Характеристика эякулята в оценке репродуктивных возможностей человека тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.04, кандидат биологических наук Комарова, Марина Валериевна

• Комарова, Марина Валериевна
• кандидат биологических наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Комарова, Марина Валериевна

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. Обзор литературы

1.1. Особенности метаболизма сперматозоидов на разных этапах сперматогенеза

1.2.Роль спермальной плазмы в фертилизации эякулята

ГЛАВА 2. Материалы и методы исследования

2.1. Характеристика обследованной группы

2.2. Общеклиническое исследование эякулята

2.3. Исследование количества и степени конденсации хроматина клеток эякулята методом лазерной проточной цитофлуориметрии

2.4. Исследование показателей обмена спермальной плазмы и сперматозоидов

2.5. Статистическая обработка результатов исследований

ГЛАВА 3. Характеристика клеточного состава эякулята

3.1. Сравнение показателей спермограммы у фертильных мужчин и обследованных по поводу бесплодия

3.2. Содержание ДНК в клетках эякулята у мужчин с различной фер-тильностью

ГЛАВА 4. Показатели метаболизма эякулята

4.1. Показатели обмена в спермальной плазме и сперматозоидах фертильных доноров

4.2. Метаболичекские характеристики спермальной плазмы у мужчин с различными нарушениями репродуктивной функции

ГЛАВА 5. Взаимосвязи между характеристиками эякулята

5.1. Корреляционные связи между показателями обмена спермальной плазмы и спермограммы

5.2. Взаимосвязи между показателями количества и степени конденса

5.2. Взаимосвязи между показателями количества и степени конденсации хроматина и показателями обмена спермальной плазмы. 96 5.3.Оценка состояния хроматина сперматозоидов в зависимости от метаболических особенностей спермальной плазмы 104 ЗАКЛЮЧЕНИЕ 108 ВЫВОДЫ 124 ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 125 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Характеристика эякулята в оценке репродуктивных возможностей человека»

Актуальность исследования. В современных условиях при снижении рождаемости возможность иметь ребенка каждой семьей является важной как для общества в целом, так и для благополучия отдельного человека.

Известно что, около 15% супружеских пар страдает бесплодием, причем треть случаев приходится на мужское бесплодие (Nieslchlag Е. et al., 1997). Идиопатические нарушения функции гонад достигают 21% причин бесплодия у мужчин (Филатов О.С. с соавт., 1997). По наблюдениям ряда авторов, качество спермы за последние десятилетия падает, что заключается в уменьшении концентрации и подвижности сперматозоидов (Carlsen Е. et al., 1992; Jacques А., 1995).

Спермограмма является распространенным лабораторным исследованием состояния репродуктивной системы мужчин (Тиктинский О.Л., 1990; Пшеничникова Т.Я., 1991; Карпигценко А.И., 1998), однако существует большой межлабораторный разброс в получаемых результатах (Maison P.L., 1995), что снижает диагностическую ценность исследования (Barratt C.L., 1995).

Экспертами ВОЗ разработаны четкие стандарты для исследования эякулята (WHO, 1992), затрагивающие вопросы подготовки пациента, преданали-таческой подготовки пробы и референтные значения показателей спермо-граммы.

В литературе имеются сведения о влиянии биохимического состава спермальной плазмы на оплодотворяющую способность сперматозоидов (Николаев А.А. с соавт. 1992, 1997, 1998; Неймарк А.И. с соавт. 1998; Липатова Н.А., 1997, 1998; Lewin L.M. et al., 1993; Povoa H.J. et al.,1986; Garcia L.C. et al., 1992; Noguera J.A. et al., 1993; Rolf С. et al., 1998; Sidhu R.S. et al., 1998), однако спектр веществ, изученных в спермальной плазме ограничен.

Исследования генетического материала сперматозоидов методически недостаточно разработаны, что делает данные трудно сопоставимыми (Меле5 щенко А.Б. с соавт., 1991; Филатов М.В. с соавт., 1999; Ег^Ь Е. е! а1., 1993; Вгибу Ь. ег а!., 1996; Наскег-К1от и.В. ег а1., 1999).

Сведения о биохимическом составе эякулята и состоянии хроматина сперматозоидов носят фрагментарный характер, что не позволяет использовать их для оценки оплодотворяющей способности спермы и судить о причинах расстройства гаметогенной функции гонад у значительного числа инфер-тильных мужчин.

Цель настоящего исследования заключается в изучении метаболических и морфологических показателей спермы у мужчин с бесплодием.

Задачи исследования.

1. Изучить клеточный состав эякулята с оценкой количества сперматозоидов, их двигательной способности и морфологических особенностей.

2. Провести изучение соотношения клеток спермы по плоидности и качеству хроматина.

3. Определить некоторые параметры углеводного, белкового обменов в сперматозоидах и провести сравнительную оценку показателей метаболизма в сперматозоидах и спермальной плазме.

4. Провести корреляционный анализ между отдельными показателями обмена в сперматозоидах, спермальной плазме и морфологическими, функциональными характеристиками сперматозоидов.

5. Проследить и выявить закономерности взаимоотношений между качеством и количеством хроматина в клетках сперматогенеза различной степени зрелости и метаболическими характеристиками спермальной плазмы.

Научная новизна. Новым явилось исследование генетического материала сперматозоидов у фертильных и инфертильных мужчин модифицированным методом лазерной проточной цитофлуориметрии. При этом у мужчин с бесплодием обнаружены существенные отклонения в распределении и степени конденсации хроматина в сперматозоидах, имеющие корреляционную 6 связь с концентрацией сперматозоидов в эякуляте, что отражает глубину нарушений сперматогенеза.

Впервые изучен метаболический статус сперматозоидов по определению в них содержания глюкозы, общего белка, альбумина, мочевины, креати-нина, активности аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, у-глютамилтрансферазы, креатинкиназы, щелочной фосфатазы, холинэстеразы, а-амилазы.

Получены новые сведения о составе спермальной жидкости. Проведен сравнительный анализ состояния обмена в спермальной плазме и мужских гаметах. Обнаружены корреляционные связи между отдельными параметрами метаболизма, а также морфо-функциональными характеристиками сперматозоидов, их концентрацией.

Установлено, что при этиологически различных заболеваниях, приведших к бесплодию, характерным является снижение содержания кальция в спермальной плазме, увеличение вариабельности активности ферментов (креатинкиназы, холинэстеразы, щелочной фосфатазы, аспартатаминотрансферазы) и изменение формы распределения показателей, в связи с чем использованы непараметрические методы статистической обработки.

Научно-практическая значимость. Предложен новый алгоритм лабораторной диагностики мужской инфертильности. Помимо детальной спермо-граммы он включает анализ распределения и степени конденсации хроматина в сперматозоидах для оценки полноценности их генетического материала с помощью модифицированной методики лазерной проточной цитофлуоримет-рии. Для оценки выраженности обменных нарушений в самих сперматозоидах отработана методика их разрушения с помощью детергента тритона Х-100. Для выявления метаболических изменений в спермальной плазме адаптированы методики ее пред аналитической подготовки. 7

Выделены лабораторные синдромы для оценки тяжести и прогноза мужского бесплодия, а именно:

•сочетание сниженной концентрации сперматозоидов в эякуляте с изменением их морфологии и низкой подвижностью;

•появление сперматозоидов с измененным содержанием хроматина и недостаточной его конденсацией, увеличение доли незрелых сперматозоидов, а также сперматозоидов с низким содержанием ДНК;

•значительные отклонения уровней активности ферментов и снижение концентрации кальция в спермальной плазме.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Для оценки состояния мужской репродуктивной системы недостаточны сведения о количественном и качественном составе сперматозоидов. Целесообразно изучение показателей метаболизма в спермальной плазме и сперматозоидах. К числу перспективных направлений диагностики мужской фертильности относятся дополнительные исследования состояния хроматина сперматозоидов как носителя генетической информации и компонентов семенной плазмы, отражающих состояние спермато- и спермио-генеза.

2. Сравнительная оценка метаболизма сперматозоидов и спермальной плазмы, выявившая более высокий уровень в сперматозоидах общего белка, альбумина, активностей ферментов а-амилазы и более низкий уровень мочевины, креатинина, глюкозы, активностей ферментов: креатинкиназы, аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, у-глютамилтрасферазы. Активность лактатдегидрогеназы и холинэстеразы в сперматозоидах и спермальной плазме практически одинаковые.

3. Наличие существенных взаимосвязей между показателями метаболизма спермальной плазмы и функциональными, морфологическими характеристиками сперматозоидов. 8

4. Характер специфических метаболических сдвигов в спермальной плазме при различной картине спермограммы у инфертильных мужчин.

5. Изменение распределения хроматина в клетках эякулята, снижение конденсации хроматина, уменьшение концентрации мужских гамет, снижение концентрации общего белка, креатинина и снижение активности щелочной фосфатазы как проявления нарушения сперматогенеза.

Апробация работы. Основные результаты исследований были представлены на научно-практической конференции, посвященной 5-летию Самарского диагностического центра (Самара, 1995), научно-практической конференции "Современные диагностические технологии на службе здравоохранения" (Омск, 1998), научно-практической конференции "Факультету последипломной подготовки СамГУ - 15 лет" (Самара, 1998), научно-практической конференции, посвященной 75-летию КВД (Самара, 1999), научно-практической конференции: "Самарскому государственному медицинскому университету 80 лет" (Самара, 1999), на заседании кафедры биологической и клинической химии совместно с Самарским отделением биохимического общества (Самара, 1999).

Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 7 работ.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследования, трех глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 145 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18 рисунками и содержит 28 таблиц. Библиография включает 190 источников, из которых 22 отечественных и 168 зарубежных авторов.

Заключение диссертации по теме «Биохимия», Комарова, Марина Валериевна

ВЫВОДЫ

1. По данным спермограммы мужчин с бесплодием концентрация сперматозоидов и пределах нормы - у 68 %, снижена - у 24 %, свыше 200 млн/мл - в 8% случаев.

2. Содержание хроматина в клетках эякулята, степень его конденсации колеблются 15 пределах нормы у 48% мужчин с инфертильностью. При бесплодии встречаются нарушения конденсации хроматина сперматозоидов и появление дополнительных пиков на гистограмме распределения ДНК клеток спермы.

3. Сравнительная оценка показателей метаболизма в сперматозоидах и спермальной плазме показала, что содержание общего белка, альбумина, активность а-амилазы в сперматозоидах выше, чем в спермальной плазме; тогда как содержание мочевины, креатинина, глюкозы, активность ферментов: креа-тинкиназы, аланинаминотрансферазы, аспартатаминотрансферазы, у-глютамилтрансферазы ниже в сперматозоидах, чем в спермальной плазме. Активность лактатдегидрогеназы и холинэстеразы в сперматозоидах и спермальной плазме практически одинаковые.

4. Активность лактатдегидрогеназы и аспартатаминотрансферазы спермальной плазмы связаны положительной коррелятивной связью с концентрацией сперматозоидов.

5. Двигательная способность сперматозоидов имеет положительную корреляционную связь с содержанием альбумина и креатинина спермальной плазмы у фертильных доноров, при бесплодии эта связь отсутствует.

6. И вменения морфологии головок сперматозоидов сочетаются с отклонениями в метаболизме спермальной плазмы у мужчин с бесплодием, а именно: снижением концентрации креатинина, активности щелочной фосфатазы и холинэстеразы спермальной плазмы.

125

7. Эффективность диагностики инфертильности у мужчин при нормальном количестве сперматозоидов базируется на определении характера распределения хроматина в сперматозоидах и оценке содержания белка, кальция, активности лактатдегидрогеназы, у-глютамилтрансферазы, аспартатаминотранс-феразы в спермальной плазме.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Диагностическими критериями в оценки тяжести и прогноза мужского бесплодия являются следующие изменения характеристик эякулята:

• сочетание сниженной концентрации сперматозоидов в эякуляте с изменением морфологии их головок, шеек, хвостов и низкой подвижностью;

• обнаружение сперматозоидов с измененным содержанием хроматина и недостаточной его конденсацией, увеличение доли незрелых сперматозоидов, а также сперматозоидов с низким содержанием ДНК;

• значительные отклонения уровней активности ферментов лактатдегидрогеназы, креатинкиназы, у-глутамилтрансферазы, аспартатаминотранс-феразы и концентрации кальция в спермальной плазме.

2. Для оптимизации диагностики различных форм мужской инфертильности в целях выработки патогенетически обоснованной тактики лечения и оценки возможности использования собственного генетического материала для экстракорпорального оплодотворения предлагается:

• детальное изучение спермограммы для выявления неблагоприятных признаков: снижения концентрации сперматозоидов, подвижности и доли морфологически полноценных сперматозоидов;

• анализ распределения и степени конденсации хроматина в сперматозоидах для оценки полноценности их генетического материала с помощью проточной цитометрии ДНК клеток эякулята;

126

• изучение метаболических показателей спермальной плазмы: уровня общего белка, креатин и на, кальция, активностей лактатдегидрогеназы, аспартатаминотрансферазы, у-глутамилтрансферазы, изменение которых сочетаются со снижением оплодотворяющей способности сперматозоидов.

127

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Комарова, Марина Валериевна, 1999 год

1.Активность ферментов спермоплазмы в эякулятах различной фертиль-ности / A.A. Николоаев, Д.Л. Луцкий, В.А. Бочановский, Л.В. Ложкина // Урол. нефрол. 1997. - N5. - С.35 - 39.

2. Артифексов С.Б. Андрологические аспекты бесплодного брака // Урол. нефрол. 1996. - N4. - С.39-41.

3. Биология развития млекопитающих. Методы: Пер с англ./ Под ред. М. Манк. М.: Мир. 1990. 406 с.

4. Гласс Дж., Стенли Дж. Статистические методы в педагогике и психологии (пер. с англ. Л.И. Хайрусовой под ред. Ю.П. Адлера). М.: Прогресс, 1976.-496 с.

5. Гублер Е.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов. Л.: Медицина, 1978. - 296 с.

6. Евдокимов В.В., Фыонг В.Т., Орлова Е.В., Ерасова В.И. Антигены эякулята при патологических процессах в репродуктивной системе и нарушениях сперматогенеза // Материалы IV Всесоюзного съезда урологов. Москва, 1990. - С. 361.

7. Кендалл М. Методы ранговой корреляции. М.: Статистика, 1974.168с.

8. Липатова H.A., Раков С.С., Морозова В.Т. Белковые маркеры спермоплазмы в лабораторной диагностике бесплодия при воспалительных и невоспалительных заболеваниях мужской репродуктивной системы // Клиническая лабораторная диагностика. 1997.- №5. - С.40 -41.

9. Липатова H.A., Раков С.С., Морозова В.Т. Исследование белков спермоплазмы у больных с воспалительными заболеваниями мужской репродуктивной системы // Клиническая лабораторная диагностика. 1998. - №9. -С.40.128

10. Ю.Медицинские лабораторные технологии и диагностика: Справочник. Медицинские лабораторные технологии / Под ред. А.И. Карпищенко. Санкт-Петербург: Интермедика, 1998. - 408 с.

11. П.Мелещенко А.Б., Кравцов A.JL, Ледванов М.Ю. Проточная цитоф-люориметрия сперматозоидов человека// Лабораторное дело. 1991. - N2. - С. 25 -27.

12. Неймарк А.И., Фидркин A.B., Алиев Р.Т. Изменение уровня энзимов спермы у мужчин с бесплодием // Урол. нефрол. 1998. - №2. - С.44 — 45.

13. Николаев A.A., Луцкий Д.Л., Ложкина Л.В. Белковый спектр эякуля-тов различной фертильности // Урол. нефрол. 1992. - №2. - С.48 - 51.

14. И.Николаев A.A., Луцкий Д.Л., Николаева H.H. Обмен железа и неге-миновых ферропротеинов в эякулятах различной фертильности // Урол. нефрол., 1998 №5. - С.27 - 31.

15. Пашков A.B. Ультрамикрометод определения фруктозы в сперме // Клиническая лабораторная диагностика. 1997. - N9. - С.38.

16. Пчелкина З.М., Фыонг И.Т., Евдокимов В.В. Определение слюнос-пермального глобулина при нарушениях сперматогенеза // Материалы IV Всесоюзного симпозиума с международным участием "Иммунология репродукции" .- Киев, 1990.-С. 81.

17. Пшеничникова Т.Я. Бесплодие в браке. М. Медицина. 1991. 320 с.

18. Руководство к практическим занятиям по клинической лабораторной диагностике. Под ред. М.А. Базарновой. К.: Выща школа, 1988. - 318 с.

19. Руководство по андрологии / Под ред. О.Л.Тиктинского. Л.: Медицина, 1990.-416 с.

20. Сексопатология: Справочник / Под ред. Г.С. Васильченко. М.: Медицина, 1990. - 576с.

21. Татаринов Ю.С., Олиференко Г.А., Петрунин Д.Д. Альфа 2- микроглобулин фертильности // Успехи совр. биологии. 1985. - Т. 100, вып. 3. - С.129465 472.

22. Afzelius B. A. Genetical and ultrastructural aspects of the immotile-cilia syndrome // Am. J. Hum. Genet. -1981. Y. 33. - P. 852-864.

23. Afzelius B. A., Eliasson R. Male and female infertility problems in the immotile-cilia syndrome // Eur. J. Respir. Dis. Suppl. 1983. - V. 127. - P. 144-147.

24. Ahmad K., Naz R. K. Effects of human antisperm antibodies on development of preimplantation embryos // Arch. Androl. 1992. - V.29. - P.9-20.

25. Aitken R.J., Clarkson J.S. Significance of reactive oxygen species and antioxidants in defining the efficacy of sperm preparation techniques // Journal of An-drology. 1988. V. 9. - N6. - P.367-376.

26. Alkaline phosphatase in human semen: an investigation using enzyme inhibitors and gel electrophoresis / L.M. Lewin, R. Golan, Y. Soffer et al. // Eur. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. 1993. -N12. - P.811-814.

27. J.S.Armstrong, M.Rajasekaran, W.J.Hellstrom, S.C. Sikka // J. Androl. 1998. -V.19, N4. - P.412-419.

28. Apparent doubling in the frequency of undescended testes in England and Wales / C. P. Chilvers, M.C. Forman, D. Fogelman, K. Wadsworth // Lancet. -1984. N2. - P. 330-332.

29. Ascorbic acid protects against endogenous oxidative DNA damage in human sperm / C.G. Fraga, P.A. Motchnik, M.K. Shigenaga et al. // Proceedings of the National Academy of Sciences. 1991. - V.88. - P. 11003-11006.

30. Ballachey B.E., Hohenboken W.D., Evenson D.P. Sperm head morphology and nuclear chromatin structure evaluated by flow cytometry in a diallel cross in mice // Can. J. Genet. Cytol. 1986. - V.28. - P.954-966.

31. Barratt C.L.R. On the accuracy and clinical value of semen laboratory tests // Hum. Reprod. 1995. - N 10. - P. 250-252.

32. Buitrago J.M., Diez L.C., Battaner E. Human semen aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase activity in male fertility studies // Andrologia.1981. V. 13, N4. P. 335-341.

33. Buonaguidi A., Mondina R., Polvani F. Prospectives of the study of seminal fluid in the diagnosis of infertility // J. Biol. Chem. 1996. - V.271. - P.32159-32167.

34. Calvin H. I., Bedford J. M. Formation of disulfide bonds in the nucleus and accessory structures of mammalian spermatozoa during maturation in the epididymis // J. Reprod. Fertil. 1971. V. 13. -P.65-75.

35. Characterization of a sperm-specific monoclonal antibody and isolation of 95-kilodalton fertilization antigen-2 from human sperm / R.K. Naz, C. Morte, V. Garcia-Framis et al. //Biol. Reprod. 1993. - V.49. - P. 1236-1244.

36. Cicero T.J., Bell R.D. Ethanol induced reductions in testicular steroidogenesis: Major differences between in vivo and in vitro approaches // Steroids.1982.-V. 40. -N5.-P. 561-568.131

37. Correlation of sperm motility with mitochondrial enzymatic activities / E. Ruiz-Pesini, C. Diez, A.C. Lapena, et al. // Clin. Chem. 1998. - V.44, N8. - P. 16161620.

38. Creatine kinase activity in human spermatozoa and seminal plasma lacks predictive value for male fertility in in vitro fertilization / C. Rolf, H.M. Behre, T.G. Cooper et al. // Fertil. Steril. 1998. - V.69, N4. - P.727-734.

39. Dadoune J.P. The nuclear status of human sperm cells // Micron 1995. -V. 26 -N4. P. 323-345.

40. Daltero S., Badre F. Cannabinoids in mice: effects on fertility and spermatogenesis // Science. 1982. - V. 216, P. 315-316.

41. Daltero S., Bartke A., Mayfield D. D9-tetrahydrocannabinol increases plasma testosterone concentration in male mice // Science. -1981. -V. 213. P. 581583.

42. Darzynkiewicz Z., Crissman H. Methods in cell biology // Flow Cytometry. University of California, 1990. V.33.

43. Decline in Semen Quality among Fertile Men in Paris during the Past 20 Years / J. Auger, J.M. Kunstmann, F. Czyglik, P. Jouannet // New Engl. J. Med. -1995. -V. 332, N. 5. P. 281-285.

44. Demonstration of antispermatozoal antibodies in varicocele related infertility with an enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) / J. Golomb, N. Vardi-non, Z.T. Homonnai et al. // Fertil. Steril. 1986. - V. 45. P. 397 -401.

45. DNA flow cytometry of left and right testes in normospermic patients affected by left varicocele / G. Bonanni, A. Calcagno, G. Mammana et al. // Hum. Reprod. 1997. -Nl. - P. 64-67.132

46. DNA organization in human spermatozoa / J.G. Barone, J. De Lara, K.B. Cummings, W.S. Ward//J. Androl. 1994. - V.15, N2. - P. 139-144.

47. Drudy L., McCaffrey M., Mallon E. Spermatozoal DNA flow cytometry and recurrent miscarriage // Arch. Androl. 1996. - V.37, N3. -P.143-147.

48. Dubin L., Amelar R.D. Etiologic factors in 1294 consecutive cases of male infertility// Fertil. Steril. 1971. - Y. 22. - P. 469.

49. Effect of lipid peroxidation on beating frequency of human sperm tail / C.Y. Hong, M.F. Lee, L.J. Lai, C.P. Wang // Andrologia. 1994. - V.26, P.61-65.

50. Eliasson R., Virji N. LDH-C4 in human seminal plasma and its relationship to testicular function. II. Clinical aspects // Int. J. Androl. 1985. —N1 - P. 201214.

51. Engh E., Scholberg A., Clausen O.P. DNA flow cytometry of sperm from normozoospermic men in barren couples and men of proven fertility. Int. J. Fertil. Menopausal Stud. 1993. - Y.38, N5. - P. 305-310.

52. Enzyme and hormonal markers in the differential diagnosis of human azoospermia / L.C. Garcia Diez, P.F. Esteban Ruiz, E. Villar // Arch. Androl. 1992. -V. 28, N3. - P. 181-194.

53. Evenson D.P., Baer R.K., Jost L.K. Flow cytometric analysis of rodent epididymal spermatozoal chromatin condensation and loss of free sulfhydryl groups // Mol. Reprod. Dev. 1989. - V. 1. - N4. - P.283-288.

54. Evidence for decreasing quality of semen during past 50 years / E. Carlsen, A. Giwercman, N. Keiding, N.E. Skakkebaek // B.M.J 1992. - N9. - P.609-613.

55. Experience with the determination of LDH-X in seminal plasma as diagnostic and prognostic factor in varicocele / A. Buonaguidi, M. Grasso, C. Lania et al. // Arch. Esp. Urol. 1993. - V. 46, N1. - P. 35-39.

56. Farghali H., Williams D.S., Gavaler J. Effect of short-term ethanol feeding on rat testes as assessed by 31P NMR spectroscopy, 1H NMR imaging, and biochemical methods //Alcohol. Clin. Exp. Res. 1991. - N15. - P. 1018-1023.

57. Forejtek P., Navratil S. Relation between aspartate aminotransferase (AST) activity in the seminal fluid and indicators of boar ejaculate quality // Vet. Med. (Praha) 1984. - V.29. - N4. - P. 217-222.

58. Fraser L. R., Mclntyre K. Calcium channel antagonists modulate the acro-some reaction but not capacitation in mouse spermatozoa // J. Reprod. Fertil. 1989 - V. 86. - P. 223-233.

59. Fraser L.R. Fertilization promoting peptide: an important regulator of sperm function in vivo? // Rev. Reprod. 1998. - N3. - P. 151-154.

60. Gagnon C., Iwasaki, A., Lamirande, E.D. Reactive oxygen species and human spermatozoa // Annals of the New York Academy of Sciences. 1991. -V.637. - P. 436-444.

61. Garner D.L., Johnson L.A. Viability assessment of mammalian sperm using SYBR-14 and propidium iodide // Biol. Reprod. 1995. - V.53, N2. - P.276-284.

62. Garner D.L., Thomas C.A., Allen C.H. Effect of semen dilution on bovine sperm viability as determined by dual-DNA staining and flow cytometry // J. An-drol. 1997. -V.18, N3. - P.324-331.

63. Gender-specific glycosylation of human glycodelin affects its contraceptive activity / H.R. Morris, A. Dell, R.L. Easton et al. // Minerva Ginecol. 1991. -V.43, N11. -P.499-503.

64. Gershbein L.L., Thielen D.R. Enzymatic and electrolytic profiles of human semen // Prostate. 1988. -V.12, N3. - P. 263-269.

65. Glander H.J., Kratzsch J., Weisbrich C. Insulin-like growth factor-I and alpha.2-macroglobulin in seminal plasma correlate with semen quality // Hum. Reprod. 1996. - V.ll. -Nil. - P.2454-2460.134

66. Glucose in human semen/ H. J. Povoa, J.J. Bastos, M.E. Silva et al. // Biomed. Biochim. Acta. 1986. - V.45, N5. - P.685-686.

67. Glycodelin from seminal plasma is a differentially glycosylated form of contraceptive glycodelin-A / H. Koistinen, R. Koistinen, A. Dell et al. // Mol. Hum. Reprod. 1996. - V.2, N10. - P.759-765.

68. Gonzales G.F., Garcia-Hjarles M.A., Guitierrez R. The secretor activity of seminal vesicles and its relationship with sperm motility: effects of infections in the male reproductive tract // Int. J. Androl. 1989. - N 12. - P. 286-294.

69. Gonzales G.F., Kortebani G., Mazzolli A.B. Hyperviscosity and hypo-function of the seminal vesicles // Arch. Androl. 1993. - V. 30. - N1. - P.63-68.

70. Gopalkrishnan K., Hinduja I.N., Kumar T.C. Volume of semen as a parameter of its quality // Indian J. Med. Res. 1992. - V. 96. - P.361-365.

71. Gopalkrishnan K., Padwal V., D'Souza S., Shah R. Severe asthenozoo-spermia: a structural and functional study // Int. J.Androl. 1995. - V.18. - N1. -P.67-74.

72. Hacker-Klom U.B., Gohde W., Nieschlag E. DNA flow cytometry of human semen //Hum. Reprod. 1999. - V.14. - N10. - P.2506-2512.

73. Halliwell B. Reactive oxygen species in living systems: source, biochemistry, and role in human diseases // Amer. J. Med. 1991. - V.9. - P. 14-22.

74. Haugan T.B., Grotmol T. PH of human semen // Int. J. Androl. 1998. -N2. - P. 105 - 108.

75. Hershlag A., Cooper G. W., Benoff S. Pregnancy following discontinuation of a calcium channel blocker in the male partner // Hum. Reprod. 1995 -N10. -P. 599-606.

76. Huaijin C., Junyan Z., Naiguan C. Prostatic fluid and sperm examination: 106 cases. Preliminary study on infertility // Acta. Urol. Belg. 1998. - V. 66, N1. -P. 19-21.

77. Hull M.G.R. Infertility treatment: relative effectiveness of conventional135and assisted conception methods // Hum. Reprod. 1992. - N7. - 785-796.

78. Human male infertility may be due to a decrease of protamine P2 content of sperm chromatin / I.A. Belokopitova, E.I. Kostyleva, A.N. Tomilin, V.I. Vorobev // Mol. Reprod. Dev. 1993. -V34. - P.53-57.

79. Jager S., Wijchman J., Kremer J. Studies on the decondensation of human, mouse, and bull sperm nuclei by heparin and other polyanions // J. Exp. Zool. -1990. V.256, N3. - P.315-322.

80. Javed A. A., Naz R. K. Human cleavage signal-1 protein: Molecular cloning, transcription and immunological analysis of in vitro translated protein // Gene.- 1992. V.112. - P. 205-211.

81. Jeulin C., Lewin L.M. Role of free L-carnitine and acetyl-L-carnitine in post-gonadal maturation of mammalian spermatozoa // Hum. Reprod. Update.1361996. -N2. -P.87-102.

82. Jones R.C., Murdoch R.N. Regulation of the motility and metabolism of spermatozoa for storage in the epididymis of eutherian and marsupial mammals // Reprod. Fertil. Dev. 1996. - V.8. - N4. - P.553-568.

83. Keltimlidis K., Papadimas J., Bontis J. LDH isoenzymes in semen of infertile men // Arch. Androl. 1989. - V.22, N1. - P. 77-84.

84. Kulikauskas V., Blaustein D., Ablin R.J. Cigarette smoking and its possible effects on sperm // Fertil. Steril. 1985. - V. 44 - P. 526-528.

85. Kumar G.P. Lipid phase transitions and a possible lipid-protein lattice structure as an activity regulator in maturing spermatozoa. // Biochem. Mol. Biol. Int. 1993.-V.29, N6. - P.1029-1038.

86. Kung A.W., Ho P.C. ,Wang C. Seminal leucocyte subpopulations and sperm function in fertile and infertile Chinese men // Int. J. Androl. 1993.- V. 16.-N3. - P. 189- 194.

87. OO.Labby D.H. / Current obstetric and gynaecologic diagnosis and treatment //Lang. California, 1982. - P. 486-501.

88. Lactic dehydrogenase-C4 activity in seminal plasma and male infertility / J.A. Noguera Velasco, I. Tovar Zapata, P. Martinez Hernandez et al. // Fertil. Steril. 1993. -V. 60, N2. - P. 331-335.

89. Laudat A., Foucault P., Palluel A.M. Relationship between seminal LDH-C4 and spermatozoa with acrosome anomalies // Clin. Chim. Acta. 1997. - V. 265, N2. - P. 219-224.

90. Leiva S., Loyola M., Agar A.M. Evaluation of DNA/protein status and nuclear maturity of human sperm // Cytobios. 1994. V.78. - P.7-18.

91. Leyton L., Saling P. 94 kD sperm proteins bind ZP3 and serve as tyrosine kinase substrates in response to zona binding// Cell. 1989. - V.57. - P. 1123-1130.

92. Liu D. Y., Baker H. W. inhibition of acrosin activity with a trypsin inhibitor blocks human sperm penetration of the zona pellucida // Biol. Reprod. -1993. N48.-P. 340-348.

93. MacLeod J. Seminal Cytology in the presence of varicocele // Fértil. Steril. 1965. - V.16. - P.735 -740.

94. MacLeod J. Further observations on the role of varicocele in human male infertility// Fértil. Steril. 1969. - V. 20. - P. 545 - 548.

95. Male reproductive tract sensitivity to ethanol: A critical overview /R.A. Anderson, B.R. Willis, C. Oswald, L.J.D. Zaneveld // Pharmacol. Biochem. Behaviour. 1983. -V.18. - P. 305-310.

96. Male reproductive toxity of lead in animals and human. ASCLEPIOS study group / P. Apostoli, P. Kiss, S. Porra et al. // Occup. Environ. Med. 1998. -V.55, №6-P. 364-374.

97. Matson P.L. External quality assessment for semen analysis and sperm antibody detection: results of a pilot scheme // Hum. Reprod. 1995. N10. - P. 620625.

98. Maxwell W.M., Welch G.R., Johnson L.A. Viability and membrane integrity of spermatozoa after dilution and flow cytometric sorting in the presence or absence of seminal plasma // Reprod. Fértil. Dev. -1996. N8. - P.l 165-1178.

99. McLean D.J., Jones L.G., Froman D.P. Reduced glucose transport in138sperm from roosters (Gallus domesticus) with heritable subfertility // Biol. Reprod. -1997. V.57, N4. - P.791-795.

100. Measurement of seminal LDH-X and transferrin in normal and infertile men / C. Orlando, R. Casano, A.L. Caldini et al. // J. Androl. 1988. -N3. - P. 220-223.

101. Mendelson J.H., Mello N.K., Ellignbee E.J. Effects of acute alcohol intake on pituitary-gonadal hormones in normal human males // J. Pharmacol. Exp. Therap. 1976. - V. 202. - P. 676-682.

102. Moilanen J., Hovatta O., Lindroth L. Vitamin E levels in seminal plasma can be elevated by oral administration of vitamin E in subfertile men // Int. J. Androl. 1993. - V.16. -P.165-166.

103. Mortimer D. Practical Laboratory Andrology // Oxford University Press. -New York, 1994. 120 p.

104. Mortimer D. The male factor in infertility. Part I. Semen analisis // Curr. Probl. Obstet. Gynecol. Fertil. 1985. - N 8. - P.3-87.

105. Mortimer D., Bramley T.A. Glutamic-oxalacetic transaminase leakage from human spermatozoa as an indicator of cryodamage // Arch. Androl. 1981. -N6. - P. 337-341.

106. Mortimer D., Johnson A.V., Long-Simpson L.K. Glutamic-oxaloacetic transaminase isozymes in human seminal plasma and sperm extracts // Int. J. Fertil. -1988. V.33, N4. - P. 291-295.

107. Mortimer S.T., Swan M.A., Mortimer D. Effect of seminal plasma on ca-pacitation and hyperactivation in human spermatozoa // Hum. Reprod. 1998. - N8. - P.2139-2146.

108. Moser W, Pratt W. National Center for Health Statistics: fecundity and infertility in the United States, 1965-1988. Advance data from vital and health statistics. No. 192. Hyattsville, Md.: Public Health Service, 1990. P.121-126.

109. Mundy A.J., Ryder T.A., Edmonds D.K. Asthenozoospermia and the hu139man sperm mid-piece // Hum. Reprod. 1995. - V.10, N1. - P. 116-119.

110. Nakamura M., Okinaga S., Arai K. Studies of metabolism of round spermatids: glucose as unfavorable substrate // Biol. Reprod. 1986. - V.35, N4. -P.927-935.

111. Naz R. K. Effects of antisperm antibodies on early cleavage of fertilized ova//Biol. Reprod. 1992. - V.46. - P.130-139.

112. Naz R. K., Brazil C., Overstreet J. Effects of antibodies to sperm surface fertilization antigen-1 on human sperm-zona pellucida interaction // Fertil. Steril. -1992. V.57. - P.1304-1310.

113. Naz R. K., Sacco A. G., Yurewicz E. C. Human spermatozoal FA-1 binds with ZP3 of procine zona pellucida // J. Reprod. Immunol. 1991. - V.20. - P. 43-58.

114. Neischlag E., Behre H. Andrology: Male reproductive health fnd disfunction. Springer. Berlin 1997.

115. Organization of SCP1 protein molecules within synaptonemal complexes of the rat / K. Schmekel, R.L. Meuwissen, A.J. Dietrich et al. // Exp. Cell Research. 1996.-V. 226.-P. 20-30.

116. Oscillations in intracellular free calcium induced by spermatozoa in human oocytes at fertilization / C.T. Taylor, Y. M. Lawrence, C.R. Kingsland et al. // Hum. Reprod. 1993. - N8. - P.2174-2179.

117. Palmblad J., Mossberg B., Afzelius B. A. Ultrastructural, cellular, and clinical features of the immotile cilia syndrome // Annu. Rev. Med. - 1984. - V.35. -P. 481-492.

118. Patel S.M., Skandhan K.P., Mehta Y.B. Seminal plasma fructose and glucose in normal and pathological conditions // Acta Eur Fertil. 1988. - N6. - P.329-332.

119. Pedron N. Cholinesterase activity of seminal plasma and human spermatozoa in normal and infertile subjects // Arch. Androl. 1983. - V.10, N3. - P. 249-251.140

120. Perreault S. D., Wolff, R.A., Zirkin, B. R. The role of disulfide bond reduction during mammalian "sperm decondensation in vivo // Devel. Biol. 1984. -V.125. - P.181 - 186.

121. Perreault S.D., Barbee R.R., Elstein K.H. Interspecies differences in the stability of mammalian sperm nuclei assessed in vivo by sperm microinjection and in vitro by flow cytometry // Biol. Reprod. 1988. - V.39. - P. 157-167.

122. Perreault, S. D., Barbee R. R., Slott V. L. Importance of glutathione in the acquisition and maintainance of sperm nuclear decondensing activity in maturing hamster oocytes//Devel. Biol. 1988. - V.125. - P. 181 - 186.

123. Population study of causes, treatment and outcome of infertility / M.G.R. Hull, C.M.A. Glazener, N.J. Kelly et al. // Br. Med.J. 1985. P. 1693-1697.

124. Presence of endogenous nicks in DNA of ejaculated human spermatozoa and its relationship to chromomycin A3 accessibility / G.C. Manicardi, P.G. Bian-chi, S. Pantano et al. // Biol. Reprod. 1995. - V.52, N4. - P.864-867.

125. Purification of an acrosomal antigen recognized by a monoclonal antibody and antifertility effects on isoimmune serum / M.S. Liu, Y. Yang, J. Pan et al. // Int. J. Androl. 1989. - N12. - P.451- 463.

126. Raber N.M. , Barloge R. DNA Flow Cytometry of Human Solid Tumors // Flow Cytometry and Sorting. 2nd ed, New York: Wiley-Liss, Inc, 1990. P. 745 - 754.141

127. Recombinant human zona pellucida protein ZP3 produced by Chinese hamster ovary cells induces the human sperm acrosome reaction and promotes sperm-egg fusion / M. Duin, J. E. Polman, I. T. De Breet et al. // Biol. Reprod. -1994. -V.51. P.607-617.

128. Relationship between abnormal sperm chromatin packing and IVF results / M.V. Filatov, E.V. Semenova, O.A. Vorob'eva et al. // Mol. Hum. Reprod. 1999. - N9. - P.825-830.

129. Relationship between creatine kinase levels and clinical diagnosis of infertility / R.S. Sidhu, J. Hallak, R.K. Sharma et al. // J. Assist. Reprod. Genet. -1998. V.15, N4. - P.188-192.

130. Riley R.S., Mahin E.J. DNA analisis // Flow Cytometry. Clinical applications. ASCP National Workshop N9072. ASCP National Meeting, Washington, D.C. 1989. - P. 63 -108.

131. Rodriguez H., Ohanian C., Bustos-Obregon E. Nuclear chromatin decondensation of spermatozoa in vitro: a method for evaluating the fertilizing ability of ovine semen // Int. J. Androl. 1985. - V.8. - N2. - P.147-158.

132. Rodriguez H., Ohanian C., Bustos-Obregon E. Nuclear chromatin decondensation of spermatozoa in vitro: a method for evaluating the fertilizing ability of ovine semen // Int. J. Androl. 1985. - N2. - P.147-158.

133. Sakkas D., Manicardi G., Bianchi P.G. Relationship between the presence of endogenous nicks and sperm chromatin packaging in maturing and fertilizing mouse spermatozoa//Biol. Reprod. 1995.-V.52, N5. - P.1149-1155.

134. Saypol D.C. Varicocele//J. Androl. 1981. - N 2. - P. 61 - 65.

135. Schoysmn R., Gerris J. Twelve-year-up study of pregnancy rates in 1291 couples wiht idiopathically impathically impaired male fertility // Acta Eur. Fertil. -1983.-N14.-P. 51-56.

136. Shapiro H.M. Practical Flow Cytometry: parameters and probes. Second edition. New York: AlanLiss, 1988. P. 133 - 164.142

137. Sidhu R.S., Sharma R.K., Agarwal A. Relationship between creatine kinase activity and semen characteristics in subfertile men // Int. J. Fertil. Womens Med. 1998. - V. 43. - N4. - P. 192-197.

138. Sikka S., Rajasekaran M., Hellstorm W. Role of oxidative stress and antioxidants in male infertility // J. Androl. 1995. - N16. - P. 464 - 468.

139. Sperm capacitation in humans is transient and correlates with chemotactic responsiveness to follicular factors / A. Cohen-Dayag, I. Tur-Kaspa, J. Dor et al. // Proc. Nat. Acad. Sci. 1995. - V.92. - P.l 1039-11043.

140. Sperm creatine kinase activity in normospermic and oligozospermic Hungarian men / A. Gergely, J. Szollosi, G. Falkai et al. // J. Assist. Reprod. Genet. -1999. V.16, N1,-P. 35-40.

141. Sperm motility and AFP content in seminal hyperviscosity / G.R. Men-deluk, M.J. Munuce, C. Carizza et al. // Arch Androl. 1997. -V.39, N3. - P.223-227.

142. Speroff L., Glass R.H., Kase N.G. Clinical Gynecologic Endocrinology and Infertility. Williams & Wilkins, Baltimore, 1989. 345 p.

143. Stewart B.H. Varicocele in infertility: incidence and results of surgical therapy // J. Urol. 1974. - V. l 12 - P. 222 -228.

144. Structural analysis of the oligosaccharides derived from glycodelin, a human glycoprotein with potent immunosuppressive and contraceptive activities / A. Dell, H.R. Morris, R.L. Easton et al. // J. Biol. Chem. 1995. V. 270, N41. - P. 24116-24126.

145. Studies on the origin of redox enzymes in seminal plasma and their relationship with results of in-vitro fertilization / C.H. Yeung, T.G. Cooper, M. De143

146. Geyter et al. // Mol. Hum. Reprod. 1998. - N9. - P. 835-839.

147. Tesarik J. Appropriate timing of the acrosome reaction is a major requirement for the fertilizing spermatozoon // Hum. Reprod. 1989. - N4. - P. 957961.

148. Tesarik J. Oocyte activation after intracytoplasmic injection of mature and immature sperm cells. Hum. Reprod. - 1998. - N13. - Suppl. 1 - P.117-127.

149. Tesarik J., Sousa M., Testart J. Human oocyteactivation after intracytoplasmic sperm injection // Hum. Reprod. 1994. - N9 - P.5 11-518.

150. The effect of calcium ion channel blockers on sperm fertilization potential / S.G. Benoff, W. Cooper, I. Hurley et al. // Fertil. Steril. 1994. - V. - 62. - P. 606617.

151. The removal of morfologically abnormal sperm forms by phagocytes: a positive role for seminal leukocytes? / M.J. Tomlinson, A. White, C.L. Barratt et al. // Hum. Reprod. 1992. - N4. - P. 517-522.

152. The routine assessment of sperm motility at room temperature and 37°C / A.G. Birks, H. Izzard, D.R. Morroll et al. // Int. J. Androl. 1994. - V. 17, P. 289291.

153. Thiele J.J., Freisleben H.J., Fuchs J Ascorbic acid and urate in human seminal plasma: determination and interrelationships with chemiluminescence in washed semen//Hum. Repr. 1995. V. 10, N1. - P. 110-115.

154. Total antioxidant capacity of seminal plasma is different in fertile and infertile men / S. Lewis, P.M. Boyle, K.A. McKinney // Fertility and Sterility. 1995. V.64, N4. - P. 868-870.

155. Treatment of human spermatozoa with seminal plasma inhibits protein tyrosine phosphorylation / C.N. Tomes, R. Carballada, D.F. Moses et al. // Mol. Hum. Reprod. 1998. - V.4,N1.-P.17-25.

156. Tyler J.P., Crockett N.G., Driscoll G.L. Studies of human seminal para-netries with frequent ejaculationl. Clinical characteristics // Clin. Reprod. Fertil.1441982. -N 1. P.273-285.

157. Urch U. A., Wardrip N. J., Hedrick J. L. Proteolysis of the zona pellucida by acrosin: the nature of the hydrolysis products // J. Exp. Zool. -1985. V. 236. - P. 239-243.

158. Viability assessment of turkey sperm using fluorescent staining and flow cytometry / A.M. Donoghue, D.L. Garner, D.J. Donoghue, L.A. Johnson // Poult. Sci. 1995. - V.74, N7. - P.1191-1200.

159. Virji N. LDH-C4 in human seminal plasma and its relationship to testicular function. I. Methodological aspects // Int. J. Androl. 1985. - N1. - P. 193200.

160. Virji N., Eliasson R. LDH-C4 in human seminal plasma and testicular function. III. Relationship to other semen variables // Int. J. Androl. 1985. - N10. -P. 376-384.

161. Ward W. S., Coffey D. S. DNA packaging and organization in the mammalian spermatozoa: comparison with somatic cells // Biol. Reprod. 1991. - V.44. -P.569 - 574.

162. Ward W.S. Deoxyribonucleic acid loop domain tertiary structure in mammalian spermatozoa // Biol. Reprod. 1993. - V.48. - P. 1193 - 1201.

163. Watanabe Y., Okuda M. Ultrastructural study of immotile cilia syndrome // Rhinology. 1984. - V. 22. - P. 193-199.

164. Weissenberg R., Bella R., Yossefi S. Changes during puberty in chromatin condensation, morphology and fertilizing ability of epididymal spermatozoa of the golden hamster // Andrologia. 1995. - V.27, N6. - P.341-344.

165. WHO Laboratory mannual for the examination of Human semen and semen-cervical mucus interaction. Cabridge University Press, 1987. - 55 p.

166. WHO Laboratory manual for the examination of Human semen and semen-cervical mucus interaction.3ld ed. The Press Syndicate of the University of Cambridge, 1992. 60 p.

167. Wittmaack F.M., Shapiro S.S. Longitudinal study of semen quality in145

168. Wisconsin men over one decade // Wis. Med. J. 1992. -№ 91. - P. 477 - 479.

169. Yen S.C., Jaffe R.B. Reproductive Endocrinology. W.B. Saunders Company, Philadelphia, 1991. - 560 p.

170. Zalata A., Hafez T., Comhaire F. Evaluation of the role of reactive oxygen species in male infertility // Hum. Reprod. 1995. - V.10, N6. - P. 1444-1451.

171. Zinc, magnesium and calcium in human seminal fluid: relations to other semen parameters and fertility / M.B. Sorensen, I.A. Bergdahl, N. Henrik et al. // Mol. Hum. Reprod. 1999. - N4. - P.331-337.

172. Zirkin B. R., Perreault S. D., Naish S.J. Formation and function of the pronucleus during mammalian fertilization // In The Molecular Biology of Fertilization. Academic Press, San Diego, 1989. - P.91 - 114.