических E. coli, K. рпвишотае, P. aeruginosa, C. perfringens, P. acnes, S. aureus и C. albicans с применением разработанной математической модели, позволило определить, что у всех исследуемых штаммов максимальная величина дискриминантной функции была установлена на второй стоке (Д2), на основании чего исследуемые культуры были отнесены к «чужим» штаммам микросимбионтов.

Сходные данные с результатами, полученными в отношении культур E. coli, E. faecium K. pneumoniaе, S. aureus и C. albicans были показаны в работе Н.Б. Перуновой [51]. Что же касается таких культур как B. fragilis, L. rhamnosus, P. aeruginosa, C. perfringens и P. acnes, то метод микробного распознавание бифидофлорой данных ассоциантов был применен впервые.

Таблица 11 - Значение дискриминантных функций (Д1/Д2) микробного распознавания «свой-чужой» бифидобак-

териями в паре «доминант-ассоциант»

доминант n=30 ассоциант n=33 Значение дискриминантных функций Me[25;75]

Д1/Д2 B. bifidum B. longum B. pseudocatenulatum B. catenulatum B. adolescentis

E. coli hly «-» lac «+» Д1 -«свой» 1206[415;2590] 1460 [538;4403] 596,8[-161;876] 395[115;624] -140,2[223;-1109]

Д2 -«чужой» -4469 -1244 -1867 -2416 -2582

E. coli hly «+» lac «-» Д1 -«свой» -1418 -1642 -1578 -379,7 -1432

Д2 -«чужой» -30,06 [-650;1354] 278,02[243;1029] 247,78[-894;1189] -1066[-1243;-998] 279,9[-921;279]

K. pneumoniaе Д1 -«свой» -2052 -1767 -2325 -1517 -1310

Д2 -«чужой» 892[-757;2560] 931[204;1690] 663[310;1016] 240[-612;756] 115[-484;145]

P. aeruginosa Д1 -«свой» -2173 -1788 -1943 -2477 -1477

Д2 -«чужой» 974[-1069;1110] 1076,7[908;1925] 669,4[285;889] 411[124;705] 229[-554;368]

C. perfringens Д1 -«свой» -886.1 -1676 -770.2 795 -1084

Д2 -«чужой» -625,6[-978;194] 586[-144;1312] -615,4[-2057;1758] -2416[-2412;-1804] -58,7[-554;229]

B. fragilis Д1 -«свой» -237[-1491;1430] -508[-994;41,3] -450,2[-1723;1515] 795[-345;1562] 182,6[-70;183]

Д2 -«чужой» -1263 -721.9 -844.9 -2416 -1635

P. acnes Д1 -«свой» -1547 -1699 -2852 -2341 -1262

Д2 -«чужой» 543,9[-855;1547] 889[452;1334] 920,8[232;2312] 437[126;745] 132[-709;510]

L. rhamnosus Д1 -«свой» 576[-1021;1305] 975,6[270;1291] 547,5[445;799] -162[-196;51] 75,1[-112;116]

Д2 -«чужой» -2098 -1872 -1803 -1131 -1317

S. aureus Д1 -«свой» -1645 -1769 -1891 -1501 -1307

Д2 -«чужой» 380[-490;1813] 575,9[495;1113] 504[441;566] 305[76;508] 119[-493;176]

E. faecium Д1 -«свой» 221,6[-782;931] -117[-790;228] 226[138;438] -234[-880;-115] -266[-873;340]

Д2 -«чужой» -1522 -555.5 -1546 -995 -974

C. albicans Д1 -«свой» -1592 -1619 -1768 -1854 -1215

Д2 -«чужой» 373[-384;975] 540,8[-457;1672] 664[65,6;924] 456[-145;612] 89,8[-515;678]

Применение разработанной математической модели для микробного распознавания позволило, не только дифференцировать ассоциантов на «свои» и «чужие», но и получить отличающиеся значения уровня дискрими-нантной функции у различных видов доминантов в отношении одного вида ассоциантов.

Причем уровень дискриминантной функции ранжировались от отрицательного до выраженного положительного значения, что может свидетельствовать о том, что у различных штаммов бифидобактерий способность к распознаванию ассоциантов различается от умеренно (отрицаетльные значения Д1 или Д2) до выраженного (положительные значения Д1 или Д2) эффекта оппозитного влияния доминанта на базовые характеристики физиологических свойств ассоциантов.

Так, выраженность дискриминантной функции Д1 при реализации микробного распознавании штаммов L. rhamnosus у доминантов ранжировалась следующим образом: B. longum (Д1=975,6 [270;1291]) > B. bifidum (Д1=576 [-1021;1305]) > B. pseudocatenulatum (Д1=547,5 [445;799]) > B. catenulatum (Д1=75,1 [-112;116]]) > B. adolescentis (Д1=-162 [-196;51]). На основании чего мы можем сделать вывод, что представители B. longum, B. bifidum и B. pseudocatenulatum проявляют выраженный синергизм в отношении L. rhamnosus, поскольку значения Д1 имеют положительные значения и варьируют от 547,5 до 975,6 ед., в отличие от культур B. catenulatum и B. adolescentis, у которых значения Д1 либо низкие, либо имеют отрицательный знак.

Анализируя разброс значения дискриминантной функции Д2 доминантов в отношении чужеродности S. aureus, можно также отметить отличия уровней показателя Д2 у культур бифидобактерий, который уменьшался в ряду: B. longum (Д2=575,9 [495;1113]) > B. pseudocatenulatum (Д2=504 [441;566]) > B. bifidum (Д2=380 [-490;1813]) > B. catenulatum (Д2=305 [76;508]) > B. adolescentis (Д2=119 [-493;176]).

Данные закономерности в варьировании значения дискриминантных функций отмечались во всех парах «доминант-ассоциант» при реализации микробного распознавания, причем различия наблюдались не только на уровне вида, но и штаммов доминантов. В качестве примера штаммоспеци-фического характера микробного распознавания можно проанализировать пример дифференцировки ассоциантов на «свои» и «чужие» культурами вида B. bifidum (табл. 15).

Оценивая значения дискриминантных функций Д1 штаммов B. bifidum в отношении ассоциантов L. rhamnosus, были получены следующие результаты: штамм B. bifidum № 310 имел значения Д1 равные 789 ед., у культуры B. bifidum № 349 - 286 ед., причем оба штамма выделены при эубиозе толстого кишечника, но B. bifidum № 349 в ассоциации с B. longum и B. pseudocatenulatum, у B. bifidum № 310 отмечалось вегетирование в микро-симбиоценозе толстого кишечника в моновидовом варианте. У культур B. bifidum № 742, № 599, № 906 и 830 изолированные при дисбиозе толстого кишечника уровень Д1 варьировал от -395 ед. до -34,3 ед. Хотя в целом у представителей данного вида бифидобактерий компоненты метаболитов L. rhamnosus не вызывали нареканий, что эта культура - «своя» и не имеет признаков «чужеродности», так как во всех случаях значения Д1 было больше Д2.

Что касается результатов оценки значений дискриминантной функции Д2 культур бифидобактерий внутри вида B. bifidum в отношении S. aureus, то штаммоспецифические особенности при распознавании ассоциантов сохранялись. Значение Д2 у штамма В. bifidum № 310 (Д2=775) было выше, чем у В. bifidum № 349 (Д2=380), а у представителей, изолированных при дисбиозе изменялись от -350 ед. до 1813 ед. Отличия на уровне штаммов отмечались не только при анализе способности бифидобактерий сортировать ассоциан-тов, но и имелись отличия в белковом профиле, спектре карбоновых кислот и системообразующих факторов штаммов доминантов (таблица 12).

Для оценки взаимосвязи биологических свойств доминантов в реализации микробного распознования «свой-чужой» был проведен корреляционный анализ параметров микробного распознавания с характеристиками протеом-ного, метаболического профиля и биологических свойств бифидобактерий. В результате среди всех изученных параметров наибольший коэффициент корреляции был характерен для АЛА бифидобактерий (г=0,66), БПО (г=0,62) и способности продуцировать УК (г= 0,7), Это позволило рассматривать данные свойства доминантов как факторы, определяющие и значимые в реализации феномена микробного распознавания в условиях кишечного микро-симбиоценоза.

Таким образом, полученные результаты микробного распознавания бифидофлорой ассоциантов показали, что способность к реализации феномена «свой-чужой» имеет как видоспецифические особенности, так и штам-моспецифические отличия внутри вида. Способность бифидофлоры к диф-ференцировке ассоциантов, также как биопрофиль, спектр короткоцепочеч-ных жирных кислот и белковый профиль, является индивидуальной характеристикой штаммов бифидобактерий.

Учитывая, что штаммоспецифичность свойств бифидобактерий коррелирует с микроэкологическим состоянием микросимбиоценоза толстого кишечника человека, то можно предположить, что данные особенности экспрессии свойств отдельных штаммов бифидофлоры связаны с их функциональным потенциалом, позволяющих оказывать мутуалистический эффект бифидобактерий в организме человека.

На следующем этапе работы была предпринята попытка моделирования данного метода. Для этого был использован метод векторизации аналитических триад (ВАНТ), являющийся вычислительным и обеспечивающий связь признакового и геометрического пространств. Связь достигается с помощью тригонометрических вычислений углов в 3-0 пространстве между идеальным искусственным вектором (репер) и тестируемыми векторами.

Таблица 12 - Сравнительные данные, характеризующие белковый, метаболический профиль, биологические свойства и способность различных

штаммов В. bifidum к микробному распознаванию

——штаммы свойства ——______ № 310 № 349 № 530 № 599 № 742 № 830

E. coli hly «-» lac «+» 2590 1672 810,6 385 415 594

L. rhamnosus 789 286 -395 -497 -372 -166

^ E. faecium 893 931 -332 -787 222 295

B. fragilis 351 41,3 591 -526 -722 -251

E. coli hly «+» lac «-» 244 190 -800 -425 -30,1 577

K. pneumoniae 892 871 1205 434 684 1029

P. aeruginosa 1040 1042 893 936 907 939

С* C. perfringens 433 273 -713 -978 -813 -60

S. aureus 1547 1537 1033 -683 613 260

P. acnes 775 380 966 -58,7 309 547

C. albicans 1176 975 257 194 562 373

Количество спектров 4 33 5 19 16 18

« „ S >4 >4 R Диапазон 7484- 1157- 1157- 1151- 1151- 1159-

g я й "î " О 1 7545 13176 9849 9843 9753 9505

7502 1157 1157, 2690, 2690, 2690,

« M И К Max интенсивные пики 5388 3588, 3588, 3589, 3590,

9836 7311 5390 5393 5393

Уксусная кислота, ммоль/л 38,5 15 2,8 9,2 8,4 6,9

X M ы CÛ о я от 1© о Я (J Si SS Пропионовая кислота, ммоль/л 0,15 0,044 0,05 0,08 0,64 0,05

Изомасляная кислота, ммоль/л 0,07 0,014 0,014 0,01 0,12 0,02

Масляная кислота, ммоль/л 0,06 0,06 0 0,04 0,02 0,06

а « н Ьй » = и Валериановая кислота, ммоль/л 0,12 0,02 0 0 0 0,02

Капроновая кислота, ммоль/л 0,05 0,005 0,03 0,1 0,1 0,03

Изокапроновая кислота, ммоль/л 0,09 0,05 0 0,02 0 0,03

е о АЛА 1,42 1,1 1,32 0,75 0,43 0

БПО 0,4 0,32 0,33 0,243 0,24 0,13

и ростовые свойства 0,6 0,51 0,44 0,3 0,46 0,3

Примечание: Д1/Д2 - значения коэффициентов распознавания; СОФ щий фактор микросимбиоценоза; АЛА - антилизоцимная активность, образование - системообразую-БПО - биопленко-

Геометрическое пространство формировалось координатными осями X, У, 7, которые соответствовали 3 системообразующим признакам: АЛА, РОСТ и БПО (рисунок 16). Вначале был определен идеальный искусственный вектор с равными и максимальными значениями АЛА, РОСТ и БПО. То есть идеальный вектор (красный вектор на рис.) - это вектор, равноотда-лённый в координате трёх осей, длина которого максимальна из всех возможных, так как по каждой оси находилось максимальное значение из заданной выборки. После определения идеального вектора в заданном пространстве строили все остальные векторы и сравнивали с ним. Для этого на каждой оси отмечали значение равное уровню признака каждого теста, соответствующие значению свойств ассоциантов, и в результате в пространстве каждому тесту соответствовала своя точка. Точка порождает свой вектор, а угол между ним и идеальным вектором очевидно обратно пропорционален генеральному сходству тестов.

Далее мы находили вектора, которые расположены в том же направлении, что и исскуственный вектор и которые имеют минимальное значение косинуса угла с ним, дополнительно учитывается длина векторов. Мы выбирали вектор, который самый близкий к идеальному, этот вектор являлся кандидатом на реальный репер в заданной выборке. Затем вся процедура тригонометрических вычислений углов в 3-0 пространстве повторялась, но уже между реальным вектором и векторами тестов. Находится проекция каждого из векторов на реальный вектор. Она равна произведению длины вектора на косинус угла с ним. Отношение проекции к длине идеального вектора обозначается КиШ. Чем меньше значение угла между векторами, тем ближе тест к заданному реперу по заданным биологическим характеристикам: АЛА, РОСТ и БПО. Мы выбирали те тесты, которые поддерживают эталонный вектор при различных выборках. Очевидно, что тесты с близкими характеристиками будут генерировать вектора близкие к друг другу, направленные в одном пространстве и с малым углом между ними. И напротив, можно было ожидать, что тесты - антагонисты к реальному вектору будут формировать век-

тора в противоположном направлении. На данном принципе нами и была предпринята попытка численного измерения характеристик сходства/различия тестов (микроорганизмов) путем расчета углов между этими векторами и их длинами. Такой подход позволяет наметить важнейшие характеристики формирования симбиотических взаимоотношений при реализации феномена микробного распознавания «свой-чужой».

При анализе экспериментальных результатов «свой-чужой» в паре «доминант-ассоциант» методом векторизации аналитических триад в качестве реального вектора мы использовали значения АЛА, РОСТ и БПО эталонного штамма B. longum MC-42, как ассоцианта, который распознавался доминантами - представителями бифидофлоры.

Рисунок 16 - Принцип метода векторизации аналитических триад (ВАНТ)

В результате все числовые значения углов в 3-D пространстве отражали межмикробные взаимоотношения между доминантами и ассоциантами по сравнению со способностью доминантов распознавать представителей собственного таксона. Интерпретация особенностей межмикробного распознова-ния с помощью метода ВАНТ позволила получить данные сходные с результатами, полученными с помощью математической модели на основе дискриминантного анализа. Метод ВАНТ также позволил дифференцировать ассоциативную микробиоту на «своих» и «чужих».

На рисунках 17 и 18 представлено ранжирование коэффициентов распознавания в отношении ассоциативной микрофлоры толстого кишечника человека с использованием математической модели и вычислительно-пространственной. Значения коэффициентов распознавания (Kutil) находились в диапазоне от -1 до +1. Знак коэффициента определяет тип (синергизм/антагонизм) влияния бифидобактерий на базовые физиологические свойства ассоциантов.

Отрицательные значения коэффициентов, характеризующие антагонистический тип влияния бифидофлоры на РС, АЛА и БПО ассоцианта, позволяет отнести культуры C. perfringens, E. coli hly+, P. acnes, C. albicans, P. aeruginosa, S. aureus и K. pneumoniae к штаммам, имеющим признаки «чу-жеродности». Тогда как положительные значения коэффициента, свидетельствующие о синергидных взаимоотношениях доминантов с ассоциативными культурами, дает возможность причислить штаммы E. coli hly -, L. rhamnosus, E. faecium и B. fragilis к «своим», лишенным признаков «чужеродности».

Величина коэффициента распознования отражает выраженность антагонистического или синергидного влияния бифидофлоры на биологические свойства ассоциативной микробиоты. Наиболее выраженные значения коэффициента в отношении «своих» ассоциантов отмечались к штаммам E. coli hly - и L. rhamnosus (от 0,88 до 0,59 ед.), в отношении «чужих» - C. albicans, P. aeruginosa, S. aureus и K. pneumoniae (от -0,77 до -0,98 ед.).

1500

с! Ш

-500

Рисунок 17 - Ранжирование коэффициента распознавания (Д1/Д2) бифидобактерий в паре «доминант-ассоциант» с использованием дискриминантного анализа

Примечание: сплошная черная штриховка- среднее значение коэффициента распознавания Д1 («своих»), сплошная светло-серая штриховка среднее значение коэффициента распознавания Д2 («чужих»)

Рисунок 18 - Ранжирование коэффициента распознавания (КиШ) бифидобактерий в паре «доминант-ассоциант» с использованием вычислительного метода ВАНТ

Примечание: сплошная черная штриховка - среднее значение коэффициента распознавания КиШ («своих»), сплошная светло-серая штриховка - среднее значение коэффициента распознавания КиШ («чужих»)

Коэффициент микробного распознования отличался у различных видов бифидобактерий. Так, в отношении «своих» ассоциантов уровень коэффициента уменьшался в ряду B. longum (^Ш 0,9 ед.) > B. Ыfidum (^Ш 0,77 ед.), B. pseudocatenulatum (Kutil 0,65 ед.) > B. catenulatum (Kutil 0,53 ед.) > В. adolescentis (^Ш 0,31 ед.). В то время как в отношении «чужих» ассоциантов ряд был представлен следующим образом: B. longum (^Ш - 0,91 ед.) > B. Ыfidum (^Ш - 0,69 ед.) > B. catenulatum (^Ш -0,64 ед.), В. adolescentis (^Ш -0,6 ед.) > B. pseudocatenulatum (^Ш -0,52 ед.). Таким образом, культуры бифидобактерий вида B. longum имеющие выраженные значения коэффициентов микробного распознавания. Что также соотносится с данными дискрими-нантного анализа.

Модельная система микробного распознования «свой-чужой», реализуемая бифидофлорой, позволила ранжировать ассоциантов кишечного мик-росимбиоценоза по степени «чужеродности» и оценить особенности биокоммуникативной активности доминантов при различных микроэкологических состояниях толстого кишечника человека, характеризующиеся сменой синергидных/антагонистических типов связей с ассоциантами при эубиозе на антагонистический тип при дисбиозе, сохраняя за счет механизмов непрямого антагонистического действия регуляторное влияние на состав микросим-биоценоза.

При анализе фактического материала совершенно очевидно, что при ассоциативном симбиозе не только организм хозяина способен участвовать в распознавании «свой - чужой» в отношении микрофлоры посредством различных механизмов врожденного и адаптивного иммунитета, но и доминантные микроорганизмы могут определять «свои» и «чужие» виды бактерий и грибов при формировании микросимбиоценоза. Это значит, что механизмы хозяина и микробиоты вовлечены в тесное сотрудничество для своего синер-гидного существования в целях сохранения симбиоза. Данный факт подтверждает как значение микробного распознавания, так и отражает ключе-

вую роль бифидобактерий в процессах сохранения гомеостаза толстого кишечника человека.

5.2. Разработка способа определения биосовместимости кишечных микросимбионтов на основе феномена распознавания «свой-чужой»

В природе организмы существуют не дискретно, вне связи с другими организмами, а постоянно взаимодействуют с множеством других организмов. Наличие связи между ними приводит к возникновению биологических ассоциаций, симбиотических комплексов с микроорганизмами разной степени сложности. Для определения эффективности взаимодействия микросимбионтов должны быть определены критерии (признаки), направленность типов связей, требующие проведение исследований и разработки новых экспериментальных подходов [10, 13]. Понимание и теоретическое осмысление экологических закономерностей функционирования симбиотической микрофлоры является необходимой предпосылкой для развития и совершенствования способов влияния на ее формирование и нормализацию с помощью различных форм пробиотиков из представителей резидентной микрофлоры.

В фундаментальной работе «Новый принцип биологии. Очерки теории симбиогенеза» Б.М. Козо-Полянским (1924) было предложено для характеристики симбиоза учитывать степень объединения партнеров, выявляя морфологические, физиологические особенности симбиотических систем. Вместе с тем, в современной литературе мы не встретили индексы и показатели, характеризующие уровень биосовместимости между участниками симбиоза. Известно использование для оценки взаимодействия между партнерами -симбионтами индекса взаимодействия или симбиотический индекс, определяемый как соотношение показателя развития вида в составе симбиоза к таковому в свободноживущем состоянии [13]. Данный индекс может скорее характеризовать степень облигатного (обязательный) симбиоза или уровень специализации микросимбионтов к занимаемому биотопу, нежели свиде-

тельствовать об отношениях между партнерами, учитывая многокомпонент-ность известных симбиозов.

Современные информационные технологии дают возможность структурировать обширные базы данных, оценивать как множество единичных показателей, так и их совокупность в многомерном пространстве показателей, проводить статистический и экологический анализ. Так, использование синэкологического анализа микросимбиоценозов здоровых и больных людей разных возрастных групп, проживающих на территории промышленного мегаполиса, проводили с помощью количественного описания видового разнообразия сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки человека [57, 58]. Были проведены расчеты с использованием общепринятых в экологии индексов: видового разнообразия Шеннона, доминирования Симп-сона, видового богатства Маргалефа и выравненности Пиелу, а также предложены авторами особенности возрастной периодизации, основанной как на физиологических параметрах, так и на состоянии микробиоты ЖКТ. В результате был определен спектр родов микроорганизмов, приоритетных для использования в качестве штаммов-продуцентов пробиотиков: бактерии родов Lactobacillus, Bifidobacterium и Lactococcus.

Проведенный анализ межвидовых коммуникаций бифидобактерий в парных сочетаниях в рамках биоценоза показал избирательное отношение видов к совместному вегетированию [43, 44]. Для определения степени совместимости или расхождения между парами видов использовали показатель К (коэффициент парной совместимости), учитывающий число событий, в которых одновременно наблюдалось оба исследуемых вида в сравнении по отношению к число событий с видами в общей выборке. По выраженности коэффициента совместного встречаемости видов судили о наличии, либо отсутствии антагонистических отношений в парах бифидобактерий.

Вместе с тем, использование показателей, характеризующих структурно-таксономические особенности микросимбиоценозов, без учета ряда физиологических параметров (рост, репродукция, выживаемость) прокариот,

может являться, прежде всего, предпосылкой для дальнейшего изучения формирования и функционирования симбиотических взаимодействий микроорганизмов.

В методах экосистемномного анализа также известно применение коэффициентов конкурентоспособности жертв и конкурентоспособности хищников, используемый при изучении модели сосуществования только двух видов, из которых один («жертва») служит пищей для другого («хищника») [23]. Данная модель подходит для изучения биосистем с большей степенью организации, чем у одноклеточных прокариот и характеризуют только антагонистический тип взаимодействия между партнерами.

На сегодняшний день модель «хищник-жертва» получила активное развитие в теориях эволюционной игры, нелинейной динамики и теории случайных процессов, включающая математические инструменты и концептуальную основу для более глубокого понимания взаимодействий видов в экологических системах [77, 110, 234, 296]. Эти теории сформулированы на языке нелинейной динамики, где термины теории игр «равновесие Нэша» или «эволюционная стабильная стратегия» отображаются на «неподвижных точках» обычных нелинейных дифференциальных уравнений. Иллюстрации этих понятий даны в терминах двухстраничных игр и циклической модели Лотка-Вольтерра, также известной как игра «камень-ножницы-бумага».

Циклическая конкуренция видов, как метафорически описываемая детской игрой «камень-ножницы-бумага», является основой видовых взаимодействий. Лабораторные эксперименты по популяциям, состоящим из различных бактериальных штаммов E. coli, показали, что бактерии могут сосуществовать, если низкая подвижность сегрегации (отделения) различных штаммов. Однако детерминированное описание популяций взаимодействующих индивидов в терминах нелинейных дифференциальных уравнений не учитывает некоторые важные особенности реальных экологических систем. Так, показаны нетранзитивный тип взаимодействий «камень-ножницы-бумага» на примере бактериоцин-продуцирующих, бактериоцин-

чувствительных и бактериоцин-резистентных штаммов E. coli [86, 145]. Однако, в естественной среде наличие у прокариот генетически детерминированной системы «токсин-антитоксин» определяет существование у большинства штаммов способности к секреции и резистентности к действию колици-нов, и лишь у небольшой части популяции - чувствительности.

С позиции ассоциативного симбиоза, оценивая микросимбиоценоз в качестве биологической системы, обладающей регуляторной функцией, направленной на поддержание собственной сложной многовидовой структуры и выступающей регулятором гомеостаза организма хозяина, авторами были выделены 2 наиболее важные функции микробной системы: размножение и адаптацию к меняющимся условиям среды [10]. В соответствии с названными базовыми функциями были уточнены их критерии. Для оценки ростовых свойств - это колониеобразующие единицы (КОЕ), т.е. число микробных клеток, а адаптации - факторы персистенции (переживания). Универсальный характер факторов персистенции позволил выделить: биопленкообразование (БПО) и антилизоцимный тест (АЛА), как отражающие адаптивные возможности микроорганизмов и встречающиеся одинаково часто при эубиозе, и при дисбиозе. Выбор этих универсальных тестов, характеризующих базовые функции микросимбионтов чрезвычайно важен, т.к. они позволяют одновременно решить вопрос и об определении «биомишени», без чего невозможна регуляция биосвойств микроорганизмов и отбор эффективных средств.

На модели микросимбионтов дистального отдела толстого кишечника человека с использованием алгоритма микробного распознавания «свой-чужой» были определены антагонистические/синергидные типы связей, что позволили с помощью доминантных микроорганизмов - бифидобактерий дифференцировать «свои» и «чужие» культуры микросимбионтов среди клинических изолятов бактерий и грибов. При использовании математической и аналитической модели при интерпретации результатов микробного распознавания был определен уровень как «чужеродности» между микросимби-

онтами и доминантами, так и уровень «биосовместимости» бифидофлоры к «своим» ассоциантам.

Это позволило нам использовать разработанный алгоритм как основу для определения способа биосовместимости между кишечными микросимбионтами, имеющего значение при формировании и функционировании мик-росимбиоценоза толстого кишечника человека. Разработка количественного способа биосовместимости микросимбионтов на основе микробного распознавания и определения разнонаправленности симбиотических типов связи между микроорганизмами, позволит ранжировать ассоциативное звено мик-росимбиоценоза, определить особенности экологических закономерностей формирования сообществ симбиотических микроорганизмов толстой кишки и прогнозировать дальнейшее формирование микросимбиоценозов через интерференцию ассоциантов, либо формирования стабильных консорциумов с доминантами. Поскольку ассоциативные микросимбионты, с одной стороны, не накапливаются в значимых количествах в морфологических структурах макросимбионта, с другой, часто присутствуют только на определенных стадиях развития симбиоза [5].

На следующем этапе работы были проведены экспериментальные исследования по разработке способа определения биосовместимости микросимбионтов на основе алгоритма микробного распознавания «свой-чужой», с определением показателя уровня биосовместимости (В). Для этого была предложена формула расчета показателя уровня биосовместимости микросимбионтов:

в _ (Р^/ РСk -1) + (БПОo/ БПОk-1) + (АЛАo/ АЛАk-1) " 3

где В - степень биосовместимости, %;

РСо - ростовые свойства штаммов в опыте, ед. ОП450;

РСк - ростовые свойства штаммов в контроле, ед. ОП450;

БПОо - биопленкообразование штаммов в опыте, ед. ОПбЗО; БПОк - биопленкообразование штаммов в контроле, ед. ОПбЗО; АЛАо - антилизоцимная активность штаммов в опыте, мкг/мл*ОП450; АЛАк - антилизоцимная активность штаммов в контроле, мкг/мл*ОП450, при этом при значении уровня биосовместимости равном либо больше 51% биосовместимость штаммов консорциума считают высоким.

Для проверки формулы был проведен анализ видового состава микро-симбиоценозов дистального отдела толстого кишечника человека у 20 пациентов в динамике (на 1-й и 14-30 день). Решение вопроса о принадлежности ассоциантов к «своему» или «чужому» виду проводили с использованием разработанной модели оценки распознавания «свой-чужой» в паре «доми-нант-ассоциант».

Для исследования микросимбиоценозов кишечника человека в динамике были выбрана группа условно-здоровых пациентов в возрасте от 18 до 45 лет, у которых при первичном обследовании был выявлен эубиоз биотопа дистального отдела толстого кишечника (10 пациентов) или дисбиоз кишечника I степени тяжести (10 пациентов). На время проведения исследований прием антибактериальных препаратов и коррекция микросимбиоценоза иммунобиологическими препаратами не проводилась.

Микросимбиоценозы кишечника пациентов на момент обследования были образованы ассоциациями микроорганизмов следующего состава: при эубиозе - «Bifidobacterium spp. (B. longum, B. bifidum) + E. coli (лактозопози-тивные негемолитические) + E. faecium» (у 2 пациентов), «Bifidobacterium spp. (B. longum, B. bifidum) + Lactobacillus (L. acidophilus, L. fermentum) + E. coli (лактозопозитивные негемолитические) + E. faecium» (у З пациентов); при дисбиозе I степени - «Bifidobacterium spp. (B. longum, B. bifidum) + E. coli (лактозопозитивные негемолитические) + E. faecium + C. albicans» (у 4 пациентов), «Bifidobacterium spp. (B. longum, B. bifidum) + Lactobacillus (L. acidophilus, L. fermentum) + E. coli (лактозопозитивные негемолитические) + E. coli (лактозонегативные гемолитические)» (у 5 пациентов), «Bifidobacterium spp. (B. longum, B. bifidum) + E. coli (лактозопозитивные негемолитические) +

E. faecium + K. pneumoniae» (у 2 пациентов); «Bifidobacterium spp. (B. longum, B. bifidum) + E. coli (лактозопозитивные негемолитические) + E. faecalis (гемолитические)» (у 4 пациентов).

Изолированные штаммы ассоциантов (лактозопозитивные негемолитические E. coli, лактозонегативные гемолитические E. coli, K. pneumoniae, E. faecium, E. faecalis, C. albicans) были исследованы по разработанной методике оценки «свой-чужой» в микросимбиоценозе кишечника человека. В качестве индикаторных штаммов были использованы культуры B. longum, выделенные из исследуемого микросимбиоценоза толстого кишечника человека. Определяли влияние доминантов (B. longum), после предварительного со-инкубирования с супернатантами ассоциантов, на рост/размножение, антили-зоцимную активность и биопленкообразование ассоциантов. Для интерпри-тации результатов микробного распознавания в микросимбиоценозах рассчитывали величину дискриминантной функции и параллельно показатель уровня биосовместимости микросимбионтов. Обобщенные результаты исследований представлены в таблице 13.

Применение разработанной математической модели для штаммов лак-

тозопозитивных негемолитических кишечных палочек позволило определить, что у всех исследуемых штаммов E. coli максимальная величина дис-криминантной функции была установлена на первой стоке (Д1), на основании чего исследуемые культуры были отнесены к «своим» штаммам микросимбионтов. Расчет показателя уровня биосовместимости культур с бифидобак-териями составил 45,0±4,2 %.

При повторном посеве испражнений пациентов через 14 -30 дней в большинстве случаев (16 микросимбиоценозов из 20) отмечалось сохранение численности лактозопозитивных негемолитических кишечных палочек на прежнем уровне. У 3 пациентов отмечена тенденция к увеличению показате-

7 8

ля микробной обсемененности эшерихий с 10 до 10 КОЕ/мл и в 1 случае лактозопозитивные негемолитические E. coli в микросимбиоценозе не обнаруживались.

Таблица 13 - Результаты обследования микросимбиоценозов кишечника пациентов в динамике с различным уровнем показателя биосовместимости штаммов

Виды микроорганизмов Первичный результат обследования Коэффициенто микробного распознавания Д1/Д2 (ед.) Показатель уровня биосовместимости (%) Вторичный результат обследования (через 14-30 дней)

Частота (%) встречаемости вида ПМО (КОЕ/г) вида Частота (%) встречаемости вида ПМО (КОЕ/г) вида

E. coli лактозопозитивные негемолитические 100 (n=20) 105-107 Д1 (n=20) 806[402;1390] 45,0±4,2 (n=20) 95±0,5 105-108

E. coli лактозонегативные гемолитические 25±1,9 (n=5) 103-105 Д2 (n=5) 252[194;489] -48,0±3,0 (n=5) 0 0

K. pneumoniae 10±2,1 (n=2) 107-108 Д2 (n=2) 686[320;916] -68,0±3,8 (n=2) 0 0

E. faecium 55±1,5 (n=11) 105-107 Д1 (n=10) 224[141;398] Д2 (n=1) 216[108;411] 34,0±4,5 (n=10) -32,0±2,8 (n=1) 91±1,0 105-107

E. faecalis гемолитические 20±2,0 (n=4) 105-107 Д2 (n=4) 324[228;621] -42,0±3,1 (n=4) 0 0

C. albicans 20±2,0 (n=4) 104-105 Д2 (n=4) 356[141;617] -44,8±3,1 (n=4) 20±2,0 102-103

Исследование штаммов лактозонегативных гемолитических кишечных палочек с применением математической модели, позволило определить, что у всех исследуемых штаммов E. coli максимальная величина дискриминант-ной функции была установлена на второй стоке (Д2), на основании чего исследуемые культуры были отнесены к «чужим» штаммам микросимбионтов. Значение показателя уровня биосовместимости было равно -45,0 ±3,0 % При повторном посеве испражнений пациентов через 14 -30 дней во всех случаях лактозонегативные гемолитические E. coli в микросимбиоценозе не обнаруживались.

Сходные данные, с результатами, полученными в отношении лактозонегативных гемолитических E. coli, были выявлены при реализации микробного распознавания в паре «доминант-ассоциант» с участием штаммов клеб-сиелл и гемолитических энтерококков. Что же касается грибов рода Candida, которые по результату исследований были отнесены к «чужим» видам микросимбионтов, а уровень биосовместимости равен -74,0±5,8 %, то при повторном изучении микросимбиоценоза кишечника пациентов дрожжевые грибы были обнаружены в составе микросимбиоценоза, но их численность снизилась с 103-104 до 101 КОЕ/мл.

Применение разработанной формулы расчета биосовместимости микросимбионтов и математической модели для штаммов энтерококков позволило определить, что у большинства (10 штаммов из 11) исследуемых штаммов E. faecium максимальная величина дискриминантной функции была установлена на первой стоке (Д1), на основании чего исследуемые культуры были отнесены к «своим» штаммам микросимбионтов, а одна культура E. faecium была отнесена к «чужому» штамму. При этом значение показателя биосовместимости в первом случае составила 34,0±4,5% , а во втором - соответственно - 32,0±2,8 %. При повторном посеве испражнений пациентов через 14 -30 дней в большинстве отмечалось сохранение численности энтерококков на прежнем уровне.

Таким образом, полученные результаты показали в 92±6,9 % случаев эффективность разработанной формулы расчета уровня биосовместимости, результаты которой совпадали с применением дискриминатного анализа при интерпретации микробного распознавания в паре «доминант-ассоциант». Микроорганизмы, которые по результату воздействия на них бифидобакте-рий были отнесены к категории «чужой» и были бионесовместимые, при повторном исследовании микросимбиоценоза кишечника через 14-30 дней снижали свою численность либо не обнаруживались, тогда как «свои» (биосовместимые) виды микросимбионтов достоверно не изменяли свою численность и сохранялись в ассоциации с бифидофлорой на протяжении данного времени.

Очевидно, что присутствие в супернатанте микроорганизмов факторов, связанных с патогенностью и персистентными свойствами микроорганизмов значимо для микробного «распознавания», что было выявлено фенотипиче-ски в ряде экспериментов. Показано, что наличие токсинов (гемолизины, эн-теротоксины) и факторов, обеспечивающих антилизоцимный признак энте-робактерий, позволяет доминантной микрофлоре (бифидобактериям) «распознавать» штаммы в качестве «чужеродных» в условии стабильного подавления параметров репродукции и адаптации микроорганизмов. Однако, вопрос о химической природе этих факторов остается открытым. Кроме того, выяснение механизмов феномена микробного распознавания требует создания моделей in vitro, основанных на оппозитных штаммах одного и того же вида микроорганизмов, различающихся по своим биологическим характеристикам, метаболическому и генетическому профилю.

В продолжение исследований микробного распознавания «свой-чужой», были выбраны культуры E. coli M-17 и ЛЭГМ-18. Целью данного этапа исследования явилось определение различий в распознавании бифидо-бактериями «чужеродности» среди штаммов кишечных палочек, различающихся по наличию острова патогенности, кодирующего колибактин.

В качестве доминантов использовали эталонные штаммы бифидобак-терий: B. bifidum 791 (№ депонента АС-1247 Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИ «Генетика»), B. longum МС-42 (ГИСК им. Л.А. Тарасевича), являющиеся производственными пробиоти-ческими культурами. Также были использованы клинические культуры B. longum 505, B. bifidum 349, B. catenulatum 504, изолированные от пациентов при обследовании на дисбиоз кишечника.

В качестве культур ассоциантов, в отношении которых изучалась способность бифидобактерий дифференцировать «свои» и «чужие» штаммы, использовали эталонные культуры бактерий E. coli M-17 и E. coli ЛЭГM-18 (ГИСК им. Л.А. Тарасевича). Ранее было установлено, что штамм E. coli М-17 содержит введённую неконъюгативную, немобилизуемую плазмиду рСо1ар, несущую гены продукции колицина Е1 и детерминант устойчивости к ампициллину в дозах до 150 мг/л, а также гены clbB, clbN, clbA и clbQ, ассоциированные с образованием генотоксического колибактина [60].

При оценке полученных результатов следует обратить внимание, что в начале опыта были поставлены контроли изучаемых биологических характеристик E. coli M-17 и E. coli ЛЭГM-18. В таблице суммированы эти данные на основании 9 опытов и оказалось, что различия между изучаемыми культурами были отмечены только в отношении пролиферативной активности бактерий, которая значительно была выше у E. coli M-17, где РС составили 0,93±0,06 ед*ОП450, тогда как для E. coli ЛЭГM-18 этот показатель был ниже - 0,57±0,1 ед*ОП450 (р<0,05). Характеристики БПО и АЛА у сравниваемых кишечных палочек существенно не различались. У E. coli M-17 эти показатели составили для БПО - 0,3±0,03 ед*ОП630, АЛА - 0,52±0,1 мкг/мл*ОП450, а для штамма E. coli M-18 - 0,25±0,09 ед*ОП630 и 0,4±0,08 мкг/мл*ОП450 соответственно. Таковы были исходные биологические характеристики изучаемых культур.

На следующем этапе опытов было оценено влияния метаболитов ин-тактной бифидофлоры на биологические характеристики изучаемых кишеч-

ных штаммов (ещё один контроль), а в последующем было определено воздействие индуцированной бифидофлоры метаболитами ассоциантов, на изучаемые характеристики E. coli M-17 и E. coli ЛЭГМ-18. Результаты представлены в таблице 14, 15.

Оценивая культуру E. coli М-17, следует отметить, негативное отношение к ней (подавление изучаемых признаков) со стороны индуцированной нормофлоры эталонных культур - B. bifidum № 791инд и B. longum МС-42инд. Интересно, что в целом сходно повели себя и наши клинические штаммы B. longum 505инд, B. bifidum 349инд и B. catenulatum 504инд, что позволяет отнести E. coli М-17 к «чужим» видам, хотя она использовалась в коммерческом препарате «Колибактерин» в прошлом. Что касается результатов оценки культур с использованием интактных метаболитов бифидофлоры в отношении ассоциантов (промежуточный контроль), то изучение E. coli ЛЭГМ-18 (без острова патогенности) не вызывало нареканий, что эта культура - «своя» и не имеет признаков «чужеродности», что демонстрирует B. bifidum № 791 не проявляя выраженного антагонизма. Тоже можно сказать и о другой эталонной культуре - B. longum МС-42, проявляющей четко выраженный синергизм в отношении E. coli ЛЭГМ-18. Не проявляли выраженного антагонизма в отношении кишечной палочки ЛЭГМ-18 и клинические культуры (даже на промежуточном контрольном этапе) - B. longum 505к, не говоря уже о B. longum 505инд Тоже следует сказать о B. bifidum 349 и B. catenulatum 504.

В данной работе были выявлены особенности регуляторного влияния в отношении модельных штаммов E. coli М-17 и E. coli ЛЭГМ-18 как у бифи-добактерий из контрольных проб, так и у индуцированных метаболитами тест-культур, заключающиеся в преимущественном усилении исследуемых биологических характеристик у E. coli ЛЭГМ-18 и подавлением - у E. coli М-17, которые усиливались или появлялись у индуцированных культур бифи-добактерий.

По-видимому, наблюдаемые различия при действии штаммов E. coli, различающихся по наличию генотоксин-кодирующего острова патогенности

могут быть связаны с многофункциональной ролью низкомолекулярных пеп-тид-поликетидных соединений, тесно связанных с системами сидерофоров [209]. Известно, что эти молекулы имеют широкое адаптивное значение для множества микроорганизмов в условиях конкуренции за ионы многовалентных металлов [168], детекция которых, таким образом, может играть важную роль в межвидовой коммуникации бактерий в системе распознавания «свой-чужой». Полученные результаты свидетельствуют, что данные низкомолекулярные пептид-поликетидные соединения могут являться одними из «кандидатов» на роль маркеров «чужеродности» микросимбионтов, значимых при микробном распознавании, что требует дальнейших исследований в этом направлении. Учитывая тот факт, что в экспериментах in vitro были использованы эталонные штаммы бифидобактерий, являющиеся производственными культурами пробиотиков, полученные данные открывают перспективу использования микробного распознавания «свой-чужой» в качестве базового метода при отборе пробиотических препаратов и штаммов микроорганизмов для создания новых синбиотических композиций.

Таблица 14 - Динамика биологических свойств пробиотических культур E. coli М-17 и E. coli ЛЭГМ-18 под воздействи-

ем метаболитов бифидобактерий при межмикробном распознавании «свой-чужой»

Исследуемые E. coli М-17 E. coli ЛЭГМ-18

ассоцианты Доминантные культуры рс, ед. ОП450 БПО, ед. ОП630 АЛА, мкг/мл*ОП450 РС, ед. ОП450 БПО, ед. ОП630 АЛА, мкг/мл*ОП450

контроль 0,93±0,06 контроль 0,3±0,03 контроль 0,52±0,1 контроль 0,57±0,1 контроль 0,3±0,09 контроль 0,4±0,08

B. bifidum № 791к 0,94±0,2 0,3±0,04 0,57±0,03 0,56±0,07 0,57±0,004* 0,48 ±0,005*

ыы К £р § ^ B. bifidum № 791инд. 0,76±0,03** 0,24±0,02** 0,15±0,03** 0,75±0,02* 0,9±0,03* 0,39±0,04

§ £ & ^у ¡Г) B. adolescentis М-42к 0,77±0,003** 0,3±0,04 0,53±0,07 0,55±0,07 0,37±0,09* 0,65±0,1*

B. adolescentis М-42инд 0,65±0,04** 0,2±0,02** 0,14±0,03** 0,7±0,09* 0,61±0,05* 0,9±0,03*

B. longum 505к 0,9±0,05 0,27±0,01 0,48±0,03 0,63±0,02 0,28±0,02 0,42±0,03

(U B. longum 505инд 0,81±0,03** 0,18±0,03** 0,22±0,03** 0,83±0,04* 0,51±0,01* 0,8±0,04*

К _, кы О £ fr B. bifidum 349к 0,91±0,03 0,22±0,04** 0,33±0,04** 0,61±0,02 0,35±0,04* 0,42±0,02

к £ к ^ лк B. bifidum 349инд 0,89±0,01 0,2±0,1** 0,24±0,01** 0,74±0,1* 0,32±0,02* 0,65±0,06*

B. catenulatum 504к 0,94±0,1 0,31±0,05 0,6±0,05 0,94±0,05* 0,75±0,03* 0,38±0,01

B. catenulatum 504инд 0,78±0,02** 0,12±0,06** 0,37±0,01** 0,71±0,03* 0,54±0,07* 0,45±0,07

Примечание: отсутствие индекса - нейтрализм, * - синергизм, ** - антагонизм (р<0,05)

Таблица 15 - Значение дискриминантной функции и показателя уровня биосовместимости пробиотических культур E. coli М-17 и E. coli ЛЭГМ-18 под воздействием метаболитов бифидобактерий при межмикробном распознавании «свой-чужой»

Исследуемые ^^^ ассоцианты E. coli М-17 E. coli ЛЭГМ-18

Доминантные ^^^ культуры Д1/Д2, ед Интерпретация В, % Интерпретация Д1/Д2, ед Интерпретация В, % Интерпретация

3 л нр н ут о ^ B. bifidum № 791 Д2: 614,94 «чужой» - 37 БНс Д1: 317,41 «свой» 77 Бс

§ ч ал £ * ¡Г) B. longum МС-42 Д2: 773,24 «чужой» - 46 БНс Д1: 596,12 «свой» 82 Бс

е и B. longum 505 Д2: 481,01 «чужой» -37 БНс Д1: 1169,2 «свой» 89 Бс

Клиническ культуры B. bifidum 349 Д2: 484,04 «чужой» - 31 БНс Д1: 186,00 «свой» 40 Бс

B. catenulatum 504 Д2: 515,34 «чужой» - 35 БНс Д1: 253,78 «свой» 93 Бс

Примечание: БНс - бионесовместимые; Бс - биосовместимые

5.3. Обсуждение результатов

Полученные результаты по определению биокоммуникативной активности бифидофлоры на основе микробного распознавания «свой-чужой» свидетельствуют о том, что у различных видов бифидобактерий способность дифференцировать ассоциантов на «своих» и «чужих» варьирует как среди представителей различных видов (B. longum > B. bifidum > B. pseudocatenulatum > B. catenulatum > B. adolescentis), так и на уровне штам-мового признака.

Использование метода межмикробного распознавания «свой-чужой» позволило разработать способ определения биосовместимости микробных культур и провести тестирование степени синергизма («своих») или антагонизма («чужих») микросимбионтов толстого кишечника человека, ранжируя их по степени чужеродности. Под биосовместимостью мы понимали: такое сочетание компонентов в консорциуме, при котором в результате микробного распознавания «свой-чужой» существенно (на 50 % и более) изменяются параметры СОФ микросимбиоценоза, обеспечивающие высокую жизнеспособность микробных клеток в данном консорциуме. К «своим» микросимбионтам были отнесены культуры, к которым степень синергизма снижалась в ряду: E. coli hly«-» lac«+» > L. rhamnosus > E. faecium > B. fragilis, к «чужим» степень антагонизма изменялась в ряду: S. aureus > P. aeruginosa > K. pneumoniae > C. albicans > E. coli hly «+» lac «-» > P. acnes > C. perfringens.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ, ИЗЛОЖЕННЫМ В 5 ГЛАВЕ

Монография:

1. Бухарин О.В., Перунова Н.Б., Иванова Е.В. Бифидофлора при ассоциативном симбиозе человека. - Екатеринбург: УрО РАН, 2014. - 212 с. (глава 3).

Статьи в журналах, рекомендованных в ВАК:

1. Перунова, Н.Б. Микробная регуляция биологических свойств бактерий кишечного микросимбиоценоза человека / Н.Б. Перунова, Е.В. Иванова, О.В. Бухарин // Журнал микробиология, эпидемиологии и иммунобиологии. -2010. - № 6. - С.76-80.

2. Перунова, Н.Б. Влияние Bifidobacterium bifidum на способность инди-генных бактерий ингибировать образование биоплёнок транзиторной микрофлоры кишечника человека / Н.Б. Перунова, Е.В. Иванова // Вестник Оренбургского государственного университета. - 2011. - № 4. - С.62-65.

3. Бухарин, О.В. Взаимодействие Bifidobacterium bifidum с представителями нормальной микрофлоры в микросимбиоценозе кишечника человека /

0.В. Бухарин, Н.Б. Перунова, Е.В. Иванова // Журнал микробиология, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2012. - № 4. - С.51-56.

4. Иванова, Е.В. Изучение биологических свойств Candida spp. под действием экзометаболитов Bifidobacterium bifidum / Е.В. Иванова, Н.Б. Перунова // Проблемы медицинской микологии. - 2012. - Т.4, № 2. - С.86.

5. Перунова, Н.Б. Изменение биопленкообразования и антилизоцимной активности Gtrobacter freundii под действием метаболитов кишечной микро-биоты / Н.Б. Перунова, В.Г. Туйгунова, Е.В. Иванова, Ю.З. Габидуллин // Научно-практический журнал «Медицинский вестник Башкортостана. - 2013. - № 4. - С.10 - 14.

6. Бухарин, О.В. Микросимбиоценоз кишечника у детей с реактивным артритом / О.В. Бухарин, О.Е. Челпаченко, Е.И. Данилова, И.Н. Чайникова, Н.Б. Перунова, Е.В. Иванова, И.А. Никифоров, Л.П. Федотова, Т.А. Бонда-ренко, А.В. Салгина // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -2016. - №6. - С. 41 - 48.

Публикации в других изданиях:

1.Салгина, А.В. Антилизоцимная активность в ассоциации облигатно-анаэробных микросибионтов кишечника человека / А.В. Салгина, Т.А. Бон-даренко, Е.В. Иванова, [и др.] // Бюллетень Оренбургского научного центра

УрО РАН (электронный журнал). - 2014. - №3. - С. 1-7. URL: http: //www. elmag. uran. ru

2.Иванова Е.В., Перунова Н.Б., Борисова О.С., Кузнецова М.С. Характер межмикробных взаимоотношений при ассоциативном симбиозе дрожжевых грибов и бифидобактерий. Иммунопатология, аллергология, инфектология, 2010. №1. с. 104.

3. Челпаченко О.Е., Данилова Е.И., Федотова Л.П., Перунова Н.Б., Иванова Е.В., Сидорова О.И., Бондаренко Т.А. Особенности состояния кишечного микросимбиоценоза у детей с реактивными артритами // Материалы XVIII конгресса педиатров России «Актуальные проблемы педиатрии». Москва, 2015. часть I. С. 267.

Учебное пособие:

1. Бухарин О.В., Перунова Н.Б., Иванова Е.В., Андрющенко С.В. Бифидобактерии: геносистематика, экология и роль в организме человека: учебное пособие под грифом УМО по специальности «Бактериология» -040301. - Оренбург: Издательский цент ОГАУ, 2013. - 95 с.

ГЛАВА 6. ФУНДАМЕНТАЛЬНЫЕ И ПРИКЛАДНЫЕ АСПЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ БИФИДОБАКТЕРИЙ

По современным представлениям микробиота кишечника является основой формирования здоровья человека и его патологии. В последние годы появляется все больше доказательств взаимосвязи кишечной микробиоты и нарушений гомеостаза человека [148, 207, 232, 320].

В связи с этим, организм человека представляется как «супероорга-низм», включающий в себя консорциумы множества видов эукариот, бактерий, архей и вирусов [10, 151, 188, 270], где представители индигенной мик-робиоты рассматриваются как основной комплекс экстракорпоральной физиологической системы, работающей вкупе с метаболическими системами хозяина как единый организм для достижения гомеостаза системы в целом в условиях окружающей среды [212, 286, 315]. Несмотря на то, что некоторые механизмы влияния бифидобактерий на функции человека детально изучены, отсутствуют единые представления о том, каким образом может осуществляться интеграция Bifidobacterium spp. с хозяином? Какие основные направления регуляции систем макропартнера задействованы в интеграции с бифи-добактериями при достижении гомеостаза?

Расшифровку этих механизмов возможно осуществить, принимая во внимание взаимоотношения микробиоты и хозяина с позиции ассоциативного симбиоза - многокомпонентной интегральной системы, включающей хозяина (макропартнера), доминантные (нормофлора) и ассоциативные (условно-патогенные и патогенные) микроорганизмы с разнонаправленными эффектами [6]. Такой подход, четко обозначивший 3 вектора этой модели -«хозяин-доминант», «хозяин-ассоциант» и «микросимбиоценоз» оказывается весьма продуктивным, где микробная клетка является регулятором ряда физиологических функций организма.

Опираясь на анализ фактического материала, представленного в предыдущих главах, нами была предпринята попытка провести комплексный анализ физиологической роли бифидофлоры в организме человека,

определяющей механизмы интегративных взаимодействий микробиоты с организмом человека и основу доминирования бифидобактерий в процессах формирования симбиотических отношений как внутри микросимбиоценоза, так и с организмом хозяина. Не исключено, что использование инфектологического подхода в изучении данной проблемы может позволить расширить возможности использования бифидобактерий в прикладных целях: разработка критериев для отбора эффективных пробиотиков, конструирование новых симбиотиков (синбиотиков), создание эффективных биопрепаратов и продуктов функционального питания для стабилизации микробного баланса кишечной микробиоты человека.

6.1. Функциональные группы бифидофлоры кишечной микробиоты в

ассоциативном симбиозе человека

Вопрос о понимании физиологической роли, особенностей функционирования бифидофлоры в условиях кишечного микросимбиоценоза, направленных на поддержание гомеостаза микробиоты и макропартнера остается открытым. К настоящему времени накоплены убедительные материалы штаммовой специфичности бифидофлоры, определяющей различия функциональной активности культур в условиях межмикробного общения. Так, в ряде работ различные эффекты пробиотических бифидобактерий связывают со штаммоспецифическими особенностями иммуномодулирующего действия [72, 98] и метаболической активности бактерий [221]. Материал, полученный нами, позволил при изучении белкового профилирования бифидофлоры, их антагонистической активности и способности влиять на ассоциативную мик-робиоту, выявить, наряду с общностью штаммов, и различия между ними внутри вида. Не исключено, что оценивать физиологический потенциал би-фидобактерий необходимо не только по их видовой принадлежности, но и, возможно, по выявлению функциональных признаков микроорганизмов, подсказать природу которых может кластерная группировка бактерий.

В связи с этим, целью работы было определение функциональных групп бифидофлоры толстого кишечника человека на основе анализа особенностей спектра метаболитов, протеома, биопрофиля, иммунорегулятор-ных свойств и способности проводить дифференцировку «свой-чужой» среди ассоциантов, позволяющих выявлять особенности формирования функциональных кластеров доминантов при регуляции гомеостаза толстого кишечника человека.

Материалом для исследования послужили 260 штаммов бифидобакте-рий, выделенных из 122 кишечных микросимбиоценозов при обследовании лиц в возрасте от 1 года до 45 лет на дисбиоз толстого кишечника. Основным методологическим принципом работы явился комплексный симбиотический подход для изучения роли бифидофлоры в ассоциативном симбиозе человека. Авторами проведены эксперименты in vitro с использованием бактериологического, масс-спектрометрического, хроматографического, иммунологического методов, что позволило представить комплексную характеристику исследуемых штаммов бифидобактерий. В работе были оценены параметры системообразующего фактора (СОФ) микросимбиоценоза (ростовые свойства (lg ПМО), антилизоцимная активность (АЛА) и биопленкообразование (БПО) доминанта), персистентные свойства (антииммуноглобуллиновая (АИГА) и антилактоферриновая (АЛфА) активность), метаболический профиль (спектр и уровень уксусной (УК), пропионовой (ПК), масляной (МК), изомасляной (иМК), валерьяновой (ВК), капроновой (КК) и изокапроновой (иКК) кислот) и масс-спектр белков бифидобактерий.

Материалы по взаимодействию бифидобактерий с ассоциативным звеном микросимбиоценоза включили исследования: антагонистической активности (АА) бифидофлоры, ее способности к микробному распознаванию «свой-чужой», где в качестве параметров были использованы значения дис-криминантных функций Д1 (распознавание «своего» микросимбионта) и Д2 (распознавание «чужого» микросимбионта) [10, 51]. Раздел работы по изучению особенностей взаимодействий бифидобактерий с системой врожденного

и адаптивного иммунитета макропартнера включал результаты изучения способности метаболитов доминантов изменять продукцию (ПЦ) про- (ШК-у, ТЫБ-а, ГЬ-17, 1Ь-8, 1Ь-6) и антивоспалительных (IL-10, IL-1Ra) цитокинов. Данные исследования были проведены с помощью иммуноферментного анализа на модели перитонеальных макрофагов мышей-гибридов (СВАхС57В16^1 и мононуклеаров периферической крови здоровых людей (доноров). Антипептидная активность (АПА) бифидобактерий оценивалась при соинкубировании супернатантов микроорганизмов с рекомбинантными цитокинами (ШО-а, ШБ-у, IL-6, IL-10, IL-17, IL-1Ra).

Выявление трех кластеров было осуществлено при помощи к-метода кластерного анализа с последующим использованием дискриминантного анализа для определения значимых параметров биологических свойств исследуемых штаммов бифидобактерий. Статистическая обработка материала выполнена средствами пакета $1а11811са 10.0.

На первом этапе при поиске оптимального уровня кластеризации анализировалось число и состав кластеров при разных значениях метрики расстояний, отложенных вдоль вертикальной оси полученный дендрограммы. Оптимальной считалась такая межкластерная дистанция, при которой частотное распределение штаммов в соответствующих кластерах было бы максимально ассимметричным. В результате этой работы определились 3 кластера, содержащих штаммы различных видов бифидобактерий.

Однако природа такой группировки, и причины наблюдаемой кластеризации и формирование групп штаммов для каждой из них не были очевидными. Уточнение этих вопросов легло в основу второго этапа анализа, состоящего в изучении физиологической специализации рассматриваемых кластерных групп с помощью к-метода кластерного анализа, который вычислял средние значения признаков по каждой из трех групп. Соответствующие спайдер-диаграммы признаков для каждой группы приведены на рисунке 19, где значения каждого признака вычислялись как средние для каждого из к-

кластеров и сравнивались для интерпретации процессов, определяющих физиологическую специализацию каждого кластера.

В результате анализа физиологической специализации рассматриваемых кластерных групп были установлены виды-лидеры и информативные критерии, значимые при их формировании. Так, первый кластер был представлен на 52,0±1,2 % от выборки штаммами, принадлежащими к виду B. bifidum. Наиболее значимыми тестами для первой группы (рис 19А) явились свойства, характеризующие способность метаболитов бифидобактерий проявлять антипептидную активность в отношении маркерных провоспалитель-ных цитокинов Th1 (IFN-y) и Th2 (TNF-а), а также регуляторного цитокина Tr1(IL-10), включая и стимуляцию его продукции через иммуноциты (ПЦ IL-10).

Выявление признаков, характеризующих способность бифидобактерий регулировать баланс про- и противовоспалительного цитокинов, как информативных показателей штаммов из 1 кластера, позволила определить роль B. bifidum в формировании иммунного гомеостаза через цитокиновый профиль хозяина. Известно, что бифидобактерии посредством изменения концентрации цитокинов в микроокружении клеток способны поддерживать цитокино-вый гомеостаз и формировать необходимые условия, в которых реализуется созревание и поляризация дендритных клеток с дальнейшей направленной активацией эффекторов адаптивного иммунитета.

Во втором кластере было установлено преобладание вида бифидобак-терий - B. longum (в 64,0±1,5 % случаев). Существенная роль среди всех анализируемых свойств бифидобактерий принадлежала семи параметрам (рис. 19 Б), характеризующим участие доминантов в формировании вектора ассоциативного симбиоза человека - микросимбиоценоза.

Рисунок 19 - Диаграмма биологических характеристик бифидобактерий в кластерной группе 1 (А), группе 2 (Б) и группе 3 (В)

Примечание: ^ ПМО - показатель микробной обсеменности в АЛА - антилизоцимная активность, БПО - биопленкообразование, Д1 -значения дискриминантных функций распознавания «своих» ассоциантов, Д2 - значения дискриминантных функций распознавания «чужих» ассоциантов, АА - антагонистическая активность, УК - уровень уксусной кислоты, ПК- пропионовой, МК - масляной, иМК - изо-масляной, ВК - валерьяновой, КК - капроновой, иКК - изокапроновой кислот, АИГА - антииммуноглобуллиновая, АЛфА - антилакто-ферриновая, АПА - антипептидная активность в отношении FNO-a, ВДБ-у, ГЪ-6, ГЪ-10, ГЪ-17, ГЪ-Жа, ПЦ - способность влиять на продукцию FNO-a, ВДБ-у, ГЪ-6, ГЪ-10, ГЪ-17, IL-1Ra мононуклеарами перефирической крови здоровых людей (доноров)

Значимыми были такие базовые характеристики микросимбионтов как репродуктивная функция (размножение, lg ПМО) и адаптационный потенциал (антилизоцимный тест и образование биопленок) бактерий. Кроме того, важными явились способность бифидобактерий осуществлять микробное распознавание «свой-чужой» (Д1/Д2) и проявлять антимикробный эффект в отношении патогенов (антагонистическая активность и способность доми-нантов синтезировать уксусную кислоту). Известно, что в антимикробном эффекте бифидофлоры, помимо бактериоцинов, имеют значение карбоновые кислоты. Так, ацетат проявляет токсическое действие в отношении ряда патогенов (сальмонеллы, энтерогеморрагическая кишечная палочка, листерии, клостридии) за счет диффузии КЦЖК внутрь клеток, подавления их роста и процессов деления бактериальной клетки [277, 292].

Физиологическая специализация штаммов B. longum второго кластера, направленная на защиту биотопа и дискриминацию патогенов оказалась значима в формировании кишечного гомеостаза человека. Первичная дискриминация «чужеродного материала» бифидобактериями - инициальный этап последующего «сигналинга» в регуляции иммунного гомеостаза хозяина, где первичный отбор микросимбионтов осуществляют преимущественно представители B. longum.

В третьем кластере видовой состав бифидофлоры был более разнообразный (B. bifidum, B. longum, B. adolescentis, B. catenulatum, B. pseudocatenulatum, B. breve, B. infantis), а частотное распределение видов варьировало от 4 % до 28 %. При оценке информативных параметров, определяющих вклад штаммов бифидобактерий в формирование третьего кластера (рис. 1 9 В), обращает внимание участие свойств, характеризующих способность доминантных бактерий к синтезу масляной, изомасляной, валериановой, капроновой и изокапроновой кислот. По литературным данным выявленные короткоцепочечные жирные кислоты имеют значение в энергетическом обмене и поддержании барьерной функции энтероцитов, за счет увеличения синтеза соединительных белков - клаудин и окклюдин [277].

В литературе показано, что улучшение барьерной функции биотопа толстого кишечника возможно за счет усиления целостности эпителиального барьера компонентами бифидобактерий. Структура пептидогликана доминанта распознаётся через TLR-2 рецепторы и в ответ на этот сигнал инициируется синтез EGF-R фактора, укрепляющего плотные контакты эпителиоци-тов толстого кишечника за счет процессов апикальной стяжки и герметизации [261].

Показано, что компоненты муцина за счёт процессов деградации обеспечивают экологическое преимущество для БШёоЬас1ег1иш Брр., так как служат субстратом для их роста (эндогенные пребиотики), адгезии и защиты. Бифидобактерии обладают рядом ферментов — а-Ь-1исо81ёа8е, а-Лг-асе1у^а1ас1;о8ат1шёа8е, ga1actosy1-Лr-acety1hexosaшine рИоБрИогу^е, участвующих в этих процессах. Соотношение синтеза и деградации муцина в толстом кишечнике постоянно, что необходимо для процессов регенерации слизи, поддержания необходимой толщины, состава и последовательности слоёв муцина, важной для нормального функционирования кишечной стенки и поддержания гистологического барьера [120, 159, 167].

Рассмотрение бифидобактерий с позиции ассоциативного симбиоза человека позволило приблизить нас к пониманию физиологической роли бифи-дофлоры, направленной на поддержание гомеостаза человека. Проведенный анализ комплекса биологических свойств, отражающих биокоммуникативную активность бифидофлоры при формировании симбиотических отношений с организмом человека, позволил выявить функциональные кластеры бифидобактерий, характеризующие их способность участвовать в регуляции взаимоотношений в парах «доминант-ассоциант», «доминант-макропартнер» при формировании гомеостаза биотопа толстого кишечника человека.

Полученные материалы позволили определить, что ключевая функция бифидофлоры в регуляции гомеостаза кишечного биотопа реализуется за счет образования функциональных кластеров, среди которых первая группа

участвует в формировании цитокинового баланса, вторая - ответственна за микробное «распознавание» ассоциативных микросимбионтов и прямую защиту биотопа от патогенов, а третья необходима для поддержания барьерной функции энтероцитов в толстом кишечнике человека (рисунок 20).

Рисунок 20 - Функциональные группы бифидобактерий в регуляции гомеостаза кишечного биотопа человека

Выделение физиологических групп бифидофлоры может пояснить особенности структурной организации и функционирования консорциумов, представленных в кишечном микросимбиоценозе различными видами бифи-добактерий, где лидирующие позиции занимают два вида: В. longum и В. Ыу^ыш. Как показали исследования для представителей В. превали-

рующих в первом кластере, характерна физиологическая специализация, направленная на поддержании гомеостаза кишечной микробиоты через цито-киновый профиль хозяина. Тем самым формируется цитокиновое микроокружение дендритной клетки, которая, в свою очередь, направляет диффе-ренцировку и созревание наивных CD4+ Т-лимфоцитов по пути образования

регуляторных Т-клеток, контролирующих формирование иммунного гомео-стаза биотопа толстого кишечника человека.

Поддерживаемый цитокиновый баланс обеспечивает условия оптимального функционирования кишечного биотопа в условиях высокой антигенной нагрузки. И здесь приобретают значение представители В. 1оп§иш, лидирующие во втором кластере, реализующие защитную функцию и способность бифидобактерий распознавать «свои» и «чужие» штаммы ассоциан-тов, регулируя формирование и функционирование микросимбиоценоза толстого кишечника человека.

Формирование гистологического барьера, реализуемая штаммами бифидобактерий третьего кластера, является важной физиологической функцией нормофлоры, сохраняющей гомеостаз биотопа толстого кишечника, в условиях которого осуществляется дискриминация патогенов и поддержание баланса про- и противовоспалительных цитокинов. Таким образом, установленные функциональные кластеры бифидофлоры может способствовать пониманию механизмов интеграции доминантной микрофлоры (бифидобакте-рий) с организмом человека при ассоциативном симбиозе.

Наряду с этим, использование инфектологического подхода в изучении функциональных групп доминантов позволяет расширить круг возможностей клинического использования бифидобактерий: диагностика микроэкологических нарушений биотопа (дисбиоз), разработка критериев для отбора биосовместимых композиций пробиотиков, а также конструирование новых биопрепаратов (про- и синбиотиков) для коррекции дисбиотических нарушений кишечной микробиоты с учетом физиологической «специализации» бифидо-бактерий (рисунок 21).

Рисунок 21 - Фундаментальные и прикладные аспекты изучения физиологических групп бифидобактерий

6.2. Бифидобактерии - регулятор иммунного гомеостаза хозяина в условиях ассоциативного симбиоза

Известно, что микробиом человека играет важную роль в поддержании гомеостаза (здоровья) человека [114, 304], но, к сожалению, роль микробного фактора как регулятора здоровья и реализации функционирования висцеральных систем хозяина еще далека от своего разрешения.

Оценивая инфекционный процесс как результат паразит-хозяинных отношений, мы рассматриваем его в качестве модели, описывающей такое природное явление как ассоциативный симбиоз [6]. Такой подход создает методологическую платформу для решения вопроса о синергидных и антагонистических механизмах взаимодействия про- и эукариот, расширяя патогенетические представления в области инфектологии, определяет перспективы развития нового направления, возникшего на стыке биологии и медицины -«инфекционной симбиологии».

Несмотря на разнообразие биотопов организма, есть общие моменты, заслуживающие внимания. Для каждого биотопа существует свой «ключевой» (основной) вид (виды) нормофлоры, обладающей универсальным набором характеристик микробного антагонизма в защите этого биотопа. Для кишечной автохтонной микрофлоры важны бифидобактерии, лактобациллы, типичные эшерихии; для женского репродуктивного тракта - лактобациллы, для полости носа - стафилококки и коринеформные бактерии, для зева -стрептококки. Формирование индигенной микрофлоры в биотопе также во многом зависит от его морфофункциональных особенностей и степени защищенности от патогенов различными природными субстратами (лизоцим, интерферон, карнозин, лактоферрин и др.) хозяина.

Ключевая функция доминантных микроорганизмов, в частности бифи-дофлоры в кишечном биотопе хозяина, как показали наши исследования, определяется «наведением порядка в доме» за счет поддержания своих микроорганизмов и выраженного антагонизма в отношении чужих. Реализация этого принципа в межмикробных отношениях позволила разработать алгоритм

микробного распознавания «свой - чужой» в микросимбиоценозе кишечника человека на основе экспериментально выявленного оппозитного феномена (усиление/подавление) важнейших физиологических функций (размножение и адаптация) выживания микросимбионтов пары «доминант - ассоциант» [6, 10]. Не исключено, что эта первичная дискриминация чужеродного материала бифидофлорой - инициальный этап последующего «сигналинга» в регуляции иммунных механизмов гомеостаза хозяина.

На следующем этапе взаимодействия - «хозяин - ассоциант» роль факторов врожденной защиты организма резко повышается при включении в ассоциативный симбиоз микроорганизмов - ассоциантов, что приводит к различным исходам инфекции. Это во многом зависит от патогенного потенциала ассоциантов - «патогенассоциированных молекулярных паттернов», их способности преодолевать распознающие механизмы врожденного иммунитета хозяина - «паттернраспознающие рецепторы», определяющие стереотипные и консервативные в эволюции молекулы, присущие большим группам микроорганизмов. Эти механизмы врожденного иммунитета, как рекогносцировочные, так и эффекторные хорошо описаны [74, 166].

При этом, несмотря на очевидную связь врожденного иммунитета с микросимбионтами, остается ряд не выясненных вопросов, в частности, каким образом осуществляется физиологическая цепь «сигналинга» от «ключевых» видов бактерий к иммунным клеткам и какова роль доминантных микроорганизмов (представителей нормофлоры) в регуляции иммунного гомео-стаза?

В связи с этим несомненный интерес представляет изучение механизмов взаимодействия микросимбионтов с дендритными клетками (ДК) человека, поскольку именно они являются важнейшими клетками иммунной системы, способными интегрировать различные сигналы, формируя прямые им-муногенные или толерогенные ответы [28, 38, 62].

Имеются указания, что ДК являются «point of contact» (точкой контакта) клеток иммунной системы и кишечной микробиоты, опосредующей под-

держание сбалансированного мукозального и системного иммунных ответов [244]. Известно, что дендритные клетки также называют «воротами иммунитета» и мобильными «стражами» [38], являющимися «связующим звеном» врождённого и адаптивного иммунитета, обеспечивающими хрупкий баланс кишечного гомеостаза, защиту от инфекции и формирование толерантности [78, 268, 285].

Установлено, что ДК - это гетерогенная популяция антигенпрезенти-рующих клеток (АПК) костномозгового происхождения, которые относят к факторам врожденного иммунитета, поскольку они, в отличие от Т- и В-лимфоцитов не несут рецепторов, ответственных за специфическое распознавание. В тоже время дендритные клетки играют важную роль в развитии реакций адаптивного иммунитета, поскольку это единственные клетки, обеспечивающие презентацию антигена (АГ) в лимфоидных органах, инициируя процессы генерации антиген - специфических клонов Т-лимфоцитов [28, 268].

Известна высокая антигенпрезентирующая способность ДК, с чем связывают их эффективное представление различных антигенов. Высокое содержание комплексов МНС-АГ (в 10-100 раз больше, чем на других АПК) позволяют одной ДК презентировать АГ одновременно большому количеству Т-лимфоцитов (до 300 - 1000 клеток). Таким образом, малое количество ДК в организме не пропорционально их эффекту влияния на адаптивный иммунитет [288]. Кроме того, у дендритных клеток более высокий уровень экспрессии молекул адгезии и костимуляции, чем у других АПК, и в зависимости от условий ДК могут секретировать различные цитокины. Все эти особенности делают ДК в 100 - 1000 раз более активными по сравнению с макрофагами и В-лимфоцитами, в процессах иммунного реагирования на чужеродные АГ (в том числе микробиоту), что свидетельствует о значимости дендритных клеток в процессах иммунорегуляции при взаимодействии с многочисленным и разнообразным по видовому составу микробиомом организма человека.

В результате взаимодействия ДК с ПАМП микроорганизмов осуществляется не только презентация АГ наивным Т-клеткам и дифференцировка их в АГ-специфический клон, с инициацией Т-клеточного ответа, но и поддержание баланса между Т-хелперами 1-го (Th 1) и 2-го (Th 2) типов. Кроме того, ДК способны стимулировать продукцию антител у покоящихся В-клеток, а в определённых условиях «переключать» изотип иммуноглобулинов. Также дендритные клетки способны регулировать процессы индукции центральной и периферической толерантности к ауто-АГ и микросимбионтам [218]. Более того, сами ДК продуцируют про- и противовоспалительные цитокины, участвующие, как в дифференцировке самих ДК, так и привлечении Т-клеток в область воспаления [87, 146].

Пластичность дендритных клеток при активации адаптивных реакций иммунитета связана с тем, что функции ДК реализуются в зависимости от сопутствующих факторов в микросреде кишечника, включая ретиноевые кислоты и цитокин TGF-ß (трансформирующий фактор роста ß) [119, 205]. Другие кофакторы, включая интерфероны 1 типа (IFN), IL-10 и IL-12 могут способствовать поляризации ответа Т-лимфоцитов на конкретный АГ [312]. Например, цитокины IL-12 и IL-10, секретируемые ДК, определяют CD4+ поляризацию Т-клеток, индукцию дифференциации в про-воспалительные (Th1) и регуляторные (Tri) Т-лимфоциты. Другой цитокин TGF-ß - является критическим для дифференциации гена семейства FOX (forkead box), кодирующих транскрипционный фактор FoxP3 регуляторных Т-клеток (Treg), что совместно с IL-6, способствует генерации IL-17- продуцирующих клеток, участвующих в защите от бактерий и грибов [91].

Таким образом, способность ДК реагировать на микроокружение может позволить им интегрированно влиять на иммунные ответы, генерируемые в отсутствие инфекции, либо в результате прямого взаимодействия с патогенами, помогая поддерживать баланс в кишечнике между различными классами защитных реакций иммунитета и толерантностью.

Наряду с ДК, клеточными компонентами лимфоидной ткани кишечника человека, находящимися в тесном контакте с громадным потоком микробного материала, являются Т-лимфоциты (40-60 % популяции), В-лимфоциты (20-40 % популяции), моноциты и макрофаги (5-10 %) [63]. Иммунокомпе-тентные клетки осуществляют ряд функций, связанных с формированием ци-токинового микроокружения в кишечном биотопе, процессами усиления синтеза IgA и презентацией антигенов.

Механизмы, с помощью которых ДК адаптируют свои ответы и проводят дискриминацию между вирулентными бактериями и не патогенными микроорганизмами - симбионтами пока остаются малоизученными [78, 206, 224]. Вместе с тем известно, что комменсальные и патогенные микроорганизмы могут по-разному активировать ДК, благодаря наличию у них множества рецепторов, за счет чего ДК способны различать микроорганизмы и индуцировать тип и интенсивность реакции адаптивного иммунитета [250].

Некоторые представители нормальной микрофлоры способствуют поляризации ДК к толерантности путем непосредственного контакта с их поверхностью. Так, взаимодействие штамма L. acidophilus с ДК приводило к продукции IL-10 при низкой экспрессии IL-12p70 этими клетками. Оказалось, что формирование «невоспалительного фенотипа» ДК было связано с активацией их поверхностного рецептора DC-SIGN, взаимодействующего с поверхностным белком SlpA лактобактерий [250]. Была отмечена гетерогенность штаммов лактобацилл в отношении иммунной стимуляции дендритных клеток: L. reuteri, L. rhamnosus, L. paracasei, L. paraplantarum индуцировали лишь незначительный уровень и/или ингибировали ряд про-воспалительных цитокинов, в то время как другие виды (L. plantarum, L. paracasei, L. acidophilus, L. gasseri) - являлись сильными индукторами IL-12, IFN-p и хемокинов CXCL10, CCL12.

В тоже время, микроорганизмы рода Bifidobacterium являются более однородными по влиянию на продукцию цитокинов. В работе Weiss G. et al. (2011) [322] показано, что ни один из 16 штаммов бифидобактерий не вызвал

секрецию больших количеств IL-12, кроме того все они значительно ингиби-ровали индуцированную L. acidophilus продукцию IL-12 дендритными клетками. Для всех штаммов бифидобактерий был характерен низкий индуцирующий потенциал в отношении цитокина IL-12, а также ингибирующая активность в отношении IL-12/ ИФН-р. Сходные данные были получены при изучении спектра цитокинов после воздействия культуры Bifidobacterium infantis 35624 на ДК, выделенные из брыжеечных лимфатических узлов человека после хирургической резекции при воспалительных заболеваниях кишечника. Дендритные клетки в ответ на стимуляцию B. infantis синтезировали IL-10 и TGF- в без индукции IL-12 и TNF-a [180]. Напротив, патогенный штамм бактерий (Salmonella typhimurium) индуцировал в ДК синтез провос-палительного цитокина IL-12. Данные результаты были подтверждены в последующих работах и позволили авторам предположить, что в ответ на присутствие В. infantis дендритные клетки селективно секретируют IL-10, но не IL-12 или IFN-a [181].

Что касается уровня продукции IL-10 дендритными клетками, то он варьировал в зависимости от вида бифидобактерий. Было изучено влияние различных видов бифидобактерий, изолированных из толстого кишечника детей, на экспрессию маркеров клеточной поверхности и продукцию IL-10, IL-12 дендритными клетками. Установлено, что все исследуемые культуры бифидобактерий в разной степени воздействовали на экспрессию маркера CD83 (маркер зрелости ДК) и продукцию IL-10. Причем, наиболее вариабельными оказались культуры B. adolescentis, под действием которых уровень секреции противовоспалительного цитокина ДК был штаммоспецифи-чен и варьировал от 4 до 53 пг/мл.

Механизмы, определяющие профиль секреции соответствующих цито-кинов у ДК под действием микроорганизмов, в частности представителей нормобиоты человека, активно изучаются. Показано, что он зависит от ряда факторов, и в значительной степени - от связывания микробных лигандов с соответствующими рецепторами. Поскольку культуры бактерий рода

Bifidobacterium способны активировать рецепторы TLR-2/6 типов, TLR-9 и DC-SIGN, предполагается, что эти ПРР рецепторы могут быть ответственны за селективность продукции цитокинов дендритными клетками. Подтверждением этому являются данные, полученные в работе Konieczna P. et al., (2012) [180], которые показали существование перекрестных «сигналов» между TLR-2/6, DC-SIGN и TLR-9 при активации ДК в ответ на В. infantis, что индуцировало высокий уровень секреции IL-10, экспрессию Foxp3 наивными лимфоцитами, и, в итоге, приводило к генерации регуляторных Т-лимфоцитов. Как известно, лимфоциты T reg необходимы в организме для формирования и поддержания толерантности к собственным АГ и микросимбионтам. Таким образом, способность микроорганизмов влиять на индукцию регуляторных Т-лимфоцитов является важной характеристикой сим-биотической микробиоты, которая защищает человека от развития патологической иммунологической реактивности.

Существует мнение, что культуры бифидобактерий могут влиять и на механизмы центральной толерантности, поскольку известны противовоспалительные эффекты данных культур микроорганизмов и за пределами желудочно-кишечного тракта. В исследованиях Guglielmetti S. et al. (2014) [150] был определен иммуномодулирующий потенциал штамма B. bifidum MIMBb75 и белка TgaA, экспрессирующегося на внешней поверхности клеток данного штамма бифидобактерий. Известно, что исследуемый белок гомологичен с другими известными иммуноактивными бактериальными белками и является пептидогликан литическим ферментом, содержащим два активных центра: литический муреин трансгликозилазу (LT) и цистеин -гистидин зависимую амидогидролазу/пептидазу (CHAP). Установлено, что под влиянием как B.bifidum MIMBb75, так и очищенного белка TgaA, происходила активация ДК с продукцией ими IL-2. Таким образом, посредством стимуляции продукции IL-2 дендритными клетками, бифидобактерии способны управлять адаптивной иммунной системой, предотвращая преобладание Th 2 иммунного ответа, связанного с аллергией [245]. Впоследствии, им-

мунологические эксперименты, проведенные с использованием двух очищенных рекомбинантных белков, соответствующих отдельным доменам LT и CHAP, показали, что иммунно-реактивной областью белка TgaA является домен CHAP, а TgaA-зависимая активация ДК возможна при наличии белка CD14. На примере другого вида бифидобактерий - B. animalis было показано [78], что наибольшей IL-10 индуцирующей способностью обладают компоненты пептидогликана и РНК данных бактерий.

Среди других механизмов регуляции бифидобактериями кишечного гомеостаза известно, что микросимбионты как представители нормофлоры, способны не только активировать и поляризовать ДК, но и контролировать цитокиновый баланс кишечника, стимулируя продукцию цитокинов лимфоцитами и снижая про-/противовоспалительные цитокины в микроокружении. Один из механизмов иммунорегуляторного влияния метаболитов бифидоф-лоры в поддержании гомеостаза кишечной микробиоты может реализовы-ваться через цитокиновый профиль хозяина и антипептидная активность микробиоты (система «цитокин-антипептидная активность»).

Известно, что периферические мононуклеарные клетки является альтернативной и удобной моделью для оценки продукции цитокинов, получившей широкое применение в оценке иммуномодулирующего потенциала микросимбионтов человека и пробиотических штаммов. На модели мононук-леаров периферической крови человека была проведена работа по изучению иммунорегуляторного влияния экзометаболитов бифидобактерий на продукцию цитокинов. Полученные результаты по изучению влияния бифидобак-терий на продукцию цитокинов мононуклеарами свидетельствуют об определенных сходствах в выраженности и направленности воздействия бифидо-бактерий на эффекторы иммунитета. Так, штаммы бифидобактерий, как и на модели дендритных клеток, оказывали противовспалительное действие, связанное с существенным снижением уровня IL-8 и IFN-y и, напротив, повышением IL-10.

Вместе с тем, помимо влияния бифидобактерий на продукцию цитоки-нов, данные микроорганизмы способны изменять уровень регуляторных пептидов непосредственно в микроокружении, а именно в культуральной среде, то есть бифидобактерии способны проявлять антипептидную активность (АПА). Для бифидобактерий характерна в равной степени высокая экспрессия АПА в отношении как провоспалительных цитокинов - TNF-a, IFN-y, так и противовоспалительного цитокина - IL-10. Выявление антицитокиновой активности у представителей нормофлоры расширяет наши представления о регулирующем влиянии микробиоты на цитокиновый статус организма человека и обуславливает адаптацию микросимбионтов в организме хозяина.

Способность бифидобактерий усиливать продукцию IL-10 в сочетании с низкой антипептидной активностью в отношении данного цитокина и хе-мокина IL-8, вероятно, характеризует значительный адаптационный потенциал доминанта в противовоспалительном эффекте и поддержании иммунологической толерантности, реализуемый даже при глубоких микроэкологических нарушениях в биотопе толстого кишечника.

Кроме того, бифидобактерии посредством изменения концентрации цитокинов в микроокружении клеток способны поддерживать цитокиновый гомеостаз и формировать необходимые условия, в которых реализуется созревание и поляризация ДК с дальнейшей направленной активацией эффекторов адаптивного иммунитета, что обеспечивает их участие в формировании иммунологической толерантности к индигенной микрофлоре.

Вместе с тем, актуальным остается изучение особенностей регуляции цитокинового ответа иммуноцитов метаболитами бифидобактерий в зависимости от микроокружения на этапе микробного распознавания ассоциантов. Известно, что сигналы, поступающие к дендритным клеткам от бифидобак-терий, являются приоритетными в сравнении с другими представителями микросимбиоценоза [119]. Вместе с тем, в условиях истощения нормобиоты, прежде всего бифидобактерий, уменьшаются интестинальные иммунные ответы, контролирующие кишечные инфекции, вызванные Citrobacter spp. и

Campilobacter spp. [8, 29]. Предполагается, что изучение регуляции бифидо-бактериями иммунного гомеостаза в биотопе толстого кишечника позволяет оценить особенности иммуномодулирующей активности доминантов в зависимости от сопутствующих факторов в микросреде, включая присутствии компонентов патогена или представителей нормобиоты, что и явилось целью следующих этапов работы. В связи с этим, был проведен анализ результатов микробного распознавания на эталонных штаммах бактерий и изучена продукция цитокинов на модели лимфоцитов периферической крови под действием штамма B. bifidum 791, индуцированного метаболитами L. fermentum 90Т-С4, Е. coli 157 и S. aureus 209.

В работе использованы эталонные штаммы бактерий Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов ФГУП ГосНИИ «Генетика» (B. bifidum 791 (№ депонента АС-1247)), отечественной коллекции ГИСК им. Л.А. Тарасевича (L. fermentum 90Т-С4), Государственной коллекции патогенных микроорганизмов ФГБУ «НЦЭСМП» Минздрава России (E. coli 157 (№ депонента 900751), S. aureus 209 (№ депонента 900781)).

Экспериментальные исследования проведены в несколько этапов. На I этапе штамм B. bifidum 791 (доминант) индуцировали метаболитами L. fermentum 90Т-С4, Е. coli 157 и S. aureus 209 (ассоциант) методом предварительного соинкубирования при реализации алгоритма «свой-чужой». На II этапе было изучено влияние метаболитов индуцированных и контрольных проб B. bifidum 791 на биологические свойства (ростовые свойства, биоплён-кообразование и антилизоцимную активность) изучаемых культур L. fermentum 90Т-С4, Е. coli 157 и S. aureus 209. На III этапе определяли изменение оптической плотности культуры (ростовые свойства, РС), способность к образованию биопленок (БПО) и антилизоцимную активность (АЛА) исследуемых тест-культур в опытных и контрольных пробах. В качестве контроля на каждом этапе исследований вместо СН микроорганизмов использовали эквивалентное количество питательного бульона. Оценку полученных данных производили по изменению РС, АЛА и БПО тест-культур в сравне-

нии с исходными биологическими характеристиками культур и по снижению изучаемых параметров штаммы относили к «чужим» видам; а при усилении РС, АЛА и БПО ассоциантов, микроорганизмы относили к «своим» видам.

В результате для каждой пары «доминант-ассоциант» были получены значения обеих дискриминантных функций (Д1 и Д2), среди которых выбиралась максимальная величина либо на первой (Д1), либо на второй строке (Д2), что позволяло отнести исследуемую культуру к «своему» (Д1) или «чужому» (Д2) штамму ассоциантов.

На заключительном этапе было оценено влияние метаболитов индуцированных и контрольных проб бифидобактерий, а также метаболитов тест-культур на продукцию цитокинов лимфоцитами периферической крови при культивировании мононуклеаров в полной культуральной среде. Продукцию цитокинов изучали в культуре мононуклеаров, сокультивируемой с метаболитами бактерий (опыт) и без добавления метаболитов (контроль, спонтанная продукция). В супернатантах мононуклеарных лейкоцитов в контрольных и опытных пробах измеряли ряд про- (IFN-y, TNF-a, IL-6, IL-17) и противовоспалительный (IL-10) цитокинов. Данные по определению регулирующего влияния бифидобактерий на продукцию цитокинов лимфоцитами - непараметрическими методами с применением критерия Манна-Уитни. Во всех процедурах статистического анализа уровень значимости p<0,05.

При оценке влияния культуры B. bifidum 791 на биологические свойства L. fermentum 90Т-С4, Е. coli 157 и S. aureus 209 на этапе реализации микробного распознавания «свой-чужой» выявлены различные типы взаимодействий микроорганизмов в паре «доминант-ассоциант», характер которых зависел от видовой принадлежности тест-культур. Максимальное значение дискриминантной функции при оценке межмикробного распознавания культур Е. coli 157 и S. aureus 209 находилось на второй строке (Д2; 350 и 380 соответственно), характеризующееся антагонистическим эффектом влияния B. bifidum 791 на биологические свойства тест-культур, что позво-

ляло отнести исследуемые культуры к штаммам, имеющим признаки «чуже-родности».

Вместе с тем, для L. fermentum 90Т-С4 максимальная величина дис-криминантной функции была установлена на первой стоке (Д1; 650), отражающая стимулирующее влияние B. bifidum 791 на биопрофиль лактобакте-рий, на основании чего исследуемая культура была отнесена к «своим» штаммам. Таким образом, использование метода межмикробного определения «свой-чужой», реализуемого на модели штамма B. bifidum 791 в качестве «доминанта», позволило отнести Е. coli 157 и S. aureus 209 к штаммам, имеющим признаки «чужеродности», тогда как L. fermentum 90Т-С4 лишена их.

На следующем этапе опытов было оценено влияния метаболитов B. bifidum 791 и исследуемых тест-культур на продукцию цитокинов лимфоцитами периферической крови. Под действием метаболитов у периферических мононуклеарных клеток изменялся профиль и уровень цитокинов, что также зависело от видовой принадлежности микроорганизмов (таблица 16).

В ответ на присутствие в культуральной среде метаболитов B. bifidum 791 у лимфоцитов по сравнению с контролем (спонтанная продукция) в 2,5 раза повышалась способность синтезировать противовоспалительный цито-кин IL-10 и отмечался супрессирующий эффект в отношении провоспали-тельных цитокинов IFN-y, TNF-a и IL-17 (на 50±0,5 %, 66±0,3 % и 74±1,2 % соответственно), за исключением IL-6, уровень которого не изменялся. Метаболиты L. fermentum 90Т-С4 оказывали выраженный ингибирующий эффект в отношении синтеза лимфоцитами как про-, так и противовоспалительных цитокинов. Уровень провоспалительных цитокинов снижался на 34

- 79 % по сравнению с контролем, а противовоспалительного цитокина IL-10

- на 40±0,5 % по сравнению со спонтанной продукцией медиаторов (моно-нуклеары без внесения метаболитов бактерий).

Таблица 16 - Иммунорегуляторный эффект метаболитов тест-культур на модели периферических мононуклеар-

ных клеток (ПМК)

Супернатант цитокины ^^ Контроль (спонтанная продукция ци-токинов ПМК), пг/мл Опыт (продукция цитокинов ПМК при влиянии метаболитов культур), пг/мл

В. ЫШиш 791 S. aureus 209 E. coli 157 Ь. fermentum 90ТС4

INF-y 18,1±1,2 9,1±1,1* 18,4±1,3 39,1±2,0* 7,6±0,2*

TNF-a 42,0±2,4 14,3±0,4* 110,6±5,6* 17,9±0,3* 13,1±1,1*

IL-6 171,0±3,7 169,0±4,3* 210,0±3,1* 35,0±2,2* 113,0±4,2*

IL-17 140,5±3,2 36,8±3,1* 137,3±2,6 148,3±3,4 30,0±1,3*

IL-10 50,03±1,1 102,0±2,5* 77,5±3,4* 48,0±1,6 30,3±2,1*

Эффект |ТЫ, |ТЫ7 ТЫ0 Противовоспалительный эффект и иммуномодуляция (поддержание аутотолерантности и иммунного гомеостаза) |Th2 В оспалительный эффект, активация гуморального иммунитета |Th1/|Th2 В оспалительный эффект, активация врожденного и T-клеточного иммунитета |ТЫ, |ТЬ2, |ТЫ7 Противовоспалительный эффект

Примечание: * - наличие различий между показателями спонтанной продукции цитокинов ПМК (контроль) и индуцированной супернатанта-ми тест-культур (опыт), при р<0,05

Напротив, внесение в культуральную среду лимфоцитов супернатантов тест-культур Е. coli 157 и S. aureus 209 способствовало стимуляции продукции ряда провоспалительных цитокинов, однако профиль цитокинов различался. Под влиянием метаболитов Е. coli 157 у лимфоцитов в 2,2 раза увеличивался синтез IFN-y, однако снижалась способность синтезировать цитоки-ны TNF-a и IL-6 (на 51±1,1 % и 60±1,4 % соответственно). На продукцию IL-17 и IL-10 метаболиты кишечной палочки не влияли, у лимфоцитов сохранялся конститутивный уровень продукции данных цитокинов. Супернатанты стафилококка стимулировали секрецию лимфоцитами TNF-a (в 3 раза по сравнению с контролем), IL-6 (на 20±1,1 %) и IL-10 (на 50±2,3 %). Вместе с тем продукция провоспалительных цитокинов IFN-y и IL-17 в культуральной среде не изменялась.

Полученные результаты показали, что влияние метаболитов B. bifidum 791 и исследуемых тест-культур на продукцию цитокинов лимфоцитами, характеризовалось разнонаправленным эффектом. Так, штаммы бифидо- и лак-тобактерии интенсивно подавляли in vitro секрецию системного флогоген-ного цитокина TNF-a и усиливали антивоспалительный эффект ингибирую-щим влиянием на продукцию провоспалительных цитокинов IFN-y , IL-6 и хемокина IL-17. У культуры бифидобактерий отмечался стимулирующий эффект в отношении противовоспалительного цитокина IL-10, что сопоставимо с литературными данными [39, 328] и имеет значение в поддержании аутотолерантности и иммунного гомеостаза в условиях биотопа толстого кишечника человека. И, напротив, у лимфоцитов, являющимися эффекторами адаптивного иммунитета, под влиянием метаболитов тест-культур Е. coli 157 и S. aureus 209, усиливался провоспалительного потенциал за счет повышения продукции провоспалительных цитокинов. Причем в первом случае отмечена стимуляция ключевого цитокина IFN-y, способствующего поляризации ХЫ-лимфоцитов, активирующих макрофаги, врожденный и Т-клеточный иммунитет, на фоне снижения уровня медиаторов ХМ-иммунного ответа. Добавление к мононуклеарам метаболитов стафилококка способст-

вовало увеличению в среде количества Th2 цитокинов, активирующих механизмы гуморального иммунитета. Не исключено, что стимуляция продукции IL-10 в ответ на метаболиты S. aureus 209 не случайна, поскольку между Th1 и Th2 существуют отношения антагонизма, реализуемые с участием продуктов - соответственно IFN-y и IL-10 [297].

Было установлено (таблица 17), что предварительное соинкубирование штамма B. bifidum 791 с метаболитами L. fermentum 90Т-С4, Е. coli 157 и S. aureus 209 влияло на способность бифидобактерий изменять концентрацию цитокинов в среде. Так, под действием метаболитов бифидобактерий, предварительно обработанной кишечной палочкой, в сравнении с эффектом интактных метаболитов B. bifidum 791, ингибирующий эффект в отношении IFN-y сменялся на стимулирующий, в результате в среде в 1,9 раза увеличивалась продукция данного цитокина. Стимулирующий эффект в отношении IL-10, характерный для метаболитов неиндуцированного штамма бифидобак-терий, отменялся и уровень цитокина в среде соответствовал спонтанной продукции лимфоцитов. Супрессирующий эффект в отношении провоспали-тельных цитокинов TNF-a и IL-17 сохранялся.

Предварительное соинкубирование B. bifidum 791 с экзометаболитами S. aureus 209 приводило к тому, что метаболиты бифидобактерий способствовали подавлению продукции лимфоцитами противовоспалительного цитокина IL-10 и отмене ингибирующего влияния на уровень провоспалительных цитокинов IFN-y, TNF-a и IL-6.

Напротив, воздействие индуцированного штамма бифидобактерий метаболитами L. fermentum 90Т-С4 характеризовалось усилением стимулирующего эффекта (в 5,2 раза по сравнению с интактными метаболитами бифидобактерий) в отношении синтеза лимфоцитами противовоспалительного цитокина IL-10 и появлению ингибирующего эффекта в отношении IL-6 (на 30±2,3 % в сравнении со спонтанным уровнем продукции).

Таблица 17 Иммунорегуляторный эффект метаболитов интактного и индуцированного штамма B. bifidum № 791

на модели периферических мононуклеарных клеток (ПМК)

Супернатант цитокины Контроль (спонтанная продукция цитокинов ГМК), пг/мл Опыт (метаболиты, интактного штамма В. ЫШит № 791), пг/мл Опыт (метаболиты штамма B. bifidum № 791, индуцированного компонентами тест-культур), пг/мл

S. aureus 209 E. coli 157 L. fermentum 90TC4

INF-у 18,1±1,2 9,1±1,1* 20,0±1,4 35,1±1,3* 22,4±1,2

TNF-a 42,0±2,4 14,3±0,4* 38,2±2,1 13,5±0,4* 48,8±2,4

IL-6 171,0±3,7 169,0±4,3* 170,0±4,1 168,0±3,3 125,0±3,1*

IL-17 140,5±3,2 36,8±3,1* 34,4±2,3* 39,5±3,0* 40,7±2,1*

IL-10 50,03±1,1 102,0±2,5* 10,1±1,4* 56,0±1,5 261,4±3,3*

Эффект |ТЫ, |ТЫ7 /| ТЫ0 Противовоспалительный эффект и иммуномодуляция (активация и поддержание аутотолерантности и иммунного гомеостаза) |Th10 Снижение аутотолерантности |Th1 Активация врожденного и T-клеточного иммунитета |Th2, |Th17/| Th10 Противовоспалительный эффект и иммуномодуляция (активация и поддержание аутотолерантности и иммунного гомеостаза)

Примечание: * - наличие различий между показателями спонтанной продукции цитокинов Г влиянии метаболитами интактного штамма B. bifidum и метаболитами штамма B. bifidui культур (опыт), при р<0,05 МК (контроль) и индукции цитокинов ГМК при п № 791, индуцированного компонентами тест-

Сравнивая результаты микробного распознавания «свой-чужой», реализуемого штаммом B. bifidum 791 со способностью лимфоцитами дифференцированно отвечать синтезом цитокинов на компоненты тест-культур, можно отметить схожесть в реакции распознавания, что подтверждает универсальность способности отличать своих от чужих как одного из фундаментальных свойств живых организмов [63, 71]. По-видимому, бифидобактерии наряду со способностью иммуноцитов, усиливающих свой про- или противовоспалительный потенциал в ответ на метаболиты бактерий, занимаются отбором микросимбионтов, оппозитно (усиление/подавление) регулируя базовые физиологические критерии (репродукции и адаптации) микроорганизмов в паре «доминант-ассоциант». Этот факт свидетельствует о том, что механизмы хозяина и микробиоты, являясь единым звеном в регуляции кишечного гомеостаза человека, вовлечены в тесное сотрудничество для своего си-нергидного существования в целях сохранения симбиоза.

Полученные результаты по изучению влияния экзометаболитов индуцированных бифидобактерий на продукцию цитокинов мононуклеарами периферической крови человека в системе in vitro характеризуют определенных различиях в направленности воздействия штамма B. bifidum 791 на эффекторы иммунитета с учетом предварительного соинкубирования с метаболитами патогена или представителей нормобиоты. Причем, характер изменения им-муномодулирующего влияния индуцированных бифидобактерий имеет определенные сходства в направленности воздействия на эффекторы иммунитета с особенностями влияния самих тест-культур. Стимулирующий эффект продукции мононуклеарами Th1 медиаторов наблюдался как под действием кишечной палочки, так и при влиянии метаболитов штамма B. bifidum 791, индуцированного метаболитами Е. coli 157. Таким образом, в условиях биотопа толстого кишечника человека сочетанное однонаправленное влияние микро-биоты и её метаболической активности на индукторы иммунитета может способствовать усилению эффектов интестинального иммунного ответа на присутствие патогена в среде. Наряду с этим доминантные микроорганизмы

реализуют «хелперную» функцию посредством микробного распознавания через подавление биологических свойств патогена, способствуя его элиминации из биотопа. К защитному действию бифидофлоры также можно отнести их способность усиливать противовоспалительный потенциал мононуклеаров и стимулировать репродукцию и адаптацию «своего» микросимбионта fermentum 90Т-С4). В целом это может способствовать колонизации нормо-биоты и поддержанию аутотолерантности и иммунного гомеостаза в биотопе толстого кишечника.

Таким образом, поддержание кишечного гомеостаза толстого кишечника человека реализуется через феномен микробного распознавания «свой-чужой», проявляющийся в способности бифидофлоры проводить первичный отбор микросимбионтов за счет оппозитного (усиление/подавление) влияния на базовые физиологические критерии ассоциантов и дифференцированного воздействия на про- или противовоспалительный потенциал лимфоцитов.

Суммируя рассматриваемый материал, можно заключить, что роль би-фидобактерий в формировании кишечного гомеостаза значима и реализуется с помощью ряда механизмов (рисунок 22). Являясь представителем нормоф-лоры бифидобактерии демонстрируют широкий диапазон физиологических возможностей как основной микробный регулятор модели ассоциативного симбиоза. Бифидобактерии способны сортировать микробные антигены на «свои и чужие», то есть микробиота осуществляет первичный отбор микросимбионтов, регулируя микросимбиоценноз толстого кишечника человека (на рис. - цифра 1). Сигналы, получаемые от доминантов дендритными клетками, являются приоритетными в сравнении с таковыми от ассоциативной микробиоты (на рис. - 2) [253, 328]. Представители доминантной микрофлоры способны путем прямого межклеточного контакта формировать зрелый тип ДК (на рис. - 3) [322]; через воздействие метаболитов влиять и на лимфоциты (на рис. - 4) с последующим действием секретируемых лимфоцитами цитокинов на ДК (на рис. - 5) [146, 150]. Формирование оптимального цитокинового баланса в биотопе кишечника определяется и количествен-

ными изменениями уровня цитокинов при прямом контакте клеток микро-биоты и их метаболитов с цитокинами (антипептидной активностью) (на рис. - 6). Тем самым формируется цитокиновое микроокружение дендритной клетки при участии системы «цитокин-антицитокиновая активность». В свою очередь ДК направляют дифференцировку и созревание наивных СЭ4+ Т-лимфоцитов по пути образования регуляторных Т-клеток (на рис. - 7) [119], контролирующих формирование иммунного гомеостаза биотопа кишечника (на рис. - 8) [114, 153, 252]. Поддерживаемый цитокиновый баланс обеспечивает условия оптимального функционирования кишечного биотопа в условиях высокой антигенной нагрузки (на рис. - 9). Таким образом, первичная дискриминация «чужеродного материала» бифидобактериями - инициальный этап последующего «сигналинга» в регуляции иммунного гомеостаза хозяина. Дальнейшие этапы регуляции осуществляются активацией дендритных клеток непосредственно бифидобактериями, их метаболитами с последующим влиянием на дифференцировку наивных СЭ4+ Т- лимфоцитов в сторону регуляторных лимфоцитов и поддержанием оптимального цитоки-нового баланса кишечного биотопа человека.

Рисунок 22 - Роль бифидобактерий в формировании иммунного гомеостаза кишечного биотопа человека

Примечание: 1- Первичный отбор микросимбионтов через микробное распознавание; 2- Поляризация и формирование зрелого типа ДК через сигналы от доминантов; 3, 4 - Дифференцировка и созревание наивных СБ4+ Тлим (ТЬ0) по пути образования регуляторных Т-клеток (Тге§); 5- Тге§ контролируют формирования иммунного гомеостаза кишечника; 6, 7, 8, 9, 10 - Формирование оптимального цитокинового баланса в биотопе кишечника; 11 - ТТитокиновый баланс определяет поддержание иммунного гомеостаза кишечника

6.3. Определение уровня биосовместимости пробиотических штаммов в симбиотической композиции и оценка биологической активности

новых композиций in vitro

В связи с неблагоприятными экологическими условиями, стрессами, антибактериальной, лучевой и химиотерапией, увеличивается количество людей страдающих нарушениями нормальной микрофлоры организма. Проблема коррекции дисбиозов толстого кишечника человека можно рассматривать как общемедицинскую, поскольку нарушения микробиоценоза играет существенную роль в патогенезе большого количества заболеваний различной этиологии, в том числе и патологии висцеральных органов [10, 17, 210, 242].