Изучение возможности использования электрофореза белков и нуклеиновых кислот для диагностики вирусных и вирусоподобных болезней ягодных культур тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 06.01.11, кандидат сельскохозяйственных наук Кандыба, Дмитрий Николаевич

• Кандыба, Дмитрий Николаевич
• кандидат сельскохозяйственных наук
• 1999

Оглавление диссертации кандидат сельскохозяйственных наук Кандыба, Дмитрий Николаевич

Содержание

Введение

Цели и задач исследований

Научная новизна и практическая ценность работы

Глава 1. Обзор литературы

1.1. Вирусные, фитоплазменные и вирусоподобные болезни

ягодных культур

1.2. Основные принципы и методы очистки вирусов и

вирусных белков

1.3. Особенности очистки непереносимых соком вирусов

1.4. Выделение и очистка вирусспецифических нуклеиновых кислот

1.5. Использование электрофореза белков для изучения и диагностики вирусов

1.6. Диагностика и анализ вирусов методом электрофореза нуклеиновых кислот

Глава 2. Материалы и методы

2.1. База исследований

2.2. Материалы и объекты исследований

2.3. Методика выделения и очистки вирусспецифических белков

2.4. Выделение и очистка вирусспецифических нуклеиновых кислот

2.5. Методика проведения электрофореза

Глава 3. Результаты исследований

3.1. Очистка и выявление методом электрофореза специфического

белка вируса хлороза жилок малины (ЯУСУ)

3.2. Очистка и выявление методом электрофореза специфических белков вирусов крапчатости (БМУ) и морщинистости (8СУ) земляники

3.3. Очистка и выявление методом электрофореза специфических белков возбудителей вирусных и вирусоподобных болезней смородины

и крыжовника

3.4. Изучение возможности использования разработанной методики для

выявления вирусов косточковых культур

3.5. Очистка и выявления методом электрофореза специфических РНК вирусов ягодных культур

3.6. Ожидаемый экономический эффект по использованию метода электрофореза белков и нуклеиновых кислот для диагностики вирусных и вирусоподобных болезней ягодных культур

3.7. Обсуждение результатов

4. Выводы

5. Рекомендации по практическому использованию

6. Список литературы

7. Приложение

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение возможности использования электрофореза белков и нуклеиновых кислот для диагностики вирусных и вирусоподобных болезней ягодных культур»

Введение

Ягодные культуры в сильной степени поражаются вирусными и фито-плазменными заболеваниями. К настоящему времени число выявленных вирусов и фитоплазм составляет на землянике -27, малине -25, смородине -14, на крыжовнике 9 (R.H. Converse, 1987). Вредоносность этих заболеваний может быть значительной. Так, израстание на малине и реверсия на смородине могут вызывать полное бесплодие насаждений (Ю.Н. Помазков, 1975). Потери урожая малины в результате заражения мозаикой могут достигать 53% (Г.Т. Борзых, 1975; A.A. Кузнецова, 1970), на землянике от вирусов крапчатости и морщинистости урожаи уменьшаются в 1,7 раза (О.О. Белошапкина, 1986; В.Ю. Минаев, 1985). Из-за внутриклеточного характера паразитирования и теснейшей взаимосвязи цикла развития вирусов с жизнедеятельностью растений-хозяев борьба с этими патогенами в существующих насаждениях невозможна. Единственный эффективный способ снижения их вредоносности в условиях многофакторной динамичной системы адаптивного садоводства является использование высококачественного оздоровленного посадочного материала (В. И. Кашин, 1995).

Производство оздоровленного посадочного материала и фитовирусологи-ческие исследования, в целом, в настоящее время невозможны без современных методов экспресс-диагностики вирусов. К одним из таких методов относится иммуноферментный анализ, основанный на производстве антисывороток к вирусам. Однако область применения этого метода довольно ограничена ввиду наличия целого ряда так называемых соконепереносимых вирусов, частицы ко-

торых необратимо разрушаются либо в экстрактах сока, либо в процессе очистки. Получение антисывороток к таким вирусам в настоящее время не представляется возможным. Диагностика этих вирусов в настоящее время возможна только путём прививок на соответствующие растения - индикаторы, что весьма трудоёмко, требует наличия зимних теплиц и большого количества растений-индикаторов, в то время, как продолжительность теста составляет 1-2 года. Аналогичным образом осуществляется сейчас и диагностика фитоплазм, поражающих ягодные культуры: израстания малины, желтухи и позеленения лепестков земляники и т. д.

Исследования последних десятилетий показали возможность решения данной проблемы на основе использования метода электрофореза белков и нуклеиновых кислот данных патогенов.

Широкое применение электрофорез получил в области фитопатологии первоначально как метод изучения, выделения и очистки нативных вирусных частиц. Позднее было признано использование данного метода для анализа кап-сидного вирусного бежа и нуклеиновых кислот. Данный метод позволяет установить природу болезнетворного агента (вироид, вирус или фитоплазменный организм), определить молекулярную массу, макроструктуру и концентрацию белков и нуклеиновых кислот, контролировать качество очистки вирусных препаратов и иммуноглобулинов, анализировать конечный продукт полимеразной цепной реакции и т.д. В последнее десятилетие электрофорез выделился в качестве самостоятельного метода диагностики некоторых флоэмограниченных ви-

русов, вироидов и считается единственным методом выявления так называемых критических вирусов.

В России и СНГ метод электрофореза использовали для диагностики вироидов веретеновидности клубней картофеля и карликовости хризантем (Т.Я. Васильева, 1985; Т.Б. Кастальева, К.А. Можаева, 1988; Ю.А. Леонтьева и др., 1988) и для изучения прижилковой мозаики и бороздчатости древесины винограда (H.A. Мулюкина, 1993); на ягодных культурах данный метод не испытывал ся.

В связи с выше изложенным, целью наших исследований являлось изучение возможности использования метода электрофореза белков и нуклеиновых кислот для диагностики вирусных и вирусоподобных болезней ягодных культур.

В конкретные задачи исследований входило следующее:

1. Выделить и изучить методом электрофореза специфические белки возбудителей вирусных и вирусоподобных болезней ягодных культур.

2. Отработать методику выделения и анализа РНК для диагностики ряда непереносимых соком вирусов ягодных культур.

3. Оценить возможность использования метода электрофореза белков и нуклеиновых кислот для выделения безвирусных клонов ягодных культур.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА И ПРАКТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ РАБОТЫ

Впервые разработана методика очистки и выявления методом электрофореза специфических белков и нуклеиновых кислот труднодиагностируемых вирусов хлороза жилок малины (КУСУ), морщинистости земляники (8СУ) и крапчато-сти земляники (8МУ) непосредственно из тканей растений хозяев.

Впервые выявлено наличие у КУСУ и 8СУ двух белков с молекулярными массами 52кД и 37кД, типичных для представителей группы рабдовирусов.

Впервые очищены и фракционированы методом электрофореза специфические белки возбудителей реверсии чёрной и красной смородины, а также нуклеиновые кислоты КУСУ, БМУ и 8СУ.

Практическое значение работы состоит в разработке методики тестирования наличия специфических белков и нуклеиновых кислот соконепереносимых вирусов ягодных культур, что позволяет сократить сроки их диагностики с 1-2 лет до 2 дней по сравнению с методом растений - индикаторов и в 43 раза снизить затраты на проведение диагностических тестов.

1. Обзор литературы

1.1. Вирусные, фитоплазменные и вирусоподобные болезни

ягодных культур

В 1994 году Европейской организацией защиты растений (ЕОЗР) были приняты сертификационные схемы получения свободного от патогенов посадочного материала ягодных культур (Certification schemes №№ 09,10,11 ЕРРО,1994). В этих схемах перечислены вирусы, фитоплазмы и вирусоподобные агенты, которые должны отсутствовать в сертифицируемых клонах, и описаны методы их тестирования (Таб. 1-3).

Схема получения сертифицированного посадочного материала земляники регламентирует подавляющее большинство известных вирусных и вирусоподобных патогенов этой культуры (Таб.1), за исключением неповируса кольцевой пятнистости томата (Том RSV), выявленного на этой культуре лишь в Северной Америке (N.N. Frasier et. al., 1961; R.H. Converse 1981).

Анализ таблицы 1 показывает, что из 22 регламентируемых патогенов земляники только четыре неповируса (AMV, SLRV, RRV, TBRV) и один илар-вирус (TSV) можно диагностировать механической инокуляцией сока растений травянистого индикатора Chenopodium quinoa, или методом иммуноферментно-го анализа (ИФА). Для выявления 12 сокопереносимых вирусов и вирусоподобных агентов земляники требуется наличие целого набора индикаторных клонов Fragaria vesca (UC-4; UC-5; UC-1; UC-6; UC-10; EMK; Alpina) и осуществление их прививки листочками тестируемых растений земляники методом Фрезера (N.W.Frazier, 1974а,б) в различных модификациях. Методы гибридизации нуклеиновых кислот и полимеразной цепной реакции, успешно испытанные для выявления вирусов слабого пожелтения краёв листьев и окаймления жилок земляники, пока ещё не используются в сертификационных программах из-за их высокой стоимости (R.H. Converse et. al., 1988; D.C. Stenger et.al., 1988; W.Jelkmann et.al., 1990). Диагностика 5 известных фитоплазмозов земляники

осуществляется по наличию характерных симптомов и методом электронной микроскопии.

Сертификационная схема ЕОЗР по малине (Табл. 2) включает фактически все важнейшие вирусы этой культуры, широко распространённые в России и Европе (Ю.Н. Приходько,1997; А.Т. Jones, 1986 и др.). В схему из-за ограниченной распространённости не включены сокоиереносимые вирусы погремковости табака (TRV) и некроза табака (TNV), обнаруженные на малине в Шотландии (С.Н. Cadman, 1961). Очевидно, редко встречается на малине и У-вирус картофеля (PVJ), серологически выявленный на этой культуре в Подмосковье (Ю.Н. Приходько, 1997). Однако, ввиду массового завоза различными коммерческими фирмами посадочного материала ежевики и малины из США, существует реальная опасность интродукции в нашу страну сокопереносимых вирусов кольцевой пятнистости томата (TomRSV), кольцевой пятнистости табака (TobRSV), штриховатости табака (TSV), рашпилевидности листьев черешни (CRLV) и афидофильного вируса скручивания листьев малины (RLCV), широко распространённых на культурах рода Rubus на американском континенте (R.H. Converse, 1987).

Из регламентируемых схемой ЕОЗР вирусов малины наиболее сложна диагностика вирусов мозаичного комплекса (BRNV, RLMV, RLSV и RINV), а также вирусов хлороза жилок малины (RVCV) и желтой пятнистости малины (RISV). Их выявление требует набора растений-индикаторов (здоровые растения R.occidentalis и RJdaeus сортов Horfolk Quant, Mailing Landmark и Mailing Promise), для инокуляции которых используют так называемый «бутылочный тест» или прививку сближением побегов (C.H.Cadman, 1961) в условиях зимних теплиц; продолжительность теста - не менее 1 года.

Видовой состав вирусов чёрной и красной смородины значительно беднее, чем у малины и земляники. Сертификационной схемой ЕОЗР регламентируется на смородине лишь 5 переносимых соком вирусов (неповирусы -AMV, SLRV, RRV, TBRV и кукумовирус огуречной мозаики) и 2 соконепереносимых патогена -вирус окаймления жилок крыжовника (GVBV) и реверсия смородины

(Таб. 3). Последние, однако, имеют наиболее важное экономическое значение (R.H. Converse, 1987). Для условий России необходимо также включение в схему рябухи смородины, повсеместно распространённой в Сибири (В.И. Гладких, 1978) и регулярно интродуцируемой с посадочным материалом в Европейскую часть нашей страны (О.Ю. Суркова, 1994). Кроме того, на наш взгляд, в схему сортификации необоснованно не включены такие вирусоподобные болезни смородины, как желтуха и инфекционная пестролистность, отмеченные в ряде стран Европы (C.Putz, 1972; J.Thresh, 1970;R.H. Converse, 1987) и в нечернозёмной зоне России (О.Ю. Суркова, 1994).

В качестве индикаторов для выявления GVBV рекомендуется использовать здоровые растения красной смородины сорта Йонхер ван Тете, для диагностики реверсии, желтухи и пестролистности -растения чёрной смородины сортов Амос Блэк, Болдуин и Оджибьён (R.H. Converse, 1987) или сорта Катюша (О.Ю. Суркова, 1994); к рябухе наиболее чувствителен сорт Голубка (В.И. Гладких, 1978). Индикаторы инокулируют прививкой щитками коры или верхушками побегов; продолжительность тестов -2года для реверсии и не менее 1 года-для остальных патогенов.

Все перечисленные в таблице 3 сокопереносимые вирусы, а также вирус окаймления жилок крыжовника, широко распространены также в Европейской части России на крыжовнике (Ю.Н. Приходько, О.Ю. Суркова, 1994).

Таким образом, все известные вирусы ягодных культур можно подразделить на две группы по способности к передаче с соком на травянистые растения. Как уже отмечалось выше, сокопереносимые вирусы диагностируются на травянистых индикаторах и методом ЙФА. Методика ИФА для выявления этих вирусов применительно к условиям средней полосы России детально отработана (OJO. Суркова, 1994; Ю.Н. Приходько, 1996; Ю.Н. Приходько и др., 1994, 1995; М.Т. Упадышев, 1996; Е.А. Лукьянова, 1998), и при условии наличия антисывороток и необходимого оборудования не представляет трудностей. Диагностика же непереносимых соком вирусов и вирусоподобных агентов по-прежнему осуществляется трудоёмким и дорогостоящим методом растений - индикато-

ров. Разработка экспресс -методов выявления этих патогенов является актуальнейшей задачей безвирусного питомниководства.

Таблица 1

Вирусы, фитоплазмы и вирусоподобные агенты земляники, регламентируемые сертификационной схемой Европейской организации защиты растений (Certification scheme №11 Pathogen -tested strawberry //OEPP/EPPO.-1994).

№ п/п Патогены Тест-методы**) Растения -индикаторы

Переносимые соком вирусы

1 Неповирус мозаика резухи (Arabis mosaic nepovirus =AMV 1,3 Chenopodium quinoa

2 Неповирус кольцевой пятнистости малины (Raspberry ringspot nepovirus = RRV) 1,3 Chenopodium quinoa

3 Неповирус латентной кольцевой пятнистости земляники (strawberry latent ringspot nepovirus = SLRV) 1,3 Chenopodium quinoa

4 Неповирус чёрной кольчатости томата (Tomato black ring nepovirus = TBRV) 1,3 Chenopodium quinoa

5 Иларвирус штриховатости табака (Tobacco streak ilarvirus = TSV)*) 1.3 , Chenopodium quinoa

Непереносимые соком вирусы

1 Рабдовирус морщинистости земляники (strawberry crincle rhbdovirus -SCV) 2 Fragaria vesca UC-4, UC-5

2 Вирус крапчатости земляники (strawberry mottle virus = SMV) 2 Fragaria vesca UC-4, UC-5

3 Вирус слабого пожелтения краёв листьев земляники (strawberry mild yellow etge virus = SMYEV) 2 Fragaria vesca UC-4, UC-5

4 Каулимовирус окаймления жилок земляники (strawberry vein banding caulimovirus =SVBV) 2 Fragaria vesca UC-6, UC-12

5 Латентный вирус С земляники (strawberry latent С virus - SLCV)*) 2 Fragaria vesca UC-5, EMC

6 Карлавирус ложного слабого пожелтения краёв листьев земляники (strawberry pseudo mild yellow edge virus = SPMYEV) 2 Fragaria vesca UC-4, UC-12, Alpine

Продолжение таблицы 1

№ п/п Патогены Тест-методы**) Растения - индикаторы

Вирусоподобные агенты

1 Хлоротическая крапчатость (Chlorotic fleck)*) 2 Fragaria vesca EMB,EMK

2 Скручивание листьев (Leafroll)*) 2 Fragaria vesca UC-5

3 Ведьмина метла (Witches'broom)*) 2 Fragaria vesca UC-4,UC-5

4 Многоверхушечность(МиШрНег plant)*) 2 Fragaria vesca UC-4,UC-5

5 Перистость листьев (Feather-leaf) 2 F. vesca UC-1;4, Alpina

6 Паллидозиз (Pallidoses)*) 2 F. vesca UC-10/UC-11

Фито плазмы

1 Фитоплазма позеленения лепестков земляники (strawberry green petal phytoplasma) 1,4 Vinca rosea

2 Фитоплазма желтухи астр (Aster yellow phytoplasma)*) 4

3 Фитоплазма желтухи (Yellows phytoplasma)*) 4

4 Фитоплазма летального увядания (Lethal decline phytoplasma)*) 4

5 Риккетсия желтухи (Yellows ricket-sia)*) 4

Примечание: *) Патогены, отсутствующие в регионе ЕОЗР и подлежащие тестированию только в материале из других регионов; **) Тест—методы: 1 - Травянистые растения -индикаторы;

2 - Индикаторные клоны Fragaria vesca;

3 - Иммуноферментный анализ;

4 - Электронная микроскопия

Таблица 2

Вирусы и фитоплазмы малины, регламентируемые сертификационной схемой Европейской организации защиты растений (Certification scheme №10 Pathogen -tested materialofRubus//OEPP/EPPO.- 1994).

№ п/п Патогены Тест-методы**) Растения -индикаторы

Переносимые соком вирусы

1 Неповирус мозаики резухи (AMV) Chenopodium quinoa

2 Неповирус кольцевой пятнистости малины (RRV) ^ LI _ Chenopodium quinoa

3 Неповирус латентной кольцевой пятнистости земляники (SLRV) _______1,3 Chenopodium quinoa

4 Неповирус чёрной кольчатости томатов (TBRV) 1,3 Chenopodium quinoa

5 Неповирус скручивания листьев черешни (Cherry leaf roll nepovirus = CLRV) 1.3 Chenopodium quinoa

6 Иларвирус мозаики яблони (Apple mosaic ilarvirus = ApMV) 1,3 Chenopodium quinoa

7 Вирус кустистой карликовости малины (Raspberry bushy dwarf virus = RBDV| 1,3 Chenopodium quinoa

8 Кукумовирус огуречной мозаики (Cucumber mosaic cucumovirus -CMV) 1,3 Chenopodium quinoa Nicotiana chlevelandii

Соконепереносимые вирусы

1 Вирус некроза чёрной малины (Black raspberry necrosis virus = BRNV) 2 Rubus occidentalis

2 Вирус крапчатости листьев малины (Raspberry leaf mottle virus = RLMV) 2 Rubus idaeus сорт Mailing Landmark, Rubus occidentalis

3 Вирус пятнистости листьев малины (Raspberr^leaf spot virus = 2 Rubus idaeus сорт Hor-folk Quant, Rubus occidentalis

4 Вирус жёлтой сетчатости Rubus (Rubus yellow net virus = RYNV) 2 R. idaeus сорт Mailing Promise, R. occidentalis R. macraei

5 Вирус жёлтой пятнистости малины (Rubus yellow spot virus = RYSV) 2 R. occidentalis R. macraei

6 Рабдовирус хлороза жилок малины (Raspberry vein chlorosis rhab-aovirus = RVCV) 2 R. idaeus сорт Mailing Landmark, Horfolk Quant,

Фитоплазмы

1 Фитоплазма карликовости малины (израстаниеХкиЬш stunt phyto-plasma) 2 R. idaeus сорт Mailing Landmark, R. occidentalis

Примечание: **) Тест-методы: 1-Травянистые растения-индикаторы;

2 -Индикаторные клоны рода ЯиЬш;

3 - Иммуноферментный анализ.

Таблица 3

Вирусы и вирусоподобные болезни смородины, регламентируемые сертификационной схемой Европейской организации защиты растений (Certification scheme № 09 Pathogen -tested material of Ribes //OEPP/EPPO.-1994).

№ п/п Патогены Тест-методы**) Растения -индикаторы

Переносимые соком вирусы

1 Неповирус мозаики резухи (AMV) 1,3 Chenopodium quinoa

2 Неповирус кольцевой пятнистости малины (RRV) 1,3 Chenopodium quinoa

3 Неповирус латентной кольцевой пятнистости земляники (SLRV) 1,3 Chenopodium quinoa

4 Неповирус чёрной кольчатости томатов (TBRV) 1,3 Chenopodium quinoa

5 Кукумовирус огуречной мозаики (Cucumber mosaic cucumovirus = CMV) 1,3 Chenopodium quinoa Nicotiana chlevelandii

Соконепереносимые вирусы

1 Вирус окаймления жилок крыжовника (Gooseberry vein -banding virus = GVBV) 2 Ribes rubrum сорт Jonkher van Tets или В1385/8

2 Реверсия смородины (Currant reversion agent) 2 Ribes nigrum сорт Baldwin

Примечание: **) Тест-методы: 1-Травянистые растения-индикаторы;

2 -Индикаторные клоны рода Ribes;

3 - Иммуноферментный анализ.

1.2. Основные принципы и методы очистки вирусов и вирусных белков

Детальное изучение видового состава, распространения, жизненного цикла и механизмов взаимодействия вирусов и растений является единственной основой для последующей разработки мер профилактики и борьбы с вирусными заболеваниями. Первым и совершенно необходимым этапом изучения вирусов растений является их идентификация (А. В. Крылов, 1992).

Начиная с классических работ Ф. Боудена (1952), много усилий было направлено на разработку методов выделения и очистки вирусов растений. В на-

стоящее время известно, что фитопатогенные вирусы весьма существенно различаются по своей концентрации и локализации в растениях-хозяевах, а также по устойчивости к различным физическим и химическим воздействиям. Это обуславливает разнообразие подходов к проблеме очистки вирусов. Даже разные штаммы одного и того же вируса могут требовать для успешного выделения применения различных методов (Р. Мэтьюз, 1973).

Процесс выделения и очистки вирусных частиц в настоящее время включает огромный арсенал физических и химических методов, позволяющих получить довольно чистые препараты.

Вследствие своих микроскопических размеров вирусы встречаются в растениях исключительно в мизерных весовых количествах. Поэтому концентрирование вирусов, т. е. получение их в приемлемых количествах из большого объёма исходного материала - один из важнейших этапов в процессе очистки (Пер - Оке Альбертсон, 1974). При этом большое значение имеет концентрация патогенов в растениях, условия выращивания последних, а также время, когда растения можно использовать для выделения вируса. Многие вирусы за несколько дней или недель достигают своей максимальной концентрации, которая затем может резко снижается. Некоторые вирусы распределяются в растениях столь неравномерно, что имеет смысл использовать для выделения лишь те его части, которые содержат вирус в высокой концентрации (Р. Мэтьюз, 1973).

Технология очистки фитопатогенных вирусов обычно включает в себя 4 следующих основных этапа:

1. Получение экстракта сока (гомогенизация заражённых вирусом тканей растений в экстрагирующих буферах);

2. Осветление экстракта сока (удаление из сока хлоропластов и других компонентов клеток растений);

3. Осаждение (преципитирование) вируса;

4. Концентрирование вирусной суспензии и её дополнительная очистка от белков растения-хозяина.

Первая стадия очистки -гомогенизация сводится к разрушению клеток и экстракции сока. Её проводят в различных гомогенизаторах и форфоровых ступках. Сок растений -это довольно сложная смесь, в состав которой входят хлоропласты, митохондрии, лейкопласты, фрагменты клеточных стенок, растительные белки, рибосомы, растворимые низкомолекулярные вещества -пектины, сахара, аминокислоты; ферменты способные, инактивировать некоторые вирусы in vitro и т.п. Удаление этих примесей и получение препарата, содержащего только вирусные частицы или вирусные белки -основная цель очистки (Р.В. Гнутова, 1993).

Глубокое замораживание растений ткани перед гомогенизацией обычно приводит к снижению выхода большинства нестабильных фитопатогенных вирусов (А.Гиббс, Б.Харрисон, 1978), но облегчает очистку флоэмограниченных клосте-ро- и лютеровирусов (R.Martin, R.Converse, 1985; R.Lee et al.,1987; K.Derrick et al., 1988 и др.).

Для защиты вирусов от инактивации гомогенизацию растительного материала проводят, как правило, в присутствии буферных растворов с определённым значением рН. При этом правильный выбор экстрагирующего буфера часто имеет решающее значение для успеха очистки. Экстрагирующие буферы, наиболее часто используемые для очистки фитовирусов, представлены нами в Приложении 1.

Выбор буфера для очистки определяется стабильностью вируса и свойствами сока используемых растений. Для гомогенизации обычно используют достаточно концентрированные буферы (0,1-0,5М), а последующую очистку проводят с применением разбавленных буферных растворов (0,001 -0,005М). Известно, что сок большинства растений имеет кислые значения рН, а частицы многих вирусов осаждают в кислой среде, поэтому для очистки используют нейтральные или щелочные фосфатные, боратные и трис-буферы (Приложение 1). Капилло-, клостеро-, карло-, поти- и потексвирусы имеют длинные нитевидные вирионы, склонные к агрегации и адсорбции на клеточном дебрисе и мембранах хозяина, поэтому их лучше экстрагировать щелочными буферами (рН

8,0-9,0) с умеренной или низкой ионной силой (например, 0,01-0ДМ) (Р.В.Гнутова, 1993; M.Akius, B.Westrom, 1983; R.Lee et al., 1987 и др.).

Несмотря на выявленные закономерности, на практике для каждого конкретного вируса наиболее оптимальные буферы приходиться подбирать экспериментальным путём. Так, при очистке карла вируса мозаики хмеля боратный буфер превосходил по эффективности трис и фосфатные буферы (A.Adams, D.Barbara, 1980), а стабилизация частиц латентного потексвируса винной ягоды и клостеровируса кольцевой пятнистости цитрусовых достигалась в 0,05М трис-буфере, но не в боратном или фосфатном буферах той же молярности (A. Jones, 1977; S.Garnsey, L.Timmer, 1980).

Экстракцию многих вирусов со сферическими и изометрическими частицами (кукумо-, лютео-, каулимо-, неповирусы и др.) также проводят в нейтральных или щелочных буферных растворах (Приложение 1). Так, стабильность и инфекционность частиц вируса крапчатости земляники лучше поддерживал 0,025М боратный буфер, рН 8,3, по сравнению с карбонатно-бикарбонатным, веронал-фосфатным или цитратным буферами (J.Polak et. al., 1991).

В то же время сферические бромовирусы в нейтральной среде набухают и их РНК становится доступной для нуклеаз, поэтому их очистку проводят в кислых ацетатных буферах с рН 4,5-5,0 (Р.В. Гнутова, 1993; R. Hull, 1972; J. Dale, 1988). Кроме того, кислые буферные растворы осаждают многие клеточные белки, что облегчает очистку вирусов. В щелочной среде повреждаются также частицы вирусов, поэтому лишь экстракцию этих вирусов производят в щелочных буферах (для лучшего выделения из клеток растений), а все остальные этапы очистки - в кислых растворах (Р.В.Гнутова, 1993; ЛВ.Скляр, R.W.Fulton, 1971; S.Spiegel et. al., 1993 и др.). Очистку вируса некроза чёрной малины также лучше обеспечивал слабокислый ацетатный буфер (рН6,0) по сравнению с щелочными фосфатным и трис-буферами (A.Murant et. al.,1976).

Агрегацию частиц вирусов пытаются также уменьшить, добавляя к буферам различные вещества - восстановители. Ими могут быть этилендиаминотет-роацетат (ЭДТА), тиогликолиевая и аскорбиновая кислоты, мочевина, твин,

цистеин, 2-меркаптоэтанол и др. (Приложение 1). Инфекционность и стабильность вирионов существенно ингибируют полифенолы, таннины и родственные им соединения, в изобилии содержащиеся в соке многих растений, в особенности семейства розоцветных. Это обуславливает необходимость введения в состав экстрагирующих буферов диэтилдитиокарбамата натрия (ДИЕКА), инакти-вирующего фермент полифенолоксидазу, или кофеина, освобождающего ви-рионы от связывания таннинами. Для защиты от необратимого ингибирования вирионов хинонами пригодны ЭДТА, тиогликолят натрия, меркаптоэтанол, а для связывания полифенольных соединений-поливинилпирролидон (ПВП), по-лиэтиленгликоль (ПЭГ) и ряд других веществ (А.Гиббс, Б.Харрисон, 1978; Р.В.Гнутов, 1993 и др.). Установлено важное значение двухвалентных катионов (в особенности ионов магния) для поддержания стабильности клостеро- и капи-ловирусов (RXister, A.Hadidi, 1971; M.Akius, B.Westrom, 1983).

Необходимость и эффективность применения тех или иных стабилизирующих веществ определяют в предварительных экспериментах. Так, интакт-ные частицы клостеровируса тристецы цитрусовых удалось получить только при использовании ПВП и тритона Х-100 в составе экстрагирующего трис -буфера, тогда как мочевина разрушала вирионы (R. Lee et. al., 1987). В то же время для стабилизации частиц клостеровируса кольцевой пятнистости требовалось присутствие аскорбиновой кислоты цистеина и меркаптоэтанола (К. Derrick et. al., 1988). ДИЕКА и тиогликолиевая кислота значительно лучше поддерживали инфекционность латентного потексвируса винной ягоды по сравнению с ЭДТА (А. Jones, 1977). Для очистки вируса некроза чёрной малины необходимо было использовать диэтилдитиокарбамат натрия, а тиогликолиевая кислота не имела какого-либо влияния (A. Murant et. al., 1976).

Для дальнейшей очистки вируса после гомогенизации тканей растений необходимо осуществить осветление экстракта сока, то есть удалить компоненты растительных клеток с помощью каких-либо приёмов. Для этих целей для очистки многих вирусов с относительно стабильными частицами используют низкие концентрации органических растворителей, таких как диэтиловый эфи-

pa, четырёххлористый углерод, бутанол, октанол, хлороформ, смеси хлороформ с бутанолом, эфиром или изопропиловым спиртом (Н.Б.Пермбская, С.И.Бутенко, 1974; А.Гиббс, Б.Харрисон, 1978; Р.В.Гнугова, 1993 и др.).

При тщательном перемешивании смеси сока с буфером и одним из этих веществ получается эмульсия, которая при низкоскоростном центрифугировании разделяется на три слоя: водный слой, содержащий гидрофильные вещества, в том числе и вирусные частицы; слой органических растворителей с лио-фильными компонентами (хлороформ, воск, жиры и др.) и слой коагулирующих белков. Последние два слоя удаляют, а водную фазу используют при дальнейшей очистке вируса. Осветление сока производят центрифугированием от 2000g до 12000g в течение 10-20 минут (А. Гиббс, Б. Харрисон, 1978; Р.В. Гнутова, 1993 и др.).

Вирусы по-разному реагируют на тот или иной органический растворитель. Так, инфекционность изометрического вируса некроза чёрной малины терялось после обработки гомогенизата бутанолом, но стабилизировалась при использовании для его осветления равных объёмов хлороформа или эфира (A.Murant et.al., 1976). Для очистки вируса крапчатости земляники наиболее хорошие результаты были получена при использовании октанола совместно с сахарозой, тогда как хлороформ, четырёххлористый углерод или их смеси снижали стабильность вирусов (J.Polak et.al., 1991). Это обуславливает необходимость проведения предварительных экспериментов по подбору оптимальных осветляющих агентов.

Для отдельных вирусов с термостойкими частицами осветление экстрактов можно проводить и нагреванием (G. Wolf, R. Casper, 1971; Н.И. Немилосте-ва, Л.И. Моженко, 1993). Это проводится с целью коагуляции большей части примесей компонентов растительной клетки, с параллельным сохранением на-тивности вируса. Кратковременное нагревание экстрактов из растений, зараженных некоторыми штаммами вируса огуречной мозаики (CMV), при 40-60°С позволяет избавиться от балластных веществ, в частности нуклеопротеидов и

белков растения. Для PYV (У-вирус картофеля) достаточно прогревания экстракта при 42 "С в течение двух минут (Р.В. Гнутова, 1993).

Вирионы илар- и бромовирусов устойчивы к низкому pH, поэтому при их очистке к осветлённому центрифугированием гомогенизату добавляют ледяную уксусную или хлорноватую кислоты до рН4,5-5,0, что вызывает осаждение компонентов растительных клеток (R.Hull, 1972; S.Mac Donald et el., 1991; S. Spiegel et al., 1993 и др.).

Однако для очистки целого ряда вирусов с лабильными частицами возникает необходимость применения значительно более дорогостоющих или трудоёмких приёмов. Как правило, органические растворители повреждают нитевидные вирионы клостеро-, капило-, карлавирусов и ряда потивирусов, а также сферические вирионы флоэмограниченных лютео- и каулимовирусов. Поэтому вместо них часто используют тритон Х-100 (эфир октил-фенол-полиэтиленгликоля) (В.К.Новиков и др., 1982; Р.В.Гнутова, 1993; E.Proll, Richter, 1979; R.Lee et al, 1987; K.Derrick et al., 1988; D.Stenger et al., 1988; S.Hemida et al., 1989 и др,.). Так, интактные вирионы клостеровируса кольцевой пятнистости цитрусовых были получены только после обработки гомогенизата тритоном Х-100 и трихлоротрифлуороэтаном (Фрион-113), тогда как хлороформ повреждал вирионы, а бутанол вызывал их разрушение (К. Derrick et al., 1988).

Осветление сока, содержащего карловирусы, рекомендовалось также проводить хромотографией на колонках с фосфатом кальция (S.Tavartis, 1983). Для очистки капиловирусов хорошие результаты давала 2-3-кратная обработка гомогенизата суспензией бентонита в сочетании с низкоскоростным центрифугированием (M. Bar-Joseph et al., 1979; M. Akius, В. Westrom, 1983).

Следующей задачей очистки является концентрирование вирусной суспензии с одновременным отделением вирусных частиц от оставшихся клеточных компонентов. Это можно осуществлять химическим (использование веществ, вызывающих осаждение вируса), физическим (центрифугирование) и физико-химическим (фильтрация через нейтральные или ионные адсорбенты) методами, либо же их комбинированием.

В качестве осаждающих агентов используют сернокислый аммоний, ацетон и этиловый спирт,но они применимы только для наиболее стабильных вирусов (А. Гиббс, Б. Харрисон, 1978).

Наиболее часто для осаждения вирусов используют ПЭГ. В зависимости от выделяемого вируса и определяется его процентная концентрация. Так, для палочковидных вирусов ПЭГ применяется в концентраций 4 и 5% в присутствии 0,1-1,8М МаС1; для сферических - 8 и 10%; для более эффективного осаждения необходимо поддерживать достаточно высокую концентрацию раствора. Обычно ПЭГ и ЫаС1 добавляют к раствору, содержащему вирус, растворяют их в течение часа при постоянном помешивании и затем вирус осаждают при 1000(^ в течение 10 минут (А. Гиббс, Б. Харрисон, 1978; Р.В. Гнутова, 1993; О. Коогёап, 1973 и др.).

Физические методы более «мягкие» и лучше подходят для очистки лабильных вирусов без заметной потери их инфекционности. Во время ультрацентрифугирования вирусные частицы и крупные компоненты клеток оседают. Осадок ресуспендируют соответствующим буфером. Большая часть невирусного белка остаётся в агрегированном состоянии и удаляется низкоскоростным центрифугированием. Несколько циклов дифференциального центрифугирования обычно позволяют получить вирусный препарат удовлетворительной частоты. Время центрифугирования выбирают в зависимости от особенностей изучаемого вируса. Продолжительность низкоскоростного центрифугирования колеблется от 3 до 20 минут при 2000-10000^ а высокоскоростного от 1 до 6 часов при 75000-300000^ Этот этап выделения очень важен, так как преследует сразу две цели; во-первых, происходит концентрирование вируса и, во-вторых, препарат освобождается от низкомолекулярных примесей.

Для отделения вирусных частиц от других высокомолекулярных компонентов растительной клетки применяют зональное (скоростное) центрифугирование. Центрифугирование в градиенте плотности позволяет разделять компоненты исследуемой смеси по скорости седиментации и их плотности, а также препаративно выделять нуклеиновые фракции. Этот метод успешно применяет-

ся для выделения самых лабильных вирусов. Градиент создают при помощи сахарозы, хлористого и сернокислого цезия, обычно применяют 10-40%-е градиенты. Дополнительная очистка вируса ломимо зонального центрифугирования может быть достигнута равновесным (изопикническим) центрифугированием, которое проводят в растворах хлористого или сернокислого цезия(А. Гиббс, Б. Харрисон, 1978; Л.А. Остерман, 1981; D. Noordan, 1973 и др.).

Фитовирусы различаются по своей реакции на центрифугирование. Так, частицы клостеровируса кольцевой пятнистости цитрусовых удовлетворительно выдерживают высокоскоростное центрифугирование, но разрушаются в градиентах сахарозы (К. Derrick et al., 1988). Частицы неповируса латентной кольцевой пятнистости земляники имеют тенденцию к агрегатированию в ходе ультрацентрифугирования, что вызывает необходимость дополнительного использования бычьего сывороточного альбумина (A.Murant, 1974). В то же время физический и физико-химический методы являются единственно пригодными для очистки рабдовирусов, чрезвычайно лабильные частицы которых не переносят воздействия химических веществ, используемых для осветления сока и осаждения вирионов. Так, для очистки рабдовирусов использовали серию из 4-х циклов дифференциального центрифугирования в кислой среде (М.В. Сапоцкий и др., 1992), или центрифугирование в ступенчатом градиенте сахарозы с последующий вакуум-фильтрацией через подушку целита (A.Jackson, S. Christien, 1977; В. Hunter et al., 1990).

Следует отметить, что большинство рассмотренных выше методик было разработано для очистки сокопереносимых вирусов из тканей вторичных растений-накопителей, относящихся преимущественно к семействам маревых, паслёновых и тыквенных. Эти растения способны поддерживать высокий уровень размножения многих фитопатогенных вирусов, а экстракты их сока содержат относительно низкие концентрации полифенольных соединений и пектиновых веществ, существенно затрудняющих процесс очистки. Значительно более сложную проблему представляет очистка непереносимых соком вирусов из тканей их естественных растений-хозяев, в особенности относящихся к семействам

розоцветных: и цитрусовых (R. Lee et al., 1987; К. Derrick et al., 1988; В. Hunter et al., 1990 и др.).

1.3. Особенности очистки непереносимых соком вирусов

Как уже отмечалось выше, весьма существенные трудности возникают при очистке флоэмограниченных клостеро- и лютеовирусов, а также рабдо-, карло-, каулимовирусов.

Гомогенизацию заражённых этими вирусами тканей обычно проводят в щелочных боратном и трис-буферах, реже используется фосфатный буфер. Высокая лабильность частиц этих вирусов обуславливает необходимость введения в состав экстрагирующих буферов различных стабилизирующих веществ, таких как меркаптоэтанол, тиогликолиевая кислота, ПВП, ЭДТА и др. (Приложение 1). Ткани растений перед гомогенизацией чаще всего подвергают низкотемпературному промораживанию или обработке жидким азотом.

Мировой практикой накоплен определённый опыт очистки вышеназванных вирусов, в том числе из растений земляники и цитрусовых культур.

Очистку клостеровирусов тристеци цитрусовых и опробковения коры винограда осуществляли соответственно из тканей Citrus excelsa и винограда, замороженных в сухом льде. Ткани гомогенизировали в 0,1М Трис-буфере, рН8,4, содержащем невысокую концентрацию (0,1%) тритона Х-100. Гомогенизат осветляли низкоскоростным центрифугированием и подвергали 2-кратной обработке ПЭГ. Выпавшие в осадок вирусы концентрировали центрифугированием и очищали путём ультроцентрифугирования в ступенчатом и равновесном градиентах сульфата цезия (R. Lee et al., 1987). Методика очистки клостеровируса кольцевой пятнистости цитрусовых (К. Derrick et al., 1988) описана в Главе 2.

Лютеовирус слабого пожелтения краёв листьев земляники экстрагировали из растений различных видов Fragariae с использованием фосфатного буфера, содержащего ДИЕКА и тиогликолиевую кислоту, и затем очищали дифференциальным и градиентным центрифугированием (R.Martin, R.Converse, 1985).

Для очистки anthriscus yellows luteovirus ткани кориандра гомогенизировали в фосфатном буфере, содержащем ЭДТА и тиогликолиевую кислоту. К го-могенизату добавляли целлюлозу для лучшего разрушения клеточных стенок. Полученный экстракт осветляли тритоном Х-100, после чего частицы вируса преципетировали обработкой ПЭГ. Затем препараты вируса подвергали 2-3-м циклам дифференциального центрифугирования. Окончательную очистку проводили центрифугированием через подушку 20%-й сахарозы, а затем - в градиентах сахарозы (S.Hemida et al., 1989). По сходной методике очищали также лю-теовирус желтой карликовости ячменя (A.Matsubara et al., 1985). Обязательным условием успешной очистки лютеовирусов является предварительное замораживание тканей растений в жидком азоте.

В экспериментах T.Morris et al., (1980) методики очистки, разработанные для ряда каулимовирусов (T.Pirone et al., 1961; A.Brunt, 1971; R.Lawson, E.Civerolo, 1978), оказались непригодны для очистки каулимовируса окаймления жилок земляники (SVBV) из листьев F. vesca. После гомогенизации листьев в натрий-фосфатном буфере с меркаптоэтанолом, осветления экстракта смесью хлороформа с бутанолом и обработки ПЭГ, был получен преципитат с чрезвычайно высокой концентрацией пектиновых веществ, что делало невозможной последующую очистку SVBV путём дифференциального центрифугирования. Это вызвало необходимость применения центрифугирований в комбинированном ступенчатом градиенте, состоящем из сахарозы и хлористого цезия, затем -в линейном градиенте сахарозы и хромотографии на колонках с целлюлозой.

В других экспериментах по очистке SVBV (D.Stenger et al., 1988) были использованы иные экстрагирующий буфер и осветляющий агент (трис-буфер, содержащий бензоат натрия, ЭДТА, ПВП, меркаптоэтанол и мочевину, а для осветления сока -тритон Х-100), концентрирование вируса с помощью ПЭГ заменили центрифугированием через подушку сахарозы, но образовавшийся вязкий осадок вновь вызвал необходимость использования хроматографии на целлюлозе.

Методика очистки из растений F. vesca карлавируса ложного слабого пожелтения краев листьев земляники (N.Yoshikawa, T.Jnouye, 1986) описана в Главе 2 данной диссертации.

Следует отметить, что кроме вирусов тристецы цитрусовых и жёлтой карликовости ячменя, все остальные вышеописанные методики очистки непереносимых соком вирусов не привели к получению коммерческих партий антисывороток, пригодных для массового тестирования растений. Это было обусловлено недостаточной степенью очистки вирионов от белков растений-хозяев и их значительной деградацией. Однако эти факторы не являются лимитирующими для метода электрофореза, который предполагает предварительную энкапсидацию вирионов и позволяет фракционировать белки вирусов от белков их растений -хозяев.(Л.А.Остерман, 1981).

1.4. Выделение и очистка вирусспецифических нуклеиновых кислот.

В настоящее время всё более широкое распространение находят методы диагностики, основанные на выявлении нуклеиновых кислот вирусов. К таким методам относятся нуклеиновые зонды, полимеразная цепная реакция и электрофорез частично очищенных препаратов нуклеиновых кислот. Первые два метода характеризуются высокой чувствительностью и специфичностью, но ввиду высокой стоимости пока ещё не используются для массового тестирования растений . О применении же для этих целей третьего метода имеются многочисленные сообщения в литературе (T.J.Morris, J.A.Dodds, 1979; Е. Breyel et al., 1988; R.Valverde et al., 1990; M.A.Hansen, R.L.Wick, 1993 и др.).

Как известно, геном фитопатогенных вирусов может представлять собой ДНК (каулимовирусы), двуспиральную РНК (криптические вирусы, фитореови-русы) и односпиральную РНК (около 90% известных вирусов растений)^. Valverde et al., 1990). В отличии от односпиральной РНК вироидов, характеризующейся циклической, замкнутой структурой, аналогичная РНК большинства вирусов имеет линейную форму (J. Schumacher et al., 1986).

В процессе своего размножения вирусы с геномной односпиральной РНК образуют репликативную форму, представляющую собой комплиментарную двуспиральную матричную РНК (дс-РНК) с относительно большой молекулярной массой порядка 1 х 106 Д и выше. Предполагается также, что именно эта форма РНК составляет основную часть содержимого вызываемых вирусами внутриклеточных образований (везикул, везикулярных макротелец) и играет большую роль в развитии симптомов болезней у растений-хозяев. Дс-РНК очень устойчива к деградации энзимами, что делает её исключительно удобным объектом для диагностики вирусов (R.Valverde et al., 1990).

Использование анализов двуспиральной вирусной РНК в качестве метода диагностики вирусных болезней основывается на предпосылке, что растения, незаражённые РНК-содержащими вирусами или вирусоподобными агентами, не могут содержать легко обнаружимые количества однородных сегментов дс-РНК с большим молекулярным весом (>0,1-106Д). Выявляемая в ходе анализов дву-спиральная РНК будет, таким образом представлять собой либо репликативную форму вирусов с односпиральной РНК, либо геном дс-РНК - содержащих вирусов и вироидов, либо плазмидоподобные молекулы класса агентов, которые ещё не классифицированы. Существенным преимуществом данного метода по сравнению с иммуноферментным анализом и гибридизационными тестами является возможность выявления всех вирусов, имеющихся в растении (в том числе и неизвестные науке), а не только тех, к которым получены антисыворотки или нуклеотидные зонды, т.е. данный метод является универсальным.

За рубежом уже показана возможность использования данного метода для диагностики вирусов табачной мозаики (W.D.Dawson, J.A.Dodds, 1982), мозаики костра, южной мозаики бобов и кустистой карликовости томата (ТJ.Morris, J.A.Dodds, 1979), жёлтой карликовости ячменя (F.S.Gildov et al., 1986), карликовости и желтухи сои (O.Smith et al., 1991), кустистой верхушки банана (J.L.Dale et al., 1986), тристецы цитрусовых (J.L.DePaulo, C.A.Powell., 1995), разеточности арахиса (E.Breyel,1988) и многих других. Благодаря этому методу открыты ви-

русы, вызывающие болезни авокадо и салата, природа которых ранее была неизвестной (В.Ра1к а а1., 1979; Я.АИеп, Ша1е, 1981).

При изучении вирусных болезней «годных культур анализ дс-РНК успешно был применён для таких патогенов, как вирусы кустистой карликовости малины, некроза чёрной малины, огуречной мозаики (А. Т. 1опе8 et а1., 1986), пятнистости листьев малины (А.Кигрра, Я.МаЛт, 1986), поллидоза земляники (М.УзЫкшуа, К.Сопуегее, 1990) и других. Дс-РНК была обнаружена также в растениях земляники с симптомами июньской желтухи (С.А.^^кшя et а1.,1990).

В Германии метод анализа дс-РНК уже сейчас считается основным при диагностике вредоносного вироида веретеновидности клубней картофеля (М.А. РГаппешйе! (Л а1., 1980; ^сЬишасИег е1 а1.,1986; К.Р^^И, А.ВоисЬег, 1987; КЬоигу е! а!., 1988; М.$с11го<1ег, H.L.Weideшann, 1989). Показана возможность использования его для выявления вироидов карликовости хризантем (К.К.Ноге^ 8.0.Ко\уато1о, 1980), экзокортиса цитрусовых (М.Огаякп, А.С таг, 1990), звёздчатого растрескивания плодов яблони (A.Hadidi е! а1., 1990), латентного вироида баклажана (С. Ра§оа§а, 1994), латентного вироида хмеля (Е.ЗоЫгвкае! аЦ 1995) и др.

Применение рассматриваемого метода предусматривает проведение следующих этапов:

1) выделение нуклеиновых кислот из тканей растений;

2) очистку двуспиральной РНК от прочих нуклеиновых кислот вирусов и растений хозяев;

3) анализ двуспиральной РЖ.

Выделение дс-РНК из растений начинается с разрушения тканей и выделения всех клеточных и вирусных нуклеиновых кислот с соблюдением условий, предотвращающих их разрушение. Для этих целей первоначально в большинстве методик применяют замораживание тканей растений в жидком азоте (Т.Шогш, J.A.Dodds, 1979; Я.К.Ноге! et а1., 1980). Уменьшая активность ферментов группы рибонуклеаз, применяют такие процедуры, как повышение рН буфера (до рН 8,0) и увеличение концентрации солей от ОД до 1,0 М. Действие

других ферментов снижают, используя такие вещества, как бентонит или ди-этилпирокарбонат (БЕР) (1.8сЬишасЬег е! аЬ, 1986) и хелаты металлов. В состав экстрагирующего буфера включают детергенты, способствующие отделению нуклеиновых кислот от белков. Чаще всего для этих целей используют додецил-сульфат натрия (ББЗ) или р-аминосалициловую кислоту. Чтобы предотвратить нерастворимость веществ первоначально экстракцию лучше проводить при комнатной температуре. Для предотвращения окисления и побурения нуклеиновых кислот во всех методиках предусматривается использование вещества -антиоксиданта - чаще всего сульфита натрия или поливинилпирролидона (H.Koganezawaetal., 1983).

Особое значение эти вещества приобретают при выделении нуклеиновых кислот из древесных растений.

Отличительной чертой методик по очистке нуклеиновых кислот является применение водонасыщенного фенола. Он позволяет обеспечить полную денатурацию белковых компонентов тканей растений и белка оболочки вирусов, что приводит к их полному осаждению. Для лучшего осаждения протеиновых компонентов добавляют смесь хлороформа и пентанола (последний может быть заменён на изоамиловый спирт) (А.Ко11аг е1 а1., 1990; О.Р.БтШ! е1 а!., 1991).

Молодые, энергично растущие и недавно заражённые ткани с симптомами обычно обеспечивают лучшее качество и более высокий выход нуклеиновых кислот вируса (ТХМогш е! а1.,1984). Образцы коры, по сравнению с тканями листьев, дают лучшие результаты по нуклеиновым кислотам патогенов с ограниченным распространением по тканям растения, таких как вирус тристецы цитрусовых (СТУ) (Р.Могепо е1 а1.,1990), а из группы фитоплазм - пролиферация яблони (А.КоИаг е! а1., 1990).

Процесс выделения суммарных нуклеиновых кислот завершается центрифугированием, в результате чего клеточные остатки оседают, образуя осадок, а нуклеопротеиды остаются во взвешенном состоянии в супернатанте. Экстракты нуклеиновых кислот затем обычно дополнительно очищают ферментами про-теазами и, в завершении, преципитируют этанолом.

Полученный препарат суммарной нуклеиновой кислоты можно затем подвергнуть электрофорезу в гелях и, сравнивая с профилями нуклеиновых кислот из контрольных здоровых растений, выявлять тем самым наличие вирусной РНК.

Однако такой подход в настоящее время применяется лишь при первичном изучении болезни с невыявленной этиологией. Для диагностики известных вирусов и вироидов в дальнейшем обычно проводят выделение, концентрирование и анализ специфической двуспиральной РНК.

В настоящее время уже известно, что дс-РНК вирусов является достаточно видоспецифичной, что открывает возможность создания каталога дс-РНК всех известных вирусов и вироидов с целью использования его для диагностики этих патогенов (M.Hansen, R.Wick, 1993).

Методы очистки дс-РНК имеют довольно широкий арсенал. Для этих целей используют ультроцентрифугирование в градиентах плотности сахарозы (M.F.Clark, R.M.Lister, 1971), центрифугирование в градиенте целлюлозы (C.Kerlan, J.Dunez, 1976), хроматографическое разделение на гидроксиаппатите и цетавлоне (В.Й.Нактинис и др., 1977), инкубирование при низких отрицательных температурах порядка -70°С в растворе этанола (J.Schumacher et al., 1986) или при -20°С (R.K.Horst, S.O.Kowamoto, 1980; M.A.Pfanennstiel et al., 1980; R.P.Singh, A.Boucher, 1987), применение раствора хлорида лития различной мо-лярности. Так, например, 2М LiCl осаждает только высокомолекулярную РНК (И.Г.Атабеков, 1981), а для осаждения дс-РНК используют 4M LiCl (E.Breyel et al., 1986). Все эти методы представляют интерес лишь для лабораторных исследований. Для массовых анализов они непригодны, так как требуют относительно высоких затрат и довольно трудоемки.

В последнее время большую популярность получил метод Морриса и Доддса (T.J.Morris, J.A.Dodds, 1979). Основу метода составило различие в связывании одно- и двуспиральной РНК и ДНК на целлюлозе специальных марок в присутствии различных концентраций этанола. Адсорбция большинства нуклеиновых кислот на целлюлозе происходит при концентрации этанола выше

35%. Фракции ДНК и односпиральной РНК затем отделяют в буфере, содержащим 15-18% этанола, тогда как РНК со сложной вторичной структурой остаются связанными с адсорбентом. Выделение дс-РНК в свободное состояние осуществляют обработкой целлюлозы буфером без этанола.

Этот метод модифицирован для массовых анализов на наличие вироидов через селективное связывание дс-РНК на небольших количествах целлюлозы в присутствии 15%-ного этанола, что приводит к адсорбции лишь дс-РНК (¿всЬитасЬег е1 а1., 1986; М.8с1ж>(1ег, Н.Ше1(1етапп, 1989 и др.).

При выделении дс-РНК из некоторых тканей небольшое количество ДНК и однонитевой РНК всё-таки сохраняется в препаратах даже при тщательном соблюдении методик. Эти примеси удаляются после хроматографии на целлюлозе, обработанной ДНКазой и РНКазой. Сначала проводят устранение однонитевой РНК путём инкубации образца при +68°С в течение 3 минут и быстрого его охлаждения во льду в течение 2 минут с последующей обработкой РНКазой. Завершают доочистку препарата обработкой ДНКазой, после чего проводят преципитацию дс-РНК этанолом (О.Р.8тШ1 et а1., 1991; C.Fagoaga е1 а1., 1994).

Очистку дс-РНК вируса ямчатости древесины винограда проводили вместо хроматографических колонок путём трёхкратного центрифугирования смеси целлюлозы и экстракта РНК: вначале в присутствии 15%-ного этанола, а затем два раза без него (КХ.МопеЦе е! а1., 1989).

Выделение дс-РНК хорошо отработано на вторичных травянистых растениях-хозяевах некоторых вирусов плодовых, но данная методика вызывает затруднения при получении препаратов непосредственно из растений ягодных культур. Это связано, прежде всего, с высокой концентрацией в данных объектах фенольных соединений, пектина и ферментных комплектов, которые при экстракции быстро вступают в реакцию с нуклеиновыми кислотами, существенно затрудняя их очистку. В этом направлении продолжаются поиски вариантов для решения данной задачи. Так, вирусологи Шотладского НИИ сельского хозяйства использовали в своих исследованиях на ягодных культурах удвоенное количество целлюлозы СР-11 ^1т1та11). Затем препараты дс-РНК очищали с

помощью РНКазы и ДНКазы и в завершении проводили доочистку дс-РНК на целлюлозе Cellex №1 (Bio-Rad) (А.ТJones et al, 1986).

При очистке дс-РНК вирусов малины: кольцевой пятнистости томата, кустистой карликовости малины и пятнистости листьев малины (A.Kurppa, R.R.Martin, 1986) использовали цетавлон и целлюлозу. Первые этапы очистки производили с помощью цетавлона, а доочистку на последних этапах - целлюлозой Cellex №1.

Все цитируемые выше авторы констатируют сложность очистки вирусной дс-РНК из тканей растений плодовых и ягодных культур. Так, например, выделение дс-РНК вируса шарки сливы (PPV) довольно легко осуществляется из травянистых растений N.chlevelandii Cray, но не из листьев сливы и терносливы, ввиду наличия вязких пектиновых веществ(Е.Вгеуе1 et al.,1986).

Кроме того, ценность последней работы состоит в том, что авторы провели параллельное тестирование образцов методами ИФА и ИЭМ. Все три метода показали одинаковую чувствительность при анализе образцов через 7 и 14 дней после инокуляции. В образцах, анализируемых через 21 день после заражения, с помощью методов ИФА и ИЭМ было трудно выявить один из штаммов PPV из-за низких концентраций антигена, тогда как дс-РНК по-прежнему выявлялась в значительном количестве (E.Breyel et al., 1986).

Путём использования метода дс-РНК было проведено изучение вирусоподобной болезни - некротической ржавой крапчатости черешни (NRM). Двуспи-ральная РНК с молекулярным весом = 12x106 и 11.5х106Д была выделена из растений черешни сортов Corum и Napoleon, заражённых NRM. Дс-РНК с молекулярной массой 11.5хЮ6Д выделялась, однако, и из растений черешни этих же сортов, неимеющих симптомов NRM. Выявление латентного заражения NRM ранее было возможно только путём тестирования на индикаторах, которое требует не менее 18 месяцев. Выявление дс-РНК может оказаться эффективным методом быстрого выявления этой болезни (D.L.Moore, H.R.Cameron, 1982,1986).

Выход дс-РНК из растений рода Rubus, по мнению A.Kurppa, R.R.Martin (1986), зависит от метода очистки и размера дс-РНК. Для дс-РНК величиной менее 4x106 Д использовали двухколоночный метод Morris и Dodds (1979), но между этими этапами хроматографической очистки применяли обработку экстрактов РНКазой и ДНКазой. Вся технология очистки завершалась в течение 1.5 дней и давала более чистые препараты дс-РНК, в некоторых содержалось не менее 5-10 нг этой нуклеиновой кислоты.

Для дс-РНК с большим молекулярным весом лучшие результаты давала методика с применением СТАВ (цеТавлон). Вирусы кольцевой пятнистости томата (Tom RSV), кустистой карликовости малины (RBDV) и пятнистости листьев малины (RLSV) легко выявлялись в зараженных Rubus spp. Полевые образцы с вирусоподобными симптомами обычно содержали по два и более вирусов, которые можно было идентифицировать по профилям дс-РНК в агарозных гелях. Эта методика представляет объективный метод идентификации RLSV, который до сих пор можно выявлять только путём прививки на растения-индикаторы и в тестах с тлями-векторами. Профили дс-РНК из заражённых RBDV и Tom RSV растений малины соответствовали таковым для экстрактов из травянистых растений, заражённых этими вирусами (A.Kurppa, R.Martin, 1986).

Интересные результаты были получены группой учёных Шотландского НИИ сельского хозяйства (A.T.Jones et al., 1986). Экстрагированная из листьев дс-РНК была фракционирована на колонках с целлюлозой и проанализирована путём электрофореза в геле полиакриламида. Данная методика позволяла выявлять дс-РНК неповирусов с травянистых растениях-индикаторах, но выявление таких компонентов в растениях рода Rubus было нестабильным. Интерпретацию результатов усложняло также периодическое выявление дс-РНК с низким молекулярным весом (меньше чем 1.0x106 Д). Эти компоненты встречались в экстрактах различных видов растений, как заражённых вирусами, так и считающихся здоровыми. Несмотря на эти трудности, вирусспецифическая дс-РНК легко выявлялась в растениях малины, заражённых обычным и разрушающим устойчивость штаммами вируса кустистой карликовости малины (RBDV) и ви-

русом огуречной мозаики (CMV). Экстракты из растений чёрной смородины сорта Daniels September, зараженных агентом инфекционной пестролистности, сорта Baldwin с симптомами желтухи и бессимптомные растения сорта Baldwin содержали дс-РНК с молекулярным весом 2.9x106Д. Экстракты из растений различных сортов и гибридов черной смородины с симптомами реверсии содержали дс-РНК с молекулярным весом 1.8х106Д, но её также выявили и в экстрактах из некоторых бессимптомных гибридов. Однако ни один из этих компонентов дс-РНК не был обнаружен в растущих в поле бессимптомных растениях сортов Ben Lomond и Ben More (A.T.Jones et al., 1986).

Растущие в полевых условиях растения земляники сорт Туее, имеющие сильные симптомы июньской желтухи, содержали следы четырёх компонентов дс-РНК с молекулярным весом 3.5; 2.8; 1.4; 0.9х106Д. А вот многочисленные образцы экстрактов из растений Fragaria vesca, заражённых при помощи тлей вирусом крапчатости земляники, дс-РНК не выявили(А.Т.Jones et al., 1986).

1.5. Использование электрофореза белков для изучения и диагностики вирусов.

Для электрофореза наиболее важное значение имеют свойства белков, связанные с их ионизацией. В каждой белковой молекуле содержится множество групп, способных отдавать или принимать протоны, что приводит к образованию в первом случае отрицательно заражённых, а во втором — положительно заряжённых групп. Преобладание одного их этих процессов зависит от состава данного белка, а также от окружения, в котором находятся его молекулы, главным образом от pH среды. В кислой среде основные группы протонированы, поэтому белки оказываются заряжены положительно. В щелочных растворах основные группы не имеют заряда, а карбоксильные легко диссоциируют, вследствии чего в молекуле образуется избыток отрицательно заряженных групп. Суммарный заряд белковой молекулы зависит от pH среды, а также от числа и характера ионизируемых групп (Э.Гааль и др., 1982).

Для выделения, изучения и диагностики белков используют электрофорез в средах, обладающих свойствами молекулярного сита. При зональном электрофорезе в геле, используемом в качестве носителя, эффект молекулярного сита может служить дополнительным фактором, улучшающим разделение натив-ных белков. Кроме того, эффект молекулярного сита может быть единственным механизмом, лежащим в основе разделения белков. В этом случае путём добавления к белковому препарату анионного детергента додецилсульфата натрия обеспечивается отрицательный заряд всем белковым молекулам. Обработав анализируемую пробу ацетил триметиламмоний - бромидом, сообщают молекулам белков одинаковый положительный заряд (А.Гиббс, Б.Харрисон, 1979; Э.Гааль и др., 1982).

Электрофорез белков позволил проанализировать структуру вирусного белка таких агентов как вирусы жёлтой мозаики тюльпана (TYMV) (G.Wolf, R.Casper, 1971), шарки сливы (PPV) (C.Kerlan, J.Dunez, 1976), вирус слабого пожелтения краёв листьев земляники (R.R.Martin, R.H.Converse, 1982; N.Yshikawa, T.Jnouye, 1986), слабой мозаика ириса (IMMV), суровой мозаики ириса (ISMV), жёлтой мозаики фасоли (BYMV), латентного вируса нарцисса (NLV) (M.Alper et al., 1984), кустистой карликовости малины (A.F.Murant et al., 1986), кольцевой пятнистости цитрусовых (CRSY) (K.SJDerrick et al., 1988). Данным методом исследовались свойства, вируса вызывающего некротическую мозаику вики ложночиновой (В.Ф.Толкачёв и др., 1993). Кроме того, с помощью электрофореза была упрощена методика по анализу вирусов мозаики и закукли-вания злаков (М.В.Сапоцкий, 1993).

Анализ белковых профилей также применялся для построения нумериче-ской таксономии фитоплазм в институте микробиологии и вирусологии имени академика Д.К.Заболотского АН Украинской ССР (А.В.Карпов и др., 1980), где были исследованы 30 изолятов фитоплазм, выделенных из высших растений.

При подготовке образцов к электрофорезу для предотвращения осаждения или образования агрегатов димерных, тримерных и более крупных белковых компонентов, которые могут давать дополнительные полосы, в рабочий буфер

добавляют мочевину в концентрации 4-8 М (C.Kerlan, J.Dunez, 1976). Процесс окисления белков и образование лишних дисульфидных мостиков предотвращают внесением в буфер 1-5% меркаптоэтанола (M.Alper et al., 1984; K.S.Derrick et al., 1988; М.В.Сапоцкий, 1993).

Для наблюдения за ходом электрофореза в исходный препарат вносят краситель, мигрирующий в том же направлении, что и белки. Наибольшее распространение получил бромфеноловый синий (Л. А.Остерман, 1981).

Электрофорез белков проводят, в основном, в полиакриламидных гелях с концентраций от 5 до 20% по двум основным методикам (U.K.Laemmli, 1970 и В J.Davis, 1964). Большой популярностью пользуется гель, синтезированный как градиент плотности полиакриламида от 5 до 15% (М. Alper et al., 1984). Данный способ позволяет получить более полную картину структуры белков вирусов и одновременно экономит время и расход реактивов, так как при обычном методе пришлось бы синтезировать три геля (5; 10; 15%), а также образец (для обычного метода его пошло бы в три раза больше).

Продолжительность электрофореза белков вирусов составляет от 15 минут до 16 часов в зависимости от оборудования и условий проведения.

После проведения электрофореза гели окрашивают в растворе уксусной кислоты и метилового спирта; в качестве красителя могут быть использованы: амидо-черный (G. Wolf, R. Casper, 1971), куммаси ярко-голубой (С. Kerlan, J. Dunez, 1976; М. Alper et al., 1984) или нитрат серебра (К. S. Derrick et al., 1988). Продолжительность окрашивания зависит от используемого красителя и может длиться 2 часа. Завершается работа с гелем его документацией с помощью целлофана или фотографирования.

В настоящее время, применительно к вирусам, электрофорез белков преимущественно используется для изучения капсид вирионов и контроля качества очистки вирусных препаратов. Его применение для диагностики сокопереноси-мых вирусов потеряло своё значение ввиду разработки более технологичного метода иммуноферментного анализа. Однако на ягодных культурах метод элек-

трофореза может стать эффективным приёмом изучения и диагностики непереносимых соком вирусных и вирусоподобных болезней.

/. 6.Диагностика и анализ вирусов методом электрофореза

нуклеиновых кислот

Разделение нуклеиновых кислот электрофорезом отличается от разделения белкового некоторыми характерными особенностями, вытекающими из различия природы этих биополимеров. Главное отличие заключается в неизменном отрицательном заряде нуклеиновых кислот, что обусловлено диссоциацией многочисленных остатков фосфорной кислоты. Величина этого заряда мало зависит от рН окружающей среды, а отношение заряда к массе практически одинаково для всех нуклеиновых кислот, поэтому в большинстве случаев фракционирование их при электрофорезе идёт за счёт различия размеров молекул (JI. А. Остерман, 1981).

Для электрофоретического разделения нуклеиновых кислот с успехом применяются крахмальные, агарозные и полиакриламидные гели, а также смешанные гели полиакриламида и агарозы (Э.Гааль и др., 1982).

Проведение электрофореза чаще всего проводят используя трис-боратные (J.Schumacher et al., 1986) или трис-ацетатные буферные системы (R.K.Horst, S.O.Kowamoto, 1980; M.A.Pfannenstiel et al., 1980). Как правило, в буфер добавляют этилендиаминотетрауксусную кислоту (ЭДТА) до концентрации 1-2 мМ. Это необходимо не только для блокирования активности нуклеаз, но и для предотвращения осаждения нуклеиновых кислот двухвалентными металлами.

Большинство авторов для разделения нуклеиновых кислот рекомендуют использовать гели полиакриламида в концентрации от 2 до 10%. Диапазон концентраций весьма широк, но это объясняется особенностями молекулярной массы нуклеиновых кислот, которая варьирует от 1 до 6ТО6 дальтон, что и определяет, в конечном счете, концентрацию полиакриламида. Многие авторы пред-

почитают использовать гели с 5%-ной концентрацией полиакриламида, смешанные гели агарозы и полиакриламида (0,5-2,5%) и чистой агарозы (1-2%) (К. УовЫках^а, Т. 1поиуе, 1986; Р. Ь. Мопейе, 1989; С. Fagoaga & а1., 1994).

Для анализа нуклеиновых кислот используют чаще всего одномерный гель-электрофорез, но в последнее десятилетие приобретает популярность двумерный гель-электрофорез (I. БсЬитасЬег et а1., 1986). Принцип данного метода заключается в том, что электрофорез ведётся в одном направлении при естественных условиях, пока лидирующий краситель не достигает противоположной границы геля. Затем меняется полюсность электрического поля, электрофорети-ческий буфер нагревается до 60°С и электрофорез продолжается в том же геле, но в обратном направлении. Использование данной модификации позволяет провести анализ всего за 4-6 часов.

В качестве лидирующего красителя при электрофорезе нуклеиновых кислот используют бромфеноловый синий и ксилен цианол.

После окончания электрофореза проводят окрашивание. Для этого в гелях полиакриламида и агарозы чаще всего используют бромистый этидий - фенон-треновый краситель, несущий положительный заряд и обладающий способностью внедряться в двухнитевые участки нуклеиновых кислот между плоскостями соседних пар оснований. Используют также окрашивание нитратом серебра (К.01тлуа, 1Ч.ЕЬа1а, 1983; 1.8сЬишасЬег е1 а!., 1986; С.Ра£оа§а а1., 1994) и толуидиновым синим (Й.Г.Атабеков, 1981).

Таким образом, не вызывают сомнение широкие возможности и высокая перспективность метода электрофореза белков и нуклеиновых кислот для изучения и диагностики вирусных и вирусоподобных болезней плодовых и ягодных культур, и в особенности непереносимых соком патогенов, для которых пока ещё отсутствуют методы экспресс - диагностики.

Заключение диссертации по теме «Защита растений», Кандыба, Дмитрий Николаевич

85 Выводы

1. Разработана методика очистки и выявления методом электрофореза специфических белков и нуклеиновых кислот труднодиагностируемых вирусов хлороза жилок малины (КУСУ), морщинистости земляники (8СУ) и крапча-тости земляники (БМУ) непосредственно из тканей растений-хозяев.

2. Предложенная методика позволяет сократить сроки диагностики КУСУ, БМУ и БСV с 1 -2 лет до 2 дней по сравнению с методом растений индикаторов и в 43 раза снижает затраты на проведение диагностических тестов.

3. Наиболее эффективная очистка вирусспецифических белков достигается использованием боратного экстрагирующего буфера, дифференциального центрифугирования и центрифугирования через подушку сахарозы.

4. Использование для доочистки белков Я УСУ, БМУ и 8СУ экстрагирующего Трис и фосфатного буферов, хлороформа и преципитации с помощью поли-этиленгликоля ухудшает качество препаратов, а центрифугирование в градиентах плотности сульфата и хлорида цезия вызывает разрушение белковой фракции.

5. У КУСУ и БСУ выявлено наличие двух белков с молекулярными массами 52кД. и 37 кД., что типично для представителей группы рабдовирусов.

6. Впервые в России очищены и фракционированы методом электрофореза специфические белки возбудителей реверсии чёрной и красной смородины.

7. Отработанная методика очистки белков с высокой эффективностью апробирована для выявления вирусов шарки слив (РРУ), некротической кольцевой пятнистости косточковых (Р>Ш8У) и карликовости сливы (РВУ) непосредственно в листьях древесных растений -хозяев.

8. Для диагностики КУСУ, 8МУ и 8СУ методом электрофореза нуклеиновых кислот целесообразно использовать метод фенольной депротеинизации, с последующим осаждением высокомолекулярной РНК хлористым литием в концентрации 2М.

9. Методика выделения и очистки специфических белков и нуклеиновых кислот вируса окаймления жилок крыжовника, возбудителей пестролистности и желтухи смородины нуждается в дальнейшей отработке.

10. Применение метода электрофореза для выявления вирусов и вирусоподобных болезней ягодных культур позволяет получить экономический эффект в размере 1189,15руб. при анализе белков этих патогенов и 1206,84руб.— их нуклеиновых кислот по сравнению с методом растений - индикаторов.

Рекомендации по практическому использованию

Использовать в специализированных центрах по производству безвирусного посадочного материала разработанную нами методику очистки и выявления методом электрофореза специфических белков соконепереносимых вирусов, позволяющую сократить тестирование с 1 -2 лет до 2 дней по сравнению с методом растений-индикаторов.

Список литературы диссертационного исследования кандидат сельскохозяйственных наук Кандыба, Дмитрий Николаевич, 1999 год

Список литературы

1. Альбертсон П. Разделение клеточных частиц и макромолекул - Издат. "Мир",- М.: 1974,- 374с.

2. Артюкова Е.В. Некоторые свойства структурных белков потексвирусов //Взаимоотношения вируса с клетками растения - хозяина. - Владивосток, ДВНЦ АН СССР.-1985. - с. 25 - 33.

3. Атрощенко Г.П. Новый диагностический признак реверсии //Защита растений. - 1992.-Ж7,- С. 52.

4. Белошапкина О.О. Особенности и усовершенствование мер борьбы с вирусными болезнями земляники //Автореферат дисс... кандидат, биол. наук. - М., 1986,- 14с.

5. Билкей Н.Д. Разработка современных иммунологических методов диагностики вируса шарки сливы //Автореферат дисс... канд. биол. наук. -Прилуки, 1992.-22с.

6. Борзых Г.Т. Распространение и вредоносность курчавости малины в Чернозёмной зоне //Сб. науч. трудов ВНИИС им. Мичурина- 1975 - Вып. 20.-с. 88-92.

7. Боуден Ф. Вирусы и вирусные болезни растений. - М. Иностр. литература. -М.: 1952.-471с.

8. Варицев Ю.А., Варицева Г.П., Трофимец Л.Н. А-вирус картофеля: очистка, получение антисыворотки, иммуноферментный анализ //Селекционно-генетические, физиолого-биологические и технологические аспекты интенсификации производства картофеля /Тез. докл. науч. конф. - Уфа, 1989.-с. 90-91.

9. Васильева Т.Я. Изучение свойств вироида веретеновидности клубней картофеля //Автореферат дисс... канд. наук. - М. 1985. - 23с.

Ю.Власов Ю. И. Вирусные и микоплазменные болезни растений - М.: Колос, 1992.-207с.

П.Гааль Э., Медьеши Г., Верецкеи JI. Электрофорез в разделении биологических макромолекул - М.: Мир,-1982.- 448с.

12.Гиббс А., Харрисон Б. Основы вирусологии растений - М.; Мир.-1978.-429с.

13.Гладких В.И. Рябуха чёрной смородины в Сибири и разработка мер борьбы с болезнью//Автореферат дисс...канд.наук.-М., 1978. - 17с.

14.Гнутова Р.В. Серология и иммунохимия вирусов растений. - М.: Наука, 1993.-301с.

15.Карпов А. В., Скрипаль И. Г., Малиновская J1. П. Электрофорез белков, как средство таксономического анализа фитопатогенных микоплазм //Вирусные болезни сельскохозяйственных культур /Всесоюз. акад.с.-х. наук им. В. И. Ленина-М.; 1980,- С.50-56.

16.Кастальева Т.Б., Можаева К.А. Фракционирование цетавлоном нуклеиновых кислот из растений, поражённых вироидом веретеновидности клубней картофеля//Биологические науки.-1988.-№10. - с. 101 - 105.

17.Кашин В. И. Научные основы адаптивного садоводства.-М.: Колос-1995,-335с.

18.Крылов А. В. Вирусы растений Дальнего Востока. Идентификация особенности биологии и классификация - М.; Наука-1992.-112с.

19.Кузнецова A.A. Вирусные заболевания мозаичного типа на малине //Автореферат дисс...канд. биол. наук.-Харьков, 1970. -22с.

20.Лукьянова Е.А. Особенности производства безвирусного посадочного материала земляники и малины в ЦЧР //Автореферат дисс...канд. с.-х. наук. - Мичуринск, 1998. - 26с.

21.Методические указания по диагностике и идентификации вироидов веретеновидности клубней картофеля (ВВКК) и карликовости хризантем (ВКХр). Под ред. Ю. А. Леонтьевой, К. А. Можаевой. - М.: ВАСХНИЛ. -1982.-40С.

22.Минаев В.Ю. Вирусные болезни в Нижнем Поволжье //Автореферат дисс... канд. биол. наук. - М., 1985. - 22с.

23. Минская JI. А., Калашникова Л. В., Алексеева Т. И., Крылов А. В. К вопросу об идентификации растворимых антигенов вирусов мозаики и закукливания злаков //Взаимодействие вирусов с клетками растения-хозяина. Владивосток: ДВНЦ АН СССР.-1985- С.40-49.

24. Минская Л. А., Федотина В. Л., Бородина Е. Е., Крылов А. В. Рабдовирусы злаков СССР -М.: Наука-1987.-129с.

25. Мулюкина Н. А. Прижилковая мозаика и бороздчатость древесины винограда (этиология, диагностика, меры борьбы). //Автореф. дисс...канд. биол. наук. - Киев. - 1993.-17с.

26. Мэтьюз Р. Вирусы растений - М.: Мир - 1973.- 600с.

27. Нактинис В. И., Малеева Н. Е., Санько Д.Ф., Мирзабеков А. Д. Два простых метода выделения ДНК из различных источников с применением цетавлона. - 1977,- Т.42, Вып. 10. - С. 1783-1789.

28. Немилостева Н. И., Моисеенко Л. И. Симптомы полосчатости риса не выясненной этиологии // Фитовирусы Дальнего Востока.-Владивосток., Дальнаука. - 1993,- С. 139-145.

29. Николаева О. В., Новиков В. К., Кагроманов В. Н. Определение М - и S-вирусов картофеля методом иммуноферментного анализа // С.-х. биология. -1985.- Т.15, №2.- С. 96-102.

30. Новиков В.К., Атабеков И.Г., Агур М.С. и др. Метод получения препарата У-вируса картофеля и приготовление диагностических антисывороток //С.— х. биология.-1982.-Т. 17, № 5.-е. 701-711.

31.0стерман Л.А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультроцентрифугирование. - М.; Наука-1981.- 240с.

32.Помазков Ю.И. Вирусные болезни плодовых и ягодных культур в Нечернозёмной зоне. /Автореф. дисс... докт. с.-х. Наук.-М. 1975.-34с.

33. Порембская Н.Б., Бутенко С. И. Некоторые вопросы очистки вируса жёлтой мозаики фасоли // Вирусы и вирусные болезни растений-Киев., Наукова думка,- 1974.-С. 225-227.

34. Проценко А. Е., Сургучёва Н. А. Микоплазменная этиология махровости чёрной смородины. //С.-х. биология.-1974.-№9-с.80-83.

35. Практикум по общей вирусологии. /Под ред. И.Г.Атабекова-М.;МГУ.-1981.-192с.

36.Приходько Ю.Н., Суркова О.Ю. Вирусные болезни крыжовника в средней полосе России //Плодоводство и ягодоводство России /Сб. науч. трудов ВСТИСП. - 1994. - С.124 - 134.

37.Приходько Ю.Н., Суркова О.Ю., Метлицкий 0.3. НЕПО-вирусы на смородине в средней полосе России и пути их диагностики // Плодоводство и ягодоводство России /Сб. науч. трудов ВСТИСП. - 1994. - С. 135 - 142.

38.Приходько Ю.Н., Веретенникова Н.П., Лапинская М.П., Суркова О.Ю., Бурдейная Т.В. Диагностика вирозов и микоплазмов ягодных культур //Защита растений. - 1995.-№8. - С.36 - 37.

39.Приходько Ю.Н. Технология оздаровления крыжовника от вирусов //Плодоводство и ягодоводство России /Сб. науч. трудов ВСТИСП. - 1996. -С.109- 113.

40.Приходько Ю.Н. О видовом составе и распространёности вирусов малины в Европейской части России //Плодоводство и ягодоводство России /Сб. науч. трудов ВСТИСП. - 1997. - Т.4. - С. 96 - 101.

41.Сапоцкий М. В. Электрофоретическое исследование белков растений, инфицированных вирусами мозаики и закукливания злаков //Фитовирусы Дальнего Востока -Дальнаука - 1993,- С. 81-89.

42.Сильвере А., Тарасова К., Ромейкие М., Рейн Ю. К проблеме этиологии и распространения реверсии (махровость) чёрной смородины. /Вирусы и вирусные болезнирастений.-Киев; Наукова думка-1974.-С. 289-292.

43.Скляр Л.В. Разработка современных иммунологических методов диагностики вируса хлоротической кольцевой пятнистости косточковых пород //Автореферат дисс... канд. биол. наук. - Кишинёв, 1993. - 18с.

44. Суркова О. Ю. Анализ распространённости, вредоносности и этиологии вирусных и вирусоподобных болезней красной и чёрной смородины и

разработка мер борьбы с ними в средней полосе России. Автореферат... канд. с.-х. наук-М., 1994. -20с.

45. Суркова О. Ю., Лапинская М. П., Приходько Ю. Н. Видовой состав и распространённость вирусов на чёрной и красной смородине в Европейской части России //Тез. Докладов Всероссийского съезда по защите растений. -Санкт-Петербург, 1995 .-с.92-93.

46.Таранухо Н.П., Глушак JI.E. Рабдовирусы смородины чёрной и малины /ЛУПкробюлопчный журнал. -1995-Т.57, №5. -С. 44 -52.

47. Толкач В. Ф., Коротаева С. Г., Волков Ю.Г., Какарека Н. П., Гнутова Р.В. Некоторые характеристики карлавируса, вызывающего некротическую мозаику вики ложночиновой (Vicia Pseudorobus Fisch et tney.) в Хабаровском крае //Фитовирусы Дальнего Востока.-Владивосток., Дальнаука. - 1993.- С. 96-103.

48.Упадышев М.Т. Вирусные болезни и оздоровление нетрадиционных ягодных и плодовых культур //Плодоводство и ягодоводство России /Сб. науч. трудов ВСТИСП. - 1996. - С. 102 - 108.

49. Федотина В. Л., Сургучева Н. А., Чирков С. Н., Кочкина 3. М. Очистка и иммуноферментный анализ вируса кольцевой пятнистости малины //Сельскохозяйственная биология. -i 990.-№5 - С. 174-181.

50.Adams A.N., Barbara D.J. Host range, purification and some properties of hop mosaic virus //Ann. appl.Biol. -1980.-Vol. 96. - P. 201 - 208.

51. Adams A. N., Barbara D. J. Transmission of a virus from Fragaria vesca infected with strawberry mottle virus to Chenopodiuin quinoa.-Acta. Hortic-1986 -№.186. P. 71-76.

52.Akius M., Westorm B. Apple chlorotic leaf spot virus (ACLSV). Purification, immunization and further characterization //Vaxtskyddsnotiser. -1983. -Vol.47, №5 - 6. - P. 74 - 76.

53. Allen R. N., Dale J. Application of rapid biochemical methods for detecting avocado sunblotch disease // Ann. appl Biol.-l 981.- Vol. 98.- P. 451-461.

54. Alper M., Salomon R., Loebenstein G. Gel electrophoresis of virus - associated polypeptides for detecting viruses in bulbous irises // Phytopathology.-1984.-Vol.74, №8.-P.960-962.

55.Barbara D.J., Ashby S.Cc., Mc Namara D.G. Host range, purification and some properties of Rubus Chinese seed -borne virus //Ann. appl Biol.-1985,- Vol. 107,-P. 45-55.

56.Barnett O.W. Mayo M.A., Raschke J.H. Some biochemical propertion and purification of raspberry bushy dwarf virus// Ann. appl Biol.-1970,- Vol. 65,- P. 435-449.

57.Bar-Joseph M., Garmsey S.M., Gonsalves D. The closterovirus: A distinct group of elongated plant viruses //Adv. Virus Res.-1979.-Vol. 25. - P. 93 -168.

58. Breyel E., Maiss E., Casper R., El-Quaghlidi F. Isolation of ds-RNA from plum pox virus-infected plant tissue // Acta Horticulturae .-1986 .- №193,- P. 167-172.

59.Breyel E., Casper R., Ansa O.A., Kuhn C.W., Misari S.M., Demski J.W. A simple procedure to detect a ds-RNA associated with groundnut rosette //J.Phytopathology.-1988.-Vol. 121,№2.-P. 119-124.

60.Bremer K. Viral diseases occuring on Ribes species in Finland //Ann. Agriculturae Fenniae. -1983 -Vol.22, №2, -P.104-109.

61.Brunt A.A. Some hosts and properties of dahlia mosaik virus //J. Appl. Biol. -1971.-Vol. 67-P. 357-368.

62.Certification scheme № 9.Pathogen - tested material of Ribes //Bulletin OEPP/ EPPO Bulletin.-1994.-Vol. 24, № 4 - P. 857 - 864.

63.Certification scheme № lO.Pathogen - tested material of Rubus //Bulletin OEPP/ EPPO Bulletin.-1994.-Vol. 24, № 4 - P. 865 - 873.

64.Certification scheme № 11 .Pathogen - tested strawberry //Bulletin OEPP/ EPPO Bulletin.-1994.-Vol. 24, № 4 - P. 875 - 889.

65.Codman C.H. Raspberry viruses and virus diseases in Britain //Horticultural Research-1961 .-Vol. 1. - P. 47 - 61.

66.Clark MF., Lister R.M. Preparation and some properties of the nucleic acid of tobacco streak virus // Vorology.-1971.-Vol.45, №1.- P.61-74 .

67.Converse R.H. Infection of cultivated strawberries by tomato ringspot virus //Phytopathology.- 1981.-Vol. 71.-P. 1149- 1152.

68.Converse R.H. Virus disease of small fruits.-USDA ARS Agriculturae Handbook.-1987 ,-N 631 .-277c.

69. Convers R. H., Schaper U. Irregular occurrence of rhabdoviruslike particles in tissues of Fragaria vesca plants infected with strawberry crinkle virus. //J. Phytopathology. -1988. -Vol. 121. -P. 206 - 209.

70.Convers R. H. Laboratory detection of viruses and mycoplasmalike organisms in Strawberry //Plant disease. 1988,- Vol.72.-№9-P.744-749.

71. Dale J.L., Peters D. Protein composition of the virions of five plant rhabdovinises // Intervirology.-l981 .-Vol.l6-№2.- P.86-94.

72. Dale J.L., Phillips D.A., Parry J.N. Double - stranded RNA in banana plants with bunchy top disease // The journal of general virology.-1986.-Vol.67, №2-P. 371-375.

73.Dale J.L. Cassia yellow blotch virus //CMV/AAB Descriptions of Plant Viruses. -1988.-№ 334. - 3s.

74.Dawson W.D., Dodds J.A. Characterization of sabgenomic double-stranded RNAs from virus-infected plants // Biochem.Biophys.Res.Commun.-1982.-Vol.107,-P.1220-1235.

75.DePaulo J.J., Powell C.A. Extraction of double-stranded RNA from plant tissues without the use of organic solvents //Plant Disease-1995.-Vol.79.-№3.-P.246-248.

76. Derrick K.S., Brlansky R.H., da Graca J.V., Timmer L.W., Nguyen T.K. Partial characterization of a virus associated with citrus ring spot // Phytopathology. -1988.-Vol.78, №10.-P. 1298-1301.

77. Fagoaga C., Pina J.A., Duraa-Vila N. Occurencee of small RNAs in severely diseased vegetable crops // Plant Disease.-l 994.-Vol.78, №7.-P.749-753.

78. Falk B.W., Moms T.J., Duffus J.S. Unstable infectivity and sedimentable ds-RNA assosiated with lettuce speckles mottle virus // Virology.-1979.-Vol.96,-P.239-248.

79.Frazier N.W., Yarwood C.E., Gold A.H. Yellow-bud virus endemic along California coast //Plant Dis. Reptr.-1961 .-Vol. 45. - P. 649 - 651.

80.Frazier N.W. Transmission of strawberry mottle virus by juice and aphids to herbaceous hosts //Plant Dis. Rep. -1968. -Vol. 52, №1. -P. 71 -76.

81 .Frazier N.W. Detection of graft-transmissible diseases in strawberry by a modified leaf grafting technique //Plant Dis. Rep.-1974a.-Vol. 58. - P. 203 - 207.

82.Frazier N.W. Six new strawberry indicator clones evaluated for the detection and diagnosis of twelve graft-transmissible diseases // Plant Dis. Rep-19746.-Vol. 58.-P. 28-31.

83.Fulton R.W. Tulare apple mosaic virus //CM1/AAB Descriptions of Plant Viruses. -1971.-№42.-3s.

84.Gardner R.C., Shepherd R.J. A procedure for rapid isolation and analisis of caulifflower mosaic virus DNA //Virology.-1980.-'Vol. 106., №3,-P. 159- 161.

85.Garnsey S.M., Timmer L.W. Mechanical transmissibility of a citrus ringspot virus isolates from Florida, Texas and California //8th Int. Org. Citrus Virol.-1980.-P. 174- 179.

86.Gillet J.M., Ramsdell D.C. Blueberry red ringspot virus //C.M.I./A.A.B. Descriptions of Plant Viruses.-l988.-№327 - 4s.

87.Gildow F.E., Ballinger M.E., Rochow W.F. Identification of double-stranded RNAs associated with Barley yellow dwarf vims infection of oats //Phytopathology.-1983.-Vol.73, №1.-P. 1570-1572.

88.Hadid A., Huang C., Hammond R.W., Hashimoto J. Homology of the agent associated with dapple apple disease to apple scar skin viroid and molecular detction of these viroids // Phytopathology.-1990.-Vol.80, №3.-P.263-268.

89.Hansen M.A., Wick R.L. Plant disease diagnosis: Present status and future prospects //Advances in Plant Pathology. -1993. -Vol.10. -P. 65 -126

90.Hemida S.K., Murant A.F., Duncan G.H. Purification and some particle properties of anthriscus yellows virus, a phloem-limited semi-persistent aphid-borne virus //Ann. appl. Biol.-1989.-Vol. 114.-P. 71-86.

91.Hepp R.F., Convere R.H. Transmission of strawberry mottle virus between Chenopodium quinoa and Fragaria vesca by aphid and sap inoculation //Phytopatholody. -1987. - Vol. 77. -P.1239.

92.Hilbert E. Mc Donal J. G. Capsid heterogeneity in turnip mosaic virus //Virology.-l976- Vol.70, №1 -P. 144-150.

93.Hisachi J., Wakimoto S. An improved method for purification of soybean mosaic virus //Ann. Phytopathol. Soc. Japan. -1985,-Vol. 39, № 5,- P.314-315.

94.Hollings M., Stone O. Tomato aspermy virus //CMI/AAB Descriptions of Plant Viruses.-1971.-№ 79. - 4s.

95.Rollings M., Brunt A. A. Potyvirus Group. //Descriptions of Plant Viruses. -1981.-№245.-6s.

96.Horst R.K., Kawamoto S.D. Use of polyacrilamide gel electrophoresis for detection of chrysanthemum stunt viroid in infected tissues //Plant Disease.-1980.-Vol. 64, № 2.-P. 186-188.

97.Hull R. The multicomponent nature of brood bean mottle virus and its nucleic acid // J. Gen. Virol.-1972.-Vol. 17, № 1.- P. 111 - 117.

98.Hunter B.G., Richardson J., Dietzgen R.G., Karu A., Sylvester E.S., Jackson A.O., Morris T.J. Purification and some physicochemical properties of strawberry crincle virus //Phytopathology. -1990. -Vol. 80.,-№ 3.-P. 282 - 287.

99.Jackson A.O., Christie S.R. Purification and some physicochemical properties of sonchus yellow net vims //Virology.-l 977-Vol. 77 - P. 344 - 355.

100. Jacob H. Investigations on symptomatology, transmission, etiology, and host specificity of blackcurrant reversion virus //Acta Hort. -1976 -№66.-P.99-104.

101. Jelkman W., Lesemann D.E., Casper R. Rhabdoviruslike particles in crinkle-diseased strawberries in Germany //J.Phytopathology.-1988.-Vol.l21, №2- P. 143 - 149.

102. Jelkman W., Martin R.R., Lesemann D., Vetten H.J., Stelton F. A new potexvirus associated with strawberry mild yellow edge disease //J. General Virology.-1990,-Vol. 71, № 6 - P. 1251 - 1258.

103. Jones A.T., Roberts I.M., Miirant A.F. Association of different kinds of bacilliform particles with vein chlorosis and mosaic diseases of raspberry (Rubus idaeus) //Ann. appl. Biol. -1974. -Vol. 77,№3. -P. 283 -288.

104. Jones A.T., Murant A.F., Stace -Smith R. Raspberry vein chlorosis virus //CMV/AAB Descriptions of Plant Viruses. -1977. -№174. -4s.

105. Jones A.T., Abo El-Nasr M.A., Mayo M.A., Mitchell M.J. Association of ds RNA with some virus-like diseases of small fruits // Acta Horticulturae.-1986.-№186.-P.63-70.

106. Jones A.T. Advances in the study, detection and control of viruses and virus diseases of Rubus, with special reference to the United Kingdom //Crop Research.-1986.-Vol. 26, № 2,- P. 127 - 176.

107. Jones A.T., McGavin W.J., Watkins C.A. Recent studies in Scotland on the aetiology of virus and virus-like diseases of small fruit crops //Acta Hort. -1992. -№308.-P. 31-35.

108. Yoshikawa N., Jnouye T., Convere R.H. Two types of rhabdovirus in strawberry //Ann. Phytopathoeogy. -1986. -Vol.52, №3. -P. 437 - 444.

109. Yoshikawa N., Jnouye T. Purification, characterization and serology of strawberry pseudo mild yellow edge vims //Ann. Phytopath. Soc. Japan-1986-Vol. 52, №4,- P.634-652.

110. Yoshikawa N., Convere R.H. Purification, and some properties of strawberry mottle vims //Ann. appl. Biol-1991 .-Vol. 118, № 3,- P/ 565-576.

111. Yoshikawa N., Convere R.H. Strawberry pallidosis disease: Distinctive dsRNA species associated with latent infections in indicators and in diseased strawberry cultivars // Phytopathoiogy. -1990. -Vol.80, №6. -P. 543 - 548.

112. Kerlan C., Dunez J. Some properties of plum pox vims and its nucleic acid and protein component // Acta Horticulturae.-1976.-№67.-P.185-192.

113. Khoiiry J., Singh R.P., Boucger A., Coomds D.Y. Concentration and distribution of mild and severe strains of potato spindle tuber viroid in crossprotected tomato plants //Phytopathology-1988-Vol. 78, № 10,-P. 13311336.

114. Kitajima E.W., Betti J.A., Costa A.S. isometric viruslike particles in leaf tissues of Fragaria vesca L. infected with strawberry mottle virus //Ciencia e Culture-1971 .-Vol.23,№5.- P.649 - 655.

115. Koganezawa H., Uanase H., Sakuma T. Viroid-like RNA associated with apple scar skin (or dapple apple) disease //Acta Horticulturae.-1983.-№130.-P.193-197.

116. Kollar A., Seemuller E., Bonnet F., Saillard C., Bove J.M. Isolation of the DNA various plant pathogenic mycoplasmalike organisms from infected plants //Phytopathology.-1990.-Vol.80, №3.-P.233-237.

117. Kurppa A., Martin R.R. Use of double-stranded RNA for detection and identification of virus diseases of Rubus species //Acta Horticulturae.-1986.-№186.-P.51-62.

118. Laemmli U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage. - 1970.-T.4.- Nature (London). -Vol.227. P. 680 - 685.

119. Lawson N.R., Civerolo E.L. Carnation etched ring virus: purification, stability of inclusions, and properties of the nucleic acid //Phytopathology-1978-Vol. 68.-P. 181-188.

120. Lee R. F., Garnsey S. M., Brlansky R. H., Goheen A. C. - A purification procedure for enhanament of citrus tristeza vims yields and its application to other phloem-limited virus. //Phytopathlogy. - 1987,- Vol.77.№4.-P.543-549.

121. Leistner H., Graichen K. Nachweis isometrischer Partikeln im Phloemgewebe von Fragaria vesca L. semperflorens nach Infektion mit dem Blattscheckungs Virus der Erdbeere (Strawberry mottle vims). //Arch. Phytopathol. Pflanzenschutz. -1986.-Vol.6.-P.5U~515.

122. Lemmetty A., Latvala S., Jones A.T., Susi P., McGavin W.J., Kehto K. Purification and properties with nepoviruses, and its close association with black currant reversion diseases // Phytopathoiogy. -1997. -Vol.87, №4. -P. 404 - 413.

123. Lesemann D.E., Koenig R., Hein L. Statistic virus Y-a vims related to bean yellow mosaic and clover yellow vein viruses //Phytopathlogy.-1970.-Vol. 95, №2.-P. 128- 139.

124. Lister R.M., Hadidi A.F. Some properties of apple chlorotic leaf spot virus and their reaction to purification problems //Virology-1971 -Vol. 45.-P. 240 - 251.

125. Lopez-Moya J.J., Canton T., Lopez-Abella D., Diaz-Rutz J.R. Differentiation of Mediterranean plum pox virus isolates by coat protein analyses //Plant Pathology. -1994. -Vol.43.-P. 164-171.

126. Mac Donald S.G., Martin R.R. Bristow P.R. Characterization of an ilarvirus associated with a necrotic shork reaction in blueberry //Phytopathlogy-1991.-Vol.81. №2,- P. 210-214.

127. Martin R.R., Converse R.H. Purification, properties and serology of strawberry mild yellow-edge virus //Phytopatologische Zeitschrift.-1985.-Vol. 114, № 1.- P. 21-30.

128. Matsubara A., Kojima M., Kawano S., Narita M., Uyeda J., Schikata E. Purification and serology of a Japanese isolates of barley yellow dwarf virus //Ann. Phytopath. Soc. Japan.-1985.-Vol. 51, № 2,- P. 152 - 158.

129. Meer van der F.A. Nicotiana occidentalis, a suitable test plant in research on viruses of small fruit crops //Acta Hort.-1989.-№236.- P. 27 - 35.

130. Miki T., Knight C.A. Some chemical studies on strains of white clover mosaic vims //Virology.-1967,-Vol. 31, №1.- P. 55 -63.

131. Miki T.,Oshima N. Chemical studies of the structural protein of potato aucuba mosaic virus //Ibid.-1972.-Vol. 48, № 2,- P. 386 - 393.

132. Mochamed W.A., Young B.R. Garlic yellow streac vims, a potyvirus infecting garlic in New Zealand //Ann. appl. Biol.-1984.-Vol. 97, № 1.- P. 65-75.

133. Monette P.L., Jomes D., Godkin S.E. Double-stranded RNA from rupestris stem pitting-affected grapevines //Vitis.-1989.-Vol.28,№3.-P. 137-144.

134. Moore D.L., Cameron H.R. A nucleic acid associated with necrotic rusty mottle - diseased cherry //Acta Horticulturae.-l 982.-№ 130 - P. 80.

135. Moore D.L., Cameron H.R. Double - stranded RNA from cherries //Acta Horticulturae.-1986.-№ 193.- P. 307 - 310.

136. Moreno P., Guerri J., Munoz N. Identification of spanish strains of citrus tristeza virus by analysis of double-stranded RNA //Phytopathology.-1990.-Vol.80,№5.-P.477-482.

137. Morris T.J., Dodds J.A. Isolation and analysis of double-stranded RNA from virus-infected plant and fungal tissue //Phytopathology-1979-Vol. 69, №8- P. 854-858.

138. Morris T.J., Mullin R.H., Schlegel D.E., Cole A., Alosi M. Isolation of a caulimovirus from strawberry tissue infected with strawberry vein banding vims // Phytopathology.-1980.-Vol. 70,№2,-P. 156- 160.

139. Murant A.F. Strawberry latent ringspot virus //CMV/AAB Descriptions of Plant Viruses.-1974.-№ 126- 4s.

140. Murant A.F., Jones A.T., Roberts J.M. Recent research on 52V virus of raspberry //Acta Horticulturae.-l 976.-JN® 66 - P. 39 - 46.

141. Murant A.F., Mayo M.A., Raschke J.H. Some biochemical properties of raspberry bushy dwarf virus // Acta Horticulturae.-l 986.-№ 186 - P.23 - 30.

142. Murant A.F., Roberts J.M. Particles of raspberry vein chlorosis virus in the aphid vector, Aphis idaei //Acta Phytopathology Hung.-1980.-Vol. 15 - P. 103106.

143. Namba S., Boscia D., Azzam O., Maixner M., Hu J.S., Golino D., Gonsalves D. Purification and properties of closteroviruslike particles associated with grapevine corky bark disease //Phytopathology-1991 -Vol.81,№ 9 - P. 964 -970.

144. Noordan D. Identification of plant viruses. Methods and experiment //Centre for Agriculturae Publishing and Documentation-Wageningen, 1973. - 216s.

145. Ochawa K., Ebata N. Silver stain for detecting 10-temtogram quantities of protein after polyacrylamide gel electrophoresis //Analytical Biochemistry.-1983.-Vol. 135, №2,- P. 409-415.

146. Ozaslan M., Cinar A. The deterction of citrus exocortis viroid by polyacrylamide gel electrophoresis //J. Turk. Phytopath. -1990. -Vol. 19,№2. -P.41-52.

147. Peters D. Plant rhabdovirus group //CMI /AAB Descriptions of Plant Viruses. -1981.-№244,- 4s.

148. Pfannenstion M.A., Slack S.A., Lane L.C. Detection of potato spindle tuber viroid in field-groowin potatoes by a improved electrophoretic assay //Phytopathology.-1980,-Vol. 70, №10,- P. 1015 - 1018.

149. Pirone T.P., Pound G.S., Shepheld R.J. Properties and serology of purified cauliflower mosaic virus //Phytopathology-1961.-Vol. 51.- P. 541 - 546.

150. Polak J., Bezpalkova H. Metody diagnozy a rozsireni viru strakatosti jahodniku VCSR //Zahradnictvi. -1987. -Vol.14, №4. -P.259 -265.

151. Polak J., van der Meer F.A., Huttinga H. Attempts at multiplication, purification, electron microscopy, and characterization of three isolates of the strawberry motle agent //Biologia Plantarum-1991 -Vol. 33, № 5.- P. 377 - 385.

152. Putz C. Les viroses des petits fruits. II Les viroses du cassis et des groseilliers //Ann. Phytopath.-1972.-Vol. 4,- P. 59-75.

153. Putz C., Meignoz R. Electron microscopy of viruslike particles found in mosaic diseased raspberries in France // Phytopathology.-1972.-Vol. 62 - P. 1477 - 1478.

154. Richardson J., Frazier N.W., Sylvester E. Rhabdoviruslike particles associated with strawberry crincle vims //Phytopathology. -1972. -Vol.62. -P.491 - 492.

155. Richardson J., Sylvester E. Succesful juice inoculation of the aphid -vectored strawberry crincle vims //Calif. Agr.-1988.-Vol.42 - P.6 -7.

156. Roberts I.M., Jones A.T. Rhabdoviruslike and closterovirus -like particles in ultrathin section of Rubes species with symptoms of blackcurrant reversion and gooseberry veinbanding diseases //Ann. appl. Biol.-Vol.130-P.77 - 89.

157. Rosa M., Lastra R. Purification and partial characterization of papaya ringspot vims //Phytopath. Z.- 1983.-Vol. 95, № 2. - P. 128 - 139.

158. Schroeder M., Weidemann H.L. Simplified application of return gel electrophoresis for the routine detection of potato spindle tuber viroid //Bulletin OEPP/EPPO Bulletin -1989.-Vo1.19, №> 4. - P. 661 - 665.

159. Schumacher J., Neyer N., Riesner D., Weidemann H.L. Diagnostic procedure for detection of viroides and viruses with circular RNAs by "return"-gel electrophoresis// J. Phytopathology.-! 986,-Vol. 155.-P.332-343.

160. Singh R.P., Boucher A. Elecrophoretic separation of a severe from mild strains of potato spingle tuber viroid // Phytopathology.-1987.-Vol.77, №>11,-P.1588-1591.

161. Smith O.P., Hunst P.L., Hewings A.D., Stone A.L., Tolin S.A., Damsteegt V.D. Identification of ds-RNAs associated with soybean dwarf virus-infected soybean//Phytopathology.-1991 .-Vol.81, №2.-P.l 31-134.

162. Solarska E., Skomra U., Kitlinska J., Wojcierowski J. The occurence of hop latent viroid (HLVd) in Poland //Phytopath. Polonica.-1995.-Vol.10,- P.55 - 59.

163. Spiegel S., Martin R.R., Leggett F., Borg M., Postman J. Characterization and geographical distribution of a new ilarvirus from Fragaria chiloensis //Phytopathology.-1993.-Vol. 83, № 9,- P.991 - 995.

164. Stace-Smith R., Lo E. Morphology of bacilliform particles associated with raspberry vein chlorosis virus //Canad. J. Botany. -1973. -Vol.51. -P. 1343 -1345.

165. Stenger D.C., Mullin R.H., Morris T.J. Isolation, molecular cloning and detection of strawberry vein banding virus DNA //Phytopathology-1988-Vol.78, №2.-P. 154- 159.

166. Sylvester E.S., Richardson J., Frazier N.W. Strawberry crincle vims //CMI /AAB Descriptions of Plant Viruses. -1976. -№163. - 4s.

167. Sylvester E.S., Richardson J. Inoculation of the aphids Hyperomyzus lactucae and Chaetosiphon jacobi with isolates of sowthistle yellow vein virus and strawberry crincle virus // Phytopathology-1981 -Vol.71P.598 - 602.

168. Sylvester E.S., Richardson J. Consecutive serial passage of strawberry crincle vims in Myzus ornatus by injection and its occasional transmission to Fragaria vesca//Phytopathology.-1986.-Vol.76,- P. 1161 - 1164.

169. Sylvester E.S., Richardson J., Stenger D.C. Use of injected Macrosiphuin euphorbiae aphids as surrogate vectors for transfer of strawberry crincle vims to Nicotiana species //Plant Dis.-1987.- Vol.71.- P. 972 - 975.

170. Takanami J., Kubo S. Enzyme-assisted purification of two phloemlimited plant vimses: Tobacco necrotic dwarf and potato leaf roll //J. Gen. Virol.-1979.-Vol. 44, № l.-P. 865-889.

171. Tavartis S.H. Impoved purification of two potato carlavirus //Phytopathology 1983.-Vol.73, № 2. - P. 190-194.

172. Thresh J.M. Virus and viruslike disease of gooseberry and currant //Virus disease of small fruits and grapevines-University of California.-1970.-P.75-104.

173. Tomlinson J.A., Shephers R.J., Walker J.C. Purification, properties and serology of cucumber mosaic virus //Phytopathology-1959-Vol. 49, № 5 - P. 293 - 299.

174. Valverde R.A., Nameth S.T., Jordan R.L. Analisis of double-stranded RNA for plant vims diagnosis //Plant Dis. -1990. -Vol.74, №3 -P. 255 -258.

175. Wagner R.R., Prevec L., Brown F., Summers D.F, Sokol F., Macleod R. Classification of rhabdovirus proteins: A proposal //J. Virology. -1972. -Vol.10. -P.1228 -1230.

176. Watkins C.A., Jones A.T., Maio M.A., Mitchell M.J. Double-stranded RNA analysis of strawberry plants affected by june yellows //Advances in Plant Pathology.-1993,-Vol.10.- P.65 -126.

177. Wei Shiquan, Wu Yuanhua The identification of strawberry mottle virus in China //Acta Phytopath. Sinica.-1994.-Vol.24,№4.- P.292 - 298.

178. Wolf G., Casper R. Disc-electrophoretic separation of elongated plant viruses in Polyacrylamide - agarose gels //J.general Virology-1971 .-Vol.l2.-P.325-329.

Экстрагирующие буферы, используемые для очистки фитопатогенных вирусов

Вирусы растения -накопитель Буферы Стабилизирующие добавки Авторы

1 2 3 4 5

Клостеровирусы, вирионы нитевидные -1200x2000x13-14нм

Тристецы цитрусовых (СТУ) Citrus excelsa ОДМ Трис-HCI, рН8,4 0,1% тритон Х-100 или 0,2% поливинилпирролидон (ПВП) Lee R. F. et al., 1987.

кольцевой пятнистости цитрусовых (СКУ) Грейпфрут,С .quinoa 0,05М Трис-HCI, рН8,0 ТАСМ-буфер 0,1% аскорбиновая кислота, 0,1% цистеин, 0,2% 2-меркаптоэтанол (2-МЭ) Derrick K.S., et al., 1988

опробковение коры винограда (ОСВУ) виноград 0,5М Трис-HCI, рН9,0 0,01М MgS04, 4% ПВП, 0,2% 2-МЭ, 0,5% бентонит, 5% тритон Х-100 S. Namba et al„ 1991

Капиловирусы, вирионы нитевидные, 600-700x12-13нм

Хлоротической пятнистости листьев яблони (АСЬБУ) С. quinoa 0.01М Трис-HCI, рН7,6 0,01MMgS04 M. Akius B. Westrom, 1983

Карловирусы, вирионы нитевидные, 610-700х13-14нм

Ложного слабого пожелтения краёв листьев земляники (БРМШУ) Fragaria vesca ОДМ боратный, рН8,2 2% ПВП, 2% никотина, 0,01М ЭДТА, 0,2% тиогликолиевая кислота N. Yoshikawa, T. Inouye, 1986

о

1 2 3 4 5

Мозаики хмеля (НМУ) хмель 0,05М боратный, рН8,0 l%Na2S03 A. Adams, D. Barbara, 1980

Латентный нарцисса (ЫЪУ) ирис 0,01М фосфатный, рН8,2 0,1% 2-МЭ, 50% хлороформа М. Alper et al., 1984

Б-вирус картофеля (РУБ), М-вирус картофеля(РУМ) N. tabacum 0.05М калий-фосфатный, рН7,5 0,005М ЭДТА, 0,2% 2-МЭ О.В.Николаева и др., 1985

Потексвирусы, вирионы нитевидные, 470-580x11-13нм

Х- вирус картофеля (РУХ) N. tabacum 0.05М фосфатный, рН7,5 0,3% ЭДТА Р.В. Гнутова, 1993

Мозаика белого клевера (\VCMV) N. tabacum 0,02М фосфатный, рН7,6 0,2% ЭДТА, 0,1% N33803 Т. Miki, С. Knight,1967

Аукуба мозаика картофеля (РАМУ) N. tabacum 0,05М фосфатный, РН7,5 0,1% 2-МЭ, 0,5М N301 Т. Miki, N. Oshima, 1972

кольцевой пятнистости гортензии (НЕ-БУ) N. tabacum 0,5М боратный, рН7,8 0,1% аскорбиновая кислота,0,1% N301 Р.В. Гнутова, 1993

Потиеирусы, вирионы нитевидные, 680-900x11-15нм

Желтой карликовости лука (ОШУ), мозаики гипеаструма (НМУ), У-вирус картофеля (РУ1) лук, гипеаструм, N. tabacum 0,05М фосфатный, рН7,6-7,8 0,005М ЭДТА, 0,2% 2-МЭ Е.В. Артюкова, 1985; В.К. Новикова и др. 1982; Mochamed W.A., Young B.R.,1984

Мозаика турнепса (ТМУ) N. tabacum 0.05М фосфатный, рН8,5 0,005М ЭДТА, 0,1% тиогликолевая кислота Р.В. Гнутова, 1993

о

1 2 3 4 5

А-вирус картофеля (РУА) N. сЫеуе1апсШ, N. 1аЬасит 0.05М фосфатный, рН8,5 0,005М ЭДТА, 0,1% тиогликолевая кислота Р.В. Гнутова, 1993

0,1М калий -фосфатный, рН8,5 0,01М ДИЕКА, 0,2% тиогликолят натрия Ю.А. Варицев и др., 1989

Мозаика сои (БМУ) соя 0,ЗМ натрий -фосфатный, рН7,0 0,01М ДИЕКА Hisachi J., Wakimoto S., 1985

0,5М боратный, рН7,8 0,2% аскорбиновая кислота, 0,2% Ш2803 Lesemann D.E. et al.,1970

Кольцевой пятнистости папайи (РЯУ) тыква 0,5М фосфатный, рН7,5 0,1% ЭДТА, 0,1% ДИЕКА, 20% смесь хлороформа и СС14 Rosa M., Lastra R, 1983

Желтой мозаики сои (В1МУ), Слабой мозаики ириса (ШМУ), Суровой мозаики ириса (ШМУ) N. 1аЬасит, ирис 0,01М фосфатный, рН8,2 0,1% 2-МЭ, 50% хлороформ M. Alper et al., 1984

Шарки слив (РРУ) N. сЫеуе1апсШ, 0,02М фосфатный, рН7,0 0,01М ДИЕКА, 0,02М тиогликоликолят C. Kerlan, J. Dunez, 1976

N. оспёеЩаНз 0,02М калий -фосфатный, рН8,0 0,01М ДИЕКА, 0,02М 2-МЭ Билкей Н.Д., 1992

Рабдовирусы, вирионы бациловидные или пулевидные, 130-200х40-95нм

Мозаика злаков (СеМУ) овёс ОДМ Трис-НС1, рН8,0 — M.B. Сапоцкий и др., 1992

Морщинистости земляники (8СУ) физалис ОДМ Трис-НС1, рН8,2 0,01М ацетат магния, 0,04М N32803, 0,001ММпС12 В. Hunter et al., 1990

Желтой сетчатости осота (БШУ) осот ОДМ Трис-НС1, рН8,2 0,01М ацетат магния, 0,04М N32803, 0,001ММпС12 A. Jackson, S. Christie, 1977

2> сг

1 2 3 4 5

Бромовирусы, вирионы полиэдрические диаметром 26нм

Мозаики костра (BrMV) ячмень 0,2М ацетатный, рН5,0 0,1% аскорбиновая кислота, 0,1% 2-МЭ R. Hull, 1972

Cassia yellow blotch virus N. chlevelandii 0,2М натрий -ацетатный, рН4,8 0,001М ЭДТА J.L. Dale, 1988

Кукумовирусы, вирионы изометрические диаметром 28-ЗЗнм

Огуречной мозаики (CMV) Аспермии томата (TAV) N. tabacum 0,5М фосфатный, рН7,5-7,6 0,1% тиогликолевая кислота P.B. Гнутова, 1993

Аспермии томата (TAV) N. tabacum 0,ЗМ фосфатный, рН7,6 0,01М ДИЕКА, 0,005М цестеин М. Hollings, О. Stone, 1971

Лютеовирусы, вирионы изометрические, диаметром 23-29нм

Слабого пожелтения краёв листьев земляники (SMffiV) земляника ОДМ фосфатный, рН7,0 0,01М ДИЕКА, 1% тиогликолевая кислота R. Martin, R. Converse, 1985

Желтой карликовости ячменя (ВГОУ) ячмень, овёс ОДМ фосфатный, рН7,0 — A. Matsubara et al„ 1985

Anthriscus yellow virus кориандр 0,06М фосфатный, рН8,0 0,01М ЭДТА, 0,1% тиогликолевая кислота S. Hemida et al., 1989

Каулимовирусы, вирионы сферические, диаметром 40-45нм

Окаймление жилок земляники (SVBV) F. vesca 0,5М натрий-фосфатный, рН7,5 0,2% 2МЭ T. Morris et al., 1980

0,2М Трис-НС1 рН7,5 0,2М ЭДТА, 2% ПВП, 0,2% 2-МЭ, 1,5М мочевина, 0,05М бензоат натрия D. Stenger et al., 1988

Мозаики цветной капусты (СаМУ) репа 0,2М Трис-НС1, рН7,0 0,02М ЭДТА, 1,5М мочевина R.Gardner, R. Shepherd, 1980

о

1 2 3 4 5

Красной кольцевой пятнистости голубики (BRRV) голубика ОДМ натрий-фосфатный, рН7,2 0,01М 2-МЭ, 0,005М тиогликолевая кислота J. Gillet, D. Ramsdell, 1988

Иларвирусы, частицы квазиметрические диаметром 26-3 5нм

Иларвирус Fragaria chiloensis (FCIV) С. quinoa ОДМ фосфатный, рН8,0 0,01М ДИЕКА, 0,01М натрий тиогликолевая кислота S. Spiegel et al., 1993

Иларвирус шока голубики (BSIV) N. chlevelandii 0,03М фосфатный, рН8,0 0,02М аскорбиновая кислота, 0,02М 2-МЭ S. Mac Donald etal., 1991

Туларе мозаики яблони (TAMV) N. tabacum 0,02М фосфатный, рН8,0 0,02М 2-МЭ R.W. Fulton, 1971

Хлоротической кольцевой пятнистости косточковых (PCRSV) тыква 0,02М фосфатный, рН8,0 0,01М ДИЕКА, 0,02М 2-МЭ JI.B. Скляр, 1993

Неповирусы, вирионы изометрические диаметром ЗОнм

Rubus Chinese seed-bone virus С. quinoa, N. chlevelandii натрий- цетратный, рН6,0 0,2% ДИЕКА, 0,2% тиогликолят натрия, 0,37% ЭДТА D. Barbara et al., 1985

Кольцевой пятнистости малины (RRV) N. rustica 0,05М фосфатный, рН7,0 0,02М 2-МЭ B.JI. Федотина и др., 1990

Неклассифицированные вирусы с изометрическими или сферисескими вирионами

Крапчатости земляники (SMV) С. quinoa ОДМ фосфатный, РН7,2 5% тритон Х-100 N. Yoshikawa, R. Converse, 1991

0,025М боратный, рН8,3 0,005М цистеин-НС1, 0,01М ДИЕКА, 0,05% твин

о 00

1 2 3 4 5

Кустистой карликовости малины (RBDV) С. quinoa 0Д25М нитратный, рН6,0 0,1% тиогликоль A. Murant et al., 1986

0,03М фосфатный, рН8,0 0,02М 2-МЭ О. Barnett, А. Murant, 1970

Некроза чёрной малины (BRNV) С. quinoa 0,05М нитратный, рН6,0 0,01М ДИЕКА A. Murant et al.,1976

о чо