Изучение свойств химеры флавивирусов Лангат и Денге 4 как кандидата в живую вакцину против клещевого энцефалита тема диссертации и автореферата по ВАК РФ 03.00.06, кандидат биологических наук Припузова, Наталья Сергеевна

• Припузова, Наталья Сергеевна
• кандидат биологических наук
• 2005

Оглавление диссертации кандидат биологических наук Припузова, Наталья Сергеевна

список сокращений.

Введение.

Обзор литературы.

1. общая характеристика рода flavivirus.

1.1 Химические и физические свойства флавивирусов.

1.2 Структура генома флавивирусов.

1.3 Функциональные характеристики белков.

1.4 Проникновение вириона в клетку.

1.5 Трансляция и протеолитический процессинг.

1.6 Репликация РНК.

1.7 Сборка и освобождение вирусных частиц из инфицированных клеток.

1.8 Антигенная классификация.

1.9 Роль структурных и неструктурных белов в иммунном ответе.

2. Генетические маркеры вирулентности и тропизма флавивирусов.

2.1 Мутации в 5' и 3'NTR, влияющие на вирулентность и тропизм.

2.2 Мутации в поверхностном гликопротеине Е, влияющие на вирулентность, тропизм и связывание с моноклональными антителами.

2.3 Мутации, влияющие на вирулентность флавивирусов, в других структурных белках.

2.4 Влияние на вирулентность флавивирусов мутаций в последовательности неструктурных белков.

3. Способы профилактики клещевого энцефалита.

4. История получения и изучения вариантов живой вакцины против вируса клещевого энцефалита.

5. новешие исследования в области получения живой вакцины против вкэ.

6. Критерии отбора и методы оценки предложенных аттенуированных вариантов живых вакцин против ВКЭ.

6.1 Критерии безопасности.

6.2 Стабильность свойств и генетическая стабильность.

6.3 Оценка возможной персистенции аттенуированных вирусов.

6.4 Способы оценки эффективности вакцин.

Материалы и методы.

1. вирусы.

2. Эксперименты на обезьянах.

3. Приготовление образцов органов обезьян для гистологического и вирусологического анализов.

4. гистологическое исследование ЦНС.

5. эксперименты на мышах.

6. приготовление образцов крови.

7. определение виремии в сгустках крови обезьян с помощью титрования на мышах.

8. определение титров штамма абсеттаров ВКЭ в органах и в сыворотках или сгустках крови методом бляшек.

9. определение титров химеры ТР21 /DEN4 методом бляшек.

10. активация персистентной инфекции у мышей.

11. Проведение пассажей TP21/DEN4 на VERO.

12. выявление вирусной РНК в мозге мышей.

13. секвенирование последовательностей РНК вирусов, полученных в результате пассажей химеры на VERO.

14. иммуноферментный анализ (ИФА).

15. Реакция нейтрализации.

16. Иммунопреципитация вирусспецифических белков с использованием протеин-А-сефарозы.

17. Опыты с использованием клещей.

Результаты собственных исследований.

1. оценка степени аттенуации химеры ТР21/DEN4 в экспериментах на лабораторных мышах.

1.1. Сравнение степени вирулентности химеры TP21/DEN4 с высоковирулентным штаммом Абсеттаров ВКЭ и родительским штаммом ТР21 вируса Лангат.

1.2 Разработка метода выявления вирусной РНК в мозге незаболевших мышей после i/p, i/сили i/sp введения TP21/DEN4.

1.3. Нейровирулентность химеры TP21/DEN4 в опытах по Ус заражению сосунков.

1.4. Сравнение уровня репродукции химеры TP21/DEN4, вируса Лангат и штамма Абсеттаров ВКЭ при Ус введении лабораторным мышам линии BALB/c весом 10-12г.

1.5. Степень вирулентности и скорость распространения по ЦНС химеры TP21/DEN4 в сравнении с вирусами Лангат и КЭ при Узр введении мышам.

1.6. Периферическая вирулентность TP21/DEN4 на мышах.

1.7. Оценка возможности персистенции химеры в организме мышей BALB/c (12-14 г) после Ур,

Ус и ysp введений.

2. ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ ХИМЕРНОГО ВИРУСА TP21/DEN4 НА МОДЕЛИ ОБЕЗЬЯН.

2.1 Периферическая вирулентность TP21/DEN4 в экспериментах на обезьянах по сравнению с высоко вирулентным штаммом Абсеттаров ВКЭ.

2.2 Оценка остаточной нейровирулентности химеры TP21/DEN4 в экспериментах на зеленых мартышках (Cercopithecus aethiops) при интрацеребральном введении.

3. ОЦЕНКА СТАБИЛЬНОСТИ ВИРУСА TP21/DEN4 ПРИ ПАССАЖАХ НА КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК VERO И ЧЕРЕЗ МОЗГ ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШЕЙ.

3.1 Оценка стабильности химеры при пассажах на культуре клеток VERO.

3.2 Оценка стабильности химеры при пассажах через мозг лабораторных мышей.

4. ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ИММУНИЗАЦИИ ХИМЕРОЙ TP21/DEN4 ДЛЯ ЗАЩИТЫ ПРОТИВ ВИРУСОВ КОМПЛЕКСА ВКЭ В ОПЫТАХ НА ЛАБОРАТОРНЫХ МЫШАХ.

4.1. Оценка протективной эффективности и формирование иммунного ответа при различных схе.иах и способах иммунизации.

4.2. Дчительность защиты против ВКЭ при Ур иммунизации химерой в сравнении с инактивированными вакцинами производства ФГУППИПВЭ u "FSM-IMMUN inject" (Immuno AG, Австрия).

4.3. Протективная активность химеры TP21/DEN4 против других штаммов ВКЭ и вируса ОГЛ при Ур иммунизации в сравнении с инактивированной вакциной производства ИПВЭ.

5. оценка эффективности иммунизации химерой tp21/den4 против вкэ в опытах на обезьянах.

5.1. Оценка иммуногенности химеры при s/c иммунизации.

5.2. Оценка эффективности s/c иммунизации химерой против s/c разрешения ВКЭ.

5.3. Оценка эффективности s/c иммунизации химерой против Ус разрешения ВКЭ.

6. оценка экологической безопасности химеры tp21/den4 в опытах на клещах.

6.1. Моделирование передачи вирусов КЭ и химеры TP21/DEN4 иксодовым клещам при питании на зараженных мышах.

6.2. Изучение фенотипических и генетических свойств вируса, выделенного из взрослой самки I. persulcatus при питании на мыши, зараженной химерой.

6.3. Изучение способности химеры TP21/DEN4 к репродукции в иксодовых клещах

Обсуждение.

1. безопасность химеры tp21/den4 на модели лабораторных мышей и обезьян.

2. оценка протективности химеры tp21/den4 на модели лабораторных мышей и обезьян.

3. изучение генетической и фенотипической стабильности свойств химеры tp21/den4 при пассажах на культуре клеток vero и через мозг мышей.

4. характеристика мутаций, найденных в геноме химеры tp21/den4, при пассажах на культуре клеток vero и через мозг мышей.

5. оценка экологической безопасности химеры tp21/den4 в опытах на клещах.

6. разработка критериев оценки аттенуированных штаммов кандидатов в живую вакцину против вкэ.

Выводы.

Введение диссертации (часть автореферата) на тему «Изучение свойств химеры флавивирусов Лангат и Денге 4 как кандидата в живую вакцину против клещевого энцефалита»

Клещевой энцефалит (КЭ) является природно-очаговой арбовирусной инфекцией с высокой 2-7 % смертностью. Около 30% заболеваний оканчиваются инвалидизацией. В настоящее время заболеваемость клещевым энцефалитом (КЭ) регистрируется в Австрии, Германии, Польше, Чехии, Словакии, Финляндии, прибалтийских государствах, России, Италии, Швейцарии. Максимальные показатели заболеваемости отмечаются в России и Австрии. В Российской Федерации клещевой энцефалит распространен в европейской части страны, в Сибири и на Дальнем Востоке. Эпидемиологическая обстановка по КЭ во многих областях и регионах с каждым годом ухудшается, поскольку значительно снизилась интенсивность противоклещевых мероприятий и вакцинирования. Ведущим фактором, определяющим заболеваемость в последние годы, является посещение очагов неиммунными жителями городов, которые болеют в 2,5 раза чаще сельских жителей. В 1996 году - через 5 лет после запрещения проведения акарицидных обработок с применением ДДТ и на фоне резкого снижения охвата населения вакцинацией - было зарегистрировано более 10000 больных КЭ (6,8 на 100 тысяч населения). В 2001-2002 годах отмечается снижение заболеваемости за счет увеличения вакцинации и возобновления противоакарицидных мероприятий - 3,57-4,38 больных на 100 тысяч населения. В настоящее время для профилактики КЭ существует несколько эффективных препаратов инактивированной концентрированной очищенной вакцины. Основным недостатком этих препаратов является необходимость ревакцинаций с интервалом в три года и возможность аллергических реакций. Необходимы дополнительные разработки по усовершенствованию вакцин, направленные на увеличение длительности индуцируемого иммунитета, широты спектра действия вакцин и снижения стоимости их производства. В связи с этим в течение многих лет ведутся разработки по получению живых вакцин. В 60-е и 70-е годы в СССР, США и Чехословакии проводились исследования по получению живой вакцины против КЭ. В это же время вырабатывались и критерии отбора аттенуированных вирусов - кандидатов в вакцинные штаммы. Восемь вариантов вирусов комплекса КЭ успешно прошли испытания на ограниченном контингенте добровольцев (9 - 2500 человек). Одна из вакцин на основе штамма Еланцев вируса Лангат была изучена в расширенном эпидемиологическом опыте на 649479 человек. Эффективность ее была признана высокой. Однако, было зарегистрировано 35 случаев вакциноассоциированных осложнений - лихорадящее заболевание, менингоэнцефалит, хронический клещевой энцефалит. Прогресс в молекулярной биологии и биотехнологии привел к появлению новых стратегий получения вакцин, таких как химеризация разных флавивирусов, специфический мутагенез вирусных детерминант вирулентности и другие. На данный момент активно разрабатываются живые аттенуированные флавивирусные вакцины для защиты от вирусов Денге и вируса Западного Нила (ЗН). Разработана живая вакцина против Японского энцефалита (ЯЭ). Живая аттенуированная вакцина против вируса желтой лихорадки на основе штамма 17D является одной из самых безопасных и наиболее эффективных вакцин. Этот штамм активно используется для создания химерных вирусов для защиты от вирусов ЗН и ЯЭ.

В последнее время в нескольких лабораториях мира проводятся исследования по получению аттенуированных вирусов, которые предполагается использовать в качестве живой вакцины для защиты от вируса КЭ. Исследования в этой области ведутся в основном в двух направлениях. Первый подход заключается в создании химер флавивирусов, которые содержат структурные белки РгМ и Е вирусов комплекса КЭ, второй подход направлен на выявление аттенуирующих мутаций в геноме ВКЭ и Лангат, и получение с помощью мутагенеза вирусов, несущих эти мутации. В обоих случаях кандидат в вакцинный штамм является вирусом, полученным генно-инженерным путем. При создании новой живой вакцины помимо получения аттенуированного иммуногенного вируса необходима разработка критериев его оценки, поскольку предложенные ранее требования к вакцинным штаммам могут не учитывать специфику генно-инженерных вирусов.

Американскими учеными (Pletnev et al., 1998) была сконструирована жизнеспособная химера TP21/DEN4, содержащая гены РгеМ-Е штамма ТР21 вируса Лангат, относящегося к комплексу КЭ, и остальную последовательность РНК вируса Денге 4 типа. На модели данного химерного вируса мы попытались определить критерии оценки аттенуированных вакцинных штаммов.

Цель и задачи работы. Целью данной работы было изучение свойств химеры флавивирусов Лангат и Денге 4, TP21/DEN4 и на модели этого вируса уточнить критерии оценки аттенуированных штаммов - кандидатов в живую вакцину против КЭ.

Для этого необходимо было решить следующие задачи:

1. Определить степень атгенуации химерного вируса ТР21 /DEN4 и оценить возможность его персистенции на модели лабораторных мышей.

2. Оценить уровень вирулентности химеры TP21/DEN4 при периферическом и интрацеребральном (i/c) введении обезьянам.

3. Охарактеризовать степень иммуногенности химерного вируса, эффективность и длительность защиты против вирусов комплекса КЭ по сравнению с инактивированными вакцинами производства ФГУП ПИПВЭ им М.ПЛумакова и "FSM-IMMUN inject" (Immuno AG, Австрия) на модели лабораторных мышей и обезьян.

4. Изучить генетическую стабильность вирусной популяции и стабильность аттенуированных свойств посевного вируса TP21/DEN4 после пассажей в культуре клеток VERO и через мозг мышей.

5. Оценить экологическую безопасность химерного вируса ТР21/DEN4 в опытах на иксодовых клещах.

6. Использовать данные, полученные на модели химерного вируса TP21/DEN4, для выработки критериев оценки безопасности и эффективности аттенуированных вирусов - кандидатов в вакцинный штамм для защиты от КЭ. Научная новизна.

Химера TP21/DEN4 является уникальным генно-инженерным вирусом, поэтому все исследования по изучению свойств этого вируса проводились впервые или существенно дополняли данные об этом вирусе, полученные ранее.

1. Проведено всестороннее изучение свойств и уровня аттенуации химерного вируса TP21/DEN4 в экспериментах на мышах разного возраста и обезьянах двух видов при i/c и периферическом введении.

2. Изучены иммуногенность химеры, уровень и длительность протективного иммунитета, индуцируемого химерой TP21/DEN4, в экспериментах на мышах и обезьянах для защиты от высоковирулентных штаммов ВКЭ, относящимся к разным субтипам, и вируса омской геморрагической лихорадки (ОГЛ).

3. Показана стабильность аттенуации посевного вируса TP21/DEN4 при пассажах в культуре клеток VERO и определены мутации в генах структурных белков ргМ и Е и 3TNTTR, связанные с адаптацией к культуре клеток VERO и репродукцией в ЦНС мышей. Получена новая информация по функциональному картированию белка Е.

4. Впервые показана возможность передачи химерного вируса клещу Ixodes ricinus в лабораторных условиях при питании на зараженной мыши, а также возможность медленной элиминации химерного вируса TP21/DEN4 в организме клеща Ixodes ricinus.

Научно-практическая значимость работы. Проведен первый этап изучения свойств химеры TP21/DEN4 и показана его перспективность, как кандидата в вакцинный штамм для защиты от КЭ с точки зрения уровня аттенуации и иммуногенности.

1. В результате работы на примере аттенуированного химерного вируса TP21/DEN4 уточнены критерии для оценки безопасности и эффективности аттенуированных вирусов - кандидатов в вакцинный штамм для защиты от КЭ.

2. Показано, что для химерных вирусов наиболее информативными являются эксперименты по изучению уровня аттенуации и протективности на обезьянах и подобран вид обезьян для этих исследований.

3. Для химерных вирусов показана необходимость проведения экспериментов по экологической безопасности.

4. В экспериментах на мышах получены следующие новые данные по протективности инактивированной цельновирионной вакцины производства ФГУП ПИПВЭ им М.П. Чумакова:

- преимущество i/m иммунизации по сравнению со стандартно применяемой s/c,

- длительность протективного иммунитета более 1 года (то есть практически пожизненный иммунитет),

- эффективность иммунизации вакциной против вируса ОГЛ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение диссертации по теме «Вирусология», Припузова, Наталья Сергеевна

выводы

По показателям степени нейровирулентности и нейроинвазивности в опытах на лабораторных мышах химера TP21/DEN4 является высокоаттенуированным вирусом. Получены данные, указывающие на отсутствие персистенции TP21/DEN4 в организме мьппей. Химера TP21/DEN4 высоко аттенуирована для приматов по следующим показателям: низкий уровень виремии и репродукции вируса в висцеральных органах, отсутствие вируса в ЦНС при периферическом введении, низкий уровень репродукции и степень морфологических изменений в ЦНС при внутримозговом введении. При этом степень остаточной вирулентности химерного вируса для приматов выше, чем для мышей.

Химерный вирус TP21/DEN4 низкоиммуногенен на мышах, по сравнению с инактивированной вакциной при подкожной и внутримышечной иммунизации. Двукратная внутрибрюшинная иммунизация мьппей химерой TP21/DEN4 обеспечивает эффективную и длительную защиту против всех трех субтипов ВКЭ и вируса ОГЛ. Однократная и двукратная подкожная иммунизация химерой TP21/DEN4 обезьян Cercophithecus aethiops индуцирует высокий уровень синтеза антител, обеспечивает формирование иммунологической памяти и предотвращает размножение вируса клещевого энцефалита в висцеральных органах.

Показана стабильность аттенуированных свойств посевного вируса TP21/DEN4 после пассажей в культуре клеток VERO. Определены мутации в генах структурных белков ргМ и Е и 3*NTR генома химеры TP21/DEN4, связанные с адаптацией вируса к культуре клеток VERO и репродукцией в ЦНС, которые могут быть использованы для контроля генетической стабильности вирусной популяции.

Впервые показана возможность передачи TP21/DEN4 клещу Ixodes ricinus в лабораторных условиях при питании на зараженной мыши и возможность медленной элиминации химерного вируса TP21/DEN4 из организма клещей Ixodes ricinus.

В результате работы на примере аттенуированного химерного вируса TP21/DEN4 уточнены критерии для оценки безопасности и эффективности аттенуированных вирусов — кандидатов в вакцинные штаммы для защиты от КЭ.

БЛАГОДАРНОСТИ Выражаю глубокую благодарность к.б.н Каргановой Г.Г. за научное руководство, постоянное внимание и поддержку. Также благодарю сотрудников ИПВЭ им. М.П.Чумакова кмн Дживанян Т.И., к.б.н Гмыль Л.В., к.б.н Буренкову Л.А., Романову Л.Ю., сотрудника ГИСК им Л.А. Тарасевича к.м.н Терешкину Н.В. и американского коллегу Доктора А. Плетнева за помощь и участие в настоящей работе. Я глубоко признательна академику РАМН Лашкевичу В.А. за внимание к работе и плодотворные научные дискуссии.

Список литературы диссертационного исследования кандидат биологических наук Припузова, Наталья Сергеевна, 2005 год

1. Воробьева М.С., Дзагуров С.Г., Ладиженская И.П., Чигиринский А.В., (1982) Изучение * аттенуированных вариантов вирусов комплекса клещевого энцефалита. Вопросывирусологии,3, 55-59.

2. Воробьева М.С., Эльберт Л.В., Грачев В.П. и др. (1983) Реактогенность и иммуногенная эффективность концентрированной очищенной вакцины против клещевого энцефалита. Вопр. Вирусол., 5,622-626

3. Дремов Д.П. (1977) Сравнительное патоморфологическое изучение нейровирулентности аттенуированных вариантов вируса клещевого энцефалита на обезьянах. "Научные основы производства вирусных и бактериальных препаратов", Томск.

4. Дубов А.В., Молотилов В. А. (19696) Живая вакцина против клещевого энцефалита. -Тюменский научно-исследовательский институт областной инфекционной патологии. Тюмень. 3, 85-90.

5. Дубов А.В., Горожанкина Т.С., Смородинцев А.А. (1969г) Живая вакцина против клещевого энцефалита. Тюменский научно-исследовательский институт областной инфекционной патологии. Тюмень. 3, 16-26.

6. Дубов А.В., Горожанкина Т.С. (1969д) Живая вакцина против клещевого энцефалита. -Тюменский научно-исследовательский институт областной инфекционной патологии. Тюмень. 3,27-34.

7. Дубов А.В., Кошуков С.Д., Григорьева Л.В., Костилев С.Г. (1969е) Живая вакцина против клещевого энцефалита. Тюменский научно-исследовательский институт областной инфекционной патологии. Тюмень. 3, 63-74.

8. Дубов А.В., Козлов Л.Б., Молотилов Б.А., Фенева Н.А. (1972) Живая вакцина противклещевого энцефалита. Антигенная активность. Вопр. Вирусол., 4,45-50.

9. Дубов А.В. Смородинцев А.А. (1980) Пути усовершенствования вакцинопрофилактикиклещевого энцефалита. Вестник АМН СССР, №10.

10. Дубов А.В.(1989) Клещевой энцефалит. Ленинград, 120-125.

11. Ерофеев B.C. (1969а) Вопросы эпидемиологии, микробиологии и иммунологии. Труды ТомНИИВС и ТМИ, XXI, 11-15.

12. Ерофеев B.C., V.S. (1969b) Вопросы эпидемиологии, микробиологии и иммунологии. Труды ТомНИИВС и ТМИ, XXI, 202-206.

13. Ерофеев B.C., Карпов С.П. (1972) Вопросы вирусологии, 5,591- 594.

14. Ерофеев B.C., Карпов С.П., Куликова Н.Н. (1976а) Конструирование и применениебиологических препаратов. Труды ТомНИИВС и ТМИ, XXVI, 223-228.

15. Иваненко А.И., Гольдфарб М.М., Лезина М.Н., Ладыженская И.П., (1969) Живая вакцина против клещевого энцефалита. Тюменский научно-исследовательский институт областной инфекционной патологии. Тюмень. 3,35-43.

16. Игнатьев Г.М., Отрашевская М.С., Воробьева М.С. (2003) Активность цитокинов при иммунизации вакциной против клещвого энцефалита в эксперименте. Вопр. Вирусол., №3, с. 22-25.

17. Ильенко В.И., Платонов В.Г., Прозорова И.Н., Смородинцев А.А. (1968а) Материалы к изучению изменчивости малайского вируса Лангат (штамм ТР-21). Бюллетень ВОЗ, Т.39, №3.

18. Каган Н. В. (1939) Экспериментальные материалы к активной иммунизации мышей против весенне-летнего (клещевого) энцефалита препаратами живого и убитого вируса. Арх. Биол. Наук, 56 (2), 97-111

19. Костилев С.Г., Дубов А.В. (1969) Живая вакцина против клещевого энцефалита. -Тюменский научно-исследовательский институт областной инфекционной патологии. Тюмень. 3, 53-62.

20. Левкович Е.Н., Засухина Г. Д., Чумаков М. П., Лашкевич В. А., Гагарина А. Г. (1960) Вопр. Вирусол., 3,233-236

21. Левкович Е.Н., Карпович Л.Г., Логинова Н.В. (1966) Анализ неровирулентных и иммуногенных свойств клонов, выделенных из популяции вируса Лангат (штамм ТР-21). Вопросы вирусологии, 2,183-189.

22. Левкович Е.Н., Карпович Л.Г., Засухина Г.Д. (1971) Генетика и эволюция арбовирусов. Москва, Медицина, 264,229-231.

23. Остерман Л.А. (1986) Хроматография белков и нуклеиновых кислот, М., «Наука», 536 с. Погодина В.В. (1967) Сравнительное изучение вирусов группы клещквого энцефалита по признаку вирусемии. Acta virol., 8, с. 113-122.

24. Смородинцев А.А., Каган Н.В., Левкович Е. Н. (1941) Ж. Микробиол., 4, с. 3-12. Смородинцев А.А., Дубов А.В. (1986) Клещевой энцефалит и его профилактика. АМН СССР. Ленинград:Москва.

25. Соколова Е.Д., Камалов И.И., Коновалов Г.В. (1994) Характеристики нейровирулентности, стабильности и ммуногенности ослабленных вариантов вируса Лангат ТР-21. Вопр. Вирусол., № 5, с. 220-223.

26. Соколова Е.Д., Камалов И.И., Коновалов Г.В., Вейгман Н.З. (1994) Нейровирулентность вариантов вируса Лангат ТР-21 в опытах на низших обезьянах разных видов. Вопр. Вирусол., № 2 , с. 116-119.

27. Фролова Т.В., Погодина В.В., Ларина Г.И., Фролова М.П., Кармышева В.Я. (1982) Активирующий эффект циклофосфана на поздних этапах персистенции вируса КЭ. Вопр. Вирусол., № 5, с. 578-585.

28. Andhzaparidze, O.G.; Rozina, E.E.; Bogomolova, N.N.; Boriskin, Yu.S. (1978) Acta Virol. 22(3), 218-223.

29. Arroyo J., Guirakhoo F., Fenner S. et al. (2001) Molecular basis for atennuation of neurovirulence of a Yellow Fever virus/Japanese encephalitis virus chimera vaccine (ChimeriVax-JE). J. of Virol., 75,2, p. 934-942.

30. Blok J, McWilliam M, Butler HC, et al. (1992) Comparison of a dengue-2 virus and its candidate vaccine derivative: Sequence relationships with the flaviviruses and other viruses. Virology, 187, 573-590.

31. Bray M, Lai CJ. (1991) Dengue virus premembrane and membrane proteins elicit a protective immune response. Virology, 185,505-508.

32. Burke & Monath (2001) Flaviviruses. In Fields Virology. Forth edition, Lippincott Raven Publishers, Philadelphia, p. 965-1030.

33. Cahour A, Pletnev A, Vazielle-Falcoz M, Rosen L, Lai CJ. (1995) Growth-restricted dengue virus mutants containing deletions in the 5' noncoding region of the RNA genome. Virology. 1995 Feb 20;207(l):68-76

34. Calisher CH, Karabatsos N, Dalrymple JM, et al. (1989) Antigenic relationships between flaviviruses as determined by cross-neutralization tests with polyclonal antisera. J Gen Virol, 70, 37-43.

35. Calisher CH. (1988) Antigenic classification and taxonomy of flaviviruses (family Flaviviridae) emphasizing a universal system for the taxonomy of viruses causing tick-borne encephalitis. Acta Virol, 32,469-478.

36. Cardiff RD, Lund JK. (1976) Distribution of dengue-2 antigens by electron immunocytochemistry. Infect Immunol, 3, 1699-1709.

37. Casals J, Brown LV. (1954) Hemagglutination with arthropod-borne viruses. J Exp Med, 99, 429-449.

38. Casals J. (1957) The arthropod-borne group of animal viruses. Trans N Y Acad Sci; 19:219-235. Casals, J. and Webster, L.T. (1944) J. Exp. Med., 79(1), 45-63.

39. Chen Y, Maguire T, Hileman RE, et al. (1997) Dengue virus infectivity depends on envelope protein binding to target cell heparan sulfate. Nat Med, 3, 866-871

40. Chiou SS, Chen WJ. (2001) Mutations in the NS3 gene and З'-NCR of Japanese encephalitis virus isolated from an unconventional ecosystem and implications for natural attenuation of the virus. Virology. Oct 10;289(l):129-36

41. Crooks AJ, Lee JM, Easterbrook LM, Timofeev AV, Stephenson JR. (1994) The NS1 protein of tick-borne encephalitis virus forms multimeric species upon secretion from the host cell. J Gen Virol. Dec;75 (Pt 12):3453-60

42. De Madrid AT, Porterfield JS. (1974) The flaviviruses (group В arboviruses): A cross-neutralization study. J Gen Virol, 23,91-96.

43. Dharakul T, Kurane I, Bhamarapravati N, Yoksan S, Vaughn DW, Hoke CH, Ennis FA. (1994) Dengue virus-specific memory T cell responses in human volunteers receiving a live attenuated dengue virus type 2 candidate vaccine. J Infect Dis. Jul; 170(1 ):27-33

44. Fokina G.I., Malenko G.V., Levina L.S., Koreshkova G.V., Rzhakhova O.E., Mamonenko L.L.,

45. Pogodina V.V., Frolova M.P. (1982) Persistence of tick-borne encephalitis virus in monkeys. V.

46. Virus localization after subcutaneous inoculation. Acta virol., 26, p. 369-375.

47. Gould EA, Buckley A, Barrett ADT, et al. (1986) Neuralizing (54 K) and non-neutralizing (54 Кand 48 K) monoclonal antibodies against structural and non-structural yellow fever virusproteins confers immunity in mice. J Gen Virol, 67,591-595.

48. Hahn CS, Dalrymple JM, Strauss JH, et al. (1987) Comparison of the virulent Asibi strain of yellow fever virus with the 17D vaccine strain derived from it. Proc Natl Acad Sci U S A;84:2019-2023

49. Halstead SB. (1988) Pathogenesis of dengue: Challenges to molecular biology. Science, 239:476-481.

50. Harabacz I, Bock H, Jiingst C, et al. (1992) A randomized phase II study of a new tick-borne encephalitis vaccine using three different doses and two immunization regimes. Vaccine; 10:145150.

51. Hasegawa H., Yoshida М., Shiosaka Т., Fujita S., Kobayashi Y. (1992) Mutations in the envelope protein of Japanese encephalitis virus affect entry into cultured cells and virulence in mice. Virology, 191, p. 158-165.

52. He RT, Innis BL, Nisalak A, et al. (1995) Antibodies that block virus attachment to Vero cells are a major component of the human neutralizing antibody response against dengue virus type 2. J Med Virol; 45:451-461.

53. Heinz FX, Berge R, Tuma W, et al. (1983) A topological and functional model of epitopes on the structural glycoprotein of tick-borne encephalitis virus defined by monoclonal antibodies. Virology, 126, 525-537.

54. Heinz FX. (1986) Epitope mapping of flavivirus glycoproteins. Adv Virus Res, 31, 103-168. Heinz, FX, Roehrig JT. Flaviviruses. (1990) In: Immunochemistry of viruses, vol II. Amsterdam-New York-Oxford: Elsevier, 289-305.

55. Heinz FX, Stiasny K, Puschner-Auer G, et al. (1994) Structural changes and functional control of the tick-borne encephalitis virus glycoprotein E by the heterodimeric association with protein prM. Virology, 198,109-117.

56. Heinz FX, Allison SL, Stiasny K, Schalich J, Holzmann H, Mandl CW, Kunz C. (1995) Recombinant and virion-derived soluble and particulate immunogens for vaccination against tick-borne encephalitis. Vaccine. Dec, 13(17), 1636-42.

57. Henchal EA, Henchal LS, Schlesinger JJ. (1988) Synergistic interactions of anti-NSl monoclonal antibodies protect passively immunized mice from lethal challenge with Dengue 2 virus. J Gen Virol, 69,2101-2107.

58. Hill AB, Lobigs M, Blanden RV, et al. (1993) The cellular immune response to flaviviruses. In: Thomas DB, ed. Viruses and the cellular immune response. New York: Marcel Dekker, 363388.

59. Holbrook MR, Li L, Suderman MT, Wang H, Barrett AD. (2000) The French neurotropic vaccine strain of yellow fever virus accumulates mutations slowly during passage in cell culture. Virus Res. Aug;69(l):31-9.

60. Jacobs SC, Stephenson JR, Wilkinson GWG. (1992) High-level expression of the tick-borne encephalitis virus NS1 protein by using an adenovirus-based vector: Protection elicited in a murine model. J Virol, 66,2086-2095.

61. Kimura T, Kimura-Kuroda J, Nagashima K, Yasui K. (1994) Analysis of virus-cell binding characteristics on the determination of Japanese encephalitis virus susceptibility. Arch. Virol;139:239-251.

62. Klockmann U, Bock HL, Franke V, et al. (1989) Preclinical investigations of the safety, immunogenicity and efficacy of a purified, inactivated tick-borne encephalitis vaccine. J Biol Stand; 17:331-342.

63. Kofler RM, Heinz FX, Mandl CW. (2002) Capsid protein С of tick-borne encephalitis virus tolerates large internal deletions and is a favorable target for attenuation of virulence. J Virol. Apr; 76(7), p. 3534-43.

64. Kofler R. M., Judith H. Aberle, Stephan W. Aberle, Steven L. Allison, Franz X. Heinz, and Christian W. Mandl (2004) Mimicking live flavivirus immunization with a noninfectious RNA vaccine. PNAS, vol. 101, no. 7,p. 1951-1956.

65. Kreil TR, Burger I, Bachmann M, Fraiss S, Eibl MM. (1997) Antibodies protect mice against challenge with tick-bome encephalitis virus (TBEV)-infected macrophages. Clin Exp Immunol. Dec;110(3):358-61.

66. Kreil TR, Maier E, Fraiss S, Attakpah E, Burger I, Mannhalter JW, Eibl MM. (1998) Vaccination against tick-borne encephalitis virus, a flavivirus, prevents disease but not infection, although viremia is undetectable. Vaccine. Jul;16(l l-12):1083-6.

67. Kreil TR, Maier E, Fraiss S, et al. (1998) Vaccination against tick-borne encephalitis virus, a flavivirus, prevents disease but not infection, although viremia is undetectable. Vaccine; 16(11— 12):1083—1086.

68. Kunz C, Hofmann H, Stary A. (1976) Field studies with a new tick-borne encephalitis (TBE) vaccine. Zentralbl Bakteriol I. Orig A;243:141—144.

69. Kunz C, Heinz FX, Hofmann H. (1980) Immunogenicity and reactigenicity of a highly purifiedvaccine against tick-borne encephalitis. J Med Virol;6:103-109.

70. Maldov DG, Karganova GG, Timofeev AV. (1992) Tick-borne encephalitis virus interaction with the target cells. Arch Virol.;127(l-4):321-5.

71. Mandl C. W., Kunz C. and Heinz F. X. (1991a) Presence of poly(A) in a flavivirus: significant differences between the 3' noncoding regions of the genomic RNAs of tick-borne encephalitis virus strains. J Virol. August; 65 (8): 4070-4077

72. Mandl C.W., Iacono-Connors L., Wallner G., Holzmann H., Kunz C., Heinz F. X. (1991b) Sequence of the genes encoding the structural proteins of the low-virulence tick-borne flavivirus Langat TP21 and Yelantsev, Virilogy, 185, 891-895.

73. Marianneau P, Megret F, Olivier R, et al. (1996) Dengue 1 virus binding to human hepatoma

74. HepG2 and simian Vero cell surfaces differs. J Gen Virol;77:2547-2554.

75. Mason PW, Pincus S, Fournier MJ, et al. (1991) Japanese encephalitis virus-vacciniarecombinants produce particulate forms of the structural membrane proteins and induce highlevels of protection against lethal JEV infection. Virology; 180:294-305.

76. Mayer, V. (1963) Acta virol., 7(5), 421-429.p

77. Mayer, V. (1966) Acta Virol., 10, 561.p

78. Mayer, V.; Ernek, E.; Blaskovic, D.; Kozuch, O. and Nosek, J (1967a) Acta Virol., 11, p 334345.

79. Mayer, V. (1967b) Acta virol. 11(3), 267-269.

80. Mayer V. (1975) A live vaccine against tick-borne encephalitis: Integrated studies. I. Basic properties and behavior of the ES "14" clone (Langat virus). Acta Virol (Praha); 19:209-218

81. McMinn P.C. (1997) The molecular basis of virulence of the encephalitogenic flaviviruses. J. Gen. Virol., 78, 2711-2722.

82. Nathanson, N.; Goldblatt, D.; Thind, I.S.; Davis, M. and Price, W.H. (1966) Histological studies of the monkey neurovirulence of group В arboviruses. II. Selection of indicator centers. Am J Epidemiol. Nov;84(3):524-40.

83. Phillpotts RJ, Stephenson JR, Porterfield JS. (1985) Antibody-dependent enhancement of tick-borne encephalitis virus infectivity. J Gen Virol;66:1831-1837.4

84. Pletnev, A.G., Bray, M., Huggins, J., Lai, C.-J. (1992). Constraction and characterization of » chimeric tick-born encefalitis/dengue type 4 viruses. Proc.Natl. Akad. Sci. USA 89,1053210536.

85. Pletnev, A.G., Karganova G.G., Dzhivanyan, T.I., Lashkevich, V.A., Bray M. (2000). Chimeric Langat/Dengue viruses protect mice from heterologous challenge with the highly virulent strains of tick-borne encephalitis virus. Virology 274,26-31.

86. Price, W.H., Thind, I.S., Teasdall, R., O'Leary, W. (1970) Vaccination of human volunteers against Russian Spring-Summer (RSS) virus complex with attenuated Langat E5 virus. Bull. WLD Hlth. Org. v. 42, p. 82-94.

87. Price W.H.and Thind I.S. (1973) Immunization of mice against Russian Spring-Summer (RSS) virus complex and monkeys against Powassan virus with attenuated Langat E5 virus. The American J. Tropical, medicine and Hygiene, v.22, No.2, p. 100-107.

88. Roehrig JT. (1986) The use of monoclonal antibodies in studies of the structural proteins of togaviruses and flaviviruses. In: Schlesinger S, Schlesinger MJ, eds. The Togaviridae and Flaviviridae. New York: Plenum Press, 251-278.т

89. Rothman AL, Ennis FA. (1999) Immunopathogenesis of Dengue hemorrhagic fever. Virology, 257:1-6.

90. Rothman AL, Kurane I, Lai C-J, et al. (1993) Dengue virus protein recognition by virus-specific murine CD8+ cytotoxic T lymphocytes. J Virol, 67, 801-806.

91. Ruoslahti E. and Pierschbacher M.D. (1987) New perspectives in cell adhesion: RGD and integrins. Science, 238, p. 491-497.

92. Salas-Benito JS, del Angel RM. (1997) Identification of two surface proteins from C6/36 cells that bind dengue type 4 virus. J Virol;71:7246-7252.

93. Schlesinger JJ, Brandriss MW, Walsh EA. (1987) Protection of mice against dengue-2 virus encephalitis by immunization with the dengue-2 virus nonstructural glycoprotein NS-1. J Gen Virol, 68, 853-857.

94. Schlesinger JJ, Brandriss MW, Putnak JR, et al. (1990) Cell surface expression of yellow fever virus non-structural glycoprotein NS1: Consequences of interaction with antibody. J Gen Virol, 71, 593-599.

95. Schlesinger JJ, Putnak JR, Eckels KH. (1992) New approaches to flavivirus vaccine development. Biotechnology, 20,289-307.

96. Smith C.E.G. (1956) Nature (Lond.), v.178, p. 581-582.

97. Sumiyoshy H., Tignor G.H., Shope R.E. (1995) Characterization of a higly attenuated Japanese encephalitis virus generated from molecularly cloned cDNA. J. of Infect. Diseases, 171, p. 11441151.

98. Tan CH-C, Yap E-H, Singh M, et al. (1990) Passive protection studies in mice with monoclonal antibodies directed against the non-structural protein NS3 of dengue 1 virus. J Gen Virol, 71, 745-748.

99. Theiler, M. (1951). The virus, p. 46-136. In G. K. Strode (ed.), Yellow fever. McGraw Hill, New York, N.Y.

100. Thind, I.S., Price, W.H. (1966a) A chick embrio attenuated strain (TP21 E5) of Langat virus. III. The ability to protect against homologous virus and Powassan virus in cross-challenge experiments. American J. Epidemiology. V. 84, p. 225-233.

101. Thind, I.S. (1981) Attenuated Langat E5 virus as a liv virus vaccine against Kyasanur forest disease virus. Indian J. Med. Res., 73,141-149.

102. Timofeev A.V.& Karganova G.G. (2003) Tick-Borne Encephalitis Vaccine: From Past to Future, Moscow, 44 p.

103. Van Der Most RG, Murali-Krishna K, Ahmed R, Strauss JH. (2000) Chimeric yellow fever/dengue virus as a candidate dengue vaccine: quantitation of the dengue virus-specific CD8 T-cell response. J Virol., 74(17):8094-101.

104. Ting Liu and Thomas J. Chambers (2001) Yellow Fever Virus Encephalitis: Properties of the